Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

CREA - зависимая углеродная катаболитная репрессия в Penicillium canescens

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "CREA - зависимая углеродная катаболитная репрессия в Penicillium canescens"

На правах рукописи

ЧУЛКИН АНДРЕЙ МИХАЙЛОВИЧ

CREA - ЗАВИСИМАЯ УГЛЕРОДНАЯ КАТАБОЛИТНАЯ РЕПРЕССИЯ В PENICILLIUM CANESCENS

03.01.03 - молекулярная биология

1 2 ЯНВ 2012

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2011

005007264

Работа выполнена в лаборатории оптимизации экспрессии генов Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН (ИНБИ РАН).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, ИНБИ РАН, г. Москва

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, ФГУП «ГосНИИГенетика», г. Москва

кандидат биологических наук, Институт биологии гена РАН, г. Москва

Ведущая организация:

Беневоленский Сергей Владимирович

Миронов Александр Сергеевич

Захарова Елена Сергеевна

Биологический факультет МГУ, г. Москв

Защита диссертации состоится « 31 » января 2012 года в « 14 » часов и заседании Диссертационного совета Д217.013.01 при ФГУП «Государственны научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленны микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИГенетика») по адресу: 117545, г. Москва, 1-Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при

ФГУП «ГосНИИГенетика».

Реферат разослан «2-^"» декабря 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент ^ Т.Л. Воюшин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Углеродная катаболитная репрессия (CCR, от Carbon Catabolite Repression) - это механизм, который позволяет микроорганизмам осуществлять последовательную утилизацию источников углерода, начиная с более предпочтительных (быстро утилизируемых и более энергетически выгодных). Обычно это достигается блокированием синтеза ферментов, вовлеченных в метаболизм менее предпочтительных источников углерода.

Мицелиальные грибы - микроорганизмы, используемые в промышленном производстве ферментов для пищевой, целлюлозно-бумажной промышленности, в производстве кормов и биотоплива. Они продуцируют широкий спектр секретируемых ферментов, необходимых для деградации стенок растительных клеток, таких как глюканазы, ксиланазы, ксилозидазы, ферулоил-эстеразы, арабинофуранозидазы, глюкуронидазы, пектинлиазы и др. Продуктами этих ферментов являются моно-, ди- и олиго- сахариды, причем последние, впоследствии также преобразуются в моно- или ди- сахариды, которые при их избытке, вызывают репрессию транскрипции ферментов этих ферментов, используя механизм CCR.

Такая система регуляции выгодна для микроорганизма, однако для промышленного производства ферментов создает большую проблему, так как ограничивает спектр используемых источников углерода при культивирования грибных продуцентов.

Pénicillium canescens F178 -почвенный изолят, который был выделен как природный продуцент Р-галактозидазы. Он характеризуется большой продукцией внеклеточного белка (до 5 г/л), высокой скоростью роста и низким количеством секретируемых протеиназ.

Кроме Р-галактозидазы, этот штамм на среде со свекловичным жомом производит до 100 ед./мл эндо-1,4-бета-ксиланазы. Гены bgaS и xylA, кодирующие эти белки были клонированы и секвенированы ранее.

1

Амплификация этих генов в Р. canescens приводила к 8-12 кратному увеличению продукции целевых ферментов. Кроме того, сильные промоторы этих генов использовались для экспрессии генов фитазыphyA, эндоглюканаз eg¡2 и egl3 Р. canescens и лакказы lacl Trámeles hirsuta.

Показано что транскрипция с этих промоторов индуцируется арабинозой и подвержена углеродной катаболитной репрессии.

Таким образом, изучение регуляции углеродной катаболитной репрессии в Р. canescens является ключевым моментом для его использования как промышленного продуцента ферментов и других белковых молекул.

Цель работы: изучение мокулярно-генетических механизмов углеродной катаболитной репрессии в мицелиальном грибе Р. canescens.

Задачи:

1. Клонировать ген сгеА Р.canescens, кодирующий репрессор транскрипции генов, подверженных углеродной катаболитной репрессии;

2. Изучить его регуляцию на уровне транскрипции и локализацию белкового продукта;

3. Определить сайты связывания репрессора СгеА с промоторами генов -мишеней;

4. Получить и охарактеризовать мутантные по углеродной катаболитной репрессии штаммы Р. canescens.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Клонированы и секвенированы гены сгеА и gpdA глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы Р. canescens.

Показано, что транскрипция гена репрессора сгеА авторегулирована, однако увеличение транскрипта сгеА, в отсутствии проверенных источников углерода, не приводит к репрессии регулируемых им генов, и, таким образом, регуляция транскрипции сгеА не является ключевым фактором в углеродной катаболитной репрессии генов в Р. canescens.

Изучена внутриклеточная локализация гибридного белка СгеА::ОРР при выращивании на средах с различными источниками углерода. Локализация СгеА в клетках Р. сапезсет являлась внутриядерной независимо от источника углерода и концентрации глюкозы в среде.

Идентифицированы сайты связывания СгеА с промоторами генов bgaS, ху1А и сгеА.

Разработана система прямой селекции мутантов по углеродной катаболитной репрессии, основанная на устойчивости к антибиотику «гигромицин

Получены и охарактеризованы мутанты P. canescens по углеродной катаболитной репрессии.

Получены мутантные штаммы мицелиального гриба P. canescens, не требующие индуктора для экспрессии генов, активируемых арабинозой в штамме дикого типа.

Мутантные штаммы могут быть использованы, как для гомологичной, так и для гетерологичной сверхпродукции различных белков и полипептидов в промышленном масштабе.

Апробация работы. Работа была представлена на международной конференции «IMC9 THE BIOLOGY OF FUNGI» (Эдинбург, Великобритания, 1-6 августа, 2010), и на совместном заседании межлабораторного семинара Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН и секции молекулярной биологии Ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 8 декабря 2011 года.

Публикации. По основным результатам диссертации опубликовано 6 работ, из них 3 статьи в рецензируемых российских журналах, 2 тезиса в сборниках материалов конференций и 1 патент РФ.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на _

страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Работа

Б».

иллюстрированау)рисунками и Т_ таблицами. Список литературы содержит/'ЛЬ источника.

Сокращения, принятые в тексте: ДДС -додецилсульфат натрия, ПААГ -полиакриламидный гель, EMSA - Electrophoretic Mobility Shift Assay, ПЦР-РВ -полимеразная цепная реакция во времени.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Клонирование гена сгеА P. canescens.

CCR в мицелиальных грибах осуществляется, главным образом, репрессором транскрипции СгеА, кодируемым геном сгеА. Было решено выяснить, есть ли в P. canescens ген, гомологичный сгеА и клонировать его.

Для этого были синтезированы вырожденные праймеры CREAD и CREAR на консервативные участки генов сгеА мицелиальных грибов:

CREAD: S'-CATGCCTGYCARTTCCCIGGCTG-S';

CREAR: 3' -GGGTTGAGIGGGTTG AGITGICG AG-5'.

Амплифицированный фрагмент ДНК P. canescens, длиной около 550 п.н., был клонирован в плазмидном векторе pUC18 и секвенирован. Сравнение полученной нуклеотидной последовательности с генами сгеА и его аналогами в мицелиальных грибах показало высокую степень гомологии.

Полученный фрагмент ДНК сгеА P. canescens был использован в качестве зонда для гибридизации по Саузерну геномной ДНК P. canescens. Показано, что в геноме P. canescens присутствует единственная область с высокой степенью нуклеотидной гомологии с геном сгеА.

Впоследствии этот зонд был использован для гибридизации с полученным нами геномным банком P. canescens в фаговом векторе XEMBL4.

В результате скрининга фаговой библиотеки выбран клон, содержащий фрагмент ДНК длиной около 12 т.п.н. с кодирующей частью гена сгеА и протяженными 3'- и 5'- нетранслируемыми областями.

Фрагмент ДНК этого фагового клона, размером около 5.5 т.п.н., был клонирован в плазмидном векторе рВЬевспр! К811(+) (плазмида рРСсгеА) и частично секвенирован (рис. 1). Таким образом, клонирован полный ген сгеА Р. сапеясет.

£шЮ( 2)

3' UTR

Рис. 1. Карта плазмиды рРСсгеА

Анализ нуклеотидной последовательности (ОепВапк: Р.1695603) выявил, что ген сгеА Р. сапезсет не содержит интронов в кодирующей части, которая имеет длину 1242 п.н. Трансляция нуклеотидной последовательности показала, что зрелый белок, состоящий из 413 а.к., имеет молекулярную массу 44.6 кДа и значение изоэлектрической точки равное 9.41. Сравнение нуклеотидной и транслированной аминокислотной (рис. 2) последовательностей гена сгеА Р. сапеясет с генами углеродной катаболитной репрессии других мицелиальных грибов и их белковыми продуктами показало значительную гомологию (до 85% и 92%, соответственно).

Из рисунка видно, что СгеА Р. сапеясет, также как и его гомологи в других мицелиальных грибах, содержит ДНК - связывающий домен с двумя цинковыми пальцами типа СуБгШБг и консервативную С-область, богатую остатками серина, треонина и пролина, что характерно для регуляторных белков. В области

цинковых пальцев имеются аминокислотные замены, причем гомология с nidulans наиболее сильная.

ААВ01677 (1

САА04425 (1)

CBF69992 (1)

P.O. CREA (1)

ААВ01677 (57)

САА04425 (71)

CBF69992 (64)

Р.с. CREA (66)

ААВ01677 (127) САА04425 (138) CBF69992 (134) P.O. CREA(136)

ААВ01677 (187) САА04425 (203) CBF69992 (204) P.O. CREA(203)

ААВ01677 (248) САА04425 (273) CBF69992 (269) Р.с. CREA(266) Consensus (281)

AAB01677 (316) CAA04425 (339) CBF69992 (336) P.O. CREA(332) Consensus (351)

AAB01677 (381) FPR3|RSSHgSBAG|DLM]

CAA04425 (407) FNfclQSSHGSlAGNDLji I

CBF69992 (395) a(sVSSSp|sb.G|DL

p.o. crea(392) H7smyssa!4|s|ag|di,KrF'

Consensus (421) GFTSG SSTTNSVAGGDLADRM

Рис. 2. Выравнивание аминокислотных последовательностей белка-репрессора CreA и его гомологов в мицелиальных грибах: САА04425 -CRE1 Sclerotica sclerotiorum, ААВ01677 -Crel Trichoderma reesei, CBF69992 - CreA Aspergillus nidulans, P.c. CREA - CreA P. canescens. Рамкой выделены последовательности «цинковых пальцев».

2. Определение нуклеотидной последовательности гена gpdA глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы P. canescens

Для последующего исследования транскрипции генов методом ПЦР-РВ и анализа локализации CreA в клетках P. canescens была определена нуклеотидная последовательность конститутивно транскрибирующегося гена gpdA P. canescens глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH) (ЕС 1.2.1.12).

Для этого были синтезированы олигонуклеотиды на консервативные участки генов глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназ мицелиальных грибов: PCGPDD2: 5'- ATGTWCGTYATGGGTGTCAAC -3'; PCGPDR1: 3'- ACCATGCTYTTGCTCACCC -5'.

С использованием этой пары праймеров и ДНК P. canescens в качестве матрицы, был получен ПЦР-фрагмент длинной около 550 п.н., секвенирование которого показало значительную гомологию с генами глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназ других грибов.

На последовательность полученного внутреннего фрагмента были синтезированы два прямых и два обратных праймера, с помощью которых методом «ПЦР для неклонированной геномной ДНК» были амплифицированы протяженные 5'- и 3'- концевые фрагменты, которые впоследствии были секвенированы, и таким образом определена нуклеотидная последовательность полного гена (GenBank: GQ996946).

Сильный промотор гена gpdA P. canescens с введенным сайтом Psc\, перекрывающимся с инициирующим ATG - кодоном, был клонирован в плазмидном векторе и использован в дальнейшем для конститутивной экспрессии сгеА в клетках P. canescens, а синтезированная пара праймеров на экзон 4 гена gpdA P. canescens, была использована для анализа транскрипции генов методом ПЦР-РВ, где gpdA служил референсным геном.

3. Анализ транскрипции сгеА P. canescens при росте культуры на средах с различными источниками углерода методом ПЦР-РВ.

В мицелиальных грибах Т. reesei и A. nidulans гены сгеА (crel) авторегулированы и имеют более низкие уровни транскрипции в условиях репрессии по сравнению с дерепрессирующими условиями, тогда как в Aspergillus chrysogenum и S. sclerotiorum уровни транскрипции сгеА {crel) имеют прямую корреляцию с внеклеточной концентрацией глюкозы.

Так как существуют различия в регуляции транскрипции сгеА и его гомологов в Т. reesei и А. nidulans по сравнению с Aspergillus chrysogenum и S. sclerotiorum, было решено изучить регуляцию транскрипции сгеА Р. canescens при росте на различных источниках углерода методом ПЦР-РВ.

Для получения препаратов РНК, штамм Р. canescens F178 выращивали в жидкой среде, после чего мицелий переносили в среды с различными источниками углерода или без них. Полученная затем кДНК использована для

проведения ПЦР-РВ с использованием праймеров на гены сгеА, gpdA, и в некоторых случаях, на ген bgaS Р. сапехсеп.ч.

Транскрипция генов сгеА и bgaS анализировалась относительно конститутивной транскрипции ^рс1А, а изменение транскрипции измерялось относительно образца, инкубированного в присутствии 50 мМ Э-глюкозы. Результаты ПЦР-РВ анализа представлены в таблице 1.

Таблица 1.

ПЦР-РВ анализ транскрипции генов сгеА на различных источниках углерода.

Источник углерода gpdA Ст, среднее сгеА Сг, среднее bgaS Ст, среднее Увеличение сгеА мРНК, раз Увеличение bgaS мРНК, раз

Без углерода 25.46±0.33 24.16±0.32 29.70±0.37 19 (14-26) 125 (88-176)

D-глюкоза* 50 мМ 21.48±0.43 21.6ftfc0.40 7 (4.5-10)

D-глюкоза ** 50 мМ 24.46±0.21 27.41±0.13 35.66±0.45 1 (0.85-1.2) 1 (0.7-1.4)

D-фруктоза 50 мМ 23.55±0.36 26.65±0.42 0.9 (0.6-1.3)

глицерин 50 мМ 21.00±0.35 22.93±0.38 2 (1.4-2.9)

D-сорбит 50 мМ 23.31±0.53 24.90±0.30 2.5 (1.7-3.9)

сахароза 25 мМ 24.37±0.38 27.25±0.39 1 (0.7-1.5)

L-арабиноза 1 мМ 25.78±0.23 24.24±0.32 24.98±0.36 22 (17-30) 4100 (3000-5500)

* - глюкоза добавлена на 30 мин после 150 мин инкубации без источников углерода. ** - данные образца были использованы в качестве «sample probe» при вычислении ДДСт.

Из полученных данных видно:

■ В присутствии всех проверенных источников углерода транскрипция сгеА уменьшается (L-арабиноза не утилизируется штаммом F178).

■ В отсутствии D-глюкозы транскрипция bgaS увеличивается в 90-180 раз, а добавление индуктора (1 мМ L-арабинозы) в 3000-5500 раз увеличивает транскрипцию bgaS , несмотря на значительное (17-30 раз) увеличение транскрипции сгеА.

■ Добавление D-глюкозы к голодающему по углероду мицелию Р. canescens не приводит к увеличению транскрипции сгеА.

Таким образом, в Р. canescens имеет место авторегуляция гена сгеА. Результаты ПЦР-РВ наглядно демонстрируют уменьшение транскрипции в присутствии проверенных источников углерода. Тем не менее, увеличение транскрипции сгеА в присутствии 1мМ L-арабинозы, являющейся индуктором секретируемой бета-галактозидазы, не приводит к репрессии транскрипции гена bgaS и говорит о том, что регуляция на уровне транскрипции сгеА Р. canescens не является ключевым механизмом углеродной катаболитной репрессии в Р. canescens.

Есть данные, что добавление репрессирующих или дерепрессирующих моносахаридов в среду с мицелием вызывает быстрое и кратковременное увеличение транскрипции сгеА. Это увеличение зависит от моносахаридной восприимчивости и, как предполагают, находится под контролем гена сгеВ. Нам не удалось увидеть этого эффекта в Р. canescens, добавив на 30 мин глюкозу к голодающему мицелию.

4. Анализ локализации СгеА в клетках Р. canescens.

Субклеточным фракционированием было доказано, что локализация гомолога СгеА (CRE1) в S. sclerotiorum зависит от присутствия источника углерода в среде. Кроме того, внутриклеточная локализация белка GFP::CRE1 S. sclerotiorum экспрессирущегося под контролем промотора crel S. sclerotiorum менялась в зависимости от концентрации глюкозы в клетках А. nidulans. Однако CreA::GFP А. nidulans, экспрессирущийся под контролем промотора gpdA А. nidulans находится в ядрах клеток А. nidulans как в репрессирующих, так и дерепрессирующих условиях и не зависит от количества глюкозы в среде.

Ввиду вышеуказанных различий в изменении локализации СгеА и его гомологов, было решено изучить локализацию СгеА Р. canescens в клетках Р. canescens. С этой целью нами была сконструирована плазмида pGPD::creA::GFP (рис. 3), несущая гибридный ген creA::sGFP под контролем конститутивного

9

промотора гена gpdA Р. сапеясет, которая была введена в геном Р. сапеясет трансформацией.

КсыЮ (а)

Рис. 3. Карта плазмиды рОРО::сгеА::СРР.

На селективной среде отобрано 20 клонов трансформантов, среди которых 11 имели ОРР-флуоресценцию после проращивания спор на среде ММ.

Споры трех штаммов, имеющих ОРР-флуоресценцию, были высеяны на агаризованную среду ММ содержащую различные источники углерода, после чего образцы подвергли микроскопии. Результаты представлены на рис. 4.

Рис. 4. Флуоресцентная (А) микроскопия и микроскопия в

проходящем свете (Б) растущего мицелия

штамма РСА-

Ю/рСРО::сгеА::ОРР/3. Источник углерода: (1) — 50 мМ Э-глюкоза, (2) -0.5 мМ Э-глюкоза, (3) -50 мМ глицерин, (4) - 50 мМ О-фруктоза, (5) - 50 мМ Б-сорбит, (6) - 50 мМ сахароза

Из рисунка видно, что гибридный белок CreA::GFP находится в ядрах клеток Р. canescens, и его локализация, также как и в А. nidulans, является внутриядерной вне зависимости от концентрации глюкозы и от источника углерода. Полученные данные можно объяснить тем, что у грибов локализация СгеА регулируется по-разному и существуют различные механизмы активации СгеА, либо локализация СгеА в клетке не является ключевым механизмом регуляции углеродной катаболитной репрессии.

5. Определение сайтов связывания СгеА Р. canescens с промоторами генов bgaS, xylA и сгеА.

Для связывания репрессора транскрипции СгеА необходимо присутствие в промоторе репрессируемого гена консервативной последовательности 5' -SYGGRG - 3'. Однако наличие этой последовательности не является достаточным условием связывания СгеА и его гомологов в других мицелиальных грибах с промоторами. Так, в промоторе гена alcA А. nidulans, функциональны только два из семи предполагаемых сайтов связывания СгеА, а в alcR промоторе - четыре из девяти.

Было решено выяснить, какие из предполагаемых сайтов связывания СгеА в промоторах генов сгеА, xylA и bgaS взаимодействуют с репрессором транскрипции. С этой целью мы экспрессировали полный ген сгеА Р. canescens и нуклеотидную последовательность ДНК-связывающего домена в клетках Е. coli с помощью рЕТ - системы и проанализировали взаимодействие полученных белковых продуктов с фрагментами промоторов генов сгеА, xylA и bgaS длинной около 250 п.н. с помощью EMSA, а затем с короткими (40 п.н.) двуцепочными олигонуклеотидами содержащими консенсусную последовательность связывания.

Для экспрессии гена сгеА в клетках E.coli были сконструированы две экспрессионные плазмиды: рЕТсгеА и pETZFcreA, содержащие полную кодирующую последовательность сгеА или только домен цинковых пальцев (рис. 5).

Плазмиды были введены в клетки E.coli , и после индукции, растворимые фракции лизатов клеток наносили на колонку с Ni-NTA Agarose.

Mfcli«)

Т7 lac promotor

His-Tag T7 teminator

Т7 lac promoter

АУ»|(Ч5)

P. canescens creA Zn-finger domain

His-Tag T7 terminator

lacl

РМВ1 replicón pMB1 replicón

Рис. 5. Карты плазмид рЕТсгеА и pETZFcreA. Указаны использованные сайты рестрикции.

1 2 М кДа

СгеА

------ 40

Рис. 6. ДДС электрофорез препаратов •и» 25 растворимых белков клеток E.coli ZnF. BL21 (DE3)/pETZFcreA (1) и

CreA BL21 (DE3)/pETcreA (2) после

хроматографии на Ni-NTA Agarose в 13% 15 ПААГ. (М) - маркер молекулярного веса.

Связавшиеся белки элюировали линейным градиентом имидазола, и

фракции, содержащие нужные белки были объединены и нанесены на

денатурирующий ПААГ (рис. 6).

На рисунке отчетливо видны мажорные полосы соответствующие белкам

СгеА и ZnF-CreA с расчетной молекулярной массой 48 и 16 кДа, соответственно.

Для первичного анализа промоторов был проведен EMSA-анализ белков

СгеА и ZnF-CreA с 5'-32Р-мечеными ПЦР-фрагментами промоторов генов xylA,

12

bgaS и creA P. canescens. Для этого получены ПЦР-фрагменты промоторов длиной около 250 п.н., перекрывающие весь промотор каждого гена (рис. 7 (А)). На рис. 7 (Б) показаны результаты предварительного EMSA-анализа взаимодействия ZnF-CreA с промоторами. Из приведенных данных видно, что ZnF-CreA P. canescens взаимодействует с промотором xylA P. canescens в областях -500 -750, -1000 -1250 и -1500 -1760, с промотором bgaS P. canescens в областях -250 -500, -750 -1000 и с промотором сгеА -250 -500, причем, судя по разнице сдвига, количество сайтов связывания различно. Также заметно исчезновение полосы соответствующей фрагменту 0 -250 промотора гена xylA, что, однако не приводит появлению четкой полосы сдвига и говорит о нестабильном связывании в этой области.

А Б

>"">«•■ '-»*> BPCR, BPCR: BPCR3 BPCR4 BPCR5 BPCR6 BPCR7

ZnF CreA

• .

CREA, CREA.CR6A4ÇReA.CREA ^^^ ^^ ^^^ фф

P. canescens xylA promoter < iHm bp).

XD4 xc% xw4 i XD3> XD4 *D4 "ч

XR4 XR3

CREA CREA CREA CREA CREACRE^CREfCREA

îVOHt г Ж t

P. canascons crnA promoter (5,1,1 bp)

-1A. CREA. CREA .СЯЕ

' —

II

BPCR 1

ZnF CreA

.pcr. .PC, «>. apesj bpcr2 BP«, XPCRI XPCR2 XPCR3 XPCR4XPCR5 XPCR6 XPCR7

c'pcri cpcr:

ZnF CreA + - -f

Рис, 7. Схема предварительного EMSA-анализа промоторов генов bgaS, xylA и creA P.canescens (A) и его результаты (Б). Указаны положения праймеров (BD1-BR7, XD1-XR7, CD1-CR2), предполагаемые сайты связывания CreA (CREA) и ПЦР-фрагменты (BPCR1-BPCR7, XPCR1-XPCR7, CPCR1-CPCR2). (-) - препарат белка ZnF-CreA не добавлен в пробу, (+) - добавлено 2 нг ZnF-CreA.

Для детального анализа промоторов синтезированы пары комплементарных олигонуклеотидов, находящиеся в связывающихся с СгеА ПЦР-фрагментах, содержащих предполагаемые сайты узнавания СгеА (5 '-SYGGRG-3'), и проведен

EMSA - анализ с фрагментом СгеА, содержащим домен «цинковых пальцев» [рис. В (А)].

Данные EMSA [рис. 8 (Б)] показывают, что СгеА связывается с олигонуклеотидами ВС1, ВС2, ВС4 и ВС5 промотора bgaS, с ХС1, ХСЗ, ХС4, ХС5 промотора. ху/А и с СС2 промотора сгеА, причем сила связывания различна.

СЯЕА BPCR 4 =50 Ь|

mm

XPCR 3 JS3 t'I' CREA CREA CREA

CREA XPCR S W>b|>

XC2 XCI CREA XPCR 7 awihp

CPCR2 asobp

CREA CREA

Рис. 8. Схема EMSA-анализа ПЦР-фрагментов генов bgaS, xylA и сгеА P.canescens (A) и его результаты (Б). Указаны ПЦР-фрагменты, предполагаемые сайты связывания СгеА (CREA) и двухцепочечные олигонуклеотиды (ВС1-ВС5, ХС1-ХС5, СС1-СС2). (1) - препарат белка ZnF-CreA не добавлен в пробу, (2), (3), (4) -добавлено 0.3, 1, 3 нг ZnF-CreA, соответственно.

P. canescens bgaS promoter (wo bp)

CREA CREA. CREACREA.CREA

CREA4 CREA CREA, CREA CREACREAJÎRI

■1750 _N .1500 ^ -1250 't -'ООО ( -750 ^ -5«П

' J 1 -1 'il I )IÎIN

BPCR 7 BPCR6 BPCR 5 BPCR4 BPCR3 BPCR2

P. canescens xylA promoter (1876 bp). CREA CREA CREA CREA CREACREACRE^CREA

-1600 . 0«JI*i t* -1000 -750 «<500 f •/

X

XPCR 7

ÎEACREACf

w

CD2, -500

XPCR 6 XPCR 5 XPCR 4

P. canescens creA promoter (533 bp)

CD1

CREA. .CREA Ж CREA

---Л -250 S

—Г

XPCR 3 XPCR 2

-

XPCR 1

\ CPCR2

T—

CPCR1

Рис. 9. Расположение предполагаемых (черный цвет) и 3 подтвержденных (красный цвет)

сайтов связывания СгеА в промоторах генов bgaS, xylA и сгеА.

В результате EMSA - анализа были локализованы четыре сайта связывания

СгеА с промотором bgaS из восьми, соответствующих консенсусной

последовательности связывания СгеА в мицелиальных грибах 5 '-SYGGRG-3', и

четыре сайта из восьми в промоторе гена xylA. В промоторе самого сгеА

14

идентифицирован один сайт связывания с СгеА, что подтверждает авторегуляцию транскрипции сгеА отрицательной обратной связью (рис. 9).

6. Получение мутантов по углеродной катаболитной репрессии Р. canescens.

Мутанты по углеродной катаболитной репрессии в A. nidulans были получены при супрессии агеА мутации, на среде, содержащей пролин или ацетамид в присутствии D-глюкозы. Полученные штаммы имели мутацию, либо в гене сгеА, что приводило к дерепрессии в присутствии всех источников углерода, либо в генах сгеВ и сгеС, где дерепрессия происходила лишь на нескольких источниках углерода. Кроме того, мутантные сгеА аллели показывали неиерархическую гетерогенность к дерепрессии различных систем. Так, смысловая мутация сгеАЗО приводила к сильной дерепрессии ale - системы, в отличие от нонсенс - мутации сгеА220. Обратная ситуация происходила с дерепрессией системы ферментов, ответственных за утилизацию пролина.

Для получения мутантов по углеродной катаболитной репрессии была разработана система, основанная на прямой селекции по устойчивости к антибиотику «гигромицин Б».

Как указано выше, экспрессия генов xylA и bgaS в штамме Fl78 Р.canescens подвержена репрессии D-глюкозой и индуцируется L-арабинозой.

Была сконструирована экспрессионная плазмида рХНРН, несущая ген hph гигромицин Б фосфотрансферазы Е. coli, обеспечивающий устойчивость к антибиотику «гигромицин Б», под контролем промотора гена xylA Р. canescens и терминатор гена trpCA. nidulans (рис. 10).

Плазмида была введена в геном Р.canescens трансформацией, после чего трансформанты приобрели способность расти в присутствии антибиотика в условиях индукции промотора xylA, однако в условиях репрессии промотора xylA рост отсутствовал. Один из трансформантов (РСА-10-4) был использован для мутагенеза.

ЛЛи1 (117)

terminator IrpC

Рис. 10. Карта плазмиды pXHPH

Грибные споры обрабатывались ультрафиолетом, после чего высевались на агаризованную среду, содержащую гигромицин и индуктор в присутствии глюкозы. Также в среду добавляли X-gal, позволяющий тестировать активность секретируемой Р - галактозидазы BgaS P. canescens по окрашиванию агаризованной среды в синий цвет.

Получено около 1500 клонов, имеющих устойчивость к гигромицину в присутствии глюкозы. В 14 из этих клонов также присутствовала активность Р-галактозидазы. Эти клоны проверяли на активность эндоксиланаз в условиях индукции и репрессии, используя чашечный тест.

Результаты скрининга отобранных мутантов представлены в таблице 2. Два мутантных штамма (PC А-10-4/1-7 и PCA-10-4/II-29) были выбраны для дальнейшего анализа. Оба мутанта имели измененную морфологию, компактный замедленный рост и плохое спорообразование.

7. Анализ продукции эндо-1-4-бета-ксиланазы XylA в мутантных по углеродной катаболитной репрессии штаммах.

Для количественной оценки результатов мутагенеза, мутантные штаммы и штамм дикого типа выращивали в колбах с индуктором в присутствии глюкозы, и

измеряли активность эндоксиланазы, остаточный сахар в культуральной жидкости и сухой вес мицелия (рис. 11).

Таблица 2.

Сравнительный анализ мутантов и штамма дикого типа при росте на

Штамм Рост на среде с Активность (3- Активность

гигромицином Б * галактозидазы ** эндоксиланазы ***

РСА-10-4 (\УТ) - - -

РСА-10-4/1-1 + ++ ++

РСА-10-4Л-3 +++ + ++

РСА-10-4/1-5 + ++ ++

РСА-10-4/1-6 ++ +++ +

РСА-10-4/1-7 +++ +++ +++

РСА-10-4/1-9 ++ + ++

РСА-10-4/1-10 +++ ++ +

РСА-10-4/11-3 +++ ++ +

РСА-10-4/11-9 ++ ++ ++

РСА-10-4/11-10 -н- + +++

РСА-10-4/11-16 ++ + ++

РСА-10-4/Н-29 +++ +++ +++

РСА-10-4/11-31 +++ + ++

РСА-10-4/11-33 + +++ +

* - диаметр колонии в присутствии гигромицина Б.

** - диаметр окрашенной зоны в присутствии Х-$а1.

*** - диаметр зоны просветления при чашечном тесте на активность эндоксиланаз.

Из представленных графиков видно, что глюкоза является репрессирующим источником углерода для эндоксиланазы в штамме дикого типа, т. к. синтез ксиланазы начинается только при исчерпании глюкозы в среде. В мутантных штаммах репрессия глюкозой эндоксиланазы сильно снижена или отсутствует, и синтез ксиланазы начинается одновременно с увеличением биомассы или незначительно отстает. Кроме того конечная активность эндокиланазы в культуральной жидкости мутантных штаммов приблизительно в 3 раза превышает активность в штамме дикого типа, при одинаковом количестве потребленной глюкозы.

8. Анализ мутации в штаммах

Для проверки, несут ли полученные штаммы мутацию по гену сгеА, мы трансформировали мутантные штаммы плазмидой рРСсгеА, несущей

Рис. 11. Рост штамма дикого типа РСА-10-4 (а) и мутантов РСА-10-4/1-7 (б), РСА-10-4/11-29 (в) в присутствии индуктора на среде с глюкозой, где А-концентрация глюкозы в среде, ■- биомасса, о- активность эндоксиланазы в среде.

полноразмерный ген сгеА Р.сапеьсепь. У полученных трансформантов наблюдалась реверсия морфологии к дикому типу (рис. 12), что позволило предположить наличие мутации в гене сгеА.

Рис. 12. Комплементационный тест мутантных штаммов, (а) - штамм дикого типа РСА-10-4, (б) - мутант РСА-10-4/ П-29, (в) -мутант РСА-10-4/ 1-7, (г) и (д) -трансформанты мутантных штаммов геном сгеА.

в

Время (ч)

Для детального анализа мутаций мутантные аллели гена сгеА штаммов РСА-10-4/1-7 и РСА-10-4/11-29 были амплифицированы и секвенированы. Анализ нуклеотидных последовательностей показал наличие точечных мутаций типа «сдвиг рамки» с делецией одного нуклеотида в позиции +468 в мутанте РСА-10-4/1-7, и в позиции +609 в мутанте РСА-10-4/Н-29, что приводило к изменению С-конца белка СгеА (рис. 13). Как видно из рисунка, мутации не затрагивали ДНК -связывающий домен СгеА, однако приводили к изменению консервативного домена.

РСА-10 (1)МЗРРТЗУ6РЗНЬЬНР0ЕААРЗАЗРАТА0РТЗЗРЗЗРШ\ЗЗУЗЪЬРРШКСАРРА«ЕЕта0Р1/

РСА-10-4/1-7 (1) МЗРРТЗУСЕЗЫЬЬМРОЕААРЗМРАТАОРТЗЗРЗЗРМАЗЗУЗЬЬРРШКСАКРАЖЕтаОРЬРШ РСА-10-4/11-29 (1) МЗРРГЗУСГЗтЬКРОЕААОЗАЗРАГАдРТЗЗРЗЗОМАЗЗУЗЬЬРРШКОАКРАОТЖтааОЬРШ

УКСР! УКСР!

РСА-10 (71)

РСА-10-4/1-7 (71) РСА—10—4/I1-29 (71)

ВРАРНКЬЕНОТКШК'П :РКАЕНКЬЕН0ТКН1КТ1 ЭЯЙГНКЬЕНОТЕНЛКТ?

ГСЕК1 НАСОЕРССТККЕЗКЗОЕЬТКНгШ! ГСЕК1 НАСОЕРССТККЕЗКЗРЕЬТКНЗКИ ГСЕК1 НАСОЕРОСТККЕЗКЗРЕЬТКНБКИ

РСА-10 (141)СОБАДМУМААИММРРР|

РСА-10-4/1-7 (141)СОПААм™ААКММРРР------ЩР|-----

РСА-10-4/11-29 (141) СОРААмтаААЦММРРРШ

^ШРМЗККЭМКАОНЬАААААААА ИРКЗККЗМКАОШАААААААА КРЫЭШ<ЗМКА0НЬАААААААА

___^цодии,

¡ЬР ЩЬЯМЕЬП§ТВЗ РТ

РСА-10 (211) АТАА30§ЕКРРНМ|ЕНСЗКННЩСЗКНН5КСЬРЗЬЗДУА130КМТКЗН§МРРР0С¥СНКУКЕЗКРМЗРМЗ

РСА-10-4/1-7

РСА-10-4 /11-29 (204)--------------------ИИ МИДИЯМ ——: И—1: ИЯМ 1 И^Д

РСА-10 (281)ТАРЗЗРТЕЗНРЗЪЗРТРРНТРЬАТРАНЗРРЬКРЬСАКЕЬНЬРЗтНЬЗЬОНТРАЬАРМЕРОРЕСРНУУЗР

РСА-10-4/1-7 (253)Т---------------------------------------------------------------------

РСА-10-4/11-29(253)Т---------------------------------------------------------------------

РСА-10 (351)00еНМЕР31ТО1МЗКРО6Т0ККЬРУР0УРКУАУ0РМЬЫРРТСЕ¥ЗМУЗЗАШЗУАСЕРЬА1ЖЕ

РСА-10-4/1-7 (254)---------------------------------------------------------------

РСА-10-4/11-29(254)---------------------------------------------------------------

Рис. 13. Сравнение транслированных нуклеотидных последовательностей генов сгеА штаммов РСА-10, РСА-10-4/1-7 и РСА-10-4/11-29.

9. Анализ транскрипции генов ху1А и сгеА в мутантных штаммах

Для изучения транскрипции генов ху1А и сгеА штаммы Р. сапеясет РСА-10-4, РСА-10-4/1-7 и РСА-10-4/11-29 выращивали в присутствии индуктора на среде с глюкозой. При достижении концентрации глюкозы в среде 30-35 мМ мицелий собирали фильтрованием для выделения РНК, а полученную затем кДНК использовали для проведения ПЦР-РВ.

Транскрипция генов ху1А и сгеА анализировалась относительно конститутивной транскрипции тeшgpdA Р. сапеясепя (рис. 14).

S 10"

1348

223

1.4

РСА-10-4/1-7 Sample

xylA 1

PCA-10-4/11-29

Рис. 14. Анализ транскрипции генов ху1А и сгеА в штаммах РСА-10-4, РСА-10-4/1-7 и РСА-10-4/11-29 в присутствии индуктора и 30-35 мМ глюкозы.

Как видно из представленных данных, в мутантных штаммах РСА-10-4/1-7 и РСА-10-4/11-29 значительно увеличен уровень транскрипции гена ху1А. Также заметно увеличение транскрипции мутантных аллелей гена сгеА.

10. Получение мутантов по арабинозной индукции из мутантов по углеродной катаболитной репрессии Р. сапеясет

Как уже упоминалось, экспрессия генов ху1А и bgaS в штамме гриба Р. сапезсет требует присутствия индуктора Ь-арабинозы. Таким образом, актуальной являлась задача получения мутантных культур гриба, у которых активационный уровень транскрипции целевых генов достигается в отсутствии Ь-арабинозы.

Полученные нами штаммы по ССЯ и наличие в них плазмиды рХНРН, несущей ген кр!г под контролем промотора гена ху1А Р. сапезсет, дали нам возможность прямой селекцией на среде с гигромицином отобрать мутанты, не требующие индуктора для экспрессии генов ху1А и bgaS.

После повторного УФ - мутагенеза споры штамма РСА-10-4/1-7 были высеяны на агаризованную среду, содержащую глюкозу, гигромицин Б и Х^а1,

но не содержащую индуктора Ь- арабинозу.

20

Было получено около 2.5 х 104 клонов устойчивых к гигромицину при росте на глюкозе в отсутствии индуктора, среди которых отобрано 36 клонов, окрашивающих агаризованную среду с Х^а1 в синий цвет, которые впоследствии были пересеяны на агаризованную среду для повторного тестирования фенотипа. По результатам этого тестирования выявлены клоны, продуцирующие (3-галактозидазу на среде с глюкозой, с воспроизводимым фенотипом (Рис. 15). Мутантный штамм РСА-10-4/1-7/12 был использован для дальнейшего анализа.

— РС.А-10-4/1-7

— РСА-10-4/1-7/12

Рис. 15. Продукция |3-галактозидазы исходным

штаммом (РСА-10-4/1-7) и отобранным мутантом (РСА-10-4/1-7/12) на среде с глюкозой.

11. Анализ иромоторной специфичности выделенных мутантов на модели промоторов ху1А и

С целью изучения промоторной специфичности мутации по арабинозной индукции, отобранной на предыдущем этапе, мы выращивали мутантный штамм в жидкой среде содержащей Б-глюкозу в присутствии или отсутствии Ь-арабинозы, после чего определяли активность эндоксиланазы и [3-галактозидазы - продуктов экспрессии генов ху1А и bgaS, соответственно в культуральной жидкости. Результаты представлены в таблице 3.

Как видно из данных таблицы, в мутантном штамме РСА-10-4/1-7/12 продукция как эндоглюканазы, так и (3-галактозидазы, происходит даже в отсутствии индуктора - Ь-арабинозы. При этом в исходном штамме секреция этих ферментов полностью зависит от добавления индуктора. Из представленных

о „ Я « 0

А А — <*_

данных можно заключить, что мутация в штамме РСА-10-4/1-7/12 приводит к арабинозо-независимой индукции обоих генов: ху1А и ЪgaS.

Таблица 3.

Продукция Р-галактозидазы и эндоксиланазы штаммами гриба Р. сапевсет.

Штамм Присутствие Ь-арабинозы Активность ферментов в культуральной жидкости, ед./мл

р-галактозидаза эндоксиланаза

РСА-10-4/1-7/12 + 30 30

- 22 19

РСА-10-4/1-7 + 43 30

- 0 0

Спектр белков в культуральных жидкостях штаммов РСА-10-4/1-7 и РСА-Ю-4/1-7/12, выращенных в присутствии или отсутствии арабинозы показан на рис. 16.

6 М кДа __ - 130

ШЧШ0

т» 70 .. Ж 55

40

35 25

Рис. 16. ДДС-ПААГ-электрофорез культуральных жидкостей штаммов РСА-10-4/1-7/12 (дорожки 1,2), РСА-10-4/1-7 (дорожки 3,4) и РСА-10 (дорожки 5, 6) , выращенных в присутствии (дорожки 2, 4, 6) или отсутствии арабинозы (дорожки 1, 3, 5). Стрелками указаны полосы, соответствующие Р-галактозидазе (1^аБ) и эдоксиланазе (Ху1А). М-маркер молекулярного веса.

выводы

1. Клонирован и секвенирован ген сгеА Р. сапезсеп$, кодирующий центральный регулятор углеродной катаболитной репрессии генов репрессор СгеА.

2. Транскрипция гена сгеА авторегулирована и уменьшается в присутствии проверенных источников углерода, однако увеличение транскрипта в отсутствии источников углерода не приводит к репрессии транскрипции генов - мишеней.

3. Гибридный белок СгеА::ОРР имеет внутриядерную локализацию, независимо от источника углерода и от концентрации глюкозы в среде, и, таким образом, локализация СгеА в клетке не является ключевым механизмом в осуществлении ССЯ в Р. сапезсепБ.

4. В промоторах генов bgaS, ху1А и сгеА идентифицированы сайты связывания с белком СгеА.

5. Получены мутантные по углеродной катаболитной репрессии штаммы мицелиального гриба Р. сапезсет. Показано, что они содержат мутации в гене сгеА, приводящие к дерепрессии гена ху1А и, собственно, сгеА на уровне транскрипции.

6. На основе сгеА мутанта получены штаммы с арабинозо - независимой экспрессией генов и ху1А, перспективные для создания на их основе штаммов-продуцентов белков

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чулкин А. М., Вавилова Е. А., Беневоленский С. В. Транскрипционный регулятор углеродной катаболитной репрессии СгеА мицелиального гриба Penicillium canescens. Молекулярная биология. - 2010. - том 44 - стр. 1-11.

2. Чулкин А. М., Вавилова Е. А., Беневоленский С. В. Мутационный анализ углеродной катаболитной репрессии у мицелиального гриба Penicillium canescens. Молекулярная биология. -2011. - том 45 - стр. 1-8.

3. Абянова А.Р., Чулкин A.M., Вавилова Е.А., Федорова Т.В., Логинов Д.С., Королева О.В., Беневоленский С.В. Гетерологичная продукция лакказы Trametes hirsuta в грибах Penicillium canescens. Прикладная биохимия и микробиология. - 2010. - том 46 - стр. 342-347.

4. Королева О.В., Степанова Е.В., Федорова Т.В., Логинов Д.С., Черкашин Е.А., Беневоленский С.В., Вавилова Е.А., Чулкин A.M., Абянова А.Р., Бударина Ж.И., Юркова Т.В., Захарова М.В., Леонтьевский А.А., Солонин А.С., Пожидаева З.А. Рекомбинантная лакказа лигнинолитического гриба Trametes sp. и способ её получения. Патент РФ № 2394912 от 20.07.2010.

5. Чулкин A.M., Беневоленский С.В. Штамм гриба Penicillium canescens -продуцент секретируемой эндо-(1-4)-бета-ксиланазы с пониженной активностью эндоглюканаз. Материалы международного симпозиума "ЕС-Россия: преспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-й Рамочной Программе", 5-9 июня 2006 г., Санкт-Петербург, в кн.:"Биотехнология будущего", С. 100-102.

6. Chulkin А.М, Vavilova Е.А., Benevolensky S.V. Transcriptional regulator of carbon catabolite repression CreA in filamentous fungus Penicillium canescens. IMC9 THE BIOLOGY OF FUNGI, Edinburgh, UK, 1-6 august 2010.

Подписано в печать:

21.12.2011

Заказ № 6427 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чулкин, Андрей Михайлович

Введение.

Список сокращений, использованных в работе.

1. Обзор литературы.

1.1. Углеродная катаболитная репрессия в S. cerevisiae.

1.1.1. Miglp и Mig2p.

1.1.2. Киназный комплекс SNF1.

1.1.3. Каталитическая субъединица Snflp.

1.1.4. Бета - субъединицы.

1.1.5. Субъединица Snf4p.

1.1Л. Snflp-активирующие киназы Saklp; Elmlp, and Tos3p.

1.8. Белковая фосфатаза Regíp-Glc7p.

1.1.9. Hxk2p.

1.1.Ш Ssn6p(Gyc8p)-Tuplp.

1.1.11. Механизм углеродной катаболитной репрессии в S. cerevisiae

1;2. Углеродная катаболитная репрессия- в Ai nidülans.28?

1.2.1. CreA.

1.2.2. Ale — система.

1.2.3. СгеВ-и CreC.;.:.

1.2.4¿ CreD и HuIA.

1.2.5. AcrB.

1.3. Углеродная катаболитная репрессия в других мицелиальных грибах.;.

2. Материалы и методы.

2.1. Реактивы, плазмидные вектора, ферменты.

2.2. Бактериальные и грибные штаммы.;.

2.3. Среды.

2.4¿ Культивирование

2.5; Буферные растворы.

2.6. Общие методы.:.

2.7. Измерение активностей ферментов;.

2.81 Качественный анализ экспрессии белков эндо-1-4-бета-ксиланазы и бета-галактозидазы на чашках Петри.

2.9. Мутагенез спор гриба Р. сапеБсепБ.48<

2.10.1 Трансформация гриба .48;

2111».Злектрофоретическое разделение белков.

2.12. Выделение высокомолекулярной ДНК из грибного мицелия.

21131 Выделение ДНК из грибного мицелия;.50«

2.14. Выделение РНК из грибного мицелия.

2.15. Получение а-Р32-меченых.фрагментов ДНК.

2.16. Гибридизация.1.

2.17. Скрининг фаговой библиотеки генов и анализ ДНК рекомбинантныхфагов.

2.18. Приготовление образцов ДНК для ЕМЗА.53^

2:19ЬЕМ8^:.;.

2.20. Обратная транскрипция РНК и ПЦР-РВ.

2121'. Плазмидная,трансформация клеток :/?. соН.

21221 Экст1рессия^гентсгеА}Р:сапе8сеп8В1Клет¥^^Е:со1К.

2123; Жидкостная* хроматография белков.

2.241 Компьютерные программы для анализа нуклеотидных последовательностей ДНК.

2.25. Определение нуклеотиднойшоследовательности ДНК.57'

2.26. Клонирование гена сгеА Р. сапеБсет.

2.27. Клонирование гена ¡*р(1АР. сапеьсепъ.;.

2.281 Конструирование плазмид рЕТСгеА и рЕТ-ХпКСгеА.

2.29. Конструирование плазмиды рХНРН.60^

2130. Конструирование плазмиды р6РО::сгеА::ОЕР.612.311. Использованные в работе синтетические олигонуклеотиды;.

31 Результаты и их обсуждение.

3.1. Клонированиегена сгеА Р. сапеБсет.

3:2: Структура гена сгеА* Р. сапеБсепБ.

3.3. Клонирование гена ¿^¿¿^глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы

Р. сапеБсет.

3.4. Структура гена gpdA Р. сапеБсет.

3.5. Анализ транскрипции сгеА Р. сапеБсеш при росте на различных источниках углерода методом ПЦР-РВ.

3.6. Анализ локализации СгеА в клетках Р. сапеБсет.

3.7. Определение сайтов связывания СгеА Р. сапеБсет с промоторами генов сгеЛ,ху1А и^аБ.

З.7.Г. Экспрессия гена сгеА Р. сапе8сепБ в клетках Е.соИ.

3;7.2. Анализ взаимодействия промоторов генов ху1А\ bgaS и сгеА"Р. сапеБсет с белком-СгеА Р: сапеБсет методом ЕМвА.80'

3.8: Получение мутантов по^углеродной катаболитной репрессии Р. сапезсет.

3.9: Анализ-продукции эндо-Г-4-бета-ксиланазьгХу1А в>мутантных по* углеродной катаболитной репрессии, штаммах.

3.101 Анализ мутации в^штаммах.

3.11. Анализ транскрипции генов х^/Л/№сг£^4»в^мутантных штаммах.9Ь

31121 Получение мутантов по арабинозной активации в.мутантах поуглероднойзкатаболитной репрессии Р. сапеъсеш.

3.13. Анализ промоторной специфичности! выделенных мутантов на модели промоторовлу/Л'и^а^'.93'

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "CREA - зависимая углеродная катаболитная репрессия в Penicillium canescens"

Углеродная катаболитная репрессия — это механизм, который позволяет организмам осуществлять последовательную утилизацию источников углерода, начиная с более предпочтительных (быстро утилизируемых и более энергетически выгодных). Обычно это достигается блокированием синтеза ферментов, вовлеченных в метаболизм менее предпочтительных источников углерода.

Углеродная катаболитная репрессия - хорошо изученный пример регулирования транскрипции генов. Она также известна как «глюкозная репрессия», поскольку глюкоза — наиболее выгодный источник энергии и самый' репрессирующий источник углерода. Углеродная катаболитная репрессия осуществляется и в прокариотах, и в эукариотах. В' бактериях, прокариотах, углеродная катаболитная! репрессия помогает оптимизировать их рост на естественных средах, представляющих собой сложные смеси питательных веществ. В эукариотах углеродная катаболитная репрессия приводит к точному регулированию транскрипции, генов для оптимального метаболизма простых и сложных источников углерода. Показано; что в дрожжах Saccharomyces cerevisiae большое количество1 генов вовлечено в механизм репрессии [92]. Углеродная катаболитная репрессия была также изучена в различных мицелиальных грибах, включая Aspergillus nidulans, Trichoderma reesei и Sclerotinia sclerotiorum. Исследования углеродной катаболитной репрессии в S. cerevisiae и в мицелиальных грибах показали, что они имеют отличный от бактерий механизм глюкозной репрессии.

Штамм P. canescens F178 (ВКПМ) — природный почвенный изолят, который был выделен как продуцент (3- галактозидазы. Этот штамм характеризуется большой продукцией внеклеточного белка (до 5 г/л), высокой скоростью роста и низким количеством секретируемых протеиназ. Все эти свойства делают его перспективным биотехнологическим объектом.

Кроме того, исследования свойств этого организма, показали, что культуральная жидкость, полученная при его росте в жидкой среде со свекловичным жомом в качестве источника углерода, кроме ß-галактозидазной, обладает значительной a-L-арабинофуранозидазной и эндо-ксиланазной активностью, и что синтез всех трех ферментов индуцируется арабинозой и подвержена.углеродной катаболитной репрессии [7].

Также было показано, что в пути катаболизма арабинозы у P. canescens Fl78 имеется дефект на уровне фермента арабитол- дегидрогеназы, приводящий к нарушению катаболизма арабинозы и внутриклеточному накоплению L-арабитола [3]. По-видимому, именно внутриклеточное накопление L-арабитола-. вызывает повышенный- синтез ферментов, индуцируемых арабинозой, прежде всего ß-галактозидазы, ксиланазы и a-L-арабинофуранозидазы.

Гены bgaS и xylA, кодирующие секретируемую ß- галактозидазу (BgaS) и эндо-1,4-бета-ксиланазу (XylA), ранее были клонированы и секвенированы [8, 9]: Штаммы, полученные введением дополнительных копий этих генов, показывали увеличенную в 8-12 раз. продукцию ферментов* [6, 9], кодируемых этими генами.

Сильные промоторы генов bgaS и xylA также- использовались, для экспрессии^ генов фитазы phyA [10]; эндоглюканаз egl2 и egl3 [11, 12] Р. canescens, и гена лакказы lad Trametes hirsuta [2].

Актуальность темы исследования связана, с непрерывно возрастающими, потребностями в больших количествах ферментных препаратов, используемых в пищевой и целлюлозно-бумажной промышленности, в* производстве кормов и биотоплива, и продуцируемых мицелиальными грибами. Продуктами этих ферментов8 являются'моно- , ди-и олиго- сахариды, которые, при их избытке, вызывают репрессию транскрипции этих ферментов, используя механизм углеродной катаболитной репрессии. Таким образом, изучение регуляции углеродной катаболитной репрессии в мицелиальных грибах является ключевым моментом для использования их как промышленных продуцентов ферментов и других белковых молекул.

Исходя из этого, было решено изучить молекулярно- генетические механизмы углеродной катаболитной репрессии в мицелиальном грибе Р. сапеБсет. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

Клонировать ген сгеА Р.сапеясет, кодирующий репрессор транскрипции генов, подверженных углеродной катаболитной репрессии;

Изучить его регуляцию на уровне транскрипции и локализацию белкового продукта;

Определить сайты связывания репрессора СгеА с промоторами генов — мишеней;

Получить и охарактеризовать мутантные по углеродной катаболитной репрессии штаммы Р. сапеясет.

Список сокращений, использованных в работе

КФ - классификация ферментов по рекомендациям Международного

Биохимического Союза [1] ПЦР - полимеразно-цепная реакция ПЦР-РВ, ПЦР во времени п.н. - пара нуклеотидов т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов ПААГ - полиакриламидный гель SDS - додецилсульфат натрия

EMSA - Electrophoretic Mobility Shift Assay (метод анализа ДНК- белкового взаимодействия, основанный на смещении электрофоретической подвижности меченой ДНК, связавшейся с белком) ОНФГ- о-нитрофенил-р-О-галактопиранозид DTT- dithiothreitol (дитиотриэтол) ИПТГ- изопропил-p-D-1 -тиогалактопиранозид

1*. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Чулкин, Андрей Михайлович

Выводы

1. Клонирован и секвенирован ген сгеА Р. сапеБсет, кодирующий центральный регулятор углеродной катаболитной репрессии генов репрессор СгеА.

2. Транскрипция гена сгеА авторегулирована и уменьшается в присутствии проверенных источников углерода, однако увеличение транскрипта в отсутствии источников углерода не приводит к репрессии транскрипции генов - мишеней.

3. Гибридный белок CreA::GFP имеет внутриядерную локализацию, независимо от источника углерода и от концентрации глюкозы в среде, и, таким образом, локализация СгеА в клетке не является ключевым механизмом в осуществлении CCR в P. canescens.

4. В промоторах генов bgaS, xylA и creA идентифицированы сайты связывания с белком СгеА.

5. Получены мутантные по углеродной катаболитной репрессии штаммы мицелиального гриба Р. canescens. Показано, что они содержат мутации в гене ere А, приводящие к дерепрессии гена xylA и, собственно, creА на уровне транскрипции.

6. На основе cre А мутанта получены штаммы с арабинозо — независимой экспрессией генов bgaS и xylA, перспективные для создания на их основе штаммов-продуцентов белков

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чулкин, Андрей Михайлович, Москва

1. Номенклатура ферментов: Рекомендации Международного Биохимического Союза: М.: ВИНИТИ, 1979. - 312 с.

2. Абянова А.Р., Чулкин А.М., Вавилова Е.А., и др. Гетерологичная продукция лакказы Trametes hirsuta в грибах Pénicillium canescens // Прикладная биохимия и микробиология. 2010. - Т. 46. - № 3. - С. 342347.

3. Вавилова Е.А., Антонова C.B., Барсуков Е.Д., и др. Механизм суперпродукции секретируемых ферментов у мицелиального гриба Pénicillium canescens II Прикладная биохимия и микробиология. 2003. - Т. 39. - № 3. - С. 284-292.

4. Вавилова Е.А., Винецкий Ю.П. Индукция синтеза эндо-1,4-р ксиланазы и Р-галактозидазы в исходных и рекомбинантных штаммах гриба Pénicillium canescens // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. -Т. 39.-№2.-С. 133-159.

5. Маниатис Т., Фрич Э., Сембрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: М.: Мир, 1984. - 480 с.

6. Николаев И.В., Беккер О.Б., Серебряный В.А., и др. Суперпродукция секретируемой бета-галактозидазы мицелиальным грибом Pénicillium canescens: структура гена и конструкция мультикопийного продуцента //Биотехнология. 1999. - Т. - № 3. - С. 3-13.

7. Николаев И.В., Винецкий Ю.П. L-арабиноза индуцирует синтез секретируемой р-галактозидазы у мицелиального гриба Pénicillium canescens//Биохимия. 1998. - Т. 63. -№ 11. - С. 1523-1528.

8. Николаев И.В., Епишин С.М., Захарова Е.С., и др. Молекулярное клонирование гена секретируемой Р-галактозидазы мицелиального гриба Pénicillium canescens // Молекулярная биология. 1992. - Т. 26. -№ 4. - С. 869-875.

9. Серебряный; В.А., Вавилова Е.А., Чулкин A.M., и др. Клонирование гена эндо-1,4-Р-ксиланазы Pénicillium canescens и получение мультикопийных штаммов // Прикладная биохимия и микробиология. -2002. Т. 38.-№ 5.- С. 495-501.

10. Синицына O.A., Федорова Е.А., Семенова М.В., и др. Выделение и свойства внеклеточной'пектинлиазы Pénicillium canescens//Биохимия.- 2007. Т. 72. - № 5. - С. 699 - 706. .

11. Чулкин A.M., Логинов Д.С., Вавилова Е.А., и др. Энзимологические свойства эндо-(1-4)-Р-глюканазы Egl2p Pénicillium; canescens и характеристика структурного гена egl2 // Биохимия. 2009. - Т. 74; - № 6.-С. 805-813.

12. Чулкин A.M., Логинов: Д.С., Вавилова Е.А.,и др. Клонирование гена egl3 эндо-(1-4)-Р-глюканазы Pénicillium canescens и характеристика рекомбинантного фермента // Прикладная биохимия и: микробиология.- 2009. Т. 45. - № 2. - С. 163-170. ' ;

13. Adams J., ChenZ.P.,Van DenderenB.J., Morton C.J:, Parker M.W., Witters L.A., Stapleton D., Kèmp B.E. Intrasteric control of AMPK via the gamma 1 subunit AMP allosteric regulatory site // Protein Sci. 2004. - Voh. 13. - № 1.-P. 155-165.

14. Ahuatzi D.,. Herrero P., de la Cera T., Moreno F. The glucose-regulated nuclear localization of hexokinase 2 in Saccharomyces cerevisiae is Migldependent// J Biol Chem. 2004: - Vol: 279.-№ 14.-P. 14440-14446.

15. Ahuatzi D;, Riera A., Pelaez R., Flerrero P., Moreno F. Ыхк2 regulates the phosphorylation state of Migl and therefore its nucleocytoplasmic distribution // J Biol Chem. 2007. - Vol. 282. - №7. - P. 4485-4493.

16. Aleksenko A.Y., Makarova N.A., Nikolaev I.V., Clutterbuck A.J. Integrative and replicative transformation of Pénicillium canescens with a heterologous.nitrate-reductase gene // Curr.Genet. 1995. - Vol. 28:. - P. 474-477.

17. Alepuz P.M., Cunningham K.W., Estruch F. Glucose repression affects ion homeostasis in yeast through the regulation of the stress-activated ENA1 gene // Mol Microbiol. 1997. - Vol. 26. - № 1. - P. 91-98.

18. Amerik A.Y., Hochstrasser M. Mechanism and function of deubiquitinating enzymes // Biochim Biophys Acta. 2004. - Vol. 1695. - № 1-3. - P. 189207.

19. Andoh T., Hirata Y., Kikuchi A. PY motifs of Rodl are required for binding to Rsp5 and for drug resistance // FEBS Lett. 2002. - Vol. 525. - № 1-3. -P. 131-134.

20. Arst H.N., Jr., Cove D.J. Nitrogen metabolite repression in Aspergillus nidulans // Mol Gen Genet. 1973. - Vol. 126. - № 2. - P. 111-141.

21. Arst H.N., Jr., Tollervey D., Dowzer C.E., Kelly J.M. An. inversion* truncating the creA gene of Aspergillus nidulans results in carbon catabolite derepression // Mol Microbiol. 1990. - Vol. 4. - № 5. - P. 851-854.

22. Ashrafi K., Lin S.S., Manchester J.K., Gordon J.I. Sip2p and its partner snflp kinase affect aging in S. cerevisiae // Genes .Dev. 2000. - Vol. 14. -№ 15.-P. 1872-1885.

23. Bailey C., Arst H.N., Jr. Carbon catabolite repression in Aspergillos nidulans // Eur J Biochem. 1975. - Vol. 51. - № 2. - P. 573-577.

24. Basrai M.A., Velculescu V.E., Kinzler K.W., Hieter P. NORF5/HUG1 is a component of the MEC1-mediated checkpoint response to DNA damage and replication arrest in Saccharomyces cerevisiae // Mol Cell Biol. 1999. -Vol. 19. - № 10. - P. 7041-7049.

25. Bateman A. The structure of a domain common to archaebacteria and the homocystinuria disease protein // Trends Biochem Sci. 1997. - Vol. 22. -№ l.-P. 12-13.

26. Bjorklund S., Gustafsson C.M. The yeast Mediator complex and its regulation // Trends Biochem Sci. 2005. - Vol. 30. - № 5. - P. 240-244.

27. Boase N.A., Kelly J.M. A role for creD, a carbon catabolite repression gene from Aspergillus nidulans, in ubiquitination // Mol Microbiol. 2004. - Vol. 53. - № 3. - P. 929-940.

28. Bohley P., Seglen P.O. Proteases and proteolysis in the lysosome // Experientia. 1992. - Vol-. 48. - № 2. - P. 151-157.

29. Bonifacino J.S., Weissman A.M. Ubiquitin and the control of protein fate in the secretory and endocytic pathways // Annu Rev Cell Dev Biol. 1998. -Vol. 14. -P. 19-57.

30. Bouquin N., Barral Y., Courbeyrette R., Blondel M., Snyder M., Mann C. Regulation' of cytokinesis by the Elml protein kinase in Saccharomyces cerevisiae // J Cell Scii 2000. - Vol. 113 ( Pt 8). - P. 1435-1445.

31. Carlson M. Glucose repression in yeast // Curr Opin Microbiol. 1999. -Vol. 2. - № 2. - P. 202-207.

32. Carlson M., Osmond B.C., Botstein D. Mutants of yeast defective in sucrose utilization // Genetics. 1981. - Vol. 98. - № 1. - P. 25-40.

33. Celenza J.L., Carlson M. Cloning and genetic mapping of SNF1, a gene required for expression of glucose-repressible genes in Saccharomyces cerevisiae // Mol Cell Biol. 1984. - Vol. 4. - № 1. - P. 49-53.

34. Celenza1 J.L., Carlson M. Mutational analysis of the Saccharomyces cerevisiae SNF1 protein kinase and evidence for functional interaction with the SNF4 protein // Mol Cell Biol. 1989. - Vol. 9. - № 11. - P. 5034-5044.

35. Celenza J.L., Carlson M. Structure and expression of the SNF1 gene of Saccharomyces cerevisiae // Mol Cell Biol. 1984. - Vol. 4. - № 1. - P. 5460.

36. Celenza J.L., Carlson M. A yeast gene that is essential for release from glucose repression encodes a protein kinase // Science. 1986. - Vol. 233. -№4769.-P. 1175-1180.

37. Celenza J.L., Eng F J., Carlson M. Molecular analysis of the SNF4 gene of Saccharomyces cerevisiae: evidence for physical association of the SNF4 protein with the SNF1 protein kinase // Mol Cell Biol. 1989. - Vol. 9. - № 11.-P. 5045-5054.

38. Chalmers J.H. Chromogenic and fluorogenic substrates for assaying xylanases of Neurospora // Fungal Genetics Newsletter. 1990. - Vol. 37. -P. 25-31.

39. Chung C.H., Baek S.H. Deubiquitinating enzymes: their diversity and-emerging roles // Biochem Biophys Res Commun. 1999. - Vol. 266. - № 3. -P. 633-640.

40. Chung C.T., Niemela S.L., Miller R.H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution // Proc Natl Acad Sci USA.- 1989. Vol. 86. - № 7. - P.2172-2175.

41. Ciechanover A., Iwai K. The ubiquitin system: from basic mechanisms to the patient bed // IUBMB Life. 2004. - Vol. 56. - № 4. - P. 193-201.

42. Cubero B., Scazzocchio C. Two different, adjacent and divergent zinc finger binding sites are necessary for CREA-mediated carbon catabolite repression in the proline gene cluster of Aspergillus nidulans // EMBO J. 1994. - Vol. 13. -№2.-P. 407-415.

43. Cullen P.J., Sprague G.F., Jr. Glucose depletion causes haploid invasive growth in yeast // Proc Natl Acad Sci USA.- 2000. Vol. 97. - № 25. - P. 13619-13624.

44. Davie J.K., Edmondson D.G., Coco C.B., Dent S.Y. Tupl-Ssn6 interacts with multiple class I histone deacetylases in vivo // J Biol Chem. 2003. -Vol. 278. - № 50. - P. 50158-50162.

45. Davie J.K., Trumbly R.J., Dent S.Y. Histone-dependent association of Tupl-Ssn6 with repressed genes in vivo // Mol Cell Biol. 2002. - Vol. 22. - № 3. -P. 693-703.

46. De Vit M.J., Waddle J.A., Johnston M. Regulated nuclear translocation of the Migl glucose repressor // Mol Biol Cell. 1997. - Vol. 8. - № 8. - P. 1603-1618.

47. DeVit M.J., Johnston M. The nuclear exportin Msn5 is required for nuclear export of the Migl glucose repressor of Saccharomyces cerevisiae // Curr Biol. 1999. - Vol. 9.-№21.-P. 1231-1241.

48. Dowzer C.E., Kelly J.M. Analysis of the creA gene, a regulator of carbon catabolite repression in Aspergillus nidulans // Mol Cell Biol. 1991. - Vol. 11. -№11. -P. 5701-5709.

49. Dowzer C.E., Kelly J.M. Cloning of the creA gene from Aspergillus nidulans: a gene involved in carbon catabolite repression // Curr Genet. -1989. Vol. 15. - № 6. - P. 457-459.

50. Dubacq C., Chevalier A., Mann C. The protein kinase Snfl is required for tolerance to the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea // Mol Cell Biol. 2004. - Vol. 24. - № 6. - P. 2560-2572.

51. Dupre S., Urban-Grimal D., Haguenauer-Tsapis R. Ubiquitin and endocytic internalization in yeast and animal cells // Biochim Biophys Acta. 2004. -Vol. 1695.-№ 1-3.-P. 89-111.

52. Edmondson D.G., Smith M.M., Roth S.Y. Repression domain of the yeast global repressor Tupl interacts directly with histones H3 and H4 // Genes Dev. 1996. - Vol. 10. - № 10. - P. 1247-1259.

53. Elbing K., Rubenstein E.M., McCartney R.R., Schmidt M.C. Subunits of the Snfl kinase heterotrimer show interdependence for association and activity //J Biol Chem. 2006. - Vol. 281. - № 36. - P. 26170-26180.

54. Elledge S.J., Zhou Z., Allen J.B., Navas T.A. DNA damage and cell cycle regulation of ribonucleotide reductase // Bioessays. 1993. - Vol. 15. - № 5. -P. 333-339.

55. Estruch F., Treitel M.A., Yang X., Carlson M. N-terminal mutations modulate yeast SNF1 protein kinase function // Genetics. 1992. - Vol. 132. - № 3. - P. 639-650.

56. Felenbok B. The ethanol utilization regulon of Aspergillus» nidulans: the alcA-alcR system as a tool for the expression of recombinant proteins // J' Biotechnol.- 1991.-Vol. 17. -№ l.-P. 11-17.

57. Felenbok B., Flipphi M., Nikolaev I. Ethanol catabolism in Aspergillus nidulans: a model system for studying gene regulation // Prog Nucleic Acid Res Mol Biol; 2001. - Vol. 69. - P. 149-204.

58. Felenbok B., Sealy-Lewis H. M., in "Aspergillus: 50 Years On" / ed. by Martinelli S.D., Kinghorn J. R. // Progress in Industrial Microbiology -Amsterdam-London-New York-Tokyo: Elsevier. 1994. Vol. 29. - P. 141179.

59. Felenbok B., Sequeval D., Mathieu M., Sibley S., Gwynne D.I., Davies R.W. The ethanol regulon in Aspergillus nidulans: characterization and sequence of the positive regulatory gene alcR // Gene. 1988. - Vol. 73. - № 2.-P. 385-396.

60. Gancedo J.M. Yeast carbon catabolite repression // Microbiol Mol Biol Rev. 1998. - Vol. 62. - № 2. - P. 334-361.

61. Gavin I.M., Kladde M.P., Simpson R.T. Tuplp represses Mcmlp transcriptional activation and chromatin remodeling of an a-cell-specific gene//EMBO J. 2000. - Vol. 19.-№21.-P. 5875-5883.

62. Ghaemmaghami S., Huh W.K., Bower K., Howson R.W., Belle A., Dephoure N., O'Shea E.K., Weissman J.S. Global analysis of protein expression in yeast // Nature. 2003. - Vol. 425. - № 6959. - P. 737-741.

63. Goebl M., Yanagida M. The TPR snap helix: a novel protein repeat motif , from mitosis to transcription»// Trends Biochem Sci. 1991. - Vol; 16. - № 5.-P. 173-177.

64. Haber D.A., Buckler A.J:, Glaser T., Call K.M., Pelletier J., Sohn R.L., Douglass E.C., Housman D.E. An internal deletion within an l'lpl3 zinc finger gene contributes to the development of Wilms' tumor // Cell. 1990. -Vol. 61.-№7.-P. 1257-1269.

65. Hardie D.G. AMP-activated/SNFl protein kinases: conserved guardians of cellular energy- // Nat Rev Mol Cell Biol. 2007. - Vol. 8. - № 10. - P. 774785.

66. Hedbacker K., Carlson M. Regulation of the nucleocytoplasmic distribution of Snfl-Gal83 protein kinase // Eukaryot Cell. 2006. - Vol. 5. - № 12. - P. 1950-1956.

67. Hedbacker K., Carlson M. SNF1/AMPK pathways in yeast // Front Biosci. -2008. Vol. 13. - P. 2408-2420.

68. Hedbacker K., Hong S.P., Carlson M. Pakl protein kinase regulates activation and nuclear localization of Snfl-Gal83 protein kinase // Mol Cell Biol. 2004. - Vol. 24. - № 18. - P. 8255-8263.

69. Hedbacker K., Townley R., Carlson M. Cyclic AMP-dependent protein kinase regulates the subcellular localization of Snfl-Sipl protein kinase // Mol Cell Biol. 2004. - Vol. 24. - № 5. - P. 1836-1843.

70. Hong S.P., Carlson M. Regulation of snfl protein kinase in response to environmental stress // J Biol Chem. 2007. - Vol: 282. - № 23. - P. 1683816845.

71. Hong S.P., Leiper F.C., Woods A., Carling D., Carlson M. Activation of yeast Snfl and mammalian AMP-activated protein kinase by upstream kinases // Proc Natl Acad Sei USA. - 2003. - Vol. 100. - № 15. - P. 88398843.

72. Hong S.P., Momcilovic M., Carlson M. Function of mammalian LKB1 and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase alpha as Snfl-activating kinases in yeast // J Biol Chem. 2005. - Vol. 280. - № 23. - P. 2180421809.

73. Huang L., Zhang W., Roth S.Y. Amino termini'of histones H3 and H4 are required for al-alpha2 repression in yeast // Mol Cell Biol. 1997. - Vol. 17. -№ 11.-P. 6555-6562.

74. Huang M., Zhou Z., Elledge SJ. The DNA replication and damage checkpoint pathways induce transcription by inhibition of the Crtl repressor // Cell. 1998. - Vol. 94. - № 5. - P. 595-605.

75. Hubbard E.J., Yang X.L., Carlson M. Relationship of the cAMP-dependent protein kinase pathway to the SNF1 protein kinase and invertase expression in Saccharomyces cerevisiae // Genetics. 1992. - Vol. 130. - № 1. - P. 7180.

76. Hynes M.J., Kelly J.M. Pleiotropic mutants of Aspergillus nidulans altered in carbon metabolism // Mol Gen Genet. 1977. - Vol. 150. - № 2. - P. 193204.

77. Ilmen M., Thrane C., Penttila M. The glucose repressor gene crel of Trichoderma: isolation and expression of a full-length and a truncated mutant form //Mol Gen Genet. 1996. - Vol. 251. - № 4. - P. 451-460.

78. Jekosch K., Kuck U. Glucose dependent transcriptional expression of the crel gene in Acremonium chrysogenum strains showing different levels of cephalosporin C production // Curr Genet. 2000. - Vol. 37. - № 6. - P. 388395.

79. Jekosch K., Kuck U. Loss of glucose repression in an Acremonium chrysogenum beta-lactam producer strain and its restoration by multiple copies of the crel gene // Appl Microbiol Biotechnol. 2000. - Vol. 54. - № 4.-P. 556-563.

80. Jiang R., Carlson M. Glucose regulates protein interactions within the yeast SNF1 protein kinase complex // Genes Dev. 1996. - Vol. 10. - № 24. - P. 3105-311*5.

81. Jiang R., Carlson M. The Snfl protein kinase and its activatingsubunit, Snf4, interact with distinct domains of the Sipl/Sip2/Gal83 component in the kinase complex // Mol Cell Biol. 1997. - Vol. 17. - № 4. - P. 20992106.

82. Kamlangdee T. Identifying targets proteins of the CreB deubiquitinating enzyme in the fungus Aspergillus nidulans. Thesis (Ph.D.) // Adelaide: University of Adelaide. 2008.

83. Keleher C.A., Redd M.J., Schultz J., Carlson M., Johnson A.D. Ssn6-Tupl is a general repressor of transcription in yeast // Cell. 1992. - Vol. 68. - № 4. - P. 709-719.

84. Kelly J.M., The regulation of carbon metabolism in filamentous fungi / ed. by Brambl R, Marzulf G.A. // In Mycota 111 Berlin-Heidelberg: SpringerVerlag. 2004. - Vol. - P. 385-401.

85. Kelly J.M., Hynes M.J. Increased and decreased sensitivity to carbon catabolite repression of enzymes of acetate metabolism in mutants of Aspergillus nidulans // Mol Gen Genet. 1977. - Vol. 156. - № 1. - P. 87-92.

86. Vol. 144(Pt 1). -P. 13-24.

87. Kloetzel P.M. The proteasome and MHC class I antigen processing' // Biochim Biophys Acta. 2004. - Vol. 1695. - № 1-3. - P. 225-233.

88. Komachi K., Redd M.J., Johnson A.D. The WD repeats of Tup 1 interact with the homeo domain protein alpha 2 // Genes Dev. 1994. - Vol. 8. - № 23.-P. 2857-2867.

89. Li B., Reese J.C. Ssn6-Tupl regulates RNR3 by positioning nucleosomes and affecting the chromatin structure at the upstream repression sequence // J Biol Chem. 2001. - Vol. 276. - № 36. - P. 33788-33797.

90. Li D., Roberts R. WD-repeat proteins: structure characteristics, biological function, and their involvement in human diseases // Cell Mol Life Sci. -2001. Vol. 58. - № 14. - P. 2085-2097.

91. Lin S.S., Manchester J.K., Gordon J.I. Enhanced gluconeogenesis and increased energy storage as hallmarks of aging in Saccharomyces cerevisiae //J Biol Chem. 2001. - Vol. 276. - № 38. - P. 36000-36007.

92. Lockington R., Scazzocchio C., Sequeval D., Mathieu M., Felenbok B. Regulation of alcR, the positive regulatory gene of the ethanol utilization regulon of Aspergillus nidulans // Mol Microbiol. 1987. - Vol. 1. - № 3. -P. 275-281.

93. Lockington R.A., Kelly J:M. Carbon catabolite repression in Aspergillus nidulans involves deubiquitination // Mol Microbiol. 2001. - Vol. 40. - № 6.-P. 1311-1321.

94. Lockington R.A., Kelly J.M. The WD40-repeat protein CreC interacts with and stabilizes the deubiquitinating enzyme CreB in> vivo in Aspergillus nidulans // Mol Microbiol. 2002. - Vol. 43. - № 5. - P: 1173-1182.

95. Lockington R.A., Sealy-Lewis H.M., Scazzocchio C., Davies R.W. Cloning and characterization of the ethanol utilization regulon in Aspergillus nidulans // Gene. 1985. - Vol. 33. - № 2. - P. 137-149.

96. Ludin K., Jiang R., Carlson M. Glucose-regulated interaction of a regulatory subunit of protein phosphatase 1 with the Snfl protein kinase in Saccharomyces cerevisiae // Proc Natl Acad Sci USA.- 1998. Vol. 95. -№ 11.-P. 6245-6250.

97. Lundin M., Nehlin J.O., Ronne H. Importance of a flanking AT-rich region in target site recognition by the GC box-binding zinc finger protein MIG1 // Mol Cell Biol. 1994. - Vol. 14. - № 3. - P. 1979-1985.

98. Lutfiyya L.L., Iyer V.R., DeRisi J., DeVit M.J., Brown P.O., Johnston M. Characterization of three related glucose repressors and genes they regulate in Saccharomyces cerevisiae // Genetics. 1998. - Vol. 150. - № 4. - P. 1377-1391.«

99. Lutfiyya L.L., Johnston M. Two zinc-finger-containing repressors are responsible for glucose repression of SUC2 expression // Mol Cell Biol. -1996. Vol. 16. - № 9. - P. 4790-4797.

100. Mach R.L., Strauss J., Zeilinger S., Schindler M., Kubicek C.P. Carbon catabolite repression of xylanase I (xynl) gene expression in Trichoderma reesei // Mol Microbiol. 1996. - Vol. 21. - № 6. - P. 1273-1281.

101. Mathieu Ml, Felenbok B. The Aspergillus nidulans CREA protein mediates glucose repression of the ethanol regulon at various levels through competition with the ALCR-specific transactivator // EMBO J: 19941 -Vol. 13. -№ 17. - P. 4022-4027.

102. Mathieu M., Fillinger S., Felenbok B. In vivo studies of upstream-regulatory cis-acting elements of the alcR gene encoding the transactivator of the ethanol regulon in Aspergillus nidulans // Mol Microbiol. 20001 - Vol. 36. -№ h-p. 123-131.

103. McCartney R.R., Rubenstein E.M., Schmidt M.C. Snfl kinase complexes with different beta subunits display stress-dependent preferences for the three Snfl-activating kinases // Curr Genet. 2005. - Vol. 47. - № 6. - P. 335-344.

104. McCartney R.R., Schmidt M.C. Regulation of Snfl kinase. Activation requires phosphorylation of threonine 210 by an upstream kinase as well as adistinct step mediated by the Snf4 subunit I IJ Biol Chem. 2001. - Vol. 276. - № 39. - P. 36460-36466.

105. Moreno F., Ahuatzi D., Riera A., Palomino C.A., Herrero P. Glucose sensing through the Hxk2-dependent signalling pathway // Biochem Soc Trans. 2005. - Vol. 33. - № Pt 1. - P. 265-268.

106. Murray A.W. Recycling the cell cycle: cyclins revisited // Cell. 2004. -Vol. 116:-№2.-P. 221-234.

107. Nandi D., Tahiliani P., Kumar A., Chandu D. The ubiquitin-proteasome. system //JBiosci. 2006. - Vol. 3k - № 1. - P. 137-155.

108. Nardelli J., Gibson T.J., Vesque C., Charnay P. Base sequence^ discrimination by zinc-finger DNA-binding domains // Nature. 1991. - Vol. 349.-№6305.-P. 175-178.

109. Nath N., McCartney R.R., Schmidt M.C. Purification and-characterization of • Snfl kinase complexesv containing a defined- Beta subunit composition // J . Biol Chem. 2002. - Vol. 277. - № 52. - P. 50403-50408.

110. Nath N;, McCartney R.R., Schmidt M.C. Yeast Pakl kinase associates with and activates Snfl // Mol Cell Biol. 2003. - Vol. 23. - № 11. - P. 39093917.

111. Nehlin J.O., Carlberg M., Ronne H. Control of yeast GAL genes by MIG1 repressor: a transcriptional cascade in the glucose response // EMBO J. -1991. Vol. 10. - № 11. - P. 3373-3377.

112. Nehlin JO., Ronne H. Yeast MIG1 repressor is related to the mammalian, early growth response and Wilms' tumour finger proteins // EMBO J. 1990. - Vol. 9.- № 9. - P. 2891-2898.

113. Nelson? N. A photometric adaptation of somogyi method for—the determination of glucose // J. Biol. Chem. 1944. - Vol. 153. - P. 375-3 80.

114. Nikolaev I., Lenouvel F., Felenbok B. Unique DNA. binding specificity of the binuclear zinc AlcR activator of the ethanol utilization; pathway in;

115. Aspergillus nidulans // J Biol Chem. 1999. - Vol. 274. - №14. - P. 97959802.

116. Papamichos-Chronakis; Mi, Gligoris: T., Tzamarias D.-; The- Srifl, kinase controls glucose repression in yeast by modulating interactions between the Migl repressor and the Cyc8-Tupl co-repressor // EMBO Rep.;- 2004- -Vol. 5;-№4:-P. 368-372. ■

117. Pelaez R., Herrero P., Moreno F. Functional domains of yeast hexokinase 2 // Biochem J 2010; - Voli 432.- № 1. - P^ 181-190.

118. Sakai A., Shimizu Y., Flishinuma F. Isolation and: characterization:, of ; mutants which show an oversecretion phenotype in Saccharomyces.cerevisiae//Genetics. 1988. - VoE 119i - № 3. - P: 499-506.

119. Sanders M:Ji, Grondin P.0., Hegarty B.D., Snowden M.A., Carling D: Investigating the mechanism for AMP activation of the AMP-activated protein kinase cascade //Biochem J. 2007. - Vol. 403. - № 1. - P. 139-148.

120. Sanz P., Alms G.R., Hay stead- T.A., Carlson M. Regulatory interactions ' between;the!Regl-Glc7, protein:phosphatase and-the Snfl protein kinase // Mol Cell Biol. 2000; - Vol.,20. - № 4. - P: 1321-1328. ::

121. SchmidfeM-C., McCartney R.R. beta-subunits:of Snflikinase are required for kinasefunction^andsubstrate definitions// EMBO! J:. 2000L- Voli: 19: - № 18.-P. 4936-4943. ,

122. Scott J.W., Ross F.A.,. Liu J.K., Hardie D.G. Regulation of AMP-activated protein kinase by. a pseudosubstrate sequence on the gamma subunit //

123. EMBO J. 2007. - Vol. 26. - № 3. - P. 806-815.

124. Siebert P.D., Chenchik A., Kellogg D.E., Lukyanov K.A., Lukyanov S.A. An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA // Nucleic Acids Res. 1995. - Vol. 23. - № 6. - P. 1087-1088.

125. Smith R.L.Johnson; A.D. Turning genes off by Ssn6-Tupl: a conserved: system of transcriptional repression in eukaryotes // Trends Biochem Sei.2000.- Vol. 25.-№ 7.-P. 325-330:

126. Somogyi M: Notes on. sugar determination// J Biol Ghem:, 1952. - Vol. 195.-№ 1.-P. 19-23. .;■■.'

127. Sprague E;R.,.Redd M.J., Johnson A.D., Wolberger C. Structure of the G-terminal'domain of Tup 1', a corepressor of transcription in yeast //.EMBOJi -2000.-Vol. 19.-№12.-P. 3016-3027.

128. Strauss J., Mach R.L., Zeilinger S., Ilartler G., Stoffler G., Wolschek M., Kubicek. C.P. Crel, the carbon catabolite repressor protein from Trichoderma reesei//FEBS Lett. 1995. - Vol. 376. - № 1-2. - P. 103-107. : .

129. Sutton RB;, Vishnivetskiy S.A., Robert J., Hanson S.M., Raman D., Knox B;E., Kono M., Navarro J., Gurevich V.V. Crystal structure of cone arrestin at 2.3 A: evolution of receptor specificity // J Mol Biol. 2005 . - Vol. 354.: №5.-P. 1069-1080.

130. Todd R.B:, Lockington R.A., Kelly JM: The Aspergillus nidulans creC gene involved in carbon catabolite, repression encodes a WD40 repeat protein // Mol Gen Genet. 2000. - Vol. 263. - № 4. - P. 561-570.

131. Toth-Petroczy A., Oldfield C.J., Simon I., Takagi Y., Dunker A.K., Uversky V.N., Fuxreiter M. Malleable machines in transcription regulation: the mediator complex // PLoS Comput Biol. 2008. - Vol. 4. - № 12. - P. el000243.

132. Treitel M.A., Carlson M. Repression by SSN6-TUP1 is directed by MIG1, a repressor/activator protein // Proc Natl Acad Sei USA.- 1995. Vol. 92. -№8.-P. 3132-3136.

133. Trumbly RJ. Glucose repression in* the yeast Saccharomyces cerevisiae // Mol Microbiol. 1992. - Vol. 6. - № 1. - P. 15-21.

134. Tu J., Carlson- M. The GLC7 type 1 protein phosphatase is required for glucose repression in Saccharomyces cerevisiae // Mol Cell Biol. 1994. -Vol: 14. - № 10. - P. 6789-6796.

135. Tu J., Carlson M. REG1 binds to protein phosphatase type 1 and regulates glucose repression in Saccharomyces cerevisiae // EMBO J.»- 1995. Vol. 14.-№23.-P. 5939-5946.

136. Tzamarias D., Struhl K. Distinct TPR motifs of Cyc8 are involved- in recruiting the Cyc8-Tupl corepressor complex to differentially- regulated promoters // Genes Dev. 1995. - Vol. 9. - № 7. - P. 821-831.

137. Vallier L.G., Carlson* M-. Synergistic release from glucose repression by migl and ssn mutations in Saccharomyces cerevisiae // Genetics. 1994. -Vol. 137.-№ l.-P. 49-54.

138. Vautard-Mey G., Cotton P., Fevre M. Expression and compartmentation of the glucose repressor CRE1 from the phytopathogenic fungus Sclerotinia sclerotiorum // Eur J Biochem. 1999. - Vol. 266. - № 1. - P. 252-259.

139. Vautard-Mey G., Fevre M. Mutation of a putative AMPK phosphorylation site abolishes the repressor activity but not the nuclear targeting of thefungal glucose regulator CRE1 // Curr Genet. 2000. - Vol. 37. - № 5. - P. 328-332.

140. Vincent O., Carlson M. Gal83 mediates the interaction of the Snfl kinase complex with the transcription activator Sip4 // EMBO J. 1999. - Vol. 18. -№23.-P. 6672-6681.

141. Vincent O., Townley R., Kuchin S., Carlson M. Subcellular localization of the Snfl kinase is regulated by specific beta subunits and a novel glucose signaling mechanism // Genes Dev. 2001. - Vol. 15. - № 9. - P. 1104-1114.

142. Vyas V.K., Kuchin S., Berkey C.D., Carlson M. Snfl kinases with different beta-subunit isoforms play distinct roles in- regulating haploid invasive growth // Mol Cell Biol. 2003. - Vol. 23. - № 4. - P. 1341-1348.

143. Watson A.D., Edmondson D.G., Bone J.R., Mukai Y., Yu Y., Du W., Stillman D.J., Roth S.Y. Ssn6-Tupl interacts with class.,I histone deacetylases required for repression // Genes Dev. 2000. - Vol. 14. - № 21. - P. 2737-2744.

144. Woelk T., Sigismund S., Penengo L., Polo S. The ubiquitination code: a signalling problem // Cell Div. 2007. - Vol. 2. - P. 11.

145. Woods A., Munday M.R., Scott J., Yang X., Carlson M., Carling D. Yeast SNF1 is functionally related to mammalian AMP-activated protein kinase and regulates acetyl-CoA carboxylase in vivo // J Biol Chem. 1994. - Vol. 269.-№30.-P. 19509-19515.

146. Wu J., Suka N., Carlson M., Grunstein M. TUP1 utilizes histone H3/H2B-specific HDA1 deacetylase to repress gene activity in yeast // Mol Cell. -2001.-Vol. 7. -№ 1. P. 117-126.

147. Yang X., Hubbard E.J., Carlson M. A protein kinase substrate identified by the two-hybrid system // Science. 1992. - Vol. 257. - № 5070. - P. 680-682.

148. Yang X., Jiang R., Carlson M. A family of proteins containing a conserved domain that mediates interaction with the yeast SNF1 protein kinase complex // EMBO J. 1994. - Vol. 13. - № 24. - P. 5878-5886.

149. Zhang Z., Reese J.C. Redundant mechanisms are used by Ssn6-Tupl in repressing chromosomal gene transcription in Saccharomyces cerevisiae // J f Biol Chem. 2004. - Vol. 279. - № 38. - P. 39240-39250.

150. Zhou Z., Elledge S.J. Isolation of crt mutants constitutive for transcription of the DNA damage inducible gene RNR3 in Saccharomyces cerevisiae // Genetics. 1992. - Vol. 131. - № 4. - P. 851-866.

151. Zitomer R.S., Lowry C.V. Regulation of gene expression by oxygen in Saccharomyces cerevisiae // Microbiol Rev. 1992. - Vol. 56. - № 1. - P. 111.