Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Секретируемые протеазы некоторых мицелиальных грибов: выделение, очистка и характеристика физико-химических и функциональных свойств

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Секретируемые протеазы некоторых мицелиальных грибов: выделение, очистка и характеристика физико-химических и функциональных свойств"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им М.В.ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

МАТВЕЕВА Анжелика Рафиковна

СЕКРЕТИРУЕМЫЕ ПРОТЕАЗЫ НЕКОТОРЫХ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ: ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ

03 00 24-микология 03 00 04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008

оазгтоэдт

003170947

Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета и в отделе функциональной биохимии биополимеров Научно-исследовательского института физико-химической биологии им А Н Белозерского Московского государственного университета имени М В Ломоносова

Научные руководители

доктор биологических наук Дунаевский Яков Ефимович кандидат биологических наук Белякова Галина Алексеевна

Официальные оппоненты'

доктор биологических наук, профессор Феофилова Елена Петровна доктор химических наук, вне Руденская Галина Николаевна

Ведущая организация.

Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ВНИИФ РАСХН)

Защита диссертации состоится iûА/С'^ 2008 года в 15 30 на заседании диссертационного совета Д 501 001 46 при Биологическом факультете МГУ имени MB Ломоносова по адресу

119992, Москва, Ленинские горы, МГУ имени MB Ломоносова, Биологический факультет (аудитория М-1) Т/факс (495)939-39-70

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени M В Ломоносова

Автореферат разослан ¿О 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

J^jGUe&U*^ м А Гусаковская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Протеолитические ферменты играют исключительно важную роль в регуляции различных биологических процессов на молекулярном, клеточном, тканевом и межорганном уровнях В фундаментальных исследованиях они используются для изучения первичной структуры белков и пептидов, кинетики и специфичности ферментативных реакций, строения активных центров В коммерческих целях применяются в легкой и пищевой промышленности, в медицине и фармакологии (Мосолов, 1971, Rao et а), 1998) Среди внеклеточных протеолитических ферментов микроорганизмов особое место занимают протеиназы, обладающие высокой фибринолитической и антикоагулянтной активностью, что предполагает их высокий терапевтический эффект при лечении тромбоэмболии (Батомункуева, Егоров, 2001, Peng et al, 2005) С участием грибных протеаз можно разрабатывать различные способы рециклизации отходов, оберегая окружающую среду Из-за высокой ферментативной активности ферменты микроорганизмов предпочтительнее при разложении природных соединений (Мюллер, Леффлер, 1995)

Возрастающий интерес к секретируемым протеазам грибов обусловлен также их участием в разнообразных формах патогенеза (St Leger, 1995, Rhodes, 1995, Larcher et al, 1996) Ферменты могут участвовать в грибной инвазии, растворяя участки кутикулы насекомых, состоящей на 70% из белка (Ferron, 1978) Клинические исследования больных кератитом, вызываемым грибами, как Aspergillus funugatus, Candida albicans, Fusarium solam, Pemcillium citreo-viride, показали, что в роговице глаза, в тканях, сыворотке испытуемых увеличивается как количество грибного мицелия, так и количество металлопротеиназ ММР-8 и ММР-9 (Dong et al, 2005, Rohini et al, 2007) Следует также отметить работы по изучению роли секретируемых протеаз Aspergillus fumigatus в патогенезе аспергиллеза человека в которых было показано, что штаммы, продуцирующие сериновую протеиназу субтшгазинового типа, более патогенны для животных, чем непродуцирующие штаммы (Павлюкова и др , 1998) Однако функциональная роль протеиназ в этом процессе до конца не выяснена Предполагается, что протеазы могут участвовать в комплексе с другими ферментами в проникновении патогена внутрь растения-хозяина и обеспечивать его питание (Мосолов, Валуева, 2006), либо быть ответственными за регуляцию других ферментов, синтезируемых организмом Возможно, грибные протеазы непосредственно участвуют в патогенном процессе через взаимодействие со «сторожевым» белком или продуктом гена устойчивости (Biezen, Jones, 1999, Дьяков, 2005)

Цель работы Сравнительное изучение физико-химичских, биохимических и функциональных свойств внеклеточных протеаз некоторых мицелиальных грибов Задачи:

1 Сравнение спектров внеклеточных протеаз на примере различающихся по патогенности мицелиальных грибов родов Fusarium Link и Colletotrichum Corda

2 Выделение и очистка секретируемых протеаз данных грибов

3 Характеристика наиболее представленных (основных) протеаз Fusarium и Colletotrichum

Научная новизна и практическая значимость Проведена работа по подбору жидких сред с целью наибольшего выхода внеклеточной протеолитической активности ферментов у различных мицелиальных грибов При погруженном культивировании видов Fusarium и Colletotrichum на средах с различными добавками показано, что сусло и казеин в большей степени индуцируют секрецию внеклеточных протеаз

Впервые из культуральной жидкости гриба Colletotrichum gloeosporioides (Penz) Penz & Sacc выделена сериновая протеиназа субтилизинового типа Разработан метод получения данного фермента В результате ряда последовательных стадий внеклеточная протеиназа С gloeosporioides была очищена до гомогенного состояния, исследованы ее физико-химические свойства, а также влияние белковых ингибиторов растительного и животного происхождения на очищенный препарат секретируемой протеиназы

Впервые проведено сравнение уровня патогенности с внеклеточной протеолитической активностью у 15 изолятов Fusarium, принадлежащих к 4 видам Показано, что у сильных фитопатогенов преобладает трипсиноподобная активность

Выделены и идентифицированы протеазы, секретируемые Fusarium oxysporum Schlecht Показано, что они относятся к сериновым протеазам семейств субтилизина и химотрипсина Были охарактеризованы некоторые их физико-химические свойства

Полученные данные могут найти практическое применение в разработке новых методов защиты растений от фитопатогенов, для диагностики патогенных микроорганизмов и получения растений, трансформированных генами ингибиторов протеаз, с повышенной устойчивостью к патогенам

Апробация работы Основные положения изложены на Международной конференции «Грибы в природных и антропогенных экосистемах» (Санкт-Петербург, 2005 г), I (IX) Международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006 г), VI Международном симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва 2007 г), XV Международном конгрессе европейских микологов (Санкт-Петербург, 2007 г), а также заседаниях кафедры микологии и альгологии Биологического факультета МГУ

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ Объем и структура работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов, методов и результатов работы, выводов Диссертация изложена на страницах, содержит иллюстрации (рисунки, таблицы) Список литературы включаетисточиика

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Объекты исследования

1 Штамм гриба С gloeosporioides полученный из коллекции культур Института экспериментальной ботаники имени В Ф Купревича HAH Беларуси

2 Грибы рода Fusarium предоставлены ВНИИ фитопатологии Всего было изучено 15 изолятов 8 возбудителей корневой гнили пшеницы F sporotrichoses Sheib (изочяты КР-98-11, КЖ-99-06), F culmorum (W G Sm) Sacc (изоляты Бр-04-53, Бр-03-19), Foxysponim (изоляты КЗ-1701-12, Вор-04-12), F heterosporum Nees & Т Nees (изоляты М-03-36, Вор-04-12), 3 возбудителя корневой гнили ячменя F culmorum (изоляты См-8-06, Рг-14-0б, Бу-1-06), 4 возбудителя фузариоза колоса ржи F culmorum (слабо и силыюпатогенный штаммы с V и IV морфолого-культуральными типами колоний соответственно), F heterosporum (с I морфолого-культуральным типом колоний) и F sporotrichioides (с I морфолого-культуральным типом колоний)

Методы исследования

Поверхностное культивирование проводили на агаризованных средах сусло-агаре, картофельно-морковном агаре, голодном агаре, стандартной среде Чапека, модифицированной среде Чапека, куда вместо неорганического источника азота добавляли казеин в 1 % концентрации

Погруженное культивирование проводили на жидких средах 7,5% сусле, среде Чапека и модифицированной среде Чапека с добавлением казеина, желатины или гидролизата казеина в конечной концентрации 1% Для получения кривых роста мицелий отбирали через определенные промежутки времени и отфильтровывали на водоструйном насосе на воронке Бюхнера Затем мицелий высушивали при температуре 85°С до постоянной массы и взвешивали В качестве источника секретируемых протеолитических ферментов использовали культуральную жидкость качалочной культуры

Препараты с мицелием просматривали на световом микроскопе и микроскопе Zeiss Axioskop 40 FL с цифровой камерой Axiocam MRc Фотографии обрабатывали в программе Axiovision 3 1

Определения патогенности гриба изучали 2 способами по влиянию споровой суспензии на проростки 5 сортов ржи, 5 сортов пшеницы и 3 сортов ячменя Первый способ - метод Овсянкиной и Коваленко (2004 г ) Во втором случае зерна помещали по 30 штук на полоски влажной фильтровальной бумаги и инокулировали споровой суспензией гриба, затем зараженные семена накрывали полиэтиленовой пленкой и заворачивали вместе с фильтровальной бумагой в рулоны Рулоны помещали в сосуды с дистиллированной водой на 10 дней За контроль принимали семена, не обработанные споровой суспензией гриба

Секретируемые протеолитические активности определяли с помощью метода Эрлангера с соавторами (Erlanger et al, 1961), используя 20мМ синтетические пара-нитроанилидные субстраты Bz-Arg-pNa, Ac-Leu-pNa, Cp-Phe-pNa, Glp-Phe-pNa, Z-Ala-Phe-Arg-pNa, ABZ-Ala-Ala-Leu-pNa, Glp-Ala-Ala-Leu-pNa, Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa, L-Tyr-pNa, L-Leu-pNa, а также с помощью метода тринитрофенилирования ( Habeeb, 1966) За единицу ферментативной активности принимали такое количество фермента в культуральной жидкости, которое при гидролизе субстрата в указанных условиях инкубации вызывает увеличение оптической плотности раствора на 0,01

Общую активность определяли в единицах ферментативной активности (ед ) Активность на мицелий - в единицах активности на сухой вес мицелия (ед /г сух мицелия) Удельную активность в единицах активности на г белка (ед /г белка)

Для определения оптимума рН и рН стабильности использовали 0,2 M буферы в диапазоне рН от 3,3 до 12,2

Температурный оптимум фермента определяли, измеряя активность фермента при температурах от 4°С до 80°С

Ионообменную хроматографию проводили на DEAE Sephadex А-50 (batch-процедура) и на колонке Mono Q (FPLC), уравновешенной 0,0Ш фосфатным буфером рН 7 0 при скорости 1 мл/мин

Фракционирование и определение молекулярной массы протеиназы проводили методом гель-фильтрации на колонках Superóse-12 HR 10/30 и Superdex-75 10/30 (FPLC)

В работе использовали следующие ингибиторы этилендиаминтетраацетат Na (ЭДТА), о-фенантролин, йодацетамид, Е-64, фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), Ы-тозил-Ь-лизин-хлорметилкетон (TJIXK), Ы-тозил-Ь-фенилаланин-хлорметилкетон (ТФХК), а также различные белковые ингибиторы

При обработке всех экспериментальных данных рассчитывали средние значения и значения стандартного отклонения Все эксперименты проводились не менее чем в трех повторностях

Результаты и обсуждения

Изучение роста колоний Fusarium и С. gloeosporioides на твердых средах. С целью описания морфологии колоний и характера роста культур, грибы выращивали на различных твердых средах.

Как видно из рис. 1 наилучший рост на твердых средах на 6 день культивирования наблюдался на сусло-агаре и картофельно-морковном агаре. 90

.SP

f У / / «г

У///.//.'

J1 ^ с/ <f

5?

У << << / / р> ¡ji

Рис.1 Диаметр колоний изолятов Fusarium на различных твердых средах на 6 день культивирования.

с - сусло-агар, кма - картофельно-морковный агар, мч - модифицированная среда Чапека, ч -среда Чапека, га - голодный агар

Изоляты характеризовались обильным ростом мицелия, в том числе воздушного, происходило образование большого количества репродуктивных структур: макро- и микроконидий, а так же хламидоспор (рис. 2).

Рис. 2. Мицелий, макроконидии (а) и хламидоспоры (б) ржаной формы F.helerosporam, выращенной на среде сусло-агар.

На модифицированной среде Чапека рост колонии был несколько замедлен по сравнению со стандартной средой Чапека, что связано с использованием различных источников азота в этих средах. В первом случае - это органический источник - казеин, для его использования в своем метаболизме грибу требуется выработка специфических ферментов, в частности, протеаз, соответственно и рост мицелия происходит медленнее. Во втором - минеральный - нитрат натрия, он более доступен и быстрее метаболизируется. Диаметр колонии на голодном агаре превышал в большинстве случаев рост на стандартной и модифицированной средах Чапека. Сам по себе голодный агар является средой с минимальным содержанием питательных веществ, и из-за их недостатка гифы распространялись на большую длину, но были тонкие, бесцветные, на них отсутствовали репродуктивные структуры, плотность колоний также была очень низкая.

Рост колоний гриба С. gloeosporioides происходит гораздо медленнее, чем Fusarium, они заполняют полностью чашки Петри к 15-17 дню культивирования (рис. 3). Наиболее хороший и быстрый рост наблюдали на сусле. На обеих средах Чапека колонии образовывали плотный подушковидный воздушный мицелий серо-белого цвета. На среде Чапека с добавлением казеина в отличие от Fusarium, С. gloeosporioides рос быстрее, чем на стандартном Чапеке, достигая 65 мм в диаметре на 15 день. При микроскопировании наблюдалось много спор и темноокрашенных, иногда утолщенных гиф (рис. 4).

—* □ ; ±. сутки роста

-1

Рис. 3. Кривая роста С. gloeospor¡oides на твердых средах.

с - сусло-агар, мч - модифицированная среда Чапека с казеином, ч - среда Чапека, га -голодный агар

Рис. 4 Конидии (а) и темноокрашенные гифы (б) С. gloeosporioides, на модифицированной среде Чапека

J

Изучение роста колоний Fusarium и С. zloeosporioides при погруженном культивировании. С целью подбора среды для наилучшего выхода внеклеточной протеолитической активности и изучения характера роста грибов, их культивировали в различных жидких средах.

В случае с Fusarium рост массы мицелия на сусле по сравнению с модифицированной средой Чапека был в большинстве случаев более значимым (рис. 5). Однако у всех изолятов вида F.oxyspomm и у 3-х изолятов F.culmorum масса сухого мицелия на модифицированной среде Чапека превышала таковую на сусле. Следует отметить, что у всех исследуемых | изолятов наличие белковых добавок в среде стимулировало накопление биомассы по ( сравнению со стандартной средой Чапека. В культуре достаточно быстро образовывались многочисленные мелкие пеллеты, что свидетельствовало о хорошем развитии гриба.

L

Рис. 5. Масса мицелия 4-х видов Fusarium, выращенных в погруженной культуре в течение 8 дней.

с - сусло, мч - модифицированная среда Чапека, гк - модифицированная среда Чапека с гидролизатом казеина, ж - модифицированная среда Чапека с желатиной, ч - среда Чапека

Изменение массы сухого мицелия С. gloeosporioides на 15 сутки культивирования на 3-х различных средах отражено на рис. 6. Как видно из рисунка, наилучший рост биомассы наблюдался на модифицированной среде Чапека, затем на сусле и стандартной среде Чапека

модифицированная среда Чапека с казеином

Рис. 6. Масса мицелия С. °1оео5ропо'^е5 на 15 день культивирования в погруженной культуре.

Из полученных результатов видно, что, как на твердой среде, так и при глубинном культивировании, модифицированная среда Чапека с казеином, как и сусло, была оптимальна для роста грибов. Следует отметить, что среда Чапека с казеином весьма удобна в исследовательских работах, так как позволяет четко контролировать влияние отдельных компонентов среды на рост гриба и секрецию внеклеточных ферментов.

Изучение секреции внеклеточной протеолитической активности. Протеолитические ферменты мицелиальных грибов многообразны и относятся к разным группам. Для их обнаружения в культуральной жидкости использовали как белковые (азоказеин), так и синтетические пара-нитроанилидные субстраты. По азоказеину определяли общую (неспецифическую) протеолитическую активность. При поиске специфических активностей были использованы специальные амино- и эндопептидазные субстраты. Среди наиболее представленных эндопептидаз в спектрах внеклеточных ферментов различных видов мицелиальных грибов можно выделить две протеиназы, а именно: активную по субстрату GIp-AIa-Aia-Leu-pNa и активную по субстрату Bz-Arg-pNa. На основании физико-химических свойств, субстратной специфичности и данных ингибиторного анализа эти ферменты могут рассматриваться, соответственно, как субтилизиноподобная и трипсиноподобная протеиназы. Сравнительное изучение секреции внеклеточной протеолитической активности у изолятов Fusarium на разных жидких средах по субстратам GIp-Ala-AIa-Leu-pNa и Bz-Arg-pNa приведено на рисунках 7 и 8.

О? ^

Рис. 7. Активность внеклеточных протеиназ у разных изолятов Fusarium по Glp-AIa-Ala-Leu-pNa рассчитанная на г сухого мицелия.

с - сусло, мч - модифицированная среда Чапека, гк - модифицированная среда Чапека с гидролизатом казеина, ж - модифицированная среда Чапека с желатиной, ч - среда Чапека

Рис. 8. Активность внеклеточных протеиназ у разных изолятов Fusarium по Bz-Arg-pNa, рассчитанная на г сухого мицелия.

с - сусло, мч - модифицированная среда Чапека, гк - модифицированная среда Чапека с гидролизатом казеина, ж - модифицированная среда Чапека с желатиной, ч - среда Чапека

Как видно из обоих рисунков, наилучший выход протеаз у всех изученных изолятов наблюдался на сусле и модифицированной среде Чапека с казеином.

У С. gloeosporioides заметной активности по Bz-Arg-pNa выявлено не было, однако по субстрату Glp-Ala-Ala-Leu-pNa секреция на модифицированной среде Чапека превышала таковую на сусле (рис. 9).

J

т

¡¡¡рр ¡¡я

модифицированная среда Чапека с казеином

Рис. 9. Активность внеклеточных протеиназ С. gloeosporioides по субстрату Glp-Ala-Ala-Leu-pNa

Следует отметить, что у всех исследуемых изолятов наличие белковых добавок в среде не только стимулировало накопление биомассы по сравнению со стандартной средой Чапека, но и увеличивало уровень секреции ферментов Сусло, являясь поликомпонентной средой, не позволяет определить влияние отдельных ее составляющих на секрецию протеолитических ферментов Поэтому для дальнейшей работы по изучению секреции протеаз в основном использовалась модифицированная среда Чапека

Сравнение патогенности грибов и уровня внеклеточной ппотеолитической активности При сравнении сапротрофных видов мицелиальных грибов с фитопатогенными была выявлена характерная особенность - появление у фитопатогенов дополнительно к субтилизиноподобной новой трипсиноподобной активности, отсутствующей у сапротрофов (Дунаевский, 1996) Характерным различием между двумя этими протеолитическими активностями было их отношение к наличию в среде белкового субстрата Если появление трипсиноподобной протеиназы в культуралыюй жидкости индуцировалось присутствием в среде белка, причем в довольно больших количествах (1%), то заметный базовый уровень активности субтилизиноподобной протеиназы в среде часто определялся и в отсутствие белкового субстрата Возможно, что субтилизиноподобная протеиназа, появляясь первой, обеспечивает условия, необходимые для последующего действия трипсиноподобной протеиназы, в частности, облегчает ее проникновение в растительную ткань На основании анализа спектров внеклеточных протеаз мицелиальных грибов, различающихся типом питания можно высказать предположение о связи трипсиноподобной протеиназы с патогенным процессом

Для выяснения вопроса о существовании связи между степенью патогенности гриба и уровнем активности секретируемой трипсиноподобной протеиназы, проводили сравнение разных видов Ршагшт, различающихся степенью патогенности У Т7 ьрогои кЫо^еь и Ие!его5ротт, ржаной и пшеничной форм, была обнаружена четкая корреляция активности с патогенностью, те более патогенный 5рою1г1сНю1с1е5 давал заметно большую

внеклеточную трипсиноподобную активность, чем менее патогенный вид /<" Ье1егоь.рогит (рис 10) Эта тенденция сохранялась при расчете активности на сухой вес мицелия, что, возможно, указывает на целенаправленный синтез и секрецию внеклеточной трипсиноподобной протеиназы у видов с более высоким уровнем патогенности

F.heterosporum, мч F sporotrichioides, мч F heterosporum, ч F.sporotrichioides, ч

Ржаная форма

Рис. 10. Сравнение активностей по Bz-Arg-pNa у двух видов Fusarium, различающихся степенью патогенности.

ч - среда Чапека, мч - модифицированная среда Чапека с казеином

Похожие результаты были получены в ходе предварительных исследований на 2-х изолятах И. си1тогит (слабо- и сильнопатогенном ), выращенных на картофельно-морковном агаре (рис. 11). Активность по Вг-А^-рЫа у сильнопатогенного изолята в 2-3 раза превышала таковую у слабого патогена.

2 з

-сильнопатогенный — слабопатогенный

4 5 6

сутки роста

Рис. 11. Активность, рассчитанная на г сухого мицелия внеклеточных протеиназ по р№ 2-х изолятов Р.си1тогит, выращенных на картофельно-морковном агаре.

Однако эта тенденция не всегда сохранялась. Два изолята К охузропт из 8 возбудителей корневой гнили пшеницы оказались наиболее хорошими продуцентами трипсиноподобной активности, но при этом не самыми сильными патогенами (рис. 12).

сутки роста

- F oxysporum Вор 04-12 -F culmorum Бр 03-19

•F sporotrichioides КЖ 99 06 -F heterosporum М 03 36

а)

350 300

=г s

I 250

о

4 200 0) ja

5 150

0

1 ш

| 100 <

50 0

123456789

сутки роста

■ F oxysporum КЗ 1701-12 —♦ -F sporotrichioides KP 98 11

* F culmorum Бр 04 53 • F heterosporum Вор 04 12

б)

Рис 12 а-б Активность, рассчитанная на г сухого мицелия, внеклеточных протеаз пшеничных изолятов Fusarium по Bz-Arg-pNa на модифицированной среде Чапека с казеином

Это может быть связано с тем, что не всегда используемые тест-системы для выявления патогенности (количество проросших семян и время их прорастания, длина корней проростков) объективно оценивают ее у отдельных видов грибов Так, если сравнение патогенности ржаной формы двух вышеуказанных видов F spoiolrichioides и F heterosporum, выявило полное совпадение результатов в 2-х тест-системах, то сравнение патогенности пшеничных форм Fusarium показало незначительные различия между видами при тестировании прорастания семян и заметную разницу при измерении длины корней проростков Возможно, что используемое в наших исследованиях определение патогенности не связано напрямую с величиной внеклеточной активности протеиназ, и следует подобрать более удобную и показательную тест-систему

Интересно отметить, что и у ксилотрофов определяющим для функционирования внеклеточной трипсиноподобной протеиназы является наличие живой ткани растений-

хозяев Эта активность присутствовала у вешенки устричной Postreatus, способной развиваться на живых деревьях, но практически полностью отсутствовала у вешенки легочной Р pulmonal ms (Fr) Quel, живущей на отмершей древесине (Барсукова и др, 1989)

Выделение, очистка и характеристика свойств наиболее представленных ферментов изученных грибов Предварительное исследование показало, что среди разнообразных протеаз С §1оео5роно1с!ез в значительном количестве секретировался фермент, активный по синтетическому субстрату С1р-А1а-А1а-Ьеи-рМа Инфекция С gloeosporю^des представляет собой многофакторный процесс и одним из факторов, определяющим его патогенность, могут быть гидролазы, секретируемые грибом и обеспечивающие его проникновение в ткани растений-хозяев Одна из таких гидролаз внеклеточная протеиназа С g\oeosporюides была очищена в 203 раза с выходом 5% (табл 1)

Таблица 1 Последовательная очистка протеиназы С gloeosporioides

Стадии очистки Количество белка, мг Удельная активность, ед /мг белка Общая активность, ед Степень очистки Выход, %

Исходный препарат после осаждения сульфатом аммония 194 33,7 6540 1 100

Хроматография на DEAE Sephadex А-50 (batch-процедура) 61,6 147 9045 4,36 138

Концентрирование на ячейке Amicon 19,6 253 4964 7,5 75,9

Ионообменная хроматография на Mono Q 0,048 6843 328,5 203 5

Типичная хромотограмма очистки протеиназы С gloeosporioides на колонке Mono Q представлена на рисунке 13, фракции 23-26, соответствующие интересующему нас ферменту, были собраны и использованы для дальнейшего анализа

Чистоту выделенного фермента оценивали с помощью электрофореза в ПААГ* в неденатурирующих и денатурирующих условиях, а также постэлектрофоретическим определением его активности на желатине, сополимеризованной с ПААГ Во всех случаях очищенная фракция давала только одну полосу, подвижность которой при электрофорезе в ПААГ в денатурирующих условиях совпадала с полосой активности исследуемого *полиакриламидный гель

фермента, определяемой непосредственно в геле после завершения -электрофореза (рис. 14). Молекулярная масса протеиназы составляла 54 кДа.

0,20

0,15

£ 0,10

0,05

0,00

- • ч

• • •

* u'i . * •

1,0 0,9 0,8

0,7 ^ 0,6 о

я Z

0,5 J

0,4 |

о

0,3 х о íj¿ 0,2

0,1

10 20 30

Номера фракций

J 0.0 60

0,25

0,20

0,15 3

0,10 !

0,05

0,00

Рис 13. Профиль элюции внеклеточной протеиназы С. Gloeosporíoides, активной по по субстрату Glp-Ala-Ala-Leu-pNa, при ионообменной хроматографии на Mono Q. / - белок Airo, 2 - активность, i - концентрация NaCl.

96 кДа 66 кДа

14 гД а

12 3 4

Рис. 14. Электрофореграммы очищенной внеклеточной протеиназы С.^/оео^ог/'о/й'ет. Стрелками показаны полосы исследуемого фермента.

1 - зимограмма в ПААГ, содержавшем 0,026% желатины

2 - ПААГ в присутствии додецилсульфата №

3 - белки-маркеры

4 - ПААГ в отсутствие додецилсульфата Ыа

Исследованные свойства очищенного фермента, такие как субстратная специфичность, восприимчивость к действию белковых ингибиторов, а также проведенный ингибиторный анализ позволили заключить, что выделенная протеиназа относится к сериновым протеиназам семейства субтилизинов

Очищенный фермент активно гидролизовал разнообразные белки, среди которых следует отметить белки клеточной стенки растений маша и пшеницы (табл 3) Гидролиз белков клеточной стенки позволяет грибу решить двуединую задачу обеспечить свое питание азотистыми соединениями и облегчить проникновение грибных гиф в клетки растения-хозяина

Таблица 3 Гидролиз белковых субстратов очищенной протеиназой С gloeosporюldes

Белковые субстраты Активность, ед Удельная активность, ед/г белка

Глобулины пшеницы 2,3 57,5

Глобулины гречихи 2,5 62,5

Альбумины пшеницы 6,66 166,5

Альбумины гречихи 5,16 129

Белки клеточных стенок Маш 18,4 460

Пшеница 8,2 205

Желатин 7,5 187,5

Казеин 8,33 207,5

У С gloeospoпoldes активность по Вг-А^-рЫа имела небольшую величину, тогда как Т7 охухрогит секретировал ее в достаточно больших количествах

С целью сравнения наиболее представленных протеаз секретируемых данными видами проводили частичную очистку и характеристику ферментов из Б охуярогит Вор-04-12 Посредством гель-фильтрации удалось разделить трипсиноподобную (активную по Вг-А^-р№) и субтилизиноподобную (активную по 01р-А1а-А1а-Ьеи-рКа) активности Измерив объем выхода исследуемых протеиназ и используя полученную калибровочную кривую, определили, что исследуемые ферменты имеют молекулярную массу 28 кДа и 630 кДа Из данных ингибиторного анализа видно, что активность протеиназы, определяемой по С1р-А1а-А1а-Ьеи-р№, ингибируется практически полностью только ФМСФ и слабо ингибируется Е-64 Протеаза, активная по субстрату Вг-Аг§-рЫа, ингибируется как ФМСФ, так и ТЛФК (табл 4)

Ингибиторы Концентрация, мМ Ингибирование, %

28 кДа 630 кДа

Для сериновых протеиназ ФМСФ (общий) 10 1 60 93

104 48 90

ТХФК (для химотрипсинодобных) 10"3 8 8

ТЛХК (для трипсиноподобных) 103 76 3

Для цистеиновых протеиназ Е-64 ю4 5 18

Для металло-протеиназ ЭДТА ю1 1 7

о-фенантролин 102 0 8

На основании данных субстратной специфичности и ингибиторного анализа можно сделать вывод, что оба исследуемых фермента относятся к классу сериновых протеаз, а именно фермент массой 28 кДа является трипсиноподобной протеиназой, а протеаза массой 630 кДа - субтилизиноподобной протеазой

Довольно заметное ингибирование субтилизиноподобного фермента ингибитором цистеиновых протеиназ и небольшая активация ферментов активатором 8Н-групп дитиотреитолом (34%) могут указывать либо на присутствие ЭН-групп вблизи активного центра, модификация которых в некоторой степени влияет на активность, либо на присутствие в полученных препаратах небольшой примеси цистеиновой протеиназы Изученные протеазы, как и в случае с ферментом С gloeospol lOldes, гидролизовалн различные белки (желатин, азоказеин), а также белковые фракции однодольных и двудольных растений альбумины и глобулины пшеницы, ржи, гречихи и белки клеточных стенок маша и пшеницы

Некоторые общие свойства полученных протеиназ приведены в таблице 5 Следует обратить внимание на необычайно большую молекулярную массу субтилизиноподобного фермента, что, в целом, не характерно для внеклеточных протеиназ Возможно, такая большая молекулярная масса объясняется агрегацией исследуемого фермента с каким-либо компонентом среды в процессе культивирования и выделения

Таблица 5 Сравнение свойств протеаз, полученных \аР охуьрогит и С $1оео5ропо1с1ез

Протеаза из С gloeosponoldes, активная по 01р-А1а-А1а-Ьеи-р1Ча Протеаза из Р охуврогит, активная по Вг-Аг£-р№ Протеаза из Р охузрогит, активная по Ир-А1а-А1а-Ьеи-р№

Молекулярная масса, кДа 54 28 630

Оптимум рН 9,0-10,0 8,7-9,7 9,0-11,0

рН стабильность 6,0-11,5 4,2 - 12,2 5,4-12,2

Температурная стабильность, °С до 55 до 55 до 55

Выделенные ферменты обладают достаточно широким диапазоном рН стабильности их оптимум рН находится в щелочной области Все протеазы стабильны до 55° Некоторые различия в физико-химических свойствах дополняют четкие различия в активном центре и субстратной специфичности, обнаруженные у главных внеклеточных протеиназ изученных грибов

Таким образом, проведенные исследования показали, что в присутствии белка в среде культивирования у грибов наблюдаются синтез и секреция довольно стабильных, узко специализированных сериновых протеиназ В большинстве случаев - это протеиназы субтилизиноподобного и трипсиноподобного типов, причем в паре сильный патоген - слабый патоген величина трипсиноподобной активности может являеться показателем степени патогенностн гриба На основании полученных и литературных данных, можно предположить, что трипсиноподобные протеиназы, представленные в значительных количествах только у фитопатогенов, могут играть определенную роль в патогенном процессе у грибов, в то время как субтилизиноподобные ферменты, характерные для большинства видов грибов, используются при решении более общих задач, например, обеспечение гриба доступными азотистыми соединениями

выводы

Как для Fusarium, так и для С gloeospoiloides наличие белковых добавок в твердых и жидких средах не только стимулировало накопление биомассы по сравнению со стандартной средой Чапека, но и увеличивало уровень секреции ферментов Идентифицирована и очищена до гомогенного состояния основная протеиназа гриба-возбудителя антракноза С gloeosporiotdes Степень очистки составляет 203 раза и выход 5%

Исследованы физико-химические свойства и субстратная специфичность данной протеиназы Исследуемая протеиназа относится к сериновым протеазам и принадлежит семейству субтилизина

Выделены и охарактеризованы секретируемые ферменты из F oxxspomm Эти ферменты относятся к сериновым протеазам семейств химотрипсина и субтилизина Обнаружено, что уровень продукции внеклеточных протеиназ Fusarium зависит от степени патогенности гриба У сильных фитопатогенов Fusarium значительно преобладает трипсиноподобная активность Специфичность ее действия, время появления и наличие могут указывать на ее особую роль в процессе патогенеза

Список работ, опубликованных по теме диссертаци Матвеева А Р. Изучение влияния различных углеводов на секрецию внеклеточных протеолитических ферментов гриба Allernaria alternata (Fr) Keissler // Микочогия и альгология - 2004 Материалы юбилейной конференции, посвященной 85-летию кафедры микологии и альгологии МГУ им MB Ломоносова - Москва, 2004, с 91-92 Домаш В И , Белозерский М А , Дунаевский Я Е , Цыбина Т А, Матвеева А Р , Шарпио Т П , Забрейко С А , Сосновская Т Ф Белковые ингибиторы протеиназ и устойчивость растений к стрессовым условиям // Сахаровские чтения 2004 года экологические проблемы XXI века Материалы международной научной конференции (21-22 мая)-Минск, 2004, с 59-61

Belozersky М А, Matveeva A.R , Belyakova G А , Tsybina Т А , Dunaevsky Ya Е , Proteases and their inhibitors as a model system to study plant-pathogen interactions // Acta Physiol Plant The 14lh FESPB Congress Book of abstracts (23-27 august) - Cracow, Poland, 2004, Vol 26, N 3, p 267-268

Матвеева A P , Дунаевский Я E , Белякова Г A , Белозерский M А Выделение и характеристика главной внеклеточной протеиназы гриба Colletotrichum gloeosporiotdes II Грибы в природных и антропогенных экосистемах Труды международной конференции,

посвященной 100-летию начала работы профессора АС Бондарцева в БИН им В Л Комарова РАН (24-28 апреля) - СПб, 2005, т 1, - с 393-395

5 Матвеева А Р, Дунаевский Я Е, Белякова Г А, Белозерский М А Щелочная внеклеточная протеиназа мицелиапьного гриба Colletotrichum gloeosporioides (Penz) Penz & Sacc // Материалы I ( IX ) международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге (21-26 мая 2006) -СПб Издательство ГЭТУ, 2006, - с 296

6 Дунаевский Я Е , Дун Чжан, Матвеева А.Р, Белякова Г А, Белозерский М А Деградация белковых субстратов ксилотрофными базидиомицетами // Микробиология 2006, Том 75, № 1, с 46-51

7 Дунаевский Я Е , Белякова Г А , Матвеева А Р , Фатхуллина Г Н , Белозерский М А Секретируемые протеиназы мицелиальных грибов как молекулярные маркеры фитопатогенности // Материалы VI симпозиума "Химия протеолитических ферментов"(23-25 апреля) - Москва, 2007, с 28

8 Матвеева А Р, Дунаевский Я Е , Белякова Г А , Домаш В И , Белозерский М А Характеристика внеклеточной протеиназы гриба Colletotrichum gloeosporioides (Penz) Penz & Sacc II Материалы VI симпозиума "Химия протеолитических ферментов"(23-25 апреля) - Москва, 2007, с 73

9 Дунаевский Я Е , Матвеева А.Р , Белякова Г А, Домаш В И , Белозерский М А Внеклеточная щелочная протеаза Colletotrichum gloeosporioides // Биохимия, 2007, Vol 72, No 3, р 424-431

10 Matveev.i AR, Fatkhullina GN, Dunaevsky YaE, Belyakova GA Belozersky MA The connection between secreted proteolytic activity and pathogenicity of fingí // XV Congress of European Mycologists Saint Petersburg, Russia, September 16-21, 2007 Abstracts - St Petersburg TREEART LLC, 2007, - p 259-260

11 Дунаевский Я E , Белякова Г A , Матвеева A P , Домаш В И, Белозерский М А Ингибиторы протеиназ растений в условиях стресса // Материалы V международной научной конференции (28-30 ноября) - Минск ИООО «Право и экономика», 2007, с 61

12 Дунаевский ЯЕ, Матвеева АР, Фатхуллина ГН, Белякова ГА, Белозерский МА ™ ах грибов как участники процесса патогенеза //

Заказ № 166/03/08 Подписано в печать 24 03 2008 Тираж 100 зкз Уел пл 1,25

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 ¡1 \v\yw с/г ги , е-тш1 т/о@с/г т

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Матвеева, Анжелика Рафиковна

Список сокращений

Введение

Глава 1 Литературный обзор

1.1 Свойства и классификация протеолитических ферментов

1.1.1 Сериновые протеиназы

1.1.2 Аспартильные протеиназы

1.1.3 Металлопротеиназы

1.1.4 Цистеиновые протеиназы

1.2 Влияние условий культивирования на секрецию протеаз

1.3 Грибы рода Colletotrichum 19 , , 1.3.1 Антракноз, вызываемый представителями рода Colletotrichum

1.3.2 Микогербицидная активность некоторых видов рода Colletotrichum

1.4 Роль секретируемых протеаз патогенных грибов в инфекционном процессе

1.4.1 Участие секретируемых протеиназ патогенных грибов в инфекционном процессе у животных и человека

1.4.2 Участие секретируемых протеиназ патогенных грибов в инфекционном процессе у растений.

1.5 Использование протеаз

1.6 Выделение протеаз

Глава 2 Материалы и методы

Глава 3 Результаты и обсуждение

3.1 Изучение роста колоний грибов Fusarium и С. gloeosporioides на твердых средах и в погруженной культуре

3.1.1 Изучение роста колоний Fusarium на твердых средах

3.1.1.1 Рост изолятов F.sporotrichioides на твердых средах

3.1.1.2 Рост изолятов F.heterosporum на твердых средах

3.1.1.3 Рост изолятов F.oxysporum на твердых средах

3.1.1.4 Рост изолятов F.culmorum на твердых средах.

3.1.2 Изучение роста колоний С. gloeosporioides на твердых средах.

3.1.3 Изучение роста колоний Fusarium и С. gloeosporioides при погруженном культивировании

3.2 Изучение секреции внеклеточной протеолитической активности в погруженной культуре у изолятов Fusarium и С. gloeosporioides

3.3 Сравнение патогенности грибов рода Fusarium и уровня внеклеточной протеолитической активности

3.4 Выделение, очистка и характеристика свойств наиболее представленных ферментов изученных грибов

3.4.1 Выделение протеиназы С. gloeosporioides из культуральной жидкости

3.4.2 Выделение ферментов F.oxysporum из культуральной жидкости 84 Выводы 90 Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БСА - бычий сывороточный альбумин ДЦС (SDS) - додецилсульфат натрия

Е-64 - L-транс эпоксисукцинил-лейциламидо (4-гуанидино) бутан

MKT- морфолого-культуральный тип

ПААГ - полиакриламидный гель

TJIXK (TLCK) -тозил-Ь-л изин хлорметил кетон

ТФХК (ТРСК) - тозил-Ь-фенилаланин хлорметилкетон

ТНБС - тринитробензолсульфокислота

ФМСФ (PMSF) - фенилметилсульфонилфторид

ЭДТА (EDTA) - этилендиаминтетрауксусная кислота

DTT - дитиотреитол

ABZ-Ala-Ala-Leu-pNa - о-аминобензоил-аланил- аланил-лейцин-я-нитроаниалид

Ac-Leu-pNa - 1Ч-ацетил-Ь-лейцил-я -нитроанилид

ВТЕЕ - М-бензоил-Ь-тирозин этилвый эфир

Bz-Arg-pNa -N -бензоил-БЬ-аргинин-я-нитроанилид

Cp-Phe-pNa - М-(3-карбокси-пропионил)-Ь-фенилаланил-п-нитроанилид

DFP - диизопропилфторфосфат

IAA - йодацетамид

Glp-Ala-Ala-Leu-pNa - пироглютамил-аланил- аланил-лейцин-я-нитроаниалид

Glp-Phe-pNa - пироглютамил-фенилаланин-я-нитроанилид

L-Leu-pNa - L-лейцил-я-нитроанилид

L-Tyr-pNa - - L-тирозил-я-нитроанилид

ММР-матриксная металлопротеиназа рСМВ - w-хлормеркурийбензоат

Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa -N-сукцинил-аланил-аланил-пролил-фенилаланил-я-нитроанилид Z-Ala-Phe-Arg-pNa - N-карбобензокси-аланил- фенилаланил -аргинин-я-нитроанилид

Введение Диссертация по биологии, на тему "Секретируемые протеазы некоторых мицелиальных грибов: выделение, очистка и характеристика физико-химических и функциональных свойств"

Актуальность темы. Протеолитические ферменты играют исключительно важную роль в регуляции различных биологических процессов на молекулярном, клеточном, тканевом и межорганном уровнях. В фундаментальных исследованиях они используются для изучения первичной структуры белков и пептидов, кинетики и специфичности ферментативных реакций, строения активных центров. В коммерческих целях применяются в легкой и пищевой промышленности, в медицине и фармакологии (Мосолов, 1971; Rao et al., 1998). Среди внеклеточных протеолитических ферментов микроорганизмов особое место занимают протеиназы, обладающие высокой фибринолитической и антикоагулянтной активностью, что предполагает их высокий терапевтический эффект при лечении тромбоэмболии (Батомункуева, Егоров, 2001; Peng et al., 2005). С участием грибных протеаз можно разрабатывать различные способы рециклизации отходов, оберегая окружающую среду. Из-за высокой ферментативной активности ферменты микроорганизмов предпочтительнее при разложении природных соединений (Мюллер, Лёффлер, 1995).

Возрастающий интерес к секретируемым протеазам грибов обусловлен также их участием в разнообразных формах патогенеза (St. Leger, 1995; Rhodes, 1995; Larcher et al., 1992). Ферменты могут участвовать в грибной инвазии, растворяя участки кутикулы насекомых, состоящей на 70% из белка (Ferron, 1978). Клинические исследования больных кератитом, вызываемым грибами, как Aspergillus fumigatus Fresen, Candida albicans (C.P. Robin) Berkhout, Fusarium solani (Mart.) Sacc., Pénicillium citreoviride Biourge, показали, что в роговице глаза, в тканях, сыворотке испытуемых увеличивается как количество грибного мицелия, так и количество металлопротеиназ ММР-8 и ММР-9 (Dong et al., 2005; Rohini et al., 2007). Следует также отметить работы по изучению роли секретируемых протеаз А. fiimigatus в патогенезе аспергиллеза человека, в которых было показано, что штаммы, продуцирующие сериновую протеиназу субтилизинового типа, более патогенны для животных, чем непродуцирующие штаммы (Павлюкова и др., 1998). Однако функциональная роль протеиназ в этом процессе до конца, не выяснена. Предполагается, что протеазы могут участвовать в комплексе с другими ферментами в проникновении патогена внутрь растения-хозяина и обеспечивать его питание (Мосолов, Валуева, 2006), либо быть ответственными за регуляцию других ферментов, синтезируемых организмом. Возможно, грибные протеазы непосредственно участвуют в патогенном процессе через взаимодействие со «сторожевым» белком или продуктом гена устойчивости (Biezen, Jones, 1999; Дьяков, 2005).

Цель работы: Сравнительное изучение физико-химичских, биохимических и функциональных свойств внеклеточных протеаз некоторых мицелиальных грибов Задачи:

1. Сравнение спектров внеклеточных протеаз на примере различающихся по патогенности мицелиальных грибов родов Fusarium Link и Colletotrichum Corda

2. Выделение и очистка секретируемых протеаз данных грибов

3. Характеристика наиболее представленных (основных) протеаз Fusarium> и Colletotrichum.

Научная новизна и практическая значимость. Проведена работа по подбору жидких сред с целью наибольшего выхода внеклеточной протеолитической активности ферментов у различных мицелиальных грибов. При погруженном культивировании видов Fusarium и Colletotrichum на средах с различными добавками показано, что сусло и казеин в большей степени индуцируют секрецию внеклеточных протеаз.

Впервые из культуральной жидкости гриба Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz & Sacc выделена сериновая протеиназа субтилизинового типа. Разработан метод получения данного фермента. В результате ряда последовательных стадий внеклеточная протеиназа С. gloeosporioides была очищена до гомогенного состояния, исследованы её физико-химические свойства, а также влияние белковых ингибиторов растительного и животного происхождения на очищенный препарат секретируемой протеиназы.

Впервые проведено сравнение уровня патогенности с внеклеточной протеолитической активностью у 15 изолятов Fusarium, принадлежащих к 4 видам. Показано, что у сильных фитопатогенов преобладает трипсиноподобная активность.Выделены и идентифицированы протеазы, секретируемые Fusarium oxysporum Schlecht. Показано, что они относятся к сериновым протеазам семейств субтилизина и химотрипсина. Были охарактеризованы некоторые их физико-химические свойства.

Полученные данные могут найти практическое применение в разработке новых методов защиты растений от фитопатогенов, для диагностики патогенных микроорганизмов и получения растений, трансформированных генами ингибиторов протеаз, с повышенной устойчивостью к патогенам.

Заключение Диссертация по теме "Микология", Матвеева, Анжелика Рафиковна

ВЫВОДЫ

1. Показано как для Fusarium, так и для С. gloeosporioides, что наличие белковых добавок в среде не только стимулировало накопление биомассы по сравнению со стандартной ¡средой Чапека, но и увеличивало уровень секреции ферментов. Как на твердой среде, так и при глубинном культивировании модифицированная среда Чапека с казеином обеспечивает грибы всеми необходимыми компонентами для эффективного роста.

2. Идентифицирована и очищена до гомогенного состояния основная протеиназа гриба-возбудителя антракноза С. gloeosporioides. Степень очистки составляет 203 раза и выход 5%.

3. Исследованы физико-химические свойства и субстратная специфичность данной протеиназы. На основании данных ингибиторного анализа и субстратной специфичности сделан вывод, что исследуемая протеиназа относится к сериновым протеазам и принадлежит семейству субтилизина.

4. Обнаружено, что уровень продукции внеклеточных протеиназ Fusarium зависит от степени патогенности гриба. У сильных фитопатогенов Fusarium значительно преобладает трипсиноподобная активность. Специфичность ее действия, время появления и наличие могут указывать на особую ее роль в процессе патогенеза.

5. Выделены и охарактеризованы секретируемые ферменты из F.oxysporum. Показано, что эти ферменты относятся к сериновым протеазам семейств химотрипсина и субтилизина.

Выражаю благодарность моим научным руководителям: Якову Ефимовичу Дунаевскому и Галине Алексеевне Беляковой за помощь в подготовке диссертационной работы и осмыслении результатов; Биланенко Елене Николаевне за помощь при определении принадлежности гриба Colletotrichum gloeosporioides\ всем сотрудникам кафедры микологии и альгологии Биологического факультета МГУ за поддержку и понимание; профессору Михаилу Андреевичу Белозерскому из отдела функциональной биохимии биополимеров НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского за помощь и поддержку в проведении исследований; Мейчик Наталье Робертовне с кафедры физиологии растений за предоставленные клеточные стенки растений; ВНИИфитопатологии и, в частности, Самохиной Илоне,Коваленко Елизавете Дмитриевне, Коломиец Тамаре Михайловне за предоставленные штаммы Fusarium.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Матвеева, Анжелика Рафиковна, Москва

1. Антонов В.К. Химия протеолиза. М.: Наука, 1991. - 504 с.

2. Астапович Н.И., Ермолицкий В.Н. Факторы, определяющие образование кислой протеазы микромицетом Aspergillus foetidus II Микология и фитопатология, 1987, 4, 318-322.

3. Барсукова Т.Н., Гарибова Л.В., Иванов А.И. Эколого-биологическая характеристика Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quel. // Микология и фитопатология, 1989, 23, 1, 14-19.

4. Батомункуева Б. П., Егоров Н. С. Выделение, очистка и разделение комплексного препарата внеклеточных протеиназ Aspergillus ochraceus 513 с фибринолитическими и антикоагулянтными свойствами // Прикладная биохимия и микробиология, 2001, 70, 5, 602-606.

5. Батомункуева Б. П., Егоров Н. С. Изучение препаратов внеклеточных протеиназ грибов Aspergillus ochraceus 513 и Aspergillus alliaceus 1 dNl // Микробиология, 2002, 71, 1,56-58.

6. Билай Т.И. Термофильные грибы и их ферментативные свойства. Киев: Наукова думка, 1985.- 150 с.

7. Бенкен И.И., Мосолов В. В., Федуркина Н. В. Влияние ингибитора протеиназ из фасоли на фитопатогенные грибы // Микология и фитопатология, 1976, 10, 3, 198-201.

8. Блиева Р. К., Сафуани Ж. Е., Искакбаева Ж.А. Влияние различных источников азота и углерода на биосинтез протеолитических ферментов у культуры Aspergillus awamori 21/96 // Прикладная биохимия и микробиология, 2003, 39, 2, 213-216.

9. Валуева Т. А., Кладницкая Г. В., Ильинская Л. И., Герасимова Н. Г., Озерецковская О. Л., Мосолов В.В. Ингибиторы химотрипсина в клубнях картофеля, инфицированных возбудителем фитофтороза // Биоорганическая химия, 1998, 24, 5, 346-349.

10. Воробьев Г.И.Гл. ред.; Ред.кол.: Анучин H.A., Атрохин В.Г., Виноградов В.Н. и др., Лесная энциклопедия: В 2-х т. М.: Советская энциклопедия, 1985.-563 с.

11. Воскобойникова Н.Е., Дунаевский Я.Е., Белозерский М. А. Ингибитор металлопротеиназы из покоящихся семян гречихи // Биохимия, 1990, 55, 5, 839-847.

12. Гребешова Р. Н., Сальседо-Торрес Л. Э., Идальго М. А. Сериновая протеаза Bacillus subtilis R // Прикладная биохимия и микробиология, 1999, 35, 2, 150-154.

13. Денисова Н.П. Протеолитические ферменты базидиальных грибов, таксономические и экологические аспекты их изучения. Дис. д-ра биол. наук. Л., 1991.

14. Дунаевский Я.Е., Павлюкова Е. Б., Белякова Г. А., Белозерский М. А. Анионные ингибиторы трипсина из покоящихся семян гречихи: выделение, специфичность действия и влияние на рост микромицетов // Биохимия, 1994, 59, 7, 990-996.

15. Дунаевский Я. Е., Белякова Г. А., Павлюкова Е.Б., Белозерский М.А. Влияние условий культивирования на образование и секрецию протеаз грибами A.alternata и F. oxysporum //Микробиология, 1995, 64, 3, 327-330.

16. Дунаевский Я.Е., Павлюкова Е.Б., Грубань Т.Н., Белякова Г.А., Белозерский М.А. Внеклеточные протеазы микромицета Ая/гегия/а //Биохимия, 1996, 61, 1904-1910.

17. Дунаевский Я.Е., Грубань Т.Н., Белякова Г.А., Белозерский М.А. Влияние состава среды на количественный и качественный состав внеклеточных протеаз микромицетов // Микробиология, 1999, 68, 3, 324-329.

18. Дунаевский Я.Е., Грубань Т.Н., Белякова Г.А., Белозерский М.А. Секретируемые ферменты мицелиальных грибов: регуляция секреции и очистка внеклеточной протеиназы Trichoderma harzianum //Биохимия, 2000, 65, 6, 848-853.

19. Дунаевский Я.Е., Дун Чжан, Матвеева А.Р., Белякова Г.А., Белозерский М.А. Деградация белковых субстратов ксилотрофными базидиомицетами // Микробиология, 2006а, 75, 1, 46-51.

20. Дьяков Ю.Т. На пути к общей теории иммунитета // Журнал общей биологии, 2005, 66, 6, 451-458.

21. Егоров Н.С., Лория Н.С., Ландау Н.С. Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз, ред., Имшенецкого A.A., М.: Наука, 1979, с. 146-244.

22. Ильина А. В., Татаринова Н. Ю., Тихонов В. Е., Варламов В. П. Внеклеточные протеиназа и хитиназа, продуцируемые культурой Streptomyces kurssanovii II Прикладная биохимия и микробиология, 2000, 36, 2, 173-177.

23. Кретович В.Л. Введение в энзимологию. 2-е изд., перераб.и доп.- М.: Наука, 1974, 352с.

24. Кладницкая Г.В., Валуева Т. А., Ермолова Н. В., Ильинская Л. И., Герасимова Н.Г., Мосолов В. В. Накопление ингибиторов протеиназ в диффузатах клубней картофеля при инфицировании возбудителями фитофтороза // Физиология растений, 1996, 43, 5, 701-706.

25. Ландау Н.С., Егоров Н.С. Особенности накопления в среде и некоторые свойства протеолитических ферментов, образуемых Nocardia minima II Микробиология, 1996, 65, 1,43-47.

26. Лобарева Л.С., Степанов В.М. Карбоксильные протеиназы плесневых грибов // Успехи биологической химии.- М.: Наука, 1978, 19, 83-105.

27. Локшина Л.А. Протеолитические ферменты в регуляции биологических процессов // Биоорганическая химия, 1994, 20, 134-142.

28. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. -М.: Наука, 1971, 414 с.

29. Мосолов В.В., Григорьева JL И., Валуева Т.А. Участие протеолитических ферментов и их ингибиторов в защите растений (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология, 2001, 37,2, 131-140.

30. Мосолов В.В., Валуева Т.А. Участие протеолитических ферментов во взаимодействии растений с фитопатогенными микроорганизмами // Биохимия, 2006, 71,8, 1034-1042.

31. Мюллер Э., Леффлер В. Микология.- М.: Мир, 1995, 343 с.

32. Овсянкина A.B., Коваленко Е.Д. Рекомендации по оценке и отбору исходного материала для создания сортов ржи, устойчивых к корневым гнилям.- М., 2004. 24 с.

33. Павлюкова Е.Б., Белозерский М. А., Дунаевский Я.Е. Внеклеточные протеолитические ферменты мицелиальных грибов // Биохимия, 1998, 63, 8, 10591089.

34. Пересыпкин В.Ф. Сельскохозяйственная фитопатология. 4-е изд., перераб. и доп. -М.: Агропромиздат, 1989.-480 с.

35. Поляков В. А., Римарева JI.B., Оверченко М. Б., Трифонова В. В. Сравнительная характеристика ферментных препаратов протеолитического действия по степени гидролиза микробного белка // Прикладная биохимия и микробиология, 2000, 36, 3, 299-302.

36. Прист Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов.- М.: Мир, 1987, 117 с.

37. Римарева JI.B., Оверченко М. Б., Серба Е. М., Трифонова В. В. Сравнительная характеристика микробных протеаз по степени гидролиза белковых субстратов // Прикладная биохимия и микробиология, 1997, 33, 1, 43-48.

38. Рудаков О. Л., Изв. АН Кирг. ССР, 1960, 2, 7, 51—55,

39. Руденская Г.Н. Новые подсемейства субтилизинов // Биоорганическая химия, 1994, 20, 5, 475-484.

40. Сапунова JI. И., Лобанок А. Г., Михайлова Р. В. /Условия синтеза пектиназ и протеаз грибом Aspergillus alliaceus и получение комплексного препарата мацерирующего действия // Прикладная биохимия и микробиология, 1997,33 , 3, 292-295.

41. Степанов В.М. Эволюция структура и функции протеолитических ферментов // "Химия протеолитических ферментов". Материалы всесоюзного симпозиума по химии протеолитических ферментов. Вильнюс, 15-17мая 1973, 7-11.

42. Степанов В.М. Тез. Докл. 2-го Всесоюзного симпозиума по химии протеолитических ферментов, Углич, 1979, 3, 3.

43. Abang М. М., Winter S., Mignouna Н. D., Green К. R., Asiedu R. Molecular taxonomic, epidemiological and population genetic approaches to understanding yam anthracnose disease // African Journal of Biotechnology, 2003, 2, 12, 486-496.

44. Ballinger M.D. Subtilisin // Handbook of proteolytic enzymes. Eds. Barrett A.J., Rawlings N.D., Woessner J.F. London: Academic Press. Electronic version on PC CD-ROM., 1998.

45. Barrett A.J. The many forms and functions of cellular proteinases // Proceedings of the Federation of American Societies for Experimental Biology, 1980, 39, 1, 9-14.

46. Barrett A.J. An introduction to the proteinases // Proteinase inhibitors. Eds. Barrett A.J., Salvesen. Elsevier Science Publishers, 1986, 3-22.

47. Bayart J. D., Pallas B. Tolerance of yam anthracnose to benzimidazoles: Results of the first study conducted in Guadeloupe // Phytoma, 1994, 461, 37-40.

48. Bowers R. C. Commercialization of Collego: An industrialist's view // Weed Sci., 1986, 34 (Suppl.), 24-25.

49. Boyette C.D. Host range and virulence of Colletotrichum truncation, a potential mycoherbicide for hemp sesbania (Sesbania exaltata) // Plant Dis., 1991, 75, 62-64.

50. Boyette C. D., Hoagland R.E., and Weaver M.A. Biocontrol efficacy of Colletotrichum truncatum for hemp sesbania {Sesbania exaltata) is enhanced with unrefined corn oil and surfactant // Weed Biology and Management, 2007,7 ,1 ,70-76.

51. Brennan J. M., Fagan B., van Maanen A., Cooke B. M., Doohan F. M. Studies on in vitro growth and pathogenicity of european fusarium fungi // Eur. J. of Plant Pathol., 2003, 109, 6, 557-587.

52. Cabrera M. G., Galmarini M. R., Flachsland E. Colletotrichum gloeosporioides, pathogen of orchids in the northeast of Argentina // Manejo Integrado de Plagas y Agroecologia, 2003, 68,57-61

53. Carlile A.J., Bindschedler, L.V., Bailey A.M., Bowyer P., Clarkson J.M. and Cooper R.M. Characterization of SNP1, a Cell Wall-Degrading Trypsin, Produced During Infection by Stagonospora nodorum // Mol. Plant-Microbe Interact, 2000, 13, 5, 538-550.

54. Daroda L., Hahn K., Pashkoulov D., Benvenuto E. Molecular characterization and in planta detection of Fusarium moniliforme endopolygalacturonase isoforms // Physiol, and Mol. Plant Pathol., 2001, 59, 6, 317-325.

55. Davis, B. J. Disc electrophoresis II method and application to human serum proteins // Ann. New York Acad. Sci., 1964, 121, 404-427.

56. Dodd J.C., Estrada A.B., Matcham J., Jeffries P. and Jeger M.J. The effect of climatic factors on Colletotrichum gloeosporioides, causal agent of mango anthracnose, in the Philippines // Plant Pathol., 1991, 40, 4, 568-575.

57. Dong, X., Shi W., Zeng Q., Xie, L. Roles of adherence and matrix metalloproteases in growth patterns of fungal pathogens in cornea // Curr. Eye Res., 2005, 30, 8, 613-620.

58. Eberling W., Hennich N., Klockow M., Metz H., Orth H.D., Lang H. Proteinase K from Tritirachium album (Linber) de Hoog // Eur. J. Biochem., 1974, 47, 1, 91-97.

59. Erlanger B. F., Kokowsky N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin // Arch. Biochem. Biophys., 1961, 95, 271-278.

60. Facchine I., and De Barros M.N. Production of extracellular enzymes by Nomuraea rileyi (Farlow) Samson // Rev. Microbiol., 1991, 22, 17-20.

61. Fernandes-Lahore H.M., Auday R.M., Fraile E.R., Biscoglio de Jimenez Bonino M., Pirpignani L., Machalinsky C., Cascone O. Purification of an acid proteinase from mesophilic Mucor sp., solid-state cultures // J. Peptide Res., 1999, 53, 6, 599-605.

62. Ferron P. Biological control of insect pests by entomogenous fungi // Ann. Rev. Enthomol., 1978,23,409-442.

63. Foucher B., Chappell J. B., McGivan, D. The effects of acetylcolletotrichinon the mitochondrial respiratory chain // Biochem. J., 1974, 138, 3, 415-423.

64. Freeman S., Rodriguez R.J. Genetic conversion of a fungal plant pathogen to a nonpathogenic, endophytic mutualist // Science, 1993; 260, 5104, 75-78.

65. Freeman S., Shalve Z., Katan J. Survival in soil of Colletotrichum acutatum and C. gloeosporiodes pathogenic on strawberry // Plant Disease, 2002, 86, 9, 965-970

66. Freeman S. Management, survival strategies and host range of Colletotrichum acutatum on strawberry // HortScience, 2008, 43, 66-68.

67. Gabriel B.P., Enzymatic activities of some entomophthorous fungi // J. Invert. Pathol., 1968, 11,70-81.

68. Gohbara M., Kosuge Y., Yamasaki S., Kimura Y., Suzuki A., Tamura S. Isolation, structures and biological activities of colletotrichins, phytotoxic substances from Colletotrichum nicotianae II Agric. Biol. Chem., 1978, 42, 1037-1043.

69. Graham, J.E.S., Sodec, J., and Hoffman, T. Rhizopus Acid Proteinases (Rhizopus-pepsins): Properties and Homology with other Acid Proteinases // Can. J. Biochem., 1973, 51, 6, 789796.

70. Grove, J. F., Speake R. N., Ward, G. Metabolic products of Colletotrichum capsici: Isolation and characterization of acetylcolletotrichin and colletodiol // J. Chem. Soc. (C), 1966, 230234.

71. Habeeb A. F. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid // Anal. Biochem., 1966, 14, 328-336.

72. Howard C. M., Maas J. L., Chandler C. K., and Albregts E. E. Anthracnose of strawberry caused by the Colletotrichum complex in Florida // Plant Dis., 1992, 76, 976-981.

73. Ievleva, E.V., Revina, T.A., Kudryavtseva, N.N., Sof'in, A.V. and Valueva, T.A. Extracellular proteinases from the phytopathogenic fungus Fusarium culmorum/l Applied Biochemistry and Mycrobiology, 2005, 42, 3, 298-303.

74. Ismail R., Salech S., Abdel-Fattah A. //Production of proteases by fungi // Microbios Letters, 1990, 43,81-85.

75. Jackson M.A., Bothast R. J. Carbon concentration and carbon to nitrogen ratio influence submerged culture conidiation by the potential bioherbicide Colletotrichum truncatum NRRL 13737 // Appl. and Environ. Microbiol., 1990, 56, 11, 3435-3438.

76. Jackson M. A., Schisler D. A. The composition and attributes of Colletotrichum truncatum spores are altered by the nutritional environment // Appl. and Environ. Microbiol, 1992, 58, 7, 2260-2265.

77. Jarai G., and Buxton F.P. Nitrogen, carbon and pH regulation of extracellular acidic protease of Aspergillus niger// Curr. Genet., 1994, 26, 3, 238-244.

78. Jelev Z.J., Bobev S.G., Minz D., Maymon M. and Freeman, S. First report of anthracnose fruit rot caused by Colletotrichum acutatum on pepper and tomato in Bulgaria. Plant Dis., 2008, 92, 1, 172.

79. Joshi L., St Leger R.J., Bidochka M.J. Cloning of a cuticle-degrading protease from the entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana II FEMS Microbiol. Lett., 1995, 125, 211217.

80. Kalisz H.M., Wood D.A., Moore D. Production, regulation and release of extracellular proteinase activity in basidiomycete fungi // Trans. Br.mycol. Soc., 1987, 88, 2, 221-227.

81. Kollatukudy P.E., Lee P.E., Rogers L.M., Zimmerman P., Ceselski S., Fox B., Stein B., and Copelan E.A. Evidence for possible involvement of an elastolytic serine protease in aspergillosis // Infection and Immunity, 1993, 61, 6, 2357-2368.

82. Kothary M.H., Chase T.Jr., and Macmillan J.D. Corellation of elastase production by some strains of Aspergillus fumigatus with ability to cause pulmonary invasive aspergillosis in mice // Infection and Immunity, 1984, 43, 1, 320-325.

83. Kucera M. J. Proteases from the fungus Metarhizium anisopliae toxic for Galleria mellonella larvae // J. Invertebr. Pathology, 1980, 35, 304-310.

84. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature, 1970, 227, 5259, 680-685.

85. Larcher G., Bouchara J.-P., Annaix V., Symoens F., Chabasse D., and Tronchin G. Purification and characterization of a fibrinogenolytic serine proteinase from Aspergillus fumigatus culture filtrate // FEBS letters, 1992, 308, 1, 65-69.

86. Larcher G., Cimon B., Symoens F., Tronchin G., Chabasse D., Bouchara J.-P. A 33 kDa serine proteinase from Scedosporium apiospermum //Biochem. J., 1996, 315, 119-126.

87. Luo Y., TeBeest D. O. Infection components of wild-type and mutant strains of Colletotrichum gloeosporioides f.sp. aeschynomene on northern jointvetch // Plant Disease, 1997,81,4, 404-409.

88. Luo Y., TeBeest D. O. Behavior of a wild-type and two mutant strains of Colletotrichum gloeosporioides f. sp. aeschynomene on northern jointvetch in the field // Plant Disease, 1998,82,4, 374-379.

89. Luo Y., TeBeest D. O. Effect of temperature and dew period on infection of northern jointvetch by wild-type and mutant strains of Colletotrichum gloeosporioides f. sp. aeschynomene II Biological Control, 1999, 14, 1, 1-6.

90. Maccheroni WJr., Araujo W.L.,Azevedo L.J. Ambient pH regulated enzyme secretion in endophytic and pathogenic isolates of the fungal genus Colletotrichum // Scienta Agricola, 2004,61,3, 298-302.

91. Malathrakis N. E., Kapetanakis G. E., and Linardakis D. C. Brown root rot of tomato and its control in Crete // Ann. Appl. Biol., 1983, 102, 251.

92. McDonald K. An overview of protease specifity and catalytic mechanisms: aspects related to nomenclature and classification // The Histochemical journal, 1985, 17, 7, 773-785.

93. McHenry J.Z., Christeller J.T., Slade E.A., Laing W.A. The major exstracellular proteinases of the silverleaf fungus Chondrostereum purpureum, are metalloproteases // Plant Pathol., 1996, 45, 3, 552-563.

94. Monod M., Fatih A., Jaton-Ogey L., Paris S., and Latge J.-P. The secreted proteases of pathogenic species of Aspergillus and their possible role in virulence // Can. J. Bot., 1995, 73, (Suppl 1), 1081-1086.

95. Mosolov V. V., Loginova M. D., Malova E. L., Benken I.I. Specific inhibitor of Colletotrichum lindemuthianum protease from Kidney bean (Phaseolus vulgaris) seeds // Planta, 1979, 144, 3 , 265-269.

96. Movahedi S., and Heale J.B. Purification and characterisation of an aspartic proteinase secreted by Botrytis cinerea Pers. ex Fries in cuticle and infected carrots // Physiol. Mol. Plant Pathol., 1990, 36, 303-324.

97. Nasuno S., Electrophoretic studies of alkaline proteinases from strains of Aspergillus flavus group //Agric. Biol.Chem, 1972, 36, 684-689.

98. Ning-Yuan Su, Chia Jung Yu, Hong-Der Shen, Fu-Ming Pan, Lu-Ping Chow. Pen c 1, a novel enzymic allergen protein from Penicillium citrinum // Eur. J. Biochem., 261, 1, 115123.

99. Olivieri F.P., Maldonado S., Tonon C.V., Casalongue C.A. Hydrolytic activities of Fusarium solani and Fusarium solani f. sp. eumartii associated with the infection process of potato tubers // J.of Phytopathol., 2004, 152, 6, 337-344.

100. Pekkarinen A. I., Longstaff C., Jones B.L. Kinetics of the inhibition of fusarium serine proteinase by barley (Hordeum vulgare L.) inhibitors // J. Agric. Food Chem., 2007, 55, 7, 2736-2742.

101. Peng Y., Yang X., and Zhang Y. Microbial fibrinolytic enzymes: an overview of source, production, properties, and thrombolytic activity in vivo // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 69, 2, 126-132.

102. Pichova I., Pavlickova L., Dostal J., Hruskova-Heidingsfeldova O., Weber J., Ruml T., Soucek M. Secreted aspartic proteases of Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida lusitaniae // Eur. J. Biochem., 2001, 268, 9, 2669-2677.

103. Ramesh M.V., Kolattukudy P.E. Disruption of the serine proteinase gene (sep) in Aspergillus flavus leads to a compensatory increase in the expression of a metalloproteinase gene (mep20) //J. Bacterid., 1996, 178, 13, 3899-3907.

104. Rao M.B., Tanksale A.M., Ghatge M.S., and Deshpande V.V. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases // Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1998, 62, 3,. 597-635.

105. Redman R.S., Freeman S., Clifton D. R., Morrel J., Brown G., Rodriguez R.J. Biochemical analysis of plant protection afforded by a nonpathogenic endophytic mutant of Colletotrichum magna //Plant Physiol., 1999, 119, 2, 795-804.

106. Redman, R.S., and Rodriguez, R. J. Characterization and isolation of an extracellular serine protease from the tomato pathogen Colletotrichum coccodes, and it's role in pathogenicity // Mycol. Res., 2002, 106, 12,1427-1434.

107. Rhodes J.C., Bode, R.B., and McKuan-Kirsch, C.M. Elastase production in clinical isolates of Aspergillus II Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 1988, 10, 3, 165-170.

108. Rhodes J.C., Aspergillus proteinases and their interactions with host tissues // Can.J.Bot., 1995, 73, (Suppl.l), SI 126-1131.

109. Rohini, G., Murugeswari, P., Prajna, N.V., Lalitham P., Muthukkaruppan, V. Matrix metalloproteases (MMP-8, MMP-9) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP-1, TIMP-2) in patients with fungal keratits // Cornea, 2007, 26, 2, 207-211.

110. Schisler D. A., Jackson M. A., Bothast R.J. Influence of nutrition during conidiation of Colletotrichum truncatum on conidial germination and efficacy in inciting disease on Sesbania exaltata II Phytopathol., 1991, 81, 587-590.

111. Shevchik, V. E., Boccara M., Vedel R., and Hugouvieux-Cotte-Pattat N. Processing of the pectate lyase Pell by extracellular proteases of Erwinia chrysanthemi 3937 // Mol. Microbiol., 1998,29, 6, 1459-1469.

112. Shimizu S., Tsuchianti Y., and Matsumoto T. Purification and properties of an extracellular protease from Beauveria bassiana II J.Seric. Sci. Spn., 1992, 61, 421-428

113. Smith R.J., Pekrul S., and Grula E.A. Requirement for sequential enzymatic activities for penetration of the integument of the corn earworm (Heliothis zed) II J. Invert Pathol., 1981, 38, 335-344.

114. Sreedhar L., Kobayashi Y.D., Bunting T.E., Bradley H. I., Belanger F. C. Fungal proteinase expression in the interaction of the plant pathogen Magnaporthe poae with its host // Gene, 1999, 235, 1-2, 121-129.

115. St. Leger R.J., Charnley A.K., Cooper R.M. Cuticle-degrading enzymes of entomopathogenic fungi:synthesis in culture on cuticle // J. Invert. Pathol., 1986, 48,. 85-95.

116. St Leger R.J., Bidochka M.J., Roberts D.W. Isoforms of the cuticle-degrading Prl proteinase and production of metalloproteinase by Metarhizium anisopliae // Arch. Biochem. Biophys., 1994,313, 1, 1-7.

117. St Leger R.J. The role of cuticle-degrading proteases in fungal pathogenesis of insects // Can. J. Bot., 1995, 73, (Suppl.l), SI 119-1125.

118. Sutton, B. C. The Coelomycetes. Fungi imperfecti with Pycnidia, Acervuli and Stromata. Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, England, 1980, 696 p.

119. Templeton G.E. Potential for developing and marketing mycoherbicides // Proc. First Int. Weed Control Cong. J.H. Combellack, KJ. Levick, J. Parsons and R.G. Richardson (eds.)-Weed Sci. Soc. Victoria, Inc. Melbourne, Australia, 1992, 1, 264-268.

120. Transfiguración J.C., Lee B.H., Park S.Y. and Van der Voort F.R. Purification and characterization of a carboxypeptidase Y from Kluyveromyces fragilis JSB95 // Journal of Dairy Science, 1998, 81, 3, 647-654.

121. Tunlid A., Rosen S., Ek B., and Rask L. Purification and characterisation of an extracellular serine protease from the nematode de-trapping fungus Arthrobotrys oligospora II Microbiology, 1994, 140, 7, 1687-1695.

122. Ueda M., Kubo T., Miyatake K., Nakamura T. Purification and characterization of fibrinolitic alkaline protease from Fusarium sp. BLB // Appl. Microbiol Biotechnol., 2007, 74, 2,331-338.

123. Wang R. Current status and perspectives of biological weed control in China // Chinese J. Biol. Contr., 1986, 1, 173-77.

124. Xu J., Baldwin D., Kindrachuk C., Hegedus D.D. Serine proteses and metalloproteases associated with pathogenesis but not host specificity in the Entomophthoralean fungus Zoophthora radicans II Can. J. Microbiol., 2006, 52, 6, 550-559.

125. Yu X., Hallett S. G., Sheppard J., and Watson A.K. Effects of carbon concentration and carbon to nitrogen ratio on growth and sporulation of Colletotrichum coccodes in a cyclone column bioreactor// J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 1998, 20, 6, 333-338.