Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура и особенности регуляции экспрессии генов бета-галактозидаз у мицелиального гриба Penicillium canescens

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура и особенности регуляции экспрессии генов бета-галактозидаз у мицелиального гриба Penicillium canescens"

Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

СТРУКТУРА И ОСОБЕННОСТИ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ КАЛАЙТОЗИДАЗ У МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА РЕШС1ЬЫи11 СЛЛЕ8СЕ\8

(специальность 03.00.03 — молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1992

Работа выполнена в лаборатории структуры генов эукариот Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор Ю. П. Винецкий.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Р. С. Шакулов; доктор биологических наук, профессор Л. С. Чернин.

Ведущее учреждение — Институт биологии гена РАН.

Защита диссертации состоится 1993 г. в _час. на заседании Специализиро-

ванного совета Д 098.12.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИГенетика.

Автореферат разослан_

//ЗСъ&^и? 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

В. И. ЩЕРБАКОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В настоящее время мицелиальные грлбы наряду с дрокжами все чаще становятся объектов молекулярно-биологических исследований. Сравнительная простота организации грибов, способность к росту на самых разнообразных средах, а также возможность применения молекулярно-генетических подходов позволяет рассматривать эти организмы а качестве перспективной модельной системы для изучения основных биохимических процессов у эукариот. С этой точки зрения изучение механизмов регуляции экспрессии генов у мицелиальных грибов на модели Lac системы может оказаться весьма интересной задачей, особенно если учесть успехи, достигнутые на примере 1ас-оперона Е.coli или лакгозно-галактозного регулона у К. lactis (Beckwith ei al.,1978, Dickson et al.,1980).

Ключевой фермент Lac признака - /3-галактозидаза или лактаза СКФ 3.2.1.23) гидролнзует (3(1-4)-галактозидные связи в лактозе и некоторых других полисахаридах с аналогичным типом связи. У мицелиальных грибов этот фермент часто представлен в секретируемой форме наряду с другими гидролаэами, субстратом которых-1 является олиго- и полисахариды различной структуры. Изучение регуляции активности этой группы белков представляет большой интерес, т. к. вплотную связано с проблемой секреции и процессинга белкбв, а танке молекулярными основами внутриклеточной коммуникации. Вместе с тем, многие виды грибов охотно утилизируют лактозу. Секреции /3-галактозидазы при этом не наблюдается, что позволяет поставить вопрос о существовании внутриклеточных форм фермента. В практическом плане мицелиальные грибы можно рассматривать как наиболее доступный источник /3-галактозидазы. Некотооые штаммы способны синтезировать до 1 г белка с литра культуры CTakenishi et al.,1983). Внеклеточная, же локализация белка значительно упрощает его выделение, а высокая стабильность и широк»»- диапозон действия позволяют надеяться ■ на его промышленное-- использование для гидролиза лактозы в молочных продуктах

О структуре и механизмах экспрессии" генов, кодирующих Lac признак у грибов, известно крайне мало. У Л.nidulans охарактеризовано несколько . локусов, ответственных за утилизацию лактозы, однако имеющиеся данные далеко не совр;м»шш и. подчас противоречат друг другу (Fantes et al.,1973). Предстоит еще разобраться, сколько генетических лскусов :"в частности гено» #-гаяакто»алаз), а следовательно, и ccotm'Tcte.md'ïhx $ерм<?нтов'

составляют Lac систему у мицелиальных грибов, каковы механизмы и; регуляции, а также какую роль выполняют эти ферменты i жизнедеятельности клетки.

Цель и задачи исследования. Мы поставили перед собой задач; молекулярно-генетического изучения организации и регуляции La< системы у мицелиальных грибов, ограничив исследования лишь одни! элементом, составляющим Lac признак, а именно - р-галактоэидаэой В качестве объекта исследований был выбран мицелиальный гри> PeniciiUum canescens, являющийся одним из наиболее эффективны продуцентов этого фермента.

Научная новизну и практическая значимость работы. Исследован: основные закономерности биосинтеза ,/?-галактозндаз у мицелиальног гриба P.canescens. Показано, что в зависимости от источник питания клетки гриба способны синтезировать секреткруемый и дк внутриклеточных Фермента гидролиза /3-галактозидной связи Разработаны способы их очистки. Показано, что на долю внеклеточно ß-галактоэилазы приходится до 20V всех синтезируемых клетко белков. По своим молекулярным характеристикам цитоплазматически (З-Галактозидазы существенно различаются между собой и о внеклеточной формы белка.

С помою,d синтетических олигонуклеотидных зондов из фаговс библиотеки генов гриба P.canescens был отобран клон, содержащи ген секретируемой $-галактозидазы. Была определена частична нуклеотиднад последовательность гена и проведен ее анализ. F основании полученных экспериментальных данных выдвинут предположение о наличии в клетке нескольких генетичес? 'Независимых локусов, ответственных за гидролиз /3-галактсзиднс связи у вне- и внутриклеточных субстратов. Обнаружено, чт регуляция экспрессии гена секретируемого фермента, в основнок происходит, на уровне транскрипции. Показано, что клонированнг регуляторная последовательность этого гена, включающая промоторн; область и область лидерного петида может быть основой для создан! новых ьекторнык систем экспрессии чужеродных генов в мицелиальш грибах. . •

Благодаря высокой стабильности в растворах и широкому спект] pH-действия внеклеточный фермент может быть , использован д; гидролиза лаптопы не только в творожной сыворотке СрН 4.5), но молоке ' £рН-'5,6), что особенно ваяю для люд«й. «трэдам: лактазнсй недг.-.-таточирстью. .

ртруктура и объем работы. Диссертация наложена на J'Y страницах, вкдочая 23 рисунка и 7 таблиц. Работа состоит' из ЗЕ0Д8ШШ, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей условия проведения экспериментов, полученных результатов и их обсуждения, а такз:е списка использованной литературы из наименований отечественна и заруйехиих работ.

.тАпрсбаиия_ работы,. Материали диссертационной работы докладывались иа IV-оы совместном симпозиуме Тонная пн.жнерия и ферменты для. биотехнологии" СНоЯ-Брандербург, Германия, 1333), 6-ом сгездэ ОГиС СМинск, 1G92), сошшара отдела биотехнологии ВШКГенвтюса (Москва, 19931.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Еносиятоэ. йеркентов с (З-гапактозядаанрЯ гштпвностьо 1.3'У''йЛ11а Л-ЬН-РГ" .Три ба ...P.- ÇaBgsgêQg. Прежде всего предстояло установить физиологические потребности выбранного продуцента, а такте определить какие факторы влияют на биосинтез /3-галактозидазы. Некоторые особенности биосинтеза ферментов гидролиза /Э-галактозидной связи в зависимости лт источников питания отражены в таблице 1. Обнаружено, что в зависимости от условий культивирования клетки ющелнального гриба зпособнц синтезировать несколько ферментов, специфичных к данному типу связи, различающихся по своей' локализации - один ;екретируемш1 белок и, по крайней мере два внутриклеточных :Рис.1). Лактоза и галактоза индуцнруют лишь цитоплазматические З-галактоэидазы, причем галактоза - только одну из двух форм фермента. Динамика накопления /3-галактозидазной активности этражена на рисунке 2. Как следует из графика, внутриклеточная истинность достигает максимального уровня уже на 1 сут ;ультивироваш1я. тогда как биомасса нарастает только на 3 сут. 'аким образом,. присутствие внутриклеточных /3-галактозидаз ¡ущоственно лишь на ранних стадиях цикла развития гриба, »беопечивая, ^о-видимому, прорастание конидий. Задержка синтеза на :реде с галактозой С активность возрастает на 4 сут), вероятно, "оть результат ьыоок.ой скорости ее утилизации. Поэтому ь момент •нтенсивиого роста концентрации этого сахара в клетке может оись едостэточно для запуска механизмов . экспрессии генов цтоияаэмэтР'шсккх й-галактсиидаз, Другое объяснение оономюастоя •л нсфелвш раомпкях к йнауиирумцем дэйсттшн лактоз и и гаяакт'.чч

Таблица 1

Регуляция биосшгтсза р-галактозидаз Р.сап&сеы и зависимости от источников питания

Источник углсродя Максимальная удельная активность Биомасса,

или азота Р-галактознпаэ ед/г биомассы г/100 мл

внеклгточная внутриклеточная

глицерин + - " 0,56

глюкоза - - 0,ВЗ

сахароза - - 0,7

мальтоза - - 0,38

фруктоза - - 0,42

рамном - - 0,56

лактоза - + 0,35

галактоза - + 0,51

арабнноза +++ - 0,11

пектин ++ - 0,44

свекловичный жом ++++ 0,55

соевая мука +++++ 0,73

лактоза+фруктоза - - 0,52

лактоза+сахароза - - 0,63

лактоза+глгокоза - - 0,78

лактоза+глюкоза+нАМФ - - 0,75

галакгоза+фруктоза - - 0,62

галакгоза-+глюкоза - - 0,84

арабнноза+фруктоза + ' - 0,39

араСиноза+глюкоза - - 0,75

арабнноза+глюкоза+цАМФ - - 0,72

арабнноза+глнцерин ++ - 0,33

арабиноза+лактоза ++ + 0,3

арабиноза+галактоза + + 0,54

пектин+фруктоза . - - 1,2

некпш+сахароза , - - 1,3

пектии+лактоза + + 0,9

псктин+галактоза - 1,1

св0 жом+фруктоза - 1,4

св. жом+лактозз ++ + 1,2

св. жом+галактоза ++ ' + 1,4

сп. жом+арабнноза +++ - 1,2

св. жом+иектин +++ - 0,9

пептон + 0,17

фрукгоза+пептон + 1,2

ИИТГ+пегггон + - 0,2

лактоза+пептон • + + 1,2

арабнноза (-пептон +++ - , . 0,74

пектнн+пептон ++++ ■ ■ 0,72

св. жом+пегпон +++++ ' - 0,66

св, жом+БВК +++++ - . 0,72

Обозначения: - соответствует значению ул. активности ниже 0,1 ед/г; + если акптность колеблется в пределах от . 1 до 5 ед/г;

++■--„--„ —„-„ --5-50

+++-_„-„-„ — 50-500

++++-„-—„ ——-„--„-500-5000

+ +■+++--п---„---„ выше 5000

ни а

й я & Р ^

П 3 I 1 §

К;. : У:. • ■..('■ •:■> V '

№

■■¿у-,-;'-

Рис. 1. Тсслфование зон с р-галактозндазной шспюжп..,^ в ггяс после ¡лехтрофорсгического разделения белков культуральной жидкости (образец 2) п ■ нутриклеточного лнзата балков (остальные. образны) гриба Р.сапгксеп:, цращешгаго на различных источниках углерода.

игпгапость: вхгхлетвчтт (сфы)

кутрыалеточиая (за о-3, ед/мг)

Биомасса

г/100 мл

Рис.2. Синтез р-тликтозидаз р.сапе!сеш иа среде: 1-со свекловичным жомом и птоном; 2-лактозой; 3-галактозой. Приведены кривые накоплеичч биомассы па где со снеклоиичным *о\»пм (Г) и лактозой (2').

В присутствии пектина и других олиго- и полисахаридов входящих в состав клеточной стенки растений, начинается синтез внеклеточной /7 -галактоэидазы (Табл. 1). Секреция ферменту отмечается на стадии прорастания конидий и достигает максимальной скорости в стационарной фазе роста, что морфологически соответствует стадии ветвления мицелия С Рис. 2). Вообще говоря, в случае высокомолекулярных и не проникающих в клетку веществ анализ истинной природы индуктора крайне затруднителен. Им может быть сигнальная молекула, запускающая целый комплекс механизмов, регулирующих работу генов. Например, отсутствие в среде низкомолекулярных субстратов может рассматриваться клеткой как своеобразный сигнал голодания и тем самым -стимулировать синтез внеклеточных ферментов. Либо таким сигналом может быть непосредственный контакт полимерного субстрата с рецепторами клетки. Альтернативный вариант состоит в том, что индуктором является низкомолекулярный продукт гидролиза полисахаридов сложной структуры, образующийся не обязательно пол действием /3-галактозидазы базального уровня синтеза, но других карбогидролаз, специфичных к данному полимеру. В нашем случае индуктором могла бы быть арабиноза, входящая в состав пектина. Способность арабинозы стимулировать синтез /3-галактозидаз отмечается и для других мицелиальных грибов СТихомирова,198]),. Однако несмотря на то, что из всех исследованных моно- и дисахарицбв наибольшее количество фермента синтезировалось на средах, где единственным источником углерода была арабиноза, индукция косит в некотором смысле условный характер. С одной 'стороны, при добавлении арабинозы к несбраживае.чому источнику углерода, например, глицерину наблюдается синтез внеклеточного фермента (ТаояЛ). С другой стороны, присутствие арабинозы и в меньшей степени, пектина в среде со свекловичным жомом угнетает синтез /З-галактозидаэн. Кроме того, предварительно выращенная на среде с мальтозой культура гриба Р.canescens после переноса на арабинозу начинала синтез фермента с лаг-п^риодом около 24 ч, в то время как на пектине ферментативная активности тестирораяасг.- ?• культураяьной жидкости уже через 4 ч после индукции. Следует o-rdo подчеркнуть, что при выращивании на ореде с лактозой оовриич белков в кулътуральную жидкость практически полностью отсутстп у <•■:•. Следовательно, лактоза, по ьсей вгроято отв. не является прир-.даим субстратом Бгк.кпето'шого <$»р№<чгга в том еммллс. ЧТ1 пе- грисут:-: '".</:> в среде не приводит . к 1И.«,лл<?1тому -:шт-~пу •.ívoTpeTCTvy'j-rS

идролазы. Утилизация же лактозы происходит только после ее роникновения в клетку.

Наличие в среде одновременно любого из индукторов каждого ипа приводит к независимому синтезу всех /3-галактозидаз С Рис. 2), отя секреция внеклеточного фермента значительно снижается, собенно в случае галактозы. При добавлении к индуктору как вне-, ак и внутриклеточных /3-галактозидаз любого другого источника глерода, необязательно репрессирующей природы, например фруктозы, риводит к его предпочтительной утилизации и как следствие этого -локированию синтеза всех лактаз. Внесение экзогенного цАМФ не пинает репрессирующего.действия глюкозы (Тася. 1).

В отличие от внутриклеточных /3-галактозидаз, синтез екретируемого фермента оказался подвержен азотной регуляции, бильное снабжение азотом в виде смеси аминокислот и пептидов, оступающих с пептоном или дрожжевым экстрактом, приводило к величению выхода фермента в несколько раз. Представляется вполне этичным, если клетка выработала дополнительные регуляторные еханизмы, допускающие синтез внеклеточной ß-галактозидазы только условиях питания, богатых органическим азотом. Не "исключено акже, что вместе с другими внеклеточными гидролазами, этот зрмент обеспечивает потребности клетки в углероде и азоте при зсте гриба на полимерных источниках питания, например, ютительного происхождения.В таком случае в роли индуктора третируемого фермента может выступать какой-нибудь гликопротеин неточной стенки растений., причем для достижения максимальной шрости синтеза одинаково необходим как белковый, так и :леводный компонент молекулы индуктора. Такая.гипотеза покажется злее убедительной, если учесть, что in vitro фермент спосдбен адролизовать соответствующий тип связи в гликопротеинах CAkasaki . al.,1976), а также принадлежность многих видов грибов к группе шротрофов. В общих чертах, исследуемая модель напоминает Lac" гстему N.crassa с той лишь разницей, . что галактоза и ее юиэводные инициирует образование внутри-, -а не внеклеточного грмента (Comp et al. ,1971).

Молекулярные характеристики ß-галактозидзз P.canescens

!1з результатов, представленных в таблице 1, следует, что »ебованиям максимального уровня й.юсинтеза секретируемой •гал&ктозида'зь!, а следовательно. олта&алышм условиям со

выделения отвечает среда, содержащая в качестве источника углерода свекловичный жом и богатая органическим азотом. В этом случае на доле данного фермэнта приходится до 20% всех синтезируемых клеткой белков. Учитывая не столь широкую распространенность в природе /ЗС1-4)-галактоз идных связей, остается непонятным, зачем клетке такое количество специфичной гидролазы, тем более в постэспоненциальной фазе роста.

Сочетанием методов хроматографического разделения белков на КМ-сефарозе С1-6В и сефакриле 2-200 из культуральной жидкости Р. сапеБсепз был выделен фермент с /3-галактозидазной активностью. Гоыогеность препарата подтверждалась электрофорезом в нативных и денатурирующих условиях, а также центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Физико-химические и каталитические характеристики полученного препарата суммированы в таблице 2. По своим свойствам и аминокислотному составу фермент близок к охарактеризованным ранее внеклеточным лактазам грибного происхождения. Активной формой белка является мономер с молекулярной массой субьединицы 120 кДа. В зависимости от степени гликоэилирсвания он может образовывать две изоформы с различными изозлектрическими точками. Фермент активен при кислых значениях рН и высокой температуре, стабилен в растворах на протяжении длительного времени, выдерживает изменения рН и температуры в широких пределах, для проявления своей активности не требует присутствия дополнительных кофакторов. Достигнутая в ходо выделения чистота препарата оказалась достаточной для определения последовательности первых 25 аминокислотных остатков.

Из лизата клеток гриба, индуцированного лактозой. с использованием методов хроматографии быстрого разделения на нонообменнике МопоО удалось выделить два индивидуальных белка, обладающих /3-галактозидазной активностью. В соответствии с молекулярной массой ферменты обозначены как тяжелая и легкая галактозидаэа. На долю 0-галактозидаэа,.^ приходится 80?; общей клеточной активности, доля же этих ферменте от общего содержания белков в клетке составляет 0,1-0,2%. Расчеты показывает, при индукции лактозой а клетке образуется в 2-3 раза больше молекул (С'-галактозкдазь;Г£,„. Скорость же синтеза секретируемого Фермента в 500-1000 раз превышает число молекул внутриклеточных /З-галактооидао, образующихся м единицу времени.

По своим м )лекулярнчм харткт^ристшсам внутриклеточные р-галак-тозидары различим«я как тт„г/ чо^Л. так и от декретируемого белка.

Таблица 2

Молекулярные характеристики ($—галактозиддч Р.сапеэсепз

Молекул. Актив- Оптимум Стаби- Ионы— Уд- Км, мМ

Локали- масса ная действия льность активато- актив- ОНФГ/

зация субьед., форма Р1 в раст- ры (инш- ность лакто-

кДа рН т°с воре биторы) ед/мг за

Иоци

металлов,

внекле- 120-125 Моно- 6,7 4.5 55 рН 3- ЭДТА,

точная мер (5,7) 7.5 ГТХМБ па 200 0,5/ 1-1

Т<50°С влияют на

активность

внутри- К+, Мд+2

клеточ- 120 Тетра- — - 10 —

ная мер обладают

(тяже- слабо

лая) 6,3 35 лабиль- стимула -

внутри- ны ругощнм

клеточ- 57 Моно- — л дейст- 7,3 —.

ная мер вием

(легкая)

Активной формой /3-галактозидази т является, по всей видимости, тетрамер с молекулярной массой субъединицы около 120 кДа. Легкая |3-галактозидазы активна в виде мономера весом 57 кДа. Ферменты имеют различные изозлектрические точки,, т. к. по-разному сорбируются на ионообменнике МопоО. Низкое содержание /3-галактозидаз в лизате внутриклеточных белков нз позволило получить достаточные количества очищенных препаратов, поэтому изучение каталитических свойств ферментов проводили, используя суммарный экстракт белков.В отличие от секретируемого фермента, активного при кислых значениях рН среды, препарат внутриклеточных белков в /З-галактозидазной активностью имеет оптимум действия в области, близкой к физиологическому значению рН в клетке. Температурный оптимум действия цитсплазв/атических /3- галактоз и дао на 20 0 С ниже, чем у секретируемой. Инкубирование при 50 0 С в течение'30 мин практически полностью инактивирует внутриклеточные ферменты. В аналогичных условиях внеклеточный фермент почти ш> теряет активности. Методом иммуноблоттичга не еыло оОнзру&ено общих■ антигенных детерминант у вне- и внутриклеточных /3-галактозидаз Р. сапезсопэ, что .метет отражать существенны;; различия в структурной организации салкой.

Закономерен вопрос, являются ли эти белки продуктами одного или разных генов. Безусловно, нельзя было окончательно исключать возможность существования нескольких молекулярных форм фермента. Более того, отдельные различия между /3-галактозидазамя, например в молекулярной массе, можно отчасти объяснить возможностью альтернативного сплайсинга, другой точкой инициации транскрипции или посттрансляционными модификациями белков. Тем не менее маловероятно, чтобы подобные механизмы могли столь существенно изменить всю совокупность молекулярных характеристик фермента. Кроме того, как мы отмечали ранее, регуляция биосинтеза каждой из трех /Э-галактозидаэ имеет свои существенные особенности. Поэтому более правдоподобна ситуация, когда все три фермента есть продукты независимых генов, возможно, частично гомологичных между собой. Для того, чтобы окончательно отдать предпочтение той или другой возможности требовались дополнительные доказательства на генетическом уровне.

Генетическая структура Lac признака гриба Р.canescens.

Нами была предпринята попытка клонировать ген секретируемой . /3-галактозицазы путем скрининга банка генов гриба Р. canescens, созданного на основе фагового вектора замещения XEMBL4, с помощью гибридизационного олигонуклеотидного зонда. Зонд синтезировали на основании установленной нами аминокислотной последовательности белка. Однако среди 50. ООО анализируемых клонов положительных сигналов обнаружено не было. Как впоследствие показал анализ иуклеотидной последовательности гена, область, комплементарная зонду, разделена интроном. Образующихся при' этом участкоЕ гомологии,, очевидно, недостаточно для отбора соответствующих клопов.. Тем не менее. этот зонд достаточно специфично гибридизопалсч с: препаратами мРНК. выделенными из мицелия на стадии максимальной скорости синтеза внеклеточной /3-галактозидазы. Размер мР1Ж, лающей зону гибридизации оказался равен 4 т.н., что соотвествует размеру транскрипта данного re;.i. При культивировании на среде с глюкозой (.ч этих условиях наблюдается репрессия синтеза Фермента) в препарате мРНК соответствующий трчнскрипт отсутствовал. . Полученные результаты дали принципиальную возможность использовать дашшй зонд в качестве затравки в экспериментах а достройкой праймера на мРНК. Была определена нуялеотидная последовательность достроенных фрагментов, включающая "3' нетраисл'Друему» область гена до сайга инициации гранскричиии и

область, кодирующую лидерный пептид, на основании, которой был синтезирован другой олигонуклеотидный зонд. С его помочьй удалось отобрать клой, содержащий ген секретируемой. /3-галактоэидазы и фланкирующие его участки. Была построена рестрикционная карта одного из EcoRI-фрагментов ДНК вставки, в пределах которого локализован искомый ген.

Нами была определена частичная нуклеотидная последовательность клонированного гена,' включая 5' нетрансЛируемую область 430п.н.) и область, кодирующую N-концевой фрагмент белка 650п. н.3 и проведен ее анализ (Рис.З). Установленная на основании нуклеотидной, аминокислотная последовательность первых 25 остатков полностью совпала с результатами прямого секвенирования белка, за исключением 20-ой позиции, где вместо идентифицированного ранее остатка Pro находится Arg. Дальнейиее транслирование нуклеотидной последовательности гена и локализация положения интронов в пределах клонированного фрагмента стало возможным благодаря сравнению с опубликованной недавно последовательностью кДНК-ой копии гена . секретируемой /3-галактозидазы A.niger (Kumar-et al. ,1992). В 80?'. случаев в одних и тех же положениях находятся идентичные аминокислотные остатки. В пределах секвенированной последовательности кодирующая рамка считывания прерывается трижды. Мы предполагаем, что внеклеточная (3-галактозидаза P.canescens синтезируется в виде предшественника, а отшепление лидерного пептида (39 а.к.) происходит в два этапа под действием сигнальной пептидазьг и сайт-специфичной эндопептидазы, наподобие КЕХ2 протеазьг дрозаеП. Эксперименты с достройкой праймера позволили локализовать единственный сайт инициации транскрипции, отстоящий на 88 л.н. от стартового кодопа. В 5' регуляторной области гена были найдены характерные для эукариотических промоторов консервативные TATА и СААТ боксы. Любопытно, что непосредственно к TATA блоку примыкает псслг'довательность, обладающая симметрично' расположенным палиндромными участками. ■ Однако о ее функциональной роли, пока можно лишь догадываться. Никаких других потенциальных элементов регуляции ■ UAS типа или участков, . отвечающих эа азот- и углерод-катаболитную репрессию генов у грибов, ,в пределах данной 3' фланкирующей области не обнаружена.

Фрагменты клонированного нами гена, кодирующие 1Í-,С-концевыо л серединную М части белка (их расположение на рестрикцйонной :сарт(? гена указано на рисунке 4а) были использозакы в качестве-

gg9atcatCQ3tccttctectacgaäta9»at03CCtct.c^e^ct9cgacgttgt -237 CQtctQCt^aatjgtccatacacacctggtcaacccccacgcctcgttcccctgtegatflattaaatgscaaQat -212 tQacgaaagagggtcgaagtgcagatcgcgctctagtcccafigtccacfigccttcgaggtccaacQCCcgagaga -137

aacgtgcagaataatgatgcgagtgcggcagtgacggaatacacggcattEtgccttegtgaaGgtgattcgc« -¿2

V+1

gtcgatcgtcgctcgagaagtjtatatgaijjgcccgccgatcccttgcagtctgtgaaatgcaagctgctgaagc 13

tgaagctcttttcataattagcttctcctaaggcgaaggtcgcgtotattcttttcatcgtcgactttgctcacc 83

Hat lys Leu Leu Sar Sar Trp Val Vat Ma Ala Leu Ma Ala Gin Ala Ala Gly Ala Ala -20 ATG AAG CTT TTG TCT TCT iGG GTC GTG GCT GCT TTG GCA CCA CAG GCT CCA GGT CCT CCT 148

lie Ser His Lys Leu Asp Gly Phe Thr I le Arg Glu Ills Ala Asp Pro Ala Lys ArgiAla 1 AVA AGO CAT AAG TTG GAT CGC TTC ACC АТС CGG GAG CAT GCG GAT CCC GCG AAA CGG GCC 208

Leu Leu Gin Lys Туг 6

CTG CTG CAG AAA TAT g^tqttqqatatttctcttqcqa'tattcaatcqgqctgtaqtaçtQatgacqqac 27S

Val Thr Trp Asp Glu HU Ser Ile Phe Val Asn Gly Qlu Arg Leu «et Ile Phe 24 CactgiaaGTA ACC TG8 ÖAC GAG CAC TCG ATA TTC GTC АЛТ GGC GAG CGG HG ATQ ATT ПС 341

Ser Gly Glu Val His Pro Туг Arg 32

AGT GGT СЛА GTC CAC CCQ TAT CG ai3laitatatggtcgagactggacggatttH£lMtâtaaatc 40Э

Leu Pro Val Ala Ser Leu Туг Ile Asp I le Pha Glu Lys Val Lys Ala Leu Gly 50 gcttê^T CTG CCT GTC GCC TCC TTG TAC ATT GAT ATT TTC GAG AAG GTC AAG GCA CTC GGA 470

Pha Asn Cys Val Ser Phe Туг Val Asp Trp Ala Leu Leu Glu Gly Asn Pro Gly His Tyr 70 TTC AAT TGC GTG TCC TTC TAT GTC GAT TGG GCT TTG TTG GAG GGC AAC CCG GGC CAC TAC 530

Ser Ala Glu Gly По Pho Asp Leu Gin Pro Phe Phe Asp Ala Ala Lys Glu Ala Gly Ile 90 TCT GCC. CAG GGC ЛТС TTT GAC CTC CAG CCC TTC ПС GAT GCG GCC AAG GAA GCT GGT ATT 5Э0

Tyr Leu Leu Ala Arg Pro Gly Pro Туг I le Aen Ala Glu Val бег Gly Gly Gly Phe Pro 110 TAC TTG CTG GCT CGT CCC GGT CCT TAT ATT AAC GCT GAG GTC TCT GGT GGT GGT TTC CCC 650

Gly Trp Leu Gin Arg Val Asp Gly lie Leu Arg Thr Ser Asp Gin Ala Tyr Leu Lys Ala 130 ■GGC TGG CTG CAG CGA GTC GAT GGC ATT CTG CGG ACT AG С GAT GAS'GCA TAC HG AAG GCG 710

Thr Asp Lys 133

ACC GAT AA gláiüüacatcgtccttcgatc 740

Рис. 3. Частичная нуклеотидная последовательность гена секретнруеыой [i галаетоэидазы P.car.esctns и предсказанная аминокислотная последовательность белка Рамками обоедены СААТ и ТЛТД боксы в промотсрноЯ области гена. +1 нукяеош; соответствует точке шшциацнн транскрипции. Вертикальной стрелкой указан caih отщепления лндерного пептида. Подчеркнуты консервативные последовательности к: 5'- и 3'- концах шпронов, а также предполагаемые с.ынали сплайсинга. Штрихового линией выделен пзлмндраиим'й участок, прилегающий к TATA блоку.

О

1.Н.

__EL_.E_.B9_

В Е

©

М

о 14

Э "' -

5

3

АТС

и

•в,о

N

& 'ДУМАИ± Я

о

м

а

3 а я в 1«

х о, . >

5 й «

ё 3 2

-£ «

^ ^ п ООО

н ^ *

в в ё и и и

я Я

аз 3 я •

О ^ И

о

М Й

...... - ^

и и и о у V-

'С* ** © * в

N

©

М

Рис. 4. Блот-гпбрншпашш рестрнкниоиных фрагментов ДНК (а) н аратоп мРНК (б) из клеток гриба Р.спнехсем с радиоактивно мечгп-I фрагментами гена секрстнруемой р-галакгоэндазы. Сг.йгм рестрик-В, ВптНЬ Е, ЕсоЮ; В5, ЩИ.

зондов при блот-гибридизации с рестрикционными фрагментами ДНК Р.сапезсепз, ¡Зонды М и С обнаруживают в препаратах ДНК по одному сходному гибридизующемуся фрагменту, размер которого варьирует в-зависимости от сайтов узнавания той или иной эндонуклеазой. Дополнительная зона гибридизации с М зондом при рестрикции ДНК по Вд1П объясняется наличием в середине гена сайта расщепления данным ферментом. Те же зоны выявляются ■ при использовании Н-концеЕого зонда, что позволяет сделать вывод о существовании в геноме Р.сапезсепз всего одной копии гена. Наряду с основной зоной гибридизации, соответствующей гену секретируемой /3-галактозидазы, на ДНК-блоттинге наблюдается ряд различающихся по молекулярному весу полос, специфичность связывания которых с зондом N существенно ниже. В подтверждение того, что эти последовательности гомологичны, но , не идентичны И-концевой области гена свидетельствуют также • результаты гибридизации рестрикционных фрагментов ДНК с синтетическими олигонуклеотидиыми зондами. Ни один из трех зондов, комплементарных различным участкам Н-концевого фрагмента гена, не выявлял.характерных минорных полос. Естественно возникает вопрос, несут ли эти последовательности какую-нибудь функциональную нагрузку, и если да, то имеет ли это отношение к изучаемой системе утилизации лактозы. Кроме того, интересно было исследовать те факторы и механизмы, которые обеспечивают столь высокий уровень синтеза секретируемой /3-галактозидазы.

Некоторые особенности регуляции транскрипции генов ¿З-галактозидаз

Р. сапезсепз

Согласуясь с полученными данными о влиянии источников углерода на уровень экспрессии генов /3-галактозидаз у гриба Р. сапезсепБ СТабл.1, Рис.1), препараты мРНК из клеток мицелия, выращенного в условиях индукции и репрессии синтеза вне- и внутриклеточных лактаз, были подвернуты анализу методом блот-гибридизации с радиоактивно меченными N. М, С фрагментами гена . секретируемого фермента. Результаты анализа могут быть сведены к следующему СРис.46):

1. Количество внеклеточного фермента коррелирует с содержанием соответствующего транскрипта, а наблюдаемый феномен углерод-катаболитной репрессии сопровождается его исчезновением из • . пула мРНК:

2. Независимо от добавляемого источника углерода Слактоза, галактоза, сахароза, глюкоза) на РНК-блоттинге возникает зона гибридизации с II-, но не М и С-кокцевым зондом, соответсвувшая эазмеру транскрипта 1,6 т.н.

На основании, полученных результатов можно сделать насколько южных выводов относительно структурной организации и особенностей югуляции генов Lac системы у гриба P. canescens, отвечающий: за lytiKUHD гидролиза /J-галактоэидной связи. Очевидно, что основным ■ровней регуляции экспрессии гена секретируемой /3-галактоэидазы вляется ■ транскрипционный. Что касается » ■экспресснрующихся оследователыюстей, гомологичных области Н-копцевого домена неклеточного фермента, то, по всей видимости, они едва ли имеют гношение к генам Lac признака. Накопление внутриклеточной ^тинное™ /?-галактоэидаз не сопровождается эквивалентный зменением уровня транскрипции, этих участков. Не исключено, что годукты этих генов выполняют в клетке какую-нибудь функция, шример, показано, что С-концевой домен /3-галактозидазы Е. coli кет области гомологии с дегидрофоь ,т редуктазой СHood et .,1978). ...

Б целом, по своей организации Lac система P. cnescens поминает гены Sta фенотипа у дрожжей-сахаромицетов. В клетке шествует несколько генетически несцепленных локусов, отвечающих выполнение одной функции гидролиза гликозидных связей у вне- и утриклеточных субстратов. Разница состоит лишь в том, что в нем случае гены вне- и внутриклеточных 0-галактоэидаз возникли, зоятно, независимо друг от друга.

юляция препаратов мРКК из гриба Р.canescens, в бесклеточной системе синтеза

Можно предположить, что регуляция на уровне транскрипции 1юдь не единственный механизм, обеспечивающий эффективную прессию гена секретируемой /3-галактозидазы. Некоторые .из ученных препаратов мРНК были транслированы в бесклеточной теме синтеза из ретикулоцитов кролика, а продукты трансляции лизировали злектрофоретнчески.

В зависимости от препарата мРНК, т. е. , от условий ьтивирования гриба, в электрофоретическом спектре белков можно элить эонч. образуемые специфи ю , синтезировавшимися «пептидами. Так для трансляции мРНК из клеток мицеЛия,

индуцированного лактозой Св. этом случае начинается накопленш внутриклеточных (3-галактозидаз), характерно образование зоны i области разделения белков с молекулярной массой 120 кДа. Хот; размер полипептидной цепи /3-галактозидазытяж близок к данно! величине, маловероятно, чтобы эта полоса принадлежала дашгонз белку, т.к. из расчетов следует, что доля фермента' в клеточись лиэате составляет 0,2:;, и он даже не визуализируется ул злектрофореграммэ. При синтезе секретируемого фермента на среде с полисахаридами в спектре продуктов трансляции uF!IK увеличивается интенсивность полос, соответствующих размерам полипаптадоь 35 и 5С кЯа. Удивительным кауетск отсутствие белковой зоны в области, где обычно (.'.нгрируег внеклеточная (З-галзктсзкдаза, несмотря на то, что б .дула ыРНК заведомо вызотсл необходимый транскрипт. Никакие продукты трансляции антителами к сакретируемой /З-галактоаидазе не осагдались. Виесте с тем, некоторые белки достаточно специфично реагировали с антителами к культуральной гидкссти. В качестве наиболее реального объяснения наблюдаемого ямтш шгмо предположить наличие в клетке гриба P.canescens видоспецкфичшк факторов трансляции пли Си) не совсем обычной структуры 5' {«¡транслируемой области мРНК, кодирующей секретируэмуь /3-галактозидазу. И в том, и в другом случае при трансляции iu vitro необходимый продукт будет отсутствовать.

Функциональный .шаяиз 5' пегуляторной области гена секретируеяой

(З^гапакторидазы

Клонированный нами по EcoRI-сайту фрагмент размером 4,2 т.п.и. содержал, кроме кодирующей, 3' фланкирующую область гена внеклеточной /3-галактозндазы длиной * 700 п.н. СРис.4). Интересно было проверить, содержит ли эта последовательность все необходшлю элементы регуоции, тем более, что фактически мы имели и распоряжении уже готовую конструкцию из исследуемого промотора и гена репортера ' С в качестве гена-репортера выступал сам ген секретируемой (i-галактсзидазы). В состав рекомбинаитной плазмиди был введен селективный маркер, комплемеитируюшм ауксотрофную мутацию по ,:>дной из аминокислот СРкс.5а). Эффективность функционировав'л промотора исследовали в клетках гриба A.nidularv-», т. к. согласно литературным сообщениям ссс^ствонасй ьиеклеточкоа /5-галактозиаазы у эгого вкяа жпелиаль-ст. 'гскй-Jfi ис с.1напу*(?ио С Fan*.;»; et a I. 1973)

Р.сцпюсепч АпМцкч? глюкоза — — — — +

pVC8

ЕсоШЕсо И Есо И Ьев-С"

Геномный СгйЯ! -фрагмент б) (4,3 т. ПЛ.)

нагруакаЦ 1 й | п

О Й Ю * О О ю о 8

Л 2 3_

_кДа ■ 200

1 2 3

еаэ

л . >

встэ. 92,5 »;Ф 69

. 46

30

• . и

12 3

21,5

I

I

и

|1

1ч •■

IV.

м-

•■г«/ %

Гнс.,5. а-схема конструирования рекомбинаитноЙ илаэмидм рШлсб; б-' я-гибрвдиззиня и/«пиратов мРШС с М-фрагмогтем гит (5-акгозидазы; в-ДСН-злекгрофорез (слева), нммуноблотпшг-с ителами к секретируемой [5-галактозидазе (в серектс), ферментативное шроваипе (справа) препаратов культуралыюА жидкости сформированного (1) н рециппсптного (2) иггяммоп Л.пМи'аи-. Образец репарат р-галакто'знцазы Р.сапехсеы*

Анализ препаратов мРНК ОШЮРО Ч-> трзнсформант<?»

Л. Г)1с1и1а.пз, выращенного в условиях синтеза внеклеточной ^-галактозлдааы Р.сапезсепз, показал, что количество образующихся транскриптоз исследуемого гена приблизительно в 20 раз меньше, чем ь клетках гриба Р.сапезсепэ (Рис.56). Можно предположить, что клошфованный ЕссК!-фрагмент хромосомной ДШ( Р. сапеэсепз не еахватывает всей &' регуляторной области гена, либо механизмы регуляции экспрессии гонов у данных видов шцелиалышх грибов несколько различаются. Вместе с тем, исследуемый промотор индуцировался теми ко источниками углерода, что и в исходной штамме, а именно арабинозой и полисахаридами клеточной стенки растений, а таксе подверхеи репрессирующему действию глюкозы.

Тестировании культуральной жидкости траисформантов показало, что фермент секратируется во внеклеточное пространство в активной форме, причем ни по электрофоретнческой подвикности, ни по антигенным характеристикам рекомбинантный белок не отличии о натнвного (Рис. 5з). Максимальный уроьень ферментативной активности достигался на среде со свекловичным жомом и составил 2,2 ед/мл. что в 20-30 раз ниже, чем у Р.сапезсепз. При индушш арабинаэо» на доля данного фермента приходится до 60^ белков культуральной падкости, а уровень гетерологичноЯ экспрессии сравним с данными для исходного штамма^ Поэтому возможно, что при выращивании трансформантов Л^хсШапз. среде с полисахаридами эффективной транскрипции не происходит только потому, что истинный индуктор синтеза не образуется в достаточных количествах.

Таким образом, клонированная . нами последовательность полностью кодирует структурный ген секретируемой /З-галактозидазн Р.сапезсепз, , а прилегающая к нему регуляторная область функционирует, хотя и не столь эффективно, даже в чужеродном генетическом окружении. Последнее обстоятельство позволяет надеяться, что промоторная область и область лидерного пстияа могут быть' с успехом использованы при -создании ноет; векторни« систем для экспрессии чужеродных генов в мицелиальны/ грибах.

- ai -

выводы

1. Показано, что в зависимости от условий культивирования клетки мицелиального гриба Pénicillium canescens способна синтезировать несколько ферментов гидролиза ß-галактоэидной связи различной локализации - два внутриклеточных и один секретируемый белок. Изучены основные закономерности их биосинтеза.

2. Ферменты очищены до гомогенного состояния и исследованы их молекулярные характеристики. Обнаружено, что по своим физико-химическим и каталитическим свойствам внутриклеточные ß-галактозидазы' различаются как между собой, так и от внеклеточного фермента.

3. С помощью синтетических олигонуклеотидных зондов, синтезированных на основании установленной N-концевой аминокислотной последовательности белка, клонирован структурный ген секретируемой. |9-галактозидаэы P. canescens. Определена частичная нуклеотидная 'последовательность гена и проведен ее анализ. Показано, что в геноме гриба P.canescens, помимо гена секретируемой /3-галактозидазы, представленного единственной копией, содержатся гомологичные . экспрессирующиеся последовательности, по всей вероятности, функционально несвязанные с исследуемой Lac системой.

4. Установлено, что основным уровнем регуляции экспрессии гена секретируемой /3-галактозидазы является транскрипционный. Помимо этого, существуют специфические регуляторные механизмы, обеспечивающие эффективную трансляцию данного белка в клетке.

5. Показано, что клонированная регуляторная последовательность гена внеклеточной /З-галактозидаэы Р. canescens, включающая промоторную область и область ливерного пептида, достаточно эффективно функционирует в клетках гриба Aspergillus nidiilans и может быть использована при создании новых векторных систем для экспрессии чужеродных генов в мицелиальных грибах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Николаев И. В. , Ходова 0. М., Тимохина Е. А. , Алексенко А. Ю. , Винецкиа й. П. Молекулярные характеристики секретируемой /З-галактозидази мицелиального гриба Pénicillium canescens ■//. Тезисы 4-ой Всесосз конф. "Биосинтез ферментов микроорганизмами", Ташкент. 1988, С.114-115.

2. Николаев И. В. , Ходова О.М. , Тимохина Е.А., Алексешсо А. КЗ., .Винецкий Ю. П. Молекулярные характеристики секретируеиой рггалактозидазы Pénicillium canescens // Биохимия, 1989, Т.54, С. 1294-1299.

3. Макарова Н. А., Николаев И. В. , Винецкий Ю. П. Секреция /З-галактоэидазы на разных стадиях развития гриба Pénicillium canescens // Тезисы Всесоюз. конф. "Регуляция микробного метаболизма", Пушило. 1989, С. 43.

4. Николаев И. В., Вавилова Е. А., Винецкий Ю. П. Молекулярная структура Lac признака у мицелиального гриба Pénicillium canescens: налич;..' секретируемой и двух внутриклеточных 0-галактозидаэ // Биохимия, 1992, Т.57, С. 873-879.

5. Николаев И. В., Епишин С. М., Захарова Е. С., Котенко С. В., Винецкий Ю. П. Молекулярное клонирование гена секретируемой 0-галактозидазы мицелиального гриба Pénicillium canescens /✓ Молекулярная биология, 1992, Т.26, С.869-873.

6. Zakharova E.S. , Aleksenko A.Y., Lomakin I.В., llikolaev I. V., Epishin S. M., Vinetski Yu. P. Transcriptional expression of human interleukin-б gene in Aspergillus nidulans // Abstr. of International Conference cn AIDS, Cancer and Human Retroviruses, St.Peterburg. 1903, P.36.