Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Трансформация картофеля и табака генами дефензинов и ингибитора протеиназ BWI-1a

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Трансформация картофеля и табака генами дефензинов и ингибитора протеиназ BWI-1a"

Направахрукописи

ЧЕРЕДНИЧЕНКО Михаил Юрьевич

ТРАНСФОРМАЦИЯ КАРТОФЕЛЯ И ТАБАКА ГЕНАМИ ДЕФЕНЗИНОВ И ИНГИБИТОРА ПРОТЕИНАЗ BWI-1a

Специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии им. КА. Тимирязева.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация

доктор биологических наук, академик РАСХН, проф. Шевелуха B.C.

доктор биологических наук Поляков А.В.

кандидат биологических наук Огаркова О.А.

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Защита диссертации состоится « КЧ » декабря 2004 г. в 11 на заседании диссертационного совета Д.220.043.10 при Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49 (тел/факс 976-40-72).

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке МСХА им. К.А. Тимирязева.

Автореферат разослан ¡SU ноября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Г.И. Карлов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Картофель (Solanum tuberosum L.) является одной из ведущих сельскохозяйственных культур как в нашей стране, так и во всем мире. Однако многие из районированных его сортов не обладают устойчивостью к вирусным, бактериальным и грибным патогенам. Потери урожая от болезней в период вегетации и хранения составляют 25-30 %, а в годы эпифитотий могут доходить до 90 %.

Требования сельскохозяйственного производства к продуктивности и качеству сортов различных культур, в том числе картофеля, их устойчивости к болезням и вредителям постоянно растут. Поэтому создание форм картофеля, толерантных к биотическим стрессам, остается актуальной проблемой. Для решения этой задачи наряду с традиционными методами селекции целесообразно использование методов биотехнологии, и, в первую очередь, клеточной и генетической инженерии, которые позволяют ускорить селекционный процесс.

В генноинженерных программах по селекции сельскохозяйственных растений приоритет отдается использованию генов общей устойчивости, обеспечивающих защиту одновременно против нескольких видов фитопатогенов (Ryan, 1990, Michaud, 1997, Мосолов др., 2001, Парашина и др., 2000, Ляпкова и др., 2001). В связи с этим представляют интерес гены таких защитных растительных белков, как дефензины и ингибиторы протеолитических ферментов, обладающие широким спектром действия (Conceicao, Broekaert, 1998, Penninckx et al., 1996, Дунаевский и др., 2000).

Дефензины растений, представленные небольшими (около 5 кДа), обычно основными, цистеин-богатыми пептидами, принадлежат к семейству антимикробных белков со специфическим ар-мотивом (Bruix et al., 1993, Broekaert et al., 1995, De Samblanx et al., 1997). Это семейство антипатогенных белков достаточно широко представлено не только у растений, но и у других многоклеточных организмов, что свидетельствует о важности этих молекул как основных компонентов стратегии защиты от стрессовых факторов (Osbom et al., 1995, Terras et al., 1995, Thomma et al., 1998). В растениях экспрессия генов дефензинов может быть индуцирована как биотическими, так и абиотическими стрессами, что приводит к их накоплению в определенных типах клеток (Conceicao, Broekaert, 1998).

В работах по трансформации растений генами дефензинов имеются противоречивые данные об их эффективности, что явилось одним из важных мотивов для проведения таких экспериментов в нашем исследовании.

] юс нашкжми»« I шммши

I. УЯрда

Белки-ингибиторы протеолитических ферментов растений являются регуляторами эндогенных протеиназ и локализованы в межклеточном пространстве и клеточной стенке. Обнаружены также растительные ингибиторы протеиназ, активно действующие на экзогенные ферменты патогенных микроорганизмов и насекомых (Ryan, 1990, Валуева, Мосолов, 1995). Большинство известных и исследованных ингибиторов протеиназ из растений взаимодействуют с такими широко распространенными сериновыми протеиназами, как трипсин, химотрипсин и субтилизин. К настоящему времени ингибиторы протеиназ идентифицированы у многих видов растений (Мосолов и др., 1993, Antcheva et al., 1996, Bueno et al., 1999, Цыбина, 2002). При этом для разных видов растений показаны различия как по эффективности проводимых протеолитических реакций, так и по их направленности (EckeDcamp et al., 1993, Дунаевский и др., 2000, Мосолов и др., 2001).

Получение и анализ трансгенных линий растений, несущих гены дефензинов и ингибиторов протеиназ, может представлять как научный интерес при изучении экспрессии чужеродного гена в геноме генетически модифицированного организма (ГМО), так и иметь прикладное значение в селекционной практике.

Цель и задачи исследования. Целью наших исследований являлась оптимизация технологий трансформации, получение на их основе и изучение трансгенных растений картофеля, содержащих экспрессирующий ген rs дефензина редьки Rs-AFP2, ген ас дефензина амаранта Ac-AFP2, ген 1р ингибитора протеиназ гречихи BWI-la.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Изучить на различных вариантах питательных сред регенерационную способность различных типов эксплантов 20 сортов картофеля, отличающихся по своей устойчивости к основным фитопатогенам.

2. Оптимизировать методику трансформации картофеля и табака с целью повышения ее эффективности. Получить трансгенные растения картофеля с генами rs дефензина редьки и ас дефензина амаранта, а также трансгенные растения табака и картофеля с геном 1р ингибитора протеиназ гречихи.

3. Определить у трансформированных линий картофеля и табака наличие генетической вставки, ее копийность и уровень экспрессии.

4. Выявить возможные изменения у транс генных растений в уровне накопления растворимых фенольных соединений и лигнина.

Научная новизна и практическая ценность работы. Выявлены условия для эффективной регенерации и генетической трансформации 20 сортов картофеля отечественной и- -зарубежной,.. селекции, различающихся по степени

устойчивости к основным грибным и бактериальным патогенам. Определены сорта картофеля, обладающие наибольшей регенерационной способностью, и предложены условия проведения трансформации сортов картофеля и табака от этапа прекультивации до этапа регенерации. Впервые получены растения табака и картофеля, экспрессирующие ген 1р ингибитора сериновых протеиназ гречихи, который участвует в системе защиты растений от насекомых и фитопатогенных микроорганизмов. Полученные в работе результаты и разработанные методики могут быть использованы при размножении в культуре in vitro различных сортов картофеля и табака, при создании трансгенных линий и их оценке на устойчивость к различным заболеваниям. Созданные трансгенные линии картофеля с геном rs дефензина редьки, геном ас дефензина амаранта и геном 1р ингибитора протеиназ гречихи, экспрессирующие соответствующие пептидные антибиотики, могут быть использованы в качестве исходного материала в дальнейшей селекционной работе.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международной научно-практической конференции «Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке», Москва, 2000 г.; Международной научно-практической конференции молодых ученых «Молодые ученые -возрождению сельского хозяйства России в XXI веке», Брянск, 2000 г.; II Международной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2000 г.; научной конференции памяти Грегора Менделя, Москва, 2001 г.; Международной научно-практической конференции молодых ученых «Биотехнология - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке», Санкт-Петербург, 2001 г.; научной генетической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А. Р. Жебрака и 70-летию образования кафедры генетики в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева, Москва, 2002 г.; 2-ой конференции МОГиС им. Н.И. Вавилова, Москва, 2003 г.; IV Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2004 г.; Международном симпозиуме «Физиология трансгенных растений и проблемы безопасности», Москва, 2004 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных

работ.

Структура диссертационной работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и

обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Работа изложена на_

страницах машинописного текста, содержит_рисунков и_таблиц. Список

цитируемой литературы включает_наименований, из них__иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследования. В работе были использованы растения картофеля 20 сортов отечественной и зарубежной селекции. Стерильные пробирочные растения отобранных сортов были предоставлены к.б.н. Мусиным СМ. и к.б.н. Хромовой Л.М. (ВНИИ картофельного хозяйства им. АХ. Лорха). В экспериментах также использовались растения табака сорта Самсун, предоставленные к.б.н. Хадеевой Н.В. (ИОГен им. Н.И. Вавилова).

Векторные плазмиды: Генноинженерные конструкции, содержащие функциональные гены дефензинов редьки (rs) и амаранта (ас) были предоставлены ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии; векторная плазмида, содержащая ген ингибитора протеиназ гречихи (1р), была предоставлена НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова,

Культивирование эксплантов in vitro и получение регенерантов. Регенеранты из эксплантов получали методом прямого органогенеза на среде Мурасиге-Скуга (Murashige, Skoog, 1962), содержащей 3 % сахарозы и различные сочетания цитокининов и ауксинов.

Получение трансгенных растений. Трансформация картофеля проводилась по базовой методике, разработанной в лаборатории генной и клеточной инженерии ВНИИКХ им. А.Г. Лорха (Методические указания..., 1995). Агробактериальную трансформацию табака проводили по Horsch и др. (1985).

Анализ трансформированных растений. Выделение тотальной растительной ДНК производили по методу Edwards et al. (1991).

ПЦР-анализ проводили по стандартным методикам с использованием праймеров, комплементарных последовательности гена nptll.

Блот-гибридизацию по Саузерну проводили по стандартной методике (Маниатис и др., 1984). В качестве зонда использовали фрагмент ДНК, комплементарный соответствующему гену.

Для проведения Нозерн-блот-гибридизации ро1у(А)+-мРНК была изолирована с использованием набора для выделения мРНК (Quickprepmicro-mRNA purification kit, Pharmacia Biotech, США). В качестве зонда использовался фрагмент векторной конструкции длиной 1,2 т.н.п., содержащий ген 1р. Для выравнивания уровней экспрессии использовался ДНК-зонд длиной 1,8 т.н.п., содержащий TUAS-ген а-тубулинов арабидопсиса. Для визуализации гибридизации использовали систему Phosphorimager (Kodak, США).

Проведение биотеста. Штамм фитопатогенного гриба Fusarium sp. был предоставлен кафедрой фитопатологии МСХА им. К.А. Тимирязева. Штамм

бактерии Е. coli (DH1) был предоставлен лабораторией генетики растений ИОГен им. Н.И. Вавилова.

В случае тестирования антибактериального эффекта растертые фрагменты побега (стебли и листья) контрольных и трансгенных растений наносили на чашки Петри, предварительно засеянные бактериальной культурой (Е. coli)> is. инкубировали при комнатной температуре (22-25°С). Результаты теста оценивали через 24-48 часов.

Анализ фунгицидной активности проводили на чашках Петри, которые засевались спорами гриба Fusarium sp. Через 2 дня, после нарастания гриба, на чашку помещали растертые фрагменты побега (стебли и листья) контрольных и трансгенных растений и инкубировали при комнатной температуре (22-25°С). Результаты теста оценивали через 48-72 часа. В качестве контроля использовали экспланты нетрансформированных линий картофеля.

Определение содержания суммы растворимых фенольных соединений, флавоноидов и лигнина проводили по стандартным методикам (Запрометов, 1971, Загоскина и др., 2003).

Статистическая обработка данных. Статистические показатели и достоверность различий рассчитывали по Доспехову (1985). В таблицах приведены средние величины и указаны доверительные интервалы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Зависимость эффективности регенерации от генотипа выбранных сортов картофеля и условий проведения трансформации

Исследование генотип-специфичности различных сортов картофеля при культивировании и морфогенезе in vitro

Наиболее критичным этапом трансформации, от которого в основном зависит эффективность получения трансгенных растений, является этап регенерации, в связи с чем было проведено изучение регенерационной способности различных сортов картофеля в культуре in vitro на разных типах эксплантов на 4 вариантах питательных сред.

Зависимость эффективности регенерации различных сортов картофеля от типаэкспланта

Сравнительный анализ регенерационной способности 20 сортов картофеля проводили на стеблевых и листовых эксплантах. По результатам эксперимента, стеблевые экспланты всех взятых в анализ сортов давали больший процент регенерации, чем листовые экспланты (табл. 1).

Таблица 1.

Эффективность регенерации (%) различных сортов картофеля в зависимости от типа экспланта (в среднем по 4 вариантам питательных сред)

Эффективность регенерация, %

Сорт листовые стеблевые

экспланты экспланты

Альянс 4,6 ±2,0 45,3 ±4,9

Бинтье 5,9 ±1,9 38,8 ±4,6

Брянский ранний 3,5 ±1,4 64,1 ±4,8

Дезире 3,5 ±1,3 60,2 ±5,5

Десница 4,4 ±1,8 49,2 ±5,3

Жуковский ранний 3,7 ±1,7 39,5 ±3,5

Ильинский 2,8 ±1,1 42,4 ±2,9

Лорх 3,3 ±1,6 29,9 ±4,6

Лукъяновский 3,7 ± 1,6 39,7 ±4,3

Невский 1,5 ±0,6 38,5 ±5,2

Осень 1,8 ± 1,1 22,7 ±5,7

Петербургский 5,2 ±1,6 66,6 ±4,7

Раменский 5,0 ±2,1 57,1 ±5,5

Резерв 3,4 ±1,8 50,9 ±6,0

Синецвет 4,0 ±1,4 39,3 ±5,6

Сказка 2,6 ±1,1 43,0 ±4,9

Сотка 4,5 ±1,5 47,5 ±3,7

Удача 4,8 ±1,5 53,7 ±5,1

Эффект 5,3 ±1,5 59,9 ±4,4

Янтарный 4,4 ±1,5 66,2 ±5,5

У сортов Осень, Бинтье, Ильинский на среде с 5 мг/л 6-БАП, а также на сортах Лорх и Невский на средах с 5 мг/л 6-БАП + 0,5 мг/л ИУК и 5 мг/л 6-БАП вообще не удалось получить регенерацию из листовых эксплантов.

Зависимость эффективности регенерации различных сортов картофеля от концентрациирегуляторовроста в питательной среде

На 20 сортах картофеля отечественной и зарубежной селекции, отличающихся по степени устойчивости к основным фитопатогенам, была проведена оценка их регенерационной способности. Все анализируемые сорта картофеля показывали наибольшую эффективность регенерации из стеблевых эксплантов на средах, содержащих 3 мг/л цитокинина 6-БАП с добавлением или без добавления 0,5 мг/л ауксина ИУК (табл. 2).

Таблица 2.

Эффективность регенерации (%) сортов картофеля из стеблевых эксплантов в зависимости от гормонального состава среды

Сорт Эф< активность регенерации, %

ЗБАП ЗБАП/ 0,5 ИУК 5 БАП/ 0,5 ИУК 5 БАП

Альянс 56,1 ±5,4 55,4 ±3,8 48,5 ±7,1 26,3 ± 3,2

Бинтье 54,8 ±4,5 37,2 ± 3,6 32,6 ±3,5 30,6 ±6,8

Брянский ранний 76,3 ±5,1 70,1 ±5,8 68,6 ±3,9 41,7 ±4,2

Дезире 69,3 ±5,6 71,7 ±6,1 65,6 ±5,3 34,2 ±4,8

Десница 59,2 ± 6,9 52,7 ±3,5 57,5 ±7,3 27,2 ±3,6

Жуковский ранний 48,2 ±3,1 43,2 ±4,3 39,6 ±2,8 26,8 ±3,7

Ильинский 52,1 ±3,2 50,3 ±3,7 46,5 ±2,2 20,7 ±2,4

Лорх 45,2 ±5,6 27,9 ± 4,2 30,5 ±5,1 16Д ± 3,4

ЛуКЬЯНОВСКИЙ 43,6 ±4,2 47,7 ±5,1 37,3 ±5,3 30,2 ±2,6

Невский 56,6 ±6,8 40,2 ±3,4 42,7 ±3,2 14,4 ± 7,5

Осень 45,3 ±6,4 24,3 ±7,1 15,1 ±5,2 6,2 ±4,1

Петербургский 87,1 ±3,9 70,2 ±5,9 63,4 ±6,8 45,8 ±2,1

Раменский 80,2 ±4,9 61,1 ±5,9 54,7 ±5,1 32,2 ± 6,2

Резерв 79,7 ±7,1 56,2 ±6,6 45,9 ±5,2 21,6 ±5,1

Синецвет 54,2 ±7,1 42,3 ±4,1 37,1 ± 8,5 23,6 ±2,7

Сказка 57,2 ±5,1 49,1 ±3,2 42,6 ±5,9 23,2 ± 5,4

Сотка 60,8 ±5,9 58,2 ±3,3 45,9 ±2,5 25,1 ±3,0

Удача 68,2 ± 5,4 62,7 ±6,8 49,6 ±3,9 34,4 ±4,3

Эффект 74,1 ± 5,3 69,4 ±4,8 65,3 ±3,8 30,6 ±3,7

Янтарный 83,2 ±5,4 73,2 ±4,6 68,4 ±3,8 40,1 ± 8,0

Низкий выход регенерантов на средах, содержащих 5 мг/л БАЛ с добавлением или без добавления 0,5 мг/л ИУК, был обусловлен тем, что в этих вариантах экспланты образовывали каллус, из которого в дальнейшем не были получены регенеранты. Хотя подобные соотношения цитокининов и ауксинов используются при получении регенерантов из каллуса (Дмитриева, 1990), в нашем случае, по всей видимости, происходило угнетение морфогенной активности высокими концентрациями цитокинина.

Зависимость эффективности регенерации различных сортов картофеля от генотипа

Был проведен общий сравнительный анализ эффективности регенерации взятых в анализ сортов картофеля от типа экспланта и гормонального состава сред.

Из 20 изученных генотипов картофеля на 4 вариантах питательных сред с различным содержанием 6-БАП и ИУК наибольший морфогенный потенциал in vitro показали растения сорта Петербургский (87,1 %), Янтарный (83,2 %), Раменский (80,2 %), Резерв (79,7 %) и Брянский ранний (76,3 %), регенерировавшие побеги из стеблевых эксплантов на среде с 3 мг/л 6-БАП.

Однако для нас представляло интерес провести трансформацию сортов картофеля, изначально отличающихся друг от друга по степени устойчивости к грибным и бактериальным фитопатогенам. В связи с этим для получения трансгенных линий, экспрессирующих белки дефензина редьки RS-AFP2, дефензина амаранта Ac-AFP2 и ингибитора протеиназ гречихи BWI-la, нами были отобраны сорта, различающиеся именно по этой характеристике.

Таким образом, на первом этапе были отобраны генотипы, перспективные для проведения генетической трансформации, а также выявлены условия получения максимального выхода регенерантов - тип экспланта и гормональный состав среды для регенерации.

Определение оптимальной концентрации антибиотиков при проведении агробактернальной трансформация картофеля и табака

При проведении трансформации растений с помощью Agrobacterium tumefaciens необходимо использование различных антибиотиков на этапе регенерации: для избавления от внешней агробактрии - клафоран (цефотаксим), для селекции полученных трансформированных линий -канамицин.

Определение оптимальной концентрации антибиотика клафорана для ингибированияроста агробактерии

По данным наших экспериментов, достаточной концентрацией для подавления роста агробактерии оказалась концентрация клафорана 500 мг/л. При меньшей концентрации происходил агробактериальный зароет эксплантов и их последующая гибель, при большей замедлялся рост эксплантов, а у сортов картофеля Ильинский, Лорх, Лукъяновский и Осень достоверно снижалась эффективность регенерации. При концентрации 500 мг/л растения картофеля и табака практически не угнетались, и такая концентрация в подавляющем большинстве случаев являлась вполне достаточной для уничтожения внешней агробактерии и предотвращения агробактериального зароста эксплантов.

Определение оптимальной концентрации антибиотика канамицина для селекции трансформированные астений картофеля и табака

Векторные генетические конструкции, которыми были трансформированы сорта картофеля и табака, в качестве маркерного содержали ген прШ (неомицинфосфотрансферазы), определяющий устойчивость к антибиотику канамицину. Известно, что при использовании канамицина в качестве селективного агента возможен отбор псевдотрансформантов, однако увеличение концентрации канамицина в среде для более строгой селекции может привести к гибели даже истинных трансгенных растений.

Растения 20 сортов картофеля черенковали и помещали на среды, содержащие соответственно 25, 50 и 100 мг/л канамицина, а также, в качестве контроля, на среду, не содержащую данный антибиотик. Исходя из полученных в экспериментах данных, можно сделать вывод о том, что концентрация канамицина 50 мг/л является достаточной для проведения селекции растений картофеля. Именно эта концентрация канамицина использовалась в дальнейшем при проведении трансформации растений картофеля. На среде с концентрацией канамицина 100 мг/л выживали растения только четырех сортов картофеля: Раменский, Резерв, Удача и Эффект. Причем корни у этих растений практически не образовывались, а рост был очень низким.

Установлена оптимальная концентрация селективного антибиотика канамицина 150 мг/л при проведении трансформации табака. Отбор на средах, содержащих меньшую концентрацию, неэффективен, а при более высоких концентрациях возможно угнетение истинно трансгенных линий.

Влияние условий проведения трансформации растений картофеля на эффективность последующей регенерации

Было проведено исследование реакции эксплантов растений картофеля различных сортов на наличие или отсутствие освещенности во время прекультивации, в результате чего были выявлены генотип-зависимые различия. Так, экспланты сорта Альянс гораздо лучше сохраняли способность к регенерации после проведении прекультивации в темноте, экспланты сорта Десница, Жуковский ранний, Невский и Осень, наоборот, - на свету. По другим сортам достоверных различий в реакции не наблюдалось.

При сравнении эффективности регенерации у анализируемых сортов картофеля в зависимости от продолжительности этапа прекультивации (2, 5 суток) выявлялись сортовые различия. Так, растения сорта Синецвет регенерировали после трансформации только в том случае, если прекультивация проводилась в течение 2 суток. Сорта Жуковский ранний, Лорх и Сказка давали регенерацию после трансформации только с 5-дневной

прекультавацией. На остальных сортах регенерация наблюдалась в обоих вариантах в различном соотношении: например, у сорта Альянс регенерация шла преимущественно после 2-дневной прекультивации, а у сорта Эффект -после 5-дневной.

В серии опытов изучалась возможность оптимизации агробактериальной трансформации табака сорта Самсун путем добавления экссудата табака в суспензию агробактерии и использования цистеина (400 мг/л) в средах для культивирования. Как показали эксперименты, добавление цистеина как в среду для кокультивации, так и в среду для регенерации приводило к росту регенерационной способности эксплантов (76,3 % по сравнению с 53 % при использовании сред без добавления цистеина).

2. Трансформация сортов картофеля и табака генами фунгицидных белков

В результате проведенных экспериментов по агробактериальной трансформации сортов картофеля и табака генными конструкциями, содержащими функциональные гены га дефензина редьки, ас дефензина амаранта, 1р ингибитора протеиназ гречихи по оптимизированным методикам были получены генетически модифицированные линии 16 сортов картофеля и табака сорта Самсун.

Было получено 98 линий картофеля, трансформированных геном т дефензина редьки: 2 линии сорта Осень, 6 линий сорта Брянский ранний, 9 линий сорта Дезире, 16 линий сорта Янтарный, 7 линий сорта Альянс, 8 линий сорта Десница, 6 линий сорта Сотка, 11 линий сорта Лорх, 12 линий сорта Сказка, 11 линий сорта Синецвет, 6 линий сорта Эффект, 4 линий сорта Жуковский ранний.

Было получено 10 линий картофеля, трансформированных геном ас дефензина амаранта: 3 линии сорта Осень, 3 линии сорта Брянский ранний, 3 линии сорта Раменский, 1 линия сорта Бинтье.

Было получено 145 линий картофеля и табака, трансформированных геном 1р ингибитора протеиназ гречихи: 5 линий картофеля сорта Резерв, 2 линии картофеля сорта Удача, 138 линий табака сорта Самсун.

3. Молекулярный анализ полученных трансформированных линий

ПЦР-анализ трансформированных линий картофеля и табака

Доказательство трансгенной природы трансформированных линий картофеля было проведено методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Так как во всех векторных конструкциях в качестве селективного маркера при трансформации был использован ген прШ неомицинфосфотрансферазы, в реакции амплификации были использованы последовательности праймеров, комлементарные ^Ш-гену, с помощью которых нарабатывался фрагмент соответствующей длины. В качестве положительного контроля использовалась ПЦР-смесь, содержащая ДНК вектора (~10 пкг), в качестве отрицательного контроля использовали ПЦР-смесь, не содержащую ДНК.

Рис. 1. Результаты ГЩР-анализа трансформированных линий картофеля: а) сорт Янтарный, б) сорт Десница (дорожки 1-5) и сорт Альянс (дорожки 6-10).

Результаты проведенного тестирования представлены на рис. 1. Как было показано в результате проверки, не все трансформированные линии, регенерировавшие на среде с канамицином (50 мг/л), были истинными трансгенами (табл. 3).

Как следует из табл. 3, количество трансгенных линий было неодинаково у разных сортов картофеля, что дает возможность предполагать наличие генотипических различий в эффективности трансгеноза. Наибольший процент трансгенных растений был получен для сорта Янтарный (75 %), что совпадает с результатами других исследований (Аветисов, 1997), где также отмечали высокую способность данного сорта к трансформации.

Таблица 3.

Эффективность трансгеноза (%)

Сорт Количество трансформированных линий Количество трансгенных линий Эффективность трансгеноза, %

Альянс 7 2 28,6

Дезире 9 5 55,5

Десница 8 2 25,0

Раменский 3 1 33,3

Резерв 5 3 60,0

Янтарный 16 12 75,0

Таким образом, в результате проведенного ПЦР-анализа 40 линий 4 сортов картофеля (Альянс, Дезире, Десница и Янтарный), трансформированных генетическими конструкциями, содержащими ген гз дефензина редьки; 3 линий сорта Раменский, трансформированных геном ас дефензина амаранта, и 5 линий сорта Резерв, трансформированных геном 1р ингибитора протеиназ гречихи, была подтверждена трансгенная природа: 21 линии 4 сортов картофеля (Альянс, Дезире, Десница и Янтарный), трансформированной геном гз дефензина редьки, 1 линии сорта Раменский, трансформированной векторной конструкцией, несущей ген ас дефензина амаранта, и 3 линий сорта Резерв, трансформированных геном 1р ингибитора протеиназ гречихи.

Аналогично методом ПЦР были протестированы линии табака сорта Самсун, трансформированные векторной конструкцией, несущей ген 1р ингибитора протеиназ гречихи (рис. 2). Из 138 трансформированных линий табака положительный результат при ПЦР-анализе дали 125 линий, что составляло 90,5 %.

Рис. 2. Результаты ПЦР-анализа трансформированных линий табака сорта Самсун

Такой высокий процент трансгенных линий, полученных при трансформации табака, по сравнению с аналогичным показателем при трансформации картофеля можно объяснить прежде всего выбранной схемой селекции на высокой концентрации канамицина (150 мг/л), что резко сокращало количество регенерировавших псевдотрансформантов. В то же время, как было сказано выше, на картофеле селекцию при столь высоких концентрациях канамицина проводить нельзя из-за полного ингибирования ростовых процессов.

Анализ трансформированных линий картофеля и табака методом блот-гибридизации по Саузерну

Для проведения Саузерн блот-анализа были отобраны линии, наличие в которых вставки было показано методом ПЦР. Всего были проанализированы 2 трансгенные линии картофеля сорта Дезире (Дез-13/1, Дез-12/9), 1 трансгенная линия сорта Десница (Д-8/1) и 1 трансгенная линия сорта Альянс (Ал-16/1), несущие конструкцию с геном rs дефензина редьки; 3 линии картофеля сорта Резерв (Рез-18/12, Рез-24/1, Рез-17/2) и 5 линий табака сорта Самсун (С-20/2, С-31/14, С-15/6, С-34/22, С-38/7), трансформированных векторной конструкцией, содержащей ген 1р ингибитора протеиназ гречихи.

В качестве зонда как в случае гена rs, так и в случае гена 1р был использован фрагмент векторной конструкции, захватывающий целевой ген. Для блот-гибридизации по Саузерну геномная ДНК растений-транформантов обрабатывалась рестриктазами PstI (rs-трансформанты) и BgUI (Ip-трансформанты). На рис. 3 представлены результаты блот-гибридизации рестрицированной ДНК трансформированных линий с 32Р-меченой ДНК зонда.

У всех линий, трансформированных конструкцией с геном rs, наблюдался общий фрагмент длиной 0,95 т.н.п., соответствующий фрагменту генной конструкции (рис. За). В трех случаях при гибридизации ДНК линий картофеля присутствовал еще один фрагмент, вариабельный по длине, что объясняется различным расположением сайта рестрикции в геномной ДНК, фланкирующей вставку трансгена. Присутствие двух гибридизующихся фрагментов свидетельствует о монокопийности вставки в этих линиях. В целом преобладание одиночных инсерций совпадает с литературными данными по частотности встраивания генных конструкций при Т-ДНК-опосредованной агробактериальной трансформации (Raina et al., 1998).

а 6

12345 123456

Рис. 3. Результаты анализа трансгенных линий картофеля и табака методом блот-гибридизации по Саузерну: а) ген га (1 - Ал-16/1,2 - Дез-13/1, 3 - Дез-12/9,4 - Д-8/1,5 - контроль); б) ген 1р (1 - Рез-24/1,2 - Рез-18/12, 3 - Рез-17/2,4 - С-20/2,5 - С-34/22,6 - контроль) (в качестве контроля брали ДНК нетрансформированного растения сорта Резерв)

В случае линии Д-8/1, характеризующейся присутствием трех фрагментов, можно говорить о наличие двух копий трансгенной конструкции в геноме трансформированной линии.

У всех линий, трансформированных конструкцией с геном 1р, наблюдался общий фрагмент длиной 0,6 т.н.п., соответствующий фрагменту генной конструкции (рис. 36). В пяти случаях при гибридизации ДНК линий картофеля и табака присутствовал дополнительный фрагмент различной длины, что, аналогично случаю с к-геном, объясняется гибридизацией с районами, фланкирующими инсерции.

Таким образом, были проанализированы 4 линии картофеля (Дез-13/1, Дез-12/9 сорта Дезире, Д-8/1 сорта Десница и Ал-16/1 сорта Альянс), трансформированные геном п, 3 линии картофеля (Рез-18/12, Рез-24/1, Рез-17/2 сорта Резерв) и 5 линий табака (С-20/2, С-31/14, С-15/6, С-34/22, С-38/7 сорта Самсун), трансформированных геном 1р; подтверждена их трансгенная природа, а также определена копийность встроенной векторной конструкции. У всех линий, наличие в которых генных конструкций было показано методом ПЦР, выявляли инсерции и методом блот-гибридизации по Саузерну.

Проверка фунгицндной и антибактериальной устойчивости полученных линий картофеля и табака (биотест)

Для обнаружения антибактериального и фунгицидного действия полученных трансгенных линий картофеля и табака был проведен биотест. Для биотестирования фунгицидного действия трансгенных линий нами были проведены эксперименты с фитопатогенным грибом Fusarium sp. В опытах на трансгенных линиях табака, несущих ген rs дефензина редьки и ген 1р ингибитора протеиназ гречихи, был показан фунгицидный эффект, заключавшийся в остановке роста гриба на расстоянии >5 мм от эксплантов трансгенных линий, в то время как контрольные (нетраясформированные) варианты зарастали полностью.

Биотестирование антибактериальной активности встроенных генов проводили на чашках Петри, предварительно засеянных культурой Е. coli (штамм DH1). Антибактериальный эффект действия гена 1р наблюдался на трансгенных линиях картофеля сорта Резерв - Рез-24/1 и Рез-18/12 - и линий табака сорта Самсун - С-23/12, С-31/14, С-34/22 и С-38/7.

Таким образом, можно сделать вывод, что растения трансгенных линий картофеля и табака производят функциональные белки - дефензин редьки и ингибитор протеиназ гречихи, - которые оказывают защитное действие и подавляют развитие бактерии и гриба. Причем линии, наличие в которых вставки было подтверждено методом ПЦР и блот-гибридизацией по Саузерну, демонстрировали экспрессию соответствующего белка и в биотестах.

Анализ экспрессии функционального гена 1р в клетках трансформированных линий картофеля и табака

Для детекции транскрипта мРНК гена ингибитора протеиназ в полученных трансгенных линиях табака и картофеля, трансформированных конструкцией с геном 1р ингибитора протеиназ гречихи, и определения уровня экспрессии гена был проведен Нозерн-блот-анализ. Для гибридизации были отобраны 6 трансгенных линий картофеля - Рез-24/1, Рез-18/12, и Рез-17/2 - и табака - С-20/2, С-34/22 и С-23/12. Линии Рез-24/1, Рез-18/12, Рез-17/2, С-23/12 и С-34/22, по данным проведенного биотеста, показывали антибактериальную и антигрибную активность, в то время как линия С-20/2 таковой не проявляла.

У линий картофеля Рез-24/1, Рез-17/2 и Рез-18/12 сорта Резерв и линий табака С-34/22 и С-20/2 сорта Самсун был определен транскрипт мРНК, ожидаемой длины (~200 н.п.) (рис. 4).

1 2 3 4 5 6

Рис.4. Результаты Нозерн блот-гибридизации трансгенных линий картофеля (1 - Рез-24/1,2 - Рез-17/2,3 - Рез-18/12) и табака (4 - С-34/22,5 - С-20/2)

Как следует из рис. 4, уровень экспрессии гена 1р ингибитора протеиназ гречихи у различных линий картофеля и табака отличался. Количество мРНК было наибольшим в линии картофеля сорта Резерв Рез-18/12, что коррелировало с данными, полученными в ходе биотеста. У линий картофеля сорта Резерв Рез-17/2, Рез-24/1 и линии табака сорта Самсун С-34/22 отмечался более низкий уровень экспрессии гена 1р. Однако в связи с тем, что все протестированные в данном эксперименте линии демонстрировали антимикробную активность в биотесте, можно высказать предположение, что, несмотря на такой уровень экспрессии гена 1р, данного количества мРНК достаточно для проявления фунгицидной и антибактериальной активности.

Таким образом, была показана экспрессия гена 1р ингибитора протеиназ гречихи в клетках растений картофеля и табака. Анализ экспрессии гена у шести трансгенных линий картофеля и табака выявил различия уровня транскрипции этого гена. Показано, что различия в количестве лтранскрипта коррелируют с данными, полученными в результате биотеста.

Анализ содержания февольных соединений в трансформированных растениях картофеля

Ранее было показано, что полифенолы, наряду с целлюлозой, образуют барьер на пути проникновения патогенных микроорганизмов (Запрометов, 1992, 1996, Беляев и др., 1989), ингибируя рост и развитие патогенных микроорганизмов и, прежде всего, грибов, а также продуцирование и активность их метаболитов. В случае инфицирования в месте проникновения часто наблюдается активация синтеза фенольного полимера - раневого лигнина, выполняющего ряд защитных функций (Запрометов, 1996).

Таблица 4.

Содержание суммы растворимых фенольных соединений (РФС), флавоноидов (ФЛ) и лигнина (ЛГ) в контрольных и трансгенных линиях картофеля различных сортов

Сорт Линия РФС, мг/г свежей массы ФЛ, мг/г свежей массы ЛГ, мг/г свободного от экстрактивных веществ остатка

Дезире контроль 2,14 ±0,13 1,31 ±0,03 3,22 ±0,23

Дез-13/1 0,98 ±0,08 0,13 ±0,01 4,51 ±0,31

Дез-12/9 0,83 ± 0,07 0,16 ±0,01 2,99 ±0,21

Резерв контроль 1,02 ±0,11 0,16 ±0,02 2,44 ±0,18

Рез-24/1 1,01 ±0,09 0,08 ±0,01 4,36 ±0,33

Рез-17/2 1,04 ±0,08 0,23 ±0,02 2,35 ±0,15

Рез-18/12 2,07 ±0,12 0,46 ±0,02 не опр.

Раменский контроль 0,72 ±0,04 0,49 ±0,02 не опр.

Рам-14/1 1,57 ±0,08 0,66 ±0,03 не опр.

Десница контроль 2,71 ± 0,13 1,64 ±0,03 не опр.

Д-8/1 2,39 ±0,11 0,49 ±0,02 не опр.

В связи с тем, что существует зависимость биосинтеза фенольных соединений в тканях растений от их генотипа (Власкж, 1979, Калашникова, 2003), были исследованы полученные трансгенные линии картофеля сорта Дезире (Дез-13/1 и Дез-12/9) и сорта Десница (Д-8/1), трансформированные конструкцией, содержащей ген п дефензина редьки, трансгенная линия сорта Раменский (Рам-14/1) со встроенным геном ас дефензина амаранта и трансгенные линии сорта Резерв (Рез-24/1, Рез-17/2 и Рез-18/12), несущие ген 1р ингибитора протеиназ гречихи, для того чтобы оценить уровни накопления в них растворимых фенольных соединений (РФС), в том числе наиболее распространенных их представителей - флавоноидов, а также фенольного полимера лигнина. В качестве контроля использовали растения ^трансформированных линий соответствующих сортов.

Как следует из данных, представленных в табл. 4, существуют межсортовые различия в уровне накопления РФС, при этом у контрольных линий сортов Резерв и Раменский отмечался более низкий показатель содержания РФС по сравнению с растениями сортов Дезире и Десница.

Трансгенные растения картофеля сорта Дезире содержали почти вдвое меньшее количество РФС по сравнению с растениями исходного сорта, а накопление флавоноидов снижалось в 8-10 раз. Что же касается накопления

лигнина, то в трансгенной линии Дез-13/1 оно было примерно на 40 % выше, чем в контроле, в то время как у линии Дез-12/9 - достоверно не отличалось от контроля. У трансгенной линии сорта Десница Д-8/1 также наблюдалось снижение содержания РФС, в том числе и флавоноидов, причем уровень последних падал в 3 раза.

По-видимому, введение гена гз в геном растений картофеля вызывает снижение уровня РФС (фенилпропаноидов и флавоноидов), что может быть следствием либо их преимущественного вовлечения в синтез лигнина, что наблюдалось у линии Дез-13/1, либо ослабления их биосинтетической способности, что наблюдалось у линий Дез-12/9 и Д-8/1.

У трансгенной линии Рам-14/1 наблюдался рост как содержания РФС, так и уровня флавоноидов.

Полученные трансгенные линии сорта Резерв практически не отличались от контрольных растений по содержанию РФС. При этом уровень лигнина в растениях трансгенной линии Рез-24/1 был в 1,8 раза выше, а уровень флавоноидов в 3 раза выше, чем в контроле; у линии Рез-17/2 не происходило значительных изменений в накоплении лигнина, в то время как уровень флавоноидов повышался.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны и предложены условия оптимизации процесса трансформации картофеля на этапах от прекультивации до регенерации. Установлено, что наибольшей регенерационной способностью обладали стеблевые экспланты сортов Петербургский, Янтарный, Раменский, Резерв и Брянский ранний на среде, содержащей 3 мг/л 6-БАП с добавлением и без добавления 0,5 мг/л ауксина ИУК.

2. Методом агробактериальной трансформации получено 98 линий 12 сортов картофеля (Осень, Брянский ранний, Дезире, Янтарный, Альянс, Десница, Сотка, Лорх, Сказка, Синецвет, Эффект и Жуковский ранний), трансформированных геном гз дефензина редьки; 10 линий 4 сортов картофеля (Осень, Брянский ранний, Раменский, Бинтье), трансформированных геном ас дефензина амаранта; 7 линий 2 сортов картофеля (Резерв и Удача) и 138 линий табака сорта Самсун, трансформированных геном 1р ингибитора протеиназ гречихи.

3. Методом ПЦР и Саузерн блот-гибридизации показана трансгенная природа 2 трансформированных линий картофеля сорта Дезире, несущих конструкцию с геном гз дефензина редьки; 3 линий картофеля сорта Резерв и 5 линий табака сорта Самсун, трансформированных векторной конструкцией,

содержащей ген Jp ингибитора протеиназ гречихи. Определена преимущественно монокопийность встроенных генных конструкций.

4. С помощью биотеста, проведенного на грибе Fusarium sp. и бактерии Escherichia coli, показано, что в 2 трансгенных линиях картофеля сорта Дезире, несущих ген rs дефензина редьки, 2 трансгенных линиях картофеля сорта Резерв и 4 трансгенных линиях табака сорта Самсун, несущих ген 1р ингибитора протеиназ гречихи, происходит экспрессия соответствующих генов.

5. На уровне мРНК показана экспрессия гена Jp ингибитора протеиназ гречихи в клетках растений 3 трансгенных линий картофеля сорта Резерв и 2 трансгенных линий табака сорта Самсун. Анализ экспрессии гена выявил различия в уровне транскрипции у протестированных линий: у линии картофеля сорта Резерв Рез-18/12 количество транскриптов было максимальным. Различия в количестве Тр-транскрипта коррелируют с данными, полученными в результате биотеста.

6. Показано, что у трансгенных растений различных сортов картофеля изменяется концентрация растворимых фенольных соединений, в том числе флавоноидов, и уровень накопления лигнина. Показаны межсортовые различия по этим показателям.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чередниченко М.Ю., Чухнина ЕМ., Камшонкова А.С., Хромова Л.М., Кочиева Е.З. Использование гена rsl для трансформации сортов картофеля // Тезисы Международной научно-практической конференции «Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке».24-27 июля 2000 г. - с. 325.

2. Чередниченко М.Ю., Камшонкова А.С., Чухнина Н.М. Влияние условий прекультивации и векторных конструкций на эффективность регенерации различных сортов картофеля // Материалы Международной научно-практической конференции молодых ученых «Молодые ученые -возрождению сельского хозяйства России в XXI веке». Брянск, 2-5 октября 2000г.-с. 73-74.

3. Чередниченко М.Ю., Чухнина Н.М., Камшонкова А.С. Получение трансгенных растений различных сортов картофеля, несущих ген дефензина rs-1 // Материалы научной конференции памяти Грегора Менделя. 20 февраля 2001 г. - М.: Изд-во МСХА, 2001. - с. 151-152.

4. Чередниченко М.Ю. Создание трансгенных растений картофеля, несущих ген пептидного антибиотика дефензина // Доклады ТСХА. Вып. 273, ч. 1. - М.: Изд-во МСХА, 2001. - с.18-22.

5. Чередниченко М.Ю. Трансформация сортов картофеля геном ас пептидного антибиотика дефензина // Материалы научной генетической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А. Р. Жебрака и 70-летию образования кафедры генетики в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева. Москва, 26-27 февраля 2002 г. - М.: Изд-во МСХА, 2002.-с. 350-352.

6. Чередниченко М.Ю., Вальдеррама Ромеро А.С. Получение трансгенных линий картофеля, несущих ген пептидного антибиотика // Аллоцитоплазматическая пшеница и некоторые аспекты биотехнологии растений. - Мл Компания Спутник+, 2002. - с. 107-113.

7. Чередниченко М.Ю. Трансформация сортов картофеля генами дефензинов. // Материалы 2-й конференции МОГиС им. Н.И. Вавилова. Москва, 20-21 февраля 2003 г. Т.2. - с. 197-199

8. Чередниченко М.Ю. Эффективность регенерации при трансформации сортов картофеля // Известия ТСХА, 2003. Вып. 1. - с. 108-115.

9. Чередниченко М.Ю., Денчик А.М., Кузьмина Н.А. Использование генов ингибиторов протеиназ для повышения устойчивости растений к биотическим стрессовым факторам // Тез. докл. IV Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». 31 марта 2004 г. - с.35-36.

10. Чередниченко М.Ю., Гладышко Т.О., Шейко И.А., Загоскина Н.В. Трансгенные растения картофеля и образование в них фенольных соединений // Сборник тезисов Международного симпозиума «Физиология трансгенных растений и проблемы безопасности», Москва, 29 ноября - 3 декабря 2004 г. -

с.35.

Объем 1,25 п. л.

Зак. 258

Издательство МСХА 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

Тир. 100 экз.

»26132

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чередниченко, Михаил Юрьевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ингибиторы протеиназ растений

1.1.1. Протеолитические ферменты

1.1.2. Ингибиторы протеиназ растений

1.1.2.1. Локализация и индукция действия ингибиторов протеиназ растений

1.1.2.2. Участие ингибиторов протеиназ в регуляции активности внутриклеточных ферментов растений

1.1.3. Ингибиторы протеиназ в системе защиты растений от биотических стрессов

1.1.3.1. Ингибиторы протеиназ в системе защиты растений от насекомых

1.1.3.2. Ингибиторы протеиназ в системе защиты растений от патогенных микроорганизмов

1.2. Дефензины растений

1.2.1. Структура дефензинов растений

1.2.2. Локализация и предполагаемый механизм действия дефензинов растений

1.2.3. Классификация дефензинов растений

1.2.4. Фунгицидная активность дефензинов растений

1.2.5. Бактерицидная активность дефензинов растений

1.2.6. Вклад дефензинов в защиту растения-хозяина

1.3. Болезни картофеля

1.4. Генетическая инженерия картофеля

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Растительный материал

2.2. Векторные конструкции

2.3. Культивирование эксплантов in vitro

2.4. Методика проведения трансформации растений картофеля и табака

2.5. Молекулярный анализ полученных трансформированных линий картофеля и табака

2.6. Определение суммы растворимых фенольных соединений, накопления флавоноидов и лигнина

2.7. Статистическая обработка данных

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Зависимость эффективности регенерации от генотипа выбранных сортов картофеля и условий проведения трансформации

3.1.1. Морфогенетическая способность in vitro различных сортов картофеля

3.1.2. Определение оптимальной концентрации антибиотиков при проведении агробактериальной трансформации картофеля и табака

3.1.3. Влияние условий проведения трансформации картофеля и табака на эффективность последующей регенерации

3.2. Трансформация картофеля и табака конструкциями, содержащими гены фунгицидных белков

3.3. Молекулярно-биологический анализ полученных трансформированных линий картофеля и табака

3.3.1. ПЦР-анализ трансформированных линий картофеля и табака

3.3.2. Блот-гибридизация по Саузерну

3.3.3. Проверка фунгицидной и бактерицидной активности клеток полученных трансгенных линий картофеля и табака

3.3.4. Анализ экспрессии функциональных генов rs и 1р в клетках трансгенных линий (уровень мРНК)

3.3.5. Анализ содержания фенольных соединений в трансгенных растениях картофеля

Введение Диссертация по биологии, на тему "Трансформация картофеля и табака генами дефензинов и ингибитора протеиназ BWI-1a"

Картофель (Solarium tuberosum L.) является одной из ведущих сельскохозяйственных культур как в нашей стране, так и во всем мире. Пищевая и кормовая ценность картофеля определяется тем, что его клубни содержат около 25 % сухих веществ (крахмала 14-22 %, белков 1,5-3 %). Картофель служит сырьем для спиртокуренной, крахмалопаточной, декстриновой, глюкозной и других отраслей промышленности. Эта культура — хороший предшественник для зерновых, кукурузы и зернобобовых. Однако многие из районированных сортов не обладают устойчивостью к вирусным, бактериальным и грибным патогенам (Анисимов, 1999, 2000, 2001). Потери урожая от болезней в период вегетации и хранения составляют 25-30 %, а в годы эпифитотий - до 90 %.

Требования сельскохозяйственного производства к продуктивности и качеству сортов различных культур, в том числе картофеля, устойчивости их к болезням и вредителям постоянно растут. У картофеля, как вегетативно размножаемой культуры, вводимые тем или иным способом признаки закрепляются в репродукциях из-за отсутствия мейоза, который отсекает значительную долю индуцированной вариабельности на культурах, размножаемых половым путем. Тем не менее селекция картофеля на устойчивость к биотическому стрессу — трудная задача из-за тетраплоидной природы культурного картофеля и его сильной гетерозиготности.

Создание растений картофеля, устойчивых к биотическим стрессам, постоянно остается актуальной проблемой. Однако традиционными селекционными методами не всегда возможно в достаточно короткие сроки решить такую задачу. Эффективным способом ускорения селекционного процесса может служить использование возможностей биотехнологии, в частности клеточной и генетической инженерии, для создания устойчивых к болезням и вредителям сортов. Линии, полученные с помощью клеточной селекции или клеточной инженерии, а также трансгенные линии важных сельскохозяйственных культур, обладающие хозяйственно-ценными признаками, в том числе устойчивостью к абиотическим и биотическим стрессам, могут служить исходным материалом для дальнейшей селекционной работы и вовлекаться в скрещивания в качестве доноров соответствующих признаков.

К настоящему времени изучено и выделено большое количество защитных генов растений, большинство из которых кодируют устойчивость лишь к ограниченному кругу патогенов или даже расам патогенов и являются неэффективными против других возбудителей болезней. Несмотря на высокую степень защиты, достигаемую с помощью таких генов и их стабильностью в разных условиях окружающей среды (Попкова, 1992), приоритет в последнее время отдается использованию генов общей устойчивости, обеспечивающим защиту одновременно против нескольких видов фитопатогенов. В связи с этим представляют интерес гены таких защитных растительных белков, как дефензины и ингибиторы протеолитических ферментов, обладающие широким спектром действия.

Дефензины растений - это семейство небольших (около 5 kD), обычно основных, пептидов, богатых цистеиновыми остатками, связанными дисульфидными мостиками (Bruix et al., 1993). Они экспрессируются почти в каждом органе растения, включая листья, корни, клубни, органы цветения, плоды и семена (Kragh et al., 1995). Основываясь на антимикробном действии, наблюдаемом на грибах, дефензины могут быть разделены, по крайней мере, две группы - морфогенные и неморфогенные. Морфогенные дефензины растений приводят к редукции роста гифов и одновременным увеличением числа ветвей, тогда как неморфогенные дефензины растений только замедляют рост гифов, но не индуцируют заметных морфологических изменений (Osborn et al., 1995).

Белковые ингибиторы протеолитических ферментов, локализованные в межклеточном пространстве и клеточной стенке, являются регуляторами эндогенных протеаз и широко представлены в различных тканях животных, растений и микроорганизмов, контролируя, таким образом, множество внутриклеточных метаболических процессов (Van Loon, 1987, Guevara et al.,

1999, Глинка и др., 2000). Кроме того, обнаружены растительные ингибиторы протеиназ, активно действующие на экзогенные ферменты насекомых и патогенных микроорганизмов (Eckelkamp et al., 1993, Дунаевский Я.Е. и др.,

2000, Мосолов В.В. и др., 2001). Большинство известных и исследованных в настоящее время ингибиторов протеиназ из растений взаимодействуют с сериновыми протеиназами (трипсином, химотрипсином, субтилизином), которые широко распространены в растениях и к настоящему времени получены из многих источников (Мосолов и др., 1993, Antcheva et al., 1996, Цыбина, 2002).

Целью наших исследований явилось получение трансгенных растений картофеля, экспрессирующих ген rs дефензина редьки R.S-AFP2, ген ас дефензина амаранта Ac-AFP2, ген 1р ингибитора протеиназ гречихи BWI-la.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Изучить на различных вариантах питательных сред регенерационную способность различных типов эксплантов 20 сортов картофеля, отличающихся по своей устойчивости к основным фитопатогенам.

2. Оптимизировать методику трансформации картофеля и табака с целью повышения ее эффективности. Получить трансгенные растения картофеля с генами rs дефензина редьки и ас дефензина амаранта, а также трансгенные растения табака и картофеля с геном 1р ингибитора протеиназ гречихи.

3. Определить у трансформированных линий картофеля и табака наличие генетической вставки, ее копийность и уровень экспрессии.

4. Выявить возможные изменения у трансгенных растений в уровне накопления растворимых фенольных соединений и лигнина.

Научная новизна и практическая ценность работы. Выявлены условия для эффективной регенерации и генетической трансформации 20 сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции, различающихся по степени устойчивости к основным грибным и бактериальным патогенам. Впервые получены растения табака и картофеля, экспрессирующие ген ингибитора протеиназ гречихи, проявляющие повышенную устойчивость к ряду патогенов. Полученные в работе результаты и разработанные методики могут быть использованы при размножении в культуре in vitro различных сортов картофеля и табака, при создании трансгенных линий и их оценке на устойчивость к различным заболеваниям. Созданные трансгенные линии картофеля с геном rs дефензина редьки, геном ас дефензина амаранта и геном 1р ингибитора протеиназ гречихи, отличающиеся повышенной устойчивостью к ряду фитопатогенных грибов, могут быть использованы в качестве исходного материала в дальнейшей селекционной работе.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международной научно-практической конференции «Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке», 2000 г.; Международной научно-практической конференции молодых ученых «Молодые ученые -возрождению сельского хозяйства России в XXI веке», Брянск, 2000 г.; II Международной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». Москва, 2000 г.; научной конференции памяти Грегора Менделя, Москва, 2001 г.; Международной научно-практической конференции молодых ученых «Биотехнология - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке». Санкт-Петербург, 2001 г.; научной генетической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А.Р.

Жебрака и 70-летию образования кафедр генетики в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева. Москва, 2002 г.; 2-ой конференции МОГиС им. Н.И. Вавилова, Москва, 2003 г.; IV Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». Москва, 2004 г.; Международном симпозиуме «Физиология трансгенных растений и проблемы безопасности», Москва, 2004 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Чередниченко, Михаил Юрьевич

ВЫВОДЫ

1. Изучена морфогенетическая способность эксплантов различных тканей 20 сортов картофеля, различающихся по устойчивости к основным фитопатогенам, на различных вариантах питательных сред. Установлено, что наибольшей регенерационной способностью обладали стеблевые экспланты сортов Петербургский, Янтарный, Раменский, Резерв и Брянский ранний на среде, содержащей 3 мг/л 6-БАП. Предложены условия проведения трансформации сортов картофеля, начиная с этапа прекультивации и заканчивая этапом регенерации.

2. Получены трансгенные растения картофеля, трансформированные конструкциями с генами дефензина редьки rs и амаранта ас, а также трансгенные растения табака и картофеля, трансформированные геном ингибитора протеиназ гречихи 1р.

3. Методом ПЦР и Саузерн блот-гибридизации показана трансгенная природа полученных трансформированных линий табака и картофеля Определено, что вставки в основном были монокопийны.

4. С помощью биотеста показано, что растения полученных трансгенных линий табака сорта Самсун и картофеля сортов Резерв, Дезире, Десница демонстрируют повышенную устойчивость к грибным и бактериальным патогенам.

5. На уровне мРНК показана экспрессия гена 1р в трансгенных растениях картофеля и табака.

6. Показано, что у трансгенных растений различных сортов картофеля изменяется уровень фенольных соединений, а также накопления лигнина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время в генноинженерных программах по селекции сельскохозяйственных растений на устойчивость к биотическим стрессам приоритет отдается использованию генов общей устойчивости, обеспечивающих защиту одновременно против нескольких видов фитопатогенов (Ryan, 1990, Michaud, 1997, Мосолов и др., 2001, Парашина и др., 2000, Ляпкова и др., 2001). В связи с этим представляют интерес гены таких защитных растительных белков, как дефензины и ингибиторы протеолитических ферментов, обладающие широким спектром действия (Conceifao, Broekaert, 1998, Penninckx et al., 1996, Дунаевский и др., 2000).

В наших исследованиях мы проводили трансформацию растений 20 сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции, различающихся по степени устойчивости к основным фитопатогенам, геном rs дефензина редьки Rs-AFP2, геном ас дефензина амаранта Ac-AFP2, а также растений картофеля различных сортов и табака сорта Самсун геном 1р анионного ингибитора сериновых протеиназ гречихи BWI-la.

Была изучена морфогенетическая способность эксплантов различных тканей 20 сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции, различающихся по устойчивости к основным фитопатогенам, на различных вариантах питательных сред. Установлено, что наибольшей регенерационной способностью обладали стеблевые экспланты сортов Петербургский, Янтарный, Раменский, Резерв и Брянский ранний на среде, содержащей 3 мг/л 6-БАП. Предложены условия проведения трансформации сортов картофеля и табака, начиная с этапа прекультивации и заканчивая этапом регенерации.

Было получено 98 линий картофеля, трансформированных геном rs дефензина редьки: 2 линии сорта Осень, 6 линий сорта Брянский ранний, л* 9 линий сорта Дезире, 16 линий сорта Янтарный, 7 линий сорта Альянс,

8 линий сорта Десница, 6 линий сорта Сотка, 11 линий сорта Лорх, 12 линий сорта Сказка, 11 линий сорта Синецвет, 6 линий сорта Эффект, 4 линий сорта Жуковский ранний. Было получено 10 линий картофеля, трансформированных геном ас дефензина амаранта: 3 линии сорта Осень, 3 линии сорта Брянский ранний, 3 линии сорта Раменский, 1 линия сорта Бинтье.

Впервые были получены линии картофеля и табака, трансформированные геном 1р ингибитора протеиназ гречихи: 5 линий картофеля сорта Резерв, 2 линии картофеля сорта Удача и 138 линий табака сорта Самсун.

В результате проведенного ПЦР-анализа была подтверждена трансгенная природа 21 линии 4 сортов картофеля (Альянс, Дезире, Десница и Янтарный), трансформированной геном rs дефензина редьки, 1 линии сорта Раменский, трансформированной векторной конструкцией, несущей ген ас дефензина амаранта, и 3 линий сорта Резерв, трансформированных геном 1р ингибитора протеиназ гречихи. Методом Саузерн блот-гибридизации была показана трансгенная природа полученных трансформированных линий табака и картофеля. Определено, что вставки в основном были монокопийны.

С помощью биотеста было показано, что растения полученных трансгенных линий табака сорта Самсун и картофеля сортов Резерв, Дезире, Десница демонстрируют повышенную по сравнению с исходными растениями сорта устойчивость к грибным (Fusarium sp.) и бактериальным (Escherichia coli) патогенам. На уровне мРНК (Нозерн-блот-анализ) была показана экспрессия гена 1р ингибитора протеиназ гречихи в трансгенных растениях картофеля сорта Резерв и табака сорта Самсун.

Было показано, что процесс трансгеноза влияет на накопление растворимых фенольных соединений, особенно на уровень флавоноидов, у полученных форм. Также в некоторых вариантах было показано изменение накопления в клетках трансгенных растений фенольного полимера лигнина.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чередниченко, Михаил Юрьевич, Москва

1. Аветисов В А. Биотехнологические основы расширения генетического разнообразия картофеля // Автореф. дис. д-ра биол. наук. -М., 1997. 46 с.

2. Аветисов В.А., Соболькова Г.И., Гартель А.Л. и др. Эффективная система трансформации картофеля при использовании срезов клубней // Новые направления биотехнологии. Пущино, 1988. с.62.

3. Авсенева Т.В., Федуркина Н.В., Мосолов В.В. Изменение активности протеиназы и ее ингибитора при прорастании семян кукурузы // Физиология растений, 1988. Т.35. Вып.1. с. 106-112.

4. Анисимов Б.В. Картофель 2000-2005: итоги, прогнозы, приоритеты // Картофель и овощи, 2001. №1. — с. 5-7.

5. Анисимов Б.В. Сорта картофеля, возделываемые в Российской Федерации. М.: Информагротех, 1999. — 116 с.

6. Анисимов Б.В. Сортовые ресурсы и передовой опыт семеноводства картофеля. М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2000. — 152 с.

7. Белозерский М.А., Дунаевский Я.Е. Протеолитические ферменты и их ингибиторы в семенах гречихи // Физиология растений. 1999. Т.46. №3. -с.388-399.

8. Белозерский М.А., Дунаевский Я.Е., Мусалямов А.Х., Егоров Ц.А. Аминокислотные последовательности анионных ингибиторов протеаз из семян гречихи //Биохимия. 1996. Т.61. Вып.10. с.1743-1750.

9. Беляев А.В., Войтович А.В., Чернышева Т.Н. Фенольные соединения корнеплодов свеклы при поражении корневыми гнилями //

10. Физиолого-биохимические основы повышения продуктивности и устойчивости к болезням сахарной свеклы в условиях орошения. Фрунзе, 1989.-с. 40-51.

11. Бенкен И.И., Мосолов В.В., Федуркина Н.В. Влияние ингибитора протеиназ из фасоли на фитопатогенные грибы // Микология и фитопатология, 1976. Т. 10. Вып.З. с.198-201.

12. Богачева A.M. Субтилизины растений (обзор) // Биохимия, 1999. Т.64. Вып.З. с.347-353.

13. Валуева Т.А., Кладницкая Г.В., Ильинская Л.И., Герасимова Н.Г., Озерецковская О.Л., Мосолов В.В. Ингибиторы химотрипсина в клубнях картофеля, инфицированных возбудителем фитофтороза // Биоорганическая химия, 1998. Т.24. №5. с.346-349.

14. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Белки-ингибиторы протеолитических ферментов у растений (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология, 1995. Т.31. №6. с.579-589.

15. Валуева Т.А., Ревина Т.А., Кладницкая Г.В., Мосолов В.В., Ментеле Р. Первичная структура 21 кДа-белка из клубней картофеля // Биохимия, 1999. Т.64. Вып.11. с.1489-1498.

16. Валуева Т.А., Ревина Т.А., Мосолов В.В. Белки-ингибиторы протеиназ из клубней картофеля, относящиеся к семейству соевого ингибитора Кунитца // Биохимия, 1997. Т.62. Вып. 12. с. 1600-1608.

17. Валуева Т.А., Ревина Т.А., Мосолов В.В. Реактивные центры 21 кДа-белка-ингибитора сериновых протеиназ из клубней картофеля // Биохимия, 1999. Т.64. Вып.9. с. 1274-1279.

18. Вальдеррама Ромеро А.С. Изучение процессов регенерации и клонирования некоторых перуанских видов картофеля в культуре in vitro. Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 2002. 24 с.

19. Воскобойникова H.E., Дунаевский Я.Е., Белозерский М.А. Ингибитор металлопротеиназы из покоящихся семян гречихи // Биохимия, 1990. Т.55. №5. с.839-847.

20. Глагоцкая Т.Ц., Шульга О.А., Сидоров В.А., Захарьев В.М., Скрябин К.Г, Глеба Ю.Ю. Трансгенные растения картофеля с чужеродным геном белка оболочки Х-вируса картофеля // Доклады АН СССР, 1990. Т.314. №5.-с. 1240-1242.

21. Глагоцкая Т.Ц., Щербатенко И.С., Сидоров В.А., Шульга О.А., Захарьев В.М., Скрябин К.Г., Глеба Ю.Ю. Трансгенные растения картофеля, обладающие устойчивостью к вирусным инфекциям // Доклады АН УССР, 1990. Т. 10, серия Б. с.57-59.

22. Глез В.М. Вредители картофеля и борьба с ними // Агро XXI, приложение «Эффективные технологии производства картофеля», 1999. -с.16-17.

23. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. -М.: Мир, 2002.-е. 371-403.

24. Глинка Е.М., Проценко М.А. Активность белкового ингибитора полигалактуроназы в растениях картофеля // Прикладная биохимия и микробиология, 2000. Т.36. №2. с.225-228.

25. Глинка Е.М., Проценко М.А. Функции белкового ингибитора полигалактуроназы в растении (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология, 1999. Т.35. №1. с.3-9.

26. Глинка Е.М., Проценко М.А., Буланцева Е.А., Салькова Е.Г. Действие белкового ингибитора полигалактуроназы из тканей плодов яблони на фермент, выделяемый фитопатогенными грибами // Прикладная биохимия и микробиология, 2001. Т.37. №5. с.607-611.

27. Данилова С.А. Оптимизация агробактериального метода трансформации кукурузы. Автореферат дис. канд. биол. наук. М., 2001. — 20 с.

28. Дмитриева С. А. Генетическая трансформация картофеля с помощью Agrobacterium tumefaciens: Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1990.-20 с.

29. Домаш В.И. Протеиназно-ингибиторная система высших растений: свойства и биологические функции. Автореферат дис.д-ра биол. наук. -Минск, 1995.-38 с.

30. Домаш В.И., Забрейко С.А. Белки из семян люпина многолетнего (.Lupinus polyphyllus L.), ингибирующие активность эндогенных и экзогенных протеиназ // Доклады АН Беларуси. 1995. Т.39. №2. с.70-73.

31. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). М.: Колос, 1979. -416 с.

32. Дунаевский Я.Е., Белозерский М.А. Эндогенные ингибиторы протеаз как фактор устойчивости растений // Молекулярная биология, 1995. Т. 29. №6. с.1258-1264.

33. Дунаевский Я.Е., Грубань Т.Н., Белякова Г.А., Белозерский М.А. Влияние состава среды на количественный и качественный состав внеклеточных протеаз микромицетов // Микробиология, 1999. Т.68. №3. -с.З 24-329.

34. Дунаевский Я.Е., Павлюкова Е.Б., Белозерский М.А. Свойства ингибиторов трипсина и сериновых протеиназ микромицетов, выделенных из семян гречихи // Биоорганическая химия, 1994. Т.20. №3. с.297-301.

35. Дунаевский Я.Е., Павлюкова Е.Б., Белякова Г.А., Белозерский М.А. Анионные ингибиторы трипсина из покоящихся семян гречихи: выделение, специфичность действия и влияние на рост микромицетов // Биохимия, 1994. Т.59. Вып.7. с.990-996.

36. Дунаевский Я.Е., Павлюкова Е.Б., Белякова Г.А., Белозерский М.А. О физиологической роли ингибиторов протеаз растений: две группы функционально активных ингибиторов в семенах гречихи // Молекулярнаябиология, 1995. Т.29. Вып.6. с.1258-1264.

37. Дунаевский Я.Е., Павлюкова Е.Б., Грубань Т.Н., Белякова Г.А., Белозерский М.А. Внеклеточная протеаза микромицета Alternaria alternata И Биохимия, 1996. Т.61. Вып.10. с.1904-1910.

38. Дунаевский Я.Е., Цыбина Т.А., Белозерский М.А. Ингибиторы протеаз из семян высших растений как фактор устойчивости к патогенной микрофлоре // Агрохимия, 2000. №10. с.56-61.

39. Ефремова Н.Н., Крашенинникова JI.B. Получение трансгенных растений картофеля, экспрессирующих человеческий альфа-интерферон и двунитевую РНК // Вопросы картофелеводства: научные труды. М., 1994. — с.74-78.

40. Загоскина Н. В., Фернандо С.Ч., Федосеева В.Г., Азаренкова Н.Д., Запрометов М.Н. К вопросу о способности диплоидных и полиплоидных сортов чайного растения к образованию фенольных соединений // Сельскохозяйственная биология, 1994. №5. с. 117-119.

41. Запрометов М.Н. Фенольные соединения и их роль в жизни растения // LVI Тимирязевские чтения. М.: Наука, 1996. - 45 с.

42. Запрометов М.Н. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях. М.: Наука, 1993. - 272 с.

43. Ибрагимов Р.И. Подавление активности внеклеточных протеиназ патогенного гриба Fusarium sp. ингибиторами из семян и вегетативных органов растений // Доклады РАСХН. 1997. №2. с. 15-17.

44. Ибрагимов Р.И., Ахметов P.P. Активность протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов в семенах и проростках злаков // Итоги научных исследований биологического факультета Башкирского госуниверситета за 1994 год: Тез. докл. Уфа, 1995. с.84-87.

45. Калашникова Е.А. Влияние метаболитов гриба Rhizoctonia solani на рост пробирочных растений, каллусной ткани и суспензионной культуры картофеля. // Биотехнология, 2003, № 3. — с.27-35.

46. Калашникова Е.А. Клеточная селекция растений на устойчивость к грибным болезням. Автореферат дис.д-ра биол. наук. М., 2003. — 53 с.

47. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. — Киев.: Наукова думка, 1980. -488 с.

48. Картель Н.А., Курочкина С.Д., Забенькова К.И. Эффективность агробактериальной трансформации у разных генотипов картофеля (Solarium tuberosum L.) // Доклады Академии наук Беларуси, 1994. Т.38. №2. с.67-71.

49. Кладницкая Г.В., Валуева Т.А., Домаш В.И., Новикова JI.M., Мосолов В.В. Экзопротеиназы гриба Fusarium sambucinum Fuck и их взаимодействие с ингибиторами // Прикладная биохимия и микробиология, 1994. Т.ЗО. Вып.1. с.21-28.

50. Кладницкая Г.В., Валуева Т.А., Ермолова Н.В., Ильинская Л.И., Герасимова Н.Г., Мосолов В.В. Накопление ингибиторов протеиназ в диффузатах клубней картофеля при инфицировании возбудителем фитофтороза // Физиология растений, 1996. Т.43. №5. с.701-706.

51. Конов АЛ., Стародубцева A.M., Шульга О.А., Скрябин К.Г. Генетическая инженерия картофеля: от лаборатории до поля // Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку. М.: Наука, 2000. - с. 110-119.

52. Контроль качества и сертификация семенного картофеля (практическое руководство). — М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2003. — 316 с.

53. Коршунов А.В. Современные технологии возделывания картофеля // Агро XXI, приложение «Эффективные технологии производства картофеля», 1999. с.9-10.

54. Кравец О.А., Погребняк Н.Я., Шиша Е.Н., Лопато С.В., Глеба Ю.Ю. Трансформация различных сортов картофеля и анализ полученных трансгенных растений // Биополимеры и клетка, 1992. Т.8. №6. с.44-49.

55. Курбанова И.В., Соловова Г.К. Агробактериальная трансформация однодольных // Изучение генома и генетическая трансформация растений. -Новосибирск, 2001. — с.163-173.

56. Курочкина С.Д. Получение трансгенных растений картофеля и их молекулярно-генетический анализ. Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1995.-21 с.

57. Методические указания по получению трансформированных растений картофеля / Рассадина Г.В., Юрьева Н.О., Ефремова Н.Н. М., 1995. -13 с.

58. Мосолов В.В. Белковые ингибиторы протеолитических ферментов. Автореферат дис. докт. биол. наук. М., 1979. — 54 с.

59. Мосолов В.В., Валуева Т.А. Растительные белковые ингибиторы протеолитических ферментов. М., 1993. - 207 с.

60. Мосолов В.В., Григорьева Л.И., Валуева Т.А. Участие протеолитических ферментов и их ингибиторов в защите растений (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология, 2001. Т.37. № 2. с. 131-140.

61. Мосолов В.В., Хлуднев Д.В. Поведение белка ингибитора эндогенной альфа-амилазы в прорастающем зерне пшеницы // III съезд Всероссийского общетсва физиологов растений: Тез.докл. — С.-Пб., 1993. №2. -с. 167.

62. Падегимас Л.С., Шульга О.А., Скрябин К.Г. Создание трансгенных растений Nicotiana tabacum и Solatium tuberosum, устойчивых к гербициду фосфинотрицину//Молекулярная биология, 1994. Т.28. с.437-443.

63. Парашина Е.В. Создание и характеристика трансгенных форм томатов (Lycopersicon esculentum L.), экспрессирующих ген дефензина редьки Rs-AFP2. Автореферат дис. канд. биол. наук. — М., 1999. — 18 с.

64. Парашина Ё.В., Сердобинский Л.А., Калле Е.Г., Лаврова Н.В., Аветисов В.А., Лунин В.Г. Народицкий Б.С. Получение трансгенных растений рапса и томата, экспрессирующих ген дефензина редьки // Физиология растений, 2000. Т. 47. №3. с.471-478.

65. Парашина Е.В., Шаденков А.А., Лаврова Н.В. Аветисов В.А. Использование гена защитного пептида (дефензина) из семян редьки для повышения устойчивости томатов к заболеваниям, вызываемым грибами // Биотехнология, 1999. № 6. с.35-41.

66. Попкова К.В. Учение об иммунитете растений. М., 1992. — 288 с.

67. Ралдугина Г.Н. Получение и исследование трансгенных растений рапса (Brassica napus L.). Автореферат дис.доктор биол. наук. М., 1997. — 26 с.

68. Растениеводство / Г.С. Посыпанов, В.Е. Долгодворов, Г.В. Коренев и др.; Под ред. Г.С. Посыпанова. — М.: Колос, 1997. — с.267-301.

69. Ревина Т.А., Валуева Т.А., Ермолова Н.В., Кладницкая Г.В., Мосолов В.В. Выделение и характеристика нового ингибитора трипсина ихимотрипсина из клубней картофеля // Биохимия, 1995. Т.60. Вып.11. -с. 1844-1851.

70. Ревина Т.А., Валуева Т.А., Ермолова Н.В., Мосолов В.В. Характеристика реактивных центров нового ингибитора трипсина и химотрипсина из клубней картофеля // Биохимия, 1996. Т.61. Вып.1. с.126-130.

71. Соколова М.А., Пугин М.М., Шульга О.А., Скрябин К.Г. Получение трансгенных растений картофеля, устойчивых к Y-вирусу картофеля // Молекулярная биология, 1994. Т.28. с. 1002-1008.

72. Федуркина Н.В., Авсенева Т.В., Мосолов В.В. Активация протеолитических ферментов в прорастающих семенах кукурузы // Физиология семян: формирование, прорастание, прикл. аспекты. Душанбе, 1990.-с. 212-214.

73. Цыбина Т.А. Катионные ингибиторы сериновых протеиназ из семян гречихи (Fagopyrum esculentum Moench.). Автореферат дис. канд.биол.наук. М., 2002. - 22 с.

74. Цыбина Т.А., Дунаевский Я.В. Катионные ингибиторы сериновых протеиназ из семян гречихи // Биохимия, 2001. Т. 66. № 9. с. 1160-1165.

75. Abe М., Abe К., Kuroda М., Arai S. Corn kernel cysteine proteinase inhibitor as a novel cystatin superfamily member of plant origin. Molecular cloning and expression studies. // Eur. J. Biochem. 1992 V. 209. №3. pp.933937.

76. An G., Watson B.D., Chiang C.C. Transformation of tobacco, tomato, potato and Arabidopsis thaliana using a binary Ti vector system. // Plant Physiology, 1986. V.81. p.301-305.

77. Antcheva N., Patthy A., Athanasiadis A., Tchorbanov В., Zakhariev S., Pongor S. Primary structure and specificity of a serine proteinase inhibitor from paprika (Capsicum annuum) seeds. // Biochim. Biophys. Acta. 1996. V.1298. -pp.95-101.

78. Birch R.G. Plant transformation: problems and strategies for practical application. // Annual reviews in Plant physiology and plant molecular biology,1997. V.48. p.297-326.

79. Birk Y., Gertler A., Khalef S. Separation of a Tribolium-protease inhibitor from soybeans on a calcium phosphate column. // Biochim. Biophys. Acta. 1963. V. 67. № 3. pp.326-328.

80. Bradshaw H.D., Hollick J.B., Parsons T.J., Clarke H.R.G., Gordon M.P. Systemically wound-responsive genes in poplar trees encode proteins similar to sweet potato sporamins and legume Kunitz trypsin inhibitors. // Plant Mol. Biol. 1989. V.14.-pp.51-59.

81. Brandstadter J., Ropiach C., Theres K. Expression of genes for a defensin and a proteinase inhibitor in specific areas of the shoot apex and the developing flower in tomato // Mol. Gen. Genet. 1996. V.252. pp.146

82. Brown W.E., Takio K., Titani K., Ryan C.A. Wound-induced trypsin inhibitor in alfalfa leaves: identity as a member of the Bowman-Birk inhibitor family. // Biochemistry. 1985. V.24. pp.2105-2108.

83. Bruemmer J.H., White J.M. Base of phytoalexin production in carrot cell cultures to evaluate leaf blight susceptibility // Proc. Florida State Hortic. So hake Afred, Fia, 1987. V.59. pp. 156-157.

84. Bruix M., Gonzalez C., Santoro J., Soriano F., Rocher A., Mendez E., Rico M. 'H-NMR studies on the structure of a new thionin from barley endosperm // Biopolymers. 1995. V.36. №6. pp.751-763

85. Bryant J., Green T.R., Gurusaddaiah Т., Ryan C.A. Proteinase inhibitor II from potatoes: isolation and characterization of its protomer components. // Biochemistry. 1976. V.15. pp.3418-3424.

86. Caaveiro J.M.M., Molina A., Gonzales-Manas J.M., Rodriguez-Palenzuela P., Garcia-Olmedo F., Goni F.M. Differential effects of five types of antipathogenic plant peptides on model membranes // FEBS Lett. 1997. V.410. -pp.338

87. Chen P., Rose J., Love R., Wei C.H., Wang B.C. Reactive sites of an anticarcinogenic Bowman-Birk proteinase inhibitor are similar to other trypsin inhibitors. // J. Biol. Chem. 1992. V.267. pp. 1990-1994.

88. Chiang C.C., Hadwiger L.A. The Fusarium solani-induced expression of a pea gene family encoding high cysteine content proteins // Mol. Plant-Microbe Interact. 1991. V.4. pp.324-331

89. Conceigao A. de Silva, Broekaert W.F. Plant Defensins // Pathogenesis-related proteins in plants. Datta S.K., Muthukrishnan S. (eds.). 1998. pp. 247-260.

90. Cordero M.J., Raventos D., San Segundo B. Expression of a maize proteinase inhibitor gene is induced in response to wounding and fungal infection: systemic wound-response of a monocot gene. // Plant J. 1994. V.6. pp. 141-150.

91. Cornet В., Bonmatin J.-M., Hetru C., Hoffmann J.A., Ptak M., Vovelle F. Refined three-dimensional solution structure of insect defensin A // Structure. 1995. V.3. pp.435-441.

92. Coxon D.T., Heill T.M., Mansfield J.M. et. al. Identification of three hydroxyflavan phytoalexins from daffodil bulbs // Phytochemistry, 1980. V.19. -3p.889-892.

93. Davies H.V. Recent development in our knowledge of potato transgenic biology. // Potato research, 1996. V.39. p.411-427.

94. Davis D. Fusaric acid in selective pathogenecity of Fusarium oxysporum. //Phytopathology, 1969. V.59. №10. -pp.1391-1395.

95. Dempsey D.A., Silva H., Klessig D.F. Engineering disease and pest resistance in plants. // Trends in Microbiology, 1998. V.6. No.2. p. 54-61.

96. Doares S.H., Narvaaez-Vasquez J., Conconi A., Ryan C.A. Salicylic Acid Inhibits Synthesis of Proteinase Inhibitors in Tomato Leaves Induced by Systemin and Jasmonic Acid // Plant Physiology. 1995. V.108. №4. pp. 1741-1746.

97. Dobinson K.F., Lecomte N., Lazarovits G. Production of an extracellular trypsin-like protease by the fungal plant pathogen Verticillium dahliae. // Can. J. Microbiol. 1997. V. 43. № 3. pp.227-233.

98. Dow J.M., Davies H.A., Daniels MJ. A metalloprotease from Xanthomonas campestris that specifically degrades proline/hydroxyproline-rich glycoproteins of the plant extracellular matrix. // Mol. Plant-Microbe Interact. 1998. V. 11. № 11. pp.1085-1093.

99. D'Silva I., Poirier G.G., Heath M.C. Activation of cysteine proteases in cowpea plants during the hypersensitive response—a form of programmed cell death. // Exp. Cell. Res. 1998. V. 245. №2. pp.389-399.

100. Dunwell J.M. Novel food products from genetically modified crop plant: methods and future prospects. // International Journal of Food Science&Technology, 1998. V.33. No.3. p.205-213.

101. Eckelkamp C., Ehmann В., Schopfer P. Wound-induced systemicaccumulation of a transcript coding for a Bowman-Birk trypsin inhibitor-related protein in maize (Zea mays L.) seedlings. // FEBS Lett. 1993. V.323. pp.73-76.

102. Edwards S.K., Johanson S., Thompson S.A. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis // Nucleic Acid Res., 1991. V. 19.-pp. 13-49.

103. Enari T.M., Mikola J. Peptidases in germinating barley grain: properties, localization and possible functions. // Ciba Found Symp. 1977. V.50. -pp.335-352.

104. Epple P., Apel K., Bohlmann H. ESTs reveal a multigene family for plant defensins in Arabidopsis thaliana // FEBS Lett. 1997. V.400. pp.168-174.

105. Evers D., Overney S., Simon P., Greppin H., Hausman J.F. Salt tolerance of Solanum tuberosum L-overexpressing an heterologous osmotin-like protein. //Biologia Plantarum, 1999. V.42. No.l. p. 105-112.

106. Fant F., Vranken W., Broekaert W.F., Borremans F. Determination of the three-dimensional solution structure of Raphanus sativus antifungal protein 1 by 'H-NMR// J. Mol. Biol. 1998. V.279. №1. pp.257-270.

107. Fritig В., Heitz Т., Legrand M. Antimicrobial proteins in induced plant defense. // Curr. Opin. Immunol. 1998. V.10. №1. pp. 16-22

108. Garcia-Olmedo F., Salcedo G., Sanchez-Monge R., Gomez L., Royo J., Carbonero P. Plant proteinaceous inhibitors of proteinases and alpha-amylases. // Oxf. Surv. Plant Mol. Cell. Biol. 1987. V.4. pp.275-334.

109. Giudici A.M., Regente M.C., Villalain J., Pfuller K., Pfuller U., De La Canal L. Mistletoe viscotoxins induce membrane permeabilization and spore death in phytopathogenic fungi. // Physiol Plant. 2004. V.121. №1. pp.2-7.

110. Goddijn J.M., Pen J. Plants as bioreactors. // Trends in Biotechnology, 1995. V.13. p. 379-387.

111. Graham J.S., Pearce G., Merryweather J., Titani K., Ericsson L.H., Ryan C.A. Wound-induced protease inhibitors from tomato leaves. II. The cDNA-deduced primary structure of pre-inhibitor II. // J. Biol. Chem. 1985. V.260. -pp.6561-6564.

112. Green T.R., Ryan C.A. Wound-induced proteinase inhibitor in plant leaves: a possible defense mechanism against insects. // Science. 1972. V.175. -pp.776-777.

113. Greiner S., Rausch Т., Sonnewald U., Herbers K. Ectopic expression of a tobacco invertase inhibitor homolog prevents cold-induced sweetening of potato tubers. // Nature Biotechnology, 1999. V.17. No.7. p.708-711.

114. Gu Q., Kamata E.E., Morse M.J., Wu H.M., Cheung A.Y. A flower-specific cDNA encoding a novel thionin in tobacco // Mol. Gen. Genet. 1992. V.234. pp.89-96

115. Guevara M.G., Oliva C.R., Machinandiarena M., Daleo G.R. Purification and properties of an aspartic protease from potato tuber that is inhibited by a basic chitinase // Physiologia Plantarum. 1999. V.106. №2. -pp. 164-169.

116. Gutierrez-Campos R., Torres-Acosta J.A. Saucedo-Arias L.J., Gomez-Lim M.A. The use of cysteine proteinase inhibitors to engineer resistance against potyviruses in transgenic tobacco plants. // Nat. Biotechnol. 1999. V. 17. №12. -pp.1223-1226.

117. Heyer A.G., Lloyd J.R., Kossmann J. Production of modified polymeric carbohydrates.//Current Opinion in Biotechnology, 1999. V.10. No.2. pp.169174.

118. Hilder V.A., Gatehouse A.M.R., Sheerman S.B., Barker R.F., Boulter D. A novel mechanism of insect resistance engineered into tobacco. // Nature. 1987. V.330. pp.160-163.

119. Hildmann Т., Ebneth M., Pena-Cortez H., Sanchez-Serrano J.J., Willmitzer L., Prat S. General roles of abscisic and jasmonic acids in gene activation as a result of mechanical wounding. // Plant Cell. 1992. V. 4. №9. -pp.1157-1170

120. Horisberger M, Tacchini-Vonlanthen M. Ultrastructural localization of Bowman-Birk inhibitor on thin sections of Glycine max (soybean) cv. Maple Arrow by the gold method. // Histochemistry. 1983. V.77. №3. pp.313-21.

121. Horsch R.B., Fry Т., Hoffmann N.Z. A simple and general method for transferring genes into plants // Science, 1995. V.227. №4691. pp.1229.

122. Hwang D.L., Yang W.-K., Foard D.E. Rapid Release of Protease Inhibitors from Soybeans // Plant Physiology. 1978. V.61. №1. pp.30-34.

123. Ishida B.K., Snyder G.W., Belknap W.R. The use of in vitro-grown microtuber discs in Agrobacterium-mediated transformation of Russet Burbank and Lemhi Russet potatoes. // Plant Cell Reports, 1989. V.8. p.325-328.

124. Iwasaki Т., Kiyochara Т., Yoshikawa M. Chemical and physicochemical characterization of two different types of proteinase inhibitors (inhibitors II-а and Il-b) from potatoes. // J. Biochem. 1972. V.72. №4. pp. 10291035.

125. Johnson R., Narvaez J., An G., Ryan C. Expression of Proteinase Inhibitor Genes from Potato and Tomato in Transgenic Plants Enhances Defense against an Insect Predator // Biotechnology in Agriculture Series. Wallingford. 1990. №3.-pp.97-102.

126. Jorda L., Coego A., Conejero.V., Vera P. A genomic cluster containingfour differentially regulated subtilisin-like processing protease genes is in tomato plants. // J. Biol. Chem. 1999. V.274. №4. pp.2360-2365.

127. Joshi B.N., Sainani M.N., Bastawade K.B., Gupta V.S., Ranjekar P.K. Cysteine protease inhibitor from pearl millet: a new class of antifungal protein. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. V.246. pp.382-387.

128. Kapur R., Tan-Wilson A.L., Wilson K.A. Isolation and Partial Characterization of a Subtilisin Inhibitor from the Mung Bean (Vigna radiata) // Plant Physiology. 1989. V.91. pp. 106-112.

129. Katayama H., Soezima Y., Fujimura S., Terada S., Kimoto E. Property and amino acid sequence of a subtilisin inhibitor from seeds of beach canavalia (Canavalia lineata). // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1994. V.58. pp.2004-2008.

130. Keil M., Sanchez-Serrano J., Schell J., Willmitzer L. Primary structure of a proteinase inhibitor II gene from potato (Solarium tuberosum). II Nucleic Acids Res. 1986. V.14. pp.5641-5650.

131. Kembhavi A.A., Buttle D.J., Rauber P., Barren A.J. Clostripain: characterization of the active site. IIFEBS Lett. 1991. V. 283. № 2. pp.277-280.

132. Kragh K.M., Nielsen J.E., Nielsen K.K., Dreboldt S., Mikkelsen J.D. Characterization and localization of new antifungal cysteine-rich proteins from Beta vulgaris // Mol. Plant-Microbe Interact. 1995. V.8. №3. pp.424-434.

133. Kurusaki P., Amin M., Nishi A. Induction of phytoalexin production and accumulation of phenolic compounds in cultured carrot cells // Physiol. Molec. Plant. Pathol., 1986. V.28. №3. pp.359-370.

134. Lee M.C., Scanlon M.J., Craik D.J., Anderson M.A. A novel two-chain proteinase inhibitor generated by circularization of a multidomain precursor protein. // Nat. Struc. Biol. 1999. V.6. pp.526-530.

135. Lee S., Jung K.H., An G., Chung Y.Y. Isolation and characterization of a rice cysteine protease gene, OsCPl, using T-DNA gene-trap system. // Plant Mol Biol. 2004 V.54 №5. pp.755-765.

136. Li W., Zarka K.A., Douches D.S., Coombs J.J., Pett W.L., Grafius E.J. Coexpression of potato PVYo Coat Protein and cryV-Bt genes in potato. // J. Amer. Soc. Hort. Sci., 1999. V.124. No.3. p.218-223.

137. Linthorst H J., van der Does C., Brederode F.T., Bol J.F. Circadian expression and induction by wounding of tobacco genes for cysteine proteinase. // Plant Mol. Biol. 1993. V. 21. № 4. pp.685-694.

138. Lynn D.G., Chang M. Phenolic signalis cohabitation: Implications for plant development.// Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1990. V.41. -pp.497-503.

139. Mackay G.R. An agenda for future potato research. // Potato research, 1996. V.39. pp. 387-394.

140. Maeda K., Kakabayashi S., Matsubara H. Complete amino acid sequence of an alpha-amylase inhibitor in wheat kernel (0.19-inhibitor). // Biochim Biophys Acta. 1985. V.828. №3. -pp.213-21.

141. Meyer В., Houlne G., Pozueta-Romero J., Schantz M.L., Schantz R. Fruit-specific expression of a defensin-type gene family in bell pepper. Upregulation during ripening and upon wounding // Plant Physiol. 1996. V.112. №2. -pp.615-622.

142. Mikola J., Suollina E.-M. Purification and Properties of an Inhibitor of Microbial Alkaline Proteinase from Barley // Archives of Biochemistry and Biophysics. 1971. V.144. №2. pp.566-575.

143. Moreno M., Segura A., Garcia-Olmedo F. Pseudothionin, a potato peptide active against potato pathogens // Eur. J. Biochem. 1994. V.223. pp. 135139

144. Mosolov V.V., Loginova M.D., Fedurkina N.V., Benken I.I. The biological significance of proteinase inhibitors in plants // Plant Science Letters. 1976. V.7. pp.77-80.

145. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassaya with tobacco tissue cultures // Physiologia Plantarum, 1962. V.15. — pp.473-497.

146. Narvaaez-Vasquez J., Franceschi V.R., Ryan C.A. Proteinase-inhibitor synthesis in tomato plants: Evidence for extracellular deposition in roots through the secretory pathway // Planta. 1993. V.189. №2. pp.257-266.

147. Nozawa H., Yamagata H., Aizono Y., Yoshikawa M., Iwasaki T. The complete amino acid sequence of a subtilisin inhibitor from adzuki beans (Vigna angularis). // J. Biochem. 1989. V. 106. № 6. pp. 1003-1008.

148. Ohtsubo K., Richardson M. The amino acid sequence of a 20 kDa bifunctional subtilisin/alpha-amylase inhibitor from bran of rice {Oryza sativa L.) seeds. // FEBS Lett. 1992. V.309. №1. pp.68-72.

149. Ojima A., Shiota H., Higashi K. et al. An extracellular insoluble inhibitor of cysteine proteinases in cell cultures and seeds of carrot. // Plant Mol. Biol. 1997. V.34. pp.99-109.

150. Ooms G, Hooykaas P.J.J., van Veen R.J.M., van Bellen P., Regensburg-Tuink T.J.G., Schilperoort R.A. Octopine Ti-plasmid deletion mutants of Agrobacterium tumefaciens with emphasis on the right side of the T-region. // Plasmid, 1983. V.7. p.15-29.

151. Ooms G., Karp A., Burrell M.M., Twell d., Roberts J. Genetic modification of potato development using Ri T-DNA. // Theor. Appl. Genetic, 1985. V.70.-p.44-446.

152. Pautot V., Holzer F.M., Reisch R., Walling L.L. Leucine aminopeptidase: an inducible component of the defense response in Lycopersicon esculentum (tomato).// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993. V.90. №21. pp.99069910.

153. Pautot V., Holzer F.M., Walling L.L. Differential Expression of Tomato Proteinase Inhibitor I and II Genes During Bacterial Pathogen Invasion and Wounding // Molecular Plant-Microbe Interactions. 1991. V.4. №3. pp. 284292.

154. Pearce G., Johnson S., Ryan C.A. Purification and characterization from tobacco (Nicotiana tabacum) leaves of six small, wound-inducible, proteinase isoinhibitors of the potato inhibitor II family. // Plant Physiol. 1993. V.102. pp.639-644.

155. Pearce G., Strydom D., Johnson S., Ryan C.A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. // Science. 1991. V.253. pp.895-898.

156. Pehu E. The current status of knowledge on the cellular biology of potato. // Potato research, 1996. V.39. p.429-435.

157. Pen J., Sijmons P.C., Ooijen A.J.J., Hoekema A. Protein production in transgenic crops: analysis of plant molecular farming. // Trangenic Plants: Fundamentals and Applications, 1993. p.239-251.

158. Pernas M., Sanchez-Monge R., Gomez L., Salcedo G. A chestnut seed cystatin differentially effective against cysteine proteinases from closely related pests. // Plant Mol Biol. 1998. V.38. №6. pp. 1235-42.

159. Plunkett, Senear, Zuroske et al., 1982 Plunkett G., Senear D.F., Zuroske G., Ryan C.A. Proteinase inhibitors I and II from leaves of wounded tomato plants: purification and properties. // Arch. Biochem. Biophys. 1982. V.213. -pp.463-472.

160. Ries S.M., Albersheim P. Purification of a Protease Secreted by Colletotrichum lindemuthianum II Phytopathology. 1972. V.63. pp.625-629.

161. Rodrigo I, Vera P, Conejero V. Degradation of tomato pathogenesis-related proteins by an endogenous 37-kDa aspartyl endoproteinase. // Eur J Biochem. 1989. V.184. №3. -pp.663-669.

162. Ryan C.A. Protease inhibitors in plants: genes for improving defenses against insects and pathogens. // Annu. Rev. Phytopathol. 1990. V.28. №2. -pp.425-449.

163. Ryan C.A. The search for the proteinase inhibitor-inducing factor, PIIF. // Plant Mol. Biol. 1992. V.19. pp.123-133.

164. Ryan C.A., Pearce G. Systemins: a functionally defined family of peptide signals that regulate defensive genes in Solanaceae species. // Proc Natl

165. V. Acad Sci USA. 2003. V.100 Suppl 2. pp.14577-14580.

166. Schaller A., Bergey D.R., Ryan C.A. Induction of Wound Response Genes in Tomato Leaves by Bestatin, an Inhibitor of Aminopeptidases // The Plant Cell. 1995. V.7. №11. pp.1893-1898.

167. Schaller A. Action of proteolysis-resistant systemin analogues in wound signalling. // Phytochemistiy. 1998. V. 47. № 4. pp.605-612.

168. Sheerman S., Bewan M.W. A rapid transformation method for Solarium tuberosum using binary Agrobacterium tumefaciens vectors. // Plant Cell Reports, 1998. V.7. p.13-16.

169. Shivaraj В., Pattabiraman T.N. Natural plant enzyme inhibitors. Characterization of an unusual alpha-amylase/tiypsin inhibitor from ragi (Eleusine coracana Geartn.). //Biochem. J. 1981. V. 193. № 1. pp.29-36.

170. Siffert O., Emod I., Keil B. Interaction of clostripain with natural trypsin inhibitors and its affinity labeling by Nalpha-p-nitrobenzyloxycarbonyl arginine chlormethyl ketone.// FEBS Lett. 1976. V. 66. № 1. pp.114-119.

171. Solomon M., Belenghi В., Delledone M., Menachcn E., Levine A. The involvement of cysteine proteases and protease inhibitor genes in the regulation of programmed cell death in plants.// Plant Cell. 1999. V.l 1. №3. pp.431-444

172. Sreedhar L., Kobayashi D.Y., Bunting Т.Е., Hillman B.I., Belanger F.C. Fungal proteinase expression in the interaction of the plant pathogen Magnaporthe poae with its host. // Gene. 1999. V. 235. № 1-2. pp.121-129.

173. Srivastava O.L., Van Huystee R.B. Interections among phenolic oxidase activities of peanut peroxidase isozymes .// Phytochem., 1997., v. 16. N. 10. pp. 1527-1530.

174. Stotz H.U., Contos J.J.A., Powell A.L.T., Bennet A.B., Labavitch J.M. Structure and expression of an inhibitor of fungal polygalacturonases from tomato. // Plant Mol. Biol. 1994. V.25. №4. pp.607-617

175. Stotz H.U., Kroymann J., Mitchell-Olds T. Plant-insect interactions. // Curr. Opin. Plant Biol. 1999. V.2. №4. pp.268-272.

176. Svendsen I., Hejgaard J., Mundy J. Complete amino acid sequence of the alpha-amylase/subtilisin inhibitor from barley. // Carlsberg Research Communications. 1986. V.51. №1. pp.43-50.

177. Tavazza R., Tavazza M., Ordas R.J., Ancora G., Benvenuto E. Genetic transformation of potato (Solarium tuberosum): an efficient method to obtain transgenic plants. // Plant Science, 1988. V.59. pp. 175-181.

178. Terras F.R.G., Torrekens S., Van Leuven F., Osborn R.W., Vanderleyden J., Cammue B.P.A., Broekaert W.F. A new family of basic cysteine-rich plant antifungal proteins from Brassicaceae species // FEBS Lett. 1993. V.316. pp.233-240

179. Thevissen К., Ghazi A., De Samblanx G.W., Brownlee C., Osborn R.W., Broekaert W.F. Fungal membrane responses induced by plant defensins and thionins //J. Biol. Chem. 1996. V.271. №25. pp. 15018-15025.

180. Thevissen K., Osborn R.W., Acland D.P., Broekaert W.F. Specific high affinity binding sites for an antifungal plant defensin on Neurospora crassa hyphae and microsomal membranes // J. Biol. Chem. 1997. V.272. № 32176. pp. 311318.

181. Tornero P., Conejero V., Vera P. Identification of a new pathogen-induced member of the subtilisin-like processing protease family from plants. // J. Biol. Chem. 1997. V.272. №22. pp. 14412-14419.

182. Tornero P., Conejero V., Vera P. Primary structure and expression of a pathogen-induced protease (PR-P69) in tomato plants: Similarity of functional domains to subtilisin-like endoproteases // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V.93. №13. pp.6332-6337.

183. Urbanek H. Fusarium: Mycotoxins, Taxonomy, and Pathogenecity / Ed. Chelkowski J. Amsterdam: Elsevier. 1989. pp.243-256.

184. Urbanek H., Kaszmarek A. Extracellular proteinases of the isolate of Botrytis cinerea virulent to apple tissues. // Acta Biochem. Pol. 1985. V.32. №2. -pp.101-109.

185. Walker-Simmons M., Ryan C.A. Isolation and Properties of carboxypeptidase from leaves of wounded tomato plants // Phytochemistry. 1980. V.19. №1. pp.43-47.

186. Walker-Simmons M., Ryan C.A. Wound-induced peptidase activity in tomato leaves. // Biochem Biophys Res Commun. 1977. V.74. №2. pp.411-416.

187. Wenzler H., Mignery G., May G., Park W. A rapid and efficient transformation method for the production of large numbers of transgenic potato plants. // Plant Science, 1989. V.63. pp.79-85.

188. Wilson K.A. The Release of Proteinase Inhibitors from Legume Seeds during Germination // Phytochemistry. 1980. V.19. №12. pp.2517-2519.

189. Wordragen M.E., Dons H.J.M. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of recalcitrant crops. // Plant Molecular Biology Reporter, 1992. V.lO.No.l. -pp.12-36.

190. Wyatt S.D., Shepherd R.J. Isolation and characterization of a virus inhibitor from Phytolacca americana. // Phytopathology. 1969. V.59. № 12. -pp.1787- 1794

191. Yamada K., Shimada Т., Kondo M., Nishimura M., Hara-Nishimura I. Multiple functional proteins are produced by cleaving Asn-Gln bonds of a single precursor by vacuolar processing enzyme. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. № 4. -pp.2563-2570

192. Zhu Y., Huang Q., Qian M., Jia Y., Tang Y. Crystal structure of the complex formed between bovine beta-trypsin and MCTI-A, a trypsin inhibitor of squash family, at 1.8 A resolution. // J. Protein. Chem. 1999. V.18. pp.505-509.