Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анионные ингибиторы протеаз из семян гречихи: их свойства и влияние на патогенную микрофлору

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Анионные ингибиторы протеаз из семян гречихи: их свойства и влияние на патогенную микрофлору"

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н. БАХА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

АНИОННЫЕ ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕАЗ ИЗ СЕМЯН ГРЕЧИХИ: ИХ СВОЙСТВА И ВЛИЯНИЕ НА ПАТОГЕННУЮ МИКРОФЛОРУ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в отделе функциональной биохимии биополимеров Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Я.Е. Дунаевский

Оффициальные оппоненты:

доктор биологических наук, Т.А. Валуева

доктор химических наук, Г.Н. Руденская

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В .А. Энгельгардта

РАН

Защита состоится " Ю " МАЛ' 1997 г. в часов на заседании диссертационного Совета К 002.96.01 при Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН (117071 Москва, Ленинский пр., 33, корп. 2).

Автореферат разослан " ^ " СИ^Ыи^ 1997 г.

Ученый секретарь специализированного совета, д.б.н.

М.И. Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Среди фитопатогенов, ответственных за инфекционные заболевания сельскохозяйственных культур, значительную часть составляют грибы. Взаимоотношения между высшими растениями и грибами-патогенами очень сложны и включают в себя применение различных химических соединений как со стороны грибов (в частности токсинов и ферментов), так и со стороны растений (в т.ч. ингибиторов, ферментов и фитоалексинов). Одним из компонентов системы, используемой грибами для нападения на растения и разрушения их тканей, являются гидролитические ферменты. Из литературных данных известно, что внеклеточные протеолитические ферменты фитопатогенньгх микроорганизмов способны играть определенную роль в инфекционном процессе, вызываемом ими у растения-хозяина. Эти данные позволяют судить о некоторых функциях внеклеточных протсиназ грибов в инфекционном процессе (McHeniy et al., 1996), но четких доказательств их участия в патогенезе на настоящий момент очень мало.

Белковые ингибиторы протеиназ широко представлены во многих видах высших растений. Предполагается, что основными функциями белковых растительных ингибиторов являются: 1) регуляция активности эндогенных протеиназ, 2) участие в пуле запасных белков и 3) создание защитного барьера против атаки насекомых-паразитов и фитопатогенных микроорганизмов (Ryan, 1973; Мосолов и Валуева, 1993).

~ Ранее было показано, что ингибиторы протеаз из семян высших растений способны подавлять рост ряда микромицетов (Halim et al., 1973; Mosolov et al., 1976). Кроме того, в работах японских ученых (Ikeda and Kusano, 1983; Kiyohara and Iwa&ki, 1985) было показано присутствие в семенах гречихи ингибиторов трипсина (ИТ), различавшихся по молекулярной массе, изоэлектрической точке и аминокислотному составу. Однако не была исследована возможность участия выделенных ИТ в регуляции роста и развития патогенной микрофлоры и активности протеиназ фитопатогенов.

Цель и задачи исследования. С целью изучения факторов, участвующих во взаимодействии патогенного гриба и растения-хозяина, в настоящей работе ставятся следующие задачи:

1.Выделение, очистка и характеристика ингибиторов протеолитических ферментов

из семян гречихи, способных ингибировать секретируемые протеиназы несовершенных грибов Alternaria alternata и Fusarium oxysporum, возбудителей альтернариоза и фузариоза.

2. Изучение действия ингибиторов протеаз из семян гречихи на рост и развитие А. alternata и F. oxysporum.

3. Изучение условий, влияющих на синтез и секрецию внеклеточных протеаз А. alternata и F. oxysporum.

4. Выделение, очистка и изучение свойств внеклеточной протеиназы А. alternata.

Научная новизна и практическая ценность. Из семян гречихи выделены и очищены до электрофоретически гомогенного состояния новые ингибиторы сериновых протеиназ, не действующие на эндогенные ферменты, но подавляющие активность протеиназ фитопатогенных грибов. Кроме того, выделен новый фермент - внеклеточная сериновая трипсин-подобная протеиназа Altemaria alternata. Анионный ингибитор трипсина из семян гречихи (ИТ-1) на основании установленной аминокислотной последовательности был идентифицирован как член семейства картофельного ингибитора I. Доказано, что ИТ-1 заметно отличается от других белков, отнесенных к этому семейству, по ряду свойств (молекулярной массе, специфичности и строению реактивного центра). Полученные данные существенно дополняют современные представления о процессах, сопровождающих инфекционные заболевания растений. Результаты исследования позволяют предположить, что ИТ-1 является одним из компонентов защитной системы растений и может бьпъ использован при селекции растений, устойчивых к грибной инфекции.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на III симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 1993), конференции "Мо-лекулярно-генетические маркеры и селекция растений" (Киев, Украина, 1994), IX конгрессе Федерации Европейских обществ физиологов растений (Брно, Чехия, 1994), XVI международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Нью-Дели, Индия, 1994), III конференции EFPP "Environmental Biotic Factors in Integrated Plant Disease Control" (Познань, Польша, 1994), XIII международном конгрессе по защите растений (Гаага, Нидерланды, 1995), VI международной конференции "Frontiers in Biochemistry and Molecular Biology, the Legacy of Andrey Belozersky" (Москва, 1995), на IV симпозиуме "Химия протеолитических

ферментов" (Москва, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 24 рисунками. Указатель литературы содержит 363 работы.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Методы исследования

В работе были использованы покоящиеся семена гречихи (Fagopyrum esculentum Moench.) сорта Шатиловская 5, а также семена, растущие в течение 4 дней во влажной камере.

Для определения активности ингибиторов смесь раствора, содержащего ингибитор, с раствором трипсина ("Calbiochem") инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Остаточную активность трипсина определяли по методу Эрлангера и др. (Erlanger et al., 1961), используя в качестве субстрата 0,6 мМ раствор п-нитроанилида а-1Ч-бензоил-0,Ь-аргининп (БАПА) ("Fluka AG") в 0,1 M К,Ка-фосфатном буфере, рН 7,0; инкубацию проводили в течение 30 мин при 37 °С. Аналогичным образом определяли активность ингибиторов по отношению к а-химотрипсину ("Реахим"), используя в качестве субстрата 0,6 мМ сукцинил-L-Phe-pNa (СФПА) ("Serva"); инкубацию проводили в течение 4 ч при 37 °С. За единицу активности ингибитора принимали такое его количество, которое снижало оптическую плотность при 410 нм (Ацо) на 0,1 ед. в условиях определения ферментативной активности.

Активность протеиназы определяли по методу Эрлангера и др. (Erlanger et al., 1961), используя в качестве субстрата 0,6 мМ раствор БАПА в 0,1 M K,Na-фосфатном буфере, рН 7,0,; инкубацию проводили в течение 1 ч при 37 °С. За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, вызывающее при гидролизе субстрата увеличение оптической плотности раствора на 0,01 ед. в указанных условиях инкубации. В ряде случаев за единицу активности фермента принимали количество фермента, катализирующее выделение 1 нмоля п-нитроанилина при расщеплении субстрата в указанных условиях инкубации за 1 мин.

Активность протеиназ измеряли также методом тринитрофенилирования (Habeeb, 1966), используя в качестве субстрата 1%-ный казеин ("Реахим"). За единицу активности фермета принимали такое его количество, которое вызывало освобождение 1 нмоля аминогрупп при расщеплении субстрата в указанных условиях инкубации за 1 ч. При проведении ингибиторного анализа смесь растворов фермента и синтетического ингибитора предварительно инкубировали 1 ч при 20 °С (pH 8,0).

Культура гриба F. oxysporum была получена из коллекции Г. Гарифуллиной (МГУ). Выделение гриба A. altérnala проводили из семян гречихи.

В качестве источника секретируемого протеолитического фермента использовали культуральную жидкость, полученную в результате культивирования гриба на жвдкой модифицированной среде Чапека, в которую вместо ИаЫОз добавляли раствор казеина до конечной концентрации 1%. Для посева культуры использовали 2 мл суспензии спор. Концентрацию спор рассчитывали с помощью камеры Горяева; она составила 2 х 105 спор/мл для A. alternata и 5 х 104 спор/мл для F. oxysporum.

Действие ингибиторов на рост мицелия грибов изучали с помощью метода, описанного Н.С. Егоровым (1957). На поверхность твердой среды наносили 5 мл той же среды, содержащей суспензию спор гриба (2 х 105/мл). После застывания агара с помощью стерильного сверла диаметром 7 мм в нем делали шесть лунок, куда заливали растворы ИТ (по 0,05 мл).

Для определения влияния ИТ на прорастание спор последние смывали питательной средой, смешивали затем с растворами ИТ различной концентрации и оставляли во влажной камере при 24 °С на 18 ч, после чего у 50 спор проводили учет длины гиф.

Концентрацию белка определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951) и спектрофотометрически при 280 нм.

Электрофорез ингибиторов и ферментов -проводили по методу Дэвиса (Davis, 1964) в 10%-ном полиакриламвдном геле при силе тока 5 мА на трубку. Гели окрашивали 0,02%-ным раствором Кумасси G-250 ("Serva") в 3,5%-ной хлорной кислоте в течение 24 ч, избыток красителя удаляли смесью С2Н50Н+СНзС00Н+Н20 (3:1:8).

Аминокислотный состав ингибиторов определяли стандартным методом на

анализаторе "Hitaclii". Для определения серосодержащих аминокислот белок окисляли смесью 30%-ной Н2О2 и 88%-ной муравьиной кислоты (1:9) и затем гидролизовали 5,7 н. НС1. Триптофан определяли после гидролиза белков 4 н. метансульфоновой кислотой в присутствии 0,2%-ного триптамина. Определение наличия свободных сульфгидрильных групп с помощью 5,5'-дитио-бис(2-нитробензойной кислоты) ("Calbiochem") проводили по методу Эллмана (ЕШпап, 1959).

Модификацию остатков лизина в молекулах ИТ проводили по методу Фридмана (Freedman et al., 1968) с использованием уксусного ангидрида. Модификацию остатков аргинина осуществляли по методу Смита (Smith, 1977) с использованием диацетила (2,3-бутандиола) ("Sigma").

Двойную иммунодиффузию проводили в 1%-ном агаровом геле в 0,01 М фосфатном буфере, рН 6,8, с 0,14 М NaCl при комнатной температуре в течение 24 ч (Ouchterlony, 1949). Гели отмывали 1 сутки 0,14 М NaCl, затем 1 сутки дистиллированной водой и высушивали при 37 °С. Отмьггые гели окрашивгыи 0,1%-ным Кумасси R-250 в смеси С2Н50Н+СНзС00Н+Н20 (5:1:1) в течение 5 мин, избыток краски отмывали смесью С2Н5ОН+СН3СООН+Н2О (4,5:1:4,5).

Молекулярную массу ингибиторов и фермента определяли методом гель-фильтрации на колонке (94 х 0,95 см) с Сефадексом G-50, уравновешенной 0,01 М фосфатным буфером, рН 6,8. В качестве белков-маркеров использовали ингибитор трипсина из сои ("Reanal") (22 кДа), РНКазу ("Реахим") (14 кДа), цитохром с ("Merck") (12,4 кДа) и убиквитин ("Sigma") (8 кДа).

Масс-спектрометрический анализ белков проводили с помощью плазменно-десорбционного масс-спектрометра с калифорниевым источником (cf-252) производства НПО "Селми" (Украина).

Результаты и их обсуждение

В настоящей работе изучены ингибиторы трипсина (ИТ), выделенные с помощью аффинной хроматографии на трипсин-сефарозе из покоящихся семян гречихи. Последующая очистка включала ионообменную хроматографию на Mono Q в условиях высокоэффективной жидкостной хроматографии (FPLC) (рис. 1). Сорбировавшиеся белки элюировали линейным градиентом NaCl (0-0,1 М).

оа О

a. g

зс

Ш X

О О

X (0 s k-

u <

10 20 30 40 50 60 70 Номер фракции

Рис. 1. Хроматография на Mono Q ингибиторов, выделенных с помощью аффинной хроматографии на трипсин-сефарозе (стрелкой указано место введения 1 М NaCl).

В элюате были обнаружены четыре главные фракции (1-4), обладающие трипсин-ингибирующей активностью, которые в результате проведенной очистки (табл. 1) были получены в элеюрофоретически гомогенном состоянии (рис. 2) и охарактеризованы по ряду свойств. Таким образом, полученные результаты могут свидетельствовать о наличии в семенах гречихи множественных форм ИТ.

С помощью двойной иммунодиффузии с использованием кроличьих антисывороток к ингибиторам 1 и 4 показана антигенная идентичность ингибиторов 1, 2 и 4 (рис. 3).

Установлено, что молекулярные массы ИТ из фракций 1, 2 и 4, определенные гель-фильтрацией на Сефадексе G-50, соответственно равнялись 9,0, 9,2 и 8,7 кДа, а полученные с помощью масс-спектрометрии, были равны 7,7-7,9 кДа. Эти величины хорошо вписываются в интервалы значений молекулярных масс, определенные для большинства изученных растительных ингибиторов протеаз.

ИТ-1 ИТ-2 ИТ-4

Рис. 2. Электрофореграммы очищен- Рис. 3. Двойная иммунодиффузия очищенных препаратов ИТ в 10%-ном ПААГ.

ньк препаратов ИТ: а - ИТ-1, б - ИТ-2, в - ИТ-4. В центральной лунке — антитела к ИТ-1.

Таблица 1. Очистка ингибиторов трипсина из семян гречихи

Стадия очистки Белок, мг Общая активность, ед. Удельная активность, ед/мг Степень очистки Выход, %

Экстракция 21000 1160000 55 1,0

Осаждение сульфатом аммония 8300 520000 63 1,1 45

Аффинная хроматография на трипсин-сефарозе 130 350000 2700 49 30

FPLC на Mono Q:

свободный объем 60 150000 2500 45 13

ИТ-1 12 29000 2500 45 2,5

ИТ-2 13 30000 2300 42 2,6

ИТ-3 2,9 9000 3100 56 0,8

ИТ-4 2,9 6700 2300 42 0,6

В табл. 2 приведены данные по влиянию изученных ИТ на активности различных протеолитических ферментов. Найдено, что кроме активности

трипсина, ИТ-1 и ИТ-2 ингибируют также активность химотрипсина, хотя и с меньшей эффективностью. Все исследованные ИТ подавляли активность трипсина из гепатопанкреаса камчатского краба.

Таблица 2. Влияние ИТ на активность различных протеолитических ферментов

Протеаза Отношение ингибитор/фермет (моль/моль) при 50%-ном ингибировании

ИТ-1 ИТ-2 ИТ-4

Трипсин быка 0,45 0,42 0,48

Трипсин краба 0,50 0,45 3,60

Химотрипсин 2,3 2,5 не инг.

Папаин не инг. не инг. не инг.

Пепсин не инг. не инг. не инг.

Эластаза не инг. не инг. не инг.

Субтшшзин не инг. не инг. не инг.

Субтилизин-подобный фермент Madura promifera не инг. не инг. не инг.

Рис. 4. Зависимость активности трипсина от концентрации ИТ

( ■ » ИТ-1,......ИТ-2,

■ ИТ-4 ).

0.1 10

Ингибитор/трипсин, моль/моль

Зависимости активности трипсина от возрастающих количеств ИТ-1, 2 и 4 представлены на рис. 4. Все три ингибитора вели себя сходным образом, при этом 1 моль каждого из ингибиторов реагировал стехиометрически с 1 молем трипсина, образуя фермент-ингибиторный комплекс в молярном отношении 1:1.

Установлено, что прединкубация ИТ-1 и ИТ-2 с химотрипсином снижала ингибирующую активность этих белков по отношению к трипсину не более чем на 16%, тогда как их прединкубация с трипсином полностью устраняла химотрипсин-ингибирующую активность. По-видимому, эти результаты могут бьггь о&ьяснены следующим образом: как ИТ-1, так и ИТ-2 имеет один центр связывания ферментов, сродство которого к трипсину значительно выше, чем к химотрипсину.

Аминокислотный состав очищенных ИТ сходен (табл. 3) и характеризуется высоким содержанием глутаминовой кислоты и валина и низким содержанием изолейцина, ароматических и серосодержащих аминокислот. В изученных ИТ не обнаружено свободных сульфгидрильных групп.

Таблица 3. Аминокислотный состав ингибиторов трипсина из семян гречихи

Аминокислоты Число остатков

ИТ-1 ИТ-2 ИТ-4

Asp 7 8 8

Thr 1 1 1

Ser 3 3 4

Glu 12 13 13

Pro 4 3 4

Gly 5 6 6

Ala 4 3 4

1/2 Cys 2 2 2

Val 11 10 11

Met 1 1 0

Ile 2 2 2

Leu 4 4 3

Туг 0 0 0

Phe 1 1 1

Lys 3 3 3

His 0 1 0

Arg 7 7 6

Тгр 1 1 1

Сумма 68 69 69

M, кДа 7.6 7.8 7.6

Изучение устойчивости выделенных ИТ по отношению к различным внешним воздействиям выявило их высокую рН-стабильность. В течение 4-х

часовой инкубации (4 °С) при рН от 1 до 11 исследованные ИТ теряли не более 36% своей активности. Лишь при рН 13 наблюдалось резкое падение ингибирующей активности у ИТ-4 (на 95%) и химотрипсин-ингибирующей активности у ИТ-1 (на 97%), при этом трипсин-ингибирующая активность у ИТ-1 снижалась только на 57%. Наиболее устойчив в этих условиях оказался ИТ-2, сохранявший при рН 13 более 90% своей активности.

Получены данные о стабильности исследуемых ИТ при трех различных рН в условиях их инкубации при 100 °С в течение 15 или 30 мин. Результаты опытов свидетельствуют о высокой термостабильности ИТ-1 и несколько меньшей ИТ-2 и ИТ-4 при кислом рН; выделенные ингибиторы сохраняли более 50% активности после 15 мин инкубации при 100 °С. Обнаружено также, что при нейтральном, и, в особенности, щелочном рН термостабильность всех изученных нами ИТ резко падает.

Модификация свободных е-аминогрупп остатков лизина у изученных нами ингибиторов уксусным ангидридом не вызывала снижения ингибиторной активности (табл. 4). Модификация остатков аргинина с помощью диацетила вызывала снижение трилсин-ингибирующей активности ингибиторов 1, 2 и 4 на 58, 57 и 55%, соответственно. Полученные данные указывают на присутствие остатков аргинина в реактивном центре каждого из исследованных ИТ. Установленная позже аминокислотная последовательность ИТ-1 подтвердила наличие в реактивном центре этого ингибитора остатка аргинина.

Таблица 4. Модификация остатков аргинина и лизина в молекулах ИТ

Модифицирующий агент Остаточная активность ИТ, %

ИТ-1 ИТ-2 ИТ-4

Уксусный ангидрид 100 100 100

Диацетил (2,3-бутандиол) 42 43 45

Сходство специфичности изученных ИТ, их антигенная идентичность, а также сходство их аминокислотных составов и физико-химических свойств позволяют предположить, что мы имеем дело или с различными модифицикациями одного белка или с семейством родственных белков.

В нашей лаборатории получена полная аминокислотная последовательность ИТ-1 (Векэгегеку е1 а!., 1995). Анализ гомологии последовательностей ИТ-1 и

других известных ингибиторов протеаз позволил идентифицировать исследуемый нами ингибитор как член семейства картофельного ингибитора I.

Характерной особенностью представителей этого семейства является низкое содержание остатков Суя (одна дисульфидная связь на протомер с молекулярной массой около 8000 Да). Ингибитор из семян гречихи, состоящий из одной полипептидной цепи, также имеет в своем составе всего два остатка Су5.

PI-1A

PI-IB

PI-IC

PI-ID

TI-I

CI-2

CI-IC

VSI

LIE

CMTI

ATI

ИТ-1

P, Pi

-V

GlySerProValThrMet GlySerProValThrLeu G lySerPro ValThrLeu GlySerProValThrLeu GlySerProValThrLeu GlyjlbrlltWalThrMet AspAlaMetValProLeu Gli^PheyalThrAla GlySerProValThrLeu Gl}

Asp Phe ArgCysAspArgValArgLeuPheAsp Asp AspPhe ArgCysAspArgValArgLeuPheAsp Asp Гуг ArgCysAspArgValArgLeuPheAsp Ysn Гут ArgCysAspArgValArgLeuPheAsp \sn FyrLeuCysAspArgValArgLeuPheAsp \sn ry^rg!le|\spArgValArgLeuPheJValA^p nArgVal PheValEeuVal His AspfnirLysPheGhwgValArgLeufTyrValAsp Asp Leu \rm yiKspArgValArgValPhaTyrAsn Asp Phe ArgCysAsnArgValArgllefTrpVaLAsn Asp Phe ArgCysAspArgValTrpValValValAsp Asp Leu ArgCysAsp Arg VaLArgVallFrp Le u P h e

Рис. 5. Первичная последовательность в районе реактивных центров ингибиторов семейства картофельного ингибитора I (консервативные остатки аминокислот молекул ингибиторов обведены линиями):

PI-IA, PI-IB, PI-IC, PI-ID - протомеры ингибитора I из клубней картофеля (Richardson and Cossins, 1974); TI - ингибитор I из листьев томатов (Graham et al., 1985), CI-2, CI-IC - ингибиторы субтилизина из ячменя (Svendsen et al., 1980, 1982); VSI - ингибитор субтилизина из конских бобов (Svendsen et al., 1984), LIE -ингибитор сериновых протеиназ из медицинской пиявки (Seemuller et al., 1980), CMTI-V - ингибитор трипсина из тыквы (Krishnamoorthi et al., 1990), ATI -ингибитор трипсина из амаранта (Valdes-Rodriguez et al., 1993), ИТ-1 - ингибитор протеиназ из семян гречихи (Belozersky et al., 1995).

На рис. 5 приведены аминокислотные последовательности вблизи реактивных центров для ингибиторов, принадлежащих к этому семейству. Следует отметить, что в положении Pj реактивного центра ингибитора протеиназ из семян гречихи находится остаток Arg в отличие от Met и Leu у большинства представителей этого семейства. Из литературных данных известно, что типичные

ингибиторы данного семейства из картофеля Р-1 (Kiyohara et al., 1973), томатов TI-I (Plunkett et al., 1982) и медицинской пиявки LIE на два-три порядка эффективнее связывают химотрипсин по сравнению с трипсином, в то время как ингибитор протеиназ из гречихи является более сильным ингибитором трипсина, чем химотрипсина. Данный эффект может быть объяснен с точки зрения строения реактивных центров ингибиторов Р-1, TI-I и LIE, в положении Pi которых

находится остаток Leu, более специфичный к а-химотрипсину, а в случае ингибитора из гречихи - Arg, имеющий повышенное сродство к трипсину. К настоящему времени в литературе известны еще два представителя семейства картофельного ингибитора I, содержащих основной остаток (Lys) в положении Pj. Это ингибиторы трипсина из тыквы CMTI-V (Krislmamoorthi et al., 1990) и амаранта ATI (Valdes-Rodriguez et al., 1993). Однако сравнительные сведения о

сродстве к трипсину и а-химотрипсину для них отсутствуют.

Изучение влияния исследованных ингибиторов на рост грибов A. alternate и F. oxysporum выявило угнетение роста мицелия этих грибов вокруг лунок с ингибиторами. Уже на вторые сутки роста грибов вокруг лунок наблюдали светлые зоны. В этих зонах мицелий развивался очень слабо, был редким и стелился по поверхности среды. Величина зоны угнетения роста мицелия вокруг лунки уменьшалась по мере снижения концентрации ингибитора (табл. 5).

Таблица 5. Влияние ИТ-1 на рост мицелия фигопатогенных грибов

Количество Зона ингибирования роста мицелия, мм

ингибитора, мкг A. alternata F. oxysporum

48 3 4

24 2 4

12 1,5 3

6 1 2,5

3 0 1

Изучение зависимости прорастания спор А. аИетаШ от концентрации ИТ-1 (рис. 6) показало, что увеличение концентрации ИТ-1 в растворе приводило к уменьшению длины прорастающих гиф. При концентрации ингибитора 1 мг/мл происходило полное подавление прорастания спор (рис. 7). Уменьшение длины

прорастающей гифы по отношению к контролю концентрации ингибитора, равной 0,07 мг/мл.

на 50% наблюдалось при

0.2 0.3 0.4 0.5 Концентрация ИТ1 (мг/мл)

0.6

Рис. б. Среднее изменение длины прорастающих гиф А. аНета1а в зависимости от концентрации ИТ-1.

1

Рис. 7. Влияние ИТ-1 (1мг/мл) на прорастание спор А. аИегпШа (/ — в присутствии ИТ-1, 2— контроль без ингибитора).

Полученные данные о способности изученных нами ИТ подавлять рост мицелия и прорастание спор микромицетов в совокупности с результатами других ученых (НаЦш е1 а!., 1973; Мо5о1оу ее а!., 1976; Левицкий и Погорелецкая, 1985), свидетельствующими о способности ингибиторов сериновых протеиназ из семян высших растений замедлять рост мицелия ряда грибов, подтверждают гипотезу об активной роли белковых ингибиторов протеиназ из семян высших растений в

процессах иммунитета, защищающих растение-хозяина от действия фитопатогенных микроорганизмов.

В связи с этим интересно провести сравнение свойств рассматриваемых ингибиторов с растительными белками, связанными с патогенезом, так называемыми PR-белками, вырабатываемыми в растениях в ответ на заражение (Stintzi et al., 1993). Как и PR-белки, ингибиторы протеиназ из гречихи подавляют рост микроорганизмов. Эти группы белков объединяет высокая стабильность в кислой области рН, устойчивость к действию протеолитических ферментов при физиологических рН, невысокая молекулярная масса. Сходство ИТ из гречихи и PR-белков также свидетельствует о том, что ИТ могут являться компонентами защитной системы растения, направленными против внеклеточных протеиназ микроорганизмов, которые, по литературным данным, могут играть важную роль в патогенезе.

В связи с тем, что возможной мишенью изученных ингибиторов являются секретируемые протеазы грибов, нами была проведена работа по очистке и характеристике преобладающей внеклеточной протеиназы микромицета Alternaría altemata. В первую очередь было необходимо определить оптимальные условия синтеза и секреции протеиназ микромицетов.

При изучении влияния условий культивирования на синтез и секрецию гидролитических ферментов грибами A. altemata и F. oxysporum было показано, что присутствие белка в среде культивирования является необходимым условием для продукции внеклеточной протеазы. Исследование протеаз, синтез и секреция которых запускаются только при введении в среду роста белковых субстратов, представляет особый интерес, т.к. такое введение белков может служить удобной моделью для изучения взаимодействия фитопатогена с растением-хозяином.

Полученные данные указывают на прямую связь между количеством белкового субстрата и величиной внеклеточной протеолитической активности; быстрое снижение измеряемой активности после достижения максимума, вероятно, связано с истощением в среде белка (в данном случае казеина), вследствие чего утрачивается необходимость в поддержании определенного уровня глшролизующего казеин фермента.

Использование среды культивирования, лишенной углеводов (сахарозы), вызывало заметное (в 5 раз) снижение уровня секретируемой протеолитической активности A. altemata. Внесение в среду культивирования ингибитора трансляции

белков циклогексимида (10 мкг/мл) приводило к практически полному подавлению появления протеолитической активности в среде, что свидетельствует о синтезе de novo протеиназ, ответственных за изучаемую внеклеточную протеолитическую активность.

Внеклеточная протеиназа A. altemata была очищена с помощью аффинной хроматографии на бацитрацин-силохроме, гель-фильтрации на Сефадексе G-50 и гель-фильтрации на Суперозе 6 (FPLC) в 1300 раз с выходом 8,3% (табл. 6). Выделенный фермент был практически гомогенен по данным электрофореза в полиакриламидном геле. Молекулярная масса выделенной протеиназы, определенная методом гель-фильтрации на Сефадексе G-50, равнялась 33 кДа.

Таблица 6. Очистка внеклеточной протеиназы A. altemata

Стадия очистки Белок, мг Удельная активность по БАПА, нмоль/мин-мг Общая активность по БАПА, нМ/мин Очистка Выход, %

Культур альная жидкость, 75 мл 1125 0,45 510 1

Осаждение ацетоном, центрифугирование и диализ 600 0,68 410 1,5

Аффинная хроматография на бацитрацин-силохроме 2,5 95 240 210 47

Гель-фильтрация на Сефадексе G-50 0,47 160 . 73 350 16

Гель-фильтрация на Superóse 6 (FPLC) 0,071 590 42 1300 8,3

Проведенные эксперименты показали, что активность, определяемая по БАЛА, имеет оптимум рН, равный 8,0, тогда как рН оптимум активности, измеряемой по казеину, сдвинут в более щелочную область (рН 9,1). Ниже рН 6,0 активность как по отношению к БАЛА, так и по отношению к казеину, либо незначительна, либо полностью отсутствует.

Проведено изучение температурной и рН-стабильности выделенной протеиназы. После инкубации протеиназы в течение 18 ч при 4 °С при различных рН не было обнаружено значительных изменений активности фермента

(сохранялось до 90% активности) в пределах рН 6-10. При более высоких и более низких значениях рН активность протеиназы снижалась. При рН 11 это снижение составило 25%, а при рН 3,5 - 40%. Следовательно, выделенная протеиназа является рН-стабильным ферментом.

Установлено, что оптимум аетивности секретируемой протеиназы находится при 48 °С. Определение температурной стабильности протеиназы проводили при инкубации фермента в течение 40 мин (рН 8,0) при различных температурах. Установлено, что фермент стабилен при температуре ниже 30 °С, при повышении температуры его активность довольно резко снижается и при температуре выше 50 °С сохраняется менее 5% активности.

Таблица 7. Действие ингибиторов на активность протеиназы А. аЧетШа

Ингибитор Концентрация, М Относительная активность (%) по отношению к

БАЛА казеину

100 100

ФМСФ 1,2 х 10-4 10'1 58 3 45 2

И-а-тозил-Ь-лизин-хлорметилкетон (ТЬСК) 1,4 х Ю-4 0 43

К-а-тозил-Ь-фенилаланин-хлорметилкетон (ТРСК) 1,4 х 10"4 98 99

Пепстатин 2,5 х 10"3 2 х 10'5 87 100 50 100

ЭДТА 10-2 97 98

о-фенантролин 6 х Ю-3 98 100

ПХМБ Ю-з 95 76

1,4-дитиотреитол (ДТТ) ю-з 98 100

Этанол 10% 98 65

Ингибиторный анализ, проведенный с целью выяснения природы функциональных групп активного центра очищенного фермента (табл. 7) показал, что активность секретируемой протеиназы, определяемая как по синтетическому субстрату, так и по казеину, практически полностью подавляется ингибитором сериновых протеиназ - фенилметилсульфонилфторидом (ФМСФ).

Кроме того, хлорметилкетон тозил-Ь-лизина вызывал полное ингибирование активности, измеряемой по БАЛА, а протеолитической активности, измеряемой по казеину, на 57%. Небольшое, но заметное подавление активности (особенно по гидролизу казеина) наблюдалось при использовании ингибитора цистеиновых протеиназ - п-хлормеркурибензоата (ПХМБ). Сходное ингибирование внеклеточных сериновых протеиназ грибов Acremonium chrysogenum и Aríhrobotrys oligospora ПХМБ обнаружено также в работах других авторов (Stepanov et al., 1986; Tunlid et al., 1994).

Изучение субстратной специфичности показало, что очищенный фермент гидролизует субстраты, характерные для трипсин-подобных протеиназ (табл. 8); этот факт хорошо подтверждает данные ингибиторного анализа. При этом субстраты других сериновых протеиназ химотрипсин- и субтилизин-подобного типа практически не гидролизовались. Субстраты, содержащие аргинин, расщеплялись лучше, чем субстраты, содержащие лизин; в обоих случаях более длинные субстраты гидролизовались на порядок быстрее, чем короткие. Как видно из данной таблицы, секретируемая протеиназа обладает значительной эстеразной активностью.

Таблица 8. Субстратная специфичность внеклеточной протеиназы A. altérnala

Субстрат Активность, мкмоль/мл мин

1. Glp-Phe-Aia-pNa 0,00024

2. Glp-Ala-Ala-Phe-pNa 0

3. Suc-Phe-pNa (СФПА) 0

4. Z-Ala-Ala-Leu-pNa 0,00064

5. a-N-Bz-DL-Arg-pNa (БАПА) 0,23

6. Z-D-Pro-Phe-ArR-pNa 2,4

7. Z-D-Val-Leu-Lvs-pNa 1,9

8. a-N-Bz-DL-Lys-pNa 0,04

9. a-N-Bz-DL-ArR-BNa 0,04

10. a-N-Bz-L-Arg-OEt 1,5

Glp — пироглутамил, Suc — сукцинил, Z — бензоилоксикарбонил, Bz — бензоил, PNa — (1-нафтиламкд, pNa — п-нитроанилид, О Et — этиловый эфир.

Таким образом, проведенные исследования показали, что внеклеточный протеолитический фермент A. altemala, синтезируемый и секретируемый только в случае присутствия белка в культуральной среде, является рН-стабильной трипсин-подобной сериновой протеиназой, возможно, содержащей SH-группу вблизи активного центра. Изученные свойства выделенного фермента (молекулярная масса, рН- и температурный оптимум активности, рН- и температурная стабильность, субстратная специфичность) близки к свойствам большинства описанных внеклеточных сериновых протеиназ грибов.

Установлено, что активность очищенной протеиназы A. alternata эффективно подавляется выделенными нами анионными ингибиторами сериновых протеиназ из семян гречихи (рис. 8). Характер обнаруженных зависимостей указывает на то, что в случае ИТ-I и ИТ-2 происходит прочное связывание ингибитора с ферментом в стехиометрическом отношении 1:1. В то же время связывание ИТ-4 с изучаемым ферментом является непрочным. Наблюдаемое ингибирование in vitro может служить косвенным доказательством участия внеклеточных протеаз грибов и растительных ингибиторов протеаз во взаимодействии патогенного гриба и растения-хозяина.

ИТ-1 ИТ-2 ИТ-4

0.0

0.5

1.0 1.5

—I— 2.0

2.5

Ингибитор/прспеиназа, моль/моль

Рис. 8. Зависимость активности внеклеточной протеиназы А. аШтаЮ от концентрации ИТ.

В заключение хотелось бы отметить, что проведенная работа может иметь значение для дальнейшего изучения взаимодействия грибов с высшими

растениями. Выделенная и очищенная внеклеточная трипсин-подобная протеиназа A. altemata может быть использована для последующего изучения молекулярных механизмов взаимодействия внеклеточных протеолитических ферментов грибов и растительных белковых ингибиторов протеаз и адаптации микромицетов к ингибиторам протеаз.

ВЫВОДЫ:

1. Установлено наличие в семенах гречихи множественных форм ингибиторов трипсина. В результате разделения и очистки анионных ИТ из гречихи три ингибитора (ИТ-1, ИТ-2 и ИТ-4) были получены в гомогенном состоянии.

2. Молекулярные массы выделенных ингибиторов лежат в пределах 7,7-9,2 кДа. Кроме трипсина, ИТ-1 и ИТ-2 ингибируют химотрипсин, хотя и менее эффективно.

3. Реактивный центр каждого из изученных ингибиторов содержит остаток аргинина. Получены данные, позволяющие предположить существование у них одного центра связывания ферментов. Исследованные ингибиторы характеризуются высокой устойчивостью в кислой и щелочной областях рН и стабильностью при высоких температурах.

4. На основании установленной первичной структуры ИТ-1 идентифицирован как член семейства картофельного ингибитора I. Доказано, что ИТ-1 заметно отличается от других белков, отнесенных к этому семейству, по ряду свойств (молекулярной массе, специфичности и строению реактивного центра).

5. Изучение влияния условий культивирования на синтез и секрецию протеаз грибами Alternaría altemata и Fusarium oxysponitn показало, что присутствие белка в среде культивирования является необходимым условием для продукции внеклеточных протеаз.

6. Выделена и очищена внеклеточная протеиназа мицелиального гриба A. altemata, имеющая молекулярную массу 33 кДа и оптимум активности при рН 8,0 - 9,1 и температуре 48 °С. Изученный фермент является рН-стабильной трипсин-подобной сериновой протеиназой.

7. Показано, что ИТ-1 способен вызывать угнетение роста мицелия микромицетов A. altemata и F. oxysporum и подавлять прорастание спор A. altemata.

In vitro ИТ-1 ингибирует протеолитическую акгавность, секретируемую этими

грибами в процессе роста. Вероятно, ИТ-1 является одним из компонентов

защитной системы растений и может быть использован при селекции растений,

устойчивых к грибной инфекции.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Дунаевский Я.Е., Павлюкова Е.Б., Белякова Г.А., Белозерский М.А. Ингибиторы трипсина и внеклеточных сериновых протеиназ микромицетов из семян гречихи // Тезисы докладов III симпозиума "Химия протеолитических ферментов". Москва. 1993. С. 96.

2. Дунаевский Я.Е., Павлюкова Е.Б., Белозерский М.А. Свойства ингибиторов трипсина и сериновых протеиназ микромицетов, выделенных из семян гречихи // Биоорганическая химия. 1994. Т. 20, № 3. С. 297-302.

3. Дунаевский Я.Е., Павлюкова Е.Б., Белякова ГА., Белозерский МА Анионные ингибиторы трипсина из покоящихся семян гречихи: вьщеление, специфичность действия и влияние на рост микромицетов // Биохимия. 1994. Т. 59, № 7. С. 990-996.

4. Дунаевский Я.Е., Павлюкова Е.Б., Белякова ГА, Белозерский МА. Полиформизм ингибиторов трипсина в семенах гречихи и их связь с устойчивостью растений к поражению грибной микрофлорой // Материалы конференции "Молекулярно-генетические маркеры и селекция растений". Киев, Украина. 1994. С. 20.

5. Dunaevsky Y.E., Pavlukova Е.В., Beliakova GA, Belozersky M.A. Interaction of protein inhibitors from the seeds of buckwheat, and proteases secreted by micromycetes Alternaría altérnala and Fusarium oxysporum // Biología plantarum. 1994. V.36. (Abstracts 9-th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology, Brno, Czech. Republic). S. 330.

6. Dunaevsky Y.E., Pavljukova E.B., Beliakova GA, Belozersky MA Inhibitors of trypsin and extracellular serine proteinases of micromycetes from buckwheat seeds // Abstracts 16-th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology. New Delhi, India. 1994. V. II. P. 78.

7. Pavjjukova E.B., Dunaevsky Y.E., Belozersky M.A. Isolation, properties of the protease secreted by Alternaría altemata and its interaction with protein inhibitors from

buckwheat seeds // Abstracts 16-th International Congress of Biochemistry and Molecular biology. New Delhi, India. 1994. V. II. P. 165.

8. Dunaevsky Y.E., Beliakova G.A., Pavlukova E.B., Belozersky M.A. The role of the protease inhibitors of the seeds in plant defence reactions // Abstracts 3-rd EFPP conference "Environmental biotic factors in integrated plant disease control". Poznan, Poland. 1994. P. 96.

9. Дунаевский Я.Е., Белякова Г.А., Павлюкова Е.Б., Белозерский М.А. Влияние условий культивирования на образование и секрецию протеаз грибами Alternaría altérnala и Fusarium охузрогиЩМикробис^^ия. 1995. Т. 64, № 3. Р. 327-330.

Ю.Дунаевский Я.Е., Павлюкова Е.Б., Белякова Г.А., Белозерский М.А. О физиологической роли ингибиторов протеаз растений: две группы функционально активных ингибиторов в семенах гречихи // Молекулярная биология. 1995. Т. 29, № 6. С. 1258-1264.

11.Dunaevsky Y.E., Beliakova G.A., Pavlukova Е.В., Belozersky M.A. Characterization of a system inhibitor-protease involved in development of a defense reaction in buckwheat seeds in response to pathogen attack // European Journal of Plant Pathology (Abstract of XIII International Plant Protection Congress. Hague, Netherlands). 1995. P. 176.

12.Dunaevsky Y.E., Pavljukova E.B., Beliakova G.A., Belozersky M.A. Two groups of protease inhibitors functionally active in buckwheat seeds // Current Advances in Buckwheat Research. 1995. P. 743-748.

13.Dunaevsky Y.E., Pavljukova E.B., Belozersky M.A. Isolation and properties of anionic protease inhibitors from buckwheat seeds // Biochemistry and Molecular Biology International. 1996. V. 40, № 1. P. 199-208.

14.Дунаевский Я.Е., Павлюиш Е.Б., Грубам^Г.Н., Белякова Г.А., Белозерский М.А. Внеклеточная протеаЯГмикромицета Alternaría alternata // Биохимия. 1996. Т. 61, № 10. С. 1904-1910.

/