Иммунные протеасомы в развитии иммунной системы и в условиях эффективного и неэффективного иммунного ответа у крыс

Карпова, Ярослава Дмитриевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммунные протеасомы в развитии иммунной системы и в условиях эффективного и неэффективного иммунного ответа у крыс
ВАК РФ 03.03.05, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Иммунные протеасомы в развитии иммунной системы и в условиях эффективного и неэффективного иммунного ответа у крыс"

На правах рукописи

005009494

Карпова Ярослава Дмитриевна

ИММУННЫЕ ПРОТЕАСОМЫ В РАЗВИТИИ ИММУННОИ СИСТЕМЫ И В УСЛОВИЯХ ЭФФЕКТИВНОГО И НЕЭФФЕКТИВНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА У КРЫС

03.03.05 «Биология развития и эмбриология» 03.03.01 «Физиология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 Я Н 8 2072

Москва - 2012

005009494

Работа выполнена в лаборатории биохимии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Научные руководители: доктор биологических

наук ШАРОВА Наталья Петровна

кандидат биологических наук ЛЮПИНА Юлия Вячеславовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, чл.-корр.

РАН

НЕМОВА Нина Николаевна (Институт биологии Кар НЦ РАН)

доктор биологических наук, профессор ЗИНОВЬЕВА Рина Дмитриевна (ИБР РАН)

Ведущая организация: Институт молекулярной

биологии им. В.А. Энгельгардта

РАН

Защита состоится 22 февраля 2012 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 при Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (http://idbras.comcor.ru)

Автореферат разослан 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н. ele0806@vandex.ru

Е.Б. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов становления иммунной системы в онтогенезе и развития иммунных реакций и иммунологической толерантности является актуальной проблемой современной биологии. Решение данной проблемы поможет понять, в какой период онтогенеза начинает функционировать иммунитет, чем определяется развитие иммунных реакций или иммунологической толерантности в ответ на появление того или иного антигена, и выявить причины различных нарушений в работе иммунной системы. В связи с этим наиболее перспективным представляется исследование иммунных протеасом, играющих ключевую роль в образовании антигенных эпитопов из чужеродных белков в клетках лимфоидных и нелимфоидных органов. Совместно с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) класса I антигенные эпитопы выносятся на поверхность клеток для представления Т-лимфоцитам СБ8+-фенотипа. В антигенпредставляющих клетках вторичных лимфоидных органов этот процесс важен для активации наивных С08+-лимфоцитов, а в клетках любого иного органа, за исключением головного мозга, - для предъявления их цитотоксическим Т-лимфоцитам. В рамках данной проблемы наиболее актуально исследование иммунных протеасом селезенки, вторичного лимфоидного органа, ответственного за развитие иммунных реакций, и печени - органа с особым иммунным статусом. Печень является местом развития иммунологической толерантности к пищевым и другим попадающим в нее антигенам, в эмбриональный период печень выполняет функции первичного лимфоидного органа. Вместе с тем, в случае инфицирования клеток печени вирусами гепатитов зараженные гепатоциты служат мишенями Т-клеточного иммунного ответа, эффективность которого определяется уровнем иммунных протеасом. Не меньший интерес представляет изучение экспрессии иммунных протеасом в клетках злокачественных опухолей при их развитии и регрессии и в клетках трансплантатов при индукции иммунологической толерантности или

в ее отсутствие. Выявление особенностей функционирования иммунных протеасом в различных иммунологических ситуациях может прояснить роль отдельных форм иммунных протеасом.

Цель работы: исследовать особенности экспрессии иммунных протеасом в развитии иммунной системы в раннем онтогенезе и в различных иммунологических ситуациях: при росте и регрессии злокачественной опухоли и трансплантации ткани яичника.

Задачи исследования:

1. Изучить динамику экспрессии и распределения иммунных протеасом в селезенке и печени крысы в раннем онтогенезе в сравнении с изменениями химотрипсин- и каспазаподобной активностей и экспрессии тотального пула протеасом.

2. Исследовать относительный уровень иммунных протеасом в печени плодов крысы после индукции воспаления у матери введением липополисахарида.

3. Выявить особенности экспрессии иммунных протеасом в карциносаркоме Walker 256 при ее росте у крыс линии WAG и при ее регрессии у крыс линии Brattleboro.

4. Исследовать относительное содержание иммунных протеасом в трансплантате ткани яичника и в печени реципиента в условиях индукции донорспецифической портальной толерантности и в ее отсутствие.

Научная новизна. Впервые изучена динамика экспрессии иммунных протеасом в селезенке и печени крысы в эмбриональном и раннем постнатальном развитии и выявлена связь этой динамики с клеточными процессами, происходящими в этих органах. Обнаружены особенности миграции В- и Т-лимфоцитов из красной пульпы в белую пульпу в развивающейся селезенке и показано, что миграция Т-лимфоцитов завершается к концу третьей постнатальной недели - именно в тот период, когда возрастает

экспрессия иммунных протеасом в гепатоцитах. Таким образом, выявлены причины неэффективности иммунитета в первые недели после рождения.

Впервые исследованы особенности функционирования иммунных протеасом в процессе регрессии опухоли (на модели карциносаркомы Walker 256, трансплантированной крысам линии Brattleboro). Показано повышение экспрессии иммунных протеасом в клетках опухоли в период, предшествующий началу ее регрессии, что может объяснить причину распознавания опухоли иммунной системой.

Впервые описана разница функций различных форм иммунных протеасом при трансплантации: иммунные протеасомы, содержащие субъединицу LMP7, важны для развития иммунных реакций и отторжения трансплантата, в то время как иммунные протеасомы, содержащие субъединицу LMP2, играют роль в развитии иммунологической толерантности и приживлении трансплантата.

Научная и практическая значимость работы. Полученные результаты важны как для понимания молекулярных механизмов становления и регуляции иммунной системы, так и для практического применения в медицине - для разработки инновационных подходов к противоопухолевой терапии и создания препаратов, регулирующих на молекулярном уровне процесс приживления трансплантатов. Результаты и выводы диссертации могут быть взяты за основу для разработки новых курсов лекций по биологии развития, физиологии и иммунологии.

Личное участие автора. Все разделы диссертации выполнены непосредственно автором или при его активном участии в лаборатории биохимии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Апробация работы. Работа прошла апробацию на VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 23-25 апреля 2007 г.), Международной научной конференции «Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки» (Минск, Беларусь, 25-26 октября 2007 г.),

Конференции «Современные проблемы биологии развития» (Москва, 14-16 ноября 2007 г.), Пятой конференции по экспериментальной и трансляционной онкологии (Краньска Гора, Словения, 26-30 марта 2008 г.), XV школе «Актуальные проблемы биологии развития» (Звенигород, 19-24 октября 2008 г.), Конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, 2007 г., 2010 г., 2011 г.), Первом международном конгрессе по исследованию рака (Анталия, Турция, 21-24 мая 2009 г.), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 23-27 июня 2009 г.), Конференции ЕМВО (Барселона, Испания, 4-7 сентября 2010 г.), Пятом Всероссийском съезде трансплантологов (Москва, 8-10 октября 2010 г.), V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 8-12 августа 2011 г.), 36-м конгрессе FEBS «Биохимия для медицины завтра» (Турин, Италия, 2530 июня, 2011 г.).

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 122 страницах, содержит 34 рисунка, 3 таблицы, 132 источника литературы. Состоит из глав: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение, Заключение, Выводы, Список литературы.

Публикации по теме диссертации. По теме диссертации опубликованы 4 статьи в журналах перечня ВАК, 3 статьи в иностранных рецензируемых журналах, 12 тезисов докладов на Российских конференциях, 5 тезисов докладов на зарубежных конференциях.

Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (гранты № 06-04-48229-а и № 09-04-00077-а) и Министерством образования и науки Российской Федерации (госконтракт № 02.512.12.2047).

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. Исследование становления иммунной системы проводили на крысах Вистар в эмбриональном развитии (Е14—Е21) и в раннем постнатальном развитии (PI—Р26). Воспаление индуцировали у беременных крыс инъекцией липополисахарида (LPS) на 12-й день беременности

внутрибрюшинно из расчета 18 мкг на 1кг веса животного. Контрольным животным вводили физиологический раствор.

Эксперименты по трансплантации проводили на 3-4-х месячных самках крыс Август и Вистар. Для индукции донор-специфической толерантности (ДСТ) крысам Август в портальную вену печени вводили 1 мл суспензии выделенных спленоцитов крыс Вистар (в количестве 1х107 клеток). Через 7 дней после этого крысам Август проводили овариоэктомию и трансплантировали неонатальные яичники крыс Вистар под капсулу левой почки (2 яичника на одного реципиента). Исследование трансплантатов и органов (печень, селезенка) осуществляли на 30-е сутки после трансплантации. В эксперименте выделяли несколько групп животных: 0 группа - интактный контроль, 1 группа - ложнооперированные животные (введение чистого физиологического раствора интрапортально и имитация трансплантации), 2 группа - животные с индукцией ДСТ и трансплантацией, 3 группа - животные с трансплантацией без индукции ДСТ.

Исследование роста и регрессии карциносаркомы Walker 256 проводили на шестимесячных самцах крыс линий Brattleboro и WAG весом 200—250 г. Крысы линии Brattleboro характеризуются инактивацией гена аргинин-вазопрессина (АВП) из-за делеции гуанина в кодирующей области и смещении рамки считывания. Физиологически нормальные крысы линии WAG использованы в качестве контрольных животных. Гомология геномных аллелей у этих линий крыс составляет более 95%. В заднюю конечность крыс внутримышечно инъецировали суспензию клеток Walker 256 (в количестве 8х105 клеток). В первые дни у крыс Brattleboro происходит развитие опухоли, а затем - ее регрессия (после 17 дней развития), у крыс WAG - только развитие (Хегай и др., 2006). Опухоли выделяли на 7, 14, 17 и 24-й дни после инъекции клеток.

Определение активностей протеасом. Химотрипсин- и каспазаподобную активности протеасом определяли по гидролизу

флуорогенных пептидов Suc-LLVY-AMC и Z-LLE-AMC, соответственно. Наличие примесных протеолитических активностей выявляли с помощью специфических ингибиторов протеасом MG132 и AdaAhx(3)L(3)VS.

Исследование экспрессии протеасом. Экспрессию тотального пула протеасом и иммунных протеасом в органах и тканях исследовали с помощью Вестерн-блоттинга с применением антител к субъединицам al,2,3,5,6,7, входящим в состав всех форм протеасом, и к иммунным субъединицам LMP7 и LMP2, соответственно. Результаты нормализовали на относительное количество ß-актина. Экспрессию иммунных протеасом в клетках исследовали с помощью иммунофлуоресцентного мечения клеток на срезах и стеклах антителами к иммунным субъединицам протеасом и клеточным маркерам. Флуоресценцию анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа DM RXA2 («Leica», Германия) и конфокального микроскопа TCS SP («Leica», Германия). Специфичность первых антител подтверждалась с помощью контролей, при которых реакция проводилась только со вторыми антителами. Отсутствие перекрестной реакции между первыми и вторыми антителами проверялось путем инкубации каждого из первых антител с противоположными вторыми антителами.

Статистический анализ. Статистическую обработку данных проводили с помощью программного приложения Excel. Данные представлены как среднее значений, полученных минимум в 3-х аналогичных экспериментах, ± стандартная ошибка. Статистическую достоверность оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа, достоверными считали различия при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Иммунные протеасомы в развитии иммунной системы у крыс 1.1. Иммунные протеасомы в развивающейся селезенке. В селезенке иммунные субъединицы LMP2 и LMP7 выявляются уже на Е21, затем

LMP7 LMP2

al, 2, 3, 5, 6, 7

кДа

E21 PO PI РЗ Р5 Р8 Р15 Е21 РО РЗ Р5

»■■■имим!«..............................lililí-''"-» _ _

Р15 PIS Р21

% 300

250 200 150 -100 -

LMP7

LMP2

200 ■ 150 100 ■ 50

jSLJSL

11 III

E21 PO PI P) P5

P15 PIS P21

E21 PO PI Pi P5 PS P15 PIS P21

Рис. 1 (А) Вестерн-блоты белков осветленных гомогенатов селезенки крыс в разные периоды эмбрионального и постнатального развития. (Б) Относительное количество (оптическая плотность блотов) исследуемых субъединиц протсасом в осветленных гомогенатах селезенки. За 100% принимали количество субъединиц LMP2 на Р15 и количество иммунной субъединицы LMP7 на Р5. *р<0,05.

происходит увеличение их количества к Р1 и более значительное увеличение -к Р18 и Р21 при постоянном тотальном пуле протеасом (Рис. 1). Подобные изменения сказываются на активностях пула протеасом: возрастает химотрипсинподобная активность, но падает каспазаподобная активность (Рис. 2). Полученный результат согласуется с литературными данными о том, что при замене протеолитических конститутивных субъединиц на иммунные субъединицы более выраженными становятся химотрипсин- и трипсинподобная активности при уменьшенной каспазаподобной активности (Rock and Goldberg, 1999). Это обусловливает способность протеасом образовывать антигенные эпитопы с нужной С-концевой аминокислотой, гидрофобной или положительно заряженной. Однако обнаруженная нами динамика изменения активностей не объясняется только

д зоо -

5 250 -

*о

Ь 200

150

!-Г-I—1—Г-4—

14 16 1820220 2 4 6 8 1012141618202224262830 182022 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

Рис. 2. Химотрипсинподобная (А, Б) и каспазаподобная (В, Г) активности протеасом в осветленных гомогенатах селезенки (Б, Г) и печени (А, В) крыс в разные периоды эмбрионального и постнатального развития. По оси абсцисс - дни развития, до 0 — эмбриональные стадии, после 0 - постнатальные. Приведены средние значения минимум трех экспериментов (± стандартная ошибка среднего), * р < 0,05.

заменой протеолитических субъединиц, но носит более сложный характер, зависящий и от других факторов, в том числе, регуляторов протеасом.

Чтобы определить, какие процессы на клеточном уровне лежат в основе изменений экспрессии иммунных протеасом, было проведено двойное иммунофлуоресцентное мечение клеток на срезах селезенки на разных стадиях раннего онтогенеза. Выявлено, что в эмбриогенезе иммунные протеасомы локализуются преимущественно в Т- и В-лимфоцитах в красной пульпе, белая пульпа остается незанятой (Рис. 3 и 4). Данный метод также позволил проследить необычную миграцию лимфоцитов в процессе формирования морфофункциональных зон селезенки. К 9-му постнатальному дню В-лимфоциты занимают маргинальную зону белой пульпы (Рис. 4), Т-лимфоциты в этот период выстраиваются плотным тяжом у маргинальной зоны, как будто

Рис. 3. Двойное иммуиофлуоресцентное мечение клеток на срезах селезенки крысы на 21-й день эмбрионального развития (А) и 4-й (Б), 9-й (В), 15-й (Г) и 19-й (Д) дни постнатального развития. Использованы поликлональные антитела кролика к LMP7 и антитела к IgG кролика, меченные CY3 (левый столбец, «красная» метка), моноклональные антитела мыши к CD3 (маркеру Т-лимфоцитов) и антитела к IgG мыши, меченные FITC (средний столбец, «зеленая» метка). Правый столбец - двойное мечение.

Рис. 4. Двойное иммунофлуоресцентное мечсние клеток на срезах селезенки крысы на 21-й день эмбрионального развития (А) и 4-й (Б), 9-й (В) и 19-й (Г) дни постнатального развития. Использованы поликлональные антитела кролика к LMP7 и антитела к IgG кролика, меченные CY3 (левый столбец, «красная» метка), моноклоналъные антитела мыши к CD45RA (маркеру B-лимфоцитов у крыс) и антитела к IgG мыши, меченные FITC (средний столбец, «зеленая» метка). Правый столбец - двойное мечение.

готовясь к «прыжку», в конце третьей недели «прыжок» завершается, нам удалось увидеть Т-лимфоциты в процессе «прыжка» (Рис. 3). Изучению формирования белой пульпы селезенки у млекопитающих, в том числе у крыс, посвящен ряд работ (Veerman, 1975; Dijkstra and Dopp, 1983, van Rees, et al., 1990; Fu and Chaplin, 1999). Основное внимание в этих работах уделено изучению последовательности накопления различных субпопуляций

лимфоцитов в белой пульпе. Нам впервые удалось не только исследовать распределение иммунных протеасом в клетках селезенки в раннем развитии, но и описать особенности миграции Т- и В-лимфоцитов из красной пульпы в белую в процессе ее формирования. У взрослых животных Т- и В-лимфоциты поступают из первичных лимфоидных органов с током крови и лимфы непосредственно в белую пульпу (Dullmann, et al., 2006). Наши результаты указывают на то, что в раннем постнатальном развитии красная пульпа служит помощником для формирования белой пульпы. Обнаруженный нами относительно высокий уровень иммунных протеасом в В-лимфоцитах связан, по-видимому, с их ролью антиген-представляющих клеток. В Т-лимфоцитах, иммунные протеасомы выполняют другую функцию, а именно участвуют в контроле пролиферативной активности лимфоцитов (Caudill, 2006).

1.2. Иммунные протеасомы в развивающейся печени. В печени иммунные протеасомы с субъединицами LMP7 и LMP2 не обнаруживаются методом Вестерн-блоттинга на 14-й день эмбрионального развития, но отчетливо выявляются на El6, их количество возрастает к El8 и остается на этом уровне до РЗ, немного снижается к Р5. Значительное увеличение уровня иммунных протеасом наблюдается к концу третьей постнатальной недели, становится наибольшими по сравнению с ранними сроками (Рис. 5). Тотальный пул протеасом не меняется.

Химотрипсин- и каспазаподобная активности также, как и в селезенке, претерпевают изменения в раннем развитии печени, и эти изменения носят сложный характер (Рис. 2). Важно отметить общую черту: и в печени и в селезенке обе активности имеют «провал» в период между постнатальными 1012-м днями. Как это можно объяснить? Известно, что период полужизни протеасом в норме составляет 12-15 дней (Tanaka, Ichihara, 1989). Возможно, что в указанный период происходит истощение старых пулов протеасом в печени и селезенке и начало сборки новых протеасом.

al, 2. 3,5. 6, 7

1-29-

:оо

ISO 160 140

i:o

100

LMP 7

Ii4 * Îl

E14 El6 EIS E21 PI P3 P5 PS P12 P15 PIS P21

LMP2

60 40

E14 E16 EIS E21 PI P3 P5 PS P12 P15 PIS P21

Рис. 5. (А) Вестерн-блоты белков осветленных гомогенатов печени крыс в разные периоды эмбрионального и постнатального развития. (Б) Относительное количество (оптическая плотность блотов) исследуемых субъединиц протеасом в осветленных гомогенатах печени. За 100% принимали количество субъединиц LMP7 и LMP2 на Р3.*р<0,05.

Для того, чтобы объяснить, чем обусловлены изменения экспрессии иммунных протеасом в раннем развитии печени крысы, было проведено иммунофлуоресцентное мечение клеток на срезах печени антителами к иммунным субъединицам LMP7 или LMP2, маркеру B-лимфоцитов CD45RA или маркеру Т-лимфоцитов CD3 и вторыми флуоресцентными антителами. Оказалось, что на Е14 в гепатоцитах слабо выявляются иммунные протеасомы, лимфоциты на этом сроке в печени не обнаруживаются. На 21-й эмбриональный день в печени присутствуют Т- и B-лимфоциты, причем количество иммунных протеасом в В-лимфоцитах превышает их содержание в Т-клетках, интенсивность флуоресценции которых находится практически на одном уровне с интенсивностью флуоресценции гепатоцитов. На РЗ в печени присутствуют и Т-, и B-лимфоциты, причем с тем же содержанием в них

иммунных протеасом, что и на Е21 (Рис. 6). Оба типа клеток исчезают к Р8.

Рис. 6. Двойное иммунофлуоресцентное мечение клеток на срезах печени крысы

(А-Г) - 14-й, (Д-3) - 21-й дни эмбрионального и (И-М) - 3-й дни постнатального развития. (А, В, Д, Ж, И, Л) - поликлональные антитела кролика к LMP7 и антитела к IgG кролика, меченные Alexa 546; (Б, Е, К) - моноклональные антитела мыши к CD3 и (Г, 3, M) - CD45RA и антитела к IgG мыши, меченные Alexa 488.

Таким образом, первый период подъема уровня иммунных протеасом в печени, обнаруженный Вестер-блоттингом, связан с присутствием в печени В-лимфоцитов, обогащенных иммунными протеасомами. Кроме того, в эмбриональном и постнатальном развитии печени иммунные протеасомы содержатся в макрофагах и эндотелиальных клетках синусоидов (Рис. 8). Возможно, отдельные формы иммунных протеасом играют в этих клетках роль, не связанную с функцией представления антигена, поскольку была выявлена разница в распределении иммунных протеасом, содержащих субъединицу LMP7, и иммунных протеасом, содержащих субъединицу LMP2, в макрофагах. Субъединица LMP7 располагается равномерно по цитоплазме макрофага, в то время как субъединица LMP2 локализуется в околомембаранной цитоплазме, в

Е21

PI5

PI 5

1 \И'~ 1 f ЮОцт Ч !

IAHT Ч S

♦

10цт

IM!" / ч Ш Юмт 0ls;.i. Ы» %t

i MF2 ШГ

g if

7» y» 0 Юцт

Рис. 7. Распределение субъединиц иммунных протеасом ЬМР2 и ЬМР7 по цитоплазме макрофага печени на Е21

(макрофаги указаны белыми стрелками, определялись по экспрессии

специфического маркера). Использовались антитела к субъединицам ЬМР7 и соответствующие вторые антитела, меченные А1еха 488.

Рис. 8. Двойное иммунофлуоресцентное мечение мононуклеарных клеток печени крысы на Е21 и Р15. Использованы антитела к субъединицам LMP7 и соответствующие вторые антитела, меченные Alexa 488, и антитела к SE-1 (маркера эндотелиальных клеток синусоида печени) или антитела клона His36 (маркера тканевых макрофагов) и соответствующие вторые антитела, меченные Alexa 546.

выростах и псевдоподиях макрофага (Рис. 7). С чем связано такое распределение иммунной субъединицы LMP2 остается неясным, но указывает на ее особое значение и уникальность выполняемых функций, возможно, в ослаблении окислительного стресса. Иммунные протеасомы выявлены нами и в гепатоцитах. Причем в процессе развития печени происходит значительное увеличение количества иммунных протеасом в гепатоцитах, что следует из резкого повышения интенсивности флуоресценции на Р21 по сравнению с РЗ и Р8 (данные не приведены). Эти результаты подтверждают результаты, полученные с помощью Вестерн-блоттинга. Итак, увеличение экспрессии иммунных протеасом в гепатоцитах происходит в тот период, когда завершается формирование функциональной Т-зоны белой пульпы селезенки. Иными словами, Т-клеточный иммунный ответ по отношению к гепатоцитам со стороны селезенки у крыс возможен начиная с третьей постнатальной недели.

El? conlr

EI7 LPS

E19 conlr

EI9 LPS

LMP7

1.MP2

a 1,2,3,5,6,7 ЩШ

кДа

— 29

— 20 — 29

Рис. 9. (А) Вестерн-блоты осветленных гомогенатов печени плодов крыс на Е17 и Е19 после введения LPS матери на 12 день беременности и печени плодов контрольных животных. (Б) Относительное количество (оптическая плотность блотов) исследуемых субъединиц протеасом в осветленных гомогенатах печени. За 100% принимали количество субъединиц группы Е19 LPS. *р<0,05.

о «

—

е.

о X t—<

120 100 80 60 40 20 0

LMP7

El 7 conti

Е Г LPS

rib

ЕЮ conti

Е19 LPS

LMP2

EIS conti

E19 LPS

1.3. Иммунные протеасомы при воспалении в эмбриональном развитии.

Вместе с тем, важно понять, возможно ли увеличение экспрессии иммунных протеасом в эмбриональной печени при воспалении подобно тому, что происходит у взрослых особей. Для ответа на этот вопрос самкам на 12-й день беременности вводили LPS и через 5 и 7 дней исследовали изменения в пуле протеасом печени плодов. Оказалось, что повышенная экспрессия иммунных протеасом при воспалении возможна в печени уже на 17 и 19 день эмбрионального развития (Рис. 9), несмотря на то, что вторичные лимфоидные органы в этот период еще не сформированы. Полученный результат указывает на высокую пластичность иммунных реакций на уровне иммунных протеасом.

2. Иммунные протеасомы при трансплантации в условиях индукции донорспецифической портальной толерантности и в ее отсутствие

Одной из экспериментальных моделей неэффективного и эффективного иммунного ответа служила трансплантация ткани яичника крысам в условиях

200цт

Рис. 10. Трансплантаты овариальной ткани на 30-е сут после трансплантации: А -

отторгнутый трансплантат 3-й группы животных (аллотрансплантация); Б -прижившийся трансплантат 2-й группы животных (предтрансплантационное введение спленоцитов и аллотрансплантация). Трансплантаты указаны стрелками.

индукции ДСТ и в ее отсутствие, соответственно. На основании гистологического исследования (Рис. 10) и анализа гормонального уровня сделано заключение, что при аллотрансплантации ткани яичника под капсулу почки крысам без индукции ДСТ развивается острое отторжение трансплантата, а у животных с индукцией ДСТ установлена хорошая выживаемость трансплантата. Обнаружено увеличение общего пула протеасом и содержания иммунных протеасом с субъединицей LMP7 и иммунных протеасом с субъединицей LMP2 в селезенке как ложнооперированных, так и неиндуцированных и индуцированных животных по сравнению с нативным контролем. Этот факт, скорее всего, связан с иммунными реакциями, развивающимися в селезенке в ответ на оперативное вмешательство (Рис. 11). Принципиально иные результаты получены при исследовании печени и трансплантатов у крыс различных групп. Так, в печени животных с индукцией ДСТ происходит увеличение экспрессии субъединицы LMP2 иммунных протеасом по сравнению с печенью животных контрольных групп и неиндуцированных животных. Напротив, количество субъединицы LMP7 иммунных протеасом наиболее высоко в печени крыс без индукции ДСТ. Похожая картина наблюдается в трансплантатах овариальной ткани (Рис. 11). Общий пул иммунных протеасом, увеличенный в трансплантатах опытных групп животных по сравнению с контрольными неонатальными яичниками, обогащен иммунной субъединицей LMP2 в прижившемся трансплантате и LMP7 - в отторгнувшемся. Тотальный пул протеасом при этом постоянен. Мы связываем увеличение количества иммунной субъединицы LMP2 в печени и

трансплантате с развитием портальной иммунологической толерантности и приживлением трансплантата, а увеличение количества иммунной субъединицы LMP7 - с развитием иммунного ответа и отторжением трансплантата.

LMP7

Трансплантат

Печень шц, .пиши

кДа 29

LMP2

al,2,3,5,6,7/ сс5

20 29

5000 4000 3000 2000

Трансплантат *

L о

* йй ЯШ *

250

Печень

200

150

100 il « I

50 В ■

0 H L 1

Селезенка

LMP7

LMP2

a 1,2,3,5,6,7/ a5

Рис. 11. Вестерн-блоты осветленных гомогенатов овариальной ткани и печени (А), селезенки (В) Относительное количество (оптическая плотность блотов) LMP7, LMP2 и субъединиц a овариальной ткани и печени (Б), селезенки (Г). За 100% принимали количество субъединиц 0 группы. По оси абсцисс - группы животных. Выравнивали на относительное количество р actin. Обозначены достоверные отличия при р < 0,05 по сравнению с группой 0 * и группой 2 ".

3. Иммунные протеасомы при росте и регрессии опухоли.

Второй экспериментальной моделью неэффективного и эффективного иммунного ответа служили рост карциносаркомы Walker 256 у физиологически нормальных крыс WAG и ее регрессия у крыс Brattleboro, дефектных по синтезу аргинин-вазопрессина, соответственно. Показано, что экспрессия тотального пула протеасом и субъединиц LMP7 и LMP2 не изменяется в опухоли между 7-м и 24-м днями после имплантации крысам WAG. При этом в клетках опухоли практически не выявляются молекулы ГКГ класса I (Рис. 12). В опухоли, имплантированной крысам Brattleboro, наоборот, происходит увеличение экспрессии тотального пула протеасом и субъединиц LMP7 и LMP2 между 7-ми 14-м днями и достигает максимального значения в период между 14-м и 17-м днями после введения опухолевых клеток, то есть в период, предшествующий началу регрессии опухоли. Одновременно с увеличением экспрессии иммунных протеасом в клетках опухоли повышается уровень

Рис. 12. Вестерн-блоты белков осветленных гомогенатов опухоли Walker 256, выделенной на разных сроках после введения исходных опухолевых клеток крысам линий Brattleboro и WAG. Представлено относительное количество (оптическая плотность блотов) исследуемых субъединиц протеасом: LMP7 и LMP2. *р<0,05.

молекул ГКГ класса I (Рис. 12). Таким образом, низкий уровень молекул ГКГ класса I и иммунных протеасом связан с неэффективностью системы продукции и представления антигена. Увеличение же уровня иммунных протеасом и молекул ГКГ класса I в опухоли у крыс линии Brattleboro способствует восстановлению нормальной продукции антигена и, как следствие, полной регрессии опухоли.

ВЫВОДЫ

1. В печени и селезенке крысы в развитии увеличивается доля иммунных протеасом, включающих субъединицы LMP7 и LMP2, при постоянном общем количестве протеасом.

2. В селезенке увеличение содержания иммунных протеасом обусловлено миграцией обогащенных ими В- и Т-лимфоцитов, постепенно заполняющих белую пульпу селезенки. В печени этот процесс осуществляется за счет изменения ее клеточного состава и увеличения экспрессии иммунных протеасом в гепатоцитах.

3. Возрастание доли иммунных протеасом в общем пуле сопровождается нелинейными изменениями химотрипсин- и каспазаподобной активностей. Спад активностей в обоих органах на 10-12-й дни постнатального развития отражает процесс деградации старого пула и наработку новых протеасом.

4. Увеличение уровня иммунных протеасом в печени крысы при воспалении возможно уже в эмбриональном развитии в ответ на введение в организм матери липополисахарида.

5. Обнаружена связь между судьбой опухоли и содержанием в ней иммунных протеасом. Так, у физиологически нормальных крыс линии WAG карциносаркома Walker 256 развивается при постоянном содержании в ней иммунных протеасом. У крыс линии Brattleboro, дефектных по синтезу аргинин-вазопрессина, значительно повышается уровень иммунных протеасом в клетках карциносаркомы Walker 256 в период, предшествующий ее регрессии.

6. При индукции донорспецифической портальной толерантности происходит приживление трансплантата и обогащение его клеток иммунными протеасомами с субъединицей LMP2. Иммунный ответ против трансплантата, напротив, сопряжен с его обогащением иммунными протеасомами с субъединицей LMP7. Подобная зависимость обнаружена и для клеток печени.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах перечня ВАК

1. Мельникова В.И., Карпова Я.Д., Афанасьева М.А., Захарова Л.А. Шарова Н.П. Иммунные протеасомы в формирующейся селезенке крысы // Известия РАН. Серия биологическая. 2008. № 2. С. 163—168.

2. Шарова Н.П., Мельникова В.И., Хегай И.И., Карпова Я.Д., Дмитриева С.Б., Астахова Т.М., Афанасьева М.А., Попова Н.А., Иванова Л.Н., Захарова Л.А. Особенности экспрессии протеасом в клетках опухоли Walker 256 после их трансплантации крысам Brattleboro с генетическим дефектом синтеза вазопрессина // Докл. РАН. 2008. Т. 419, № 6. С. 833—837.

3. Шарова Н.П., Астахова Т.М., Карпова Я.Д., Абатурова С.Б., Люпина Ю.В., Богомягкова Ю.В., Абрамова Е.Б., Ерохов П.А. Множественные формы протеасом как мишени противоопухолевых лекарств нового поколения // Онкохирургия. 2011. Т. 3. № 2. С. 37—42.

4. Божок Г.А., Карпова Я.Д., Люпина Ю.В., Легач Е.И., Богомягкова Ю.В., Бондаренко Т.П., Шарова Н.П. Возможная роль протеасом печени в реализации механизмов трансплантационной толерантности. Вестник трансплантологии и искусственных органов //2011. Т. XIII. №3. С. 73—81.

Статьи в иностранных рецензируемых журналах

1. Шарова Н.П., Астахова Т.М., Дмитриева С.Б., Мельникова В.И., Афанасьева М.А., Карпова Я.Д., Захарова Л.А. Роль иммунных протеасом в молекулярных механизмах становления иммунитета // Известия Национальной Академии Наук Беларуси. Серия медицинских наук. 2008. № 1. С. 106—111.

2. Sharova N.P., Zakharova L.A., Astakhova Т.М., Karpova Ya.D., Melnikova V.I., Dmitrieva S.B., Lyupina Yu.V., Erokhov P.A. New approach to study of T cellular immunity development: Parallel investigation of lymphoid organ formation and changes in immune proteasome amount in rat early ontogenesis // Cell. Immunol. 2009. V. 256. P. 47—55.

3. L.A. Zakharova, I.I. Khegai, N.P. Sharova, V.I. Melnikova, Y.D. Karpova, T.M. Astakhova, N.A. Popova, L.N. Ivanova. Pattern of MHC class I and immune proteasome expression in Walker 256 tumor during growth and regression in Brattleboro rats with the hereditary defect of arginine-vasopressin synthesis // Cell. Immunol. 2011. V. 271. P. 385—391.

Заказ № 320-1 /01/2012 Подписано в печать 18.01.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

/^СГ^ 000 "Цифр081™*" тел' (495) 649-83-30

V )) \v\vw. ф. ги; е-таИ:гак@с/г. ги

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Карпова, Ярослава Дмитриевна, Москва

61 12-3/482

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

на правах рукописи

Карпова Ярослава Дмитриевна

ИММУННЫЕ ПРОТЕАСОМЫ В РАЗВИТИИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ И В УСЛОВИЯХ ЭФФЕКТИВНОГО И НЕЭФФЕКТИВНОГО ИММУННОГО

ОТВЕТА У КРЫС

03.03.05 «Биология развития и эмбриология» 03.03.01 «Физиология»

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: Н.П. Шарова, доктор биологических наук Ю.В. Люпина, кандидат биологических наук

Москва-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................8

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................12

1 Структура протеасомы и ее функционирование.................................12

1.119Б субчастица.........................................................................12

1.2 20Б субчастица.......................................................................14

1.3 Убиквитинирование белка-субстрата...........................................16

1.4 Биогенез 208 протеасом............................................................18

2 Иммунные протеасомы и их функции.............................................18

2.1 Иммунные протеасомы, строение и сборка....................................18

2.2 Участие иммунных протеасом в образовании антигенного эпитопа .. ..20

2.3 Участие иммунных протеасом в запуске сигнала на уничтожение дефектных клеток........................................................................21

2.4 Участие иммунных протеасом в образовании антигенных эпитопов из ВЮРэ..........................................................................................22

2.5 Участие иммунных протеасом в активации наивных СИ8 Т-лимфоцитов................................................................................22

2.6 Участие тимопротеасом в положительной селекции тимоцитов.......23

2.7 Участие иммунных протеасом в отрицательной селекции тимоцитов. .24

2.8 Неиммунные функции иммунных протеасом...................................24

3 Лимфоидные органы иммунной системы и нелимфоидные органы .........25

3.1 Взаимоотношения между центральными и периферическими органами иммунной системы и нелимфоидными органами...................................25

3.2 Строение селезенки..................................................................25

3.3 Строение печени......................................................................27

3.4 Особенности иммунитета печени................................................29

3.4.1 АПК клетки печени и специфический иммунный ответ...................31

3.4.2 Неспецифический иммунный ответ в печени.................................33

3.5 Возможная роль протеасом в развитии портальной толерантности ...35 4. Липополисахарид - индуктор воспалительного процесса.....................36

5 Иммунные протеасомы и злокачественные опухоли............................37

5.1 Иммунные протеасомы в развитии раковых опухолей.......................37

5.2 Особенности роста и регрессии опухоли Walker 256, трансплантированной крысам линии Brattleboro..................................39

6 Заключение...............................................................................41

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................42

1 Животные и схемы экспериментов..................................................42

1.1 Схема работы по исследованию иммунных протеасом в раннем развитии....................................................................................42

1.2 Схема работы по исследованию иммунных протеасом в развитии донор-специфической иммунологической портальной толерантности...............42

1.3 Схема работы по исследованию иммунных протеасом при росте и регрессии злокачественной опухоли Walker 256у крыс линий WAG и Brattleboro..................................................................................45

2 Получение осветленных гомогенатов органов....................................45

3 Определение активностей протеасом...............................................46

4 Вестерн-блоттинг.......................................................................48

5 Приготовление криостатных срезов органов и последующее иммунофлуоресцентное окрашивание................................................49

6 Выделение мононуклеарных клеток печени.......................................50

7 Проточная цитометрия.................................................................50

8 Статистический анализ................................................................50

РЕЗУЛЬТАТЫ.............................................................................51

1 Протеасомы в раннем развитии селезенки и печени крысы...................51

1.1 Изменение уровня иммунных протеасом, 1 ЯБ-активатора протеасом и тотального пула протеасом в раннем развитии печени и селезенки крысы .51

1.2 Химотрипсин- и каспазаподобная активности протеасом в раннем развитии печени и селезенки крыс....................................................54

1.3 Распределение иммунных протеасом по клеткам селезенки и печени ....56

1.3.1 Иммуногистохимическое исследование клеток на срезах селезенки ....56

1.3.2 Иммуногистохимическое исследование клеток на срезах печени........63

1.3.3. Иммуноцитохимическое исследование мононуклеарных клеток

печени........................................................................................67

1.4 Изменение количества иммунных протеасом в печени плода при индукции воспаления у матери инъекцией LPS..................................................69

2 Иммунные протеасомы при индукции донорспецифической толерантности..............................................................................71

2.1 Уровень половых гормонов у различных групп животных...................71

2.2 Гистологическая картина трансплантатов на 30 сутки...................71

2.3 Содержание протеасом в селезенке, печени и аллотрансплантате яичника......................................................................................74

2.4 Активность протеасом в селезенке, печени и аллотрансплантате яичника......................................................................................76

2.5 Иммуногистохимическое исследование аллотрансплантата яичника ...78

3 Протеасомы в опухоли Walker 256 у крыс линий WAG и Brattleboro.......79

3.1 Протеасомы в опухоли Walker 256у крыс линии Brattleboro...............80

3.2 Протеасомы в опухоли Walker 256у крыс линии WAG.......................80

3.3 Экспрессия молекул МНС класса I в опухоли Walker 256у крыс линии

Brattleboro и WAG.........................................................................81

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ......................................................85

1. Иммунные протеасомы в раннем онтогенезе иммунной системы..........86

1.1 Иммунные протеасомы в развивающейся селезенке..........................86

1.1.1 Изменение количества иммунных протеасом в развивающейся селезенке.....................................................................................86

1.1.2 Активность протеасом в развивающейся селезенке......................87

1.1.3 Иммунные протеасмоы в клетках формирующейся селезенки..........89

1.1.4 Особенности формирования морфофункциональных зон селезенки.. .91

1.2 Иммунные протеасомы в развивающейся печени.............................93

1.2.2 Количество иммунных протеасом в развивающейся печени............93

1.2.2 Активность протеасом в развивающейся печени.........................94

1.1.3 Иммунные протеасмоы в клетках формирующейся печени............95

1.3 Заключение: возможные особенности работы иммунной системы в раннем развити, связанные с функционированием иммунных

протеасом...................................................................................99

1.4. Иммунные протеасомы при индукции воспаления в эмбрионалном

развитии.................................................................................100

2 Иммунные протеасомы при эффективном и неэффективном иммунном ответе.....................................................................................100

2.1 Иммунные протеасомы в развитии донорспецифической

толерантности........................................................................100

2.1.1. Иммунные протеасомы в селезенке, печени и трансплантатах при

развитии ДСТ...........................................................................101

2.1.2 Активность протеасом в исследуемых органах при развитии ДСТ.........................................................................................103

2.2 Иммунные протеасомы при росте и регрессии опухоли......................104

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..........................................................................106

ВЫВОДЫ.................................................................................108

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................109

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АВП - Аргинин-вазопрессин

АПК - Антигенпредставляющие клетки

АТФ - Аденозинтрифосфат

ДНК - Дезоксирибонуклеиновая кислота

ДСТ - Донорспецифическая толерантность

мРНК - матричная Рибонуклеиновая кислота

ПААГ - Полиакриламидный гель

ЭДТА- Этилендиаминтетрауксусная кислота

сАМР - cyclic Adenosin monophosphate

CD - Cluster of differentiation

DRiPs - Defective ribosomal products

ECL - Enhanced chemiluminescence

FITC - Fluorescein isothiocyanate

Foxp3 - Forkhead box P3

cGMP - cyclic Guanosine monophosphate

GTP - Guanosine triphosphate

HSC - Hepatic stellate cells

IgG - Immunoglobulin type G

IFN - Interferon

IkK - IkB kinase

IL - Interleukin

INK - c-Jun N-terminal kinases КС - Kupffer cells

KIRs - Killer immunoglobulin-like receptors LMP - Low molecular mass polypeptide LPS - Lipopolysaccharide LSEC - Liver sinusoidal endothelial cells МАРК - Mitogen-activated protein kinase MHC - Major histocompatibility complex

MICA - MHC class I polypeptide-related sequence A

NF-kB - Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells

NK - Natural killer cells

NKG2 - Natural killer G2 receptors

NKT - Natural killer T-cells

NKp46 - Natural killer p46 receptors

PALS - Periarteriolar lymphoid sheath

PBS - Phosphate buffered saline

PD-1 - Programmed Death 1

PD-1L - Programmed Death lligand

PE - Phycoerythrin

PGE2 - Prostaglandin E2

15d-PGJ2 - 15-Deoxy-Delta-l2,14-prostaglandin J2

POMP - Proteasome maturation protein

RDPs - Rapidly degraded polepetides

RT1A - Rano class 1 histocompatibility antigen A

SDPs - Slowly degraded polepetides

SDS - Sodium dodecyl sulfate

SE-1 - Sinusoidal endothelial cells

TAP - Transporter associated with antigen presentation

TCR - T-cells receptor

TGF-ß - Transforming growth factor ß

TLR - Toll-like receptors

Treg - T regulatory cells

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов становления иммунной системы в онтогенезе и развития иммунных реакций и иммунологической толерантности является актуальной проблемой современной биологии. Решение данной проблемы поможет понять, в какой период онтогенеза начинает функционировать иммунитет, чем определяется развитие иммунных реакций или иммунологической толерантности в ответ на появление того или иного антигена, и выявить причины различных нарушений в работе иммунной системы. В связи с этим наиболее перспективным представляется исследование иммунных протеасом, играющих ключевую роль в образовании антигенных эпитопов из чужеродных белков в клетках лимфоидных и нелимфоидных органов. Совместно с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) класса I антигенные эпитопы выносятся на поверхность клеток для представления Т-лимфоцитам СБ8+-фенотипа. В антигенпредставляющих клетках вторичных лимфоидных органов этот процесс важен для активации наивных СБ8+-лимфоцитов, а в клетках любого иного органа, за исключением головного мозга, - для предъявления их цитотоксическим Т-лимфоцитам. В рамках данной проблемы наиболее актуально исследование иммунных протеасом селезенки, вторичного лимфоидного органа, ответственного за развитие иммунных реакций, и печени - органа с особым иммунным статусом. Печень является местом развития иммунологической толерантности к пищевым и другим попадающим в нее антигенам, в эмбриональный период печень выполняет функции первичного лимфоидного органа. Вместе с тем, в случае инфицирования клеток печени вирусами гепатитов зараженные гепатоциты служат мишенями Т-клеточного иммунного ответа, эффективность которого определяется уровнем иммунных протеасом. Не меньший интерес представляет изучение экспрессии иммунных протеасом в клетках злокачественных опухолей при их развитии и

регрессии и в клетках трансплантатов при индукции иммунологической толерантности или в ее отсутствие. Выявление особенностей функционирования иммунных протеасом в различных иммунологических ситуациях может прояснить роль отдельных форм иммунных протеасом.

Цель работы - исследовать особенности экспрессии иммунных протеасом в развитии иммунной системы в раннем онтогенезе и в различных иммунологических ситуациях: при росте и регрессии злокачественной опухоли и трансплантации ткани яичника.

Задачи:

образом, выявлены причины неэффективности иммунитета в первые недели после рождения.

(Москва, 14-16 ноября 2007 г.), Пятой конференции по экспериментальной и трансляционной онкологии (Краньска Гора, Словения, 26-30 марта 2008 г.), XV школе «Актуальные проблемы биологии развития» (Звенигород, 19-24 октября 2008 г.), Конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, 2007 г., 2010 г., 2011 г.), Первом международном конгрессе по исследованию рака (Антапия, Турция, 21-24 мая 2009 г.), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 23-27 июня 2009 г.), Конференции ЕМВО (Барселона, Испания, 4-7 сентября 2010 г.), Пятом Всероссийском съезде трансплантологов (Москва, 8-10 октября 2010 г.), V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 8-12 августа 2011 г.), 36-м конгрессе БЕВ8 «Биохимия для медицины завтра» (Турин, Италия, 25-30 июня, 2011 г.).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 Структура протеасомы и ее функционирование

Для нормальной жизнедеятельности и функционирования клетки необходимо громадное количество правильно работающих белков. Белок, который имеет неправильную структуру из-за мутации или ошибки в синтезе, или тот, который уже отработал и больше не нужен клетке, необходимо вовремя уничтожить. В противном случае это может закончиться летально как для клетки, так и для всего организма. Функцию разрушения таких внутриклеточных белков выполняют специализированные мультисубъединичные белковые комплексы - протеасомы (Coux et al., 1996). Протеасомы обладают несколькими протеазными активностями и в клетках эукариот представлены множественными субтипами.

26S протеасома состоит из трех частей: 20S внутренней (коровой) части и двух 19S субчастиц, расположенных с двух сторон от коровой части (рис. 1А). 19S субчастица связывает, подготавливает к гидролизу и «проталкивает» белок-субстрат в 20 S субчастицу, в которой и происходит его деградация. Протеасома не способна сама распознать белок, который нужно гидролизовать. Для этого он метится специальной системой ферментов цепочкой из не менее четырех белков-убиквитинов. Рассмотрим подробнее строение 26S протеасомы.

1.119S субчастица.

19S субчастица состоит из 17 субъединиц, гетерогенных по молекулярной массе, аминокислотной последовательности и структуре (Voges et al., 1999). В состав этой субчастицы входят два комплекса: base и lid (основной комплекс и крышка), выполняющие различные функции. Base-комплекс состоит из девяти субъединиц (Rptl-Rpt6, Rp

Информация о работе

Карпова, Ярослава Дмитриевна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.03.05

Диссертация

Иммунные протеасомы в развитии иммунной системы и в условиях эффективного и неэффективного иммунного ответа у крыс - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы