Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Катаболитная регуляция экспрессии внеклеточной глюкоамилазы у дрожжей

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Катаболитная регуляция экспрессии внеклеточной глюкоамилазы у дрожжей"

¡23 иЗ

ПЛУЧНО-ИССЛЕДОВЛТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ Л\ИКРООРГЛНИЗМОИ

На правах рукописи

КУЧИН Сергей Владимирович

КЛТЛБОЛИТНЛЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ Г Л10 К О Л Л1И Л Л 3 Ы У ДРОЖЖЕЙ

0,4.00.03 — Молекулярная биология

/V ВТОРЕ Ф Е Р Л Т

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Л\оскна 1992

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте генетики н селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая, организация:

кандидат биологических наук С. В. Беневоленский.

доктор биологических наук, профессор Ю. П. Винецкий; кандидат биологических паук И. П. Арман.

Институт экспериментальной кардиологии КНЦ.

. . 1992 года в

специализированного совета Д 0558.12.01 при Научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-й Дорожный пр., д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке научно-исследовательского института генетики н селекции промышленных микроорганизмов.

Защита состоится «./■.» .//Г часов па заседании

Автореферат разослан « I. » . 92 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

В. И. Щербакова

ОБЩАЯ'ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТ!!

Актуальность Одним, из путей нов тетю

рентабельности процессов промышленного культивирования прожжеи-сэяароиицетов является использование дешевых к доступных ростов?« субстратов, в частности, источников углерода. К последним в полной мере относится природный полимер глюкозы -крахмал, который некоторые ттамми Sacchareipyces cerevisiae способны усваивать ото свойство обусловлено способность» экспрессирогать крахналгидролизущий фермент - внеклеточную гл:окоамилазу (ГА). Полная структурная ииюрнация для ее биосинтеза содержится в любом из трех идентичных кесцепленных генов - STA1, STA2, S7A3, встречающих с? в крахмалуоваиваюганх штампах дрожжей в любой числе (1-3) к любых сочетаниях (TarenKi, 1978). Иодчо ожидать, что экспрессия генов СТА должна Опть регулируемой. Основной общий механизм регуляции генов, ответственных за утилизацию углеводов у дрожжей (SVC, GAL, ML, МЕИ, - глюкоза?ч (катаГюлитнач)• репрессия, приводящая к снижению уровня транскрипции, гтих' генов в дес$»тки и cowm по срапнекпо с нерепрессирумцими условиями (Carlson and Botstein, i9&2; Federoif et ai,, i98.3; Johnston, 108": P.uobola et al, , 1980). Однако, согласно данным, опуОлккованнчм к моменту начала кашей работы (Pretonus et al., 1956), а также более поздним данным (Dranglnis, ',939!, rem OTA, до-висимчму, выделяются на общем фоне нетипично слабой чувстБИтель«остью иг -экспрессии к гдкюзе.

Таким образом, изучение осолекностей. катаболитной регулилии

экспрессия ГА прокстаБляетсч актуальным. >■«

iiSJlb установить генатпчеекиз механизин катэ/юлигной

регуляции экспрессии ГА, колируемой геном STA2 у лрог*ей r.acch. cerevisiae,

Задачи цяботк. Продемонстрировать рвгулируекссть экспрессии ГА источнгпзми углерода, в частности - гижо?ои: идентифициропоть гены, осуцестглящче контроль экспрессии ГА; Чщсптифнцкр-'пзть ы>з«'.'хнм<* мишени в промоторе гена STA.-, отг^чзк'1г;не за репрвссируемоеть последнего глюкозой.

ГД: л

CeriTJMi-rt

HäZIää? iliiMillä Ш практическая .значимость работы. Впервые убедительно продемонстрирована репрессируемость гена STA? глюкозой. Получена налболее полная на сегодняшний день коллекция мутант^Х с нарушением экспресс -ay гена STA 2 и, тем самым, доказано участие в регуляция экспрессии гена STA2 гротеинкиназы SKF1 (ключевого регулятора экспрессии глюкозорепрессируеных генов у дрожжей), транскрипционных активаторов SHFS н SNF5, а также продукта неизвестного ранее гена HAF2, Впервые показано, что ггаокозная репрессия гена STAC осуществляется посредством, как минимум, двух генетически различных механизмов - ШХг-зависимого ("классического") и' ИХК2-независимого. В промоторе гена STA2 идентифицированы, три неизвестных ранее гомологичных друг другу Фрагмента ( в- .элемента), опосредующих НХКй-зависимую глюкозную репрессий гена ' STAP. Идентифицированы также клеточные Факторы,- способные ( связываться с в-элементом усредненной структуры in vitro,

Установление особенностей катаболитной-регуляции экспрессии-", ГЛ позволяет сформировать рациональные подходы к созданию промышленных штаьмов крахналутилизирующих Дрожжей методами классической генетики. - .'.'••.

Апробация работы, Основные результаты.работы представлены на УШ двустороннем симпозиуме СССР-ФРГ "Организаций генома-и . регуляция активности генов" ¡(Hphj-rcií, 1969), на, XV международном специализированном симпозиуме'по дрожжам (Рига, 1591), на семинаре отдела биотехнологии (ВННИгенетика),

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ - V

В -работе использованы генетически маркированные штаммы Saccharomyces cerevisiae из коллекции.лаборатории.

Использован шт.?мм Е. coli СбОО (F", thi-1, -thr-l, 1еиВб, . siipE44. laeYi, íonA2i ¡, полученный в БКИ

Использованы плазмиды: Y£pt3-3 (Нейстат с сдавт. , 19Ö7), РОЕ? (Celenza-ana Carlson, 1904-j, рыи'зг (CeieíW et al,, 1969), РШЗ&-4, PJW34. (Abrams et al,"-, Í966W-? fEL?. Ю (fcstrucí. and. Cari son, 1990), pLG-67CZ (Guórcnte and Pt'asW, 195¡). plQ ¿312 (Guarente and l-Io.ar, I9fi4) и плазиида-рИП»?.

л

. Дрожжи кульгизироаапп на'агаризованкш и жидких средах -богатой (YP) и синтетической (SC) - содержащих различные источники углерода, как описано ранее (Rore еt al. , 1939)

Трансформацию ннтактныч дрожжевых клеток р'лазмнднсй ДНК проводили по методу ito et al. (1963), отбирал клони трансформантов на селективной среде ЗС с глюкозой.

¡Слетки S. со 11 трансформировали плазмидной ДИК как описано в сборнике иетодос Маниатяс с соавт. (1934).

Скрещивание и последую®!;'! генетический анализ дрожжей проводили в соответствии со стандартными методами 'Sherman el al., ísaí),

Мутагенез дроя^еььх культур осуществлялся как описано ранее (Кучин с соавт., 1920),

Количественное определение ГА активности описано в (Hunt so-/ et al. ,199!).

Качественное тестирование активности секрет,;руекой ¡полой фосфатазы (фенотипа Р1ю) проводилось в соответствии с методом 'KeyhacX et al. (1982).

Экспрессия р-гзлактозкдазы в дрожжах тестировалась как описано paree {.Rose et al., 1969). ;

Sta фенотшт тестировался следующим образом: клетки выращивали в течение 2-4 дней при ¿6°.C на чашках с агаризованной средой УР, содержащей 1, 5ü. крахмала и дополнительно либо о', п глюкозы (нерепрессируюдая концентрация), -.¡rjtCo Зл глицерина и Zt этанола. Затем чашки инкубировали при б течение ночи,' чтобы лроизошлг преципитация негидролизов.анкого крахмала, б результате чего ' вокруг Sta+ колоний наблюдали четкие прозрачные зоьы гидролиза крахмала; вокруг колоний таких зон г.е было.

Определение концентраций глюкозы проводилось либо с покошью стандартного нгбора реактивов (Stesas.), либо з соответствии с методом Hi 11 ст (1909).

Суммарную клеточную РНК дрожжей выцедят кзк описано ранее , Prut chard ancl ¡folla и,. 1965).

'■ ' Northern-анализ суммарной клеточной РНК ¡проводили кзк рекомендован'; a Blotting Protocols (Amersham).

ОЛ1.тонукле<чт"днне лослг-довательнссти ДНК синтезированы з НПО

"Вектор" (Новосибирск).

Тести на изменение электрофоретической подвижности молекул ДНК (mobility shift assays), вызываемое ик связыванием in vitro с белковыми Факторами ¡сеточного экстракта, проводили по негоду, описанному ране! (Goutte and Johnson, 193&), с изменениями, оговариваемыми в текте,

Все манипуляции с молекулами ДНК проводили в соответствии со ебсриикон методов Иаииатис с соавт. (19Ö4),

Для компьютерного анализа последовательностей ДНК использовали пакет программ "DHA SUÎI" (ВНШгенетика),

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Влияние источников углерода на экспрессию ГА

Поскольку ГА является звеном системы углеводного катаболизма, можно ожидать, -что основными внешними факторами, влияющими на экспрессию ГА, должны быть источники углерода (НУ). В чрстности, крахмал, являющийся субстратом ГА, мог бы быть индуктором экспрессии ГА, а глюкоза, являющаяся, -с одной стороны, продуктом гидролиза крахмала ГА, а с другой'стороны, вообще наиболее предпочтимым ИУ для клеток, иогла бы: вызывать репрессии, Поэтому была проведена -оценка влияния этих и некоторых других ЗУ на .экспрессию ГА.

1.1. Влияние-источников углерода на уровень йродукции ГА.

Клетки штампа YBS249 (STA2) выращивали на среде YP, содержащей различные ИУ до стационарной Фазы, после чего ' измеряли уровень накопления-ГА активности-(табл, 1), Полученные значения нормировали на соответствующий клеточный титр и »ыражали в процентах от величины, наблюдаемой при росте клеток на среде со смесью глюконеогеиетических ИУ - глицерина и этанола (контроль).

Поскольку, согласно предварительным опытам. ГА стабильна при ¿!00е(температура культивирования), как шнииу«, в течение недели, данная постановка эксперимента адекватна поставленной цели - получить нпнлнальнуи оценку степени влияния различных: UV

на' гкспрессию ГА и классифицировать ИУ 'по этому эффекту.

Из. полученных результатов следует, что наличие в ростовой среде крахмала не является необходимым условием для экспрессии ■ ГА; более того,, уровень ГА актианости, накоплению* при росте на, I крахмале, не превосходят соответстнующей величины в контроле (отсутствие индукция!,

В то же время, глюкоза и другие сахара (сахароза, галактоза и мальтоза) репрессировали экспрессию ГА, как йининум, в 5-д раз, В случае'глккооы мохно дополнительно утверждать, что ее . отрицательный йффект еще внраженней, т.к. , некоторая дерепрессия экспрессии ГА наблюдается начиняя лягзь с того момента в экспоненциальной Фазе роста, когда глюкоза п ср«"Д<? ..полностью истощается (данные не приведены).

Таблица I,

Влияние источников углерода на уровень накопления активности" ГА стационарными культурами и на накопление этанола ' экспоненциально растущими культурами.

Источник углерода Активность ГА/ титр клеток, У. от, контроля (стационарная фаза) концентрация этанола/ ■ титр клеток, икмоль/Ю7 кл. (экспон&нц. фаза)

Глюкоза (£/!) 13

Сахароза {2И) 21 36

Гзлактоза (2)!) 22 24

Мальтоза {а и) 15 66

Крахмал (2 X) 95 О

Глицерин (ЗЯ) +

+ гтанол (¿7.) 100-

Таким образом, перечисленные ИУ можно классифицировать по и:; эффекту на экспрессию ГА следующим образом: (1) гяоконеогонетические ИУ и крахмал (максимальный уровень экспрессии ГА); (и) глюкоза, сахароза, галактоза и мальтоза

Дмишмальинй'уровень'экспрессии ГА).

Следует"отметить, что репрессирующее действие сахарозы и мальтозы едва ли сопряжено с накоплением при росте, на &тих сйхарак глюкозы s концентрациях выше некоторой ророговой • величины: концентрация свободной глюкозы в среде в этих случаях йе превышает о, 02'/, что существенно ниже заведомо керепрг-сскрухщей концентрации - ö, i'/. (данные не приведены).

Перечисленные сахара, включая глюкозу, различаясь по своей структуре и первичным этапам их утилизации клеткой, , обладают нажним оШщ свойством, отличающим их от- такого углевода как крахмал, сбраживаемость» в условиях аэроСиоза, о чем можно судить по накоплению культурами этанола в экспоненциальной Фазе роста на эти» сахарах в условиях: азрации (таСл, х).

Ввиду вышесказанного, глюкоза как фактор катаболадиой регуляции экспрессии ГА.может рассматриваться двояко: (1) глюкоза как таковая (специфически распознаваемая клетками); (11) глюкоза как частный случай в ряду сбраживаемых Сахаров,, Это, в свою очередь, может отражать реализацию того или иного механизма глкжозной репрессии (или даже совокупности механизмов).

1.2, Влияние источников углерода транскрипцию гена STA2. ■ ■

Клетки штампа YBSE49 выращивали:на среде YP, содержащей ' различные йУ, до раннеэкспонеадиа^^ной фазы (титр 1,6-2 хЮ7 кл/мд),' Затек проводили Korthern-анализ вкдеиевиой 'из клеток „•' суммарной РНК-на присутствие' ыРНК Гена STA2, гибридизуя ев щ фильтрах с меченный радиоактивно Sall-Фттагментом ДНК■гера'STAH «з плазмкды УЕр 13.-3. :

Из сравнения полученных результатов (рис.1) с результатами, приведенными в табл. I, /следует, • что'репрессирующее, действие.. " глюкозы и сахароз« нг, эксдрессио ГА осуществляется на урокле транскрипций, в то.вфеня как репрессия галактозой и мальтозой • . ■обусловлена блоком/на некотором посттракскрипционном уровне. Иаконеи . отсутстгие 'йндупирущегс ''действия крахмала на продукцию ГА коррелирует с отсутствием такого 'действии на •транскрипцию гена s?A£. " ' •

•; 'Как показало денситометрическое сканирование авторадпогранм, уровень накопления STA?. м?НЗС при рост* клеток, ка мавзг' и

.i 2 3 4 5 "б

Панель А

lllp ^w

SiA2 mWK

i 2: 3

Панель Б

&

,7/12 иШ

Кис,1, Korthern-анализ STA2 мРНК из клеток штамма YBSS49 дикого , ипа, окрашенных в среде YP с разными ИУ. Все дорожки содержат равные количества (Ю нкг) суммарной клеточной РНК, Внутренний контроль (полосы IBS и 25S рРКК) здесь и далее не приведен.

Панель А, Кинетика церелрессии транскрипций гена STA?.

Клетки, вирацеинне в среде с ?'/, глюкозы (дорожка 3), перенесены к*

в среду с О, О5Z глюкозы и культивированы дополнительно в течение 0,5 ч (яг-рожка 4), 1ч (дорожка 5) и 3 ч (дорожка б). Контрольные культуры выращены в среде с 2'/. крахмала (дорожка .1) и со смесью Т/. глицерина и SX этанола.

Панель В. Клетки выращены в среде с д.1 сахарозы (дорожка 1), 2'«: галдктозн (дорожка 2), V. мальтозп (дородна 3), Ш крахмала (дорожка 4).

сахароэс не превышает 2-4Z от величины, наблюдаемой' при росте 'на смеси глицерина и этанола. ,

ГЛАВА 2. Генетический контроль экспрессии РАуидентификация генов, яе обходимых для дерепр-е с сии

Говоря о механизме того или иного феномена регуляции, имеют ввиду прежде всего конкретное гоны, продукты, которых существенны для реализации ?того Феномена. Стандартным подходом к идентификации таких генов является получение и анализ мутантов г. аномалиями в экспрессии изучаемого признака.

Этот подход Mil использовал» для идентификации генов, необходимых дйя дерепрессии ГА, подучив и охарактеризовав : мутактаые культуры с конститутивной потерей способности экспрессяройать ГА {мутанта по. дерепрессии).

2.1. Получение мутантов с фенотипом Sta",

Клетки штамма YB32M подвергли Уф облучеки» в дозе, приводящей к 907.-му уровню летальности. Среди £0 ООО колоний, ';;■. выживших после облучения, Сило отобрало 10 независимых ¡¡

нутантннх культур с Фенотипом Sta*.' - • "

£, г. Генетический и компле*шнтац':;ошшй анализ мутантов.

Для докагательства моногенности индуцированных мутацйй '.Рыли .проведены возвратные скрещиваний нутантных культур,, а также . ютамма YBS249 (контроль)'. Последующий тетрадный анализ -порученных гибридов (на материале 12-16 тетрад)чвыявил, что .фенотип Sta" у восьми из 50 мутантов обусловлен нарушениями в одинйчнкк ядерный гевак (ESta*/.asta*). Только, эти моногенные мутанты рассматривались а дальнейшем. Поскольку :соответствувВД1е диплоиды имели фенотип Sta'',' все восемь мутаций были признаки рецессивными, На'»той'этапе отобргкы нутанпше .сегрегаи'ш.обоик типов спаривания, несущие различные ау!С¥Отро).нпе маркеры, для 'ислош>ао.еаиие:в компйементациокнык тестах. : , ''.''■, ■ .

- / Результата тестов на Фуикдкональкзпо-.комплекентаито (даншг-не приведен«! позволяй заключить, что муташ»! образуют дят»

.. 9

групп комплементации.

Одна группа образована нутациями в гене STA 2 (sta2-l, sta2-3, sta2-5); эти мутации не представляли дальнейшего интереса. А

Четыре других группы были обозначены hafl (hafl-1, hafl-2), haf2 (hafa-l). haf3 (haf3-i) и haf4 (haf4-l).'

Нутации haft.-haf4 не сцеплены ни между собой, ни с анализировавшимися а-уксотрофншш-маркерами {îeu2, lys7 ипгаЗ), ни с локусом типа спаривания HAT.

2.3. Анализ плейотропного действия мутаций hafl-häf4,

В процессе генетического анализа выявилась неспособность к споруляции диплоидов, гомозиготных по люоой мутации liai.

Кроме того, поскольку экспрессия ГА подвержена глюкозной репрессии, мы проверили, не вызывают ли идентифицированные мутации дефектов по другим глюкоз©репрессируемым функциям. В качестве таковых мы рассмотрели способность клеток расти на " альтернативных по отношению к глюкозе ИУ - мальтозе, сахарозе, галактозе, этаноле и глицерине. Результаты, приведенные в табл,,

свидетельствуют об ухудшенном, по сравнению с диким типом, росте мутантов, на этих ИУ. Мутанты генотипа fcaf3 выделяются ' особенно плохим росток.

Следует отметить, что упомянутая вше способность к .споруляции, отсутствующая у мутантннх дирлоидов, также является глюкозорепрессируемой Функцией (Miller, 1989).

Была также'исследована способность мутантов гкспрессировать секретируемую кислую фосфатазу .( фенотип.. Pho). Исходной посыл'кой для этих тестов была идея проверить, не вызывают ли haf-мутации общих дефектов ло^еекреции. Несмотря на то, что мутации hail, haf2 и b.af.4 (но не haf3) действительно приводят к фенотипу Pho", остальной спектр вызываемых ими плейотропннх дефектов не говорит в пользу возможного непосредственного участия продуктов генов HAFI, HAF2 и HAF4 в-процессах белкового экспорта.

Таким образом, результата проведенного анализа позволяют сформулировать два основных вывода:

1) общей чертой нутаций hafl-haf4 является распространненость их плейотропного действия на целый ряд -

глйкозореирессируеиых функций;

2) несмотря на ряд общих черт, нутации ЗзаП-Ьа!:'! образуют две Фекотшшчески/отличных группы; (1) вызывающая

нанПолее тяжелые ростовые дефекты, и (Ш , и йаМ,

нарушающие, как минимум, одну клеточную"функцию (фенотип РЬо), не регулируемую глюкозой.

Таблица 2.

Плейотропност* действия нутаций Ьа-Н-ЬаМ.

Рост на чашках1** с ИУ 12I каждый) РЬо-Генотип* _ _ _ фено-

Глю- Крах- Гли- Эта- Саха- Гаяа-. Надъ- tmi

коза мал церин нол роза кто за тоза

Дикий тип > + + + + , + + + + +

haii-l +» -Л -/+ -Л -Л . ' - -

bafl-г ■ -Л +/- -/+

haf2~l ++ */- -/+ -Л * -Л -

haf3-l + - - -/* +/- • - +

haf4-l + + -Л -Л., -Л . ч- -Л -

Обозначения: ++, средний размер колонии >£ км; +,1-2 мм; */•, 0,5-1 мм; <0,5 мм; нет роста, • - ' '.'.

"Данные для нескольких щтаммов соответствующего геяотипа; . *"чашки инкуСировалясь при 28°C в теЧчкие.5 дней.

• 2.1. Влияние мутаций'hafl-haf4 на транскрипцию гена' STAH..

Следует отметить,- что уровни экспрессии ГА мутантами 'генотипов haft-haf^ количественно 'не детектируются, Далее, . поскольку спекгры/плейотропности нутаций распространяются на значительное число глюкозорепрессйруемкх Функций, можно было

• предположить, что эти мутации должны вызывать дефекты на уровне \ транскрипции, .т, е, на уровне, регулируемом глюкоаной

. репрессией о первую очередь,

PeayniTairi ЯсгШегп-анализа (pkc.S) подтверждают это преисояохеиие. В отличие от клеток дикого типа, мутант» не

Ii

л. т. Wu ha{2-i ha/з- f haf4-1

FL D R D R D 1Г~ТГ R D

ST/32 «P//K

Рис-НоНйегп-анализ ?ТА2 нРНК из клеток штамма дикого типа ч hаf-мутантов, выраиенннх в условиях глюкоэной репрессии (К) и аерепрессии (0). Дерепрессия обеспечивалась кул?>тиБированием репрессированных клеток в среде ТР с О, 05И глюкозы в течение 3 ч. Все дорожки содержат по 10 мкг суммарной клеточной РНК.

Гис. 3. Northern-анализ STA2 mPHK1 из клеток штамма YB3702

сЪ этанола (дорожка П. £'< глюкозы (дорожка 2), Ы сахарозы (дорожка 3), ¿У. галактозы (дорожка Ч), г'/, мальтозы (дорожка 5), £?:'. крахмала (доро*кэ 6). Каждая дорожка содержит 10 мкг суммарной клеточной РНК.

4 2 3 4-5 5

(hxK2), выращенных и среде TP с различными ЙУ: 37. глицерина и

'' . ■ ■ ' 12 способны накапливать транскрипт STA2 в дерепрессирутацих -условиях. Следовательно, продукты генов HAF1-HAF4 необходимы для дерепрессии транскрипции гена STA?.

2,4. Анализ комплементации мутаций îiafi-haf4 клонированными генами серии SNF, Полученные мутанты отличаются ухудшенным ростом на сахарозе, что предполагает их родственность мутантам серии snf (sucrose-non-fermenting) , специально отобранным по их сниженной способности расти на сахарозе (Helgeborn and Carlson, 1984), , пять из -которых - snfl, snfZ,- snf4, sni5 и snf6 - вызывают ; дефекты в транскрипции гена SUC2, кодирующего секретируемую ичвертазу. эти мутации обладают спектрами ллейотропности, сходными со спектрами дефектов, вызываемых нутациями серии haf. Примечательным совпадением является то, что фенотип Pho" . мутантов с генотипами hafi, îiaf2 и haf4 был ранее неожиданно- • обнаружен у мутантов snf2, snf5 и snffi (Abrams et al., 1966). Таким образом, представляло интерес установить возможный . аллелизм между мутациями серий haf и snf. Для этого тестировалась способность мутаций haf кокгтементироваться генами ENF1, SNF2, SNF4, SKF5 и SNF6 в составе плаэмид рСЕ9, PLH132, pLH13e-4,, PJV34 и pEL3. i&, соответственно,

Штаммы Y3S665 (hafi-1), УВЗбЫ (iiäfl-2), YBS692 {haf2-l), . YBS696 (îiaf3-i ) и YBS70S'(haf4-1)' были трансформированы; указанными плазиидами. Затем у трансформантов* был. тестирован фенотип Sta. Если он оказывался положительным, то трансформанты , тестировались на восстановление остальных дефектов,' вызываемых соответствующей мутацией. Таким образом,. комплементация, когда, . она наблюдалась, была полной. Полученные результаты суммированы в табл.3. ?ти результаты позволяют заключить, что гены HAF1, • ; HAF3 и HAF4, по-видимому, являются теми/же генами, что и SNF2, • SNF1 и SNF5, соответственно. В то же время, ген HAF2, будучи подобным генам SNF2 и SNF5, не является ни одним/из известных ■генов серии sçf. '. ..' "

' , , '13

Таблица 3.

Комплементация мутаций клонированными генами ЭЛ?.

Реверсия к-дикому типу у трансформантов,. . несущих плазмиду** ГенОтил , ._:_:__:_____

реципиента* рСЕ9 (ЗНП) рШ1 35-ч ($№2) - рЛ'34(5МР5)

+

-

*Мутация hafg-l не комллемеягируется ни одним геном SNF;

**плазмиды pLNS52(SNF4) и pEL3. IQ(SKF6) не конплементировали , ни одну мутацию серии haf.

Отождествление гена HAF3 с геном 3NF1 представляется особенно важным, т- к. установлено, что протеинкиназа SNF3 {Celenza and Carlson, 1966) играет одну из ключевых ролей в углеродной^катаболитной регуляции экспрессии генов у дрожжей (Entian, 1986; Gancedo, arid Gancedo,' 1986), Таким образом,-подверженность refta SIAS катаболктной регуляции можно считать

не только Феноменологически, -не и генетически доказанным

* •

Фактом. ... .' ..'■'■ '

ГЛАВА 3.. Генетический контроль экспрессии ГА; влияние мутаций - ЙХК2 на репрессируемое?* .гена'STA2 глюкозой ' :

Регуляция экспрессии генов в 'ответ на изменение содержаний ' глюкозы в окружающей среде .обеспечивается не 'только генами положительного контроля, но у, генами, 'продукты .которых . осуществляют негативна контроль.'. Если положительный контроль гена STA2 осуществляется системой, общей длй- большинства гзюко'зрреярессируеннх генов, то это не исключает йозмоинш: особенностей гена STA 2- -в гшэие' его не га^изной' регуляций. Известен пейий\ряд пнс>Ъ4, ■ нутации.-а который приводят к

hafl-1 hafl-2 haf3-1 haf4-i

плейотроиной потере катаболктной репрессии, например: REGI, GRR1 . (Balîey and Woodword, 1984; Hatsumoto et al. , 1933; Helgefcorn and Carlson, 1967), HXK2 (Entiaii, 19Ô0; Ha and Botstein, 1936; Zliamermann and Scheel, 1977), sstis (Carlson gt al., 1964),

HXK2 является единственным геном среди перечисленных, продукт которого - гексокиназа PII - непосредственно участвует в гликолизе. Более того, гексокиназа PII катализует самую первую реакцию пути катаСолизма глхж.ооы - ее фосфорштарованис* (см. , '.например, Gancedo and Gancedo, 19S9). За этот же -этап гликолиз?, ответственны еще два фермента - гексокиназа PI и глюкокиваза, но они, по-видимому, не играют роли в катаболитной репрессии (см., например, Valsh et al.., 1991). ' Поэтому, считается, что продукт гена KXK¿ выполняет функцию специфического распознавания глюкозы как Фактора катаболигной'.репрессии, Как отмечалось вник?, глюкоза как Фактор репрессии гена STA2 может является, лиеь частным случаен в ряду сбраяикаемых Сахаров, и, следовательно, ее специфическое'.распознавание клеткой мож&т быть не' обязательным для осуществления блока экспрессии ГА, Поэтому, были исследовано влияние-мутации hxk2 на-характер регуляции гена STA2 глюкозой и другими источниками углерода,

?.. 1. Конструирование штаммов генотипа STA2 ДхК2.

Штамм WAY.10-2В, з кромссоие которого геи НХК2 замещен геном LEU2 (h:fK2: : LEUS)-,' а ген LEU2 в своем естественном положении несет неревертирумг/ю мутацию 1еи?.-3, И2, Сил предоставлен проф. Karl-Dieter Sntian (Университет Гете, ФРГ1 и имел фенотип sta".

Для получения штампов генотипа STA2 -hxK2, которне были Оы относительно.близкородственны нашим дрожжевым линиям, были проведены два последовательных скрещивания:-перйый раз"WAY. 10-2В был скрещен со иганмом.7BS7!О (STA2 НХК2 1еи2) с последующим отбором среди меиотнческого потомства этого гибрида сегреглитов Фенотипа sta+ Leu+; второй раз - один из таких сегрегантсв, YBS7.11 (СТА2 1 ек2 hxK2 : :LF-U2 ),- бил скрещен со штаммом YBS55» (sta0 НХКс ¡eu2), вновь с отбором в мейотичс-ском потомстве сегрегантов фенотипа sta+ Leu4. Два таких сегреганта, Y5S7CJ и YPS702, использовались Б дальнейшей работе.

'3.2. Влияние мутации hxKH на регуляцию гена'STA2'источниками углерода-..

Клетки штамма YBS702 выращи&али на среде YP с различными ИУ до ранне экспоненциальной фазы (i-2 х 107 кл,/мл), Затем проводили Horthern-анализ суммарной РНК, выделенной из зтих клеток, на присутствие мРНК гена STA2,

Полученная'раяиоавтограмма .приведен«., на рис.3. Видно, что экспрессия гена STA2, как и в диком типе, репрессируется глюкозой. Этот принципиально.важный результат подтвержден также для штамма YBS701 (данные не приведены). _

Любопытно; что транскрипция гена STA2 в мутанте генотипа hxk2.репрессируется галактозой, чего не наблюдалось дли клеток дикого типа (ср. рис, 1 и рис.3). Пока'не дано' вменения этому ' явлению, тем более странному, что гексокиназе Р1Г в, рамках/ традиционной биохимии не приписывается никакой роли в метаболизме'галактозп.

Таким образом,"особенностью генетической детерминации глюкозной репрессии гена S7A2' является (суммарная) независимость этой регуляции от функции гена НХК2. ,Это обстоятельство оказалось совместимым с представлением, что глскоза как Фактор репрессии генэ STAS,может восприниматься лишь как частный случай в ряду прочих Сахаров, различных по своей структуре и механизмам их первичной утилизации, но объединяемых их способностью, слаживаться клеткой в условиях • '. ■• аэробиоза, Тем не менее, ■ рассматривая механизм катабояитной репрессии гена STA?. в целой, нельзя исключить возможного участия в нем скрытой' НХК2--зависимоЛ компонента

ГЛАВА 4. Идентификация возможных мииеней в 'просторе гена S'íÁ2, .опосредуюдах'репрессируеность гена 5ТА2 глюкозой

Установлено,' что промотор GAL'l,'iO у нрожжей (ЬтвечзкииЛ зг. .экспрессию дру'х дивергеитно транскрибируемых геяоч - GAL1 и GALIO, продукты которых необходимы дия утилизации галактогн)

содержит участок ррзиерс.м 67 иуклеотид.чу.х пар, киекуянык УР>г>дг,. который, бус учи интегрярг в аи в состав' кс-нотнтутизиого .промотора (НЗЗЗ), способен •, чс-.-регг.о¡з-гг1.. К'ХГг. >

' ■ 16 глюкоьную репрессии этого" промотора {Fil^cK añd Johnston, 1990),

Представляло интерес выяснить,' не вызвано ли сходство в характере реакции UHSQAL и промотора гена SIA2 на мутацию hxKS наличием участков" гомологии- в первичных структурах URSqá'l и промотора. .STA2 :{Lam¡brec.»its et al. , 1991), . "

4.1. Компьютерный поиск топологий в первичных

последовательностях URSq¿l и промотора гена- STA2. . Компьютерный анализ показал, 'что содержащийся е URSqaj,.двойной повтор ( -164 5'-ТСАААТТААС-3' -175; r¿S7 5'-TCAAATGAAC-3' -188, . "где координаты отсчитаны от первого транслируемого АТЗ-кодона) трижды встречается в промоторе STA2: 1). -275 5'-GTTCAAATTAAA-3' -25'Ц ■ - 2) -1142 5' -GTTCAAATTAAG-i' -113.1; -3) -1252 5'-QCTCAAATTAAA-3' -1241." '.Соответствующая усредненная последовательность;

^ 5-GTTCAAATTAAA-3' ... '..;■'

(участок гомологии.с повтором из URSq^l подчеркнут) обладает несовершенной палиндромной- симметрией относительно центрального А, в. которой участвуют все нуклеотиды за исключением первого G: •." • 5' -TTPyAÁ(А)ТГРиАА-3'.

Зта усредненная последовательность далее именуется 0-элементом, '.

4. 2. Конструирование плазмид для проверки функциональности ©-элемента in vivo.' .'..•,..<, Для. проверки функциональности в,-элемента in vivo в качестве базовых использованы две тест-пл'аЗмиды:-.рЬЪЫОЯ и pLG¿312! 3 обеих плазмидах в. качестве.репортера использован ген lacZ-из Е. ccll, экспрессию которого в дрожжах легко тестировать по изменению цвета дрожжевых колоний с^белого,на синий при росте на.чашках, содержавших индикатор X-gal. ' Ген lacZ в."указанных, шлазмидах находится под транскрипционным контролем делеционных вариантов промотора гена CYC1 дрожжей. -

, В плазмиде pLG670Z (рис. 4) этот промотор модифицирован таким образом, что в не^к отсутствуют иАЗ-последователгнести,- На месте отсутствующих UAS расположен уникальный сайт узнавания _

Синтетический дуплекс:

3а11-

Xbal Sali

5' -W

J t

'CGACGGATCTGYGTTCAAATTAAATATCTAßAG"3' '

3' -GCC ? AG АС А С A AGTT'f A. .TTTATftGA'TCTCÄGCTr б' 1 « ! * 1 в-элемент . '

pWi А312:

PLG670Z;

нет

mj.

BamHI,

„---ТхБоТР-—■—frÄTÄl-—(СУС1:;! äcZ/"

*«• ,

— Xbal

Рис.л. Структура синтетического дуплекс?., содержащего б-элемент, к стратегия, его клонирования в состав плааиик pI.G67.0Z и рьо Л312, ■ суявственныб. участки йогорн* изображены » . • '• •схематически. V- ■ . ; . • _ . : • •

■рестриктазы Хлс1, предназначенный для ^интегрирования {-рагментос ДНК, тестируемых на функцию UAS.

И плазмиде pLS¿3í2 (рчс.4) использован вариант промотора СУС1 с делецмей, приводящей к практически,конститутивному функционированию этого промотора. Уникальный сайт узнавания рестриктазы Xhol, расположенный между областью UAS и TATA-боксом, предназначен для интегрирования Фрагментов ДНК, тестируемых на способность опосредовать репрессию транскрипции.

В настоящей работе, использовался синтетический. дэухцепочечный Фрагмент ДНК, первичная структура которого приведена на рис.4, йз том :*е рисунке, приведена стратегия клонирования этого Фрагмента ДНК в состав указанных плазмид. фрагмент ДНК содержит 6-элемент, фланкированный "липкими" . сайтами узнавания рестриктазы SaU, комплементарными "липким" концам, образующимся при расщеплении плазмидной ДНК по сайту Xhpï. Кроме того, в, составе синтетического дуплекса имеется сайт Xbal. При лигированш синтетического дуплекса в состав плазмипы в последней должен возникнуть новый сайт Xbal. Далее, при встраивании лишь единичной копии Фрагмента образования новых сайтов Saîl ь плазмиде происходить не должно. Если же ■' новый сайт SalI.образуется,- значит дуплекс встроился такдемно.

Об ориентации единичных копий б1-элемента в составе плазмид,4 отобранных на предыдущей этапе, судили по размеру ХЬа1/ВатЩ-.Фрагмента (сайты указаны на-рисунке), который в случае прямой ориентации ф-элемента-(т, е, той же относительно направления транскрипции, что и в промоторе STA2) доставлял около 190 п. н., в .случае обратной - около 220. .'. .

Полученные плазмидн - pL,GA3i2-ô-<Un, pLGb7'OZ-0-<lir (в обеих прямая ориентация вставки;, pLú¿3l2-$-rev н pLG670Z-6-rev ¡обратная Ориентация вставки) использовали в дальнейших тестах.

4. 3. Функциональность 0-элекента in vive.

Полученными плазмидами трансформированы клетки штаммов УВ.5б!В (дикий тип)'и УВ5702 (МхИЕ) с отбором на прототрофность по урацилу. В качестве, контроля для трансформации взяты также исходное н-пазнудь;: plG¿3t2 и pLG670Z. Полученные траисформач-ш Биращлвались па чашках с агаризовашюА селек*гив:-к.й минеральном

средой, содержащей в качестве йу 0,1/. глюкозы ^репрессирующие условия) и ?»>.глюкозы (репрессирующие условия). кроме того, чашки содержали индикатор Х-ег>1 для тестирования экспрессия ^ -галактэзидазы.

Полученные результата (табл. 1) позволяют заключить, что ни в прямой,ни в обратной ориентация^ 9--элемент не обладает функцией ПАЗ. В то же время, наличие элемента л любой ориентации придает модельному промотору плазмицы р1ЛЗД31£ способность репрессироваться глюкозой.

Влияние встроенного модельных промоторов.

Таблица Ч-

•элемента на функционирование

Экспрессия ^-галзктозидазы ) в траясФормантах генотипа

Ялазмида

•юта:

■ о, п.

г,рюко зн

глюкозы

с, и

глюкозы

глюкозы'

•1 • . )

?1вб7ог-'л рь<з&тог-б-<1п-рЬС6?О2-0-геу рьз Д3121 ; ^'¡У-У . Д 312' в-ЛИг^"- .;• ?ЬЧ й 31

М

Л,- ./■•'

* -

Любопытно,что опосредуемая. 0-зпеи?ктом гчлю;;азнач репрессия «меняется в кутана генотипа да.кг'; несмотря яа что ятот-'-элемент очл идентифицирован,по его пойсдогии с ^(щ,, : ' • . ответственным а* НХ£2-;«£евисииу&.глодсозяу» репрессии,-„'.Это,: по-зидмному,' означает, что ИйЗсщ,' преаставляб?' собой'мозаийу. ' элементов, отвечзкзди: за нш-ррзиснкый к ие'зависктой меяади'лк »епресси«. с протонном случае обнаруженную роиопоги* сае-дует '

признать случайной, 'вероятность чего крайне низка (менее 10"6).

Необходимо также отметить, что идентификация в составе промотора гена 3TAS последовательностей, опосредующих НХКС-зав^симую глэксзную репрессию, представляется доказательством того что экспрессия гена SIAS находится псд одновременным контролем HXJCfc-зависимого и независимого механизмов глкжозной репрессии.

4. Специфическое связывание 0-элемента факторами клеточного экстракта in vitro, <

•Стандартней проверкой способности фрагмента ДИК сваЬываться с соответствующими клеточными белковыми Факторами является .п&сТамовка тестов на замедление электрофоретическсй •подвижности Фрагмента ДНК после инкубации его в клеточном экстракте (mobility-shift assay),

, Для постановки этик тестов использовался синтетический Фрагмент ДНК (рис.1), содержащий 0-элемент, едноцепочечнке концы которого были полностью достроены с помощью Фрагмента Клеясза ДКК-полимеразы I в присутствии радиоактивного оС-згР-ÖATP-; ■

, Экстракты бнли получены из клеток, выращенных до ранне экспоненциальной Фазы (2 х 1(>7 кл/мл) на жидкой среде YP, содержащей либо ИХ глюкозы,, либо смесь ЗУ. глицерина и ВУ, этанола.

Результата элёктрофс-ретического разделения связавшихся и несвязавшихся Фрагментов ДНК (рис. 5) свидетельствуют, что, в зависимости от условий культивирования клеток, использованных для получения экстрактов, с исс^едуенмм -фрагментом связываются одиночные дискретные-комплексы с различней подвижностью. Эти комплексы заметно снижают подвижность связавшейся ДНК по сравнению со свободной. ö-евябывающий комплекс, образующийся в нерепрессиругдах условиях, обозначен 0-ЁС1 (binding censplex 1); комплекс, возникший -в условиях глк'козной репрессии -0-всг. - '

Основываясь на однозначной зависимости характера связывания с этими комплексами от условий культивирования,, а также на .том, что ВС! "и ВС2 являются, судя но всему, основными

а

<5" с

(

9-ВС-4

8-ВС 2.

игсвр^вийяс?

ДНК ■

Рис. 5, Картина элоктрофоретического разделения фрагмента' ДНК (рис, 4), 'связавшегося и не связавшегося in vitro со специфическими факторами .клеточного экстракта. О, 1 пмоль радиоактивно меченого фрагмента ДНК.и 4 мкг разрушенной ипрщем/?№(/»* (неспецифический конкурент) инкуОирояаш-при 23°С в течение 30 мин. в; ,

а) 30 мк.П' экстракта клеток штамма; дикого типа» выраженных в среде YP с ЪУ, глицерина и этанола; ■

б) 30 мкл экстракта клеток штамма дикого типа, ияращетих в

V . I

преде YP с ZV. глюкозы;

в) 30 мкл экстракционного буфера Б2О0 (ионные условия ■• 200мИ

Nací), ; ..''•■ .

затем проводился электрофорез .в кеденатуривущкх условиях• в &Ч-• ом полиакрил анидном геле. ! ■' • • •

.•'•■. • гг

факторами, взаинодейс-тБУющияи с эленен'том, мг>жко предполагать, что функциональное состояние ¿того элемента в составе промотора, определяется, в пер'ьую очередь, конкуренцией именно идентифицированных' ВС) ;и ВСЯ за пидзнв'акие .с', кии. .

Трудно сказать,. являютс'й ли эти комплексы совершенно различными, :$ли являются .результатом взаимного (кодификационного превращения. Опираясь на результаты "Функцисгналг-ного тёстирорания, можно полагать, что .BCi, функционально пассивен, , э то время каг взаимодействие,ВС2 с -.' О-элементом'способно приводить к репрессии транскрипции.

. ЭЫВОШ ■■ ' . - '

1.- Экспрессии■ внеклеточной г„псц?с.амилазы, кодируемой геном

■ ЯТА2 у дрожжей, репрессируется глюкозой и рядом других ебр.зднваг.шх Сахаров: 'глюкоза-и' сахароза репрессируют транскрипцию гена' КГА2; галактоза и мальтоза вызывают репрессию на д.ос-ттр?нскряцционцб« уровне,- ' \ ,

2. Экспрессия гена STA2 находится под конч'ролем . протеинкиназы SKFI, игрэздей- ключевую роль в регуляции ',

■экспрессии глкьй.збрепрессируемых генов у ..дрожжей, ■ .,

3. Для'транскрипции, гена STA2 необходимы гены SfiF?.,' SHF5 и. неизвестны"! ранее г»к НДГ2,- отвечающие за экспрессию ряда других генов, регулируемых и н<* регулируемых "глюкозой. '

-.4, Мутакья. в.ген? НХ;<2..' приводящая к'к«.чститутивиой : экспрессии' многих гл«козорепр'ессируе"мых генов у дрожжей, не •указывает существенного влияний нэЛрепроссируемость гена STA2 глюкозой. ■ : ' ' • ■

6,.- Яромогор*' гена -STA&, в »делом • регулируемый глюкозой НХК2-незаП'ИсймыЫ-.образом,. Содержит участки.' способные опосредовать

■ НХК2--зависимую глюкозную' репрессию.

: ' , '•' 'СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ .

-1, - f.. v\ Benevo te'n-sKyv.'S. V: Kuchin, H. A. Keystat, К'. I. Suirt söv, ' . В, V. HashRo. ' J\cg'i 1 a tion of secretion of fite STA 2 • e'nc-oy\?<3 ■ f!i»<roaraylÄse in the yeast Sarcbaromyces cetrv?vl."ta>.

Abstracts of trip-VIII-Bilateral Symposium-tJSSP-FRG /'Genome Organization-and-Regulation ,'oi Gene Activity" (Иркутск, . : 1989), '.p. 42. ' I ; _ . ;

Ибрагимова O.K., Бенероле-йский С. В. , -.Лихова с. в.., Устянниьоэ Б,/., Коркеико Л. Г- . Натко С. В., >Стер«ин В. -Э. , Кучин" С.-В,., ' Сунцою '-й. И. Способ получения гибркднмх штаммов дрожжей ; Saccharomyces cerevislir-e для сбраяиъания крахмалсодержацего сырья в производстве оганола, лтами Sacci^rcrcv^ces carevisiae ВКПМ Утб2б - продуцент-этанола, -штамм Saccliaromyces • ' . cefevlsiae ВКПК Y-Tf7 .-. продуцент этанола, Авторское ■ свидетельство 06. 19S9.

Кучин С,'В, , НеЛстат' И. А., Герасименко о. г., Машко С. -, Беневоленский С. К (1'9-90)ч- Нутационный анализ системы утилизации крахмала у.дрожж'ей Saccharom'yces ce-revlsiae, / • Молекулярная, ¡биология', микробиология' л вируссгоР4<н Wf, £9. _ ■ "

?1,1. SunUov, :s7v. Kuchin, ■ И. A. Neys'tat, S, V. MashKp, ■' ■ S, у. BenevolenaKy (1951), Production <jf the STA2-encode<J ■ glucoamy!ase in the yeast Saccharomyces' cerevisiae is. . ^utject to .feed-bacK control, Yeast,. V.:7, 119-125. H. 1. Sunt sov,.' S. V, ruchin, - N. H. rartasheva",' 3, V. Bene vol e/isky. Fe.ed-bacK control of extracellular gluc'oaraylase product ion ' in Sacgharc-myces. Abstracts - of. i hei istft International Specialj2eaitSyiJiposium on Ye?sts (Riga/ 1991);-.p. 135.