Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протеасомы головного мозга грызунов в раннем развитии и при функциональных нарушениях нервной системы

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Протеасомы головного мозга грызунов в раннем развитии и при функциональных нарушениях нервной системы"

9 15-3/137

На правах рукописи

Радченко Александра Шамилевна

ПРОТЕАСОМЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА ГРЫЗУНОВ В РАННЕМ РАЗВИТИИ И ПРИ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ НАРУШЕНИЯХ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ

03.03.01 «Физиология» 03.03.05 «Биология развития, эмбриология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 2015

Работа выполнена в лаборатории биохимии процессов онтогенеза Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук, Шарова Наталья Петровна

кандидат биологических наук. Люпина Юлия Вячеславовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, член-корр. РАН,

Немова Нина Николаевна, главный научный сотрудник лаборатории экологической биохимии, директор Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института

биологии Карельского научного центра РАН

кандидат биологических наук, Морозов Алексей Владимирович, научный сотрудник лаборатории регуляции внутриклеточного протеолиза Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биология имени В.А. Энгельгардтн РАН

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт цитологии РАН

Защита состоится PE-TftBPH 2015 г. в часов на заседании диссертационного гппрпъЯ Q0l.Vsi.0l в Институте биологии развитая им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 2G.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН: http://idbraa.ni,''.

Автореферат разослан <Л» VO^fr_2015 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук ^ (

Бойко О.В.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Одним из основополагающих свойств нервной системы, обеспечивающих адекватный поведенческий ответ организма на изменяющиеся условии среды, является её пластичность. Синаптическая пластичность считается важным условием адаптивных изменений в мозге, а также компенсации нарушений функционирования нейрональных сетей при нейродегенера-тивных процессах, вызванных наследственными нарушениями либо патологическими воздействиями. Формирование и элиминация синапсов в зависимости от активности нейронов, рост и ликвидация аксонов зависят от интенсивности и специфичности работы убиквитин-протеасомной системы (УПС). В экспериментальных моделях на животных показано, что ингибирование активности протеасом снижает пластичность как нервной, так и иммунной систем. Известно, что при патологиях развития более всего страдают отделы конечного мозга, вносящие наибольший вклад в осуществление когнитивных функций. В связи с этим в настоящей работе исследованы особенности функционирования УПС в эмбриональном и раннем постнатальном развитии коры и гиппокампа, которым принадлежит ведущая роль в осуществлении организации движения и реализации процесса обучения, а также ствола мозга, содержащего ядра жизненно важных центров у млекопитающих. Важно также было изучить особенности функционирования УПС в головном мозге грызунов, развитие которого проходило в генетически обусловленных стрессовых физиологических условиях. Эти исследования мы проводили на двух моделях: мышах, иокаутных по белку /32-микроглобулину (В2ш), и крысах линии Август с нарушением обмена моноаминов. У В2ш-нокаутных мышей отсутствуют молекулы главного комплекса гистосовместимости класса I (ГКГ I), для которых иммунные протеасомы образуют олигоиептиды. В норме молекулы ГКГ I представляют олигопептиды на поверхности клеток, обеспечивая специфические межклеточные взаимодействия. Инбрсдная линия крыс Август характеризуется нарушениями синтеза моноаминов и выбрана нами ввиду тесной связи моноаминергичсской системы с формированием эмоций, памяти, мотивации и обучения, а также с диффе-репцировкой, миграцией нейронов и синаптогснезом. Выявление особенностей функционирования протеасом в реализации молекулярных механизмов нейро-нальной пластичности поможет биологам и медикам продвинуться в понимании ключевых механизмов нарушений развития и функционирования центральной нервной системы (ЦНС).

Степень разработанности темы. С момента открытия протеасом в конце 1980-х годов А. Чсхановером (A. Ciechanover), А. Гершко (A. Hershko) и И. Ро-узом (I. Rose), получившими за свое открытие Нобелевскую премию в 2004 г.,

внимание многих научных групп приковано к изучению структуры и функций этого уникального протеолитического комплекса. Исследованию роли протеасом в обеспечении пластичности ЦНС посвящены работы десятков авторов. Имеются данные о важной роли протеасом в обеспечении нейронального и синаптиче-ского гомеостаза. Доказано участие протеасом в процессах синаптической пластичности и долговременной потенциации в ЦНС (Morris, 2006). Известно, что распределение протеасомных субъсдиниц варьирует в различных отделах головного мозга взрослых особей грызунов (Nöda et al., 2000; Ding, Keller, 2001). Протеасомы регулируют уровень специфических белков: NMDA-рецепторных субъединиц, глутаматного транспортера и других белков-переносчиков, участвующих в синаптической передаче. Была выдвинута гипотеза о том, что в ЦНС именно глутаматергическая активность регулирует экспрессию иммунных протеасом через активацию транскрипционных факторов, среди которых Zif268 и CREB (James et al., 2006). Исследования in vivo показывают вовлеченность УПС в формирование памяти (Choi et al., 2010). Некоторые данные позволяют полагать, что деградация белков играет важную роль на определенном этапе рекон-солидации памяти. Молекулы ГКГ I, представляющие на поверхности клетки пептиды, продуцируемые протеасомами, регулируют синаптическую функцию нейронов и их морфологию (Barco et al., 2005). Показано, что процессы старения в ЦНС связаны с изменениями в структуре и функциях протеасом (Ding, Keller, 2001). Нарушения протеасомной активности наблюдаются при окислительном стрессе и процессах нейродегенерации (Diaz et al., 2003).

Однако перечисленные работы не затрагивали вопроса функционирования пула протеасом и его регуляции в ходе эмбрионального и раннего постнаталь-ного развития ЦНС млекопитающих, когда пластичность играет критическую роль. Также детально не изучено участие УПС в проявлениях пластичности мозга у животных с генетически обусловленными отклонениями в функционировании нервной системы, то есть, на моделях нарушения развития нервной системы. В связи с этим нами были изучены особенности функционирования УПС в головном мозге у крыс в период эмбрионального и раннего постнаталь-ного развития, а также у мышей, нокаутных по В2ш, и у инбредной линии крыс Август с метаболическими нарушениями в серотонинсргической и дофаминер-гичсской системах.

Цель работы: Выявить особенности пула протеасом головного мозга грызунов в раннем развитии, а также при генетически обусловленных нарушениях обмена моноаминов и в отсутствие молекул ГКГ I.

Задачи исследования:

1. Изучить изменение пула протеасом (активности протеасом, содержание регуляторов и субъединиц протеасом) в связи с динамикой содержания транскрипционного фактора Zif268 в коре, гиппокампе и стволе головного мозга в эмбриональном (Э19-Э21) и раннем постнатальном (П1-П15) развитии крыс линии Вистар.

2. Изучить особенности пула протеасом, а также экспрессию белка HSP70 и транскрипционного фактора Zif268 в коре, стриатуме и стволе головного мозга у крыс линии Август с генетически обусловленными нарушениями метаболизма моноаминов в ЦНС.

3. Исследовать особенности функционирования протеасом и связанных с ними сигнальных путей в коре, стриатуме, мозжечке и стволе головного мозга у мышей, нокаутных по /32-микроглобулину, входящему в состав молекул ГКГ I.

Научная новизна. Впервые изучена динамика содержания конститутивных и иммунных протеасом, а также регуляторов РА28, РА200 и РА700 протеасом в коре, гиппокампе и стволе головного мозга крыс в эмбриональном и раннем постнатальном развитии. Показано повышение уровня иммунных субъсдиниц LMP2 и/или LMP7 протеасом во всех изученных структурах мозга в периоды развития Э19-Э21 и П7-П15. В период П7-П15 это повышение сопряжено с увеличением содержания транскрипционного фактора Zif268.

Впервые выявлена связь субъединичного состава протеасом с обменом серо-тонина (5-НТ) и дофамина (DA) в мозге крыс. Показана повышенная экспрессия иммунных протеасом, содержащих субъединицы LMP2 и/или LMP7, HSP70 и транскрипционного фактора Zif268 в коре, стриатуме и стволе головного мозга крыс линии Август, отличающихся сниженной активностью ферментов синтеза 5-НТ и DA. Содержание регуляторов РА28, РА200 и РА700 протеасом повышено в коре и снижено в стриатуме крыс Август.

Впервые исследованы особенности функционирования протеасом в различных отделах головного мозга у мышей, нокаутных по В2ш. Обнаружено, что фронтальная кора и ствол В2т-нокатуных мышей характеризуются противоположными изменениями в пулах протеасом при постоянном общем уровне протеасом у В2ш-нокаутных мышей но сравнению с контрольными животными. Отсутствие в мозге молекул ГКГ I связано с повышенной экспрессией иммунных протеасом и регулятора РА28 протеасом в коре и мозжечке.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты важны для понимания молекулярных механизмов развития и функционирования ЦНС млекопитающих на уровне регуляции работы синаптиче-ских структур и межклеточных взаимодействий. Установленные особенности пула протеасом клетрк головного мозга в изменённых условиях выявили потенциальные мишени воздействия (иммунные субъединицы LMP2 и/или LMP7 и регулятор РА28) для будущих разработок терапевтических и генноинженерных подходов в коррекции отклонений функционирования ЦНС.

Личное участие автора. Все эксперименты выполнены непосредственно автором или при его активном участии совместно с сотрудниками лаборатории биохимии процессов онтогенеза ФГБУН Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Автором было изучено изменение пула протеасом в связи с динамикой содержания транскрипционного фактора Zif268 в коре, гиппокамие и стволе головного мозга в эмбриональном (Э19-Э21) и раннем постнатальном (П1-П15) развитии крыс линии Вистар, исследованы особенности функционирования протеасом (активности протеасом, содержания субъединиц протеасом и их регуляторов) в коре, гиппокампе и стволе головного мозга у крыс линии Август с нарушениями метаболизма моноаминов в ЦНС, а также в коре, стри-атуме, мозжечке и стволе головного мозга у мышей, нокаутных по В2т.

Степень достоверности и апробация результатов. Результаты, приведенные в работе достоверны и воспроизводимы, объем выборки достаточен, статистическая обработка проведена с использованием современного программного обеспечения. Работа прошла апробацию на 2-й Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомсдицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012); на конференциях молодых ученых ИБР РАН (Москва, 2012, 2013); VI российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, 2013); на 30-м Международном конгрессе по клинической нейрофизиологии (ICCN) сообщества IFCN (Берлин, Германия, 2014); на VII Всероссийской конференции «Протеолитические ферменты: структура, функции, эволюция» (Петрозаводск, 2014 г.).

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на «110» страницах, содержит «28» рисунков, «3» таблицы, «174» источника литературы.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК — 3, тезисов докладов и материалов конференций — 6.

Методы исследования

Животные. Изучение особенностей функционирования пулов протеасом в развитии ЦНС в эмбриональном (Э19, Э21) и раннем постнатальном (П1, ПЗ, П4, П5, П7, П15) периодах проводили на крысах линии Вистар. Исследование функционирования УПС в отделах головного мозга у мышей с нарушениями ГКГ I проводили на половозрелых мышах-самцах линии C57BL/6J-B2mtmlUnc и C57BL/6 контрольной группы. Изучение особенностей содержания иммунных протеасом в различных отделах головного мозга крыс с нарушением метаболизма моноаминов проводили на инбредной линии крыс Август с нарушениями обмена 5-НТ и DA и контрольной линии Вистар. Все эксперименты были выполнены в соответствии с Перечнем требований по этике работы с лабораторными животными.

Определение активностей протеасом. Гомогенаты отделов головного мозга (фронтальная кора, стриатум, гиппокамп, мозжечок и ствол мозга) центрифугировали при 15400g на настольной центифуге («Eppendorf», Германия) при температуре 4СС. Надосадочную жидкость (осветленные гомогенаты) использовали для дальнейших исследований. Химотрипсинподобную (ХПА) и каспазапо-добную (КПА) активности протеасом определяли по гидролизу флуорогенных олигопептидов Suc-LLVY-AMC и Z-LLE-AMC, соответственно. Для оценки активности примесных протсаз исиользовали ингибитор ХПА протеасом MG132 и ингибитор КПА протеасом AdaAhx(3)L(3)VS. Активности выражали в условных единицах показаний флуоримсгра и нормализовали на содержание в пробах белка и на содержание в пробах /3-актина, которое оценивали с помощью Вестерн-блоттинга.

Исследование содержания белков. Уровень содержания тотального пула протеасом, конститутивных и иммунных субъединиц протеасом, регуляторов протеасом, нейральных маркеров, белков теплового шока и транскрипционных факторов в отделах головного мозга исследовали с помощью Вестерн-блоттинга с применением антител к субъединицам al, 2,3,5,6, 7, входящим в состав всех форм протеасом, к иммунным субъединицам LMP2 и LMP7, конститутивным субъединицам /31 и /35, регуляторам РА700, РА28 и РА200 протеасом, нейраль-ным маркерам NeuN и gFAP, белку теплового шока HSP70, транскрипционному фактору Zif268 и nNOS. Результаты нормализовали на относительное количество /3-актина. Колокализацию иммунных протеасом и транскрипционных факторов в клетках исследовали с помощью иммунофлуоресцентного мечения клеток на срезах головного мозга антителами к иммунным субъединицам протеасом, клеточным маркерам, транскрипционному фактору Zif268 или белку теп-

лового шока НЗР70. Флуоресценцию анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа БМ 11ХА2 («Ье1са>, Германия) и конфокального микроскопа ТСБ ЭР («Ье1са», Германия). Специфичность первых антител подтверждалась с помощью контролей, при которых реакция проводилась только со вторыми антителами. Отсутствие перекрестной реакции между первыми и вторыми антителами проверялось путем инкубации каждого из первых антител с противоположными вторыми антителами.

Определение содержания моноаминов и их метаболитов. Содержание моноаминов (5-НТ, БА) и продуктов их метаболизма (5-гидроксииндолуксусная кислота (5-Н1АА), гомованилиновая кислота (НУА) и 3, 4-диоксифенилуксусная кислота (БОРАС)) в тканях головного мозга крыс рассчитывали по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии. Хроматографическое разделение катехоламинов и метаболитов проводили на обращённо-фазной колонке 11ерго811-Риг, ОББ-З, 4x100 мм с диаметром пор 3 мкм (Бг. Ма]всЬ СМВН,«Эл-сико», Россия). Полученные хроматограммы обрабатывали с помощью пакета программного обеспечения «Мультихром 1,5».

Статистический анализ. Статистическую обработку данных проводили с помощью программного пакета «БЪаЫзиса 10.0». Данные представлены как среднее значений, полученных минимум в четырех шести аналогичных экспериментах. Статистическую достоверность результатов оценивали с помощью регрессионного анализа и с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни, взаимосвязь параметров содержания нейральных маркеров и протеасом выявляли с помощью метода ранговых корреляций Спирменар, достоверными считали различия при р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Протеасомы в коре, гиппокампе и стволе головного мозга крыс линии Вистар в эмбриональном и раннем постнатальном развитии. Изучение содержания конститутивных и иммунных субъединиц, а также регуляторов протеасом в коре, гиппокампе и стволе головного мозга крыс линии Вистар в эмбриональном (Э19 Э21) и раннем постнатальном (П1 П15) развитии показало изменения количественного и качественного состава пула протеасом (рисунок1). В коре мозга крыс в эмбриональный период развития Э19 Э21 происходит основная миграция нейральных клеток, увеличивается плотность и функциональность синапсов. В этот период нами отмечено во фронтальной коре повышение

Рис. 1: Динамика содержания иммунных субъединиц LMP2 (1) и LMP7 (2), конститутивных субъединиц /31 (3) и /35 (4) (а); субъединиц РА28а (5), Rpt6 (6) регуляторов РА28 и РА700 протеасом, регулятора РА200 протеасом (7) и транскрипционного фактора Zif268 (8) (б). Содержание указанных белков в коре, гиппокамне и стволе головного мозга крыс в период раннего развития (дни): Э19, Э21, П1, ПЗ, П4, П5, П7, П15, определено по данным Вестерн-блоттинга. Приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего, *р < 0,05, п = 4, где р - доверительная вероятность, п - количество независимых экспериментов.

и

(б)

г з

Э19 Э21 за ПО П1 ПЗ П5 П7 Пв ПН П1Э П15

Э10 Э21 323 ПО m ПЗ П5 П7 П9 П11 П13 П15

Рис. 2: ХПА (а) и КПА (б) протеасом в коре (1), гиппокампе (2) и стволе (3) головного мозга крыс в период раннего развития (дни): Э19, Э21, П1, ПЗ, П4, П5, П7, П15. Приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего, *р < 0, 05, п = 4, где р - доверительная вероятность, п - количество независимых экспериментов.

содержания иммунной субъединицы LMP7 и регулятора РА28 и снижение содержания иммунной субъединицы LMP2, /31 и регулятора РА700 протеасом. В гиппокампе, относящемся к древней коре, значительных изменений в содержании протеолитических субъединиц протеасом в период Э19 Э21 не обнаружено. В коре, гиппокампе и стволе мозга в период П7 П15, характеризующийся активным процессом формирования медиаторной структуры нейронов и пиком синаптогенеза, происходило нарастание уровня иммунных субъединиц LMP2 и LMP7 протеасом относительно периода Э19 П5. Этот процесс в коре сопровождался значительным повышением ХПА и КПА протеасом (рисунок 2). Содержание протеолитической конститутивной субъединицы ¡31 во всех структурах снижалось на П4 относительно П1 и повышалось на П15 до уровня П1. Вместе с тем, уровень содержания протеолитической конститутивной субъединицы /95 протеасом в коре, гиппокампе и стволе увеличивался после Э21 и достигал максимальных значений в период П1-П5, резко падая на П7 во всех структурах и оставаясь низким в стволе и гиппокампе до П15. Следует отметить, что в период П7 П15 содержание иммунных субъединиц LMP2 и LMP7 во всех структурах повышалось одновременно с содержанием конститутивной субъединицы /31. Учитывая низкий уровень содержания субъединицы/35 в стволе и гиппокампе в указанный период, можно сделать заключение о том, что в этих структурах субъсдиница LMP7 присутствует в сочетании с субъединицей LMP2 в составе иммунных протеасом и в сочетании с субъединицей/31 в составе смешанного типа протеасом. В коре мозга, скорее всего, существуют преимущественно формы LMP7+/31, /31 + /35 на П7 и LMP2+LMP7, 01 + /35 на П15. Такая смена состава пула сопровождается повышением ХПА и КПА протеасом. В гиппокампе

в отличие от коры наблюдается переход от равновесного существования форм LMP7t/31, LMP7+LMP2 на П7 к повышению содержания иммунных протеа-сом, состоящих из субъсдиниц LMP2—LMP7, на П15. В стволе смесь протеасом типов LMP7—/31, /31 + /35, LMP2^LMP7, наблюдаемая на П7 преобразуется к П15 в классическую комбинацию иммунных LMP2^LMP7 и конститутивных /31 + /95 форм протеасом. Изменения состава пулов протеасом в гиппокампе и стволе не приводят к изменению активности протеасом.

Показана положительная связь динамики содержания регулятора РА28 и конститутивной субъединицы /35 в коре и гиппокампе в период ПЗ-П5 и в стволе мозга в период П1-П5. По-видимому, в эти периоды в указанных отделах мозга регулятор РА28 и субъединица /35 функционируют в составе одной и той же структуры протеасом. Выявленная динамика содержания регуляторов РА28 и РА700 (рисунок 1) позволяет сделать заключение о том, что в период ПЗ-П5 в коре и стволе происходит замещение регулятора РА700 специфическим регулятором РА28 в пуле протеасом, а в гиппокампе регулятор РА28 функционирует наряду с РА700. Очевидно, в указанный период наличие регулятора РА28 важно для развития всех изученных структур головного мозга.

Ранее были опубликованы данные об участии регулятора РА28 в продукции антигенных эпитоиов для молекул ГКГ I при его ассоциации с иммунными протеасомами (Dick et al., 1996; Fabunmi et al., 2000; Giocttrup et al., 1996). В соответствии с этими публикациями логично предположить роль регулятора РА28 в качестве активатора иммунных протеасом, изначально присутствующих в небольших количествах в коре, гиппокампе и стволе головного мозга крыс. Однако возможно и другое объяснение, основанное на данных о работе регулятора РА28 в качестве адаптора при рефолдинге поврежденных белков с участием белков теплового шока HSP90, HSP40 и HSP70 (Minami et al., 2000). Регулятор РА700 в свою очередь обеспечивает необходимый базовый уровень убиквитин-и АТР- зависимого протеолиза в изученных отделах головного мозга крыс.

В период раннего иостнатального развития П7-П15 увеличение уровня содержания иммунных субъединиц LMP2 и LMP7 и активностей протеасом во всех изученных отделах мозга сопряжено с экспрессией транскрипционного фактора Zif268 (рисунок 1 и 2), которая, как известно, связана с созреванием нейронов (James et al., 2005, 2006; Gavilan et al., 2009).

Таким образом, к П15 в указанных структурах головного мозга крыс способность протеасом гидролизовать пептидные связи после гидрофобных аминокислотных остатков повышена за счет возрастания уровня иммунных протеасом, что приводит к образованию большего количества антигенных эпитоиов для молекул ГКГ I, необходимых для реализации нейрональной пластичности ЦНС. Транскрипционный фактор Zif268 в коре и стволе экспрессируется в период формирования нейрональных эфферентных связей и необходим на этапе ие-

рсхода новорожденного животного к самостоятельной жизни и формирования условных рефлексов (Bozon et al., 2003; Knapska et al., 2004; Lee et al., 2004). В гиппокампе процессы запоминания и формирования ассоциативных связей начинаются сразу после рождения, что отражается в экспрессии транскрипционного фактора Zif268, начиная с П1.

Содержание иммунных протеасом, а также транскрипционного фактора Zif268 в коре, гиппокампе и стволе достигает максимальных значений к концу второй недели постнатального развития, к моменту перехода к самому важному периоду обучения и запоминания, приобретения сложных двигательных, поведенческих навыков, импринтинга и построения взаимоотношений в группе животных. В этот период активного синаптогенеза (до П25), накопления ней-росекреторных гранул и созревания шипикового аппарата в коре заканчивается нейрональная дифференцировка, а ветвление аксонов и дендритов достигает уровня взрослого животного (Оленев, 1978). Вероятно, иммунные протеасомы играют важную роль в регуляции ключевых биохимических процессов раннего онтогенеза ЦНС и необходимы для возникновения и реализации синаптической пластичности в изученных структурах головного мозга у крыс.

Связь субъединичного состава протеасом с обменом 5-НТ и DA в головном мозге крыс линий Август и Вистар. Выраженный рост содержания иммунных протеасом в важнейшие периоды реализации нейрональ-ной пластичности в онтогенезе крыс Вистар указывает на необходимость специфической работы УПС в эмбриональном и раннем постнатальном периодах развития головного мозга. Моноаминергическая система участвует как в диф-ференцировке и миграции нейрональных клеток мозга, так и в формировании синаптических связей. Выявленные нами особенности изменения пула протеасом в развитии головного мозга крыс Вистар послужили основой для изучения протеасомных механизмов пластичности головного мозга крыс линии Август с генетически измененным метаболизмом моноаминов и отличающихся от крыс линии Вистар сниженной активностью ферментов синтеза 5-НТ и DA.

Показано, что уровни содержания субъединиц/31, /35, LMP2, LMP7 и регуляторов РА28, РА700 и РА200 протеасом, а также транскрипционного фактора Zif268 повышены в коре головного мозга крыс линии Август (рисунок 3) на фоне уменьшения содержания субъединиц al, 2, 3, 5,6, 7 (данные не приведены), то есть общего пула протеасом. При этом ХПА и КПА в коре мозга не отличались у крыс обеих линий (рисунок 4). Колокализация иммунных субъединиц LMP2, LMP7 и транскрипционного фактора Zif268 в коре подтверждена методом им-муногистохимического окрашивания (рисунок 5). В стриатуме повышено содержание конститутивной /31 субъединицы и иммунных LMP2, LMP7 субъединиц протеасом, Zif268 не изменяется, содержание РА28, РА200, РА700, а также ХПА

8истар

Линий крыс

Рис. 3: Относительное содержание иммунных LMP2, LMP7 и конститутивных /31, /35 субъединиц протеасом, субъединиц РА28а, РА200, R.ptG регуля торов иро-теасом, белков Zif268, HSP70, NeuN, gFAP в коре головного мозга крыс линий Август и Вистар по данным Вестерн-блотов белков осветленных гомогенатов с использованием антител к указанным белкам. При анализе относительное количество (оптическая плотность блотов) субъединиц нормализовали на содержание /3-актина. Приведено в процентах оптической плотности (ОП) от максимального значения. Анализ проведен с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни, различия достоверны мри уровне значимости *р 0,05.

Рис. 4: Химотрипсинподобная активность (а) и каспазаподобная активность иротеасом (б) в коре, стриатуме и стволе головного мозга крыс линии Август относительно таковых у крыс линии Вистар (нормирование на мг белка).

LMP2 + Zi(268 LMP7 + Zif26fl

Рис. 5: Иммунофлуоресцентная колокализация (желтый) транскрипционного фактора Zif'268 (зеленый) и иммунных субъединиц LMP2 и LMP7 иротеасом (красный) на срезах фронтальной коры головного мозга крыс линии Август (А) и Вистар (W).

и КПА снижено у крыс линии Август. В стволе головного мозга, обеспечивающем жизненно важные функции организма, также, как и в коре и стриатуме у крыс линии Август повышено содержание иммунной субъединицы LMP7 протеасом, но несколько снижено содержание каталитических субъединиц/31, /95 и регулятора РА28. Это изменение субъсдиничного состава протеасом сопровождается повышением ХПА и снижением КПА протеасом. Содержание Zif2G8 в стволе головного мозга крыс линии Август не отличается такого же показателя крыс линии Вистар. Содержание белка теплового шока HSP70 у крыс Август повышено во всех изученных структурах мозга, что свидетельствует о стрессовом состоянии нейрональных клеток. Экспрессия NcuN и gFAP, а следовательно, и популяция нейронов и глиальных клеток в стволе, стриатуме крыс Август не отличалась от таковой крыс линии Вистар, но была выше в коре крыс линии Август. Содержание 5-НТ и DA в коре и стриатуме крыс линии Август превышало таковое крыс линии Вистар (таблица 1).

Таблица 1: Содержание ссротонина, дофамина и их основных метаболитов в коре, стриатуме и стволе крыс линий Вистар и Август по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии. Указано стандартное отклонение для полученных средних значений._

Вещество Содержание, пмоль/мг ткани

Кора, Вистар Кора, Август Стриатум, Вистар Стриатум, Август Ствол. Вистар Ствол. Август

DOPAC 0, 2 ± 0, 1 0,3 ±0,1 4,9± 1,3 13, 4±1, 2 0,1 ±0,1 0, 1 ± 0, 1

DA 0,4 ± 0,1 0,6 ±0,1 4,3± 1,2 13, 5±1, 3 0.2 ±0,1 0,2 ±0,1

5-HIAA 2,8 ±0,3 3, 5 ± 0,9 3,7± 1,1 3,8 ± 0.1 2. 2 ±0,2 2, 5 ± 0, 2

HVA 0,2 ±0,1 0,1 ±0,1 3,5 ±0,4 3,8 ±0.3 0.1 ± 0,1 0,1 ± 0,1

5-НТ 1,0 ± 0,1 1,6 ± 0,3 1,0 ±0,2 1,3 ±0,2 1,4 ± 0,2 1,С±0,1

Сравнение (5-Н1АА)/5-НТ, (НУА),/БА и (БОРАС)/БА в структурах головного мозга крыс обеих линий указывает на то, что БА в коре, стриатуме и стволе крыс линии Август разрушается менее активно, так же как 5-НТ в коре и стриатуме крыс этой линии (таблица 2).

Таблица 2: Коэффициенты отношения содержания метаболитов 5-HIAA, HVA,

Оцениваемое отношение Кора Стриатум Опюл

5-HIAA/5-HT 0,7 ± 0,4 0,8 ± 0,5 1,0 ±0,4

HVA/DA 0,4 ±0,1 0,4 ±0,1 0,6 ±0,1

DOPAC/DA 0,8 ± 0,2 0,9 ±0,1 0,5 ±0,2

Вероятно, сниженная активность ферментов синтеза моноаминов (Доведо-ва, 2007; Хрусталев, 2007; Доведова, 2008) компенсируется увеличением времени жизни 5-НТ и DA, что может быть обусловлено уменьшением активности либо количества моноаминоксидазы (МАО). Содержание МАО регулируется убиквитин-протсасомной системой (Kabayama, 2013). По-видимому, повышенный уровень иммунных протеасом, содержащих субъединицы LMP2 и/или LMP7, и транскрипционного фактора Zif268 в исследованных структурах древней и новой коры головного мозга крыс линии Август в условиях нарушения обмена моиоаминов регулирует активность МАО и обеспечивает пластичность ЦНС этих животных.

Протеасомы в головном мозге мышей, нокаутных по В2т. Ввиду того, что иммунные протеасомы продуцируют эпитопы для представления в составе молекул ГКГ I, было решено оценить субъединичный состав пула протеасом у животных, не имеющих ГКГ I. Обнаружено, что фронтальная кора и ствол, структуры с разным соотношением содержания NeuN и gFAP, характеризуются противоположными изменениями в пулах протеасом при постоянном общем уровне протеасом у В2т-нокаутных мышей по сравнению с контрольными мышами C57BL/6. В коре В2т-нокаутных мышей повышена ХПА (данные не приведены), а также содержание иммунной субъединицы LMP7 и регулятора РА28 протеасом, в то время как в стволе эти показатели снижены (рисунокб). Содержание сигнальных и стресс-лимитирующих молекул nNOS и HSP70 в коре В2т-нокаутных мышей также повышено, а в стволе снижено (рисунок 7), что указывает на возможный контроль экспрессии субъединицы LMP7 и регулятора РА28 с их помощью. Методом иммуногистохимического окрашивания срезов мозга на стёклах белок теплового шока HSP70 и иммунная субъединица протеасом LMP7 выявлены в нейронах коры головного мозга мышей, положительно окрашенных на маркер NeuN. Интенсивность окрашивания у В2ш-нокаутных мышей оказалась значительно выше, чем у контрольной группы (рисунок 8). Изменения в пуле протеасом стриатума В2т-нокаутных мышей сходны с таковыми в стволе. Вместе с тем, мозжечок характеризуется отличной от всех структур картиной функционирования протеасом. В нем повышена экспрессия иммунных суб'ьсдипиц LMP7, LMP2 и регулятора РА28, но понижена экспрессия регулятора РА700. В большей части отделов головного мозга В2т-нокаутных мышей обнаружен дефицит NeuN (нейроны) и gFAP (глия), а в коре повышено содержание gFAP (рисунок 6).

Полученные в данной работе результаты позволили предложить схему компенсаторных механизмов, развивающихся в коре головного мозга и обеспечивающих поддержание синаптической пластичности у мышей в отсутствие молекул ГКГ I. Отсутствие молекул ГКГ I приводит к стрессовому состоянию нейронов

Кора

Стриатум Мозжечок Ствол

4?

У

а1,2,3,5,6,7 -«► .— — — — (29-32 кДа)

LMP7 (26 кДа) —» — -— —

LMP2 (23 кДа) —^ «—. — — —.

РА28и (28 Kfla) —

Rpt6 (48 кДа)--- - -

NeuN (46. 48 кДа) Ж ^

gFAP (50 кДа) — «—

р-актин 143 кДа) « —

g 75 § 50 25 О

100 ¿75 g 50 25 О

100

ê75 g 50

25

О

Ж

I

1

LMP2

f

100 g 75 g 50 25 О

100 g 75 g 50 25 О

100 , g 75 g 50 25 0

4

CI C57BL/6 Ш B2m

PA28„

9

Rpt6

L

gFAP

4

Рис. 6: Экспрессия субъединиц al, 2,3,5,6, 7, LMP7, LMP2 протеасом, субъединицы РА28о и Rpt6 регуляторов протеасом, белков NeuN и gFAP в различных отделах головного мозга мышей C57BL/G и В2га-нокаутных мышей по данным Всстерн-блотов белков осветленных гомогенатов с использованием антител к указанным субъединицам. При анализе относительное количество (оптическая плотность блотов) белков нормализовали на содержание /3-актина.

Кора .«? s

Ствол

nNOS (137 кДа) HSP70 (70 кДа) (1 актин ИЗ кДа)

100 з? 75

■Я*

nNOS

V

I I C57BL/6 МЯЛ В2т

100

б75 g 50

25

0

1

*

Кора

Ствол

Кора

Рис. 7: Экспрессия белков пЖ)Э и НБР70 во фронтальной коре и стволе головного мозга мышей С57ВЬ/6 и В2т-нокаутных мышей. Вестерн-блоты с использованием антител и гистограммы относительного количества белков, нормализованного на содержание /3-актина. За 100% принято содержание пМОБ и НБР70 в коре мозга В2т-нокаутных мышей. Приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего, достоверное отличие от контроля при *р < 0,05, п = 4.

HSP70

C57/Black

В2т

LMP7

NeuN

■■

« и f $8 * л m *

Рис. 8: Конфокальная микроскоиия клеток фронтальной коры головного мозга мышей C57BL/6 и В2т-нокаутных мышей. Иммуногистохимическое мечение клеток на срезах антителами к субъединице LMP7 протеасом,белкам HSP70 и NeuN.

и нарушению межнейронных взаимодействий, которое подтверждается повышенным содержанием в клетках nNOS и HSP70. Эти молекулы участвуют в сигнальных путях, приводящих к увеличению экспрессии иммунных протеасом и регулятора РА28. Вероятно, иммунные протеасомы в совокупности с регулятором РА28 в нейронах коры головного мозга В2ш-нокаутных мышей создают определенный «молекулярный паспорт» для каждого нейрона, путем образования специфического набора олигопептидов. Последние, попадая на клеточную поверхность тем или иным способом, обеспечивают адгезивные взаимодействия с другими нейронами и глией, компенсируя нарушения во взаимодействиях, в норме обусловленных наличием молекул ГКГ I у контрольных животных.

Заключение. Полученные нами данные говорят о важнейшей роли иммунных протеасом в реализации пластичности головного мозга в период активного развития и становления как жизнеобеспечивающих древних структур мозга (ствол, гиппокамп), так и эволюционно молодой структуры — фронтальной коры, отвечающей за сложные двигательные и поведенческие навыки млекопитающих. Кроме того, увеличение количества иммунных протеасом, содержащих субъединицы LMP2 и/или LMP7, и регулятора РА28 служит адаптивным механизмом реализации пластичности ЦНС в условиях отсутствия ГКГ I или нарушений обмена моноаминов и отражает особенности нейрогенеза и диффе-ренцировки нейральных клеток головного мозга у В2ш-нокаутных мышей и у крыс линии Август. Функционирование иммунных протеасом в мозге сопряжено с экспрессией транскрипционного фактора Zif268, направлено на усиленную продукцию синаптических олигопептидов и адгезионных молекул, и, вероятно, служит адаптационным механизмом пластичности конечных структур головного мозга. Дальнейшее изучение роли протеасом в реализации различных аспектов пластичности головного мозга позволит исследователям выявить фундаментальные основы молекулярных механизмов функционирования ЦНС млекопитающих и расширить список терапевтических мишеней для медицинского воздействия.

Выводы

1. Развитие головного мозга крысы сопровождается изменениями в пуле протеасом. В период эмбрионального развития Э19-Э21 в коре, гиппокампс и стволе мозга крыс линии Вистар увеличивается содержание иммунной субъединицы LMP7. В коре также повышается содержание регулятора РА28 протеасом.

2. В период раннего постнатального развития ПЗ-П5 в коре, гипиокамне и стволе головного мозга крысы происходит увеличение содержания регулятора РА28 и частичное замещение им регулятора РА700. В период П7 П15 увеличивается содержание иммунных субъединиц LMP2 и/или LMP7 протеасом и транскрипционного фактора Zif268 в изученных структурах мозга.

3. В коре и стриатуме головного мозга крыс с нарушениями обмена моноаминов (линия Август) увеличено содержание иммунных субъединиц LMP2 и LMP7 протеасом, а также белков Zif268 и HSP70 относительно контрольных крыс (линия Вистар). Кроме того, в коре головного мозга крыс линии Август повышен уровень регуляторов РА28, РА200 и РА700 протеасом.

4. В коре и мозжечке головного мозга В2ш-нокаутных мышей повышено содержание иммунной субъединицы LMP7 и регулятора РА28 протеасом относительно контрольных мышей C57BL/6. Общее содержание протеасом в сравнении с контролем не изменено. При этом у В2т-нокаутных мышей увеличено содержание nNOS и HSP70.

5. Иммунные иротеасомы, содержащие субъединицы LMP2 и/или LMP7, и регулятор РА28 являются компонентами пула протеасом, важными для реализации нейрональной пластичности ЦНС в раннем развитии, при нарушениях в моноаминергичсской системе, а также при отсутствии молекул ГКГ I в головном мозге у грызунов.

6. Полученные данные позволяют выдвинуть гипотезу о вовлеченности транскрипционного фактора Zif268 и/или белков HSP70 и nNOS в регуляцию экспрессии иммунных протеасом в раннем развитии, при нарушениях в моноаминергичсской системе, а также при отсутствии молекул ГКГ I в головном мозге у грызунов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в журналах, соответствующих Перечню ВАК:

1. Люпина Ю.В., Богатырев M. Е., Орлова А.Ш., Марюхнич Е.В., Казанский Д.Б., Шарова Н.П. Иммунные протеасомы в головном мозге мышей, нокаутных ио/?2-микроглобулину // Биохимия, 2013, Том 78 (10), С. 14361447.

2. Люпина Ю.В., Орлова А., Карпова Я.Д., Горностаев Н.Г., Михайлов B.C., Шарова Н.П. Пластичность нервной и иммунной систем у различных организмов: возможная роль протеасом в этих процессах // Журнал общей биологии, 2014, Том 75, №1, С. 374-392.

3. Орлова А.Ш., Люпина Ю.В., Абатурова С.В., Шарова Н.П. Особенности экспрессии иммунных протеасом в развитии центральной нервной системы у крыс // Биоорганичсская химия, 2014, Т. 40, № 6, С. 1-9.

Тезисы:

1. Орлова А.Ш., Люпина Ю.В., Шарова Н.П. Особенности пула протеасом в различных отделах головного мозга крыс в раннем онтогенезе // Тезисы докладов 2-й Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», Медицинский академический журнал, Санкт-Петербург, 2012, Приложение 1, С. 282-283.

2. Орлова А.Ш., Особенности экспрессии иммунных субъединиц и активаторов протеасом в раннем развитии головного мозга крысы // Тезисы докладов конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 29-30 ноября 2012 г. Онтогенез, 2013, том 44, № 4, С. 236.

3. Люпина Ю.В., Орлова А.Ш., Астахова Т.М., Шарова Н.П. Функционирование протеасом в центральной нервной системе бестимусных мышей Balb/C (Nude) // Материалы VI российского симпозиума «Белки и пептиды», Уфа, 2013, С. 87.

4. Orlova A., Lyupina Y., N. Sharova. Differences of expression of transcription factor Zif268, proteasome subunits and regulators in the brain stem and frontal cortex of two rat strains // Abstracts of the 30th International Congress of Clinical Neurophysiology (ICCN) of the IFCN, March 20-23, 2014, Berlin, Germany. Clinical Neurophysiology, 2014, V. 125, Supplement 1, P. S230.

5. Люпина Ю. В., Орлова А. Ш., Карпова Я. Д., Абатурова С. Д., Шарова Н. П. Особенности экспрессии иммунных протеасом в развитии иммунной и нервной систем у крыс // Тезисы докладов VII Всероссийской конференции «Протеолитические ферменты: структура, функции, эволюция», Петрозаводск, 30 июня — 4 июля 2014 г., Издательский отдел: Карельский Научный Центр РАН, С. 48.

6. Орлова А.Ш., Люпина Ю.В., Шарова Н.П. Связь субъединичного состава протеасом с обменом серотонина и дофамина в головном мозге крыс линий Август и Вистар // Тезисы докладов VII Всероссийской конференции «Протеолитические ферменты: структура, функции, эволюция», Петрозаводск, 30 июня — 4 июля 2014 г., Издательский отдел: Карельский Научный Центр РАН, С. 107.

Список сокращений

ГКГ I — главный комплекс гистосовместимости класса I;

КПА - каспазаподобная активность;

МАО — моноаминоксидаза;

УПС - убиквитин-протеасомная система;

ХПА — химотрипсинподобная активность;

ЦНС - центральная нервная система;

В2т - /32-микроглобулин;

Б А - дофамин;

БОРАС - 3, 4-диоксифенилуксусная кислота;

5-Н1АА - 5-гидроксииндолуксусная кислота;

5-НТ - серотонин;

НУА — гомованилиновая кислота.

Подписано в печать:

06.07.2015

Заказ № 10851 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autorefcrat.ru

1 5 - - 8 4 3 ?

2015675171

2015675171