Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль протеасом и их субъединиц α-типа в гидролизе РНК и сплайсинге

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль протеасом и их субъединиц α-типа в гидролизе РНК и сплайсинге"

На правах рукописи

Федорова

Ольга Андреевна

РОЛЬ ПРОТЕАСОМ И ИХ СУБЪЕДИНИЦ а-ТИПА В ГИДРОЛИЗЕ РНК И

СПЛАЙСИНГЕ 03.01.03. - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 МАЙ 2012

Санкт-Петербург 2012

005016493

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук

Научный руководитель:

Барлсв Николай Анатольевич,

доктор биологических наук Институт цитологии РАН, заведующий лабораторией

Официальные оппоненты:

Корнилова Елена Сергеевна,

доктор биологических наук, профессор Институт цитологии РАН, заведующий лабораторией

Трибулович Вячеслав Генрихович,

кандидат химических наук НИИ гриппа РАМН, старший научный сотрудник

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский государственный университет, биолого-почвеїпіьій факультет

Защита диссертации состоится «25» мая 2012 года в 14 часов на заседании

Диссертационного совета Д.002.230.01 на базе Института цитологии РАН по адресу:

194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий проспект, д. 4

e-mail: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru

Сайт: http://www.cytspb.rssi.ru

Факс: 8(812)297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан » апреля 2012 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, , 4г,

кандидат биологических наук Е.В.Каминская

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1 Актуальность проблемы

Протеасома - это мультисубъединичный белковый комплекс, одна из главных задач которого в клетке состоит в направленной и специфической деградации белков. Изучение роли протеасом в различных клеточных процессах приобретает все большую актуальность в связи с многочисленными экспериментальными данными об их участии в процессах раковой трансформации, старения и нейродегенерации. Модуляция активности протеасом влияет на клеточные процессы, такие как транскрипция, прохождение по клеточному циклу, репарация ДНК, дифференцировка, развитие, иммунный ответ (Wojcik et al., 2000; Pajonk, McBride, 2001; Glickman, Ciechanover, 2002; Collins, Tansey, 2006; Maupin-Furlow et al., 2006; Reed, 2006; Sikder et al., 2006; Fcrdous et al., 2007).

Под термином протеасома или 26S протеасома обычно подразумевают белковый комплекс, состоящий из 20S корового комплекса (CP или 20S протеасома) и 19S регуляторного комплекса (RP, также известного как 19S протеасома или РА700) (Groll et al., 2005; Nickel] et al., 2009). Коровый комплекс является каталитическим центром 26S протеасомы и представляет собой полый цилиндр, состоящий из четырех гептамерных колец. Каждое кольцо образуется семью гомологичными, но не одинаковыми субъединицами. Два внешних кольца состоят из семи а-субъединиц (а1-а7) и формируют "ворота", через которые входят субстраты и высвобождаются продукты. "Ворота" корового комплекса ограничивают размер субстрата, который способен проникать внутрь протеолитической камеры. Два внутренних кольца образованы семью ß-субъединицами (ßl-ß7) (Lupas and Baumeister, 1997; Voges et al., 1999). Известно, что субъединицы ßl(Y), ß2(Z), ß5(X) обладают каспазо-, трипсино- и химотрипсиноподобной активностью, соответственно (Heinemeyer et al., 1997).

Наиболее известной функцией протеасом является убиквитин-зависимый протеолиз белков, однако в начале 1990-х годов впервые было показано, что протеасома способна расщеплять некоторые белки без предварительного убиквитинилирования. Эксперименты показали, что к таким белкам относятся: c-Jun (Jariel-Encontre et al., 1995), кальмодулин (Tarcsa et al., 2000), тропонин С (Benaroudj et al., 2001), ингибитор циклин-зависимых киназ p21Cipl (Sheaff et al., 2000), опухолевый супрессор p53 (Asher et al., 2002).

Более детальное изучение этого процесса показало, что такие белки как кристаллин аВ (Boelens et al., 2001), ингибитор циклин-зависимых киназ p21 (Touitou et al., 2001), коакгиватор стероидного рецептора (SRC-3) (Yi et al., 2008) и опухолевый супрессор Rb (Sdek et al., 2005) деградируют без предварительного убиквитинилирования через связывание с субъединицей al.

В 1989 году впервые было показано, что протеасомы обладают эндорибонуклеазной активностью (Tsukahara et al., 1989). Дальнейшие исследования доказали, что 20S протеасомы, выделенные из подсолнечника, были способны расщеплять РНК вируса табачной мозаики и вируса мозаики салата (Ballut et al., 2003). Далее было показано, что РНКазной активностью обладают также 26S протеасомы, выделенные из клеток линий человека А431 и К562, при этом субстратом для расщепления могут быть различные РНК эукариот - как рибосомные, так и специфические информационные (Евтеева и др., 2000; Миттенберг и др., 2002; Kulichkova et al, 2010). Установлено также, что протеасомы сами содержат низкомолекулярные РНК, которые формируют гетерогенную популяцию молекул с длиной от 20 до 120 иуклеотидов (Pamnani et al., 1994; Schmid et al., 1995). Однако происхождение и природа этих РНК до конца не известна.

Регуляция протеолитических и эндорибонуклеазных функций протеасом может осуществляться с помощью дополнительных белков, которые ассоциированы с протеасомами. Недавние исследования показали, что существует ряд дополнительных белков, которые связаны с 26S протеасомами (Verma et al., 2000; Wang et al., 2007). Эти белки могут быть условно разделены на две группы: факторы, относящиеся к системе убиквитинилирования, и белки, которые регулируют функции протеасом. К первой группе белков относятся деубиквитиншшрующие ферменты (USP14 и Uch37) (Demartino and Gillette, 2007), ЕЗ лигазы (Hul5/KIAA10, Е6АР и Parkin), а также некоторые Е2 лигазы (Ubc 1, 2, 3, 4 и 5) (Demartino and Gillette, 2007). Функции белков, относящихся ко второй группе, более сложно определить. К примеру, удалось показать, что с 26S протеасомой, выделенной из коры головного мозга крыс, связываются белки семейства 14-3-3 (gamma и zeta/delta) (Tai et al., 2010). Белки 14-3-3 участвуют в различных процессах, включая регуляцию клеточного цикла, контроль за метаболизмом, апоптоз и транскрипцию генов (Fu et al. 2000, Aitken 2006, Hermeking and Benzinger 2006). Существует множество других белков, которые связаны с протеасомами, таких как p28/gankirin, Rpnl4, р27 и S5b. Некоторые из них, предположительно, отвечают за регуляцию 26S протеасом или сброку корового комплекса с регуляторными субъединицами (Tanaka, 2009). Однако функциональная значимость этого связывания неоднозначна и требует дальнейшего изучения.

В связи с тем, что ферментативные активности протеасом отличаются в раковых клетках от нормальных, приобретает особую значимость изучение механизмов регуляции специфических активностей протеасом, в частности через белок-белковые взаимодействия. Эти данные могут в дальнейшем позволить обнаружить новые ингибиторы активностей протеасом, как протеолитических, так и неканонических, в качестве возможных противораковых препаратов. Соответственно, учитывая данные о наличии

эндорибонуклеазной активности у протеасом и их ассоциации с низкомолекулярными РНК и белками сплайсинга, представляет интерес как определение спектра белков, связывающихся с коровым протеасомным комплексом, так и изучение влияния протеасом на метаболизм РНК.

1.2 Цели и задачи работы

Целью данной работы является изучение роли протеасом и их отдельных субъединиц в расщеплении РНК и сплайсинге.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Проверка наличия РНКазной активности и ее сравнение у рекомбинантных белков субъединиц альфа-типа 20S протеасомы.

2. Определение спектра белков, способных связываться с 20S протеасомой (субъединица а7).

3. Изучение участия протеасом в альтернативном сплайсинге.

1.3 Основные положения, выносимые па защиту

1. Рекомбинантные субъединицы al, a2, a3, а4, а5 и а7 20S корового комплекса обладают РНКазной активностью.

2. РНКазная активность al, a2, a3, а4, а5 и а7 20S корового комплекса зависит от присутствия ионов Са2+ и Mg2+.

3. Рекомбинантная субъединица a7 (PSMA3) 20S протеасомы способна связываться с белками, участвующими в различных клеточных процессах: транскрипция, трансляция, репарация ДНК, сплайсинг.

4. Протеасомы участвуют в регуляции альтернативного сплайсинга in vitro гена SMN1,

при этом протеолитические активности 20S протеасом не критичны для подавления сплайсинга.

1.4 Научная новизна полученных результатов

В данной работе был впервые определен спектр белков, способных связываться с PSMA3 (а7) корового комплекса. Были идентифицированы как цитоплазматические, так и ядерные белки, ассоциированные с субъединицей а7, которые отвечают за важные клеточные процессы: транскрипцию, трансляцию, репарацию ДНК и сплайсинг.

Удалось показать, что субъединицы альфа-типа корового комплекса протеасом обладают регулируемыми РНКазными активностями. Впервые показано, что 20S протеасома участвует в альтернативном сплайсинге. Таким образом, в данной работе впервые установлена роль субъединиц альфа-типа протеасом в метаболизме РНК.

1.5 Теоретическое н практическое значение работы Внимание большинства исследователей сосредоточено на роли протеасом в

убиквитин-зависимом протеолизе, однако другие функции остаются малоизученными. Полученные результаты имеют фундаментальное значение для определения роли протеасом в сплайсинге и расщеплении РНК. Кроме того, изучение роли протеасом в альтернативном сплайсинге гена SMN1 имеет практическое значение для лечения спинальной мышечной дистрофии.

1.6 Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на Политехнических симпозиумах «Молодые учёные — промышленности Северо-Западного региона» 2009 и 2010 года (Санкт-Петербург), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2009» (Москва, 2009), 13-й Международной Пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2009), 34-м и 35-м конгрессах Европейского биохимического сообщества (Прага, 2009; Ґетеборг, 2010), 2-й конференции молодых учёных ИНЦ РАН (Санкт-Петербург, 2010), VI конференции «Фундаментальная онкология - Петровские чтения» (Санкт-Петербург, 2010).

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 4 статьи в рецензируемых журналах.

1.7 Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего^^ источников. Диссертация изложена на страницах машинописного текста. Иллюстративный материал содержит^ схем.Х^ рисунков, и таблиц.

1.8 Финансовая поддержка работы

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (проекты №08-04-00834 и №10-04-01234), Программы Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология", ФЦНТП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 годы ГК No. 16.740.11.0366 и ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы" ГК No.16.512.ll.2242

1.9 Личный вклад автора

Идентификация белков, ассоциированных с рекомбинантным белком GST-a7, была осуществлена с помощью метода масс-спектрометрии совместно с Андрю Боттриплом в отделе биохимии (Университет Лестера, Англия). Влияние протеасом на сплайсинг in vitro было определено в совместных исследованиях с Т.Н.Моисеевой и Ианом Эпероном в о тделе биохимии (Университет Лестера, Англия).

Лично автором были получены экспрессионные вектора, содержащие гены субъединиц al, a2, a3, а4, а5 и а7, подобраны оптимальные условия синтеза и очистки рекомбинантных белков. Автором также проведены исследования наличия РНКазной активности у субъединиц al, a2, a3, а4, а5 и al протеасом человека. GST-pulldown и двухмерный электрофорез ассоциированных с субъединицей а7 белков были проведены также лично автором. Лично автором проведен иммуноблот анализ для подтверждения связывания белков, участвующих в сплайсинге, с субъединицей а7.

Материалы, вошедшие в данную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Клеточные культуры

Клетки проэритролейкемии человека линии К562 (Lozzio, Lozzio, 1975), полученные из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН), культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки в атмосфере 5 % СОг при температуре 37 °С.

2.2 Создание экспрессионпых векторов, экспрессия п очистка белков Последовательности кДНК протеасомных субъединиц a-типа (al, a2, a3, а4, а5, а7) были получены методом ОТ-ПЦР из тотальной мРНК клеток человека линии К562.

Полученные продукты ПЦР были клонированы в экпрессионный вектор pGEX-5X-l, линеаризованный BamHI, для последующей экспрессии химерных белков. Экспрессию белков осуществляли в клетках E.coli BL21 при 37 °С в присутствии 1 мМ изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ). Очистку белка проводили методом афинной хроматографии ira глутатиогг-сефароче (GE Health Care, США).

2.3. Транскрипция in vitro Транскрипцию З'-нетранслируемой области мРНК с-тус проводили с использованием

32 32

[а- Р] ЦТФ и РНК полимеразы фага SP6, мРНК р53 синтезировали в присутствии [а- Р] ЦТФ и ТЗ РНК полимеразы.

2.4 Обработка РНК с помощью химерных белков РНК инкубировали с 26S протеасомными комплексами в буферном растворе, содержащем 20 мМ HEPES-NaOH, pH 7.6, 50 мМ KCl, 0.1 мМ ЭДТА, 10 % глицерина, 0.5 мМ PMSF, 2 мМ DTT, 1 мМ АТФ в течение 30 мин при температуре 37 °С. При необходимости в реакционную смесь добавляли МцСЬ или СаСЬ.

РНК выделяли методом фенолыю-термического фракционирования (Георгиев и Мантьева, 1962).

2.4 Электрофорез РНК в денатурирующих условиях

Электрофорез проводили в 5%-ном акриламидном геле в трис-боратном буфере (90 мМ Трис-борат, 2 мМ ЭДТА, pH 8.3) в присутствии 7 M мочевины. Препараты радиоактивно меченных РНК разделяли в приборе для высоковольтного электрофореза фирмы Hoefer (США). Гель сушили на стекле, а затем экспонировали с рентгеновской пленкой Kodak X-Omat К (США).

2.S Получение клеточного экстракта

Для получения клеточного экстракта 2*107 клеток линии KS62 промывали холодным PBS и лизировали в буфере (50 мМ Tris-HCI (pH 8.0), 150 мМ NaCl, 1% Triton Х-100 и protease inhibitor cocktail (Roche)) в течение 30 мин на +4 °С. Затем клетки осаждали центрифугированием в течение 30 мин при 20,000g и 4 °С. Ядерный и цитоплазматический клеточные экстракты были получены с помощью метода Dignam and Roeder (Dignam et al., 1983).

2.6 Метод GST-puUdown

Для анализа белков, способных связываться с субъединицей аП протеасом человека, был использован метод GST-pulldown. Клеточные экстракты были преинкубированы с 50 мкг GST, иммобилизованном на 50 мкл глутатион-сефарозе (Amersham), в течение 2 ч при 4 °С. Преинкубированный клеточный экстракт затем инкубировали с 50 мкг GST-alpha7 или 100 мкг GST, иммобилизованных на 50 мкл глутатион-сефарозе, в течение 4 ч при 4 °С. Сефарозу промывали 5 раз PBS от несвязавшихся белков. Комплексы белков с GST или GST-alpha7 элюировали с помощью буфера (125 мМ Tris-HCI (pH 6.8), 4% SDS, 0.1% бромфеноловый синий, 20% глицерин, 200 мМ DTT) и анализировали с помощью электрофореза.

2.7 SDS-электрофорез и иммуноблот анализ

Белки разделяли в 12 %-ном полиакриамидном геле в присутствии SDS (Laemmli, 1970) и переносили на мембрану PVDF по стандартной методике (Towbin et al., 1979). Использовали антитела к a-PSMAl, PSMA3, и Rpn2 фирмы Biomol (UK) и a-hnRNPA2/Bl, Ddx5 фирмы Santa Cruz (USA). Белки выявляли методом усиленной хемилюминесценции (ECL) с помощью SuperSignal system (Pierce) согласно рекомендациям производителя.

2.8 Двухмерный электрофорез белков

Белки, ассоциированные с GST и GST-a7, были разделены с помощью двухмерного электрофореза с использованием установки GE Healthcare lPGphor Ettan 2D-system согласно инструкциям фирмы-изготовителя (GE Healthcare Bio-Sciences Inc., США). Электрофорез во втором направлении проводили в 12 %-ном ПААГ в стандартной системе Лэммли (Laemmli, 1970). Белки визуализировали при помощи окрашивания Coomassie.

2.9 Масс-спсктрометрия

Пятна, содержащие белки, были вырезаны из геля, отмьггы от Coomassie и подвергнуты трипсинолизу с помощью автомата Multiprobe II Plus EX (Perkin Elmer, Великобритания). Масс-спектрометрии (MS) предшествовала жидкостная хроматография (LC) на обращенно-фазовой колонке, содержащей матрикс Acclaim РерМар (Dionex, Великобритания), с последующим элюированием на обращенно-фазовой колонке Waters Symmetry С18 lOOE (Waters, Великобритания). Анализ полученных фракций проводился с помощью масс-спектрометра 4000 Q-Trap (Applied Biosystems, Великобритания). В результате получали спектр ионов, который обрабатывали, используя поисковую программу MASCOT49 и базы данных UniProtKB/Swiss-Prot50. Рассматривались белки, для которых было обнаружено 3 и более пептидов с р < 0.05.

2.10 Сплайсинг in vitro

Пре-мРНК гена SMN1, соответствующая 7-му экзону, была транскрибирована с

32

использованием Т7 РНК полимеразы в присутствии [а- Р] ГТФ. Продукт траснкрипции был очищен с помощью гель-электрофореза от несвязавшихся нуклеотидов и элюирован в течение ночи при 4 °С в ТЕ буфере, содержащем 0.2 % SDS и 0.5М ацетат натрия. Сплайсинг in vilro осуществляли при 30 °С в 40 %-ном ядерном экстракте с добавлением 1.5 мМ Л'ГР, 20 мМ Crl'j, 3.2 мМ MgC12, 20 мМ Hepes pH 7.5 и 50 мМ глутамата калия. Из реакционной смсси отбирали равные аликвоты сразу, через 90 и Î80 мин после начала реакции. Полученные в результате сплайсинга наборы PIIK были выделены из каждой пробы и разделены с помощью элсктрофорст в денатурирующих условиях, в 5%-ном ахриламидном геле. Гели высушивали и эффективность сплайсинга анализировали с помощью I'hospholmagcr (Packard Bioscience).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ'И ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее было показано, что две субъединицы а-типа (al, a5), выделенные из культуры клеток, обладают РНКазной активностью (Petit et al., 1997). Однако наличие таковой у других протеасомных субъединиц не было описано в литературе. Кроме того, в цитируемых работах методы выделения индивидуальных субъединиц 20S комплекса не исключали возможности контаминации препарата другими субъединицами протеасом, а также неполного восстановления нативной структуры белка после денатурации.

Поэтому в данной работе была использована методика получения индивидуальных субъединиц а-типа в гетерологичной экспрессионной системе Е. coli, которая исключала присутствие других протеасомных субъединиц и обеспечивала нативность получаемых препаратов. Для этого были получены экспрессиотшые векторы pGEX-5X-l- al, 2, 3,4, 5 и 7,

несущие гены, кодирующие субъедницы al, a2, a3, а4, а5 и а7 соответственно. Гены были помещены в открытые рамки считывания гена фермента глутатион-8-трансферазы (GST) таким образом, что синтезируемые белки представляли собой белки слияния функционально активной GST и аминокислотной последовательности субъединиц. Были подобраны оптимальные условия синтеза этих белков. Для очистки химерных белков был использован метод афинной хроматографии на основе взаимодействия домена глутатион-8-трансферазы и глутатион-сефарозы. Степень очистки рекомбинантных белков проверяли с помощью SDS-электрофореза (рис. 1).

4 5 6

GST-Q5

Рис.1. SDS электрофорез рекомбинантных белков GST-al (1), GST-a2 (2), GST-a3 (3), GST-a4 (4), GST-a5 (5) и GST-a7 (6) после очистки на глутатион-сефарозе.

Ранее было показано, что способность протеасом расщеплять РНК чувствительна к наличию в реакционной среде двухвалентных катионов, к рН и температуре реакции (Petit et al., 1997). Также было показано, что субъединица а5 обладает способностью расщеплять РНК в большей степени, чем субъединица al. Поэтому для начала были подобраны оптимальные условия для проявления РНКазной активности рекомбинантной субъединицы а5. В качестве субстрата была использована высокомолекулярная цитоплазматическая РЫК. Чтобы исключить возможное влияние белка GST на РНКазную активность исследуемого химерного белка, в качестве контроля использовали GST, выделенная в тех же условиях (рис.2).

Электрофоретический анализ продуктов гидролиза цитоплазматической РНК показал, что химерная субъединица a5-GST обладает способностью расщеплять РНК. При этом было доказано, что для проявления РНКазной акивности необходимы ионы Са2+ или Mg2+ (для сравнения дорожки В,2 и Г,2.).

Для исследования РНКазной активности других очищенных субъединиц в качестве субстратов использовали транскрибированные in vitro мРНК р53 и 3'-нетранслируемую область мРНК с-тус. В качестве контроля был также взят белок GST, выделенный в тех же условиях (рис. 3 и 4).

Рис.2. Электрофореграммы цитоплазматической РНК. Необработанная РНК (А1, Б1, В1,Г1 и Д1); ОБТ в присутствии ионов Са2+ (10 мМ) (А,2) и ионов МЁ2+ (10 мМ) (Б,2). С8Т-а5 без ионов (В,2) и в присутствии ионов Са2+ (10 мМ) (Г,2) и ионов Мё2+ (10 мМ) (Д,2)

Электрофоретический анализ продуктов гидролиза З'-нетранслируемой области мРНК с-тус (рис. 3) свидетельствует о том, что все исследуемые рекомбинантные белки способны гидролизовать данный РНК-субстрат. Однако мРНК р53 подвергалась эндонуклеолизу не всеми исследуемыми субъединицами — аЗ субъединица не способна гидролизовать данный РНК-субстрат (рис. 4, блок аЗ-GST). При этом РНКазная активность на обоих субстратах специфически зависела от присутствия в реакционной среде ионов Са21 или Mg2+. Необходимо также подчеркнуть, что сам по себе белок GST не проявлял РНКазной активности (рис. 3 и рис. 4, блок GST).

Важно отметить, что в случае использования З'-нетранслируемой области мРНК с-тус в качестве субстрата только рекомбинантные белки а! и а5 проявляли РНКазную активность в отсутствие двухвалентных катионов (рис. 3, дорожки 1). Остальные исследуемые субъединицы были неактивны в отсутствие ионов Са2+ или Mg2' (рис. 3, дорожки 2, 3). И если ионы Mg2+BO всех случаях активировали РНКазную активность (рис. 3, дорожки 2), то влияние ионов Са2+ зависело от конкретной субъединицы (рис. 3, дорожки 3). Таким образом, можно сделать вывод, что все исследуемые нами рекомбинантные субъединицы были способны гидролизовать З'-нетранслируемую область мРНК с-тус, но их активность специфически зависела от присутствия двухвалентных катионов.

При использовании мРНК р53 в качестве субстрата ни один из рекомбинантных белков не проявлял РНКазной активности в отсутствие двухвалентных катионов (рис. 4, дорожки 1). Как и в случае субстрата З'-нетранслируемой области мРНК с-тус, ионы Mg2 1 обладали стимулирующим эффектом (рис. 4, дорожки 2), влияние же ионов Са2+ на

РНКазную активность рекомбинантных субъединиц было избирательным (рис. 4, дорожки 3). Однако субъединица аЗ не гидролизовала РНК даже в присутствии двухвалентных ионов (рис. 4, блок аЗ-(т8Т).

Рис.3. Радиоавтограф электрофореграммы транскрибированной in vitro 3'-нетранслируемой области мРНК с-тус, обработанной рекомбинантными белками al-GST, a2-GST, a3-GST, а4-GST, a5-GST, a7-GST и GST. К — интактная РНК; 1— РНК, обработанная рекомбинантными белками в отсутствие двухвалентных катионов; 2— РНК, обработанная рекомбинантными белками в присутствии 10 мМ MgCb; 3— РНК, обработанная рекомбинантными белками в присутствии 10 мМ СаСЬ

Рис.4. Радиоавтограф электрофореграммы транскрибированной in vitro 3'-нетранслируемой области мРНК р53, обработанной рекомбинантными белками al-GST, a2-GST, a3-GST, а4-GST, a5-GST, a7-GST и GST. К— интактная РНК; 1— РНК, обработанная рекомбинантными белками в отсутствие двухвалентных катионов; 2— РНК, обработанная рекомбинантными белками в присутствии 10 мМ MgCb; 3— РНК, обработанная рекомбинантными белками в присутствии 10 мМ СаСЬ

Результаты наших экспериментов показывают, что все исследованные рекомбинантные субъединицы a-типа, слитые с GST, обладали РНКазной активностью. Важно отметить тот факт, что активность отдельных субъединиц зависела от используемого субстрата и присутствия в реакционной смеси двухвалентных катионов (Федорова и др., 2010; Kulichkova et al., 2010).

Исходя из наших данных о наличии эндорибонуклеазной активности субъединиц а-типа, а также литературных данных об ассоциации с протеасомами низкомолекулярных РНК, нами было выдвинуто предположение о том, что 20S протеасомные комплексы могут участвовать в РНК-опосредованных процессах, например, в сплайсинге. Для проверки этой гипотезы было решено выяснить, взаимодействуют ли белки 20S протеасомы с белками, участвующими в регуляции сплайсинга. Из литературных данных известно, что с субъединицей а7 связывается целый ряд белков, которые затем деградируют по убиквитин-независимому механизму. Таким образом, субъединица а7 является узловой точкой взаимодействия различных белков с 20S частицей протеасомы. Именно поэтому эта субъединица была выбрана для определения ассоциированных с ней белков.

М, кДа

М,

кДа

117 85 GST-a7 л..... 117 85

48 48

34 34

26 26

контроль

117 117

85 48 34 iff 1 ■ 85 48 34

26 — ■ 26

ядро

117 ; 117

85 ™ 85

48 48

34 26 Шщ 34 26

РІ 3 цитоплазма 10

ядро

р! 3

10

цитоплазма

Рис.5. Двухмерный электрофорез после инкубации Рис.6. Двухмерный электрофорез после GST с ядерным (ядро) или цитоплазматическим инкубации GST-a7 с ядерным (ядро) или клеточным экстрактом (цитоплазма) и не цитоплазматическим клеточным экстрактом

инкубированный GST (контроль). Окраска (цитоплазма) и не инкубированный GST-a7

Coomassie. (контроль). Окраска Coomassie.

Для определения спектра белков, способных связываться с субъединицей а7, был выбран метод GST pulldown с разделением взаимодействующих белков методом двухмерного электрофореза и последующей их идентификацией методом масс-спектрометрии. Для этого рекомбинантную субъединицу GST-a7 инкубировали с

цитоплазматической или ядерной фракцией клеточного экстракта, приготовленного из клеток проэритролейкемии человека линии К562. Белок GST был использован в качестве контроля неспецифического связывания. Связавшиеся белки разделяли с помощью двухмерного электрофореза (рис. 5 и рис. 6).

В результате разделения неинкубированного белка GST с помощью двухмерного электрофореза видно, что он представлен, как минимум, четырьмя изоформами (рис. 6). Важно отметить при этом, что ни один белок не связался с GST после инкубации как с ядерным, так и с цитоплазматическим клеточными экстрактами. При этом рекмобинантный белок GST-a7 способен связываться с различными белками (рис.5).

Белки, ассоциированные с рекомбинантным белком GST-a7, были идентифицированы с помощью метода масс-спектрометрии. Результаты представлены в таблице 1 и таблице 2 Таблица 1. Ядерные белки, ассоциированные с субъединицей о7.

Номер белка Сокращенное название белка Название белка Название гена

Белки, ассоциирование с протеасомой Р43686 Q5W0S4 PRS6B HUMAN Q5W0S4_HUMAN 26S protease regulatory subunit 6B RAD23 homolog В PSMC4 RAD23B

Деубнквитинили-руклцие ферменты

Транскрипция Q00403 Р06733 TF2B HUMAN ENOAHUMAN Transcription initiation (actor ИВ Alpha-enolase GTF2B ENOl

Сплайсинг Р09651 ROA1HUMAN Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 HNRNPA1

Трансляция P68I04 PI3639 Р23381 Р41250 Q15046 EFIA1 HUMAN EF2 HUMAN SYWC HUMAN SYG HUMAN SYK HUMAN Elongation factor 1-alpha 1 Elongation factor 2 Tryptophanyl-tRNA synthetase Glycyl-tRNA synthetase Lysyl-tRNA synthetase EEF1AI EEF2 WARS GARS KARS

Шапероны PI4625 Р07900 Р08238 PI 1142 Р34931 Р54652 Р10809 Р50990 Р50991 Р49368 Р40227 Р07237 ENPL HUMAN HS90A HUMAN HS90B HUMAN HSP7C HUMAN HS71L HUMAN HSP72 HUMAN CH60_HUMAN TCPQ HUMAN TCPD HUMAN TCPG HUMAN TCPZ HUMAN PDIA1_HUMAN Endoplasmin Heat shock protein HSP 90-alpha Heat shock protein HSP 90-beta Heat shock cognate 71 kDa protein Heat shock 70 kDa protein 1- like Heat shock-related 70 kDa protein 2 60 kDa heat shock protein, mitochondrial T-complex protein 1 subunit theta T-complex protein 1 subunit delta T-complex protein 1 subunit gamma T-complex protein 1 subunit zeta Protein disulfide-isomerase HSP90BI HSP90AA 1 HSP90AB 1 HSPA8 HSPA1L HSPA2 HSPDI CCT8 CCT4 CCT3 CCT6A P4HB

Цитоскелет и миофибриллярные белки Р68363 Р60709 TBA1B HUMAN ACTB_HUMAN Tubulin alpha-] В chain Actin, cytoplasmic 1 TUBAIB ACTB

Повреждение ДНК Р54727 RD23B_HUMAN UV excision repair protein RAD23 homolog В RAD23B

Метаболизм PI 1021 PO7237 P60174 GRP78 HUMAN PDIA1 HUMAN TPIS HUMAN 78 kDa glucose-regulated protein Protein disulfide-isomerase Triosephosphate isomerase HSPA5 P4HB ТРИ

F55084 ECHBJ1UMAN Trifunctional enzyme subunit beta, HADHB

mitochondrial

Fl8669 PGAM1J1UMAN Phosphoglycerate mutase 1 PGAM1

POIOll AACT HUMAN Alpha-1-antichymotrypsin SERPINA

Р14618 KPYM HUMAN Pyruvate kinase isozymes M1/M2 3

Р00558 PGK1 HUMAN Phosphoglycerate kinase 1 PKM2

Р04075 ALDOA HUMAN Fructose-bisphosphate aldolase A PGK1

Р04406 G3PJIUMAN GlyceraIdehyde-3-phosphate ALDOA

dehydrogenase GAPDH

Р00338 LDHA HUMAN L-lactate dehydrogenase A chain

Р10515 ODP2_HUMAN Dihydrolipoyllysine-residue LDHA

acetyltransferase DLAT

component of pyruvate

dehydrogenase complex,

mitochondrial

Р11586 C1TC HUMAN C-l-tetrahydrofolate synthase

Р17812 PYRGI HUMAN CTP synthase 1 MTHFD1

Р36776 LONM HUMAN Lon protease homolog, mitochondrial CTPS

Q14697 GANAB HUMAN Neutral alpha-glucosidase AB LONP1

GANAB

Репликация

Таблица 2. Цитоплазматические белки, ассоциированные с субъединицей а7.

Номер Сокращенное Название белка Название

белка название белка гена

Белки, PI 7980 PRS6A HUMAN 26S protease regulatory subunit 6A PSMC3

ассоциированные с Q9BZK TBL1RHUM AN F-box-1 ike/WD repeat-containing protein TBL1XR1

протеасомой 7 TBL1XR

Деубиквитинили- Р45974 UBP5 HUMAN Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 5 USP5

рующие ферменты Q8TAF WDR48 HUMAN WD repeat-containing protein 48 WDR48

3 UBP14_HUMAN Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase USP14

Р54578 14

Транскрипция Q8N7H PAF1HUMAN RNA polymerase H-associated factor 1 PAF1

5 homolog

RUVB1 HUMAN RuvB-like 1 RUVBL1

Q9Y265 PUF60 HUMAN Poly(U)-binding-splicing factor PUF60 PUF60

Q9UHX HDAC2 HUMAN Histone deacetylase 2 HDAC2

1 MCM3 HUMAN DNA replication licensing factor MCM3 MCM3

Q92769 MCM6 HUMAN DNA replication licensing factor MCM6 MCM6

Р25205 TBL1RHUMAN F-box-like/WD repeat-containing protein TBL1XR1

Q14566 TBL1XR

Q9BZK RBBP5 HUMAN Retinoblastoma-binding protein 5 RBBP5

7 ENOA HUMAN Alpha-enolase ENOl

WDR5 HUMAN WD repeat-containing protein 5 WDR5

Q15291 TADBP HUMAN TAR DNA-binding protein 43 TARDBP

Р06733 NONOHUMAN Non-POU domain-containing octamer- NONO

Р61964 binding protein

013148 FUBP2HUMAN Far upstream element-binding protein 2 KHSRP

Q15233

Q92945

Сплайсинг Q12874 SF3A3 HUMAN Splicing factor ЗА subunit 3 SF3A3

Q9UHX PUF60 HUMAN Poly(U)-binding-splicing factor PUF60 PUF60

1 U5S1_HUMAN 116 kDa U5 small nuclear EFTUD2

Q15029 ribonucleoprotein component

CPSF2_HUMAN Cleavage and polyadenylation specificity CPSF2

Q9P2I0 factor subunit 2

TADBP HUMAN TAR DNA-binding protein 43 TARDBP

Q13148 IINRPFHUM AN Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein HNRNPF

Р52597 F

HNRLLHUMAN Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein HNRPLL

Q8WV L-like

V9 ROA2_HUMAN Heterogeneous nuclear HNRNPA2

ribonucleoproteins A2/BI B1

Р22626 HN RPCHVJMAN Heterogeneous nuclear HNRNPC

ribonucleoproteins C1/C2

Р07910 FUBP2 HUMAN Far upstream element-binding protein 2 KHSRP

NONOHUMAN Non-POU domain-containing octamer- NONO

Q92945 binding protein

Q15233 PTBP1 HUMAN Polypyrimidine tract-binding protein 1 PTBPI

DDX1 HUMAN ATP-dependent RNA helicase DDX1 DDX1

Р26599 DDX5HUMAN Probable ATP-dependent RNA helicase DDX5

Q92499 DDX5

PI7844

Трансляция

Шапероны Р27797 CALR HUMAN Calreticulin CALR

Р07237 PDIAI HUMAN Protein disulfide-isomerase P4HB

Р38646 GRP75 HUMAN Stress-70 protein, mitochondrial HSPA9

PI 0809 CH60HUMAN 60 kDa heat shock protein, HSPD1

mitochondrial

PI 1142 HSP7C HUMAN Heat shock cognate 71 kDa protein HSPA8

Р34931 HS7IL HUMAN Heat shock 70 kDa protein l-like HSPAIL

Р08238 HS90B HUMAN Heat shock protein HSP 90-beta HSP90AB

Р07900 HS90A HUMAN Heat shock protein HSP 90-alpha 1

Р31689 DNJA1 HUMAN DnaJ homolog subfamily A member 1 HSP90AA

Р78371 TCPB_HUMAN T-complex protein 1 subunit beta 1

DNAJA1

CCT2

Цитоскелет и Р60709 ACTB HUMAN Actin, cytoplasmic 1 ACTB

миофибриллярные Р35609 ACTN2 HUMAN Alpha-actinin-2 ACTN2

белки 043707 ACTN4 HUMAN Alpha-actinin-l ACTN4

Р68363 TBA1B HUMAN Tubulin alpha-IB TUBA1B

Q13885 TBB2A HUMAN Tubulin beta-2A chain TUBB2A

Повреждение ДНК Q9UMS PRP19 HUMAN Pre-mRNA-processing factor 19 PRPF19

4 XRCC6JIUMAN ATP-dependent DNA helicase 2 subunit XRCC6

Р12956 1 (Ku70)

XRCC5HUMAN ATP-dependent DNA helicase 2 subunit XRCC5

Р13010 2 (Ku86)

NONO_HUMAN Non-POU domain-containing octamer- NONO

Q15233 binding protein

RU VB1 HUMAN RuvB-like I RUVBLI

Q9Y265

Метаболизм PI 1021 GRP78 HUMAN 78 kDa glucose-regulated protein HSPA5

P06576 ATPBHUMAN ATP synthase subunit beta, ATP5B

mitochondrial

P04075 ALMA HUMAN Fructose-bisphosphate aldolase A ALDOA

P02765 FETUA HUMAN Alpha-2-HS-glycoprotein AHSG

PI2277 KCRB HUMAN Creatine kinase B-type СКВ

P04406 G3PHUMAN Glyceraldehyde-3-phosphate GAPDH

dehydrogenase

P40926 MDHM_HUMAN Malate dehydrogenase, mitochondrial MDH2

Репликация P25205 MCM3 HUMAN DNA replication licensing factor MCM3 MCM3

Q14566 MCM6HUMAN DNA replication licensing factor MCM6 MCM6

Белки, ассоциированные с субъедницей а7, участвуют в таких процессах, как транскрипция, сплайсинг и процессинг РНК, репарация ДНК, метаболизм и трансляция. Кроме того, обнаружены белки цитоскелета и шапероны, взаимодействующие с а.1. Наибольшие группы ассоциированных белков участвуют в регуляции метаболизма, транскрипции, сплайсинге и процессинге РНК или представляют собой шапероны.

В данной работе впервые удалось показать, что ряд белков, участвующих в сплайсинге, ассоциирован с протеасомами. Важно отметить, что белки, ассоциированные с субъединицей а7, участвуют в различных этапах сплайсинга, а также регулируют альтернативный сплайсинг некоторых белков (табл. 3).

Таблица 3. Белки, взаимодействующие с субъединицей а7, которые принимают

участие в сплайсинге

Белки, ассоциированные с а7

Этапы сплайсинга пре-мРНК с помощью сплайсосомы і связывание мяРНП и! с 5-концом пре-мРНК Splicing factor ЗА subunit 3

Связывание мяРНП 132 с областью ветвления и 1Л. Ш образует прочную связь с последовательностью точки ветвления (ПТВ) (комплекс А). Splicing factor ЗА subunit 3 Poly(U)-binding-splicing factor PUF60 Polypyrimidine tract-binding protein 1 Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins C1/C2

Связывание 114, Ы5 и 116 с собираемой сплансосомой (комплекс В). Non-POU domain-containing octamer-binding protein

Формирование каталитически-активной сплайсосомы (активный комплекс В), отделение и! и и4

Осуществление первого каталитического этапа (комплекса С), 116 kDa U5 small nuclear ribonucieoprotein component Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins CI/C2

Осуществление второго каталитического этапа и диссоциация сплайсосомы (пост-сплайсосомный комплекс).

Отделение Ш, 115 и Ш мяРНП

Регуляция альтернативного сплайсинга Poly(U>binding-splicing factor PUF60 Heterogeneous nuclear ribonucieoprotein F Heterogeneous nuclear ribonucieoprotein L-like Far upstream element-binding protein 2 Polypyrimidine tract-binding protein 1 Probable ATP-dependent RNA helicase DDX5 TAR DNA-binding protein 43

Для подтверждения связывания субъедницы а.1 с белками, участвующими в сплайсинге, был проведен иммуноблотинг с использованием специфических антител. В данной работе на взаимодействие с GST-a7 исследовали белки DDX5 и hnRNPA2/Bl, которые оба участвуют в сплайсинге за счет различных механизмов. Клеточный экстракт, приготовленный из клеток К562, инкубировали с GST или GST-a7. Удалось показать, что оба белка связываются с химерным белком GST-a7, но при этом не связываются с GST.

Данное связывание является специфическим, так как белок GST-a7 связывается с другой субъединицей 20S протеасомы - аб, что свидетельствует о нативности конформации а7 (рис.7). Связывания GST с аб не происходит.

аб

hnRNP А2/В1

DDXS

Рис.7. Иммуноблотинг после инкубации клеточного экстракта, выделенного из клеток линии К562, с GST и GST-a7 с использованием антител к hnRNP А2/В1, DDX5 и субъединице аб.

1— контроль, клеточный экстракт до инкубации; 2— белки, связавшиеся с GST; 3— белки, связавшиеся с GST-а7.

Полученные нами результаты показывают, что субъединица а7 связывается с ядерными белками, участвующими в метаболизме РНК. Это дает основание предполагать, что 20S протеасома участвует в регуляции сплайсинга. Для дальнейшей проверки этой гипотезы были проведены транскрипция и сплайсинг in vitro с использованием ДНК-матрицы, представляющей собой фрагмент гена SMN1/2, содержащий экзон 7 с фрагментами интронов, фланкированный с обеих сторон экзонами гена Р-глобина (рис. 8). Важно отметить, что транскрибированная с этой химерной матрицы мРНК, которая содержит экзон 7 гена SMN1, может подвергаться альтернативному сплайсингу. Ген SMN1/2 кодирует белок выживания моторных нейронов (SMN). Отсутствие этого гена или его мутации приводят к заболеванию, называемому спинальная мышечная атрофия. Несмотря на то, что белок SMN кодируется двумя высокогомологичными генами (SMNI и SMN2), последний кодирует неполный белок из-за альтернативного сплайсинга и потери экзона 7 в зрелой мРНК. Такой белок не способен компенсировать потерю полноразмерного белка SMN. Оба варианта белка SMN подвергаются убиквитинилированию и последующей деградации в протеасомах (Burnett et al., 2009). Стабильность двух изоформ белка SMN различается in vitro и in vivo, что свидетельствует о том, что протеасомы могут влиять на уровень экспрессии белка SMN (в дополнение к непосредственной его деградации) путем дополнительных механизмов.

Проведенные нами эксперименты показали, что добавление как 19S, так и 20S снижало уровень продуктов альтернативного сплайсинга гена SMN1/2. 20S комплекс обладал более сильным эффектом в отношении обоих продуктов сплайсинга по сравнению с 19S (рис. 9). При добавлении 19S вместе с 20S ингибирование сплайсинга было более эффективным по сравнению с добавлением в реакцию только 19S, без 20S. Вышеизложенные

данные позволяют предположить, что 208 комплекс в значительной степени подавляет образование альтернативно сплайсированной формы .

А Б

контроль 195

20S

195+205

SMN1 [ Р) пре-мРНК

Продукты альтернативного сплайсинга

Время, ч. ......0.......1........1 0......1......2 ......0.....1......7 Q 1.....3L

.............

Рис.8. Влияние протеасом на альтернативный сплайсинг гена . А— схематическое изображение гена и двух продуктов альтернативного сплайсинга (1,2). Б— радиоавтограф электрофореграммы транскрибированной т уЦго мРНК гена 8 МЫ.

§ а

Є ь

н «

о о

U й

S «

S s

11 О &

Е а

0,2 0

19S

20S 19S+20S

Рис.9. Эффективность 19S регуляторно й частицы и 20S корового комплекса на сплайсинг in vitro.

ЇЙ

Є ^

в «

0 о

u з

1 І

ї 1 і §

О 'сЗ

s s

я

<5

Рис. 10. Влияние 20S протеасом и ингибитора протеасом MG132 на сплайсинг in vitro

К ОМвО Мв132 20Б гОБ+Мвт 20Б 80°С ВБА80оС Принимая во внимание, что основной функцией протеасом является расщепление

белков, можно предположить, что некоторые субъединицы сплайсосом деградируют с помощью 20S протеасом. Для проверки этой точки зрения в реакцию сплайсинга in vitro был добавлен ингибитор протеолитических активностей MG132. В качестве контроля в реакцию сплайсинга in vitro был добавлен ингибитор без протеасом или DMSO, который использовался как растворитель для ингибитора. Эксперимент показал, что ингибитор протеасом практически не влияет на эффект 20S корового комплекса, заключающийся в подавлении сплайсинга (рис.10). Для исключения неспецифического ингибирования за счет изменения белкового баланса в качестве контроля был взят нагретый до 80° С бычий сывороточный альбумин (BSA), который подавил сплайсинг in vitro незначительно по сравнению с добавлением в реакцию 20S или 20S с ингибитором MG132. Кроме того, важно было исключить эффект небелковой природы, для этого 20S протеасомы были нагреты до 80 °С, что приводит к денатурации белков. Удалось показать, что добавление в реакцию нагретых до 80 °С 20S протеасом приводило к подавлению сплайсинга, но не так эффективно, как без нагревания. Таким образом, нами было показано, что как 20S коровый комплекс, так и 19S регуляторные частицы влияют на альтернативный сплайсинг гена SMN1. При этом протеолитические активности 20S коровой частицы не являются условием эффективного подавления сплайсинга (Fedorova et al., 2011).

4. ВЫВОДЫ

1. Рекомбинантные субъединицы al, a2, a4, a5 и a7 проявляют специфическую эндорибонуклеазную активность in vitro по отношению к мРНК р53 и с-тус. Для проявления этой активности необходимы ионы Mg2+ или

2. Рекомбинантная субъединица аЗ не проявляет эндорибонуклеазную активность по отношению к мРНК р53 и проявляет сравнительно небольшую активность по отношению к мРНК с-тус.

3. Рекомбинантная субъединица а7 взаимодействует с белками, участвующими в транскрипции, репарации ДНК, трансляции, метаболизме и сплайсинге.

4. Как 20S коровый комплекс, так и 19S регуляторные частицы влияют на альтернативный сплайсинг гена SMN1, мутации в котором приводят к мышечной дистрофии.

5. Протеолитические активности 20S коровой частицы не критичны для подавления сплайсинга.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Федорова О.А. РНКазная активность рекомбинантных субъединиц альфа5 и альфа7 протеасомы // Материалы конференций Политехнического симпозиума. 2009. с. 185186.

2. Федорова О.А. Локализация РНКазного центра субъединицы зета 20S протеасомы // Ломоносов - 2009: Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных; Секция «Биология». Сборник тезисов. 2009. с.194-195.

3. Moiseeva T.N., Fedorova О.А., Mittenberg A.G., Barlev N.A. Novel RNAse activities of proteasome alpha-type subunits are found to be affected by apoptosis induction // FEBS J.

2009. Vol.276 supp.l, p.212-213.

4. Федорова O.A., Моисеева Т.Н., Миттенберг А.Г., Барлев Н.А. РНКазная активность рекомбинантных альфа субъедшшц протеасом, экспрессированных в e.colill биология-наука XXI века. 13-я Пущинская международная школа-конференция молодых учёных. Сборник тезисов. 2009, с.48-49.

5. Kulichkova V.A., Fedorova О.А., Tsimokha A.S., Moiseeva T.N., Bottril A., Lezina L., Gauze L.N., Konstantinova I.M., Mittenberg A.G. and Barlev N.A. 26S proteasome exhibits endoribonuclease activity controlled by extra-cellular stimuli // Cell Cycle. 2010. 9(4): 840 -849.

6. Moiseeva T.N., Fedorova O.A., Mittenberg A.G., Barlev N.A. DNA-damage induction affects RNAse activities and posttranslational modifications of proteasome alpha-type subunits// FEBS J. 2010. Vol.277 supp.l, p.291.

7. Федорова О. А., Моисеева T. H., Миттенберг A. Г., Барлев H. А. Эндорибонуклеазная активность рекомбинантных альфа-субъединиц протеасом // Цитология. 2010. 52 (12): 1012-1015

8. Моисеева Т.Н., Федорова О.А., Цимоха А.С., Миттенберг А.Г., Барлев Н.А Влияние убиквитинилирования на пептидазные активности протеасом при генотоксическом стрессе//Доклады Академии наук. 2010. 435(2): 267-271.

9. Федорова О.А. Субъединица альфа7 протеасомы человека как возможный участник регуляции экспрессии генов // Материалы конференций Политехнического симпозиума. 2010. с.212-213.

10. Федорова О.А., Миттенберг А.Г., Барлев Н.А. Регулируемые эндорибонуклеазные активности рекомбинантных альфа-субъединиц протеасом // Цитология. 2010. 52 (6):509-510.

П.Федорова О.А., Моисеева Т.Н., Миттенберг А.Г, Барлев Н.А. Протеомный анализ белков, взаимодействующих с 20S протеасомой в клетках К562 // Вопросы онкологии.

2010. 56(2):49.

12. Fedorova О.А., Moiseeva T.N., Nikiforov А.А., Tsimokha A.S., Livinskaya V.A., Mark

H., Andrew B.l, Evteeva I.N., Ermolayeva J R., Kuznetzova 1.М., Turoverov K.K., Eperon

I., Barlev N.A. Proteomic analysis of the 20S proteasome (PSMA3)-interacting proteins reveals a functional link between the proteasome and mRNA metabolism // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2011. 416(3-4): 258-265

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Георгиев Г.П., Мантьева В.Л. Биохимия 1962, 27(7):949-957. Евтеева И.Н., Куличкова II.Л., Волкова И.В., Ермолаева Ю.Б., Миттенберг А.Г., Тесленко Л.В., Обухова А.Д., Пеинияйнен В.А., Гаузе Л.Н., Константинова И.М. Цитология 2000, 42(7):675-680. Миттенберг А.Г., Куличкова В.А., Медведева Н.Д., Пепнняннен В.А., Гаузе Л.Н., Константинова И.М. Цитология 2002, 44(2):181-187. Aitken A. Semin. Cancer Biol. 2006, 16(3): 162-172. Asher G., Lotera J., Sachs L.,Kahana C., Shaul Y. Proc. Natl. Acad. Sci. USA

2002, 99(20): 13125-13130. Ballut L., Petit F., Mouzeeyar S. Le Gall O., Candresse T., Schmid P., Nicolas P., Badaoui S. Biochim. Biophys. Acta 2003, 1645:30-39. Benaroudj N.,Tarcsa

E., Cascio P., Goldberg A.L. Biochimie 2001, 83(3-4):311-318. Boelens W.C., Croes Y., de Jong W.W. Biochim. Biophys. Acta 2001, 1544 (1-2):311-319. Collins G.A., Tansey W.P. Curr. Opin. Genet. Dev. 2006, 16(2): 197-202. Demartino G.N., Gillette T.G. Cell 2007, 129(4):659-662. Dignam J.D., Lebovitz R.M., Roeder R.G. Nucleic Acids Res. 1983, 11(5):1475-1489. Ferdous A., Sikder D., Gillette T., Nalley K., Kodadck T., Johnston S.A. Genes Dev. 2007, 21(1):112-123. Fu H., Subramanian R.R., Masters S.C. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2000, 40:617-647. Glickman M.H., Ciechanover A. Physiol. Rev. 2002, 82(2):373-428. Groll M., Bochtler M., Brandstetter H., Clausen T., Huber R. Chembiochem. 2005, 6(2): 222-256. Heinemeyer W., Fischer M., Krimmer T., Stachon U., Wolf D.H. J. Biol. Chem. 1997, 272: 25200-25209. Hermeking H., Benzingcr A. Semin. Cancer Biol. 2006, 16(3):183-192. Jariel-Encontre I., Pariat M., Martin F.,CariIIo S., Salvat C., Piechaczyk M. J. Biol. Chem. 1995, 270(19):11623-11627. Kulichkova V.A., Tsimokha A.S., Fedorova O.A., Moiseeva T.N., Bottril A., Lczina L., Gauze L.N., Konstantinova I.M., Mittenberg A.G., Barlev N.A. Cell Cycle 2010, 9(4):840-849. Laemmli U.K. Nature 1970, 227:680-685. Lupas W„ Baumeister A. Curr, Opin. Struct. Biol. 1997, 7(2):273-278. Maupin-Furlow J.A., Humbard M.A., Kirkland P.A., Li W., Reuter C.J., Wright A.J., Zhou G. Curr Top Dev. Biol. 2006, 75:125-169. Nickell S.,Beck

F., Scheres S.H., Korinek A., Förster F., Lasker K., Mihalachc O., Sun N.,Nagy I., Sali A., Plitzko J.M., Carazo J.M., Mann M., Baumeister W. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2009, 106(29):11943-11947. Pajonk F., McBride W. H. Radiat. Res. 2001, 156:447-459. Pamnani V., Haas B., Puhler G., Sänger H.L,. Baumeister W. Eur. J. Biochem. 1994, 225(2):511-519. Petit F., Jarrousse A. -S., Boissonnet G., Dadet M. -H., Buri J., Briand Y., Schmid H-P. Mol. Biol. Rep. 1997a., 24:113-117. Petit F., Jarrousse A. -S., Dahlmann B., Sobek A., Hendil K.B., Buri J., Briand Y., Schmid H. -P. Biochem. J. 1997b, 326:93-98. Schmid H.P., Pouch M.N., Petit F., Dadet M.H., Badaoui S., Boissonnet G., Buri J., Norris V., Briand Y. Mol. Biol. Rep. 1995,21(1): 43-47. Sdek P., Ying H., Chang D.L., Qiu W., Zheng H., Touitou R., AUday M.J., Xiao Z.X. Mol. Cell. 2005, 20(5):699-708. Shcaff R.J., Singer J.D., Swanger J., Smithcrman M., Roberts J.M., Clurman B.E. Mol. Cell. 2000, 5(2):403-410. Sikder D., Johnston S.A., Kodadek T. J. Biol. Chem. 2006, 281(37):27346-27355. Tai H.C., Besehe H., Goldberg A.L., Schuman E.M. Front. Mol. Neurosci. 2010, 3: 12. Tanaka K. Proc Jpn Acad Ser B Phys. Biol. Sei. 2009, 85(l):12-36. Tarcsa E., Szymanska G., Lecker S., O'Connor C.M., Goldberg A.L. J. Biol. Chem. 2000,275(27):20295-301. Touitou R., Richardson J., Bose S., Nakanishi M., Rivett J., AUday M.J. EMBO J. 2001, 20(10):2367-2375. Tsukahara T., Tanaka K., Ogawa T., Ishiura S., Funabiki R., Sugita H. FEBS Lett. 1989, 255(1):179-183. Verma R.,Chen S., Feldman R., Schieitz D., Yates J.,Dohmen J.,Deshaies R.J. Mol. Biol. Cell. 2000, ll(10):3425-3439. Voges D., Zwickl P., Baumeister W. Annu. Rev. Biochem. 1999, 68:1015-68. Wang X., Chen C.F., Baker P.R., Chen P.L., Kaiser P., Huang L. Biochemistry. 2007, 46(ll):3553-3565. Wojcik C., Buiy M., Stoklosa T., Giermasz A., Feleszko W., MIynarczuk I., Pleban E-, Basak G., Omura S., JakobisiakM. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2000, 32: 957-965. Yi P., Feng Q., Amazit L., Lonard D.M., Tsai S.Y., Tsai M.J., O'Malley B.W. Mol. Cell. 2008, 29(4):465-476.

Подписано в печать 16.04.2012 Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,25 Тираж 100 экз. Заказ 140

Отпечатано в типографии «Адмирал» 199178, Санкт-Петербург, В.О., 7-я линия, д. 84 А

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федорова, Ольга Андреевна, Санкт-Петербург

61 12-3/1044

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ

На правах рукописи

ФЕДОРОВА Ольга Андреевна

РОЛЬ НРОТЕАСОМ И ИХ СУБЪЕДИНИЦ «-ТИПА В ГИДРОЛИЗЕ

РНК И СПЛАЙСИНГЕ

03.01.03. - молекулярная биология

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Н.А.Барлев,

Институт цитологии РАН.

Санкт-Петербург 2012

Содержание:

1.1. Введение..................................

1.1. Актуальность проблемы......................................................5

1.2. Цели и задачи исследования....................................................g

1.3. Основные положения, выносимые на защиту.................... 8

1.4. Научная новизна полученных результатов..................... 8

1.5. Теоретическое и практическое значение работы.........................9

1.6. Публикации...........................

......................................................9

1.7. Апробация работы..................................................................д

1.8. Финансовая поддержка работы................................................................j 0

1.9. Структура и объем работы....................................................................2 0

1.10. Личный вклад автора..............................................................I q

2. Обзор литературы......................................................................12

2.1. 26S протеасома.................................

2.1.2. 20S протеасома......................................................................22

2.1.3. Регуляторные комплексы........................................................................16

2.1.3.1.19S регуляторный комплекс............................................................2 6

2.1.3.2.11S регуляторный комплекс..............................................................2 8

2.1.3.3. Регулятор протеасом РА200 (BlmlO)................................ 20

2.1.3.4. Ингибиторы 20S протеасом..............................................................21

2.2. Локализация протеасом в клетке......................................................22

2.3. Ферментативные активности протеасом............................ 23

2.3.1. Протеолитические активности протеасом...................... 23

2.3.1.1. Убиквитин-зависимый протеолиз..................................................25

2.3.1.2. Убиквитин-независимый протеолиз............................................27

2.3.2. Эндорибонуклеазная активность протеасом....................... 29

2.4.. Участие протеасом в различных клеточных процессах................33

2.4.1. Участие протеасом в регуляции транскрипции.........................34

2.4.2. Участие протеасом в регуляции клеточного цикла.....................38

2.4.3. Участие протеасом в иммунном ответе..........................................40

2.4.4. Репарация ДНК........................................................................................42

2.4.5. Участие протеасом в апоптозе..............................................................45

2.4.6. Протеасомы и сплайсинг............................................................................48

2.5. Белки, ассоциированные с протеасомой............................ 50

3. Материалы и методы....................................................................53

3.1. Культивирование клеток......................................................................53

3.2. Создание экспрессионных векторов............................... 53

3.3. Экспрессия и очистка химерных белков............................ 54

3.4. Транскрипция in vitro..............................................................................56

3.5. Выделение препаратов цитоплазматических РНК.....................56

3.6. Обработка РНК с помощью химерных белков..........................57

3.7. Электрофорез РНК в денатурирующих условиях......................57

3.8. Электрофорез РНК в нативных условиях...............................58

3.9. Получение клеточного экстракта........................................................58

3.10. Получение цитоплазматической и ядерной фракций белков........58

3.11. Метод GST-pulldown....................................................... 59

3.12. Диск-электрофорез белков по Лэммли................................... 59

3.13. Вестерн-блоттинг......................................

3.14. Двухмерный электрофорез белков.......................................

3.15. Масс-спектрометрия...................................

3.16. Сплайсинг in vitro....................................

4. Результаты...............................................

4.1. РНКазная активность рекомбинантных субъединиц а-типа протеасом человека..................................................................................^4

4.2. Анализ связывания клеточных белков с рекомбинантной субъединицей а7 протеасомы человека....................................................................70

4.3. Анализ связывания белков, участвующих в сплайсинге, с рекомбинантной субъединицей а7 протеасомы человека......................76

4.4. Участие протеасом в регуляции альтернативного сплайсинга..............................................................................У У

4.5. Участие протеолитических активностей протеасом в регуляции сплайсинга.........

.....................................................................79

5. Обсуждение........................

.....................................................о!

6. Выводы..........................................................^

Список сокращений......................................^

Список работ, опубликованных по теме диссертации........................ 94

Литература................................................................^

1.Введение.

1.1. Актуальность проблемы.

Протеасома — это мультисубъединичный белковый комплекс, одна из главных задач которого в клетке состоит в направленной и специфической деградации белков. Изучение роли протеасом в различных клеточных процессах приобретает все большую актуальность в связи с многочисленными экспериментальными данными об их участии в процессах раковой трансформации, старения и нейродегенерации. Модуляция активности протеасом влияет на клеточные процессы, такие как транскрипция, прохождение по клеточному циклу, репарация ДНК, дифференцировка, развитие, иммунный ответ (Wojcik et al., 2000; Pajonk, McBride, 2001; Glickman, Ciechanover, 2002; Collins, Tansey, 2006; Maupin-Furlow et al., 2006; Reed, 2006; Sikder et al., 2006; Ferdous et al., 2007).

Под термином протеасома или 26S протеасома обычно подразумевают белковый комплекс, состоящий из 20S корового комплекса (CP или 20S протеасома) и 19S регуляторного комплекса (RP, также известного как 19S протеасома или РА700) (Groll et al., 2005; Nickell et al., 2009). Коровый комплекс является каталитическим центром 26S протеасомы и представляет собой полый цилиндр, состоящий из четырех гептамерных колец. Каждое кольцо образуется семью гомологичными, но не одинаковыми субъединицами. Два внешних кольца состоят из семи а-субъединиц (а1-а7) и формируют "ворота", через которые входят субстраты и высвобождаются продукты. "Ворота" корового комплекса ограничивают размер субстрата, который способен проникать внутрь протеолитической камеры. Два внутренних кольца образованы семью ß-субъединицами (ßl-ß7) (Lupas and Baumeister, 1997; Voges et al., 1999). Известно, что субъединицы ßl(Y), ß2(Z), ß5(X) обладают каспазо-, трипсино- и химотрипсиноподобной активностью, соответственно (Heinemeyer et al., 1997).

Наиболее известной функцией протеасом является убиквитин-

зависимый протеолиз белков, однако в начале 1990-х годов впервые было показано, что протеасома способна расщеплять некоторые белки без предварительного убиквитинилирования. Эксперименты показали, что к таким белкам относятся: с-1ип (1апе1-Епсоп1хе et а1., 1995), кальмодулин (Тагсза й а1., 2000), тропонин С (Вепагоиё) й а1., 2001), ингибитор циклин-зависимых киназ р21С1р1 (Sheaff et а1., 2000), опухолевый супрессор р53 (АБЬег е1 а1., 2002).

Более детальное изучение этого процесса показало, что такие белки как кристаллин аВ (Вое1еш е1 а\., 2001), ингибитор циклин-зависимых киназ р21 (Тоикои е1 а1., 2001), коактиватор стероидного рецептора (8ЯС-3) (У{ а1., 2008) и опухолевый супрессор Шэ (Sdek е1 а1., 2005) деградируют без предварительного убиквитинилирования через связывание с субъединицей а7.

В 1989 году впервые было показано, что протеасомы обладают эндорибонуклеазной активностью (ТзикаИага е1 а1., 1989). Дальнейшие исследования доказали, что 208 протеасомы, выделенные из подсолнечника, были способны расщеплять РНК вируса табачной мозаики и вируса мозаики салата (Ва11и1 й а1., 2003). Далее было показано, что РНКазной активностью обладают также 268 протеасомы, выделенные из клеток линий человека А431 и К562, при этом субстратом для расщепления могут быть различные РНК эукариот - как рибосомные, так и специфические информационные (Евтеева и др., 2000; Миттенберг и др., 2002; КиНсЬкоуа е1 а1, 2010). Установлено также, что протеасомы сами содержат низкомолекулярные РНК, которые формируют гетерогенную популяцию молекул с длиной от 20 до 120 нуклеотидов (Рашпаш е1 а1., 1994; 8с1ншс1 е1 а1., 1995). Однако происхождение и природа этих РНК до конца не известна.

Регуляция протеолитических и эндорибонуклеазных функций протеасом может осуществляться с помощью дополнительных белков, которые ассоциированы с протеасомами. Недавние исследования показали,

что существует ряд дополнительных белков, которые связаны с 26S протеасомами (Verma et al., 2000; Wang et al., 2007). Эти белки могут быть условно разделены на две группы: факторы, относящиеся к системе убиквитинилирования, и белки, которые регулируют функции протеасом. К первой группе белков относятся деубиквитинилирующие ферменты (USP14 и Uch37) (Demartino and Gillette, 2007), ЕЗ лигазы (Hul5/KIAA10, Е6АР и Parkin), а также некоторые Е2 лигазы (Ubc 1, 2, 3, 4 и 5) (Demartino and Gillette, 2007). Функции белков, относящихся ко второй группе, более сложно определить. К примеру, удалось показать, что с 26S протеасомой, выделенной из коры головного мозга крыс, связываются белки семейства 14-3-3 (gamma и zeta/delta) (Tai et al., 2010). Белки 14-3-3 участвуют в различных процессах, включая регуляцию клеточного цикла, контроль за метаболизмом, апоптоз и транскрипцию генов (Fu et al. 2000, Aitken 2006, Hermeking and Benzinger 2006). Существует множество других белков, которые связаны с протеасомами, таких как p28/gankirin, Rpnl4, р27 и S5b. Некоторые из них, предположительно, отвечают за регуляцию 26S протеасом или сборку корового комплекса с регуляторными субъединицами (Tanaka, 2009). Однако функциональная значимость этого связывания неоднозначна и требует дальнейшего изучения.

В связи с тем, что ферментативные активности протеасом отличаются в раковых клетках от нормальных, приобретает особую значимость изучение механизмов регуляции специфических активностей протеасом, в частности через белок-белковые взаимодействия. Эти данные могут в дальнейшем позволить обнаружить новые ингибиторы активностей протеасом, как протеолитических, так и неканонических, в качестве возможных противораковых препаратов. Соответственно, учитывая данные о наличии эндорибонуклеазной активности у протеасом и их ассоциации с низкомолекулярными РНК и белками сплайсинга, представляет интерес как определение спектра белков, связывающихся с коровым протеасомным комплексом, так и изучение влияния протеасом на

метаболизм РНК.

1.2 Цели и задачи исследования.

Целью данной работы является изучение роли протеасом и их отдельных субъединиц в расщеплении РНК и сплайсинге.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Проверка наличия РНКазной активности и ее сравнение у рекомбинантных белков субъединиц альфа-типа 20S протеасомы.

2. Определение спектра белков, способных связываться с 20S протеасомой (субъединица al).

3. Изучение участия протеасом в альтернативном сплайсинге.

1.3 Основные положения, выносимые на защиту.

1. Рекомбинантные субъединицы al, a2, a3, а4, а5 и а7 20S корового комплекса обладают РНКазной активностью.

2. РНКазная активность al, a2, a3, а4, а5 и al 20S корового комплекса зависит от присутствия ионов Са2+ и Mg2+.

3. Рекомбинантная субъединица al (PSMA3) 20S протеасомы способна связываться с белками, участвующими в различных клеточных процессах: транскрипция, трансляция, репарация ДНК, сплайсинг.

4. Протеасомы участвуют в регуляции альтернативного сплайсинга in vitro гена SMN1, при этом протеолитические активности 20S протеасом не критичны для подавления сплайсинга.

1.4 Научная новизна полученных результатов.

В данной работе был впервые определен спектр белков, способных связываться с PSMA3 (а7) корового комплекса. Были идентифицированы как цитоплазматические, так и ядерные белки, ассоциированные с субъединицей al, которые отвечают за важные клеточные процессы:

транскрипцию, трансляцию, репарацию ДНК и сплайсинг.

Удалось показать, что субъединицы альфа-типа корового комплекса протеасом обладают регулируемыми РНКазными активностями. Впервые показано, что 208 протеасома участвует в альтернативном сплайсинге. Таким образом, в данной работе впервые установлена роль субъединиц альфа-типа протеасом в метаболизме РНК.

1.5 Теоретическое и практическое значение работы.

Внимание большинства исследователей сосредоточено на роли протеасом в убиквитин-зависимом протеолизе, однако другие функции остаются малоизученными. Полученные результаты имеют фундаментальное значение для определения роли протеасом в сплайсинге и расщеплении РНК. Кроме того, изучение роли протеасом в альтернативном сплайсинге гена БМШ имеет практическое значение для лечения спинальной мышечной дистрофии.

1.6. Публикации.

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 4 статьи в рецензируемых журналах.

1.7 Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на Политехнических симпозиумах «Молодые учёные - промышленности Северо-Западного региона» 2009 и 2010 года (Санкт-Петербург), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2009» (Москва, 2009), 13-й Международной Пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009), 34-м и 35-м конгрессах Европейского биохимического сообщества (Прага, 2009; Гётеборг, 2010), 2-й конференции молодых учёных ИНЦ РАН (Санкт-

Петербург, 2010), VI конференции «Фундаментальная онкология -Петровские чтения» (Санкт-Петербург, 2010).

1.8 Финансовая поддержка работы.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (проекты №08-04-00834 и №10-04-01234), Программы Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология", ФЦНТП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 годы ГК No. 16.740.11.0366 и ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы" ГК No. 16.512.11.2242

1.9 Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 115 страницах машинописного текста, иллюстративный материал содержит 4 таблицы, 3 схемы и 13 рисунков.

1.10 Личный вклад автора.

Идентификация белков, ассоциированных с рекомбинантным белком GST-a7, была осуществлена с помощью метода масс-спектрометрии совместно с Андрю Боттриллом в отделе биохимии (Университет Лестера, Англия). Влияние протеасом на сплайсинг in vitro было определено в совместных исследованиях с Т.Н.Моисеевой и Ианом Эпероном в отделе биохимии (Университет Лестера, Англия).

Лично автором были получены экспрессионные вектора, содержащие гены субъединиц al, a2, a3, а4, а5 и а7, подобраны оптимальные условия синтеза и очистки рекомбинантных белков. Автором также проведены исследования наличия РНКазной активности у субъединиц al, a2, a3, а4,

а5 и а7 протеасом человека. GST-pulldown и двухмерный электрофорез ассоциированных с субъединицей а7 белков были проведены также лично автором. Лично автором проведен иммуноблот анализ для подтверждения связывания белков, участвующих в сплайсинге, с субъединицей а7.

Материалы, вошедшие в данную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем.

2. Обзор литературы 2.1. 26S протеасома

Под словом "протеасома" (англ. protease - протеиназа и лат. soma -тело) обычно подразумевают белковый комплекс, который является высоко консервативным для всех эукариот и называется 26S протеасома (схема 1). Этот комплекс состоит из более чем 30 различных белковых субъединиц и имеет молекулярную массу около 2МДа (таблица 4). 26S протеасомы делятся на 20S коровый комплекс (CP - core particle или 20S протеасома) и 19S регуляторный комплекс (RP - regulatory particle, также известный как 19S протеасома или РА700) (Groll et al., 2005; Nickell et al., 2009).

19S RP

Rpn3,5-9,11 Rpn12, 15

G> RpnIQ

Rpn1, 2,13

20SCP

19S RP

Схема. 1. Схематический рисунок 26S протеасомы (Xie Y., 2010).

2.1.2 20S протеасома

Коровый комплекс (CP) или 20S протеасома является

каталитическим центром 26S протеасомы, который отвечает за АТФ зависимую деградацию убиквитинилированных белков.

Коровый комплекс у эукариот представляет собой полый цилиндр длиной 148 Á, диаметром 113 Á и молекулярной массой около 750кДа. 20S протеасома состоит из 14 различных субъединиц с молекулярной массой

от 21 до 34 кДа. Эти субъединицы по признаку гомологичности делятся на а и ß (Lowe et al., 1995). Полая цилиндрическая структура и количество субъединиц сохраняется в течение эволюции от архебактерий Thermoplasma acidophilum (Lowe et al., 1995) и дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Groll et al., 1997), тогда как спектр гомологичных белков, составляющих группу а- или ß- субъединиц увеличивается в течение эволюции.

Коровый комплекс эукариот состоит из четырех гептомерных колец, каждое из которых образуется семью гомологичными, но не одинаковыми субъединицами. Два внешних кольца состоят из семи а- субъединиц (а1-а7) и формируют "ворота" через которые происходит вход субстратов и высвобождение продуктов. Два внутренних кольца образованы семью ß-субъединицами (ßl-ß7) (Coux et al., 1996; Schidtke et al., 1996; Groll et al., 1997; Voges et al., 1999) (схема 2.).

Схема.2. Кристаллическая структура 20S протеасомы (коровый комплекс, СР):

a) Коровый комплекс большинства архебактерий, состоящий из 14 идентичных а или ß субъедниц,

b) эукариотический коровый комплекс, состоящий из семи разных а или ß субъединиц,

c) схематический рисунок эукариотического 20S протеасомы (СР) �