Характеристика внеклеточных протеасом при апоптозе клеток К562

Зайкова, Юлия Яковлевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика внеклеточных протеасом при апоптозе клеток К562
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика внеклеточных протеасом при апоптозе клеток К562"

На правах рукописи

Зайкова

Юлия Яковлевна

ХАРАКТЕРИСТИКА ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕАСОМ ПРИ АПОПТОЗЕ

КЛЕТОК К562

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 5 НОЯ 2012

Санкт-Петербург 2012

005054899

Работа выполнена на кафедре физико-химической биологии клетки факультета медицинской физики и биоинженерии ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный политехнический университет» и в лаборатории регуляции экспрессии генов ФГБУН Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург.

Научные руководители: академик

Никольский Николай Николаевич,

Санкт-Петербургский государственный политехнический университет, факультет медицинской физики и биоинженерии, г. Санкт-Петербург

кандидат биологических наук Цимоха Анна Сергеевна, Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Корнилова Елена Сергеевна Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург

кандидат биологических наук Орлов Сергей Владимирович НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН, г. Санкт-Петербург

Ведущая организация: Санкт-Петербургский

государственный университет, биолого-почвенныи факультет

Защита состоится «30» ноября 2012 года в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д002.230.01 на базе Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4. Сайт института: http://www.cvtspb.rssi.ru: адрес электронной почты института cellbio@mail.cvtspb.rssi.ru: факс института: (812) 297-03-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан «29» октября 2012 года.

Учёный секретарь Диссертационного совета Р

кандидат биологических наук _ Л/лЕ. В. Каминская

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Апоптоз — генетически запрограммированная гибель клеток, которая приводит к "аккуратной" разборке повреждённых клеток и их удалению. Очень важно, что при апоптотической гибели клетки не развивается воспалительный процесс. Зачастую возникновение и развитие опухоли связано с нарушением в работе апоптотической системы, поэтому индукцию апоптоза используют как один из подходов в терапии канцерогенеза и ряда других заболеваний.

В клетке одной из систем деградации белков являются протеасомы. Убиквитин-протеасомная система (УПС) осуществляет программированный протеолиз и процессинг различных регуляторных белков, участвующих во множестве клеточных процессов, включая регуляцию транскрипции, репарацию ДНК, продвижение клетки по клеточному циклу, иммунный ответ, апоптоз (Konstantinova et al., 2008; Моисеева и др., 2010; Цимоха, 2010). Убиквитин-зависимому протеолитическому пути деградации подвергаются многие белки-регуляторы апоптоза (Drexler 1998; Wojcik, 2002) включая многие опухолевые супрессоры и онкогенные белки. Поэтому нарушения в УПС, вызывают, в частности, накопление в клетке онкобелков, что приводит к реализации их онкогенного потенциала и, как следствие, к образованию новых очагов опухолевого роста (Naujokat, Hoffmann, 2002; Herrmann et al., 2004).

Согласно современным представлениям, протеасомы в клетке вездесущи: они находятся и в ядре, и в цитоплазме клеток. В последнее годы исследований протеасом в литературе появились данные об их присутствии во внеклеточном пространстве (Lavabre-Bertrand et al., 2001; Stoebner et al., 2005; Sixt et al., 2007, 2009; Sixt, Dahlmann, 2008; Albright et al., 2009; Henry et al., 2009; Sixt, Peters, 2010). С помощью метода электронной микроскопии было показано, что внеклеточные протеасомы имеют структуру, аналогичную внутриклеточным частицам (Zoeger et al., 2006). Биологические функции внеклеточных протеасом до сих пор неясны, однако были выявлены различия в количестве экспортируемых из клеток в плазму протеасом при опухолевой трансформации клеток (Lavabre-Bertrand et al., 2001; Stoebner et al., 2005; Henry et al., 2009). Кроме того, наблюдается увеличение концентрации протеасом во внеклеточном альвеолярном пространстве при дыхательной недостаточности и во время воспалительных процессов в лёгких (Sixt et al., 2007, 2009; Albright et al., 2009). Интересно, что не наблюдалось никакой корреляции между клеточной гибелью и появлением протеасом во внеклеточном пространстве (Sixt et al., 2007). Предполагается, что накопление протеасом в межклеточном пространстве связано, прежде всего, с необходимостью «расчистки территории» — избавление от накапливающихся во внеклеточном пространстве белков и активация секретируемых клеткой белков-предшественников, а также процессинг антигенов (Sixt, Peters, 2010).

В упомянутых выше исследованиях была сделана оценка лишь количества и удельной протеолитической активности внеклеточных протеасом. Известно, однако, что активность и стабильность белка, так же как его функционирование в клетке, определяется, в том числе, его посттрансляционными модификациями (ПТМ), поэтому описывая такой многофункциональный белковый комплекс, как протеасома, крайне важно получить описание паттерна его ПТМ. На сегодняшний день не был сделан анализ паттерна ПТМ протеасомных субъединнц и субъединичного состава внеклеточных протеасом. Не изучались изменения пептидазных активностей протеасом при выходе их из клеток во внеклеточное пространство, а также при индукции апоптотической гибели в этих клетках.

Многие процессы внутри клеток регулируются белками, которые осуществляют свою регуляторную функцию, в том числе за счет специфического связывания с другими белками, которые, как правило, являются специфическими ферментами. В силу этого важно исследование ассоциированные с внеклеточными протеасомами белков, как возможных кандидатов в регуляторы протеасомной секреции во внеклеточное пространство.

В свете вышесказанного весьма актуальным представляется исследование специфических изменений паттерна ПТМ субъединиц и пептидазных активностей внеклеточных протеасом до и после индукции апоптоза в клетках проэритролейкемии человека линии К562 при помощи противоопухолевого препарата доксорубицина (ДР). Кроме того, важно исследовать субъединичный состав внеклеточных протеасом в сравнении с внутриклеточными частицами, получить первичный скрининг белков, ассоциированных с протеасомами.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование субъединичного состава, ПТМ и пептидазных активностей внеклеточных протеасом при индукции апоптоза в клетках проэритролейкемии человека линии К562, идентификация ассоциированных с внеклеточными протеасомами белков. Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ субъединичного состава, ПТМ и пептидазных активностей вне- и внутриклеточных протеасом в клетках линии К562.

2. Исследовать изменения ПТМ и пептидазных активностей внеклеточных протеасом при индукции апоптоза в клетках К562.

3. Определить спектр белков, ассоциированных с внеклеточными протеасомами.

Основные положения, выносимые на защиту 1. При выходе протеасом из клеток во внеклеточное пространство происходит изменение паттерна их ПТМ, субъединичного состава и пептидазных активностей.

2. При индукции апоптоза с помощью ДР в клетках К562 наблюдаются специфические изменения спектра ПТМ субъединнц внутриклеточных протеасом.

3. Воздействие на клетки К562 индуктора аиоитоза ДР приводит к снижению трипсин- и каспаза-подобных типов пептидазной активности внеклеточных протеасом и не изменяет химотрипсиновую активность.

4. В субъединицах 20S коровой частицы внеклеточных протеасом выявлены новые сайты убиквитинилирования, а также сайт ацетилирования регуляторной субъединицы Rpnl 1.

5. С протеасомами ассоциированы белки, участвующие в различных клеточных процессах: транскрипция, репарация ДНК, трансляция, а также белки цитоскелета, У ПС и др.

Научная новизна полученных результатов. В настоящей работе впервые показано, что при выходе протеасом из клеток К562 в среду культивирования происходят изменения паттерна их ПТМ, субъединичного состава и пептидазных активностей. Наблюдаются изменения паттерна ПТМ субъединиц внеклеточных протеасом после индукции апоптоза в клетках. Кроме того, после индукции апоптоза изменяются пептидазные активности внеклеточных протеасом: наблюдается снижение трипсин- и каспаза-подобных типов активности, химотрипсиновая активность не изменяется.

Впервые выявлены сайты убиквитинилирования и ацетилирования у субъединиц протеасом а2 (К.196), а4 (К189 и К234), аб (К217) и Rpn6 (А2). Обнаружено, что в составе внеклеточных протеасом присутствует регулятор РЛ200, который, как полагали ранее, локализуется в клеточном ядре.

Впервые определены белки, взаимодействующие с внеклеточными протеасомами, и показано, что с протеасомами ассоциированы белки, участвующие в таких основных клеточных процессах, как транскрипция, репарация ДНК, трансляция, белки цитоскелета и убиквитин-протеасомной системы (УПС).

Теоретическое н практическое значение работы. Полученные результаты свидетельствуют об изменениях не только паттерна ПТМ протеасомных субъединиц, но и субъединичного состава и пептидазной активности протеасом при выходе частиц из клеток. Кроме того, выявлены белки, ассоциирующиеся с протеасомами, что является отправной точкой в дальнейших исследованиях белков ко-регуляторов секреции протеасом клетками. Результаты работы имеют большое значение для понимания молекулярных механизмов секреции протеасом клетками, в том числе при индукции апоптоза в раковых клетках с помощью противоопухолевого препарата (ДР), и могут быть использованы в разработке новых подходов к лечению онкологических заболеваний с применением специфических ингибиторов протеасом в сочетании с другими терапевтическими агентами.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III конференции молодых учёных Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2012), XXIV зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2012), III, IV, VI, VIII Российских конференциях по фундаментальной онкологии (Санкт-Петербург, 2007, 2008, 2010 и 2012), 13-й и 14-й Санкт-Петербургских ассамблеях молодых учёных и специалистов (Санкт-Петербург, 2008, 2009), II съезде Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2007), 10-й и 11-й Путинских международных школах-конференциях молодых учёных (Москва, 2006, 2007), Политехническом симпозиуме Молодые учёные - промышленности северо-западного региона (Санкт-Петербург, 2006 и 2007), XXXIV и XXXV всероссийских межвузовских научно-технических конференциях студентов и аспирантов «Неделя науки СПбГПУ» (Санкт-Петербург, 2005 и 2006).

Личный вклад диссертанта. Все экспериментальные процедуры, описанные в работе, были проведены автором лично. Анализ подготовленных автором проб на проточном цитофлуориметре осуществлял Н. Д. Аксёнов, на масс-спектрометре — А. Боттрилл. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем.

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при частичной финансовой поддержке РФФИ (проекты № 08-04-00834 и № 10-04-01234), Программы Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология", ФЦНТП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 годы (№ П1389, № 16.740.11.0366 и № 8787) и ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы" (№ 16.512.11.2242) и правительства Санкт-Петербурга (2008, 2009, 2011).

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего /¿^ источников. Работа изложена на -/^Устраницах машинописного текста, иллюстративный материал содержит ^рисунков и таблиц.

Материалы и методы.

Клетки проэритролейкемии человека линии К562 (Lozzio, Lozzio, 1975) и мезенхимные клетки человека ДМЕ/Т12, полученные из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН), культивировали в среде RPM1-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Для индукции апоптоза в культуральную жидкость добавляли доксорубицин (ДР) до конечной концентрации 4 мкМ (Anand et al., 1995) и инкубировали клетки в течение 24 ч.

Индукцию апоптоза оценивали по изменению морфологии ядер, межнуклеосомной фрагментации ДНК и цитофлуорометрически.

Выделение протеасом. Цитозоль выделяли согласно методу, описанному Константиновой и соавторами (1995). Протеасомы выделяли из иостмитохондриального супернатанта цитозоля клеток или из кондиционированной клетками среды с помощью центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (15-30%) и ионообменной хроматографии на DEAE-52 целлюлозе (Hough et al., 1987).

Пептпдазную активность протеасом трипсин-подобного типа определяли по гидролизу флуорогенного пептида Ac-Arg-Leu-Arg-AMC , химотрипепн-подобного типа - по гидролизу Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC, а каспаза-подобного типа - по гидролизу Z-Leu-Leu-Glu-AMC (все пептиды Enzo LS, США). Реакцию проводили согласно инструкции фирмы - изготовителя. Концентрацию продукта гидролиза (7-амино)-4-метилкумарина определяли на флуориметре, измеряя экстннкцию и эмиссию при длинах волн 365 и 440 нм, соответственно (Barret, 1980).

Двумерный электрофорез белков проводили согласно инструкциям фирмы -изготовителя (GE Healthcare США). Электрофорез во втором направлении проводили в 12%-ном ПААГ в стандартной системе Лэммли (Laemmli, 1970). Белки визуализировали при помощи окрашивания серебром или Кумасси G-250.

Иммунопрецепптакня. Клеточный экстракт, полученный из клеток К562 (Dignain et al., 1983), инкубировали с протеин-G сефарозой (GE Healthcare, США) при постоянном перемешивании пробы в течение 1 -2 ч при температуре + 4 "С с целью удаления из пробы неспецифически связывающихся белков. Затем супернатант инкубировали с соответствующими антителами в течение ночи при +4 °С, после чего добавляли протеин-G сефарозу и инкубировали в течение 4 ч при 4 °С при постоянном, перемешивании пробы. Иммунопреципитаты отмывали 4 раза раствором PBS.

Вестернблотинг. Анализ субъединичного состава протеасом и их статуса фосфорилирования проводили методом вестернблотинга. Концентрацию белка в очищенных препаратах протеасом определяли спектрофотометрически методом Брэдфорд (Bradford, 1976). Вестернблотинг проводили согласно стандартным методикам. Белки выявляли методом усиленной хемилюминесценнии (ECL) с помощью SuperSignal West Femto согласно инструкции фирмы-изготовителя (Pierce, США). В качестве специфических антител использовали антитела к субъединнцам протеасом а- и р-типа и Rpn7 (все BioMol, Англия). Были использованы также антитела к фосфорилированным аминокислотам: Туг (BD, США), Thr (Cell Signaling, США) и Ser (Sigma, США). Использовали так же антитела против Myosin-9, AIpha-actinin-4, Tubulin alpha, Tropomyosin alpha-3, hnRNP L, hnRNP F/H. В качестве вторых антител были использованы

кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши или козьи против иммуноглобулинов кролика (Sigma, США).

iTRAQ (isobaric Tagging for Relative and Absolute Quantifications) масс-спектрометрический анализ протеасом проводили согласно описанному ранее методу (Gazzah et al., 2012). Образцы очищенных протеасом из кондиционированной клетками среды и клеток К562 нормировали между собой методом вестернблотинга с помощью специфических антител к белкам протеасом (данные не представлены). Далее препараты вне- и внутриклеточных протеасом в количестве по 75 мкг каждого ресуспендировали в 50 мМ бикарбоната триэтиламмония (ТЕАВ), добавляли 10 мМ DTT и инкубировали в течение 1 ч при температуре 60 °С. . К пробам добавляли 100 мМ йодацетамида и инкубировали в темноте в течение 1 ч при комнатной температуре. Трипсинолиз белковых проб проводили в течение 12 ч при температуре 37 °С, соотношение трипсина к белку в пробе составляло 1:100.

Пробы после трипсинолиза высушивали и ресуспендировали в 100 мМ ТЕАВ. ТМТ (Tandem Mass Tags, Termo scientific, США) реагенты для мечения растворяли в ацетонитриле, добавляли к пробам и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением в реакционную смесь 5% гидроксиламина в течение 15 мин. Пробы высушивали и растворяли в смеси 0.1% муравьиной и 0.05% трифторуксусной кислот, 2% ацетонитрила.

LC-MS/MS анализ проводили с помощью хроматографической системы RSLCnano HPLC system (Dionex, Великобритания) и масс-спектрометра LTQ-Orbitrap-Velos (Thermo Scientific, США). Жидкостную хроматографию (LC) проводили на обратно-фазовых колонках с Acclaim РерМар (Dionex, Великобритания) и с Symmetry Cl8 100 Â (Waters, Великобритания). Пептиды, выходящие с колонки, распыляли непосредственно в масс-спектрометр. Данные, полученные с масс-спектрометра, формировали в файл с расширением .raw с помощью программного обеспечения Proteome Discoverer 1.3 (Thermo Scientific, США). Анализ полученных ионных спектров проводили с помощью программы Mascot 2.2.04 (Matrix Science Ltd., США) (Perkins et al., 1999) и базы данных UniProtKB/Swissprot. Конечная обработка данных проводили с помощью программы Scaffold Q+S 3.6.0 (Proteome Software; Searle, 2010). Данные после импорта в программу анализировались X!Tandem (The Global Proteome Machine Organization; Craig, Beavis, 2004).

Результаты и обсуждение.

В исследованиях использовали модель апоптоза в клетках проэритролейкемии человека линии К562. Апоптоз в клетках индуцировали противоопухолевым препаратом ДР, широко применяемым в раковой терапии (Anand et al., 1995). ДР ингибирует топоизомеразу и вызывает двунитевые разрывы ДНК.

Индукцию апоптоза оценивали по изменению морфологии ядер (окрашивание Hoechst 33258), мокну клеосо мной фрагментации ДНК (данные не представлены) и цитофлуориметрически с помощью двойного прижизненного окрашивания клеток Annexin V-FITC и пропидий йодидом (рис. I).

Контрольная популяции клеток К562 содержала около 3% клеток, спонтанно индуцированных к апоптозу (рис. 1, а), в то время как воздействие 4 мкМ ДР на клетки К562 в течение 24 ч приводило к раннему апоптозу 25% клеток; 9% клеток находилось в стадии позднего апоптоза и некроза (рис. 1, б).

A-V( :)/ Pl(-) !.s% 1.5/4

/ф АЛ'< ) Pl(-) A-V<-)/Pl<!) 0.3%

A-Vf-) [■[(-"( 25.4% A-V(f)/}'1(!) 9.24

Jfp AV(.)/Pr(.) 65-2% 0.2?»

промдйй иодид

Рис. I. Цитофлуорометрический анализ клеток К562 до (а) и после воздействия 4 мкМ ДР в течение 24 ч (б) с помощью прижизненного окрашевания клеток Annexin V/FITC (A-V) и пропидий йодидом(Р1). A V(-)/PI(-) -жизнеспособные клетки, A V(+)/Pl(-) -ранний апоптоз, A V(+)/PI(+) — поздний апоптоз/некроз, A V(-)/Pl(+) -некроз.

Представления исследователей о способе появления протеасом во внеклеточном пространстве неоднозначны: выход протеасом, как и любого другого белка, из клеток может быть обусловлен пассивным процессом за счет поврежденных клеток в общей клеточной популяции, а также активным выходом из жизнеспособных клеток. Если допустить, что выход протеасом из клеток обусловлен по большей части поврежденными клетками, то можно ожидать повышения содержания протеасом во внеклеточной среде при запуске клеток в апоптоз. Однако, как уже упоминалось, не было выявлено никакой взаимосвязи между клеточной гибелью и появлением протеасом во внеклеточном пространстве (Sixt et al., 2007). Наблюдалось лишь повышение количества протеасом во внеклеточном пространстве при различных паталогиях (Lavabre-Bertrand et al., 2001; Stoebner et al., 2005; Sixt et al., 2007, 2009; Albright et al., 2009 Henry et al., 2009). Мы, употребляя термин «нормальные клетки и индуцированные к апоптозу», отдаем себе отчет в том, что используем в качестве модельной клеточной линии линию трансформированных клеток. Чтобы понять, является ли выход протеасом во внеклеточное пространство особенностью трансформированных клеток, мы попытались оценить количественно уровень протеасом, секретированных за одинаковое время одинаковым количеством трансформированных и нетрансформированных клеток линий К562 и ДМЕ/Р12

(мезенхимные клетки человека), соответственно. Оказалось, что секреция протеасом клетками во внеклеточное пространство - процесс, по всей видимости, постоянный и характерный как для трансформированных клеток, так и для нормальных (рис. 2).

Рис. 2. Экскреция протеасом трансформированными и мезенхимными клетками линий К562 и Г) МГУ Г12. Цифрами указаны молекулярные веса белков.

lP-аб we - J33

Согласно литературным данным, при повышении концентрации протеасом во внеклеточном пространстве при патологиях не наблюдалось повышения их удельной активности (Sixt et al., 2007, 2009; Albright et al., 2009). Однако нет данных о сравнении активности между внеклеточными протеасомами и внутриклеточными. Наши ранние эксперименты показали, что секретируемые клетками А431 протеасомы активнее цитоплазматических частиц по типу химотрипсина (Куличкова и др., 2004). Мы провели сравнительный анализ пептидазных активностей всех трех типов (химотрипсин-, трипсин- и каспаза-подобные типы) внеклеточных протеасом, секретируемых клетками К562 (Зайкова и др., 2011). Все три специфических для протеасом флуорогенных субстрата гидролизуются внеклеточными протеасомами (рис. 3). Кроме того, все три пептидазные активности внеклеточных протеасом ингибируются с помощью MG132, специфичным обратимым пептидным ингибитором протеасом (Rock et al., 1994).

Интересно, что в клетках К562 химотрипсин- и каспаза-подобные типы пептидазной активности вне- и внутриклеточных протеасом одинаковы при равной концентрации белка, при том что активность по типу трипсина снижается при выходе протеасом из клеток.

Z 20 7

I 7

Рис. 3. Влияние выхода протеасом из клеток в среду культивирования на их пептидазные активности. Приведены относительные значения и стандартные отклонения трёх независимых определений флуоресценции освобождённого (7-амино)-4-метилкумарнна.

Концентрация протеасом во всех пробах составляет I мкг. 1--

химотрипсин-подобный тип пептидазной активности протеасом; 2 —

LJ-Протеасомы среда И-Нротеасомы среда - MGÍ32 О-Прогваеемы цш ошшаш

трипсин-подобный тип пептидазной активности протеасом; 3 каспаза-подобный тип пептидазной активности протеасом.

Рис. 4. Влияние индуктора апоптоза на пептидазные активности протеасом из цитоплазмы клеток К562 и среды культивирования клеток. Приведены относительные значения и стандартные отклонения трёх независимых определений флуоресценции освобождённого (7-амино)-4-метилкумарина.

Концентрация протеасом во всех пробах составляет 1 мкг. 1 — химотрипсин-подобный тип пептидазной активности протеасом; 2 — трипсин-подобный тип пептидазной активности протеасом; 3 — каспаза-подобный тип пептидазной активности протеасом.

Ранее нами показано ингибирование пептидазных активностей внутриклеточных протеасом при индукции апоптоза в клетках К562 доксорубицином (Цимоха, Ватажок (Зайкова) и др., 2005, Цимоха, Куличкова, Евтеева, Ватажок (Зайкова) и др., 2006). Мы сравнили активности вне- и внутриклеточных протеасом при действии на клетки К562 ДР (рис. 4). Оказалось, что если после индукции апоптоза в клетках происходит снижение активности внеклеточных протеасом по типу трипсина и каспазы, аналогичное тому, что происходит с цитоплазматическими протеасомами, то химотрипсин-подобная активность протеасом вне клетки не изменяется при воздействии ДР на клетки.

»1....................................ДР-.............................................6) ДР I

Я м Я © ■■■ ! й^В^И 1 .¿■С.

и) О

я а] И И - - е- . >-V '

—1 М

М 1 # ! 1« |

Гимн««*» С>м» <.>ляД>

Рис. 5. Электрофореграмма 26Б протеасом. выделенных из цитоплазмы клеток К562 (а! и среды культивирования, кондиционорованной клетками (в). При индукции апоптоза в клетках К5Й2 наблюдается модифицирование субъединиц 208 протеасомы из цитоплазмы клеток (б) и среды культивирования (г). Модифицирование субъединиц 205 протеасом при их экскреции из нормальных клеток К562 и клеток при индуцированном в них апоптозе (д). Электрофорез в 12%-ном ПААГ. Вестернблотинг проводили с использованием антител к субъединицам 20Б протеасомы. Цифрами указаны молекулярные веса белков.

Изменения активности протеасом в клетке принято связывать, прежде всего, с различными ПТМ протеасомных белков (Wang et al., 2007; Моисеева и др., 2010). Для анализа изменений в наборе ПТМ субъединиц внеклеточных протеасом мы использовали метод разделения белков в системе двумерного электрофореза с последующим вестернблотингом с применением специфических антител к белкам 20S протеасомы.

На авторадиограммах протеасомных субъединиц, представленных на рис. 5, можно увидеть, что вне- и внутриклеточные протеасомы обладают некоторой гетерогенностью состава, обусловленной наличием различных ПТМ субъединиц 20S протеасомы: большая часть а- и ¡i субъединиц протеасом в той или иной степени модифицированы. Кроме того, вне- и внутриклеточные протеасомы имеют различный паттерн ПТМ (рис. 5, а, в). Интересен тот факт, что изоформы многих субъединиц отличаются по значениям pi, но не молекулярными массами. Важно отметить, что при секреции протеасом клетками К562 изменяется вид и степень модификаций для одной и той же субъединицы (рис. 5, а, в).

Паттерн ПТМ как цитоплазматических, так и внеклеточных протеасом меняется при индукции апоптоза (рис. 5, б, г). По всей вероятности, это объясняется «перепрограммированием» протеасом на протеолиз другого спектра белков при изменении физиологического состояния клеток.

Важно обратить внимание на субъединицы протеасом, ответственные за их пептидазные активности, ассоциированные с тремя субъединицами р-типа: трипсин-подобная осуществляется субъединицей р2, химотрипсин-подобная - Р5, каспаза-подобная - pl. Как видно на рис. 5, д, субъединица pl цитоплазматических протеасом представлена некоторым разнообразием изоформ, в то время как эта субъединица у внеклеточных протеасом имеет лишь одну форму.

Следует отметить тот факт, что активность протеасом в клетке определяется не только активными центрами на р-субъединицах, но и субъединицами а-типа, которые формируют «входное отверстие» в протеолитическую камеру 20S протеасомы и обеспечивают взаимодействие 20S протеасомы с регуляторными комплексами. Кроме того, активность протеасом определяется функционированием регуляторов протеасом (в частности, 19S комплекса) и деятельностью убиквитин-связывающей системы. Вследствие чего различные ПТМ субъединиц протеасом а-типа могут регулировать доступ субстрата в протеолитическую камеру протеасомы и влиять на присоединение регуляторных комплексов, что также определяет протеасомную ферментативную активность. Кроме того, субъединицы al и а5 отвечают за РНК-азную активность протеасом (Petit et al., 1997), субъединица а7 отвечает за белок-белковые взаимодействия при убиквитин-независимом протеолизе (Touitou et al., 2001; Sdek et al., 2005).

Данные, представленные на рис. 5, д, демонстрируют изменения паттерна ПТМ субъединиц а5 и а7 при экскреции протеасом из клеток, равно как и при индукции апоптоза (рис. 5,д).

Вестернблот анализ показывает нам лишь наличие ПТМ белков протеасом, однако мы не можем говорить о том, какие именно модификации мы видим. Поэтому мы использовали ¡ТЯА(3 масс-спектрометрический подход для идентификации ПТМ протеасом.

Табл. I. Пропорции протеасомпых субъединнц в цитоплазме и среде по данным ¡ТЯАО-масс-

спектрометрнн.

Название белка Субкомплекс протеасомы Цитоплазма/среда1

26S protease regulatory subunit 10В (Rpt4) I9S (PA700) регуляторныи комплекс 0.4

26S protease regulatory subunit 4 (Rpt2) 0.5

26S protease regulatory subunit 6A (Rpt5) 0.6

26S protease regulatory subunit 6B (Rpt3) 0.4

26S protease regulatory subunit 7 (Rptl) 0.5

26S protease regulatory subunit 8 (Rpt6) 0.4

26S proteasome non-ATPase regulatory subun t 1 (Rpn2) 0.6

26S proteasome non-ATPase regulatory subun t 10 (Gankyrin) 2.0

26S proteasome non-ATPase regulatory subun t 1 1 (Rpn6) 0.4

26S proteasome non-ATPase regulatory subun t 12(Rpn5) 0.7

26S proteasome non-ATPase reculatory subun t 13(Rpn9) 0.3

26S proteasome non-ATPase regulatory subun t 14 (Rpnl 1) 0.3

26S proteasome non-ATPase reculatory subun t 2(Rpnl) 0.8

26S proteasome non-ATPase regulatory subun t 3(Rpn3) 0.7

26S proteasome non-ATPase regulatory subun t 4 (RpnlO или S5A) 1.1

26S proteasome non-ATPase regulatory subun t 5(SSB) 0.4

26S proteasome non-ATPase reculatory subun t 6 (Rpn7) 0.4

26S proteasome non-ATPase regulatory subun t 7(RpnS) 1.1

26S proteasome non-ATPase regulatory subun t 8(Rpnl2) 0.0

Proteasomal ubiquitin receptor ADRMI (Rpnl3) 0.9

Proteasome activator complex subunit 3 (PA28y) 1 IS (РА28) регуляторныи комплекс -0.3

Proteasome activator complex subunit 4 (PA200) РА200 регуляторный комплекс -1.7

Proteasome subunit alpha type-l (n6) 20S протеасома -1.0

Proteasome subunit alpha tvpe-2 (n21 -1.0

Proteasome subunit alpha type-3 (a7) -1.7

Proteasome subunit alpha type-4 (a3) -1.0

Proteasome subunit alpha type-5 (a5) -0.7

Proteasome subunit alpha type-6 (ctl) -1.3

Proteasome subunit alpha type-7 (a3) -1.7

Proteasome subunit beta type-l (|36) -1.0

Proteasome subunit beta tvpe-2 (|14) -0.7

Proteasome subunit beta type-3 ((13) -1.3

Proteasome subunit beta type-4 ([17) -1.0

Proteasome subunit beta type-5 {(15) -1.0

Proteasome subunit beta type-6 (pi) Proteasome subunit beta type-7 (|!2) -1.7

-0.7

Логарифм (при основании 2) отношения количества белка в препарате цитоплазматическнх протеасом к количеству белка в протеасомах из среды, нормированный относительно количества белка в препаратах протеасом из кондиционированной клетками среды.

iTRAQ масс-спектрометрия - новое крупное достижение в области протеомики. Достоверность результатов и их воспроизводимость iTRAQ-масс-спектрометрии очень хорошие. Кит iTRAQ состоит из двух изобарических (одинаковой массы) амино-реактивных реагентов, которые могут маркировать пептиды в белковом дайджесте и, следовательно, позволяют точно идентифицировать и количественно определить пептиды с помощью тандемной масс-спектрометрии. Общий порядок использования iTRAQ масс-спектрометрии заключается в следующем: белковые пробы расщепляются на пептиды, которые затем дифференциально метятся реагентами iTRAQ, после чего объединяются для сравнительного анализа и подвергаются жидкостной хроматографии с последующей тандемной масс-спектрометрней (Gazzah et al., 2012).

Препараты протеасом, очищенных из цитоплазмы клеток К562 и кондиционированной клетками среды, нормировали методом вестернблотинга при помощи специфических антител к субъединицам протеасом Rpn2 (белок 19S регуляторного комплекса) и 01 (субъединица 20S комплекса). По результатам iTRAQ масс-спектрометрического анализа препаратов внеклеточных протеасом в общей сложности определены 284 белка, из которых 35 -протеасомные белки.

Поскольку iTRAQ масс-спектрометрия - количественный анализ белка, мы можем оценить соотношение между количеством белка в разных препаратах. Данные такого сравнительного анализа протеасомных белков в препаратах протеасом, очищенных из цитоплазмы и кондиционированной клетками среды, представлены в табл. 1.

Интересно, что количество субъединиц 20S протеасомы в среде в 2 раза выше, чем в цитоплазме, однако белков 19S регулятора, напротив, почти в 1.5 раза меньше. Это означает, что в среде популяция протеасом обогащена 20S протеасомами и (или) 19S комплекс заменен на другой протеасомный регулятор, как, например, 11S или РА200 комплексы, что также подтверждается повышенным содержанием этих регуляторов в среде (табл. 1).

Важно отметить, что согласно литературным данным регулятор РА200 локализуется исключительно в клеточном ядре и в комплексе с 20S протеасомой участвует в репарации ДНК (Ustrell et al., 2002).

Результаты масс-спектрометрии впервые показали, что многие субъединицы 20S корового комплекса внеклеточных протеасом подвергаются ацетилированию и убиквитинилированию (табл. 2). Мы идентифицировали несколько сайтов убиквитинилирования на субъединицах а2 (К196), а4 (К189 и К234) и аб (К217) (табл. 2), а также нам удалось обнаружить новый сайт ацетилирования на субъединице Rpn6 (А2). Также убиквитинилирована субъединица 19S регуляторного комплекса Rpn2 (К869).

Согласно результатам ¡TRAQ масс-спектрометрии препараты протеасом не имеют такой ПТМ, как фосфорилирование. Согласно литературным данным (Claverol et al., 2002;Beausoleil et al., 2004; Rush et al., 2005; Wang et al., 2007) и нашим предыдущим исследованиям (Моисеева и др., 2010), многие субъединицы 26S протеасом фосфорилированы. Мы сравнивали уровни фосфорилирования субъединиц вне- и внутриклеточных протеасом с помощью вестернблотинга с применением антител против фосфотреонина и фосфотнрозина (рис. 6).

Табл. 2. Посттрансляционные модификации (ПТМ) протеасомных белков, выявленные с помощью ¡TRAQ масс-

Название белка Альтерн. Название A.K. ПТМ Последовательность пептидов

название гена остаток

26S proteasome non-ATPase Rpn2 PSMDl K869" иь KKEPEPNFQLLDNPAR

regulatory subunit I

26S proteasome non-ATPase Rpn6 PSMDl 1 A2 Ас AAAAVVEFQR

regulatory subunit 11

Proteasome subunit alpha type-l 06 PS MA 1 K208" " ' иь ETLPAEQDLTTK

K2I7 иь VSIGIVGK

Proteasome subunit alpha 1ype-2 «2 PS MA 2 K39 иь LVQIEYALLAAVAGGAPSVGIK

К50а иь AANGVVLATEK

К196 иь YNEDLELEDAIHTAILTLK

Proteasome subunit alpha type-4 a3 PS MA 4 K238" иь EVEQL1K

Proteasome subunit alpha type-5 o5 PSMA5 К187" иь AIGSADEGAQSSLQEVYHK

Proteasome subunit alpha type-6 al PS MA 6 КЗО иь LYQVEYAFK

К164а иь CDPAGYYCGFK

Proteasome subunit alpha type-7 a4 PSMA7 К189 иь NYTDEA1ETDDLTIK

К204а иь ALLEVVQSGGK

К234 иь YVAEIEK

Proteasome subunit beta type-l (S6 PSMB1 К228" иь ICIVTK

Proteasome subunit beta type-2 Р-» PS MB 2 К29"'" иь VAASNIVQMK

Proteasome subunit beta tvpe-3 P3 PSMB3 K4I" иь FGIQAQMVTTDFQK

Proteasome subunit beta type-6 PI PSMB6 К230а иь QVLLGDQIPK

Proteasome subunit beta tvpe-7 P2 PSMB7 К72и иь ATEGMVVADK

указано положение аминокислотного остатка, несущего выявленную модификацию. Ub - убиквитинилирование, Ас - ацетилирование. Клетки линий, в которых обнаружены данные сайты убиквитинилирования: " НЕК293Т и HCTI16 (Kim et al., 2011 ), " HEK293T (Wagner et al., 2011)," HeLa (Meierhofer et al., 2008) и ' К562 (Моисеева и др 20106).

Оказалось, что при выходе протеасом из клеток происходит количественное снижение степени фосфорилирования по аминокислотам треонину и тирозину. После воздействия на клетки К562 индуктора апоптоза ДР наблюдается количественное снижение степени фосфорилирования по треонину и тирозину цитоплазматических протеасом. Степень фосфорилирования внеклеточных протеасом после индукции апоптоза по треонину снижается. Однако в случае тирозина наблюдается количественное увеличение степени фосфорилирования внеклеточных протеасом.

Участие протеасом в регулируемом протеолизе не является их единственной функцией в клетке. Согласно литературным данным, протеасомы могут связывать и переносить к «месту интереса» различные регуляторные молекулы (Scanlon et al., 2009; Tai et al., 2010; Fedorova et al.,

2011). Так, с протеасомами ассоциируются различные ругуляторные белки: шапероны, транскрипционные факторы и, согласно исследованиям наших коллег, белки, участвующие в сплайсинге (Реёогоуа ег а!.. 2011). По результатам масс-спектрометрического анализа были выявлены белки, ассоциированные с протеасомами. Мы сгруппировали белки, взаимодействующие с внеклеточными протеасомами, в соответствии с их функциями в клетке согласно базе данных ишРго!, и оказалось, что помимо ассоциированных с протеасомами белков УПС мы наблюдаем белки, участвующие в регуляции транскрипции и репликации, в ответе на повреждения ДНК, в сплайсинге и процессинге РНК, в трансляции, передаче сигнала и транспорте (табл. 3). Кроме того, часть ассоциированных с протеасомами белков - это шапероны, белки цитоскелета и белки, участвующие в клеточном метаболизме. Основные сформированные нами группы взаимодействующих белков состоят из белков, участвующих в метаболизме (21%), трансляции (15%), транскрипции и репликации (11%), сплайсинге и процессинге РНК (11%), а также в передаче сигнала и транспорте (1 1%).

7|фОЗМ| ТрСОННК

I : 1 I •> *

* í Рис. 6. При выходе из клеток изменяется статус фосфорилирования

láE f ^^ субъединиц протеасом. Дорожки 1 - протеасомы. очищенные из

■ " цитоплазмы клеток К562; 2 — протеасомы, очищенные из

* ♦ кондиционированной клетками К562 среды; 3 - протеасомы,

'' i ' очищенные из цитоплазмы апоптотических клеток К562; 4 -

протеасомы. очищенные из кондиционированной апоптотическими клетками К562 среды. Цифрами указаны молекулярные веса белков.

:: : у: 5

Для нас не стал сюрпризом тот факт, что в числе взаимодействующих с протеасомами белков присутствует большое количество белков, участвующих в клеточном метаболизме, поскольку, согласно ранним данным наших коллег по связыванию in vitro белков с протеасомной субъединицей PSMA3 (al), эта группа белков также была внушительной (Fedorova et al., 2011). Кроме того, при изучении белков, взаимодействующих с протеасомами дрожжей (Guerrero et al., 2006) и крыс (Besehe et al., 2009), также были обнаружены белки этой функциональной группы. Однако в силу недостатка данных мы не можем ответить на вопрос, являются ли эти белки регуляторами или они предназначены для деградации протеасомами.

Факт идентификации в числе белков, ассоциированных с протеасомами, шаперонов и белков цитоскелета также не противоречит литературным данным (Goldberg, 2003; Besehe et al., 2009; Scanion et al., 2009; Tai et al., 2010; Fedorova et al., 2011). Однако это можно также объяснить контаминацией в процессе выделения и очистки наших протеасом с белками цитоскелета и миофибриллярными белками в силу повышенного содержания их в клетке.

Шапероны, как полагают, обеспечивают правильную сборку самих протеасом (Цимоха, 2010) и облегчают взаимодействие белков-мишеней с протеасомами (Goldberg, 2003).

Интересен тот факт, что мы видим в числе наших групп белки, участвующие в сплайсинге и процессинге РНК (табл. 3). В нашем раннем исследовании белков, связывающихся in vitro с протеасомной субъединицей PSMA3 (а7), мы также обнаружили белки этой группы (Fedorova et al., 2011). Более того, нашими коллегами было показано участие протеасом в альтернативном сплайсинге in vitro (Fedorova et al., 2011).

абл. 3. Распределение белков, ассоциированных с протеасомами. по функциональным группам

Группа белков % белков в общем количестве Название белков

Метаболизм 21 Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase, Neutral alpha-glucosidase AB, Fatty acid synthase, Thioredoxin

Передача сигнала п транспорт 11 Vacuolar protein sorting-associated protein 35, Exportin-1, Dynactin subunit 1, Importin-5 и др.

Белки, участвующие в репарации ДНК и в ответе на повреждения ДНК 6 X-ray repair cross-complementing protein 5, DNA damage-binding protein 1, Nucleophosmin, Stress-induced-phosphoprotein 1 и др.

Сплайсинг и процессинг РНК 11 Splicing factor ЗА subunit 1, hn RNP A2/BI, hnRNP L, hnRNP F/H Spliceosome RNA helicase BATI и др.

Транскрипция, репликация 11 DNA replication licensing factor MCM2, Transcription intermediary factor 1-beta, Histone-binding protein RBBP4, Histone deacetylase 2 и др.

Трансляция 15 Elongation factor 1-alpha 1, Histidyl-tRNA synthetase, cytoplasmic, Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B, 40S ribosomal protein SA и др.

УПС 9 Ubiquitin-like modifier-activating enzyme 1, E3 ubiquitin-protein ligase CHIP, uitin-like modifier-activating enzyme 6. Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 14 и др.

Цитоскелет и миофибрилярные белки 7 Tubulin alpha-IB chain, Actin, cytoplasmic 1, Alpha-actinin-4, Filamin-A Tropomyosin alpha-3 chain и др.

Шапероны 9 Heat shock 70 kDa protein 4, Heat shock protein HSP 90-alpha. Endoplasmic Heat shock protein 105 и ri

В литературе также встречаются данные о взаимодействии с протеасомами белков, участвующих в транскрипции, трансляции или репарации ДНК (Besche et al., 2010; Tai et al., 2010). Авторы предполагают регуляторное значение данных белков, однако не отрицают вероятность того, что ассоциация этих белков с протеасомами объясняется их последующей деградацией протеасомами.

Несмотря на высокую достоверность используемого нами метода ¡TRAQ масс-спектрометрии, мы подтвердили полученные результаты вестернблотингом с использованием специфических антител к выбранным нами случайным образом белкам (рис. 6). Мы использовали антитела к белкам цитоскелета Myosin-9, Alpha-actinin-4, Tubulin alpha, Tropomyosin alplia-3, протеасомным белкам Rpn7, a5 и белкам hnRNP L, hnRNP F/H, участникам сплайсинга. Мы сравнивали белки, ассоциированные с протеасомами, очищенными из среды и цитоплазмы. Как оказалось, все белки, которые мы анализировали вестернблотингом,

взаимодействуют с протеасомами. Интересен тот факт, что с протеасомами из среды ассоциируются больше такие белки, как Tubulin alpha, hnRNP 11 и Tropomyosin alpha-З, в то время как в цитоплазме с протеасомами взаимодействуют Filamin-A и Myosin-9. Мы обратили внимание на тот факт, что Tubulin alpha в цитоплазме представлен двумя изоформами (рис. 6), что может быть обусловлено протеолизом белка протеасомами.

Рис. 7. Иммунохимический анализ ассоциированных с протеасомами белков.

Электрофорез в 12%-ном ПААГ. Иммуноблотннг с применением антител к myosin-9, alpha-actinin-4, hn RNP L. hnRNP F/H, tubulin alpha, tropomyosin alpha-3 и двум протеасомным белкам Rpn 7 и а5. Цифрами указаны молекулярные веса белков.

По результатам вышеизложенного можно сделать заключение, что внутри- и внеклеточные протеасомы имеют различные наборы ПТМ. Кроме того, внеклеточная популяция протеасом содержит регуляторный комплекс РА200, который, согласно литературным данным, локализуется лишь в клеточном ядре. Однако в сравнении с цитоплазматическими протеасомами внеклеточная популяция протеасом обеднена 19Б регуляторными комплексами. Пептидазные активности внеклеточных протеасом отличаются от таковых у цитоплазматических частиц. Выявлены новые сайты убиквитннилирования внеклеточных протеасом. Определены белки, взаимодействующие с внеклеточными протеасомами.

Выводы.

1. При выходе протеасом из клеток во внеклеточное пространство происходит изменение паттерна ПТМ их субъединиц.

2. Вне- и внутриклеточные протеасомы отличаются по пептидазным активностям: внеклеточные протеасомы менее активны по типу трипсина, чем цитоплазматические комплексы.

3. В составе внеклеточных протеасом присутствует регулятор РА200, участвующий в репарации ДНК, количество 195 регуляторных комплексов в сравнении с внутриклеточной популяцией заметно меньше.

4. Воздействие на клетки К562 индуктора апоптоза ДР вызывает специфические изменения паттерна ПТМ субъединиц внеклеточных протеасом, а также приводит к снижению

трипсин- и каспаза-подобных типов пептидазной активности внеклеточных протеасом и не изменяет химотрипсиновую активность.

5. Выявлены новые сайты убиквитинилирования и ацитилирования субъединиц протеасом а2 (К196), а4 (К189 и К234), «6 (К217) и Rpnl 1 (А2).

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Ю.Я. Зайкова, В.А. Куличкова, Ю.Б. Ермолаева, JI.H. Гаузе, A.C. Цимоха. «Сравнительный анализ вне- и внутриклеточных протеасом клеток человека линии К562». // Цитология. 2011. 53(6): 459-465.

2. В.А. Куличкова, Ю.Я. Ватажок (Зайкова), A.C. Цимоха, И.В. Кожухарова, Ю.Б. Ермолаева, H.H. Евтеева, А.Г. Миттенберг, J1.H. Гаузе, И.М. Константинова. // «Экзогенные 26S протеасомы могут входить в живые клетки и влиять на экспрессию генов в клетках-реципиентах». // ДАН. 2008. 423(6): 832-836.

3. A.C. Цимоха, Ю.Я. Ватажок (Зайкова), В.А. Куличкова, А.Г. Миттенберг, И.М. Константинова. // Изменения состава и протеолитической активности протеасом при апоптозе клеток К562.. Весци Нацыянальнай акадэми навук Беларуси.Серыя медыцынских навук. 2008, 1:112 - 118.

4. A.C. Цимоха, А.Г. Миттенберг, В.А. Куличкова, Ю.Я. Ватажок (Зайкова), Т.Н. Моисеева, H.H. Евтеева, Ю.Б. Ермолаева, J1.II. Гаузе, И.М. Константинова. // Перепрограммирование ядерных протеасом при индукции апоптоза в клетках К562». I. Воздействие глутатион-истощающего агента диэтилмалеата. // Цитология. 49(6), 2007' 451 -459.

5. A.C. Цимоха, А.Г. Миттенберг, В.А. Куличкова, И.Н. Евтеева, Ю.Я. Ватажок (Зайкова), Т.Н. Моисеева, Ю.Б. Ермолаева, Е.С. Вашукова, И.В. Волкова, И.В. Кожухарова, Л.Н. Гаузе, И.М. Константинова // Специфичность изменений в протеасомах клеток К562 при апоптозе, индуцированном дпэтилмалеато».// Цитология. 48(2), 2006: 133 141.

6. A.C.Цимоха, Ю.Я.Ватажок (Зайкова), Е.С.Вашукова, В.А.Куличкова, И.В.Волкова, Ю.Б.Ермолаева, А.Г.Миттенберг, И.Н.Евтеева, В.А.Иванов, Л.Н.Гаузе, И.М.Константинова Статус фосфорилирования протеасом и альфа-РНП частиц из клеток печени крысы. // Цитология. 2005. 47(6):436-441.

7. Ю.Я. Зайкова, Е.В. Карпова, H.A. Барлев, В.А. Куличкова, A.C. Цимоха. // «Анализ ассоциированных с протеасомами микро-РНК». // Тезисы докладов и сообщений III конференции Общества клеточной биологии. Санкт-Петербург, 16-18 октября 2012. Цитология, 54(9), 2012.

8. A.C. Цимоха, Ю.Я. Зайкова, H.A. Барлев. // «Протеомный анализ вне- и внутриклеточных протеасом при генотоксическом стрессе в клетках К562». // Тезисы докладов и сообщений III конференции Общества клеточной биологии. Санкт-Петербург, 16-18 октября 2012. Цитология, 54(9), 2012.

9. Ю.Я. Зайкова, В.А. Куличкова, A.C. Цимоха. // «Изменения посттрансляционных модификаций и активности внеклеточных протеасом при индукции апоптоза». // Тезисы докладов и сообщений III конференции молодых учёных Института цитологии РАН. Санкт-Петербург, 15 - 16 мая 2012. Цитология, 54(4), 2012.

10. Ю.Я. Зайкова, H.A. Барлев, В.А. Куличкова, А. С. Цимоха. // «Возможное участие в межклеточной коммуникации онкросупрессорных микро-РНК, ассоциированных с протеасомами». // Конференция по фундоментальной онкологии Петровские чтения -2012. Сборник тезисов. Санкт-Петербург, 20 апреля 2012, с. 67 - 69.

11. Ю.Я. Зайкова, A.C. Цимоха. // «Сравнительный анализ вне- и внутриклеточных протеасом по их пептидазным активностям». XXIV Зимняя молодёжная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Тезисы докладов и сообщений, Москва, 7-9 февраля, 2012, с. 7.

12. Ю.Я. Зайкова, А.С. Цимоха, В.А. Куличкова. // «Процесс импорта и экспорта протеасом в нормальных и трансформированных клетках». // Вопросы онкология. Санкт-Петербург, 16 апреля 2010. 56(56): 20.

13. Ю.Я. Зайкова. // «Структурно-функциональный анализ протеасом секретируемых в культуральную среду». // Четырнадцатая Санкт-Петербургская ассамблея молодых учёных и специалистов. Санкт-Петербург. 11 декабря 2009: с. 66.

14. Ю.Я. Ватажок (Зайкова). // «Роль секреции протеасом в межклеточных взаимодействиях при апоптозе неопластических клеток К562». // Тринадцатая Санкт-Петербургская ассамблея молодых учёных и специалистов. Санкт-Петербург. 2008. с. 31.

15. Ю.Я. Ватажок (Зайкова), И. В. Кожухарова, А. С. Цимоха, В. А Куличкова // Участие протеасом в программированной гибели раковых клеток. // IV Российская конференция по фундаментальной онкологии. Вопросы онкологии, 2(54), 2008.

16. В.А. Куличкова, А.С. Цимоха, А.Г. Миттенберг, Ю.Я. Ватажок (Зайкова), И.Н. Евтеева, Ю.Б. Ермолаева, И.М. Константинова. // Малые Alu-PHK ассоциированы с протеасомами. // II съезд Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия, 16-19 октября. 2007, Цитология, 2007,49(9).

17. А.С. Цимоха, Ю.Я. Ватажок (Зайкова), В.А. Куличкова, И.М. Константинова // Регуляция состава и протеолитической активности протеасом при апоптозе клеток К562. // Тезисы докладов и сообщений, представленных на Международной конференции «Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки», Минск, Беларусь, 25-26 октября.

18. А.С. Цимоха, В.А. Куличкова, И.В. Кожухарова, А.Г. Миттенберг, Ю.Я. Ватажок (Зайкова), Т.Н. Моисеева, Ю.Б. Ермолаева, И.Н. Евтеева, JI.H. Гаузе, И.М. Константинова. // Протеасомы и апоптоз клеток линии К562 проэритролейкемии человека. // III Российская конференция по фундаментальной онкологии, Санкт-Петербург, 20 апреля, 2007 Вопросы онкологии, 1(53), 2007.

19. Ю.Я. Ватажок (Зайкова), В.А. Куличкова, А.С. Цимоха, И.М. Константинова. // Влияние индукции апоптоза в клетках проэритролейкемии человека линии К562 на структуру и активности протеасом // Тезисы докладов и сообщений, представленных на 11-ой международной путинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века», Пущино, Россия, 29 октября - 2 ноября, 2007.

20. J.J. Vatazhok (Zaykova), V.A. Kulichkova, A.S. Tsimokha, I.M. Konstantinova. // Influence of exogenouse proteasomes on gene expression in K562 cells. // Abstracts of The International Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, Kyiv, Ukraine, 20-22 September, 2007.

21. A.S. Tsimokha, A.G. Mittenberg, V.A. Kulichkova, J.J. Vatazhok (Zaykova)a T.N. Moiseeva, I.M. Konstantinova // Changes in composition and enzymatic activities of proteasomes undergoing apoptosis in K562 cells. // Abstract of The International Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, Kyiv, Ukraine, 20-22 September, 2007.

22. Ю.Я. Ватажок (Зайкова), А.С. Цимоха, В.А. Куличкова // «Изменение субъединичного состава и ферментативных активностей протеасом при апоптозе клеток К562». // Молодые учёные - промышленности северо-западного региона. Материалы конференций политехнического симпозиума 2007г. Санкт-Петербург. 6 декабря 2007: с. 130-131.

23. Ю.Я. Ватажок (Зайкова), А.С. Цимоха // Специфичность изменений 26S протеасом клеток К562 при апоптозе, индуцированном глутатион-истощающим агентом диэтилмалеатом. // Всероссийская межвузовская научно-техническая конференция студентов и аспирантов «XXXV Неделя науки СПбГПУ», Санкт-Петербург, 20 - 25 ноября, 2006 г. Материалы конференции, Часть IV

24. Ю. Я. Ватажок (Зайкова), Е. С. Вашукова // Перепрограммирование протеасом при индукции апоптоза доксорубицином. // Политехнический симпозиум «Молодые учёные-

промышленности северо-западного региона», Санкт-Петербург, 2006 г. Материалы конференции.

25. Ю. Я. Ватажок (Зайкова), Константинова И.М. // Специфичность изменений в протеасомах из клеток К562 при индукции апоптоза диэтилмалеатом. // 10-я Пущинская школа-конференция молодых учёных. Пущино, 17-21 апреля 2006г. Сборник тезисов.

26. Ю. Я. Ватажок (Зайкова), Цимоха А.С. // Изменения в субъединичном составе и статусе фосфорилирования ядерных и цитоплазматпческих протеасом клеток К562 при диэтнлмалеат-индуцированном апоптозе. // Всероссийская межвузовская научно-техническая конференция студентов и аспирантов «XXXIV Неделя науки СПбГПУ», Санкт-Петербург, 28 ноября - 3 декабря 2005 г. Материалы конференции, Часть IV.

Список цитируемой литературы.

1. Зайкова Ю.Я., Куличкова В.А., Ермолаева Ю.Б., Гаузе Л.Н., Цимоха А.С. 2011. Сравнительный анализ вне- и внутриклеточных протеасом клеток человека линии К562. Цитология. 53 (6): 459-465. 2. Константинова И.М., Петухова О.А., Куличкова В.А., Туроверова Л.В., Волкова И.В., Ермолаева Ю.Б., Илькаева О.Р., Кожухарова И.В., Ермолаева Ю.Б. 1995. Молекулярная биология. 29 (5): 761-771. З.Кулнчкова В.А., Митгенберг А.Г., Ермолаева Ю.Б., Цимоха А.С., Волкова И.В., Евтеева И.Н., Кожухарова И. В., Гаузе Л.Н., Константинова И.М. 2004. Специфичность популяции протеасом, экскретируемых из клеток в культуральную среду. ДАН. 399 (5) : 503--506. 4. Моисеева Т.Н., Митгенберг А.Г., Барлев Н.А. 2010а. Протеасомы и их роль в регуляции транскрипции. Цитология. 52 (3): 195--203. 5. Моисеева Т.Н., Фёдорова О.А., Цимоха А.С., Митгенберг А.Г., Барлев Н.А. 20106. Влияние убиквитинилирования на пептндазные активности протеасом при генотоксическом стрессе. ДАН. 435 (2): 267-271. 6. Цимоха А.С., Куличкова В.А., Евтеева И.Н., Ватажок Ю.Я., Моисеева Т.Н., Ермолаева Ю.Б., Вашукова Е.С., Гаузе Л.Н., Константинова И.М. Специфичность изменений в протеасомах клеток К562 при апоптозе, индуцированном диэтилмалеатом // Цитология. 2006. 48 (2): 133-141. 7. Цимоха А.С., Ватажок Ю.Я., Вашукова Е.С., Куличкова В.А., Волкова И.В., Ермолаева Ю.Б., Миттенберг А.Г., Евтеева И.Н., Иванов В.А., Гаузе Л.Н., Константинова И.М. Статус фосфорилирования протеасом и альфа-РНП частиц из клеток печени крысы. // Цитология. 2005. 47(6):436-441. 8. Цимоха А.С. 2010. Протеасомы: участие в клеточных процессах. Цитология. 52 (4): 277-300. 9. Albright J.M., Romero J., Saini V., Sixt S.U., Bird M.D., Kovacs E.J., Gamelli R.L., Peters J., Majetschak M. 2009. Proteasomes in human bronchoalveolar lavage fluid after burn and inhalation injury. J. Burn. Care Res. 30 : 948—956. 10. Anand S., Verma H., Kumar L„ Singh N. 1995. Cancer Lett. 88:101-105. 11. Barret A.J. 1980. Biochem. J. 187: 909-912. 12. Besche H.C., Haas W., Gygi S.P., Goldberg A.L. 2009. Isolation of mammalian 26S proteasomes and p97/VCP complexes using the ubiquitin-like domain from HHR23B reveals novel proteasome-associated proteins. Biochemistry. 48 : 2538-2549. 13. Bradford M.M. 1976. Anal Biochem. 72:248-254. 14. Craig R., Beavis R. C. 2004. TANDEM: matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 : 1466-1467. 15. Claverol S., Burlet-Schiltz O., Girbal-Neuhauser E„ Gairin J.E., Monsarrat B. 2002. Mapping and structural dissection of human 20 S proteasome using proteomic approaches. Mol. Cell. Proteomics. 1: 567—578. 16. Drexler H.C.A. 1998. Programmed cell death and the proteasome. Apoptosis. 3 : 1—7. 17. Fedorova O.A., Moiseeva T.N., Nikiforov A.A., Tsimokha A.S., Livinskaya V.A., Hodson M., Bottrill A., Evteeva I.N., Ermolayeva J.B., Kuznetzova I.M., Turoverov K.K., Eperon I., Barlev N.A. 2011. Proteomic analysis of the 20S proteasome (PSMA3 (-interacting proteins reveals a functional link between the proteasome and niRNA metabolism. Biochem. Biophys. Res. Commun. 4I6(3-4):258-65. 18. Gazzah A.C., Camoin L., Abid S., Bacha II., Ladjimi M. 2012. iTRAQ: a method to elucidate cellular responses to mycotoxin zearalenone. J. Appl Toxicol, doi: 10.1002/jat. 1766. 19. Goldberg A.L. 2003. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426 : 895-899. 20. Guerrero C„ Tagwerker C., Kaiser P., Huang L. 2006. An integrated mass spectrometry-based proteomic approach: Quantita- tive analysis of tandem affinity-purified in vivo cross-linked protein complexes (qtax) to decipher the 26 S proteasome-interacting network. Mol. Cell. Proteomics. 5: 366378. 21. Henry L., Lavabre-Bertrand Т., Vercambre L., Ramos J., Carillo S., Guiraud I., Pouderoux P., Bismuth M., Valats J.C., Demattei C., Duny Y., Chaze I., Funakoshi N., Bureau J.P., Daures J.P., Blanc P. 2009. Plasma proteasome level is a reliable early marker of malignant transformation of liver cirrhosis. Gut. 58 : 833—838. 22. Herrmann J., Ciechanover A., Lerman O., Lerman A. 2004. The ubiquitin-proteasome system in cardiovascular diseases - a hypothesis extended. Cardiovascular Res. 61: 11-12. 23. Hough R., Pratt G„ Rechsteiner M. 1987. J. Biol. Chem.262: 8303-8313. 24. Kim W.,

Bennett E.J., Huttlin E.L., Guo A., Li J., Possemato A., Sowa M.E., Rad R., Rush J., Comb M.J., Harper J.W., Gygi S.P. 2011. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Mol. Cell. 44 : 325--340. 25. Konstantinova I.M., Tsimokha A.S., Mittenberg A.G. 2008. Role of proteasomes in cellular regulation, int. Rev. Cell. Mol. Biol. 267 : 59-124. 26. Laemmli U.K. 1970. Nature. 227: 680-685. 27. Lavabre-Bertrand T., Henry L„ Carillo S„ Guiraud I., Ouali A., Dutaud D., Aubry L., Rossi J.F., Bureau J.P. 2001. Plasma proteasome level is a potential marker in patients with solid tumors and hemopoietic malignancies. Cancer. 92 : 2493—2500. 28. Lozzio C.B., and Lozzio B.B. Human chronic myelogenous leukemia cell-line with positive Philadelphia chromosome // 1975. Blood (45): 321-334. 29. Meierhofer D., Wang X., Huang L„ Kaiser P. 2008. Quantitative analysis of global ubiquitination in HeLa cells by mass spectrometry. J Proteome Res. 7 : 4566-4576. 30. Naujokat C., Hoffmann S. 2002. Role and function of the 26S proteasome in proliferation and apoptosis. Lab. Invest. 82 : 965—980. 31. Perkins D.N., Pappin D.J.C., Creasy D.M., Cottrell J.S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data // Electrophoresis. 1999. 20:3551-3567. 32. Petit F„ Jarrousse A.-S., Dahlmann B., Sobek A., Hendil K. B., Bury J., Briand Y., Schmid H.-P. 1997. Involvement of proteasomal subunits zeta and iota in RNA degradation. Biocliem. J. 326: 93—98. 33. Rock K.L., Gramm C., Rothstein L., Clark K.., Stein R., Dick L., Hwang D., Goldberg A.L. 1994. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell. 78 : 761—771.34. Searle B.C. 2010. Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based proteomic studies. Proteomics. 10 : 1265-1269. 35. Scanlon T.C., Gottlieb B., Durcan T.M., Fon E.A., Beitel L.K., Trifiro M.A. 2009. Isolation of human proteasomes and putative proteasome-interacting proteins using a novel affinity chromatography method. Exp. Cell Res. 315(2): 176-189. 36. Sixt S.U., Adamzik M., Spyrka D., Saul B„ Hakenbeck J., Wohlschlaeger J., Costabel U., Kloss A., Giesebrecht J., Dahlmann B., Peters J. 2009. Alveolar extracellular 20S proteasome in patients with acute respiratory distress syndrome. Am J Respir. Crit. Care Med. 179: 1098—1106. 37. Sixt S.U., Beiderlinden M., Jennissen H.P., Peters J. 2007. Extracellular proteasome in the human alveolar space: a new housekeeping enzyme? Amer. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 292 : L1280—L1288. : L1280—L1288. 38. Sixt S.U., Dahlmann B. 2008. Extracellular, circulating proteasomes and ubiquitin—incidence and relevance. Biochim. Biophys. Acta. 1782 : 817—823. 39. Sixt S.U., Peters J. 2010. Extracellular alveolar proteasome: possible role in lung injury and repair. Proc. Amer. Thorac. Soc. 7 : 91—96. 40. Stoebner P.E., Lavabre-Bertrand T„ Henry L., Guiraud I., Carillo S„ Dandurand M., Joujoux J.M., Bureau J.P., Meunier L. 2005. High plasma proteasome levels are detected in patients with metastatic malignant melanoma. Br. J. Dermatol. 152 : 948— 953. 41. Stoebner P.E., Lavabre-Bertrand T., Henry L., Guiraud I., Carillo S., Dandurand M., Joujoux J.M., Bureau J.P., Meunier L. 2005. High plasma proteasome levels are detected in patients with metastatic malignant melanoma. Br. J. Dermatol. 152 : 948— 953. 42. Tai H.C., Besclie H., Goldberg A.L., Schuman E.M. 2010. Characterization of the brain 26s proteasome and its interacting proteins. Front. Mol. Neurosci. 3 : pii: 12. 43. Touitou R., Richardson J., Bose S., Nakanishi M„ Rivett J., Allday M.J. 2001. A degradation signal located in the C-terminus of p21 ^ AKI CIi>i js a binding site for the C8 alphasubunit of the 20S proteasome. EMBO J. 20 : 2367-2375. 44. Ustrell V., Hoffman L., Pratt G., Rechsteiner M. 2002. PA200, a nuclear proteasome activator involved in DNA repair// EMBO J. 21(13): 3516-3525. 45. Wagner S.A., Beli P., Weinert B.T., Nielsen M.L., Cox J., Mann M., Choudhary C. 2011. A proteome-wide, quantitative survey of in vivo ubiquitylation sites reveals widespread regulatory roles. Mol. Cell Proteomics. 10 : Ml 11.013284. 46. Wang X., Chen C„ Baker P.R., Chen P., Kaiser P., Huang L. 2007. Mass spectrometric characterization of the affinity-purified human 26S proteasome complex. Biochemistry. 46 : 3553—3565 47. Wojcik C. 2002. Regulation of apoptosis by the ubiquitin and proteasome pathway. J. Cell Mol. Med. 6 : 25—48. 48. Zoeger A., Blau M., Egerer K., Feist E., Dahlmann B. 2006. Circulating proteasomes are functional and have a subtype pattern distinct from 20S proteasomes in major blood cells. Clin. Chern. 52 : 2079-2086.

Подписано в печать 25.10.2012. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 9884Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812) 550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зайкова, Юлия Яковлевна

Глава 1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цели и задачи исследования.

1.3. Основные положения, выносимые на защиту.

1.4. Научная новизна.

1.5. Теоретическое и практическое значение работы.

1.6. Апробация работы.

1.7. Личный вклад диссертанта.

1.8. Финансовая поддержка.

1.9. Объём и структура диссертации.

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Протеасомы.

2.1.1. Структура.

2.1.3. Сборка 208 протеасомы.

2.1.4. Регуляторные комплексы протеасом.

2.1.5. Локализация протеасом.

2.1.6. Убиквитин-протеасомная система деградации белка.

2.1.6.1. Убиквитин-зависимый протеолиз.

2.1.6.2. Убиквитин-независимый протеолиз.

2.1.7. Участие протеасом во внутриклеточных процессах.

2.1.8. Посттрансляционные модификации протеасом.

2.1.9. Белки, ассоциированные с протеасомой.

2.1.10. Протеасомы и апоптоз.

2.1.10.1. Применение ингибиторов протеасом в раковой терапии.

2.2. Внеклеточные протеасомы.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Культивирование клеток.

3.2. Оценка индукции апоптоза в клетках К562.

3.2.1. Проточная цитофлуориметрия.

3.2.2. Флуоресцентная окраска хроматина.

3.2.3. Анализ фрагментации клеточной ДНК.

3.3. Выделение протеасом из клеток К562.

3.3.1. Выделение протеасом из цитоплазмы клеток К562.

3.3.2. Выделение протеасом из среды культивирования клеток К562.

3.4. Флуориметрическое измерение протеолитической активности протеасом.

3.5. Фракционирование протеасом на белковые субъединицы.

3.5.1. Одномерный электрофорез.

3.5.2. Двумерный электрофорез белков.

3.5.2.1. Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ).

3.6. Иммунопреципитация.

3.7. Вестернблотинг.

3.7.1. Полусухой перенос белков с геля на мембрану.

3.7.2. Связывание белков с антителами.

3.8.1ТИА(3 масс-спектрометрия.

3.9. Материалы.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Модель исследования.

4.2. Подбор оптимальных условий для индукции апоптоза в клетках К562.

4.3. Протеасомы в кондиционированной клетками среде.

4.4 Выделение и очистка препаратов протеасом из клеток К562 и среды культивирования.

4.5. Проблема присутствия сывороточных белков в препаратах внеклеточных протеасом.

4.6. Изменение протеолитической активности протеасом.

4.6.1. Изменение протеолитической активности протеасом при их выходе из клеток К562.

4.6.2. Изменение протеолитической активности внеклеточных и внутриклеточных протеасом после индукции апоптоза доксорубицином.

4.7. Изменение субъединичного состава вне- и внутриклеточных протеасом.

4.8 Масс-спектрометрический анализ препаратов протеасом.

4.9 Фосфорилирование субъединиц протеасом.

4.10 Белки ассоциированные с протеасомами.

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1. Внеклеточные протеасомы.

5.2. Пептидазные активности внеклеточных протеасом.

5.3. Посттрансляционные модификации субъединиц внеклеточных протеасом.

5.4. Масс-спектрометрический анализ препаратов протеасом.

5.5. Фосфорилирование внеклеточных протеасом.

5.6. Белки, ассоциированные с внеклеточными протеасомами.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика внеклеточных протеасом при апоптозе клеток К562"

1.1. Актуальность проблемы

Апоптоз — генетически запрограммированная гибель клеток, которая приводит к "аккуратной" разборке повреждённых клеток и их удалению. Очень важно, что при апоптотической гибели клетки не развивается воспалительный процесс. Зачастую возникновение и развитие опухоли связано с нарушением в работе апоптотической системы, поэтому индукцию апоптоза используют как один из подходов в терапии канцерогенеза и ряда других заболеваний.

Согласно современным представлениям, протеасомы в клетке вездесущи: они находятся и в ядре, и в цитоплазме клеток. В последнее годы исследований протеасом в литературе появились данные об их присутствии во внеклеточном пространстве (Lavabre-Bertrand et al., 2001; Stoebner et al., 2005; Sixt et al., 2007, 2009; Sixt, Dahlmann, 2008; Albright et al., 2009; Henry et al., 2009; Sixt, Peters, 2010). С помощью метода электронной микроскопии было показано, что внеклеточные протеасомы имеют структуру, аналогичную внутриклеточным частицам (Zoeger el al., 2006). Биологические функции внеклеточных протеасом до сих пор неясны, однако были выявлены различия в количестве экспортируемых из клеток в плазму протеасом при опухолевой трансформации клеток (Lavabre-Bertrand et al., 2001; Stoebner et al., 2005; Henry et al., 2009). Кроме того, наблюдается увеличение концентрации протеасом во внеклеточном альвеолярном пространстве при дыхательной недостаточности и во время воспалительных процессов в лёгких (Sixt et al., 2007, 2009; Albright et al., 2009). Интересно, что не наблюдалось никакой корреляции между клеточной гибелью и появлением протеасом во внеклеточном пространстве (Sixt et al., 2007). Предполагается, что накопление протеасом в межклеточном пространстве связано, прежде всего, с необходимостью «расчистки территории» — избавление от накапливающихся во внеклеточном пространстве белков и активация секретируемых клеткой белков-предшественников, а также процессинг антигенов (Sixt, Peters, 2010).

В упомянутых выше исследованиях была сделана оценка лишь количества и удельной протеолитической активности внеклеточных протеасом. Известно, однако, что активность и стабильность белка, так же как его функционирование в клетке, определяется, в том числе, его посттрансляционными модификациями (ПТМ), поэтому описывая такой многофункциональный белковый комплекс, как протеасома, крайне важно получить описание паттерна его ПТМ. На сегодняшний день не был сделан анализ паттерна ПТМ протеасомных субъединиц и субъединичного состава внеклеточных протеасом. Не изучались изменения пептидазных активностей протеасом при выходе их из клеток во внеклеточное пространство, а также при индукции апоптотической гибели в этих клетках.

Многие процессы внутри клеток регулируются белками, которые осуществляют свою регуляторную функцию, в том числе за счет специфического связывания с другими белками, которые, как правило, являются специфическими ферментами. В силу этого важно исследование ассоциированных с внеклеточными протеасомами белков, как возможных кандидатов в регуляторы протеасомной секреции во внеклеточное пространство.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Зайкова, Юлия Яковлевна

ВЫВОДЫ

3. В составе внеклеточных протеасом присутствует регулятор РА200, участвующий в репарации ДНК, количество 198 регуляторных комплексов в сравнении с внутриклеточной популяцией заметно меньше.

4. Воздействие на клетки К562 индуктора апоптоза ДР вызывает специфические изменения паттерна ПТМ субъединиц внеклеточных протеасом, а также приводит к снижению трипсин- и каспаза-подобных типов пептидазной активности внеклеточных протеасом и не изменяет химотрипсиновую активность.

5. Выявлены новые сайты убиквитинилирования и ацетилирования субъединиц протеасом а2 (К196), а4 (К189 и К234), аб (К217) и ЯрпП (А2).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зайкова, Юлия Яковлевна, Санкт-Петербург

1. Абрамова Е.Б., Шарова Н.П., Карпов B.J1. 2002. Протеасома: разрушать, чтобы жить III Мол. Биол. т.36. с.761-776.

2. Зайкова Ю.Я., Куличкова В.А., Ермолаева Ю.Б., Гаузе JI.H., Цимоха A.C. 2011. Сравнительный анализ вне- и внутриклеточных протеасом клеток человека линии К562. Цитология. 53 (6): 459—465.

3. Копнин Б.П. Механизмы действия онкогенов и опухолевых супрессоров // Молекулярная биология. — 2000. -т. 5,. -с. 7-40.

4. Куличкова В.А., Миттенберг А.Г., Ермолаева Ю.Б., Цимоха A.C., Волкова И.В., Евтеева И.Н., Кожухарова И. В., Гаузе JI.H., Константинова И.М. 2004. Специфичность популяции протеасом, экскретируемых из клеток в культуральную среду. ДАН. 399 (5) : 503— 506.

5. Моисеева Т.Н., Миттенберг А.Г., Барлев H.A. 2010а. Протеасомы и их роль в регуляции транскрипции. Цитология. 52 (3): 195—203.

6. Моисеева Т.Н., Фёдорова O.A., Цимоха A.C., Миттенберг А.Г., Барлев H.A. 20106. Влияние убиквитинилирования на пептидазные активности протеасом при генотоксическом стрессе. ДАН. 435 (2): 267-271.

7. Сорокин A.B., Ким Е.Р., Овчинников Л.П. 2009. Протеасомная система деградации и процессинга белков. Успехи биологической химии, т. 49, с. 3-763

8. Цимоха A.C. 2010. Протеасомы: участие в клеточных процессах. Цитология. 52 (4): 277-300.

9. Aitken А. 2006. 14-3-3 proteins: a historic overview // Semin. Cancer Biol. 16(3): 162-172

10. Albright J.M., Romero J., Saini V., Sixt S.U., Bird M.D., Kovacs E.J., Gamelli R.L., Peters J., Majetschak M. 2009. Proteasomes in human bronchoalveolar lavage fluid after burn and inhalation injury. J. Burn. Care Res. 30 :948—956.

11. Amerik A.Y., Hochstrasser M. 2004. Mechanism and function of deubiquitinating enzymes. Biochim. Biophys. Acta. 1695: 189—207.

12. Aouida, M., Page N., Leduc A., Peter M., Ramotar D., 2004 A genomewide screen in Saccharomyces cerevisiae reveals altered transport as a mechanism of resistance to the anticancer drug bleomycin. Cancer Res. 64: 1102-1109.

13. Arrigo A.P., Darlix L.J., Khandjian E. et al. 1985. Characterization of the prosomes from Drozofila and its similarity to the cytoplazmic structures formed by the low molecular weight heatshock proteins. EMBO J. v. 4. p. 399-406

14. Arrigo A.P., Simon M., Darlix L.J. et al. 1987. A 20S particle ubiquitous from yeast to human. J. Mol. Evol. v. 25. p. 141-150

15. Asher G, Lotem J, Sachs L, Kahana C, Shaul Y. 2002. Mdm-2 and ubiquitin-independent p53 proteasomal degradation regulated by NQOl. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 99 : 13 125— 13 13

16. Auld K.L, Silver P.A. 2006. Transcriptional regulation by the proteasome as a mechanism for cellular protein homeostasis. Cell Cycle. 5 : 1503—1505.

17. Barret A J. 1980. Biochem. J. 187: 909-912.

18. Baumeister W, Walz J, Zuhl F, Seemuller E. 1998. The proteasome: paradigm of a selfcompartmentalizing protease. Cell 92: 367—380.

19. Beausoleil S.A, Jedrychowski M, Schwartz D, Elias J.E, Villen J, Li J, Cohn M.A, Cantley L.C, Gygi S.P. Large-scale characterization of HeLa cell nuclear phosphoproteins // Proc Natl Acad Sci USA.- 2004. Vol. 101. - N 33.-p. 12130-12135.

20. Benaroudj N., Tarcsa E, Cascio P, Goldberg A. L. 2001. The unfolding of substrates and ubiquitin-independent protein degradation by proteasomes. Biochimie. 83 : 311—318.

21. Besche H.C, Haas W, Gygi S.P, Goldberg A.L. 2009. Isolation of mammalian 26S proteasomes and p97/VCP complexes using the ubiquitin-like domain from ITHR23B reveals novel proteasome-associated proteins. Biochemistry. 48 : 2538--2549.

22. Beyette J, Mason M, Murray R.et al. 1998. Proteasome activities decrease during dexamethasone-induced apoptosis of thymocytes. Biochem J. v. 332. p. 315-320.

23. Bose S, Mason G. G, Rivett A. J. 1999. Phosphorylation of proteasomes in mammalian cells. //Mol Biol Rep. 1999. v. 26. p. 11-14

24. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Analytical Biochemistry. 1976. -v. 72. -p. 248-54.

25. Brooks P., Fuertes G., Murray R.Z., Bose S., Knecht E., Rechsteiner M.C., Hendil K.B., Tanaka K., Dysons J., Rivett A.J. 2000. Subcellular localization of proteasomes and their regulatory complexes in mammalian cells. Biochem. J. 346, 155-161.

26. Burri L., Hockendorff J., Boehm U., Klamp T., Dohmen R.J., Levy F. 2000. Identification and characterization of a mammalian protein interacting with 20S proteasome precursors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 10348-10353.

27. Cardozo C., Michaud C., Orlowski M. Components of the bovine pituitary multicatalytic proteinase complex (proteasome) cleaving bonds after hydrophobic residues. // Biochemistry. 1999. 38, 9768-9777.

28. Castelli J.C., Hassel B.A., Maran A., Paranjape J., Hewitt J. A., Li X.L., Hsu Y.T., Silverman R.H., Youle R.J. 1998. The role of 2'-5* oligoadenylate-activated ribonuclease L in apoptosis. Cell Death Differ. 5: 313-320.

29. Choudhary C., Kumar C., Gnad F., Nielsen M.L., Rehman M., Walther T.C., Olsen J.V., Mann M. Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions // Science. 2009. - Vol. 325. - N 5942. - p. 834-840.

30. Chuang C.Y., Chuang L.F. 1979. Inhibition of chicken myeloblastosis RNA Polymerase activity by adriamydcin. Biochemistry. 18: 2069-2073.

31. Ciechanover A. 1998. The ubiquitin-proteasome pathway: on protein death and cell life // EMBO J., v. 17, p. 7151 -7160.

32. Ciechanover A. 2006. Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting // Hematology Am. Soc. Hematol. Educ .Program. 1-12, 505-6.

33. Ciechanover A., Brundin P. 2003. The ubiquitin proteasome system in neurodegenerative diseases: sometimes the chicken, sometimes the egg. Neuron. 40 : 427—446.

34. Ciechanover A., Iwai K. 2004. The ubiquitin system: from basic mechanisms to the patient bed. IUBMB Life. 56(4): 193-201.

35. Claverol S., Burlet-Schiltz O., Girbal-Neuhauser E., Gairin J.E., Monsarrat B. 2002. Mapping and structural dissection of human 20 S proteasome using proteomic approaches. Mol. Cell. Proteomics. 1: 567—578.

36. Coux O., Goldberg A.L. 1998. Enzymes catalyzing ubiquitinilation and proteolytic processing of the pi05 precusor of nuclear factor kappa Bl. J. Biol. Chem. 273: 8820-8828.

37. Coux O., Tanaka K., Goldberg A.L. 1996. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem. v. 65, p. 801.847

38. Craig R., Beavis R. C. 2004. TANDEM: matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 : 1466—1467.

39. Dahlmann B. 2005. Proteasomes. Essays Biochem. 41 : 31—48.

40. Dange T.D. Smith, T. Noy, P.C. Rommel, L. Jurzitza et al., 2011 BlmlO protein promotes proteasomal substrate turnover by an active gating mechanism. J. Biol. Chem. 286: 42830^12839.

41. Devoy A., Soane T., Welchman R., Mayer R. J. 2005. The ubiquitin-proteasome system and cancer. Essays Biochem. 41 : 187-203.

42. Dou Q.P., McGuire T.F., Peng Y., An B. 1999. Proteasome inhibition leads to significant reduction of Bcr-Abl expression and subsequent induction of apoptosis in K562 human chronic myelogenous leukemia cells. J. Pharmacol. Exp. Ther. 289(2): 781-790.

43. Drexler H.C.A. Programmed cell death and the proteasome // Apoptosis. -1998. .-v.3.-p. 1-7.

44. Drexler H.G., Matsuo Y., MacLeod R.A. 2004. Malignant hematopoietic cell lines: in vitro models for the study of erythroleukemia. Leuk. Res. 28(12): 1243-1251.

45. Dutaud D, Aubry L, Henry L, Levieux D, Hendil K.B., Kuehn L., et al. Development and evaluation of a sandwich ELISA for quantification of the 20S proteasome in human plasma. J Immunol Meth 2002;260(1-2):183-93.

46. Egerer K, Kuckelkorn U., Rudolph P.E., Ruckert J.C., Dorner Т., Burmester G.R., et al. Circulating proteasomes are markers of cell damage and immunologic activity in autoimmune diseases. J Rheumatol 2002;29(10):2045-52.

47. Ezhkova E, Tansey W.P. 2004. Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3. Mol Cell. 13(3): 435-442.

48. Farout L., Mary J., Vinh J. et al. 2006. Inactivation of the proteasome by 4-hydroxy-2-nonenal is site specific and dependant on 20S proteasome subtypes. Arch Biochem Biophys. v. 453(1), p.135-142.

49. Febres, D.E., Pramanik A., Caton M., Doherty K., McKoy J. et al., 2001 The novel BLM3 gene encodes a protein that protects against lethal effects of oxidative damage. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 47: 1149-1162.

50. Fehlker M., Wendler P., Lehmann A., Enenkel C. 2003 Blm3 is part of nascent proteasomes and is involved in a late stage of nuclear proteasome assembly. EMBO Rep. 4: 959-963.

51. Ferdous A., Kodadek Т., Johnston S.A. 2002. A nonproteolytic function of the 19S regulatory subunit of the 26S proteasome is required for efficient activated transcription by human RNA polymerase II. Biochemistry. 41: 12 798—12 805.

52. Fernandez Murray P., Biscoglio M. J., Passeron S. 2002. In vivo and in vitro phosphorylation of Candida albicans 20S proteasome. Arch. Biochem. Biophys. 404: 116—125.

53. Ferry A.E., Baliga S.B., Monteiro C., Pace B.S. 1997. Globin gene silencing in primary erythroid cultures. An inhibitory role for interleukin-6. J. Biol. Chem. 272: 20030-20037.

54. Finley, D., 2009 Recognition and processing of ubiquitin-protein conjugates by the proteasome. Annu. Rev. Biochem. 78: 477-513.

55. Gao X., Li J., Pratt G., Wilk S., Rechsteiner M. 2004. Purification procedures determine the proteasome activation properties of REGy (PA28y). Arch. Biochem. Biophys.425: 158-164.

56. Gazzah A.C., Camoin L., Abid S., Bacha H., Ladjimi M. 2012. iTRAQ: a method to elucidate cellular responses to mycotoxin zearalenone. J. Appl Toxicol, doi: 10.1002/jat.l766.

57. Gillette T.G., Gonzalez F., Delahodde A., Johnston S.A., Kodadek T. 2004. Physical and functional association of RNA polymerase II and the proteasome. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 101: 5904—5909.

58. Glickman M.H., Ciechanover A. 2002. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction. Physiol Rev. 82: 373-428.

59. Goldberg A.L. 2003. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426 : 895-899.

60. Gomes A.V., Zong C., Edmondson R.D., Li X., Stefani E., Zhang J., Jones R.C., Thyparambil S., Wang G.W., Qiao X., Bardag-Gorce F., Ping P. Mapping the murine cardiac 26S proteasome complexes // Circ Res. 2006. -Vol. 99.-N4.-p. 362-371.

61. Gorbea C., Goellner G.M., Teter K., Holmes R.K., Rechsteiner M. 2004. Characterization of mammalian Ecm29, a 26 S proteasome-associated proteinthat localizes to the nucleus and membrane vesicles // J. Biol. Chem. 279(52):54849-61.

62. Green D. Apoptotic pathways: the roads to ruin // Cell. 1998. 94: 695-698.

63. Griffin T.A., Nandi D., Cruz M. et al. 1998. Immunoproteasome assemblu: cooperative incorporation of interferon y (IFN-y)-inducible subunits. J. Exp. Med. 187, 97-104.

64. Grisham M.B., Palombella V.J., Elliot P.J., Conner E.M., Brand S., Wong

65. H.L., Pien C., Mazzola L.M., Destree A., Parent L., Adams J. 1999. Inhibition of NF-kB activation in vitro and in vivo: role of 26S proteosome. Methods Enzymol. 300: 345-363.

66. Groll M., Bochtler M., Brandstetter H., Clausen T., Huber R.2005. Molecular machines for protein degradation. Chembiochem. 6(2): 222-256.

67. Hartmann-Petersen R., Gordon C. Proteins interacting with the 26S proteasome // CMLS 2004, v. 61, p. 1-7.

68. Heinemeyer W., Ramos P.C., Dohmen R. J. 2004. The ultimate nanoscale mincer: assembly, structure and active sites of the 20S proteasome core. Cell Mol. Life Sci. 61: 1562—1578.

69. Hellman K, Alaiya A A, Becker S et al. Differential tissue-specific protein markers of vaginal carcinoma. Br J Cancer 2009: 100: 1303-1314.

70. Hendil K. B., Khan S., Tanaka K. 1998. Simultaneous binding of PA28 and PA700 activators to 20S proteasomes // Biochem. J. 332: 749-754.

71. Hermeking H., Benzinger A. 2006. 14-3-3 proteins in cell cycle regulation // Semin. Cancer Biol. 16(3):183-192.107

72. Herrmann J, Ciechanover A, Lerman O, Lerman A. 2004. The ubiquitin-proteasome system in cardiovascular diseases a hypothesis extended. Cardiovascular Res. 61: 11-12.

73. Hicke L. Protein regulation by monoubiquitin // Nat Rev Mol Cell Biol. -2001. Vol. 2. - N 3. - p. 195-201.

74. Higashitsuji H, Liu Y, Mayer R.J, Fujita J. The oncoprotein gankyrin negatively regulates both p53 and RB by enhancing proteasomal degradation // Cell Cycle. 2005. - Vol. 4. -N 10. - p. 1335-1337.

75. Hilt W. 2004. Target of programmed destruction: a primer to regulatory proteolysis in yeast. CMLS. 61: 1-18.

76. Hochshtrasser M. 1996. Ubiquitin-dependent protein degradation // Annu. Rev. Immunol, v. 17, p. 405-439.

77. Hoyt M.A, Coffino P. Ubiquitin-free routes into the proteasome // CMLS. -2004. V.61.-P. 1-5.

78. Hough R, Pratt G, Rechsteiner M. 1987. Purification of two high molecular weight proteases from rabbit reticulocyte lysates. J. Biol. Chem. 262: 83038313.

79. Humbard M.A, Stevens S.M. Jr, Maupin-Furlow J.A. Posttranslational modification of the 20S proteasomal proteins of the archaeon Haloferax volcanii // J Bacteriol. 2006. - Vol. 188. - N 21. - p. 7521-7530.

80. Hwang J, Winkler L, Kalejta R.F. 2011. Ubiquitin-independent proteasomal degradation during oncogenic viral infections. Biochimica et Biophysica Acta 1816: 147-157.

81. Jariel-Encontre I., Bossis G., Piechaczyk M. 2008. Ubiquitin-independent degradation of proteins by the proteasome. Biochim. biophys. acta. 1786 : 153—177.

82. Johnson D.G., Walker C.L. 1999. Cyclins and cell cycle checkpoints. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 39 : 295—312.

83. Kinyamu H.K., Archer T.K. Proteasome activity modulates chromatin modifications and RNA polymerase II phosphorylation to enhance glucocorticoid receptor-mediated transcription // Mol Cell Biol. 2007. Vol. 27. N 13.-p. 4891-4904.

84. Kleinsschidt J., Hugle B., Ground C. et al. 1983. The 22S cylinder particles of Xenopus leavis. Eur. Cell Biol. v. 32. p. 143-156.

85. Konstantinova I.M., Tsimokha A.S., Mittenberg A.G. 2008. Role of proteasomes in cellular regulation. Int. Rev. Cell. Mol. Biol. 267 : 59—124.

86. Kremp A., Schliephacke M., Kull U. et al. 1986. Prosomes exist in plant cells too. Exp. Cell Res. v. 166. p. 553-557.

87. Kumeda S.I., Deguchi A., Toi M., Omura S., Umezawa K. 1999. Induction of G1 arrest and selective growth inhibition by lactacystin in human umbilical vein endothelial cells. Anticancer Res. 19: 3961—3968.

88. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. 227(259), 680-685.

89. Lavabre-Bertrand T., Henry L., Carillo S., Guiraud I., Ouali A., Dutaud D., Aubry L., Rossi J.F., Bureau J.P. 2001. Plasma proteasome level is a potential109marker in patients with solid tumors and hemopoietic malignancies. Cancer. 92 :2493—2500.

90. Lehmann A., Jechow K., Enenkel C. 2008. BlmlO binds to pre-activated proteasome core particles with open gate conformation // EMBO Rep. 9(12): 1237-43.

91. Liu C.-W., Corboy M.J., DeMartino G.N., Thomas P.J. 2003. Endoproteolytic activity of the proteasome. Science. 299 : 408—411.

92. Loussouarn D, Campion L, Leclair F et al. Validation of UBE2C protein as a prognostic marker in node-positive breast cancer. Br J Cancer 2009: 101: 166-173.

93. Lowe J., Stock D., Jap B. et al. 1995. Crystal structure of the 20S proteasome from the Archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolutions. Science. 268, 533-539.

94. Lozzio C.B., and Lozzio B.B. Human chronic myelogenous leukemia cellline with positive Philadelphia chromosome // 1975. Blood (45): 321-334.

95. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. 1982. Molecular cloning: a laboratory manual. In: Gel electrophoresis. New York: Cold Spring Harbor Laboratory: 150-162.

96. Marques A.J., Glanemann C., Ramos P.C., Dohmen R.J. The C-terminal extension of the beta7 subunit and activator complexes stabilize nascent- 20 S proteasomes and promote their maturation // J Biol Chem. 2007. - Vol. 282. - N 48. - p. 34869-34876.

97. Mason G., Murray R., Pappin D., Rivett A.J. 1998. Phosphorylation of ATPase subunits of the 26S proteasome. FEBS. 430: 269—274.

98. Minotti G., Menna P., Salvatorelli E., Cairo G., Gianni L. Anthracyclines: molecular advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity // Pharmacol Rev. 2004. - Vol. 56. - N 2. - p. 185-229.

99. Murakami Y., Matsufuji S., Kameji T., Flayashi S., Igarashi K., Tamura T., Tanaka K., Ichihara A. 1992. Ornithine decarboxylase is degraded by the 26S proteasome without ubiquitination. Nature. 360 : 597—599.

100. Murata S. 2006. Multiple Chaperone-Assisted Formation of Mammalian 20S Proteasomes. IUBMB Life, 58: 344-348.

101. Muratani M., Tansey W.P. 2003. How the ubiquitin-proteasome system controls transcription//Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4(3): 192-201.

102. Nandi D., Woodward E., Ginsburg D.B. and Monaco J.J. 1997. Intermediates in the formation of mouse 20S proteasomes: implications for the assembly of precursor beta subunits.EMBO J. 16: 5363-5375.

103. Nandi D., Tahiliani P., Kumar A., Chandu D. 2006. The ubiquitin-proteasome system. J. Biosci. 31: 137—155.

104. Narayan K., Rounds D. 1973. Minute ring sharped psrticles in cultured cells of malignant origin // Nature New Biol. v. 243. p. 146-150.

105. Naujokat C., Hoffmann S. 2002. Role and function of the 26S proteasome in proliferation and apoptosis. Lab. Invest. 82 : 965—980.

106. Neo S.Y., Leow C.K., Vega V.B. et al. Identification of discriminators of hepatoma by gene expression profiling using a minimal dataset approach. Hepatology 2004: 39: 944-953.

107. Perkins D.N., Pappin D.J.C., Creasy D.M., Cottrell J.S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data//Electrophoresis. 1999. 20:3551-3567.

108. Petit F., Jarrousse A.-S., Dahlmann B., Sobek A., Hendil K. B., Bury J., Briand Y., Schmid H.-P. 1997. Involvement of proteasomal subunits zeta and iota in RNA degradation. Biochem. J. 326: 93—98.

109. Pickart C.M., Edding M.J. Ubiqutin: structures, function, mechanisms. // Biochemica et biophysica Acta. 2004, v. 1695, p.55-72.

110. Pickart C.M., Cohen R.E. 2004. Proteasomes and their kin: proteases in the machine age. Nat Rev Mol Cell Biol. Mar; 5(3): 177-87.

111. Polevoda B., Sherman F. Nalpha -terminal acetylation of eukaryotic proteins // J Biol Chem. 2000. - Vol. 275. - N 47. - p. 36479-36482.

112. Rabl J., Smith D.M., Yu Y., Chang S.C., Goldberg A.L., Cheng Y. 2008. Mechanism of gate opening in the 20S proteasome by the proteasomal ATPases // Mol Cell. 30(3):360-368.

113. Rao S., Porter D.C., Chen X., Herliczek T., Lowe M., Keyomarsi K. 1999. Lovastatin-mediated G1 arrest is through inhibition of the proteasome, independent of hydroxymethyl glutaryl-CoA reductase. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 96 : 7797—7802.

114. Rape M., Jentsch S. Productive RUPture: activation of transcription factors by proteasomal processing // Biochim Biophys Acta. 2004. - Vol. 1695. - N 1-3.-p. 209-213.

115. Rasti ML, Grand R. J., Yousef A.F., Shuen M., Mymryk J.S., Gallimore P.H., Turnell A.S. 2006. Roles for APIS and the 20S proteasome in adenovirus ElA-dependent transcription // EMBO J. 25(12):2710-22.

116. Rechsteiner M., Hill C.P. 2005. Mobilizing the proteolytic machine: cell biological roles of proteasome activators and inhibitors // Trends Cell Biol. 15(l):27-33.

117. Reed S.I. 2006. The ubiquitin-proteasome pathway in cell cycle control. Results Probl. Cell Differ. 42 : 147—181.

118. Reed S.H., Gillette T.G. 2007. Nucleotide excision repair and the ubiquitin proteasome pathway — do all roads lead to Rome? DNA Repair (Amst.). 6 : 149—156.

119. Rivett A.J., Palmer A., Knecht E. 1992. Electron microscopic localization of the multicatalytic proteinase complex in rat liver and in cultured cells. J. Histoch. Cytochem, v. 40, p. 1165-1172.

120. Rivett J. Intraceccular distribution of proteasomes // 1998. -p. 110-114.

121. Rush J., Moritz A., Lee K.A., Guo A., Goss V.L., Spek E.J., Zhang H., Zha X.M., Polakiewicz R.D., Comb M.J. Immunoaffinity profiling of tyrosine phosphorylation in cancer cells // Nat Biotechnol. 2005. - Vol. 23. - N 1. - p. 94-101.

122. Russell S.J., Steger K.A., Johnston S.A. 1999. Subcellular localization, stoichiometry, and protein levels of 26 S proteasome subunits in yeast. J Biol Chem. Vol. 274. N 31. - p. 2- 1943-1952.

123. Sabatini N., Di Pietro R., Rapino M., Sancilio S., Comani S., Cataldi A. 2004. PI-3-kinase/NF-kappaB mediated response of Jurkat T leukemic cells to two different chemotherapeutic drugs, etoposide and TRAIL. J Cell Biochem. 93:301-311.

124. Scanlon T.C., Gottlieb B., Durcan T.M., Fon E.A., Beitel L.K., Trifiro M.A. 2009. Isolation of human proteasomes and putative proteasome-interacting proteins using a novel affinity chromatography method. Exp. Cell Res. 315(2): 176-189.

125. Schmid H., Akhayat O., Martins D. et al. 1984. The prosome: a ubiquitous morphologically distinct RNP particle assosiated with repressed mRNPs and containing specific ScRNA and a characteristic set of proteins. EMBO J. v. 3. p. 29-34.

126. Schmidt M., J. Hanna, S. Elsasser, D. Finley, 2005b Proteasomeassociated proteins: regulation of a proteolytic machine. Biol. Chem. 386: 725-737.

127. Sdek P., Ying H., Chang D.L.F., Qiu W., Zheng IT., Touitou R., Allday M.J., JimXiao Z.-X. MDM2 promotes proteasome-dependent ubiquitin-independent degradation of retinoblastoma protein, Mol. Cell 20 (2005) 699708.

128. Searle B.C. 2010. Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based proteomic studies. Proteomics. 10 : 1265—1269.

129. Sears R.C. The life cycle of C-myc: from synthesis to degradation // Cell Cycle. 2004. - Vol. 3. - N 9. - p. 1133-1137.

130. Sheaff R.J., Singer J.D., Swanger J., Smitherman M., Roberts J.M., Clurman B.E. 2000. Proteasomal turnover of p21Cipl does not require p21Cipl ubiquitination. Mol. Cell. 5: 403—410.

131. Sixt S.U., Beiderlinden M, Jennissen H.P, Peters J. 2007. Extracellular proteasome in the human alveolar space: a new housekeeping enzyme? Amer. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 292 : L1280—L1288.: L1280—L1288.

132. Sixt S.U., Dahlmann B. 2008. Extracellular, circulating proteasomes and ubiquitin—incidence and relevance. Biochim. Biophys. Acta. 1782 : 817— 823.

133. Sixt S.U., Peters J. 2010. Extracellular alveolar proteasome: possible role in lung injury and repair. Proc. Amer. Thorac. Soc. 7 : 91—96.

134. Smalle J, Vierstra D. 2004. The ubiquitin 26S proteasome proteolytic pathway // Annu. Rev. Plant Biol. 55: 555-590.

135. Smulson M. 1974. Subribosomal particles of HeLa cells. Exp. Cell Res. v. 87. -p. 253-258.

136. Soligo D, Servida F, Delia D. et al, 2001 // The apoptogenic response of human myeloid leukaemia cell lines and of normal malignant haematopoietic progenitor cells to the proteasome inhibitor PSI. //. J. Haematol, 113: 126135.

137. Stadtmueller B.M, Hill C.P, 2011 Proteasome activators. Mol. Cell 41: 819.

138. Stoebner P.E., Lavabre-Bertrand T, Henry L, Guiraud I, Carillo S, Dandurand M, Joujoux J.M, Bureau J.P, Meunier L. 2005. High plasma proteasome levels are detected in patients with metastatic malignant melanoma. Br. J. Dermatol. 152 : 948—953.

139. Sumegi M, Hunyadi-Gulyas E, Medzihradszky K.F, Udvardy A. 26S proteasome subunits are O-Iinked N-acetylglucosamine-modified in

140. Drosophila melanogaster // Biochem Biophys Res Commun. 2003. - Vol. 312.-N4.-p. 1284-1289.

141. Tai H.C., Besche H., Goldberg A.L., Schuman E.M. 2010. Characterization of the brain 26s proteasome and its interacting proteins. Front. Mol. Neurosci. 3: pii: 12.

142. Tanahashi N., Murakami Y., Minami Y. et al. 2000. Induction by interferon-and contribution to ATP-dependent proteolysis. J. Biol. Chem., v. 275, p. 14336-14345.

143. Tanaka K. 2009. The proteasome: overview of structure and functions // Proc Jpn Acad SerB Phys Biol Sci. 85(1): 12-36.

144. Tansey W.P. 2004. Death, destruction, and the proteasome // N. Engl. J. Med. 351(4):393-4.

145. Tarcsa E., Szymanska G., Lecker S., O'Connor C.M., Goldberg A.L. 2000. Ca2+-free calmodulin and calmodulin damaged by in vitro aging are selectively degraded by 26 S proteasomes without ubiquitination. J. Biol. Chem. 275 : 20 295—20 301.

146. Touitou R., Richardson J., Bose S., Nakanishi M., Rivett J., Allday MJ. 2001. A degradation signal located in the C-terminus of p2lWA,'1/cll>1 is a binding site for the C8 alphasubunit of the 20S proteasome. EMBO J. 20 : 2367-2375.

147. Ustrell V., Hoffman L., Pratt G., Rechsteiner M. 2002. PA200, a nuclear proteasome activator involved in DNA repair// EMBO J. 21(13): 3516-3525.

148. Wakata Y., Tokumoto M., Horiguchi R., Ishikawa K., Nagahama Y., Tokumoto T. 2004. Identification of alpha-type subunits of the Xenopus 20Sproteasome and analysis of their changes during the meiotic cell cycle. BMC Biochem. 5:18.

149. Walz J., Erdmann A., Kania M., Typke D., Koster A.J., Baumeister W. 1998. 26S proteasome structure revealed by three-dimensional electron microscopy. J. Struct. Biol. 121: 19-29.

150. Wang X., Chen C., Baker P.R., Chen P., Kaiser P., Huang L. 2007. Mass spectrometric characterization of the affinity-purified human 26S proteasome complex. Biochemistry. 46 : 3553—3565.

151. Wojcik C. 2002. Regulation of apoptosis by the ubiquitin and proteasome pathway. J. Cell Mol. Med. 6 : 25^18.

152. Wojcik C., DeMartino G.N. 2003. Intracellular localization of proteasomes // Int. J. Biochem. Cell Biol. 35: 579-589.

153. Wolf D.H. 2004. From lysosome to proteasome: the power of yeast in the dissection of proteinase function in cellular regulation and waste disposal. Cell Mol. LifeSci. 61: 1—14.

154. Wolf D.H., Hilt W. 2004. The proteasome: a proteolytic nanomachine of cell regulation and waste disposal. Biochim. biophys. acta. 1695 : 19—31.

155. Zaiss D.M., Standera S., Kloetzel P.M., Sijts A.J. PI31 is a modulator of proteasome formation and antigen processing // Proc Natl Acad Sci US A.-2002. Vol. 99. -N 22. - p. 14344-14349.

156. Zoeger A., Blau M., Egerer K., Feist E., Dahlmann B. 2006. Circulating proteasomes are functional and have a subtype pattern distinct from 20S proteasomes in major blood cells. Clin. Chem. 52 : 2079—2086.

Информация о работе

Зайкова, Юлия Яковлевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2012
ВАК 03.01.03

Диссертация

Характеристика внеклеточных протеасом при апоптозе клеток К562 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы