Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование трансплантации неонатальной корковой ткани в сенсомоторную область коры мозга крысы

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование трансплантации неонатальной корковой ткани в сенсомоторную область коры мозга крысы"

РГ8 ОД

САИКТ-ПЕТЕЕЕУРПЗКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Варещак Наталия Иосифовна

КССВДОШШЕ ТРАНСШШПАДКИ НЕОНАТАЛШОЙ КОРКОВОЙ ТКАНИ В СЕНСОМОТОЕШО ОБЛАСТЬ КОШ МОЗГА ШСЫ

03.00.13 - физиология человека и зшгапшх

Автореферат диссертации на соисканиа учёвоЗ степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1994

Работа выполнена в группе нейробиологии развития Физиолопгчес-кого НШ имени А,А.Уетомского (руководитель - доктор биологических наук - Д.НДекков).

Научный руководитель - доктор. биологических наук Д.Н.Ленков

Официальные оппонента: доктор биологических наук, профессор В.Г.Кассиль

доктор медицинских наук, профессор Д.П.Матюшшн

Ведущая организация - Институт вксшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Защита состоится " /У " ^¿¿^Х* 1994 г. в ■часов на заседании Спешалкзировашюго учёного совета К 063.57.09 по присуждению учёной степени кандидата биологических наук в.Сашст-Пе-тербургском государствэшюм университете (199034, Санкт-Петербург, Университетская наберезшая, д. 7/9, ауд. 90).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке шш М.Горького Санкт-Летербургского государственного университета.

Автореферат разослан " /X" 1994 г.

Учёный сезфетарь ' Специализированного совета

А.Г.Марков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Круг проблем, связанных с методом трансплантация ткани мозга у позвоночных, имеет важное экспериментальное и в перспективе медпцшскоэ значение, поскольку у диекопи-тающих и человека ткань ВДС обладает низкой способностью к регенерации.

Один из путей восстановления ткани ЩС после ее повревдения -совершенствование методов трансплантации нервной ткани (Bibrkiund, steaevi,19s4; las et al., 1979 ), другой - разработка методов стимуляции процессов регенерации поврежденной ткани ЦНС на клеточном и тканевом уровнях (Карлсон, 1986; Полежаев, 1981; Lmd et al.,1983; Neural Regeneration, 1987; Perioral9S3).Многочисленными исследованиями установлена возможность приживления нервных тканей эмбрионов и новорожденных в токо- и гетеротопгческих участках головного и спинного мозга как у швороздешшх, так и у взрослых животных (Александрова,Полежаев,1982; Братин,Виноградова, 1981; Виноградова, 1984; Ваз,1985; Giiman, 1.991; На11аз,1982}. Показано, что клеточные элементы трансплантатов (ТП) дифференцируются, а нейроны в ТП способны формировать двусторонние связи с мозгом реципиента (Братин, 1990; Castro et al.,1985; Chong F.-L. P. et а1.,198б)#Удается не только аллотрансплавтация, но и ксено-трансплантация эмбриональной ткани мозга, хотя ксенотранспланта-ты показывают меньшую жизнеспособность (Кичииша, Виноградова, 1988; Отеллин и др.,1965,1988; ïuone et al.,1985) и со временем отторгаются.

Установлено, что нервные ТП могут восполнять недостаточность нейромедиаторов, гормонов, специфических ферментов, нейротрофлче-склх факторов в мозге животных-реципиентов, следствием чего является коррекция патологических отклонений их поведения (Брагин И др.,1984; BjJorklund et al.,1982; Cunningham et al.,1987; Ferry, 1984). В последнее время вникание исследователей привлечено клиническими перспективами использования метода трансплантации нервной и нервно-эндокринной ткани (Виноградова,1990).

Надо отметить, что на фоне обилия исследований, посвященных анализу различных аспектов использования Til для реституции поражений нигро-стркатной системы на модели экспериментального паркинсонизма ( Bjorklund et al.,1985; Olson et al.,1985; Hioux et al., 1991), значительно меньше сделано в направлении использования ТП при кортикальных повреждениях, а в области моторной коры такие

работы пока единичны ( lorter e-fc al., 1987; Wallace,Hanisterger, 1984). Исходя из общего направивши исследований, проводимых в течение длительного периода в .группа нейробиологии развития (Ленков и др. ,1976-1990), мииенью нанесения повреждения, сопровождаемого инъекцией ТП, была избрана сенсомоторная область коры мозга.

Цель и задачи исследования. Целио настоящей работы явилось комплексное, с использованием поведенческих, злектройизиологическнх и гистологических методов, исследование последствий трансплантации неонаталъной корковой ткани в полость, сделанную в паренхиме сенсомоторной области коры мозга у развивающихся и взрослых белых крис, В качестве конкретных задач исследования вкбрали следующие:

1. Сравнение локомоции развивающихся крыс после разрушения участков сенсомоторной коры и введения ТП.

2. Анализ хода изменений двигательной функции у взрослых крыс после мультЕфокалышх поражений и введения множественных ТП.

3. С целью расширения потенциальких источников донорского материала использовали для пересадки корковую ткань из гомологичных зон противоположного полушария (гетеротопическая трансплантация).

4. Электрофизиолопяесз'.ая характеризация ТП в разные сроки: а) сравнение спонтанной и вызванной активности нейронов в ТП и в окружающей корковой, ткани, б) обследование ТП и окружающей мозговой ткани методом электрической гяшростщуляции с регистрацией двигательных ответов (ДО).

5. Контроль общего состояния ТП и пограничной ткани между ТП и нормальной тканью мозга (интерфейса) с помощью метода Ниссля.

6. Гистологический анализ цитоархитектоники нейронов в ТП с помощью метода Гольджи.

7. Прослеживание динамики васкуляризации ТП с помощью интракарди-альной перфузии красителя и метода Гольдки.

Научная новизна. В данной работе впервые проведена трансплантация неонатальной корковой ткани, в том число гетеротопической, в сенсомоторную кору мозга у развивающихся и взрослых белых крыс.

Впервые выполнено длительное, до года и более, комплексное, мультдцисцшшшарное (электрофизиологическое, морфологическое, поведенческое) исследование последствий разрушения и трансплантации в сенсомоторной коре крысы.

Теоретическое и практическое значение работы. Проведенное комплексное исследование последствий трансплантации неонатальной корковой ткани во фронтальные области коры тэга у развиваэдихся и

взрослых белых крыс показало положительное воздействие корковых ТЯ на окружамцуи мозговую ткань, предохраняющее ее от некротических и существенных дегенеративных изменений в зоне повреждения в коре мозга, и возможность множественной вкутрикозговой трансплантации при культи^окалышх поражениях мозга, которые являются перспективой шгода нейротрансплантащи в восстановительной нейрохирургии.

Апшбаи^я •работа.

Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на: ХУ Съезде Всесоюзного ^топологического общества, Кишинев, 198?; Секции общей физиологии Ленинградского общества физиологов, биохимиков и (Харжкологов, Ленинград, 1988, 1990; Всесоюзно:.! симпозиуме "Трансплантация ткашг мозга млекопитащих", Пуцино, 1988; Международной конференции по биологии развития, Лейпциг, 1989; International Syrapooium. "Plasticity end regeneration of the nervous systea",Torino,Italy, 1990; Конференции "Доминантные иеха-¡шзж поведепческих эдаптащй", ЛГУ, Ленинград, 1990; III Всесоюзной конференции по нойронаукам, Киев, 1990; Soviet-Indian Symposium on liourobiologyj luschino, 1991.

Публикации. По текз диссертации опубликовано II работ.

Структура и объе:.? диссертации. Диссертация вкличает HS стра-1пщ гяншшописного текста, 33 рисунка. Текст состоит из введения, обзора литературы, описания методик исследования, четырех глав результатов экспериментов, обсуждения результатов, выводов и указателя литературы, который включает 221 источник, из них 75 на русском языке.

МЕТОДИКИ

Исследовашщ проводили на 160 беспородных белых крисах-са'лцах. Еивотнке были разделены на группы: с разрушением моторной кори (локальным и шгояеетвешгш); с разнили вариантами трансплантации корковой ткани, взятой от новорожденных крнс-донорои (гог,:отопичэ-ской и гетеротопической, локальной и кногественной); контрольные. Еиъотнне были использованы в поведенческих, электро5кзкологичес-ких и морфологических исследованиях от первых дней до двух лет после операций.

Операционнно процедуры производили под тпошшталовкм наркозом в дозе 65-70 мг/кг внутрмЗршинио. Краниотоккэ выполняли при местной анестезии 15?—шал. раствором новокаина, вводимым подкояно в зоне скальпа. Участи корковнх моторных представительств (МП) ви-

брисс или конечностей 1фысы (Вольнова,Ленков,1982; ИеаГвеу et а1,,198С) удаляли посредством отсоса. Для трансплантации использовали донорский материал коры мозга крыс 1-го дня жизни. После обширной краниотомии участок теменно-фронтальной коры иссекали, быстро переносили в охладденнъй раствор Хэикса, освобождали от соединительнотканных оболочек и элементов крови, еще раз ополаскивали и разрезали на фратаенты объемом 0,5-1,0 ш?. Эту массу закачивали в полость в коре мозга реципиента. Эти процедуры делались с учетом рекомендаций ряда методических работ (Полежаев,Александрова, 1986; В1бгк1ип<1^епет±,1985).

Наблюдения за изменениями двигательного поведения ирис после операций разрушения и трансплантации были проведены с помощью методик побекек по коридору и перехода по перекладине. При побеж-ках по коридору регистрировали следы стоп и пальцев задних конечностей, окрашенннх чернилами разного цвета, на диаграммной бумаге. Параметры лококоции - длина иага ( Ь ) и "полушага" (I ) - измеряли по ранее разработанной методике (Нгийса е* а1.,197Э) с помощью магнитного карандаша на анализаторе изображений 1БА.5-1. Последний использовали танке для статистической обработки указанных параметров, вычисления средних значений, среднеквадратичных отклонений, средних стандартных отклонений (б^ ) и коэффициентов вариации (М^ ). В методике перехода 1фыс по круглой деревянной перекладине йивоишх обучали ходить по перекладине за недели до операций, на 4-й день обучения крнсы выполняли эту задачу без ошибок - "срывов" какой-нибудь из лап с перекладины.

По окончании поведенческих наблюдений на части животных проводили острые эксперименты с отведением вызванных потенциалов (Ш), нейронной активности и микросткмуляции в ТП и соседних участках неокортекса. Опыты вели под тиопенталовым наркозом (60 мг/кг) с подкожной местной анестезией 0,5$ новокаином; для ослабления побочных эффектов барбитуратов на автономную нервную деятельность вводили внутримышечно 0,1$ атропин-сульфат; для предотвращения возможного отека мозга вводили внутримышечно лаз же в дозе 3 мг/ кг. После краниотомии голову фиксировали в стереотаксическом аппарате в двух точках: за свод черепа и верхние резцы, используя норакрил, Всзсрыьали твердую мозговую оболочку, поверхность мозга для ослабления мозговых пульсаций заливали 2% агар-агаром, приготовленным на 7% сахарозе. Отведение ЭМГ-ответов осуществляли биполярными игольчатыми электродами. Биоэлектрические потенциалы

регистрировали с экрана осциллографа С1-42 на фотопленку с помощью ФОР-2. Для визуального мониторинга использовали осциллограф С1-83. Монопояярнуи внутрпкорковую микростшуляцпп (Г.1С) производили через стеклянные микроэлектроды, заполненные 2М раствором цитрата натрия, с сопротивлением 0,5-1,5 г,Ом. Индифферентным электродом служила серебряная пластина площадью около I см2, помещаемая под коней в затылочной области. Для МО использовали серии прямоугольных импульсов длительностью 0,3-0,4 мс, с частотой 400 кмп/с; количество импульсов в серии для поиска ответов от 3 до 9; для определения пороговых значений тока кик латентных периодов (ЛП) - 5-6 в пачке (А-зепита ,1975). Ток измеряли при каждой подаче стимуляции с помощью специального устройства, изготовленного на базе пикового вольтметра Б.Д.Моченковим, с отдельными поддиапазонами на 5, 10, 25 мкА и т.д. Отведение фокальных Ш и активности нейронов фронтальной коры как в интактной, так и в экспериментальной ткани производили с помощью тех же электродов, которые использовали для МС. Как ВП, так и ответы нейронов на периферическую активацию вызывали с помощью электрокожной стимуляции конечностей и вибриссных фолликулов крысы через биполярные игольчатые электроды, а также посредством механической стимуляции вибрисс.

Изучение состояния чейроналышх и сосудистых структур ТП и прилегающих участков коры в различные послеоперационные сроки проводили морфологическими метода;,и Ниссля, Гольджи в модификациях (Ромейс,1954), транспорта пероксидазы хрена (ПХ)( Меои1ош, 1978), перфузии кровеносных сосудов проционовш голубил 3113 (Антонова,1964; Иванова,1987),

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Описание экспериментального материала.

В работе были исследованы 60 развиваицихся (1,5 мес.) и 200 зрелых (3 мес.).белых беспородных крыс-самцов морфологическими, электрофпзиологическши и поведенческими методиками до 1-2х лет после операций локального разрушения неокортекса и трансплантации корковой ткани. У 26 из 60 развивающихся крыс Сила произведена гомотопическая трансплантация неонатальной корковой ткани в область Т.5П задней конечности; у 14 - разрушение корковой ткани в области 1Ш задней конечности; 7 - была введена ЛХ; 6 - была произведена перфузия кровеносных сосудов проционовш голубым ЗЯЗ, остальные 7 животных использовали как контрольные. Из 200 зрелых крыс 20 была произведена гомотопическая трансплантация в ШП. зад-

ней конечности, 26 - гатеротопическая трансплантация, 17 - разрушение в Ш задней конечности, 34 - множественная гомотопическая трансплантация в МП вибрисс, передней и задней конечностей, 46 -множественная гетеротопическая трансплантация, 27 - множественное разрушение, остальные 30 крыс использовали для контроля (интакт-ные или после ложной операции). Морфологическое исследование по методу Ниссля было проведено на 40 крысах после введений ТЯ и разрушений в разные сроки после операций, по методу Гольдаи в различных модификациях - на 36 животных, на 10 интактннх крысах был проведен морфологический контроль. Острые електрофизиологические эксперименты были поставлены на 25 крысах. Двигательное поведение крыо было исследовано по методикам побежек по коридору и переходов по перекладине.

Морфологическое исследование состояния области коркового трансплантата и раз-рушения в сенсомоторной коре.

Прижквлешге гомотопических и гетеротопкческих ТП шло, как прело, успешно и при внесении ТП сразу после локального разрушения в моторной коро хозяина астроцитарная реакция была незначительна, соединительнотканный рубац между 'ГП и тканью хозяина не развивался и происходила хорошая интеграция с окружающей паренхимой коры. Использованные операционные приемы позволяли сохранить оболочки мозга и молекулярный слой неокортекса под ТП. Наблюдались выживание нейронов в таких ТП и элементы восстановления внутренней горизонтальной и вертикальной организации. Слоистость в ТП была нарушена, по крайней мере, до 35 дней после операции, но к 85 дню отмечены признаки восстановления ламинарной организации в ТП.

Транспорт ПХ выявил наличие корково-корковых и корково-таламн-ческих связей ТП с реципиентом через 14 дней й позже.

Врастание кровеносных сосудов в ТП из соседних зон коры било значительным уже на первой недело переживания ТП и капиллярная сеть внутри ТП достигала высокой плотности на 1-2й неделях. В поздние сроки (85 дней после операции) сосудистая сеть практически не отличалась от таковой у нормальных крыо в атом отделе неокор-текоа.

При обследовании корковой ткани в зона ТП было отмечено уменьшение выраженности дегенерации по периферии очага повреждения после внесения ТП по сравнению со случаями разрушений без ТП. На 1-£й неделях после введения ТП отмечалась гипертрофия нейронов в бонз коры хозяина, примыкающей к ТП. Измерения показали, что ope-

дний диаметр пирамидных клеток в ТП по сравнешпо с приграничными бая меньше в 2,3-2,5 раз, а с клетками нормальной коры - в 1,5 раза. Уке через месяц после операции большинство нейронов ТП были хороао дифференцированы, с развитыми базалышми и апикальными дендритами, ветвящимися до 3-го порядка. Основными нейронными формами в ТП являлись пирашцише и звездчатые клетки. ПЬшикл на де-ндритах нейронов ТП по величине и по форме не отличались от нормальных, но их плотность распределения в ТЛ была мэньие, чем в нормальной зрело.й коре, примерно вдвое.

Злектрофизиолопгчоокиэ наблюдения,

Электрофпзиологлческио опиты выполняли через I, 3-6, 10-11 месяцев после разрушений и трансплантации. Нейроны со спонтанной активность» наблюдали в поверхностной части ТП, иногда на глубине 100-200 шал, а таете едоль краев ТП. Б части случаев Ш на электроконную стимуляцию конечностей или вибркссных подушек внутри ТП . были намного шгае по амплитуде, чем аналогичные Ш з симметричных тренах в неоперированном полушарии. Ш и нейронные разряды, регистрируемые внутри ТП, тлели ЛП: при стимуляции подошв передних и задних конечностей варыфовали от 13 до 30 ме и от 17 до 38 мс, соответственно, а на стимуляцию вибрисоннх подушек - от 10 до 15 мс. В длительно переживания ТП (10-11 мес.) найщцали нейроны с узкими и широкими соматосонсорными рецептивными полями. Характер отЕетов нейронов в ТП на разновалентше соместеэкческие стимулы был различным: наряду с единицами, отвечающими достоверно на раздражение одной или двух зон кожной поверхности, встречались также единицы с широкой конвергенцией входов, в том числе нейроны, отвечающие на стимуляцию всех четырех конечностей и обеих вибриссннх подушек. В части нейронов ТП, как и в интактной се-нсомоторной .коре, преобладали контрлатеральнке входы. Однако в другой популяции нейронов ТП, а также в части нейронов в зоне, окружающой ТП, отмечалось преобладание (по порогу раздражения и амплитуде ВЦ) ипсинатеральных входов. Ш в интактном полушарии, а такие в экспериментальном, вблизи от ТП, сопровождалась ДО, сходнкми с нормальными по порогам и локализации, тогда как непосредственно из ТП при параметрах стимуляции, исключающих охват током ткани коры вне ТП, ДО получить не удалалось. Однако при погружении микроэлектрода на глубину более 2000 шал, вплоть до 3000 мнм, в части треков МО вызывала нлзкопороговыо ДО, что необычно дая таких глубин корн (белое вещество) у крыс в норме.

N

Изучение параметров локомоции у крне в норме, после частичной экстирпации и трансплантации.

Особенности локомоции экспериментальных крыс в сравнении с интак-тными животными того же возраста исследовали в условиях двух методик: побежек по коридору и переходов во перекладине. Измерения параметров локомоции по многим повторных.! записям, выполненным в одном сеансе или в последующие дни, показали устойчивость всех параметров локомоции как по интервалам распределегаш, так и по средним значениям, в согласии с данными, полученными разработчиками методики (Нгиака е-Ь а1 .,1979). При регистрации локомоции у 5-недельннх крыс как в первые дни после частичной экстирпащш ко?*-, ры, так и у крыс-реципиентов вслед за трансплантацией, наблюдалось некоторое отставание от контрольных животных по ряду параметров. Характерны,! для яивотшсс с ТП и с экстирпацией на 1-2й день после операщш было повышение концентрации точек на диаграммах рассеяния Ь и I по сравнению с нормальными животными того же возраста. Об этом же свидетельствует снижение средних значений б^ и непосредственно после операций по сравнению с таковыми в контроле, что может указывать на уменьшение степеней свободы в двигательной функции у животных с ТП и с экстирпацией. Спустя 15 дней после операций наблюдали восстановление у зфыс после экстир- ■ пации по параметрам[, и! : разброс и средние значения не имели достоверных отличий при 10^-м уровне значимости от таковых в норме, изменяясь в соответствии с возрастом. В это же время у крыс с ТП значения параметров и £ достоверно отличались от таковых у животных после экстирпации и контрольных. Через 9 недель после операций найлвдалось возрастание средних значений и 6 для левой ("больной") конечности у крыс с ТП по сравнен™ с уровнем величин этих параметров у животных спустя 5 недель после операции и введения ТП. На этом же. сроке у крыс посла экстирпации отмечались различия в направлении сдвигов и \ дня обеих задних конечностей. Анализ по критерию Стысдента выявил существенные различия в ходе процесса восстановления между крысами с ТП и после экстирпации, тогда как различия между крысами с ТП и нормальны:,га сглаживались. Сопоставление диаграмм рассеяния параметров и Ь У животных с ТП, после экстирпации и нормальных через II недель от начала исследования показывает вполне наглядные особенности: увеличение разброса крайних величин Ь и I у крыс с ТП и экстирпацией, причем субпопуляция точек, соответствующих значениям Ь около 200 мм, ха-

рактерна только для крыс с ТП. Динамику восстановления двигательной функции изучали с помощью тестирования перехода по перекладине. Исследование было проведено на 5 группах крыс (возрастом 3 мес.) в течешге более 5 месяцев, регистр1Ц)уя визуально количество срывов задней лапы. Нроизводоли экстирпацию неокортекса в зонах Ш передней и задней конечностей в правом полушарии и в операционные полости вводили корковую ткань от новорожденных крысят из гомологичного полушария (группа I) и из противоположного полушария (груша 2); нескольким животным производили аналогичные разрушения коры мозга без последующей трансплантации (группа 3); другим животным производили ложную операцию, ограниченную трепанацией черепа, (группа 4) и несколько интактных крыс использовали для контроля (хруппа 5). Крысы 4й группы в 1й день после операции и далее совершали переходы по перекладине без срывов лап, как ин-тактше крысы. Крысы 1й, 28 и Зй групп три дня после операции ке могли ходить по перекладине, так как отмечалась гшерэкстензия передней и задней лап, контрлатеральных оперировании^ полушарию. На 4й день эти крысы уяэ могли ставить "больные" лапы на перекладину и передвигаться по ней с частыми срывами этих лап. К 20-му дню после операции число срывов больной лапы у крыс после гомото- . пической и гетеротопичее.кой трансплантации было примерно на 70$ больше, чем у крыс после разрушения без ТП. Через 3 месяца и далее у крыс после.разрушения и после трансплантации регистрировалось менее 10$ срывов (I срыв за переход). Методика перехода крыс по перекладине позволя&т в первые месяцы посла операции визуально выявлять изменения двигательной функции в отличие от методики передвижения по коридору, при которой уже через I неделю оперировап-шх животных визуально было невозможно отличить от интактных, для чего требовались многочисленные измерения с последующим скрупулезным анализом с привлечением электронно-вычислительной техники.

ОБСУВДШШЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Нейвогистологические наблюдения клеточной и сосудистой организации в корковых трансплантатах и окружавшем мозге.

При внесении ТП сразу после локального разрушения в моторной коре хозяина соединительнотканная и астроцитарная реакции незначительны. Соединительнотканный рубец медцу ТП и тканью хозяина, как правило, а нашем материале был не выражен и происходила хорошая структурная интеграция. ТП с окружающей паренхшой коры. Зти результаты аналогичны наблюдениям ряда исследователей, применивших

эмбриональные корковые TIÎ и получивших плавный интерфейс между ко— рковым ТП и мозгом хозяина (Александрова и др.,1993; Гирман,Головина, 1988; Castro et al .Д985). Использованная нами методика, а именно введение ТП тангенциально через разрез в твердой мозговой оболочке сразу же в подготовленную полость, позволяет лучше сохранить ТП под неповрежденными оболочками мозга, целостность которых, по-видимому, способствует улучшению трофики и скорейшей васкуляри-захцш ТП. Наблюдается хорошее выживание нейронов в таких ТП и имеются свидетельства ламинарной и радиально-колончатой (кластерной) организации, что, по-видимому, обусловлено врастанием в Til таламо-кортикальных и кортико-кортихалькых афферентных волокон ( Cas-tro et а1.,1985; СЬал6 е« al .,1986), хотя нередко слои в ТП инвертированы вследствие случайной ориентации кусочков донорской ткани. Большой интерес представляет уменьшение зоны дегенерации по периферии очага разрушения после внесения ТП по сравнению со случаями разрушений коры без ТП. На 1-2й неделях после введения ТП отмоча-ется временная (около I мес.) гипертрофия нейронов в зоне коры хозяина, примыкающей к ТП, что может свидетельствовать о трофических влияниях как раневых посттравматнческих факторов ( Hieto-Sampeaüxo ot al .,1983), тазе и ТП (Витвицкий,1968;Cotman ot cl .,1985) на мозговую ткань хозяина. Можно признать положительное воздействие корковых ТП на окружалцую мозговую ткань, предохраняющее ее от некротических к существенных дегенеративных изменений. Через месяц после трансплантации основными нейронными формами ТП на препаратах. обработанных по модификации метода Гольджи, выявились большие и малке пирамидные и разнообразные зЕездчатш клетш с достаточно развиты:,ш деццритами. Нейроны ТП представлены скоплениями в виде "гнезд" и наиболее дифференцированы 'в участках, граничащих с окружающей корой. В более поздние сроки после операции (2,5 мес.) обращает на себя внимание интеграция нейронов ТП в ансамбли и колонки, сходные с корковыми модулями ткани реципиента. Исследования васкуляризации методами Гольджи и флуоресцентного окрашивания вня-вило на 7 день после трансплантации активный рост кровеносных сосудов реципиента, расположенных на границе с ТП, а через 14 дней наблюдалось проникновение сосудов в толщу ТП и к 85 дню сосудистая сеть внешне не отличалась от таковой s норме; Нади даннне о васкуляризации ТП согласуются с результатами других исследователей (UeiaadrovQ ,1991;Кхгдп et el .,1989;Rocenctein ,1991). Нескольким животным (от 5 дней'до 6 мес. после трансплантации) в область ТП

вводили ПХ, транспорт которой показал отсутствие связей ТП с окружающей тканью мозга на 7 сутки и появление их к 14 суткам и далее. Аналогичные результаты были получены другими исследователями при трансплантации ткани эмбрионального мозга (Полежаев,Александрова, 1986¡Castro et al .,1985,-"eUs et al .,1987). Эти данные дозволяют предполагать, что нейроны в ТП могут отчасти восполнять связи, утраченные при повреядешш мозга.

Особенности нейронной активности в корковых трансплантатах.

Характерным для шжроэлектродных погружений в зоне ТП, переживающих в мозге реципиента 1-3 месяца и дольше, было проявление групп нейронов со спонтанной активностью в поверхностных и приграничных участках ТП, тогда как на глубине 1000-1500 мкм (уровень слоя У в норме) активные "островки" были отужены зонами "молчания1'. Аналогичные наблюдения отмечены в исследованиях с использованием эмбрионального донорского материала (Братин,1990; Porter et al.,1987). Зти особенности ТП могут объясняться не только случайной ориентацией фрагментов донорской ткани, но неравномерным выживанием нейронов в срединных п периферических участках ТП, а_ тахае геометрией капиллярной сети, определяющей трофику нейронАых; скоплений. Амплитуда Ш на электрокожную стимуляцию, сниженная в' зона ТП по сравнении с симметричным нормальным участком сенсомото-рной коры, может свидетельствовать о низкой плотности распределения синаптических, б частности таламо-кортикальшх, входов в ТП (Братин,Боне,1989; Гирман,Головина,1988). Близкий к нормальному диапазон Ш фокальных Ш и нейронных ответов внутри ТП m сомато-сенсорную стимуляцию позволяет предполагать аналогичное происхок-дение и сходнпо биофизические параметры путей, опосредующих передачу соответствующих афферентных сигналов в ТП и окружающую его корковую ткань реципиента. Это согласуется с наблюдениями на ТП в других областях корн мозга (Братин,1990; Гирман,Головина,1988). Рецептивные поля нейронов внутри ТП при тестировании ответов на разновалентные соместезичаские стимулы характеризовались разнообразием как и в норме, с некоторой тенденцией к широкой конвергенции (Брагин,1990). Обнаружение субпопуляций нейронов внутри ТП и в прилежащем участке коры мозга реципиента о равноценные! билатеральными входами и даже с преобладанием ипсилатералышх соместези-ческих входов над контрлатеральными напоминает картину, имеющую место в первые недела постнатального развития (Голикова,IS90; Лок-ков,Васильева,1979), и, по-видаыому, отражает формирование нвкото-

pnx афферентных проекций з ТП ш инфантильному Timy без последующей трансформации к контрлатералыюму доминированию, происходящему при нормальном онтогенезе. Неудачи в попытках вызова ДО на МС в ТП, как и в единственной опубликованной работе с такой же методической задачей Porter et el .,1987), можно объяснить за счет низкой плотности распределении в ТП ксртикофутальшх нейронов, хотя доказательства образования немногочисленных кортикобульбарнш: проекций из ТП имеются Plooter, Joncs, 1984; Porter et el .,1987).

Восстановление локомоции после разрушения моторной коры и трансплантации корковой ткани.

Проведенный количественный анализ параметров локомоции при по-бежках крыо по коридору позволил выявить отклонения от нормы не только в первые дни после операций у крыс с разрушением и с ТП в представительстве задней конечности в моторной коре, когда еще проявляются парез и прихрамывание, но и спустя две недели, когда походка у оперированных щшс Енешне не отличалась от нормы. Через 5 недель параметры локомоции у крыс с разрушением приближаются к таковым у интактных крыо того же возраста, а у крыс с ТП достоверно от них не отличаются. Наиболее интересным и непредсказуемым явилось превышение величин L и Ь у животных с разрушением и, особенно, с ТП через 9 и II недель после операций над уровнем этих параметров у контрольных крыс того же возраста. По-видпмому, в возрасте 3-3,5 мес., когда индивидуальное формирование всех функциональных систем у нормальных крыс завершается, параметры локомоции стабилизируются, что проявляется, в частности, в тенденции к некоторому укорочению L при побежках в интервале от 9 до II недель. Однако у крыо с разрушением в этот период продолжается уве- • личение L , еще сильнее эта тенденция выражена у крыс с ТП. Можно полагать, что на этой фазе процесса восстановления проявляется феномен суперкомпенсации функции, что отражается в возрастании числа степеней свобода в нейроыоторных системах, контролирующих локомоции. В происхождении ранних эффектов важную роль могут играть нейротрсфические и нейроростовне факторы, источниками которых могут быть как глионейральные элементы ТП, так и реактивные астроцитн мозга реципиента (Полежаев,Александрова,1986; Haun et cl. ( 1984 ¡ИагеЬап ^935) # g наших морфологических наблюдениях отмечена фаза ранней (через 1-2 нед. после трансплантации) гипертрофии популяции нейронов хозяина, непосредственно примыкающей к ТП. Это согласуется с сообщениями о трофическом влиянии корковых ТП

на вшивание релейных нейронов специфических ядер таламуса (Haun et оХ.,IS84 ¡Cunningham et al .,1988), Нами также было проведено исследование последствий множественной гнутримозговой нейротранс-плантации при мультифокалышх повреждениях мозга с помощью методики перехода крыс по перекладине. Посла одновременной инъекции корковых ТП в моторную кору в несколько мест на наблюдалось отдаленных негативных воздействий на двигательное поведение животных как при гомотопической, таж и при хетеротопнческой трансплантации. У этой группы крыс выявлена начальная фаза замедления (до 6 нед.) восстановления локомоции, какой не было после множественных разрушений без трансплантации и после локальной одиночной трансплантации. Какой именно фактор лежит в .основе отмеченного эффекта -больший объем повреждения коры реципиента или специфика методики оценки локомоции - предстоит еыяснить в дальнейших исследованиях. Спустя 6 месяцев после операций у всех обследованных крыс ТП имели хорошую сохранность и плавный интерфейс между соседними ТП и Ифужающей корковой тканью реципиента. Успешное приживление гете-ротопичесюос ТП и отсутствие отдаленных негативных воздействий на двигательное поведение животных говорят о возможности использовать корковую ткань из противоположного полушария в качестве донорского материала.

Положительное воздействие корковых ТП на окружающую мозговую ткань, предохранявшее ез от существенных дегенеративных изменений как в зоне повреждения в коре мозга, так и в подкорково-стволовых "партнерах" зоны экстирпации, и возможность множествешгой внутри-мозговой нейротрансплантации при мультифокалмшх поражениях мозга указывают на потенциальные перспективы метода нейротрансплантации в восстановительной нейрохирургии.

ЖВОДЫ

1. Показана возможность длительного, до двух лет, переживания корковых трансплантатов, взятых из гомолатерального или противоположного полушария мозга новорожденных крко-докоров, в паренхиме фронтальных областей коры мозга крыс-реципиентов.

2. При введении измельченных и тщательно очищенных от соединительнотканных оболочек фрагментов донорской ткани в корковую паренхиму реципиента субдурально наблюдалась малая склонность к формированию соединительнотканного рубца на границе с мозговой тканью реципиента и, как правило, плавный интерфейс с незначительной астроглиальной сегментацией. Отмочена кратко-

временная, около I месяца, фаза гипертрофии нейронов хозяина вокруг трансплантата, не выявленная столь четко вокруг контрольных очагов разрушения коры.

3. По мере увеличения срока перевивания трансплантатов о помощью методов Гольджи и Ниссля проследили рост тел и отростков нейронов внутри трансплантатов, формирование элементов пространственной организации нейронов (гнезда пирамидных клеток, вертикальные колошей, горизонтальные ансамбли), сходные с таковыми в норме. Методами Гольдки и флуоресцентного окрашивания определен этап начального врастания в трансплантат кровеносных сосудов из тканей реципиента на 2-й неделе и показана обильная васкуляризадия трансплантатов спустя 2-3 месяца.

4. Подтверждена способность трансплантатов устанавливать функциональные связи о мозгом реципиента: спустя 3, 6 и II месяцев в трансплантатах регистрировалась фоновая активность нейронов и отиеты на периферические стимулы, икехщие латентше периоды, не отличающиеся от таковых в норке.

5. Рецептивные поля часты нейронов внутри трансплантатов били сходны с характеристиками нейронов в симметричных зонах кооперированного полушария; однако у другой группы нейронов отмечено аномальное для дефинитивной сенсомоторной коры доминирование шеилатералыш: соместезическкх входов над контрла-тералышми.

6. Количественный анализ параметров локомоции у трех групп развивающихся крыс - перенесших трансплантацию корковой ткани шш локальное разрушение в идентичной зоне моторной коры, а также интактных животных (контроль) - показал, что вслед за начальным ухудшением локомоции у всех оперированных крыс на стадии 2-4 недель восстановление параметров локомоции у крыс с трансплантатом шло быстрее, чем у животных с разрушением без трансплантата, а спустя 9-11 недель у оперированных крыс выявлена фаза функциональной сунерксмпенсации, выраженная у животных с трансплантатом ярче, чем у крыс с разрушением без трансплантата,

7. Б дииамике изменений локомоции у взрослых 1фыс после множественной гомолатеральной трансплантации вслед за мультирока-лышми разрушениями моторной коры выявлена начальная фаза

(6 недель) замедления'восстановления локомоции у крыс с трансплантатами. Дальнейшая нормализация локомоции протека-

ла плавно я спустя 3,5 месяца походка крыс с трансплантатами или после аналогичных разрушений кори без трансплантатов шеина не отличалась от таковой у конаролышх животных, однако тестирование переходов крыо по перекладине показало неполное восстановление двигательной функции - 10$ срывов и промахов конечностей па стороне, коитрлатеральной зоне разрушений и трансплантации.

8; Успешное прияивленио гомотопических и гетеротопических трансплантатов и отсутствие отдалешнх негативных последствий на двигательное поведешю взрослых 1фыс говорят о возможности использовать корковую ткань из противоположного полушария в качестве донорского материала при множественной трансплантации после мультифокалышх иораяений мозга, что может являться перспективой метода нейротрансплантации в восстановительной нейрохирургии.

По темо диосертацш опубликованы следующие работы:

1. Новые представления об организации и реорганизации двигательной кори мозга и корижокоторной системы // Матер.ХУ съезда Всесоюз.физиолог.общ., Кишинев,- 1987,- Т.2,- С.254-255 (в соавторстве с Д.Н Дешсовым, И.В.Проничевыл, Т.В.Голиковой, А.Б.Вольновой).

2. Восстановление локомощш после частичной декортикации и гомо-трансшхантащш у белой крыск // Тез.Всесоюз.симпоз. (с меяду-народашм участием) "Трансплантация ткани мозга млекопитающих? Пущино,- 1988,- С.41-42 (в соавторстве с Д.Н.Ленковым).

3. Состояние трансплантата и окружающей корковой ткани сенсомо-торной области неокортекса белых крыс в различные послеоиера-циошшо сроки // Тез.Всесоюз.сшшоз. (с международным участием) "Трансплантация ткани мозга млекопитающих", Пущшо.- 1988. - С.26-27 (в соавторстве о В.Д.ЗЕарскоЗ, Д.Н.Ленковым).

4. Ueocortical grafts end ¡rurroun&ing tissue of sensomotor cortex in аГЫао rata following to grafting // Abstr. of the Second confer. Institute of Dev. Heurosci. end Aging, Satellite 7th Intern. Keeting Intern. Society for Dov. tleuxoaci."Uolecular aspects of dev. and aging of the nervoua system", Athene, Cre-ece.-l988»- P.41 (with D.N.IenJcov, V.D.ZharslcaJa).

5. Изменения параметров локомоции после частичной экстпрпашт моторной коры у белых крыо // йурн.внсш.нерв.даят.- 1989.- Т.39, вып.1.- С.118-127 (в соавторстве с Д.Н.Ленковым).

6. Восстановление лономоции после частичной экстирпаЦии моторной коры и трансплантации корковой ткани у белой крысы // $изкол. яурн.СССР.- 1989.- Т.75,«7.- С.881-889 (в соавторстве с Д.Н. Ленковш).

7. ieculiaritleo of receptive fields of neurons in long-tern neo-eortical grafts // atstr. of the Third conference Institute of Dev. JGeuroaci and Agiiig, Intern. Sympos. "Plasticity ana regeneration of the nervous system", Torino, Italy,- 1290.- P. it

( with D.H.Lenkov, V.D.Zhorskaia).

8.' Системные и клеточные взаимодействия после трансплантации фрагментов коры мозга // Тез.докл.внутргазуз .конф. "Доминантные механизмы поведенческих адаптации", Ленинград,- 1990,- вып.II. - С.4-6 (в соавторстве с Д.Н.Ленковым, В.Д.Карской).

9; Изменения функциональных характеристик нейронов моторной коры крыс при нормальном развитии и в нейротрансплантате // Тез. докл.' III Всесооз.ковф. по нейронаукам, Киев;- 1990.'- С.75-76 (в соавторстве с Д.Н.Лекковым, Т.В.Голиковой).

10.' Восстановление локомоции после двойных разрушений моторной коры и гетеротошкеской трансплантации корковой ткани у белой

• крысы // ffi из иол. яурн .СССР,- 1991,- T.77.1S7.- С. 91-95.

11. Consequences oi multiple leaiona of the motor cortex and heterotopic cortical tranoplenkation in the аГЫпо rat // Abstr. of the Soviet-Indian sympos. on HeurotrensplEntation end Developmental iiourobiology, Puschlno.- 1991.- P.41-42.