Изменения состава и ферментативных активностей протеасом при апоптозе в клетках К562

Цимоха, Анна Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изменения состава и ферментативных активностей протеасом при апоптозе в клетках К562
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изменения состава и ферментативных активностей протеасом при апоптозе в клетках К562"

1вах рукописи □030527Б 1 >77.218+577.152.277*16

Г ьЛ

Цимоха

Анна Сергеевна

ИЗМЕНЕНИЯ СОСТАВА И ФЕРМЕНТАТИВНЫХ АКТИВНОСТЕЙ ПРОТЕАСОМ ПРИ АПОПТОЗЕ В КЛЕТКАХ К562

03.00.03. - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2007

003052761

Работа выполнена в лаборатории регуляции экспрессии генов Института цитологии РАН, Санкт-Петербург.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Константинова Ирина Михайловна, Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Корнилова Елена Сергеевна, Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор Перевозчиков Андрей Петрович, НИИ экспериментальной медицины РАМН, г. Санкт-Петербург

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский Государственный Университет, биолого-почвенный факультет

Защита состоится «30» марта 2007 года в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий проспект, д. 4 e-mail: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан «26» февраля 2007 года

Ученый секретарь Диссертационного ( кандидат биологических наук Е.В.Каминская

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Апоптоз, или программированная клеточная гибель, является важнейшим механизмом контроля над качеством и численностью клеточной популяции в многоклеточном организме. Он обеспечивает равновесие в пролиферации клеток, элиминации поврежденных (например, радиацией), пораженных вирусом и неопластических клеток, а также селекцию лимфоцитов, при которой удаляются аутоиммунные клоны. Неспособность клеток претерпевать апоптоз - это один из ключевых моментов в опухолеобразовании. Молекулярные механизмы, задействованные в этом процессе, до сих пор окончательно не исследованы.

В настоящее время широко изучается участие в апоптозе протеасом. При использовании ингибиторов протеасом обнаружили как проапоптозное, так и антиапоптозное функционирование протеасом в клетке (Wojcik, DeMartino, 2003; Yang et al., 2006). Такие противоположные роли протеасом в регуляции апоптоза, по-видимому, обусловлены пролиферативным статусом клетки (Sohn et al., 2006).

Для осуществления разнообразных функций в клетке протеасомы должны быть подвержены строгому регуляторному контролю. Фосфорилирование регуляторных белков (например, киназ) является ключевым моментом в передаче сигнала, продвижении клетки по клеточному циклу и в апоптозе (Ptacek, Snyder, 2006). Фосфорилирование субстратов и ферментов также играет важную роль в убиквитин-протеасомном пути (Glickman, Ciechanover, 2002). Известно также, что 26S протеасомы постгрансляционно модифицируются в различных случаях как фосфорилированием (Bose et al., 1999, 2004), так и N-ацетилированием (Claverol et al., 2002), гликозилированием (Zachara, Hart, 2004) и 4-гидрокси-2-ноненил-алкилированием (Farout et al., 2006). Из всех известных модификаций субъединиц протеасом чаще всего исследуется фосфорилирование (Tanaka et al., 1990; Bose et al., 1999; Iwafune et al., 2002; Tokumoto et al., 1999; Umeda et al., 1997). Обнаружены сайты потенциального фосфорилирования на субъединицах 20S протеасомы и 19S регуляторных комплексов, и, исходя из этого, выдвинуто предположение о возможном контроле протеолитической активности протеасом посредством фосфорилирования (Bose et al., 1999; Fernandez Murray et al., 2002). Так, например, дефосфорилирование аЗ и а7 субъединиц протеасом приводило к снижению двух пептидазных активностей протеасом (Mason et al., 1996). Кроме того, фосфорилирование субъединиц протеасом ответственно за ассоциацию 20S протеасомы и 19S регуляторных комплексов (Rivett et al., 2001). Известно, что в зависимости от стадии клеточного цикла, изменялся статус фосфорилирования протеасом (Iwaftine et al., 2002), и что некоторые клеточные сигналы также вызывают изменения в фосфорилированности субъединиц протеасом (Bose et al., 2001; Bardag-Gorce et al., 2004). Однако воздействие индукторов апоптоза на изменение статуса фосфорилирование протеасом не исследовалось.

Основываясь на том, что при индукции апоптоза в дифференцированных клетках изменялся субъединичный состав и протеолитическая активность протеасом, было сделано предположение, что такие изменения в протеасомах могут приводить к усилению деградации по протеасом-убиквитиновому пути определенных клеточных белков, приводящих к апоптозу (Naujokat, Hoffmann, 2002). Однако до сих пор нет данных об изменении субъединичного состава и регуляции активностей протеасом в быстропролиферирующих клетках при индукции апоптотической гибели. Кроме того, при индукции апоптоза в клетках не было исследовано изменение эндорибонуклеазной активности протеасом. Не исследовано влияние изменения статуса фосфорилирования протеасом на их протеолитическую и эндорибонуклеазную активности при индукции апоптоза как в дифференцированных, так и в быстро пролиферирующих клетках. Одним из актуальных и наименее исследованных, кроме всего прочего, является вопрос о гетерогенности популяции протеасом в клетке (в том числе, в отдельных клеточных компартментах), о назначении множественных форм протеасом. Так, например, нет данных об исследованиях субъединичного состава, статуса фосфорилирования и ферментативных активностей ядерных протеасом при индукции апоптоза в клетках.

В свете вышесказанного, представляется весьма актуальным исследование специфических изменений субъединичного состава и статуса фосфорилирования протеасом, очищенных из цитоплазмы и ядер клеток проэритролейкемии человека линии К562 при индукции программированной клеточной гибели при помощи диэтилмалеата (ДЭМ) или доксорубицина (ДР). Кроме того, важно проанализировать воздействие данных индукторов апоптоза на протеолитическую и эндорибонуклеазную активности протеасом, а также влияние дефосфорилирования протеасомных субъединиц на ферментативных активностей протеасом при индукции апоптоза в клетках К562.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование субъединичного состава и ферментативных активностей протеасом при индукции апоптоза в клетках проэритролейкемии человека линии К562. Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:

1. На модели индукции апоптоза в быстро пролиферирующих клетках К562 с помощью противоопухолевого препарата доксорубицина и глутатион-истощающего агента диэтилмалеата провести сравнительный анализ субъединичного состава и протеолитической активности ядерных и цитоплазматических протеасом.

2. Исследовать влияние индукторов апоптоза на эндорибонуклеазную активность протеасом из ядер и цитоплазмы клеток К562.

3. Оценить изменения в статусе фосфорилирования по треонину, серину и тирозину субъединиц ядерных и цитоплазматических протеасом при индукции апоптоза в клетках К562.

4. Исследовать влияние дефосфорилирования белковых субъединиц изучаемых частиц на протеолитическую и РНКазную активности протеасом, выделенных из ядер и цитоплазмы клеток К562 в контроле и при индукции апоптоза.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При индукции апоптоза с помощью ДЭМ или ДР в клетках К562 наблюдаются специфические изменение субъединичного состава протеасом и статуса фосфорилирования, то есть перепрограммирование популяции цитоплазматических протеасом.

2. При индукции апоптотической гибели в клетках К562 происходит также перепрограммирование популяции ядерных протеасом.

3. Воздействие на клетки К562 индукторов апоптоза (ДЭМ и ДР) приводит к изменению специфичности ферментативных (протеолитической и эндорибонуклеазной) активностей протеасом.

4. Изменение статуса фосфорилирования протеасом при индукции апоптоза в клетках К562 регулирует как протеолитическую, так и эндорибонуклеазную активности исследуемых частиц.

Научная новизна полученных результатов. В настоящей работе впервые показано, что индукция апоптоза в быстро пролиферирующих клетках (на примере клеток проэритролейкемии человека линии К562) вызывает изменения субъединичного состава цитоплазматических и ядерных протеасом и их протеолитической активности. Причем при действии на клетки К562 индукторов апоптоза наблюдается изменение специфичности протеолитической активности протеасом: выявлено селективное изменение трипсин- и химотрипсин-подобных типов протеолитической активности как цитоплазматических, так и ядерных протеасом.

Впервые при индукции апоптотической программы выявлены изменения статуса фосфорилирования по треонину, серину и тирозину ядерных и цитоплазматических протеасом, а также их эндорибонуклеазной активности. Наблюдается дифференциальная регуляция РНКазной активности протеасом при действии индукторов апоптоза на клетки К562. Полученные результаты свидетельствуют также о существовании пока не исследованной системы регуляции статуса фосфорилирования протеасом (причем различной в ядре и цитоплазме) в составе программы ответа клетки на действие индукторов апоптоза.

Выявлено, что при индукции апоптотической программы в клетках К562 наблюдаются модификации субъединиц 208 протеасомы, в том числе каталитических, ассоциированных с протеолитической активностью трипсин-подобного типа ф2) и РНКазной активностью (а5/ге1а и а6/ю1а).

Впервые исследован механизм регуляции протеолитической и эндорибонуклеазной активностей протеасом при индукции апоптоза, а именно обнаружена зависимость исследуемых активностей от дефосфорилирования белковых субъединиц протеасом.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты свидетельствуют об изменениях субъединичного состава, ферментативных активностей и статуса фосфорилирования, то есть о перепрограммировании популяции цитоплазматических и ядерных протеасом при индукции апоптоза в клетках К562. Результаты работы имеют большое значение для дальнейшего углубленного изучения молекулярных механизмов, задействованных в апоптозе; могут служить теоретической основой для разработки терапевтических подходов в лечении лейкемии, так как индукцию апоптоза используют для терапии рака. Протеасомы человека могут быть использованы в качестве новых фармакологических мишеней (Wojcik, 2002). Так, ингибиторы протеасом уже сейчас активно исследуются в качестве агентов противоопухолевой терапии (Vink et al., 2006). Однако результаты экспериментов с использованием ингибиторов протеасом должны соответствовать данным по сравнительному анализу структуры и функций протеасом в норме и при патологии.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 6 статей.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены Всероссийских симпозиумах «Клеточная биология на пороге XXI века» (Санкт-Петербург, 2000), «1-й съезд Общества клеточной биологии» (Санкт-Петербург, 2003), «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006); на XV Всероссийском совещании «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2005), а также на Международных конгрессах по молекулярной биологии и генетике (Киев, 2003), по внутриклеточному сигналингу (Дубровник, 2004), по биологии клетки в культуре "Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия" (Санкт-Петербург, 2004) и 30-м конгрессе Европейского биохимического общества "The Protein World. Proteins and Peptides: Structure, Function and Organization" (Будапешт, 2005).

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 02-04-49621, 05-0449606), гранта Президента РФ по поддержке ведущих научных школ (НШ-523.2006.4), Санкт-Петербургского Научного Центра 2006 года и с использованием оборудования ЦКП «Материаловедение и диагностика в передовых технологиях».

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, иллюстративный материал содержит 17 рисунков.

Материалы и методы исследований

Клетки проэритролейкемии человека линии К562 (Lozzio, Lozzio, 1975), полученные из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН), культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки. Для индукции апоптоза в культуральную жидкость добавляли диэтилмалеат

(ДЭМ) до конечной концентрации 1 мМ (Castelli et al., 1998) или доксорубицин (ДР) в концентрации 4 мкМ (Anand et al., 1995) и инкубировали клетки в течение 24 ч. Индукцию апогтгоза оценивали по изменению морфологии ядер и по межнуклеосомной фрагментации ДНК.

Выделение РНК. Ядерную и цитоплазматическую РНК выделяли методом фенольно-термического фракционирования (Георгиев, Мантьева, 1962).

Ядра и цитозоль выделяли согласно методу, описанному Константиновой и соавторами (1995). Электрофоретический анализ белков и РНК, выделение и очистку плазмид осуществляли согласно известным рекомендациям (Laemmli, 1970; Maniatis et al., 1982).

Выделение протеасом. 26S протеасомы выделяли из постмитохондриального супернатанта цитозоля клеток или из ядерного экстракта с помощью центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы (15-30%) и ионообменной хроматографии на DE целлюлозе (Hough et al., 1987).

Пептидазную активность протеасом трипсин-подобного типа определяли по гидролизу флуорогенного пептида - Bz-DL-Arg-AMC (Bachem, Швейцария), а химотрипсин-подобного типа - по гидролизу Bz-Ala-Ala-Phe-AMC (Bachem, Швейцария). Для этого 0.05 мкмоль субстрата инкубировали с 5 мкг протеасом в течение 45 мин при температуре 37 *С в буферном растворе, содержащем 50 мМ Трис-НС1, pH 7.5, 1 мМ MgC12, 10 мМ KCl, 1 мМ DTT, 5 мМ АТФ. Реакцию останавливали, добавляя равный объем смеси 70 мМ уксусной кислоты, 100 мМ хлорацетата натрия и 30 мМ ацетата натрия (Barret, 1980). Концентрацию продукта гидролиза (7-амино-4-метилкумарина) определяли на флуориметре (Туроверов и др., 1998), измеряя экстинкцию и эмиссию при длинах волн 365 и 440 нм соответственно (Barret, 1980).

Обработка РНК с помощью протеасом. РНК инкубировали с 26S протеасомами в буферном растворе, содержащем 20 мМ Hepes, pH 7.6 , 50 мМ KCl, 0.1 мМ ЭДТА, 10 % глицерина, 0.5 мМ PMSF, 2 мМ DTT, 1 мМ АТФ в течение 30 мин при температуре 37 °С. Каждая проба содержала 15 мкг РНК и 5-15 мкг протеасом (в случае экспериментов с немечеными субстратами). Если же препарат РНК предварительно подвергался радиоактивному мечению, то количество субстрата, необходимое для постановки одной реакции, определялось по включению радиоактивной метки, при этом соотношение субстрат-фермент оставалось прежним.

Транскрипция in vitro. мРНК р53 была синтезирована с помощью транскрипции в бесклеточной системе вектора Bluescript KS(-), в который по сайту EcoRI вставлена последовательность кДНК гена дикого типа р53 человека. Плазмиду расщепляли рестриктазой BamHI для перевода в линейную форму, после чего транскрибировали (с использованием [а-32Р] ЦТФ) ТЗ РНК полимеразой (для получения смыслового транскрипта), либо переваривали эндонуклеазой рестрикции HindIII, а затем осуществляли транскрипцию Т7 РНК-полимеразой (для получения антисмысловой последовательности). Плазмида была любезно предоставлена д-ром

П.М.Чумаковым. Фрагмент З'-нетранслируемой области мРНК с-тус был получен в результате транскрипции in vitro в системе вектора pGEM, в который была вставлена 3'-нетранслируемая последовательность мРНК с-тус человека. Для получения смысловой последовательности плазмиду линеаризовали с помощью рестриктазы BamHI и транскрибировали РНК полимеразой фага SP6, согласно инструкциям фирмы-изготовителя (Fermentas Life Sciences, Литва). Транскрипцию вели в присутствии [а-32Р] ЦТФ в течение 2 ч при 37 °С. Транскрибированную РНК обрабатывали ДНКазой I и очищали депротеинизацией с помощью смеси фенол-хлороформ.

Обработка протеасом щелочной фосфатазой кишечника теленка (CIAP). Протеасомы инкубировали при 37 °С в течение 90 мин в буферном растворе, содержащем 10 мМ трис-HCl, pH 7.5 и 10 мМ MgC12, с щелочной фосфатазой в количестве 2 единицы фермента на 1 мкг протеасом.

Двумерный электрофорез белков. Двумерный электрофорез (2-ДЭ) белков проводили согласно инструкциям фирмы изготовителя (Bio-Rad, США). Электрофорез во втором направлении проводили в 12%-ном ПААГ в стандартной системе Лэммли (Laemmli, 1970). Белки визуализировали при помощи окрашивания серебром.

Анализ содержания субъединиц протеасом и их статуса фосфорилирования проводили методом вестерн-блотинга. Концентрацию белка в очищенных препаратах 26S протеасом определяли спектрофотометрически методом Брэдфорд (Bradford, 1976) и уравнивали пробы по количеству белка между собой. Вестерн-блотинг проводили по стандартным методикам. Белки выявляли методом усиленной хемилюминесценции (ECL), согласно инструкции фирмы-изготовителя (ICN, США), или SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Pierce, США). В качестве специфических антител использовали антитела к субъединицам протеасом al, a2, аЗ, а4, а5, аб, а7, ß2, ß3 и ß7 (все BioMol, Англия). Были использованы также антитела к фосфорилированным аминокислотам: Туг (BD, США), Thr (Cell Signaling, США) и Ser (Sigma, США). В качестве вторичных антител были использованы кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши или козьи антитела против иммуноглобулинов кролика (Sigma, США).

Результаты и обсуждение

В работе использовали индукцию апоптоза в клетках проэритролейкемии человека линии К562 (Токтарова и др., 2004; Цимоха и др., 2006). Эта клеточная линия представляет собой прекрасную мишень для таких индукторов апоптоза, как глутатион-истощающий агент диэтилмалеат (Varghese et al., 2003) и широко применяемый в раковой терапии противоопухолевый препарат доксорубицин (Anand et al., 1995).

Для анализа изменений субъединичного состава протеасом под действием индукторов апоптоза препараты очищенных 26S протеасом, выделенных из цитоплазмы клеток К562, фракционировали при помощи метода двумерного электрофореза белков (Цимоха и др., 2005, 2006; Tsimokha et al., 2005). Как видно на рис. 1, после действия индукторов апоптоза на клетки К562 цитоплазматические 26S комплексы особым

образом изменяются. Содержание некоторых изоформ отдельных субъединиц повышается при индукции апоптоза, в то время как других, напротив, снижается, Наблюдая изменения субъединичного состава протеасом, можно предположить, что в процесс выполнения программы клеточной гибели вовлечена специфическая субпопуляция протеасом. Однако на основании представленных результатов нельзя судить о том, каким образом происходят наблюдаемые изменения в субъединичном составе протеасом - благодаря ли модификациям протеасомных субч>единиц или же изменениям их экспрессии после воздействия индуктора апоптоза.

|>Н э

- é

фа ,

■А

/ f Л

117

33 28

Рис. 1. Эленпрофореграмма 265 протеасом, выделенных из цитоплазм ы контрольных (сверху, К) и обработанных ДЭМ (слева, ДЭМ) иди ДР (справа, ДР) клеток К562. Стрелками указаны положения су&ъединиц 20Э протеасом, выявленных с помощью и м мунодетекци и.

М - маркеры мал. масс (МВ1 Г'еппег^ак). Электрофорез в 12%-ном ПААГ, окраска серебром

Рн .1

ДЭМ

iiptwí "Í**3

/ betó j

■ А \

117 92

33 28

22 kl)á

ДР

ilphn?

4. ilphal i rj -

nlptu4

Наблюдая при индукции апоптоза в клетках К562 изменения субъединичного состава, мы решили исследовать, насколько эти изменения обусловлены модифицированием (и каким образом) протеасомных субъединиц после воздействия на клетки индукторов апоптоза. Для решения этой задачи применили метод иммуноблотинга с использованием антител к субъединицам 20$ протеасомы (Tsimokha et al., 2005). Как видно на рис. 2, протеасомы, выделенные из клеток человека линии К562, проявляют ту или иную степень гетерогенности, характеризуемую присутствием различных изоформ некоторых субъединиц 20S протеасомы. Причем во многих случаях эти изоформы отличались значениями pl, но не молекулярными массами, что свидетельствует о наличие различных посттрансляционных модификаций субъединии протеасом, но не является результатом частичного гидролиза этих белков или альтернативного сплайсинга (Clavero! et а!., 2002). Так, большая часть а- су&ъединиц и

три р-субъсдиницы (р2, р.1 и (57) цитоплазматических протеасом из контрольных клеток в той или иной степени модифицированы (рис. 2). Кроме того, при индукции апоптоза в клетках К562 изменяются вид и степень модификаций для одной и той же су&ъединицы. Такие данные вполне могут свидетельствовать в пользу существования специфической (или специфических) субпопуляции протеасом, вовлеченной в реализацию программы клеточной гибели.

дэм

И !

- -

ДР

ДЭМ _

ДР

м____

[7; % .

рз

ПГ1® и

рз

Рис. 2. При индукции апоптоза в клетках К562 наблюдается модифицирование субъсдиниц цитоплазматических протеасом.

Элсктрофореграмма 26Й протеасом, выделенных из цитоплазмы контрольных (посередине, К) и обработанных ДЭМ (слева, ДЭМ) или ДР (справа, ДР) клеток К562.

Электрофорез в 12%-ком ПЛАГ Иммуноблотинг проводился с использованием антител к субъединицам 205 протеасомы (все субъединицы а-типа и три субъединицы (З-типа).

Сравнимая модификации белковых субъсдиниц протеасом из контрольных и

индуцированных клеток К562 (рис. 2) выявляются некоторые общие тенденции в

действии индукторов апоптоза. Так, при индукции апоптоза снижается содержания

(наблюдается уменьшение разнообразия) изоформ таких субъсдиниц, как а2, а4, аб и

¡33; количество изоформ субъсдиницы аЗ, напротив, возрастает после воздействия на

клетки К562 аноптотических индукторов. Кроме того, наблюдается перераспределение

изоформ а1 субъединицы протеасом после добавления и ДЭМ, и ДР к клеткам К562.

Схожий характер изменения цитоплазматических протеасом при индукции апоптоза

может свидетельствовать об участии исследуемых частиц в протеолизе одинаковых для

апоптоза анти-апоптозных бел ков-ре гуляторов с одновременным опосредованным

протеасомами накоплением про-апоптозных белковых молекул. Кроме того, для

некоторых протеасомных субъединиц, а именно «4, а5, аб и (37, вид и степень

модификаций различаются в случае разных индукторов (ДЭМ и ДР), что, по всей

видимости, объясняется различными стадиями апоптоза и (или) различными апоптотическими путями. Однако природу, характер и механизмы возникновения модификаций протеасомных субъединиц при индукции программируемой клеточной гибели еще предстоит исследовать.

Ранее проводились исследования субъединичного состава протеасом в клетках человека различной тканевой принадлежности (клетки плаценты, почек, печени; эритроциты) и ряда клеточных линий человека (Kristensen et al., 1994; Hendil et al., 1995), печени крыс (Rivett, Sweeney, 1991), в которых описано наличие изоформ у большинства а-субъединиц 20S протеасомы. Кроме того, изменения в составе протеасом были выявлены in vivo в процессе развития Drosophila (Haass, Kloetzel, 1989) и при дифференцировке B-клеток человека (Frisan et al., 1998). Однако в настоящей работе впервые проведено исследование изменения субъединичного состава протеасом при индукции апоптоза в клетках человека опухолевого происхождения.

Поскольку ферментативная активность протеасом регулируется как информационными изменениями комплексов, так и заменой и модификациями самих субъединиц, ответственных за эту активность, наблюдаемые различия в субъединичном составе протеасом при действии на клетки индуктора апоптоза, позволяют предположить, что в ответ на индукцию апоптоза в клетке происходит изменение и ферментативных активностей 26S комплексов.

Ранее при исследовании протеасом при апоптозе в дифференцированных клетках было показано, что в индуцированных дексаметазоном апоптотических тимоцитах крысы трипсин-, химотрипсин-подобные и пептидилглутамилгидролазная активности цитоплазматических протеасом снижаются (Beyette et al., 1998). Протеолитическая активность цитоплазматических протеасом при индукции апоптоза в быстро пролиферирующих, так же как и активность ядерных протеасом при апоптозе в каких-либо (дифференцированных и быстро пролиферирующих) клетках (Rockel et al., 2005), до сих пор не исследована. Поэтому для анализа влияния индукторов апоптоза на протеолитическую активность протеасом мы исследовали трипсин- и химотрипсин-подобные типы пептидазной активности протеасом, выделенных из клеток человека К562 (Цимоха и др., 2005, 2006). Как видно на рис. 3, обработка клеток К562 ДЭМ приводит к ингибированию протеолитической активности цитоплазматических протеасом: понижению на 62 % и 32 % трипсин- и химотрипсин-подобных типов соответственно (рис. 3, А и Б), но усилению активности ядерных протеасом: соответственно в пять раз и на 38 % (рис. 3, В и Г)- После обработки клеток К562 ДР усиливалась протеолитическая активность цитоплазматических протеасом трипсин- и химотрипсин-подобных типов на 80 % и 14 % соответственно (рис. 3, А и Б). Тогда как после воздействия ДР на эти клетки активность ядерных протеасом трипсин-подобного типа практически не изменялась и несколько (на 15 %) усиливался химотрипсин-подобный тип протеазы ядерных протеасом (рис. 3, В и Г).

| 50.0 I 25.0

II I

цитоппа шатичес пне

цмтоппазмапмос кие протек омы. обработанные С1ЛР

| 50.0 •!•

■ ядерные прокос оыы, обработанные С1АР

К дэм

ДР

ДЭМ

ДР

350.0 : | 300,0 Г" | 250.° | 200.0 < | (50,0 | 100.0 50.0

цктоппаэ магические протевсоиы, обработанные С1АР

дэм

ДР

I 350,0 | 300.0 : I 250,0 1

Р 200 0

| 150,0 $ 100,0 !

■О.-

■ ядер«« протасомы. обработанные С1АР

дэм

ДР

Рис. 3. Влияние индукторов апоптоза на протеолитическую активность 26Э протеасом из цитоплазмы (А и Б) и ядер (В и Г) клеток линии К562.

Приведены средние значения и стандартные отклонения трех независимых определений флуоресценции освобожденного (7-амино)-4-метилкумарина; 100 ед. флуоресценции соответствует освобождению 50 пмоль продукта ((7-амино)-4-метилкумарина). Концентрация протеасом во всех пробах составляет 5 мкг.

А, В - трипсин-подобный тип пептидазной активности протеасом; Б, Г - химотрипсин-подобный тип пептидазной активности протеасом;

1 - активность интактных протеасом;

2 - активность дефосфорилированных щелочной фосфатазой (С1АР) протеасом.

Таким образом, при индукции программированной гибели клеток К562 изменяется специфичность (т. е. соотношение различных типов активности) протеолитической активности как цитоплазматических, так и ядерных протеасом, что свидетельствует о перепрограммировании протеасом на протеолиз других типов белков. Кроме того, различия в протеолитической активности протеасом из ядер и цитоплазмы клеток К562 вероятно определяются специфическими функциями исследуемых частиц в разных клеточных компартментах.

Наблюдаемые отличия в протеолитической активности протеасом при действии на клетки К562 разными индукторами апоптоза (ДЭМ и ДР) можно объяснить различными апоптотическими путями, требующими протеолиз различных наборов белков, и (или) различными стадиями апоптотического процесса. Однако поскольку популяция протеасом в клетке гетерогенна, увеличение активности общего количества очищенных протеасом совсем не исключает возможность снижения активности какой-либо отдельной субпопуляции протеасом после воздействия индуктора апоптоза. Так, например, наблюдаемое снижение активности химотрипсиновой пептидазы всей популяции цитоплазматических протеасом при индукции апоптоза ДЭМ, по сравнению с ядерными протеасомами, может свидетельствовать о передислокации из цитоплазмы в ядро специфической, задействованной в выполнении апоптотической программы, протеасомной субпопуляции. Показано также, что при воздействии ДР на клетки в ядро привлекаются протеасомы из цитоплазмы (Иуопнуа й а1., 2001, 2002). Таким образом, помимо перечисленных выше возможных причин изменения субъединичного состава и

дом, дс

дом

др

24 <Ь>

активностей протеасом при апоптозе, также и передислокация протеасом между ядром и цитоплазмой (перераспределение субпопуляций протеасом внугри клетки) может служить одним из механизмов контроля активности протеасом в клетке. Кроме того, известно, что иротеасомы обладают, по крайней мере, пятью типами 11 ротеодитической активности. К ним относятся трипсин-, химотрипсин-подобные, постглутамилгидролазная активности и выявленная позже способность протеасом к разрезанию белковой цепи в участках после аминокислот с разветвлённой цепью в природных и синтетических пептидах и белках, а также между небольшим нейтральными аминокислотами (Orlowski et al., 1993). Поэтому возможно, что в клетке при индукции апоптоза одновременно может происходить активация одних {в данном случае двух исследуемых) нептидаз протеасом и ингибировалие других.

На исследуемых клетках уже была выявлена способность протеасом к нуклеолизу молекул РНК (Миттенберг и др., 2002а, 20026; Токтарова и др., 2004). Деградации подвергаются отдельные фракции высокомолекулярных цитоплазматических РНК (28S, 18S рибосомные РНК и ряд мРНК). Электрофоретический анализ продуктов реакции показывает появление фрагментов строго определенного размера, что свидетельствует о том, что реакция представляет собой эндонуклеолиз.

Для выяснения вопроса о том, происходят ли изменения рибонуклеазной активности 26S протсасом при индукции программированной гибели, высокомолекулярные

цитоплазм этические РНК инкубировали с исследуемыми частицами, выделенными из контрольных клеток К562 и из клеток, обработанных ДЭМ или ДР {Цимоха и др., 2005, 2006). Э лектрофоретичес кий анализ

свидетельствует, что при индукции апоптоза рибонуклеазная активность 26 S

цитоплазматических протеасом по отношению к клеточным высокомолекулярным рибосомным РНК ингибируетея (рис. 4, дорожки 2, 4 и 6).

Известно, что одним из основных этапов регуляции экспрессии генов в клетках эукариот является регуляция стабильности молекул информационных РНК (Tourriere et al., 2002). В окраска бромистым этидием. клетке молекулы РНК могут подвергаться

эндонуклеолизу на разных этапах, а при индукции апоптоза, вероятно, может возникнуть необходимость в деградации РНК либо в ядре на стадии пре-мРНК, либо в цитоплазме, на этапах, предшествующих трансляции. Полученные в данной работе

28S- 1 щ

tís. ■

■

4S-

Рис 5. Деградация высокомолекулярных рибосом выл РНК из клеток К562 265 протеасомами, выделенными из цитоплазмы контрольных клеток (дорожки 2 и 3) и клеток после воздействия ДЭМ (дорожки 4 и 5) и ДР (дорожки 6 и 7)

I - необработанная РНК, плюсы

о&оэвачают предварительное

дефосфорилирование протеасом с помощью щелочной фосфатазы (С1АР), минусы - соответст венно его отсутствие. Электрофорез в 2,75 %-пом ПААГ, окраска бр!

результаты позволяют сделать предположение об участии РНКазы протсасом в процессе регуляции стабильности молекул информационных РНК при индукции программируемой клеточной гибели. Так, например, 26S частицы могут с помощью убиквитин-зависимого протеолиза контролировать уровень бел ков-регул яторо в апоптоза, а с помощью специфическою эндонуклеолиза регулировать содержание в клетке кодирующих их мРНК. И, таким образом, с помощью протеасом клегка может наиболее быстро и эффективно инактивировать анти-апоптотические и (или), наоборот, активировать про-апоптотические гены во время реализации программы своей гибели.

Наблюдая подавление РН Казной активности протеасом при индукции апонтоти ческой гибели по отношению к суммарной рибосомной РНК, нельзя утверждать, что подобный характер изменения нуклеазной активности протеасом будет проявляться и по отношению к специфическим индивидуальным мРНК. Вполне вероятно, что в случае отдельных мРНК в клетке при индукции апоптоза может происходить как ингнбирование, так и активация РНКазы протсасом.

Для анализа специфичности

эндорибонуклеазной активности протеасом при индукции апоптоза, т. е, способ мости к расщеплению различных последовательностей РНК, исследовали нуклеолиз транскрибированных in vitro индивидуальных информационных РНК с-тус и р53 протеасомами, выделенными из контрольных и обработанных ДР клеток К562 (Митгепберг и др., 2007). При использовании ингибиторов протсасом было показано, что продукт протоонкогена с-тус, транскрипционный фактор с-Мус, разрушается по убиквитин-протеасом ном у пути (Salghetti et al., 1999). Выбор нами этого субстрата был обусловлен также и тем, что он содержит AU-богатые последовательности, а из литературы известно, что повторы AUUUA являются сигналом для деградации РНК протеасомами {Jarrousse et al., 1999). Деградация онтосупресшрното белка р53 в клетках также происходит по убиквитин-зависимому

протеасомному пути (Lopes et al., 1997).

Электрофоре: ический анализ показал, что при индукции с помощью ДР программированной клеточной гибели в клетках К562 рибонуклеазная активность цитоплазматических протеасом не изменяется по отношению к мРНК с-тус (рис. 5, А, дорожки 2 и 4), но ипгибируется по отношению к мРНК р53 (рис. 5, Б, дорожки 2 и 4). Таким образом, при индукции апоптоза ДР изменяется специфичность

л г* ей - + - ■ (ТАР

¡IT 1000. МО 400-

зоо

loo

с-тус

I 4

! '

Рис. 5. Деградация 26S протеасомами, выделенными из цитоплазмы контрольных (дорожки 2 и 3) и обработанных ДР (дорожки 4 и 5) клеток К562, транскрибированных in vitro мРНК генов с-тус (А) и р53 (Б), меченныхja-32P| ЦТФ: 1- необработанная РНК, Электрофоре» в 5 %-ном ПААГ на буфере TBE с 7 М мочевиной

эндорибонуклеазной активности цитоплазматических 26S протеасом по отношению к мРНК с-тус и р53. Наблюдаемые изменения специфичности РНКазы протеасом связаны, по-видимому, с дифференциальной регуляцией активности разных ферментативных центров исследуемых частиц.

Кроме того, выше было сделано предположение о том, что общий характер изменения РНКазы протеасом при апоптозе по отношению к суммарной рибосомной РНК может не отражать изменения этой активности по отношению к каждой конкретной мРНК. И действительно, показано, что, несмотря на ингибирование эндорибонуклеазы протеасом по отношению к суммарной рибосомной РНК, в клетках К562 при индукции апоптоза ДР происходит увеличение нуклеазной активности 26S комплексов по отношению к индивидуальной мРНК р53.

Очевидно, что в свете изменения ферментативных активностей протеасом при индукции апоптоза в клетках наибольший интерес для нас представляли каталитические протеасомные субъединицы (Цимоха и др., 2005, 2006; Tsimokha et al., 2005).

Гликозилирование или алкилирование 4-гидрокси-2-ноненом приводит к увеличению массы белка и, соответственно, к сдвигу его положения вверх на двумерном электрофорезе. Присоединение же фосфатных групп вызывает увеличение как молекулярного веса белка, так и его отрицательного заряда, сохраняя подвижность белка во втором направлении двумерного электрофореза практически неизменной. И таким образом, фосфорилированные протеасомные субъединицы находятся по своей подвижности в системе Лэммли примерно на одном уровне относительно положения соответствующей исходной изоформы, несмотря на то, что их изоэлектрические точки несколько сдвинуты в кислую сторону - тем сильнее, чем больше фосфатных групп несет белок. При N-ацетилировании белка также происходит смещение его положения на двумерной электрофореграмме в область более кислых значений рН.

Известно, что за эндорибонуклеазную активность протеасом ответственны две субъединицы a-типа, а именно Ç (zeta, или а5) и с, (iota, или аб) (Petit et al., 1997). Причем наиболее сильной РНКазной активностью обладает а5 субъединица, субъединица аб менее активна, зато в своей аминокислотной последовательности она содержит сайт связывания РНК. Поскольку выше было показано, что при индукции апоптоза происходит изменение РНКазной активности протеасом как по отношению к суммарной рибосомной РНК, так и по отношению к индивидуальным специфическим мРНК (с-тус и р53), можно предположить, что один из механизмов регуляции РНКазы протеасом заключается в модификации субъединиц, ассоциированных с эндорибонуклеазной активностью 26S комплексов. В пользу данного предположения говорят выявленные нами методом иммуноблотинга изменения субъединичного состава протеасом (в частности, затрагивающие субъединицы zeta/a5 и iota/аб) после воздействия ДЭМ и ДР на клетки К562 (рис. 2). Таким образом, изменение активности РНКазы протеасом при индукции апоптоза может быть обусловлено, в том числе,

специфическими модификациями субъединиц 208 протеасом, ассоциированных с этой активностью. Например, одним из способов модификации клеточных белков и, в частности, субъединиц протеасом может быть их фосфорилирование или дефосфорилирование специфическими киназами и фосфатазами. Интересно также, что аб субъединица протеасом из цитоплазмы контрольных клеток представлена большим числом изоформ (рис. 2, посередине). Такое количество вариантов данной субъединицы может быть связано с выше упомянутой функцией, определяющей специфичность выбора РНК-субстрата для его последующей деградации. После индукции апоптоза (ДЭМ или ДР) в клетках К562 аб субъединица цитоплазматических протеасом теряет почти все свои модификации (рис. 2, слева и справа), что может говорить о перепрограммировании нуклеолиза протеасомами, т.е. о возможной перемене РНК-субстратов.

Мы также показали, что при индукции апоптоза в клетках К562 ДР посттрансляционным модификациям подвергается и ассоциированная с трипсин-подобной протеолитической протеасомной активностью 02 субъединица (рис. 2, посередине и справа).

Было показано, что воздействие некоторых клеточных сигналов вызывает изменение статуса фосфорилирования протеасомных субъединиц. Так, например, у-интерферон вызывает изменение фосфорилирования протеасом в клетках человека линии Ы32 (Вове й а1., 2001), а этиловая диета вызывает у крыс гиперфосфорилирование субъединиц протеасом из клеток печени (Вагс)ад-(}огсе е! а1., 2004).

В настоящей работе для исследования изменения статуса фосфорилирования субъединиц протеасом при индукции апоптоза использовали метод иммуноблотинга с применением антител против фосфотреонина, фосфосерина и фосфотирозина (Цимоха и др., 2005, 2006; ТвипокЪа е! а1., 2004, 2005). Как видно на рис. 6, Б, в случае треонина ДЭМ вызывает лишь небольшие изменения в фосфорилировании протеасомных субъединиц (дефосфорилирование субъединиц с молекулярными массами около 35, 27 и 25 кД и фосфорилирование 43, 36, и 33 кДа) (рис. 6, Б, слева, дорожки 1 и 2); ДР вызывает дефосфорилирование практически всех субъединиц, за исключением одной с молекулярной массой около 31 кД (рис. 6, Б, слева, дорожки 1 и 3). Интересно, что разные индукторы апоптоза по-разному изменяют также и статус фосфорилирования протеасом по серину, а именно ДЭМ вызывает дефосфорилирование некоторых субъединиц (в области мол. масс 66 - 90 кДа, 43 и 37 кДа) (рис. 6, Б, посередине, дорожки 1 и 2); ДР, напротив, приводит к фосфорилированию протеасомных субъединиц (в области мол. масс 27 - 35 кДа, 45 и 50 кДа) (рис. 6, Б, посередине, дорожки 1 и 3). Наблюдаемое фосфорилирование и дефосфорилирование протеасомных субъединиц при действии на клетки К562 индуктора апоптоза предполагает вовлечение в процесс определенных фосфатаз и протеинкиназ. Кроме того, некоторые фосфорилированные по треонину субъединицы протеасом (с молекулярными массами в

области 31-33 кДа) также фосфорилированы и по серину и тирозину в контрольных и в индуцированных к апбптозу клетках (рис. 6, Ь). Функциональный смысл этого явления еще предстоит исследовать. Но, возможно, фосфорилирование или дефосфорилированне их не вовлечено в стадии апоптоза, индуцированного с помощью ДЭМ или ДР. Более того, используемые нами индукторы апоптоза практически не влияют на статус фосформирования цитоплазматических протеасом по тирозину (рис. 6, Б. справа).

А .«ж * Б

«42 ш : ife i

45 f •

i > i " И' W-* * я » til III II.*

Рис. 6, При индукции апоптоза изменяется статус фосфорилироваЕшн субъединиц 26Б протеасом, выделенных из цитоплазмы (Л и Б) и ядер (В и Г) (дорожка 2) или ДР (дорожка 3) клеток К562,

Г) контрольных (дорожка 1) и обработанных ДЭМ

А,'В - окраска геля Йумасси G-250; Б, Г - иммунохим и чес кое выявление фосфорилированных по треонину, серину и тирозину субъединиц в составе очищенных 26S протеасом; М - маркеры мол. масс (MBI Fermentas).

Ранее не проводились исследования статуса фо сформирования ядерных протеасом, а также не анализировалось влияние индукции апоптоза на их фосфорилирование. Для выяснения возможной регуляции статуса фосфорилировапия ядерных протеасом при апоптозе нами был проведен анализ статуса фосфорилировапия протеасом, изолированных из ядер клеток К562 до и после воздействия индукторов апоптоза (рис. 6). Как видно на рис. 6, Г, в случае треонина ДЭМ вызывает дефосфорилированне двух субъединиц ядерных 26S протеасом с молекулярными массами около 47-50 и 37-39 кДа (рис. 6, Г, слева, дорожки 1 и 2); ДР же, напротив, вызывает гиперфоефорилирование ядерных протеасом (рис. 6, i", слева, дорожки 1 и 3). Кроме того, степень фосфорилировапия субъединицы протеасом с мол. массой в области 30-33 кДа не изменяегся, и, вероятно, фосфорилирование или дефосфорилированне ее не вовлечено в ДЭМ-индуцированный апоптоз клеток К562. Под действием ДЭМ наблюдается, во-первых, снижение степени фосфорилированности по тирозину субъединиц с мол. массами порядка 30-33, 26-27 и 28-29 кДа. а во-вторых — дефосфорилированне субъединиц с мол, массами около 68, 62-65, 55-60, 47-48, 46, 44, 37, 34 и 29-30 кДа (рис. 6, Г", справа, дорожки 1 и 2). Наблюдается также под действием ДР снижение степени фосфорилированности но тирозину двух субъединиц с относительными мол. весами соответственно порядка 28-30 и 26-27 кДа и полное дефосфорилированне субъединиц с мол. массами около 68, 62-65, 55-60, 47-48, 46, 44, 37, 34, 30-33 и 29-30 кДа (рис. 6, Г, слева, дорожки 1 и 3). В случае фосфорилировапия по серину влияние индукторов апоптоза на статус фосфорилировапия ядерных протеасом практически идентично {рис. 6, Г, посередине). Таким образом.

обнаруженные специфические отличия в статусе фосфорилирования ядерных и цитоплазматических протеасом, а также регуляция их статуса фосфорилирования при апоптозе свидетельствуют об исключительно тонком регуляторном клеточном процессе, в котором задействованы различные системы киназ и фосфатаз.

Полученные нами данные об изменении фосфорилирования протеасом при действии индукторов апоптоза на клетки позволяют предположить, что такая модификация субъединиц может определять специфичность функций протеасом в апоптотических клетках К562. Кроме того, наблюдаемая разница в фосфорилированности при действии этих двух индукторов апоптоза может свидетельствовать о различных путях выполнения и (или) о разных стадиях апоптотической программы. Можно также предположить, что фосфорилирование некоторых субъединиц по определенным аминокислотам участвует в механизмах реализации апоптоза, а фосфорилирование этих же субъединиц, но по другим аминокислотам (по которым не наблюдаются изменения в статусе фосфорилирования при апоптозе) определяет функционирование протеасом в клетке и не связано напрямую с апоптозом. Возможно также, что гиперфосфорилирование по треонину может служить сигналом ядерной локализации протеасом в клетке, так как из литературы известно, что при поступлении ДР в клетку он связывается с протеасомой и переносится из цитоплазмы в ядро. Так или иначе, очень вероятно, что статус фосфорилирования протеасом определяет их функциональную активность в клетке и что механизм выполнения программы апоптоза независимо от индуктора включает в себя фосфорилирование и дефосфорилирование протеасомных субъединиц.

С целью анализа возможного функционального значения наблюдаемых различий в фосфорилировании протеасом изучали влияние дефосфорилирования протеасомных субъединиц на ферментативные активности исследуемых частиц.

В ряде работ было обнаружено влияние степени фосфорилирования субъединиц цитоплазматических протеасом на их протеолитическую активность (Mason et al., 1996; Iwafune et al., 2002). Однако изменения при апоптозе протеолитической и рибонуклеазной активностей ядерных и цитоплазматических протеасом после воздействия на последние фосфатазой ранее не исследовали. Результаты, представленные на рис. 4, демонстрируют значительное снижение химотрипсин-подобного типа активности как цитоплазматических (рис. 3, Б), так и ядерных (рис. 3, Г) протеасом из контрольных и индуцированных к апоптозу клеток К562 после дефосфорилирования протеасомных субъединиц (Цимоха и др., 2005). Более того, наблюдалось значительное повышение трипсин-подобного типа активности при дефосфорилировании протеасом, выделенных из контрольных клеток (рис. 3, А и В) -на 87 % и 93 % для цитоплазматических и ядерных протеасом соответственно. После обработки цитоплазматических протеасом щелочной фосфатазой происходит также колоссальное усиление (в 4.5 раза) их трипсин-подобной активности из ДЭМ-индуцированных клеток К562, но практически не изменяется эта активность протеасом

из клеток, индуцированных к апоптозу с помощью ДР (рис. 3, А). Аналогичная ситуация наблюдается и с ядерными протеасомами, однако здесь дефосфорилирование не изменяет активность протеасом из ДЭМ-индуцированных клеток (рис. 3, В). Итак, при индукции апоптоза ДР трипсин-подобная протеолитическая активность цитоплазматических протеасом усиливается; она усиливается также, если дефосфорилировать протеасомы из контрольных клеток, причем обработка фосфатазой протеасом из ДР-индуцированных клеток не изменяет эту активность. Можно таким образом сделать вывод, что механизм регуляции активности цитоплазматических протеасом при индукции апоптоза ДР в клетках К562 связан с дефосфорилированием протеасомных субъединиц. Проведя параллель, можно сделать аналогичное предположение и о дефосфорилировании ядерных протеасом при индукции апоптоза ДЭМ. И действительно, если обратиться к рис. 6, А и Б, то видно, что при обработке клеток ДЭМ, ядерные протеасомы дефосфорилируются по треонину. Полученные данные позволяют сделать еще один вывод о том, что изменение статуса фосфорилирования определенных протеасомных субъединиц при действии на клетки индуктора апоптоза может являться одним из путей регуляции протеасом-зависимой деградации белков, участвующих в выполнении программы гибели клетки. Кроме того, приведенные выше результаты свидетельствуют о селективном влиянии статуса фосфорилирования протеасом на разные типы их протеолитической активности.

Для анализа возможного влияния статуса фосфорилирования протеасом на их эндорибонуклеазную активность протеасомы обрабатывали при помощи щелочной фосфатазы из кишечника теленка (Цимоха и др., 2005, 2006). Показано влияние дефосфорилирования протеасом на их РНКазную активность по отношению к высокомолекулярной рибосомной РНК (рис. 4). Так, дефосфорилирование субъединиц цитоплазматических протеасом, выделенных из индуцированных к апоптозу клеток, не оказывало влияния на их активность (рис. 4, А, дорожки 4 и 5, 6 и 7); однако дефосфорилирование протеасом, полученных из контрольных клеток, приводило к снижению их нуклеазной активности (рис. 4, А, дорожки 2 и 3). Это позволяет предположить, что за наблюдаемое подавление РНКазной активности протеасом может быть ответственно дефосфорилирование протеасомных субъединиц при действии индуктора апоптоза на клетки К562.

В настоящей работе мы также исследовали вопрос влияния статуса фосфорилирования протеасом на их РНКазную активность по отношению к индивидуальным мРНК (с-тус и р53) (Митгенберг и др., 2007). Оказалось, что предварительная обработка протеасом щелочной фосфатазой не оказывает влияния на РНКазную активность цитоплазматических протеасом из контрольных клеток К562 по отношению к мРНК с-тус (рис. 5, А, дорожки 2 и 3), но стимулирует нуклеолиз этой РНК (рис. 5, А, дорожки 4 и 5) протеасомами из ДР-индуцированных клеток. И наоборот, дефосфорилирование цитоплазматических протеасом не изменяет эффективность нуклеолиза мРНК р53 протеасомами из ДР-индуцированных клеток

(рис. 5, Б, дорожки 3 и 4), но активирует протеасомы из контрольных клеток (рис. 5, Б, дорожки 2 и 3). Эти результаты свидетельствуют о том, что статус фосфорилирования субъединиц протеасом оказывает влияние на разные рибонуклеазные центры протеасом и что изменения фосфорилирования субъединиц может являться механизмом контроля деградации РНК протеасомами при индукции апоптоза.

Суммируя полученные результаты, можно сделать вывод, что степень фосфорилирования протеасомных субъединиц оказывает влияние на ферментативные (протеолитические и эндорибонуклеазные) центры протеасом, а изменение фосфорилирования субъединиц может являться механизмом координирующего контроля протеасомной деградации белков, участвующих в процессе выполнения апоптоза и в деградации кодирующих их мРНК.

Выводы

1. Индуктор программированной клеточной гибели (ДЭМ или ДР) вызывает изменения в субъединичном составе как цитоплазматических, так и ядерных 26S протеасом клеток К562. После воздействия на клетки индуктора апоптотической программы наблюдается модифицирование субъединиц 20S протеасом, как а-, так и ß-типа, в том числе и субъединиц, ответственных за ферментативные активности протеасом (а5, аб и ß2).

2. Действие индуктора апоптоза на клетки К562 приводит к изменению специфичности ферментативных (протеолитической и эндорибонуклеазной) активностей протеасом из ядер и цитоплазмы клеток К562.

3. Спектр фосфорилирования субъединиц протеасом различен в ядрах и цитоплазме. Индукция апоптоза в клетках К562 приводит к специфическим изменениям статуса фосфорилирования ядерных и цитоплазматических протеасом по серину, тирозину и треонину.

4. Неспецифическое дефосфорилирование белковых субъединиц 26S протеасом из ядер и цитоплазмы клеток К562, приводит к изменению специфичности их протеолитической и эндорибонуклеазной активностей.

5. Полученные данные свидетельствуют о существовании новой, не исследованной системы регуляции субъединичного состава и статуса фосфорилирования протеасом в составе клеточной программы ответа на апоптотические стимулы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. А.С.Цимо*а, И.В.Волкова, Ю.Б.Ермолаева, А.Г.Митгенберг, Н.Д.Медведева, А.Л.Евдонин, И.М.Константинова. "Структурно-функциональный анализ а-РНП частиц из клеток печени крыс". "1-й съезд Общества клеточной биологии". Тезисы докладов и сообщений, Санкт-Петербург, Россия, Октябрь 14-16, 2003. // Цитология. 2003. 45(9): 941.

2. A.S.Tsimokha, l.V.Volkova, J.B.Ermolaeva, AG.Mittenberg, V.A.Kulitchkova, N.D.Medvedeva, A.L.Evdonin, I.N.Evteeva, I.M.Konstantinova. "The comparative analysis of the structure and functions of the a-RNP particles and proteasomes in rat liver cells" // Abstracts of the Conference "Molecular biology and genetics" Kyev, Ukraine, 25-27 September, 2003, p. 134-135.

3. A.S.Tsimokha, V.A.Kulitchkova, I.N.Evteeva, l.V.Volkova, A.G.Mittenberg, J.B.Ermolaeva, I.M.Konstantinova. "EGF-induced changes in the composition, phosphorylation state and the endoribonuclease activity of proteasomes from different cellular compartments of A431 cells" // Abstracts of the Conference

"FEBS lecture course on cellular signaling & 4th Dubrovnik signaling conference" Dubrovnik, Croatia, 21-27 May, 2004, p. 172.

4. В.А.Куличкова, И.Н.Евтеева, А.Г.Миттенберг, М.В.Токтарова, А.С.Цимоха, И.В.Волкова, Ю.Б.Ермолаева, Л.Н.Гаузе, И.М.Константинова. Селективное влияние эпидермального фактора роста на эндорибонуклеазную активность различных субпопуляций протеасом в клетках линии А431. Специфичность популяции протесом, экспортируемых из клеток. // Цитология. 2004. 46(6): 525-530.

5. А.Куличкова, А.Г.Миттенберг, Ю.Б.Ермолаева, А.С.Цимоха, И.В.Волкова, И.В.Кожухарова, Л.Н.Гаузе, И.М.Константинова. Специфичность популяции протеасом, экскретируемых из клеток в культуральную среду. //ДАН. 2004. 399(5): 503-506.

6. А.С.Цимоха, Ю.Я.Ватажок, Е.С.Вашукова, В.А.Куличкова, И.В.Волкова, Ю.Б.Ермолаева, А.Г.Миттенберг, И.Н.Евтеева, В.А.Иванов, Л.Н.Гаузе, И.М.Константинова. Субъединицы протеасом и а-РНП из клеток печени крыс фосфорилированы по тирозину и треонину // Цитология. 2005. 47 (5): 436-441.

7. A.S.Tsimokha, V.A.Kulichkova, A.G.Mittenberg, I.N.Evteeva, I.V.Volkova, J.B.Ermolaeva, l.M.Konstantinova. "Selective effect of inductors of apoptosis on the phosphorylation state and the endoribonuclease activity of 26S proteasomes from different cellular compartments of K562 cells" // IUBMB 50th Anniversary Symposium: Protein Structure and Function, Budapest, Hungary, July 34, 2005, FEBS J, 272(sl): 47.

8. В.А.Куличкова, Ю.Б.Ермолаева, А.Г.Миттенберг, И.В.Волкова, А.С.Цимоха, И.Н.Евтеева, Л.Н.Гаузе, И.М.Константинова. Влияние ЭФР на активность ядерных и цитоплазматических протеасом в клетках А431 // Цитология. 2005. 47 (9): 774-779.

9. А.С.Цимоха, В.А.Куличкова, А.Г.Миттенберг, И.Н.Евтеева, Ю.Я.Ватажок, Ю.Б.Ермолаева, И.В.Волкова, Е.С.Вашукова, Л.Н.Гаузе, И.М.Константинова. Изменения в субъединичном составе, статусе фосфорилирования и эндорибонукпеазной активности ядерных и цитоплазматических 26S протеасом из клеток К562 при воздействии на клетки индуктора апоптоза диэтилмалеата. XV Всероссийское совещание "Структура и функции клеточного ядра", Санкт-Петербург, 18- 20 октября, 2005 // Цитология. 2005. 47 (9): 838.

10. А.С.Цимоха, В.А.Куличкова, И.Н.Евтеева, Ю.Я.Ватажок, Т.Н.Моисеева, Ю.Б.Ермолаева, Е.С.Вашукова, Л.Н.Гаузе, И.М.Константинова. Специфичность изменений в протеасомах клеток К562 при апоптозе, индуцированном диэтилмалеатом // Цитология. 2006. 48 (2): 133-141.

11. А.Г.Миттенберг, Т.Н.Моисеева, И.В.Пугачева, В.А.Куличкова, А.СЦимоха, Л.Н.Гаузе, И.М.Константинова. Регуляция специфичности эндорибонуклеазной активности протеасом при действии индукторов дифференцировки и апоптоза на клетки линии К562. // Цитология. 2007. 49(2): 142-148.

Список цитируемой литературы

1. Георгиев Г.П., Мантьева В.Л. 1962. Биохимия 2(7):949-957. 2. Константинова И.М., Петухова О.А., Куличкова В.А., Туроверова Л.В., Волкова И.В., Ермолаева Ю.Б., Илькаева О.Р., Кожухарова И.В., Ермолаева Ю.Б. 1995. Молекулярная биология. 29 (5): 761-771. 3. Миттенберг А.Г., Куличкова В.А., Медведева Н.Д., Волкова И.В., Ермолаева Ю.Б., Константинова И. М. 20026. Цитология. 44(4):357-363. 4. Миттенберг А.Г., Куличкова В.А., Медведева Н.Д., Пеннияйнен В.А., Гаузе Л.Н., Константинова И.М. 2002а. Цитология. 44(2):]81-187. S. Тостарова М.В., Куличкова В.А., Миттенберг А.Г., Кожухарова И.В., Волкова И.В., Ермолаева Ю.Б., Пешехонов А.В., Игнатова Т.Н., Гаузе Л.Н., Константинова И.М. 2004. Цитология. 46(3): 283-290. 5. Туроверов К.К., Бикташев А.Г., Дорофенюк

A.В., Кузнецова И.М. 1998. Цитология. 40(8/9): 806-814.7. Anand S., Verma Н., Kumar L„ Singh N. 1995. Cancer Lett. 88:101-105. 8. Bardag-Gorce F., Venkatesh R„ Li J., French B.A., French S.W. 2004. Life Sci. 75: 585-597. 9. Barret A.J. 1980. Biochem. J. 187: 909-912. 10. Beyette J., Mason G., Murray R., Cohen G„ Rivett J. 1998. Biochem. J. 332: 315-320. 11. Bose S„ Brooks P., Mason G.G., Rivett A.J. 2001. Biochem J. 353:291-297. 12. BoseS, Mason G.G., Rivett A.J. 1999. Mol Biol Rep. 26:11-14. 13. BoseS., Stratford F.L., Broadfoot K.I., Mason G.G., Rivett A.J. 2004. Biochem J. 378:177-184. 14. Bradford M.M. 1976. Anal Biochem. 72:248-254. 15. Castelli J.C., Hassel B.A., Maran A., Paranjape J., Hewitt J.A., Li X.L., Hsu Y.T., Silverman RH„ Youle R.J. 1998. Cell Death Differ. 5: 313-320. 16. Chuang C.Y., Chuang L.F. 1979. Biochemistry. 18: 2069-2073. 17. Claverol S„ Burlet-Schiltz O., Girbal-Neuhauser E., Gairin J.E., Monsarrat

B. 2002. Mol Cell Proteomics. 1: 567-578. 18. Earnshaw W.C. 1995. Curr Opin Cell Biol. 7: 337-343. 19. Farout L., Mary J., Vinh J., Szweda L.I., Friguet B. 2006. Arch Biochem Biophys.;453(l): 135-142. 20. Fernandez Murray P., Biscoglio M.J., Passeron S. 2002. Arch. Biochem. Biophys. 404: 116-125. 21. Frisan Т., Levitsky V„ Polack A., Masucci M.G. 1998. J. Immunol. 160: 3281-3289. 22. Glickman M.H., Ciechanover A. 2002. Physiol Rev. 82: 373-428. 23. Haass C, Kloetzel P.M. 1989. Exp. Cell Res. 180: 243252. 24. Hendil K.B., Kristensen P., Uerkvitz W. 1995. Biochem. J. 305: 245-252. 25. Hough R, Pratt G.,

Rechsteiner M. 1987. J. Biol. Chem.262: 8303-8313. 26. Iwafune Y„ Kawasaki H., Hirano H. 2002. Electrophoresis. 23: 329-338. 27. Jarrousse A.S., Petit F., Kreutzer-Schmid K„ Gaedigk R„ Schmid H P. 1999. J. Biol. Chem. 274: 22023-22028. 28. Kiyomiya K, Kurebe M„ Nakagawa H„ Matsuo S. 2002. Int J Oncol. 20(6): 1205-1259. 29. Kiyomiya K, Matsuo S., Kurebe M. 2001. Cancer Res. 61(6): 2467-2471. 30. Kristensen P., Johnsen A.H., Uerkvitz W., Tanaka K., Hendil K.B. 1994. Biochem. Biophys. Res. Commun. 205: 1785-1789. 31. Laemmli U.K. 1970. Nature. 227: 680-685. 32. Lopes U.G., Erhardt P., Yao R., Cooper G.M. 1997. J. Biol. Chem. 272: 12893-12896. 33. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. 1982. New York: Cold Spring Harbor Laboratory: 150-162. 34. Mason G.G., Hendil K.B., Rivett A.J. 1996. Eur. J. Biochem. 238: 453—462. 35. Naujokat C., Hoffmann S. 2002. Lab Invest. 82:965-980. 36. Orlowski M., Cardozo C., Michaud C. 1993. Biochemistry. 32:1563-1572. 37. Petit F., Jarrousse A-S., Dahlmann B., Sobek A., Hendil K.B., Bury J., Briand Y„ Schmid H.-P. 1997. Biochem. J. 326:93-98. 38. Ptacek J., Snyder M. 2006. Trends Genet. 22:545-554. 39. Rivett A. J., Sweeney S. T. 1991. Biochem. J. 278: 171-177. 40. Rivett A.J., Bose S., Brooks P., Broadfoot K.I. 2001. Biochimie. 83:363-366. 41. Rockel T.D., Stuhlmann D., von Mikecz A. 2005. J Cell Sci. 118:5231-542. 42. Salghetti S.E., Kim S.Y., Tansey W.P. 1999. EMBO J. 18: 717-726. 43. Sohn D„ Totzke G„ Essmann F„ Schulze-Osthoff K„ Levkau B„ Janicke R.U. 2006. Mol Cell Biol. 26: 1967-1978.

44. Tanaka K., Fujiwara T., Kumatori A., Shin S., YoshimuraT., Ichihara A., Tokunaga F., ArugaR., Iwanaga S„ Kakizuka A. 1990. Biochemistry. 29(15): 3777-3785. 45. Tokumoto M., Horiguchi R., Nagahama Y., Tokumoto T. 1999. Gene. 239(2): 301-308. 46. Tourriere H„ Chebli K„ Tazi J. 2002. Biochimie. 84: 821-37.

45. Umeda M., Manabe Y„ Uchimiya H. 1997. FEBS Lett. 403(3)313-307. 47. Varghese J., Khandre N.S., Sarin A. 2003. Apoptosis. 8:363-370. 48. Vink J., Cloos J., Kaspers G.J. 2006. Br J Haematol. 134:253-262. 50. Wojcik C. 2002. J. Cell. Mol. Med. 6: 2548. 51. Wojcik C„ DeMartino G.N. 2003. Int. J. Biochem. Cell Biol. 35: 579-589. 52. Yang W., Monroe J„ Zhang Y„ George D„ Bremer E„ Li H. 2006. Cancer Lett. 243: 217-227. 53. Zachara N.E., Hart G.W. 2004. Trends Cell Biol. 14(5): 218-221.

Отпечатано в ИНЦ РАН, 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4 Зак. 1/19. Тираж 100. Объем 1,25 п.л. Подписано в печать 19.02.2007 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Цимоха, Анна Сергеевна

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цели и задами исследования.

1.3. Основные положения, выносимые на защиту.

1.4. Научная новизна.

1.5. Теоретическое и практическое значение работы.

1.6. Финансовая поддержка.

1.7. Публикации.

1.8. Апробация работы.

1.9. Объем и структура диссертации.

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Убиквитин-протеасомный путь деградации белков.

2.1.1. Протеасомы.

2.1.2. Ферментативные активности протеасом.

2.1.3. Убиквитин-зависимый протеолиз.

2.1.4. Участие протеасом в важнейших клеточных процессах.

2.1.5. Ингибиторы протеасом.

2.2. Молекулярные механизмы регуляции апоптоза.

2.3. Вовлечение убиквитин-протеасомного пути в апоптоз.

2.3.1. Протеасомные ингибиторы как индукторы апоптоза.

2.3.2. Ингибиторы протеасом могут также ингибировать апоптоз.

2.3.3. Ингибиторы протеасом в терапии рака.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Культивирование клеток.

3.2. Анализ фрагментации клеточной ДНК.

3.3. Флуоресцентная окраска хроматина.

3.4. Выделение препаратов цитоплазматических РНК.

3.5. Выделение препаратов ядерных и цитоплазматических протеасом.

3.6. Флуориметрическое измерение протеолитической активности протеасом.

3.7. Электрофорез РНК в нативных условиях.

3.8. Электрофорез РНК в денатурирующих условиях.

3.9. Обработка протеасом щелочной фосфатазой кишечника теленка (CIAP).

ЗЛО. Обработка РНК с помощью протеасом.

3.11. Транскрипция in vitro.

3.12. Анализ содержания субъединиц протеасом и их статуса фосфорилирования методом вестерн-блотинг.

3.13. Диск-электрофорез белков по Лэммли.

3.14. Двумерный электрофорез белков.

3.15. Л/атсрналы.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Диэтилмалеат и доксорубнцин вызывают апоптоз в клетках К562.

4.2. Воздействие на клетки К562 индукторов апоптоза вызывает изменения в субъединичном составе цитоплазматических протеасом.

4.3. Популяция протеасом в клетке гетерогенна.

4.4. После индукции апоптоза в клетках К562 субъединицы протеасом модифицируются.

4.4.1. Цнтоплазматические протеасомы.

4.4.2. Ядерные протеасомы.

4.5. При индукции апоптоза в клетках К562 изменеияются ферментативные активности протеасом.

4.5.1. Воздействие на клетки К562 индукторов апоптоза изменяет специфичность протеолитической активности протеасом.

4.5.2. При индукции апоптоза в клетках К562 изменяется специфичность эндорибонуклеазной активности протеасом.

4.6. После нндукции апоптоза в клетках К562 наблюдается модифицирование субъединнц протеасом, ответственных за ферментативные активности протеасом: «5, «6ир2.

4.7. При индукции апоптоза в клетках К562 изменяется статус фосфорилирования протеасом.

4.8. Дефосфорнлнрование субъединиц протеасом специфическим образом изменяет ферментативные активности протеасом, выделенных из клеток К562.

4.8.1. ГТротеолитическая активность протеасом.

4.8.2. Механизм регуляции протеолитической активности протеасом при индукции апоптоза связан с фосфорилированием (дефосфорилированием) протеасом.

4.8.2. Эндорибонуклеазная активность протеасом.

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1. Изменения субъедипичного состава протеасом при апоптозе в клетках К

5.2. Изменения ферментативных активностей протеасом при апоптозе в клетках К562.

5.3. Изменение статуса фосфорнлирование протеасом при апоптозе в клетках К

5.4. Нсспецифическос дефосфорилирование белковых субъединиц протеасом изменяет специфичность их ферментативных активностей.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменения состава и ферментативных активностей протеасом при апоптозе в клетках К562"

1.1. Актуальность проблемы

Апоптоз, или программированная клеточная гибель, является важнейшим механизмом контроля над качеством и численностью клеточной популяции в многоклеточном организме. Он обеспечивает равновесие в пролиферации клеток, элиминации поврежденных (например, радиацией), пораженных вирусом и неопластических клеток, а также селекцию лимфоцитов, при которой удаляются аутоиммунные клоны. Неспособность клеток претерпевать апоптоз - это один из ключевых моментов в опухолеобразовании. Молекулярные механизмы, задействованные в этом процессе, до сих пор окончательно не исследованы.

Апоптоз представляет собой сложно регулируемый клеточный процесс, который принято подразделять на две стадии: запуск и выполнение программы (Earnshaw, 1995). Известно, что запуск программы, приводящей к смерти клетки, может осуществляться как специфическими сигналами (например, цитокинами или гормонами), так и неспецифическими, такими как радиация, повышение температуры или действие окислителей (например, проокислитель - глутатион-истощающий агент диэтилмалеат (ДЭМ)).

Стадия выполнения инициируется активацией каспаз (семейство цитоплазматических цистеиновых протеаз), которые деградируют специфические клеточные белки, такие как поли-(АДФ-рибоза)-полимераза (PARP)^ (Martin, Green, 1995). Это приводит к серии определенных метаболических изменений, характерных для апоптоза (в том числе, ядерной фрагментации, образование апоптотических телец).

В настоящее время широко изучается участие в апоптозе протеасом. При использовании ингибиторов протеасом обнаружили как про-апоптозное, так и анти-апоптозное функционирование протеасом в клетке (Grimm et al., 1996; Lopes et al., 1997; Dou et al., 1999; Wojcik, DeMartino, 2003; Yang et al., 2006). Такие противоположные роли протеасом в регуляции апоптоза, по-видимому, обусловлены пролиферативным статусом клетки (Naujokat,

Hoffmann, 2002; Wojcik, DeMartino, 2003; Chen, Lin, 2004; Sohn et al., 2006; Vink et al., 2006).

Для осуществления разнообразных функций в клетке протеасомы должны быть подвержены строгому регуляторному контролю. Фосфорилирование регуляторных белков (например, киназ) является ключевым моментом в передаче сигнала, продвижении клетки по клеточному циклу и в апоптозе (Bandyopadhyay et al., 2004; Sabatini et al., 2004; Contri et al., 2005; Jin et al., 2005; Wang et al., 2005; Ptacek, Snyder, 2006). Фосфорилирование субстратов и ферментов также играет важную роль в убиквитин-протеасомном пути (Glickman, Ciechanover, 2002; Wojcik, DeMartino, 2003). Известно также, что 26S протеасомы посттрансляционно модифицируются в различных случаях как фосфорилированием (Bose et al., 1999, 2004; Fernandez Murray et al., 2002; Iwafune et al., 2002), так и N-ацетилированием (Arendt, Hochstrasser. 1999; Kimura et al., 2000; Tokunaga et al., 1990; Claverol et al., 2002), гликозилированием (Schmid et al., 1993, Zachara, Hart, 2004; Sumegi et al., 2003) и 4-гидрокси-2-ноненил-алкилированием (Farout et al., 2006). Обнаружены сайты потенциального фосфорилирования на субъединицах 20S протеасомы и 19S регуляторных комплексов, и исходя из этого, выдвинуто предположение о возможном контроле протеолитической активности протеасом посредством фосфорилирования (Bose et al., 1999; Fernandez Murray et al., 2002). Так, например, дефосфорилирование аЗ и al субъединиц протеасом приводило к снижению двух пептидазных активностей протеасом (Mason et al., 1996). Кроме того, фосфорилирование субъединиц протеасом ответственно за ассоциацию 20S протеасомы и 19S регуляторных комплексов (Rivett et al., 2001). Известно, что в зависимости от стадии клеточного цикла, изменялся статус фосфорилирования протеасом (Iwafune et al., 2002) и что некоторые клеточные сигналы вызывают изменения в фосфорилированности субъединиц протеасом (Bose et al., 2001; Rivett et al., 2001; Bardag-Gorce et al., 2004). Однако воздействие индукторов апоптоза на изменение статуса фосфорилирования протеасом не исследовалось.

Основываясь на том, что при индукции апоптоза в дифференцированных клетках изменялся субъединичный состав и протеолитическая активность протеасом, было сделано предположение, что такие изменения в протеасомах могут приводить к усилению деградации по протеасом-убиквитиновому пути определенных клеточных белков, приводящих к апоптозу (Naujokat, Hoffmann, 2002). Однако до сих пор нет данных об изменении субъединичного состава и регуляции активностей протеасом в быстро пролиферирующих клетках при индукции апоптотической гибели. Кроме того, при индукции апоптоза в клетках не было исследовано изменение эндорибонуклеазной активности протеасом. Не исследовано влияние изменения статуса фосфорилирования протеасом на их протеолитическую и эпдорибонуклеазную активности при индукции апоптоза как в дифференцированных, так и в быстро пролиферирующих клетках. Одним из актуальных и наименее исследованных, кроме всего прочего, является вопрос о гетерогенности популяции протеасом в клетке (в том числе, в отдельных клеточных компартментах), о назначении множественных форм протеасом. Так, например, нет данных об исследованиях субъединичного состава, статуса фосфорилирования и ферментативных активностей ядерных протеасом при индукции апоптоза в клетках.

1.2. Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось исследование субъединичного состава и ферментативных активностей протеасом при индукции апоптоза в клетках проэритролейкемии человека линии К562. Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:

1.3. Основные положения, выносимые на защиту

1. При индукции апоптоза с помощью ДЭМ или ДР в клетках К562 наблюдаются специфические изменения субъединичного состава протеасом и статуса фосфорилирования, то есть перепрограммирование популяции цитоплазматических протеасом.

1.4. Научная новизна

В настоящей работе впервые показано, что индукция апоптоза в быстро пролиферирующих клетках (на примере клеток проэритролейкемии человека линии К562) вызывает изменения субъединичного состава цитоплазматических и ядерных протеасом и их протеолитической активности. Причем при действии на клетки К562 индукторов апоптоза наблюдается изменение специфичности протеолитической активности протеасом: выявлено селективное изменение трипсин- и химотрипсин-подобных типов протеолитической активности как цитоплазматических, так и ядерных протеасом.

Впервые при индукции апоптотической программы выявлены изменения статуса фосфорилирования по треонину, серину и тирозину ядерных и цитоплазматических протеасом, а также их эндорибонуклеазной активности. Наблюдается дифференциальная регулящй РНКазной активности протеасом при действии индукторов апоптоза на клетки К562. Полученные результаты свидетельствуют также о существовании пока не исследованной системы регуляции статуса фосфорилирования протеасом (причем различной в ядре и цитоплазме) в составе программы ответа клетки на действие индукторов апоптоза.

Выявлено, что при индукции апоптотической программы в клетках К562 наблюдаются модификации субъединиц 20S протеасомы, в том числе каталитических, ассоциированных с протеолитической активностью трипсин-подобного типа ((32) и РНКазной активностью (a5/zeta и аб/iota).

Впервые исследован механизм регуляции протеолитической и эндорибонуклеазной активностей протеасом при индукции апоптоза, а именно обнаружена зависимость исследуемых активностей от дефосфорилировапия белковых субъединиц протеасом.

1.5. Теоретическое и практическое значение работы

Полученные результаты свидетельствуют об изменениях субъедипичного состава, ферментативных активностей и статуса фосфорилирования, то есть о перепрограммировании популяции цитоплазматических и ядерных протеасом при индукции апоптоза в клетках К562. Результаты работы имеют большое значение для дальнейшего углубленного изучения молекулярных механизмов, задействованных в апоптозе; могут служить теоретической основой для разработки терапевтических подходов в лечении лейкемии, так как индукцию апоптоза используют для терапии рака. Протеасомы человека могут быть использованы в качестве новых фармакологических мишеней (Wojcik, 2002). Так, ингибиторы протеасом уже сейчас активно исследуются в качестве агентов противоопухолевой терапии (Vink et al., 2006). Однако результаты экспериментов с использованием ингибиторов протеасом должны соответствовать данным по сравнительному анализу структуры и функций протеасом в норме и при патологии.

1.6. Финансовая поддержка

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 02-04-49621, 05-04-49606), гранта Президента РФ по поддержке ведущих научных школ (НШ-523.2006.4), Санкт-Петербургского Научного Центра 2005 и 2006 годов и с использованием оборудования ЦКП «Материаловедение и диагностика в передовых технологиях».

1.7. Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ (6 статей).

1.8. Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на Всероссийских симпозиумах «Клеточная биология на пороге XXI века» (Санкт-Петербург, 2000); «1-ый съезд Общества клеточной биологии» (Санкт-Петербург, 2003), «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006); на XV Всероссийском совещании «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт

Петербург, 2005), а также на Международных Конгрессах по молекулярной биологии и генетике (Киев, 2003), по внутриклеточному сигналингу (Дубровник, 2004), по биологии клетки в культуре "Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия" (Санкт-Петербург, 2004) и 30-ый конгресс Европейского биохимического общества "The Protein World. Proteins and Peptides: Structure, Function and Organization" (Будапешт, 2005).

1.9. Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, иллюстративный материал содержит 17 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Цимоха, Анна Сергеевна

выводы

1. Индуктор программированной клеточной гибели (ДЭМ или ДР) вызывает изменения в субъединичном составе как цитоплазматических, так и ядерных 26S протеасом клеток К562. После воздействия на клетки индуктора апоптотической программы наблюдается модифицирование субъединиц 20S протеасом, как а-, так и (З-типа, в том числе и субъединиц, ответственных за ферментативные активности протеасом (а5, аб и 02).

3. Спектр фосфорилирования субъединиц протеасом различен в ядрах и цитоплазме клеток К562. Индукция апоптоза в клетках К562 приводит к специфическим изменениям статуса фосфорилирования ядерных и цитоплазматических протеасом по серину, тирозину и треонину.

4. Неспецифическое дефосфорилирование белковых субъединиц 26S протеасом из ядер и цитоплазмы клеток К562, приводит к изменению специфичности их протеолитической активности и изменению эндорибонуклеазной.

5. Полученные данные свидетельствуют о существовании новой, не 'исследованной, системы регуляции субъединичного состава и статуса фосфорилирования протеасом в составе клеточной программы в ответ на апоптотические стимулы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Цимоха, Анна Сергеевна, Санкт-Петербург

1. Абрамова Е.Б., Шарова Н.П., Карпов В.Л. 2002. Протеасома: разрушать, чтобы жить. Мол. Биол. 36: 761-776.

2. Галкин В.Э., Туроверова Л.В., Константинова И.М., Пинаев Г.П. 1998а. Взаимодействие просом с фибриллярным актином. Цитология. 40: 161-166.

3. Галкии В.Э., Туроверова Л.В., Константинова И.М., Пинаев Г.П. 19986. 268-рибонуклеопротеиновый комплекс (268-протеасома) непосредственно взаимодействует с фибриллярным актином. Цитология. 40: 618-626.

4. Георгиев Г.П., Мантьева В.Л. 1962. Информационная и рибосомная РНК хромосомно-ядрышкого аппарата, методы разделения и нуклеотидный состав. Биохимия. 27(7): 949-957.

5. Копнин Б.П. 2000. Механизмы действия онкогенов и опухолевых супрессоров // Молекулярная биология.(5): 7-40.

6. Туроверов К.К., Бикташев А.Г., Дорофенюк А.В., Кузнецова И.М. 1998. Комплекс аппаратных и программных средств для измерения спектральных и поляризационных кинетических характеристик флуоресценции в растворе. Цитология. 40(8/9): 806-814.

7. Чистохина А.В. 1993. Роль ретиноевой кислоты в процессах пролиферации и дифференцировки клеток линии К562. Автореф. канд. дис. Санкт-Петербург. Стр. 24.

8. Adams J. 2001. Proteasome inhibition in cancer: development of PS-341. Semin. Oncol. 28:613-619.

9. Adams J. 2003. Potential for proteasome inhibition in the treatment of cancer. Drug Discov Today. 8(7):307-15.

10. Adams J. 2004. The development of proteasome inhibitors as anticancer drugs. Cancer Cell. 5(5):417-21.

11. Adams J., Palombella V. J., Sausville E. A., Johnson J., Destree A., Lazarus D. D., Maas J., Pien C. S., Prakash S., Elliott P. J. 1999. Proteasome inhibitors: a novel class of potent and effective antitumor agents. Cancer Res. 59: 2615-2622.

12. Arendt C.S., Hochstrasser M. 1999. Eukaryotic 20S proteasome catalytic subunit propeptides prevent active site inactivation by N-terminal acetylation and promote particle assembly. EMBO J. 18: 3575-3585.

13. Arrigo A. P., Tanaka K., Goldberg A. L., Welch W. J. 1988. Identity of the 19^ 'prosome' particle with the large multifunctional protease complex of mammalian cells (the proteasome). Nature. 331: 192-194.

14. Bach I., Ostendorf H.P. 2003. Orchestrating nuclear functions: ubiquitin sets the rhythm. TiBS. 28(4): 189-195.

15. Ballut L., Petit F., Mouzeeyar S. Le Gall O., Candresse Т., Schmid P., Nicolas P., Badaoui S. 2003. Biochemical identification of proteasome-associated endonuclease activity in sunflower // Biochim. Biophys. Acta. 1645: 30-39.

16. Bardag-Gorce F., Venkatesh R., Li J., French B.A., French S.W. 2004. Hyperphosphorylation of rat liver proteasome subunits: the effects of ethanol and okadaic acid are compared. Life Sci. 75: 585-597.

17. Barret A.J. 1980. Fluorimetric assays for cathepsin В and cathepsin H with methylcoumarylamide substrates. Biochem. J. 187: 909-912.

18. Baumeister W., Walz J., Zulil F., Seemuller E. 1998. The proteasome: paradigm of a selfcompartmentalizing protease. Cell 92: 367-380.

19. Bold R.J. 2001. Virudachalam S., McConkey D. J., Chemosensitization of pancreatic cancer by inhibition of the 26S proteasome. J. Surg. Res. 100: 11-17.

20. Bose S,. Brooks P., Mason G.G., Rivett A.J. 2001. gamma-Interferon decreases the level of 26 S proteasomes and changes the pattern of phosphorylation. Biochem. J. 353:291-297.

21. Bose S., Mason G.G., Rivett A.J. 1999. Phosphorylation of proteasomes in mammalian cells. Mol Biol Rep. 26:11-14.

22. Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.

23. Brannigan J.A., Dodson G., Duggleby H.J., Moody P.C., Smith J.L., Tomchick D.R., Murzin A.G. 1995. A protein catalytic framework with an N-terminal nucleophil is capable of self-activation. Nature. 378: 416- 419.

24. Breitschopf K., Zeiher A.M., Dimmeler S. 2000. Ubiquitin-mediated degradation of the proapoptotic active form of bid. A functional consequence on apoptosis induction. J. Biol. Cliem. 275(28): 21648-21652.

25. Briggs S.D., Xiao Т., Sun Z.W., Caldwell J.A., Shabanowitz J., Hunt D.F., Allis C.D., Strahl B.D. 2002. Gene silencing: trans-histone regulatory pathway in chromatin. Nature. 418: 498.

26. Burger S.R., Gutter M.M., Sturgill-Koszycki S., Santoro S.A. 1992. Induced cell surface expression of functional alpha 2 beta 1 integrin during megakaryocyte differentiation of K562 leukemic cells. Exp Cell Res. 202(1): 28-35.

27. Burns T.F., El Deiry W.S. 1999. The p53 pathway and apoptosis. J. Cell Physiol. 181:231-239.

28. Burri L., Hockendorff J., Boehm U., Klamp Т., Dohmen R.J., Levy F. 2000. Identification and characterization of a mammalian protein interacting with 20S proteasome precursors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 10348-10353.

29. Bush K.T., Goldberg A.L., Nigan S.K. 1997. Proteasome inhibition leads to a heat-shock response, induction of endoplasmatic reticulum chaperones, and thermotolerance. J. Biol. Chem. 272: 9086-9092.

30. Castelli J.C., Hassel B.A., Maran A., Paranjape J., Hewitt J.A., Li X.L., Hsu Y.T., Silverman R.H., Youle R.J. 1998. The role of 2-5' oligoadenylate-activated ribonuclease L in apoptosis. Cell Death Differ. 5: 313-320.

31. Castillo E.A., Ayte J., Chiva C., Moldon A., Carrascal M., Abian J., Jones N, Hidalgo E. 2002. Diethylmaleate activates the transcription factor Papl by covalent modification of critical cysteine residues.Mol Microbiol. 45(1): 243-254.

32. Chen F., Chang D., Goh M., Klibanov S.A., Ljungmann M. 2000. Role p53 in cell cycle regulation and apoptosis following exposure to proteasome inhibitors. Cell Growth Differ. 11: 239-246.

33. Chen W.J., Lin J.K. 2004. Chen, Lin Induction of G1 arrest and apoptosis in human jurkat T cells by pentagalloylglucose through inhibiting proteasome activity and elevating p27Kipl, p21Cipl/WAFl, and Bax proteins. J Biol Chem. 279: 13496-51305.

34. Cho J.W., Park J.C, Lee J.C, Kwon Т.К., Park J.W., Baek W.K., Suh S.I, Suh M.H. 2001. The levels of MDM2 protein are decreased by a proteasomemediated proteolysis prior to caspase-3-dependent pRb and PARP cleavages. J. Korean Med. Sci. 16: 135-139.

35. Chuang C.Y, Chuang L.F. 1979. Inhibition of chicken myeloblastosis RNA Polymerase activity by adriamydcin. Biochemistry. 18: 2069-2073.

36. Ciechanover A, Brundin P. 2003. The ubiquitin proteasome system in neurodegenerative diseases: sometimes the chicken, sometimes the egg. Neuron. 40: 427-446.

37. Ciechanover A, Iwai K. 2004. The ubiquitin system: from basic mechanisms to the patient bed. IUBMB Life. 56(4): 193-201.

38. Claverol S, Burlet-Schiltz O, Girbal-Neuhauser E, Gairin J.E, Monsarrat B. 2002. Mapping and structural dissection of human 20S proteasome using proteomic approaches. Mol Ce'll Proteomics. 1: 567-578.

39. Coffey R.N, Watson R.W, Hegarty N.J, O'Neill A, Gibbons N„ Brady H.R, Fitzpatrick J.M. 2000. Thiol-mediated apoptosis in prostate carcinoma cells. Cancer. 88(9): 2092-2104.

40. Cohen D.R, Curran T. 1989. The structure and function of the fos proto-oncogene. Crit. Rev. Oncog. 1: 65-88.

41. Coux O., Goldberg A.L. 1998. Enzymes catalyzing ubiquitinilation and proteolytic processing of the pi05 precusor of nuclear factor kappa Bl. J. Biol. Chem. 273: 8820-8828.

42. Dahlmann B. 2005. Proteasomes. Essays Biochem. 41: 31-48.

43. Dahlmann В., Ruppert Т., Kloetzel P. M., Kuehn L. 2001. Subtypes of 20S proteasomes from skeletal muscle. Biochimie 83: 295-299.

44. Dallaporta В., Pablo M., Maisse C., Daugas E., Loeffler M., Zamzami N., Kroemer G. 2000. Proteasome activation as a critical event of thymocyte apoptosis. Cell Death. Differ. 7: 368-373.

45. Demartino G.N., Slaughter C.A. 1999. The proteasome, a novel protease regulated by multiple mechanisms. J. Biol. Chem. 274: 22123-22126.

46. Distelhorst "C.W. 2002. Recent insights into the mechanism of glucocorticosteroid-indiiced apoptosis. Cell Death. Differ. 9: 6-19.

47. Dou Q.P., McGuire T.F., Peng Y., An B. 1999. Proteasome inhibition leads to- significant reduction of Bcr-Abl expression and subsequent induction of apoptosis in K562 human chronic myelogenous leukemia cells. J. Pharmacol. Exp. Ther. 289(2): 781-790.

48. Drexler H.C.A. 1998. Programmed cell death and the proteasome // Apoptosis. 3: 1-7.

49. Drexler H.G., Matsuo Y., MacLeod R.A. 2004. Malignant hematopoietic cell lines: in vitro models for the study of erythroleukemia. Leuk. Res. 28(12): 12431251.

50. Dubiel W., Ferrell K., Rechsteiner M. 1995. Subunits of the regulatory complex of the 26S proteasome. Mol. Biol. Rep. 21: 27-34.

51. Earnshaw WC. 1995. Nuclear changes in apoptosis. Curr Opin Cell Biol. 7: 337-343.

52. Elliott P.J., Pien C.S., McCormack T.A., Chapman I.D., Adams J. 1999. Proteasome inhibition: A novel mechanism to combat asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 104:294-300.

53. Etlinger J. D., Goldberg A. L. 1977. A soluble ATPdependent proteolytic system responsible for the degradation of abnormal proteins in reticulocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74: 54-58.

54. Ezhkova E, Tansey W.P. 2004. Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3. Mol Cell. 13(3): 435-442.

55. Fang S., Jensen J. P., Ludwig R. L., Vousden К. H., Weissman A. M. 2000. Mdm2 is a RING finger-dependent ubiquitin protein ligase for itself and p53. J. Biol. Chem. 275: 8945-8951.

56. Farout L., Mary J., Vinh J., Szweda L.I., Friguet B. 2006. Inactivation of the proteasome by 4-hydroxy-2-nonenal is site specific and dependant on 20S proteasome subtypes. Arch Biochem Biophys.;453(l): 135-142.

57. Fenteany G., Standaert R.F., Lane W.S., Choi S., Corey E.J., Schreiber S.L. 1995. Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin. Science. 268(5211): 726-731.

58. Fernandez Murray P., Biscoglio M.J., Passeron S. 2002. In vivo and in vitro phosphorylation of Candida albicans 20S proteasome. Arch. Biochem. Biophys. 404: 116-125.

59. Ferry A.E., Baliga S.B., Monteiro C., Pace B.S. 1997. Globin gene silencing in primary erythroid cultures. An inhibitory role for interleukin-6. J. Biol. Chem. 272: 20030-20037.

60. Figueiredo-Pereira M.E., Chen W.E., Yuan H.M., Wilk S. 1995. A novel chymotrypsin-like component of the multicatalytic proteinase complex optimally active at acidic pH. Arch. Biochem. Biophys. 317(1): 69-78.

61. Forrest V.J., Kang Y.H., McClain D.E. Robinson D.H., Ramakrishnan N. 1994. Oxidativee stress-induce apoptosis prevented by Trolox. Free. Radic. Biol. Med. (16):675-684.

62. Franco A.V., Zhang X.D., Van Berkel E., Sanders J.E., Zhang X.Y., Thomas W.D., Nguyen Т., Hersey P. 2001. The role of NF-kappa В in TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)- induced apoptosis of melanoma cells. J. Immunol. 166:5337- 5345.

63. Frisan Т., Levitsky V., Polack A., Masucci M.G. 1998. Phenotypedependent differences in proteasome subunit composition and cleavage specificity in В cell lines. J. Immunol. 160: 3281-3289.

64. Fu H.Y., Doelling J.H., Arendt C.S., Hochstrasser M., Vierstra R.D. 1998. Molecular organization of the 20S proteasome gene family from Arabidopsis thaliana. Genetics. 149: 677-692.

65. Fu H.Y., Reis N„ Lee Y., Glickman M.H., Vierstra R. 2001. Subunit interaction maps for the regulatory particle of the 26S proteasome and the COP9 signalosome reveal a conserved core structure. J. EMBO. 20: 7096-7107.

66. Fujihara S., Ward C., Dransfield I., Hay R., Uings I., Hayes В., Farrow S., Haslett C., Rossi A. 2002. Inhibition of nuclear factor-кВ activation un-masks the ability of TNF-a to induce human eosinophil apoptosis. Eur. J. Immunol. 32: 457466.

67. Fujita E., Mukasa Т., Tsukahara Т., Arahata K., Omura S., Momoi T. 1996. Enhancement of CPP32-like activity in the TNF-treated U937 cells by the proteasome inhibitors. Biochem. Biophys. Res. Comm. 224: 74-79.

68. Gautier-Bert K., Murol В., Jarrousse A.S., Ballut L, Badaoui S., Petit F., Schmid H.P. 2003. Substrate affinity and substrate specificity of proteasomes with RNase activity. Mol. Biol. Rep. 30: 1-7.

69. Glickman M.H., Ciechanover A. 2002. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction. Physiol Rev. 82: 373-428.

70. Glickman M.H., Raveh D. 2005. Proteasome plasticity. FEBS Letters 579: 3214-3223.

71. Green D. 1998. Apoptotic pathways: the roads to ruin. Cell. 94: 695-698.

72. Gregory M.A., Hann S.R. 2000. c-Myc proteolysis by the ubiquitin-proteasome pathway: stabilization of c-Myc in Burkitt's lymphoma cells. Mol. Cell Biol. 20: 2423-2435.

73. Grethe S., Ares M.P., Andersson Т., Porn-Ares M.I. 2004. p38 МАРК mediates TNF-induced apoptosis in endothelial cells via phosphorylation and downregulation of Bcl-x(L). Exp. Cell Res. 298(2): 632-642.

74. Grimm L.M., Goldberg A.L., Poirier G.G., Schwartz L.M., Osborne B.A. 1996. Proteasomes.play an essential role in thymocyte apoptosis. EMBO J. 15: 3835-3844.

75. Grisham M.B., Palombella V.J., Elliot P.J., Conner E.M., Brand S., Wong H.L., Pien C., Mazzola L.M., Destree A., Parent L., Adams J. 1999. Inhibition of NF-kB activation in vitro and in vivo: role of 26S proteosome. Methods Enzymol. 300:345-363.

76. Groll M., Bajorek M., Kohler A., Moroder L., Rubin D.M., Huber R., Glickman M.H., Finley D. 2000. A gated channel into the proteasome core particle. Nat. Struct. Biol. 7(11): 1062-1067.

77. Groll M., Bochtler M., Brandstetter H., Clausen Т., Huber R.2005. Molecular machines for protein degradation. Chembiochem. 6(2): 222-256.

78. Groll M., Ditzel L., Lowe J., Stock D., Bochtler M., Bartunik H.D., Huber R. 1997. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature, 386:463-471

79. Groll M., Huber R. 2004. Inhibitors of the eukaryotic 20S proteasome core particle: a structural approach. Biochim. Biophys. Acta. 1695(1-3): 33-44.

80. Grzanka A., Zuryn A., Styczynski J., Grzanka A.A., Wisniewska H. 20'05. The effect of doxorubicin on the expression of cyclin A in K-562 leukemia cell line. Neoplasma. 52(6): 489-493.

81. Haass С., Kloetzel P.M. 1989. The Drosophila proteasome undergoes changes in its subunit pattern during development. Exp. Cell Res. 180: 243-252.

82. Haass C., Pesold-Hurt В., Multhaup G., Beyreuther K., Kloetzel P.M. 1989. The PROS-35 gene encodes the 35 kd protein subunit of Drosophila melanogaster proteasome. EMBO J. 8(8): 2373-2379.

83. Heinemeyer W., Fischer M., Krimmer Т., Stachon U., Wolf D.H. 1997. The active sites of the eukaryotic 20 S proteasome and their involvement in subunit precursor processing. J. Biol. Chem. 272: 25200-25209.

84. Heinemeyer W., Ramos P.C., Dohmen R.J. 2004. The ultimate nanoscale mincer: assembly, structure and active sites of the 20S proteasome core. Cell. Mol. Life Sci. 61:1562-1578.

85. Hendil K.B., Khan S., Tanaka K. 1998. Simultaneous binding of PA28 and PA700 activators to 20S proteasomes. Biochem. J. 332: 749-754.

86. Hendil К.В., Kristensen P., Uerkvitz W. 1995. Human proteasomes analysed with monoclonal antibodies. Biochem. J. 305: 245-252.

87. Herrmann J., Ciechanover A., Lerman O., Lerman A. 2004. The ubiquitin-proteasome system in cardiovascular diseases a hypothesis extended. Cardiovascular Res. 61: 11-12.

88. Herrmann J.L., Briones F.J., Brisbay S., Logothetis C.J., McDonnell T.J. 1998. Prostate carcinoma cell death resulting from inhibition of proteasome activity is independent of functional Bcl-2 and p53., Oncogene. 17: 2889-2899.

89. Hershko A. 1997. Roles of ubiquitin-mediated proteolysis in cell cycle control. Curr. Opin. Cell Biol. 9: 788-799.

90. Hershko A., Ciechanover A., Varshavsky A. 2000. Basic Medical Research Award. The ubiquitin system. Nat. Med. 6: 1073-1081.

91. Hilt W. 2004. Target of programmed destruction: a primer to regulatory proteolysis in yeast. CMLS. 61: 1-18.

92. Hirsch Т., Dallaporta В., Zamzami N., Susin S. A., Ravagnan L., Marzo I., Brenner C., Kroemer G. 1998. Proteasome activation occurs at an early, premitochondrial step of thymocyte apoptosis. J. Immunol. 161: 35-40.

93. Hochshtrasser M. 1996. Ubiquitin-dependent protein degradation. Annu. Rev. Immunol. 17: 405-439.

94. Hough R., Pratt G., Rechsteiner M. 1987. Purification of two high molecular weight proteases from rabbit reticulocyte lysates. J. Biol. Chem. 262: 8303-8313.

95. Hoyt M.A, Coffino P. 2004. Ubiquitin-free routes into the proteasome. CMLS. 61: 1-5.

96. Humbard M.A, Stevens S.M.J, Maupin-Furlow J. A. 2006. Posttranslational modification of the 20S proteasomal proteins of the archaeon Haloferax volcanii. J. Bacteriol. 188(21): 7521-7530.

97. Imajoh-Ohmi S, Kawaguchi T, Sugiyama S, Tanaka K, Omura S, Kikuchi H. 1995. Lactacystin, a specific inhibitor of the proteasome, induces apoptosis in human monoblast U937 cells. Biochem. Biophys. Res. Comm. 217: 1070-1077.

98. Iqbal M, Chatterjee S, Kauer J. C, Das M, Messina P, Freed B, Biazzo W, Siman R. 1995. Potent inhibitors of proteasome. J. Med. Chem. 38: 2276-2277.

99. Isoe T, Naito M, Hirai R, Tsumo T. 1991. Inhibition of ubiquitin-ATP-dependent proteolysis and ubiquitination by cisplatin. Anticancer Res. 11: 1905-1909.

100. Isoe T, Naito M, Shirai A, Hirai R, Tsuruo T. 1992. Inhibition of different steps of the ubiquitin system by cisplatin and aclarubicin. Biochim. Biophys. Acta. 1117: 131-135.

101. Iwafune Y, Kawasaki H, Hirano H. 2002. Electrophoretic analysis of phosphorylation of the yeast 20S proteasome. Electrophoresis. 23: 329-338.

102. Jarrousse A.S, Petit F, Kreutzer-Schmid K, Gaedigk R, Schmid H.P. 1999. Possible involvement of proteasomes (prosomes) in AUUUA-mediated mRNA decay. J. Biol. Chem. 274: 22023-22028.

103. Jin Z.y, Kurosu T, Yamaguchi M, Arai A, Miura O. 2005. Hematopoietic cytokines enhance Chkl -dependent G2/M checkpoint activation by etoposide through the Akt/GSK3 pathway to inhibit apoptosis. Oncogene. 24: 19731981.

104. Karin M, Ben-Neriah Y. 2000. Phosphorylation meets ubiquitination: the control ofNF-kappa.B activity. Annu Rev Immunol. 18: 621-663.

105. Kersting G, Tzvetkov M.V, Huse K, Kulle B, Hafner V, Brockmoller J, Wojnowski L. 2006. Topoisomerase II beta expression level correlates with doxorubicin-induced apoptosis in peripheral blood cells. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 374(1): 21-30.

106. Kessel M., Wu W., Gottesman S., Kocsis E., Steven A.C., Maurizi M.R. 1996. Six-fold rotational symmetry of ClpQ, the E. coli homolog of the 20S proteasome, and its ATP-dependent activator, ClpY. FEBS Lett. 398: 274-278.

107. Kim S.J., Kim H.G., Kim B.C., Park E.H., Lim C.J. 2004. Transcriptional regulation of glutathione synthetase in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Mol. Cells. 18(2): 242-248.

108. Kimura Y., Takaoka M., Tanaka S., Sassa H., Tanaka K., Polevoda В., Sherman F., Hirano H. 2000. N-Acetylation and proteolytic activity of the yeast 20 S proteasome. J. Biol. Chem. 275: 4635-4639.

109. Kishino Т., Lalande M., Wagstaff J. 1997. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nat Genet. 15(1): 70-73.

110. Kisselev A.F., Callard A., Goldberg A.L. 2006. Importance of the different proteolytic sites of the proteasome and the efficacy of inhibitors varies with the protein substrate. J. Biol. Chem. 281: 8582-8590.

111. Kisselev A.F., Goldberg A.L. 2001. Proteasome inhibitors: from research tools to drug candidates. Chem. Biol. 8: 739-758.

112. Kiyomiya K., Kurebe M., Nakagawa H., Matsuo S. 2002. The role of the proteasome in apoptosis induced by anthracycline anticancer agents. Int. J. Oncol. 20(6): 1205-1259.

113. Kiyomiya K., Matsuo S., Kurebe M. 1998. Proteasome is a carrier to translocate doxorubicin from cytoplasm into nucleus. Life Sci. 62: 1853-1860.

114. Kiyomiya K., Matsuo S., Kurebe M. 2001. Mechanism of specific nuclear transport of adriamycin: the mode of nuclear translocation of adriamycin-proteasome complex. Cancer Res. 61(6): 2467-2471.

115. Kloetzel P.M. 2001. Antigen processing by the proteasome. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2: 179-187.

116. Kloetzel P.M. 2004. The proteasome and MHC class I antigen processing. Biochim. Biophys. Acta.;1695(l-3): 225-233.

117. Kloetzel P.M., Soza A., Stohwasser R. 1999. The role of the proteasome system and the proteasome activator PA28 complex in the cellular immune response. Biol. Chem. 380: 293-297.

118. Kostova Z., Wolf D.H. 2003. For whom the bell tolls: protein quality control of the endoplasmic reticulum and the ubiquitin-proteasome connection. EMBO J. 22: 2309-2917.

119. Kristensen P., Johnsen A.H., Uerkvitz W., Tanaka K., Hendil K.B. 1994. Human proteasome subunits from 2-dimensional gels identified by partial sequencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 205: 1785-1789.

120. Kroll M., Arenzana-Seisdedos F., Bachelerie F., Thomas D., Friguet В., Conconi M. 1999. The secondary fungal metabolite gliotoxin targets proteolytic activities of the proteasome. Chem. Biol. 6: 689-698.

121. Kumeda S.I., Deguchi A., Toi M., Omura S. Umezawa K. 1999. Induction of G1 arrest and selective growth inhibition by lactacystin in human umbilical vein endothelial cells. Anticancer Res. 19: 3961-3968.

122. Kuttler C., Nussbaum A.K., Dick T.P., Rammensee H.G., Schild H., Hadeler K.P. 2000. An algorithm for the prediction of proteasomal cleavages. J. Mol. Biol. 298: 417-429.

123. Kwok J.C., Richardson D.R. 2004. Examination of the mechanism(s) involved in doxorubicin-mediated iron accumulation in ferritin: studies using metabolic inhibitors, protein synthesis inhibitors, and lysosomotropic agents. Mol. Pharmacol. 65: 181-195.

124. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685.

125. Lee D.H., Goldberg A.L. 1998. Proteasome inhibitors: valuable new tools for cell biologists. Trends Cell Biol. 8: 397-403.

126. Lee L.W., Moomaw C.R., Orth K., McGuire M.J., DeMartino G.N., Slaughter C.A. 1990. Relationships among the subunits of the high molecular weight proteinase, macropain (proteasome). Biochim. Biophys. Acta 1037: 17818-5.

127. Lee M.H., Hyun D.H., Jenner P., Halliwell B. 2001. Effect of proteasome inhibition on cellular oxidative damage, antioxidant defences and nitric oxide production. J. Neurochem. 78: 32-41.

128. Loening U.E. 1969. The determination of molecular weight of ribonucleic acid by polyacrylamide-gel electrophoresis. Biochem. J. 113: 131-138.

129. Lopes U.G., Erhardt P., Yao R., Cooper G.M. 1997. p53-dependent induction of apoptosis by proteasome inhibitors. J. Biol. Chem. 272: 12893-12896.

130. Lowe J., Stock D., Jap В., Zwickl P., Baumeister W., Huber R. 1995. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science, 268:533-539.

131. Lozzio C.B., Lozzio B.B. 1975. Human chronic myelogenous leukemia cell-line with positive Philadelphia chromosome. Blood. 45(3): 321-334.

132. Ludemann R., Lerea K.M., Etlinger J.D. 1993. Copurification of casein kinase II with 20 S proteasomes and phosphorylation of a 30-kDa proteasome subunit. J. Biol. Chem. 268: 17413-17417.

133. Ludemann R., Lerea K.M., Etlinger J.D. 1993. Copurification of casein kinase II with 20 S proteasomes and phosphorylation of a 30-kDa proteasome subunit. J. Biol. Chem. 268(23): 17413-17417.

134. Lum R.T., Kerwar S.S., Meyer S.M., Nelson M.G., Schow S.R., Schiffman D., Wick M.M., Joly A. 1998. A new class of proteasome inhibitors that prevent NFkB activation. Biochem. Pharmacol. 55: 1391-1397.

135. Luo H., Wu Y., Qi S., Wan X., Chen H., Wu J. 2001. A proteasome inhibitor effectively prevents mouse heart allograft rejection. Transplantation. 72: 196- 202.

136. Machiels B.M., Henfling M.E., Gerards W.L., Broers J.L., Bloemendal H., Ramaekers F.C. Schutte B. 1997. Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition. Cytometry 28: 243-252.

137. MacLaren A.P., Chapman R.S., Wyllie A.H., Watson C.J. 2001. p53-dependent apoptosis induced by proteasome inhibition in mammary epithelial cells. Cell Death. Differ. 8:210-218.

138. Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. 1982. Molecular cloning: a laboratory manual.# In: Gel electrophoresis. New York: Cold Spring Harbor Laboratory: 150-162.

139. Martin M.C., Dransfield I., Haslett C., Rossi A.G. 2001. Cyclic AMP regulation of neutrophil apoptosis occurs via a novel PKA- independent signaling pathway. J. Biol. Chem. 276(48): 45041-45050.

140. Martin S.J., Green D.R. 1995. Protease activation during apoptosis: Death by a thousand cuts? Cell. 82: 349-352.

141. Mason G., Murray R., Pappin D., Rivett A.J. 1998. Phosphorylation of ATPase subunits of the 26S proteasome. FEBS. 430: 269-274.

142. Mason G.G., Hendil K.B., Rivett A.J. 1996. Phosphorylation of proteasomes in mammalian cells. Identification of two phosphorylated subunits and the effect of phosphorylation on activity. Eur. J. Biochem. 238: 453-462.

143. Masson P., Andersson O., Petersen U.M., Young P. 2001. Identification and characterization of a Drosophila nuclear proteasome regulator. A homolog of human 11 S REGgamma (PA28gamma ). J. Biol. Chem. 276(2): 13831390.

144. Maupin-Furlow J.A., Humbard M.A., Kirkland P.A., Li W., Reuter C.J., Wright A.J., Zhou G. 2006. Proteasomes from structure to function: perspectives from Archaea. Curr. Top Dev. Biol. 75: 125-169.

145. Mayr J., Seemiiller E., Muller S.A., Engel A., Baumeister W. 1998. Late events in the assembly of 20S proteasomes. J. Struct. Biol. 124: 179-188.

146. McDonough H., Patterson C. 2003. CHIP: a link between the chaperone and proteasome systems. Cell Stress Chaperones. 8(4): 303-308.

147. Meiners S., Laule M., Rother W., Guenther C., Prauka I., Muschick P., Baumann G., Kloetzel P. M., Stangl K. 2002. Ubiquitin-proteasome pathway as a new target for the prevention of restenosis. Circulation. 105: 483-489.

148. Miller J., Gordon C. 2005. The regulation of proteasome degradation by multi-ubiquitin chain binding proteins. FEBS Letters 579: 3224-3230.

149. Mizutani H, Tada-Oikawa S, Hiraku Y, Kojima M, Kawanishi S. 2005. Mechanism of apoptosis induced by doxorubicin through the generation of hydrogen peroxide. Life Sci. 76(13): 1439-1453.

150. Murata S. 2006. Multiple Chaperone-Assisted Formation of Mammalian 20S Proteasomes. IUBMB Life, 58: 344-348.

151. Murray* A.W. 2004. Recycling the cell cycle: cyclins revisited. Cell. 116(2): 221-234.•180. Nalepa G, Rolfe M, Harper J.W. 2006. Drug discovery in the ubiquitin-proteasome system. Nat. Rev. Drug Discov. 5(7): 596-5613.

152. Nam S, Smith D. M, Dou Q. P. 2001. Tannic Acid Potently Inhibits Tumor Cell Proteasome Activity, Increases p27 and Bax Expression, and Induces G(l) Arrest and Apoptosis. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 10: 1083-1088.

153. Nandi D, Tahiliani P, Kumar A, Chandu D. 2006. The ubiquitin-proteasome system. J. Biosci. 31(1): 137-155.

154. Nandi D, Woodward E, Ginsburg D.B. and Monaco J.J. 1997. Intermediates in the formation of mouse 20S proteasomes: implications for the assembly of precursor beta subunits.EMBO J. 16: 5363-5375.

155. Naujokat C, Hoffmann S. 2002. Role and Function of the 26S Proteasome in Proliferation and Apoptosis. Laboratory Investigation. 82: 965-980.

156. Olink-Coux M, Arcangeletti C, Pinardi F, Minisini R, Huesca M, Chezzi C, Scherrer K. 1994. Cytolocation of prosome antigens on intermediate filament subnetworks of cytokeratin, vimentin and desmin type. J. Cell Sci. 107: 353-366.

157. Orlowski M. 1990. The multicatalytic proteinase complex, a major extralysosomal proteolytic system. Biochemistry. 29: 10289-10297.

158. Orlowski M, Wilk S. 2000. Catalytic activities of the 20S proteasome, a multicatalytic proteinase complex. Arch Biochem Biophys. 383: 1-16.

159. Orlowski M, Wilk S. 2003. Ubiquitin-independent proteolytic functions of the proteasome. Arch Biochem Biophys. 415: 1-5.

160. Orlowski R. Z, Eswara J. R, Lafond-Walker A, Grever M. R, Orlowski M, Dang C.V. 1998. Tumor growth inhibition induced in a murine model of human Burkitt's lymphoma by a proteasome inhibitor. Cancer Res. 58: 43424348.

161. Orlowski R.Z., Dees E.C. 2003. The role of the ubiquitination-proteasome pathway in breast cancer: applying drugs that affect the ubiquitin-proteasome pathway to the therapy of breast cancer. Breast Cancer Res. 5(1): 1-7.

162. Pajonk F., McBride W. H. 2001. The Proteasome in Cancer Biology and Treatment. Radiat. Res. 156: 447-459.

163. Palmer A., Rivett A.J., Thomson S., Hendil K.B., Butcher G.W., Fuertes G., Knecht E. 1996. Subpopulations of proteasomes in rat liver nuclei, microsomes and cytosol. Biochem. J. 316: 401-407.

164. Pereira M.E., Yu В., Wilk S. 1992. Enzymatic changes of the bovine pituitary multicatalytic proteinase complex, induced by magnesium ions. Arch. Biochem. Biophys. 294: 1-8.

165. Petit F., Jarrousse A.-S., Boissonnet G., Dadet M.-H., Buri J. 1997a. Proteasome (prosome) associated endonuclease activity. Mol. Biol. Rep. 24: 113117.

166. Petit F., Jarrousse A-S., Dahlmann В., Sobek A., Hendil K.B., Bury J., Briand Y., Schmid H.-P. 1997b. Involvement of proteasomal subunits zeta and iota in RNA degradation. Biochem. J. 326:93-98.

167. Piccinini M., Tazartes O., Mezzatesta C., Ricotti E., Bedino S., Grosso F., Dianzani U., Tovo P.A., Mostert M., Musso A., Rinaudo M.T. 2001. Proteasomes are a target of the anti-tumour drug vinblastine. Biochem. J. 356: 835841.

168. Pickart C.M. 2001. Mechanisms underlying ubiquitination. Annu Rev Biochem. 70: 503-533.

169. Pleban E., Bury M., Mlynarczuk I., Wojcik C. 2001. Effects of proteasome inhibitor PSI on neoplastic and non-transformed cell lines. Folia Histochem. Cytobiol. 39: 133-134.

170. Pouch M.N., Petit F., Buri J., Briand Y., Schmid H.-P. 1995. Identification and initial characterization of a specific proteasome (prosome) associated RNase activity. J. Biol. Chem. 270: 22023-22028.

171. Ptacek J., Snyder M. 2006. Charging it up: global analysis of protein phosphorylation. Trends Genet. 22(10): 545-554.

172. Rajkumar S.V., Richardson P.G., Hideshima Т., Anderson K.C. 2005. Proteasome inhibition as a novel therapeutic target in human cancer. J. Clin. Oncol. 23(3): 630-639.

173. Ramos P.C., Hockendorff J., Johnson E.S., Varshavsky A., Dohmen R.J. 1998. Umplp is required for proper maturation of the 20S proteasome and becomes its substrate upon completion of the assembly. Cell 92: 489-499.

174. Rao S., Porter D.C., Chen X., Herliczek Т., Lowe M. Keyomarsi K. 1999. Lovastatin-mediated G1 arrest is through inhibition of the proteasome, independent of hydroxymethyl glutaryl-CoA reductase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 7797-7802.

175. Reed S. 2005. The ubiquitin-proteasome pathway in cell cycle control. Results Probl. Cell Differ. 42: 147-181.

176. Rivett A., Bose S., Brooks P., Broadfoot K.I. 2001. Regulation of proteasome complexes by y-interferon and phosphorylation. Biochimie. 83: 363366.

177. Rivett A.J. 1998. Intracellular distribution of proteasomes. Curr. Opin. Immunol. 10: 110-114.

178. Rivett A.J., Palmer A., Knecht E. 1992. Electron microscopic localization of the multicatalytic proteinase complex in rat liver and in cultured cells. J. Histoch. Cytochem. 40: 1165-1172.

179. Rivett A.J., Sweeney S.T. 1991. Properties of subunits of the multicatalytic proteinase complex revealed by the use of subunit-specific antibodies. Biochem. J. 278: 171-177.

180. Rohrwild M., Coux O., Huang H.C., Moerschell R.P., Yoo S.J., Seol J.H. 1996. HslV-HslU: A novel ATP-dependent protease complex in Escherichia coli related to the eukaryotic proteasome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 58085813.

181. Ryabova L.V., Virtanen I., Olink-Coux M., Scherrer K., Vassetzky S.G. 1994. Distribution of prosome proteins and their relationship with the cytoskeleton in oogenesis of Xenopus laevis. Mol. Reprod. Dev. 37: 195-203.

182. Sabatini N., Di Pietro R., Rapino M., Sancilio S., Comani S., Cataldi A. 2004. PI-3-kinase/NF-kappaB mediated response of Jurkat T leukemic cells to two different chemotherapeutic drugs, etoposide and TRAIL. J Cell Biochem. 93: 301-311.

183. Salghetti S.E., Kim S.Y., Tansey W.P. 1999. Destruction of Мус by ubiquitin-mediated proteolysis: cancer-associated and transforming mutations stabilize Мус. EMBO J. 18: 717-726.

184. Sarin A., Adams D.H., Henkart P.A. 1993. Protease inhibitors selectively block T cell receptor-triggered programmed cell death in a murine T cell hybridoma and activated peripheral T cells. J. Exp. Med. 178: 1693-1700.

185. Satoh M., Lindahl T. 1993. Role of poly(ADP-ribose) formation in repair. Nature. 356:356-358.

186. Schmid H.P., Pouch M.N., Petit F., Dadet M.H., Badaoui S., Boissonnet G., Buri J., Norris V., Briand Y. 1995. Relationships between proteasomes and RNA. Mol. Biol. Rep. 21(1): 43-47.

187. Schwartz L.M., Myer A., Kosz L., Engelstein M., Maier C. 1990. Activation of polyubiquitin geneexpression during developmentally programmed cell death. Neuron. 5: 411-419.

188. Seemuller E., Lupas A., Stock D., Lowe J., Huber R., BaumeisterW. 1995. Proteasome from Thennoplasma acidophilum: a threonine protease. Science. 268: 579-582.

189. Shah S.A., Potter M.W., Callery M.P. 2001a. Ubiquitin proteasome pathway: implications and advances in cancer therapy. Surg. Oncol. 10: 43-52.

190. Shah S.A., Potter M.W., McDade T.P., Ricciardi R., Perugini R.A., Elliott P.J., Adams J., Callery M. P. 2001b. 26S proteasome inhibition induces apoptosis and limits growth of human pancreatic cancer, J. Cell Biochem. 82: 110122.

191. Shen Y., White E. 2001. p53-dependent apoptosis pathways. Adv. Cancer Res. 82: 55-84.

192. Smalle J., Vierstra D. 2004. The ubiquitin 26S proteasome proteolytic pathway. Annu. Rev. Plant Biol. 55: 555-590.

193. Solin D., Totzke G., Essmann F., Schulze-Osthoff K., Levkau В., Janicke R.U. 2006a. The Proteasome Is Required for Rapid Initiation of Death Receptor-Induced Apoptosis. Mol. Cel. Biol. 26: 1967-1978.

194. Solin D., TotzkeG., Schulze-Osthoff K., Janicke R.U. 2006b. Friend or Foe? The Proteasome In Combined Cancer Therapy. Cell Cycle 5: 841-845.

195. Soza A,, Knuehl C., Groettrup M., Henklein P., Tanaka K., Kloetzel P-M. 1997. Expression and subcellular localization of mouse 20S proteasome activator complex PA28. FEBS Lett. 413: 27-34.

196. Staub O., Yeger H, Plant P.J., Kim H„ Ernst S.A., Rotin D. 1997. Immunolocalization of the ubiquitin-protein ligase Nedd4 in tissues expressing the epithelial Na+ channel (ENaC). Am. J Physiol. 272:1871-1880.

197. Sumegi M., Hunyadi-Gulyas E., Medzihradszky K.F., Udvardy A. 2003. 26S proteasome subunits are O-linked N-acetylglucosamine-modified in Drosophila melanogaster. Biochem Biophys Res Commun. 312(4): 1284-1289.

198. Sun Z.W., Allis C.D. 2002. Ubiquitination of histone H2B regulates H3 methylation and gene silencing in yeast. Nature. 418: 104-108.

199. Szulawska A, Czyz M. 2006. Molecular mechanisms of anthracyclines action, Postepy Hig. Med. Dosw. 60: 78-100.

200. Tamura Т., Nagy I., Lupas A., Lottspeich F., Cejka Z., Schoofs G., Tanaka K., De Mot R., Baumeister W. 1995. The first characterization of a eubacterial proteasome: the 20S complex of Rhodococcus. Curr. Biol. 5(7): 766774.

201. Tanahashi N., Murakami Y., Minami Y., Shimbara N., Hendil K.B., Tanaka K. 2000. Induction by interferon- and contribution to ATP-dependent proteolysis. J. Biol. Chem. 275: 14336-14345.

202. Tani E, Kitagawa H, Ikemoto H, Matsumoto T. 2001. Proteasome inhibitors induce Fas-mediated apoptosis by c-Myc accumulation and subsequent induction of FasL message in human glioma cells. FEBS Lett. 504: 53-58.

203. Tanimoto Y, Kizaki H. 2002. Proteasome inhibitors block ras/ERK signaling pathway resulting in the downregulation of Fas ligand expression during activation-induced cell death in T cells. J. Biochem. 131: 319-326.

204. Tenev T, Marani M, McNeish I, Lemoine N. R. 2001. Pro-caspase-3 overexpression sensitises ovarian cancer cells to proteasome inhibitors. Cell Death. Differ. 8: 256-264.

205. To W.Y, Wang C.C. 1997. Identification and characterization of an activated 20S proteasome in Trypanosoma brucei. FEBS Lett. 404(2-3): 253-262.

206. Tokumoto M, Horiguchi R, Nagahama Y, Tokumoto T. 1999. Identification of the Xenopus 20S proteasome alpha4 subunit which is modified in the meiotic cell cycle. Gene. 239(2): 301-308.

207. Tokunaga F, Aruga R, Iwanaga S, Tanaka K, Ichihara A, Takao T, Shimonishi Y. 1990. The NH2-terminal residues of rat liver proteasome (multicatalytic proteinase complex) subunits, C2, C3 and C8, are Na-acetylated. FEBS Lett. 263: 373-375.

208. Touitou R, Richardson J, Bose S, Nakanishi M, Rivett J, Allday M.J. 2001. A degradation signal located in the C-terminus of p21WAFl/CIPl is a binding site for the C8 alpha-subunit of the 20S proteasome. EMBO J. 20: 23672375.

209. Traenckner E.B, Wilk S. Baeuerle P.A. 1994. A proteasome inhibitor prevents activation of NFkB and stabilizes a newly phosphorylated form of I kappa B-alpha that is still bound to NFkB. EMBO J. 13: 5433-5441.

210. Umeda'M, Manabe Y, Uchimiya H. 1997. Phosphorylation of the C2 subunit of the proteasome in rice (Oryza sativa L.). FEBS Lett. 403(3): 313-307.

211. Ustrell V, Hoffman L., Pratt G, Rechsteiner M. 2002. PA200, a nuclear proteasome activator involved in DNA repair. EMBO J. 21(13): 3516-3525.

212. Ustrell V, Pratt G, Gorbea C, Rechsteiner M. 2005. Purification and assay of proteasome activator PA200. Methods Enzymol. 398: 321-329.

213. Vink J, Cloos J, Kaspers G.J. 2006. Proteasome inhibition as novel treatment strategy in leukaemia. Br. J. Haematol. 134(3): 253-262.

214. Vivancos A.P, Castillo E.A, Biteau B, Nicot C, Ayte J, Toledano M.B, Hidalgo E. 2005. A cysteine-sulfinic acid in peroxiredoxin regulates H2O2sensing by the antioxidant Papl pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102(25): 8875-8880.

215. Volker C., Lupas A.N. 2002. Molecular evolution of proteasomes. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 268: 1-22.259. von Mikecz A. 2006. The nuclear ubiquitin-proteasome system. J. Cell Sci. 119(10):1977-1984.

216. Wagenknecht В., Hermisson M., Eitel K. Weller M. 1999. Proteasome inhibitors induce p53/p21-independent apoptosis in human glioma cells. Cell Physiol. Biochem. 9: 117-125.

217. Wallace A.D., Cidlowski J.A. 2001. Proteasomemediated glucocorticoid receptor degradation restricts transcriptional signaling by glucocorticoids. J. Biol. Chem. 276: 42714-42721.

218. Walz J., Erdmann A., Kania M., Турке D., Koster A.J., Baumeister W. 1998. 26S proteasome structure revealed by three-dimensional electron microscopy. J. Struct. Biol. 121: 19-29.

219. Wang C.Y., Mayo M.W., Baldwin A.S.Jr. 1996. TNFand cancer therapy-induced apoptosis: potentiation by inhibition of NFkB. Science. 274: 787789.

220. Wang H.R., Kania M., Baumeister W., Nederlof P.M. 1997. Import of human and Thennoplasma 20S proteasomes into nuclei of HeLa cells requires functional NLS sequences. Eur. J. Cell Biol. 73: 105-113.

221. Wang J., Maldonado M.A. 2006. The Ubiquitin-Proteasome System and Its Role in Inflammatory and Autoimmune Diseases. Cell Mol. Immunol. 3(4): 255-261.

222. Wang L, Chen L, Benincosa J, Fortney J, Gibson LF. 2005. VEGF-induced phosphorylation of Bcl-2 influences В lineage leukemic cell response to apoptotic stimuli. Leukemia. 19: 344-353.

223. Wang "X.W. 1999. Role of p53 and apoptosis in carcinogenesis. Anticancer Res. 19-/4759-4771.

224. Wilk S., Orlowski M. 1983. Evidence that pituitary cation- sensitive neutral endopeptidase is a multicatalytic protease complex. J. Neurochem. 40: 842849.

225. Witt E., Zantopf D., Schmidt M., Kraft R., Kloetzel P.M., Kruger E. 2000. Characterisation of the newly identified human Umpl homologue POMP andanalysis of LMP7 (beta 5i) incorporation into 20 S proteasomes. J. Mol. Biol. 301(1): 1-9.

226. Wojcik C. 1999. Inhibition of the proteasome as a therapeutic approach. Drug Discov. Today. 4: 188-192.

227. Wojcik C. 2002. Regulation of apoptosis by the ubiquitin and proteasome pathway. J. Cell. Mol. Med. 6: 25-48.

228. Wojcik C., Bury M., Stoklosa Т., Giermasz A., Feleszko W., Mlynarczuk I., Pleban E., Basak G., Omura S., Jakobisiak M. 2000. Lovastatin and simvastatin are modulators of the proteasome, Int. J. Biochem. Cell Biol. 32: 957965.

229. Wojcik C., DeMartino G.N. 2003. Intracellular localization of proteasomes. Int. J. Biochem. Cell Biol. 35: 579-589.

230. Wolf D.H. 2004. From lysosome to proteasome: the power of yeast in the dissection of proteinase function in cellular regulation and waste disposal. CMLS.61: 1-14.

231. Yang W., Monroe J., Zhang Y., George D., Bremer E., Li H. 2006. Proteasome inhibition induces both pro- and anti-cell death pathways in prostate cancer cells. Cancer Lett. 243(2): 217-227.

232. Yao Y., Huang L., Krutchinsky A., Wong M.L., Standing K.G., Burlingame A.L., Wang C.C. 1999. Structural and functional characterizations of the proteasome-activating protein PA26 from Trypanosoma brucei. J. Biol. Chem. 274:33921-33930.

233. Zachara N.E., Hart G.W. 2004. O-GlcNAc modification: a nutritional sensor that modulates proteasome function. Trends Cell Biol. 14(5): 218-221.1. БЛАГОДАРНОСТИ

234. Я выражаю глубокую благодарность и искреннюю признательность моему научному руководителю Ирине Михайловне Константиновой за мудрое руководство моей работой, неустанное внимание, интерес и все то, благодаря чему эта работа могла быть выполнена.

235. Хочу поблагодарить Ирину Михайловну Кузнецову и Константина Константиновича Туроверова за помощь в проведении флуориметрического анализа.

236. Я хочу поблагодарить Сергея Николаевича Борхсениуса за большое внимание к моей работе при подготовке рецензии.

237. Я благодарю всю свою семью и моих друзей за их заботу и моральную поддержку.

Информация о работе

Цимоха, Анна Сергеевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2007
ВАК 03.00.03

Диссертация

Изменения состава и ферментативных активностей протеасом при апоптозе в клетках К562 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы