Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование компонентов протеолитических систем крови в качестве субстратов цистеиновых катепсинов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Исследование компонентов протеолитических систем крови в качестве субстратов цистеиновых катепсинов"
На правах рукописи
ФАЕНКОВА Вера Петровна
ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПОНЕНТОВ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМ КРОВИ В КАЧЕСТВЕ СУБСТРАТОВ ЦИСТЕИНОВЫХ КАТЕЛСИНОВ
03.00.04 - биохимия
Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Санкт-Петербург 2003
Работа выполнена на кафедре биохимии (заведующий кафедрой — профессор Л.В. Галебская) Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова (ректор — член-корр. РАМН H.A. Яицкий).
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор Людвига Вячеславовна Галебская
Официальные олноненгы: доктор медицинских наук, профессор Анатолий Иванович Карпищенко кандидат медицинских наук Ольга Михайловна Спасенкова
Ведущее учреждение: Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия
Защита состоится в 7^/час. ^¿¿декабря 2003 года на заседании диссертационного совета К 20{Г088.01 по специальности 03.00.04 - биохимия при Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 14)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академик (Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 14)
Автореферат разослан « н »_/ _2003
года
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук
А. В. Караваева
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Белки биологических жидкостей человека находятся в состоянии постоянного обновления: их катаболизм уравновешен процессом тканевого биосинтеза. Катаболизм белков частично происходит в результате внеклеточного ограниченного прогеолнза, наблюдаемого в ходе функционирования протсолиткческих систем крови, но, в основном, путем внутриклеточного лизосомального протсолша, которому (¿елки и продукты их ограниченного протеол иза могут подвергаться послс ;)лнмина-ш<и из крови [Дин Р., 1981; Короленко Т.Л., 1990]. Ведущую роль и лизо-сомольном протеол те ифают цистеиновые катеисины. Эти ферменты осуществляют тотальный нротсолиз белков в лизосомах, обеспечивая и регулируя процессы клеточного питания н обновления белковых структур. Они участвуют в процесс и нгс многих внутри- и внеклеточных белков. Ка-тснсины вовлечены во многие патологические процесс!к при воспалении, злокачественном росте и других патологических процессах они выходят 1» клеток и появляются во внеклеточном матриксе и в плазме крови. При этом они могут воздействовать на белки крови и изменять их свойства. Определение катепсинов в биологических жидкостях организма и бионтатач тканей имеет важное прогностическое значение, поскольку уровень их коррелируете ростом и метастазнропаннсм опухолей.
Изучениенротеолитических ферментов лизосом, к которым относятся цистсиновые катенсины, является одним из важнейших и интенсивно развивающихся направлений современной биохимии, однако спектр белковых субстратов, применяемых для их исследования весьма ограничен. В литературе практически отсутствует информация о воздействии цнстсиноных катепсинов на белковые компоненты протеолнтических систем крови. Вместе с тем, разработанные на кафедре биохимии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова методы нх исследования (Галсбская Л.В. и др., 1990; Галсбская Л.В.,1996; Щербак И.Г. и др., 2000] поз пол яют о не и ни. возможность протс-олкза по изменению функциональных свойств отдельных компонентов указанных систем.
Некоторые участники протеолнтических систем используются (плаз-мин, активаторы плазминогена) или могут использоваться (фактор 1Э, С1-ингибитор комплемента) и качестве медицинских препаратов, поэтому исследование участия катепсинов в фзрмакокинстнке таких препаратов представляется особенно важным.
Актуальность изучения участия цистенновых катепсинов в деградации белковых компонентов протеол нтических систем крови обусловлена не только возможностью получения новых данных об нх с>бстратноЙ специфичности, но и выяснением функционального значения иистснновою про-теолиза.
ЦЫ5МСХА ±->>Л(«у+ной
ъЛ^АШЙ.__
Цели и задачи работы. Главной целью настоящей работы явилось выяснение спектра иротеолигического действия нистеиновых катеиеинов в отношении белковых компонентов протеолитическнх систем крови. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Разработка достаточно нетрудоемкого способа выделения тканевых цнетенновых катеиеинов с высоким выходом ферментов,
2. Исследование влняния цист с «новых кате пси ков на функциональную активность фактора О иС1-ИНГ комплемента, тромбина, нлазмииа, а также активатора плазминогена стрегпокипазы. Усовершенствование методов регистрации функциональной активности этих компонентов.
3. В случае обнаружения протеолиза исследованных белков иод действием цистеиновых катснсинов, анализ продуктов их деградации.
Научная новизна результатов. Разработан новый способ выделения и очистки цистснновых кате пенно к ш экстрактов тканей, обеспечивающий высокий выход ферментов, ускорение и упрощение процедуры очистки. Впервые обнаружено, что цнетенновые катенсины вызывают дефадацию стренгою >назы, что приводит к снижению, а затем и к полной потере ее плазм пноген-актнвирующей способности. Обнаружено, что тромбин, плаз-мин, фибрин, фактор О н С1-ингибитор (С1-ИНГ) системы комштеметтта устойчивы к действию цистеиновых катеиеинов. Усовершенствована методика турбиднмстрнческой регистрации процессов свертывания крови и фибр и кол и и. Разработан новый метод регистрации эффективности процесса активации плазминогена.
Научно-практическое значение. Обнаружение способности цистеиновых катеиеинов вызывать дефадацию стрептокнназы расширяет спектр белковых субстратов этих ферментов. Быстрый протеолиз стрептокиназы, используемой для предотвращения тромбообразовання у больных, может быть причиной кратковременности ее действия. Практическую значимость имеют методы, разработанные н использованные в работе. Способ выделения и очистки цистснновых катеиеинов может служить основой для получения индивидуальных катеиеинов, а также ферментного препарата для энзнмотеранин ран. Турбилимстрнческий метод может быть использован для исследования фармакодннамнкн активаторов плазминогена, а также для определения показателей гемостаза у пациентов.
Обнаруженная нами устойчивость тромбина, нлазмнна, фибрина, фактора Р и С1-ИПГ к действию цистеиновых катеиеинов можно рассматривать как благоприятный факт в случае применения катеиеинов для местной энзим отерап ни.
На заншту вы носит си следующие основные положения:
1. При выделении цистснновых катеиеинов из тканей замена общепринятой процедуры фракционирования экстракта ткани сульфатом аммония проведением ионообменной хроматофафии позволила упростить метод выделения ферментов и увеличить их выход.
2. Тромбин, шктшн, фактор О комплемента к С1-ИНГ сохраняют скою фу и к ішонал м іую а кін ии ость при обработке их цисте и ион мм к катеп-с и нам и.
3. Стрептокииаза является хорошим субстратом цистеи новых катспсн-нов її разрушается поя их действием с полной потерей сноеА активности.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены ил научной конференции, посвященной 100-летию кафедры биохимии СПбГМУ (Санкт-Петербург, 1998); на научной конференции, посвяшснноЙ 200-летию Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург, 1999); на научной конференции «Структура н функции прот сол и т н ч ее к их ферментов», (Москва, 2000); на научной конференции, посвященной 100-летию со дия рождения академика Н.И, Буланкина (Харьков, 2001); на биохимическом конгрессе Віосаїа1у£із-2002 (Москва, 2002).
Внедрение. Разработанные методы внедрены и используются в практике научных исследований и в учебном процессе па кафедре биохимии СПбГМУ имени акад. И.П. Павлова и могут быть рекомендованы к внедрению в научных учреждениях, занимающихся исследованием системы свертывания кропи (ЦНИИ гематологии и переливання крови (Москва), Кировский НИИ гематологии и переливания крови МЗ РФ, НИИ особо чистых биопрепаратов (Санкт-Петербург)).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.
Структура и объем работы. Днссертаиия изложена на страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования н их обсуждения* заключения и выводов; включает 12 таблиц, 18 рисунков и список литературы, содержащий .^¿источника, в том числе іСЦ зарубежных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Дія выделения нистси новых катепеннов по разработанному нами методу иеполыовалн трупные ночки, полученные из морга СПбГМУ им. акад. И. П. Па олова от людей, не страдавших заболеваниями почек, не позже, чем через 12 час после смерти. Компоненты комплемента напучали из сыворотки крови здоровых доноров. С1 остсразу (С1з') и СІ-ШІГ выделяли, соответственно, по методу ЛгІаисІ С. сі а1. [1977] и ИеЬоиІ Л., еґаі. 11977), оба -с модификациями, разработанными на кафедре биохимии СПбГМУ [Доро-фейков В.В., 1992; Симкина, 2001]. Фактор О комплемента выделяли по методу Козлова с соавт. [1982]. В качестве источника фибриногена и плазми ноге на использовали пул бестромбоцигарноіі нитратной плазмы здоровых допоров. Для активации свертывания и фибринолиза применяли коммерческие препараты тромбина и стреитокиназы. Оценку активности препарата цистеиновых катспсинов, плазмина и С1-эстеразы (СЬ*) проводили по скорости растепления ими низкомолскулярпых субстратов: паранитро-
фенилового эфира N-a-карбобе нзо кс и- L-л изина (Z-Ly s-O-Np* Н СI), пара-нитроаннлида N-a-6eH30tui-D, L-аргннина (БАПНА) и мет ил ку мар илам н да Ы-а-карбобснзокси-L- фе и илалан илар гин и на (Z-Phe-Arg-NНМес). Ол реде-ление активности фактора D системы компемента осуществляли в гемолитической системе [Галебская Л.В., 1996] по скорости лизиса эритроцитов кролика по альтернативному пути в присутствии реагента, дефицитного по этому компоненту (RD), В инкубационную смесь, содержащую реагент RD, ЭГТЛ-буфер, изотонический мединаловый буфер (рН 7,2) и исследуемые препараты фактора D добавляли стандартную взвесь эритроцитов кролика. Процесс лизиса регистрировали по >были оптической плотности при 800 нм. Определяли индукционный период (lag т) и скорость (V|ys) гемолиза. Функцию С1-ИНГ оценивали по торможению эстеразной активности Cls\ Эффективность работы компонентов гемостаза (тромбин, фибриноген, стрептокиназа) оценивали в системе турбиди метрической регистрации свертывания крови — фибринолиза [Ложен Т.И., 1993] в нашей модификации. Для этого в инкубационную смесь, содержащую плазму, изотонический вероналовый буфер (рН 7,4; 0,02 М), добавляли рабочие растворы стрептокнназм и тромбина. Регистрировали процесс изменения оптической плотности при 340 нм. Определяли показатели свертывания: Т^— скрытый период; V(, - максимальную скорость процесса свертывания (тангенс угла наклона касательной к кривой в точке наибольшей крутизны) и Т„ — его длительность; и фибринолиза: T„.ura - время сохранения максимума свето-поглощения; V,»,— максимальную скорость и Тл)п — длительность процесса лизиса.
Исследование продуктов деградации стрсптокиназы проводили методами электрофореза и К'льфильтрации.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Разработки способа выделении и очистки иистеи новых катепсинов.
Известные методы выделения цистеиновых катепсинов [Щербак И.Г. и др., 1979; Popovic Т. ci al., 1996] включают трудоемкую и длительную процедуру фракционирования кислотного экстракта гомогената ткани сульфатом аммония. Для ускорения и упрощения процедуры очистки мы предложили непосредственно после кислотной обработки экстракта ткани использовать ионообменную хроматографию. Эффективность очистки отражена в таблице I.
Предложенная нами замена процедуры фракционирования экстракта ткани сульфатом аммония процедурой ИОХ позволила существенно увеличить выход ферментов, который на этом этапе очистки составил 130-160% вместо 30-60% в общепринятых методах. В полученном препарате преобладал катепсин В (63,1%), Препарат имел рН^ в отношении низкомолекулярных субстратов в диапазоне 5,5-6,0, был устойчив (сохранял 95*5% ак-
тивности) при хрзпении (рН 5,0, -20°С) в течение 6 месяцев. Км и препарата составляли, соответственного,77±0,04ММ и 1,63 мкмоль час мг1 (БАПНЛ); 0,012 мМ и 9,83 мкмоль мин'мг"1 (2-Ьу5-0-Кр*НС1), что сравнимое приводимыми в литературе данными.
Таблица 1
Выделение и очистка и истей новы» катепеннов иг л очки человека. Активность иистшновы* кат еп еннов определена по ПХМБ-ипгибиру^чочу гнлролмту
ВАПНА
Название этапа Обьсм, мл Коніїеіггрзішя белка, мг/чл Удельная активность, mU/ur Обії'дя активность, ml) Выход. % Степень ОЧИСІКН
Экстракция ТКЗНН 430 4JQ 0^4 966 100 1
Кислотная обра-боїка ■100 U9 2,06 1063 no u
ИОХнаКМ-иеллюлоіе-32 32 9,18 4,93 І 449 150 14,5
Осаждение ацетоном И 7,42 16,56 1352 140 48,7
І ель-фильтраии я SO 0,3(1 ЗО 450 70 vu
Исследование действия цистепновых катснсиноп на компоненты системы комплемента
Фактор D системы комплемента является начальным звеном активации комплемента по альтернативному пути к ключевым ферментом процесса (Галебская Л,В., 1996]. Известно, что при почечной недостаточности наблюдается нарушение элиминации фактора D из организма, в результате чего содержание его в плазме крови больных на порядок превышает пор-мхтьные значения [Pascual М. et at., 1989]. Это позволяет предположить, что деградация фактора D идет в почках, и возможно, при участии цистеи-иовых катепешюв почек.
Действие цистенновых катепсинов па фактор D оценивали по их влиянию на гемолитическую активность фактора. Инкубацию очищенного препарата фактора D с катепсинами производили в течение 30 и 60 мин при 37 С, рН 6,5. Регистрировали показатели ком племеїгг-зав иен мого гемолиза (Табл. 2). Как видно из данных таблицы, существенного изменения показателей гемолитической активности фактора D после обработки его цистси-новыми катепсинами не происходит.
С1-ИНГ осуществляет контроль активности начальною звена активации системы комплемента по классическому пути п является мощным ингибитором калл икре и на JKirschfink М., Nurnberger W., 1999]. Известно, что катаболизм СІ-ИНГ осуществляется протеиназами плазми крози (лейкоцитарная эластаза, трипсин), гидролизуюишми его как белковый субстрат [Brower M.S., 1982]. Об участии иистеииовых катепсинов в катаболизме С1-ИНГ сведений в литературе не имеется. Вместе с тем, близость субстратной специфичности трипсинонодобиых ссрнновых проте и паз и некоторых ка-
тенсикои (катепсин В) позволяет предположить возможность альтернатип-нога протеолизаС1-ИНГ под действием этих ферментов.
Таблица 2
Покаытели іеи«лнтнч<:скч)й якіиьноеіи фактора D системы комллемептя человека
после инісуСзини очишетюю фастоца I) с препаратом пнсияновы! катепсіїнов
Скорость іемзіюа Vh (8 ) ИНДУКЦИОННЫЙ период 1 йц t (с)
контроль после инху&шлн с кэтепен нами контроль после инкубации с катепсинами
Зимин 6UMUH Зимин Ы)м нн
34.3 И.6 JJ.7tl.l 3S.S+U 221±2ь 213*16 220±20
Функциональную активность С1-ИИГ оценивали по степени угнетения им эстсразной активности С1ь' комплемента. Полученный нами препарат Cls' обладал улслыюй активностью 241,1 U/мг в отношении Z-Lys-O-Np*HC1. Активность препарата С1-Ш1 ["составляла 85,2 ед/мг. Для тестирования активности С1-ИНГ мы использовали такое количество препарата ингибитора, которое вызывало угнетение эсгеразиой активности Cts* на 2 5,5 ±0,5%. Нами было установлено, что, обработка С1-ИНГ цистсиновыми катенсинзми в течение 5 часов не оказывала существенного влияния на функцию белка. Препарат катепсинов также сохранял свою активность после инкубации с С1-ННГ.
Таким образом, и фактор D, и С1-ИНГ системы комплемента оказались устойчивы к протеилитическому действию цисте и новых катепсинов, что обусловлено, вероятно, недоступностью потенциальных сайтов гидролиза в молекулах этих белков.
Исследование действия инсгешювых катепсинов иа белковые компоненты системы спсртыванни кропи и фнбрннолпза
Синтез компонентой системы гемостаза происходит, главным образом, її печени, в меньшей степени — в почках и лейкоцитах. Процесс катаболизма большинства компонентов исследован мало. Имеются данные [Хомяков Ю.Н. и др., 2000; Панчснко Е.Н., 1998] об эндоцитозе комплексов тромбина и нлазмина с серпинами, которые подвергаются затем разрушению в лкзо-сомах. Только один ю белков системы гемостаза, а именно, фибриноген Сын испытан в качестве субстрата кате пси на В [Gabrijelcic D. et al, 1988, Uarsigian С. et al., 1986], который вызывал деградацию in vitro как деглико-зилированноИ, так п їликоінлированной формы белка.
Мами в качестве обьектов для действия цистеиновых катепсинов были исследованы следующие белки:
1) тромбин —наиболее активная протеаза системы свертывания крови;
2) плазмни - фермент фибринолша;
3) фибрин - субстраг плазмина при фибринолпзе;
4) стрентокииаза - широко применяемый экзогенный активатор фиб-рнполнза.
li этих белках имеются участки, но гюслслоп.пслыюстп аминокислот благоприятные для действия цистспновых катспсинои.
Турбиди метрическая регистра пня показателей снсртыпанин и фибр и нол нза с использованием ннтактноП и обра бота и но П micieinto-пыми юатепеннами плазмы
Типичная кривая свертывания и фибрииолиза представлена на рис. 1.
Рис. 1. Турбидиметричсскзя криия свертывания к роек и фнбримолнгз.
Для более точной характеристики процесса нами были предложены: (1) разделение оси времени на ряд последовательных участков; (2) оценка показателей T]4g и В нашей модификации метод позволяет одновременно н быстро оненнть ряд общепринятых показателей: тромбиновое время (сумма T|,gif T(S). концентрацию фибриногена (Ьта,), время и скорость лизиса сгустка, и определить предлагаемые нами новые показатели. Величина Ting, по нашей опенке, дает представление о количестве ингибиторов тромбина в исследу емой плазме; IV«™- отражает эффективность процесса активации плазм н но гена. Анализ зависимости показателей фнбринолиза от концентрации стрегттокиназы выявил, чго величина показателя связана обратно пропорциональной зависимостью с логарифмом концентрации стрегггокиназы. Это позволило нам разработать способ количественного определения активности стреглокниазм на основе турбидимстрической регистрации процесса образования и лизиса фибриновог© сгустка. Этот способ можно использовать для определения активности и других активаторов плазм и но гена.
i
По сравнению с применяемым до настоящего времени способом Аст-рупа [Astrup T.S., 1952], основанным на определении площади лизиса стандартной фибрнновой пленки активатором плазми но гена за определенное время, наш способ позволяет сократить процедуру определения активности с 18-24 часои до 5-7 мин. Кроме того повышается точность определения, так как предлагаемый нами метод является строго количественным.
Для демонстрации диагностической ценности метод был применен, наряду с другими стандартными лабораторными тестами, для оценки коагу-ляционного статуса н фибр и иол та у больных с механическими искусственными клапанами сердца. Это позволило выявить у 16 из 28 обследованных больных с высоким уровнем протромбина снижение hm» и Т^ то есть снижение уровня фибриногена и активацию фибринолиза, что является признаком состояния, предшествующего развитию ДВС-синдрома [Лычев В.Г., 1993].
После обработки плазмы крови цистенновыми катспсинами нами не выявлено изменений ни показателей свертывания, ни показателей фибринолиза (табл. 3).
Таблица 3
ІІокашге.ін сьсршванни кроки н фи(ірино.іим проб плаїиьі крови злоровых
доноровnofjit moitpifaimi чрешіагом цисітнновых катепсинов_
Покаміель Кон гриль 1 Іослс обработок тішим иистепновыми кагепсина-ми
J 1«. С S2i6 50і6
-Г,„с
0,1ЇМ»,05
0,10711),014 0,І(Ш 0,020
T »с 1513 15гЗ
V„,,SbV/un» O.ltrtU.OS 0.1fr*0,t)5
Іч.С 3IU 30t3
г„,.с 64U 64*3
Отсутствие изменений ішкашелей гемостаза плазмы крови после ее обработки цнстсиноиыми кагепсииачи не является свидетельством того, что кате псины не способны использовать отдельные Селки этой системы в качестве своих субстратов в лиэссочах. В плазме крови содержится много .штинрогсипаз (Ватте» АЛ. еі а1„ 19X6], способных блокировать катепсины. При обработке плазмы препаратом нистениовых катепсинов мы создавали такую их концентрацию, которая и десятки раз превышает наблюдающуюся при гшіеркаїснсинемші [ОаЬгусІсіс !>., 1990], но, по-видим ому, она все же не превышала аитинротсолитический потенциал плазмы.
Исследование дейсішіи нистеиновых катепсинов на тромбин« фибрин II Ш11ІЗМИН
От количества активною тромбина в большей степени зависят величины Т|,гиТц. После обработки тромбина нистеиноиыми катенсинами в тече-
ниє ЗО и 60 мин. нами не было зарегистрировано изменения этих показателей (табл. 4).
Та0лнца4
Показатели свертывания кроем до и мосле обработки тромбина _препаратом пнсісииовм* кчттпсинпп_
Продолжительность обработки Иокапятми смршязния
Тие (СІ Т„ (с) ■Уи.&Еиа/мин
Контроль 0 нин. 50*3 68*6 0,23*0,05
30 мин. 47 ¿3 65*3 0,21*0,05
60 мин. 50*3 67*6 0.23*0,05
Таким образом, тромбин оказался функционально устойчивым к действию цистеиновых катепсинов.
При исследование действия цисте и новых катенсинов на фибрин инкубационная смесь не содержала активаторов фибринолиза, поэтому осуществлялась регистрация только процесса свертывания до появления плато светоноглощения, наступающего после превращения всего фибриногена в фибрин (левая часть кривой на рис. 1). После добавления препарата катенсинов к образовавшемуся фибриновому сгустку мы не наблюдали снижения оптической плотности. Таким образом, мы не обнаружили существенного і ірогео литнчес ко го воздействия цистеиновых катепсинов на фибрин. Вероятно, это связано с недоступностью возможных для растепления связей в образованном фибр и новом сгустке.
Функционально устойчивым к действию катепсинов оказался и фермент фибринолиза плазмин: после инкубации препарата активного плазми-на (42,Оі0,5 и/мг) с цистеиновыми катепсинами в течение 30 и 60 минут при рН 6,0 нами не было зарегистрировано потери его активности в отношении 2-Ьу5-0-Ыр*НС1.
Исследование функциональной активності! сгрентокинязы » холе ее обработки цистеиновыми катепсинами
Как известно, активация плазминогена происходит в составе актива-торного комплекса со стректокиназой в результате конформационных изменений в молекуле плазминогена. Активаторный комплекс способен превращать другие (ннтактиые) молекулы плазминогена в активный плазмин, расщепляющий фибрин. Сам активаторный комплекс также способен вызывать лизис фибрина.
Показателями, характеризующими фибринолиз являются: ТП1аки Тв-і,
— время сохранения максимума на кривой свертывания-фибринолиза. Этот показатель характеризует процесс образования и накопления активного илазмина, он зависит ог количества функционально активных молекул стрептокиназы, способных образовать активаторный комплекс.
. Величины показателей ТЯ11, (времени лизиса) и УЛЯ1 (скорости лтиса) зависят от количества активного плазмина, образующегося из плазмииогена иол действием актива торного комплекса.
Обработка стрептокнназы цнетеиновыми катеиеннами приводила к значительным изменениям показателей фибринолиза. Было проведено исследование их изменений в зависимости от продолжительности обработки и от количества ферментов. . . .
Следует отметить, что без кате пси нов показатели фибринолиза не изменялись после инкубации ннтактной стрептокнназы в течение 120 минут.
Анализ показателей свертывания и фибринолиза, полученных при разной продолжительности обработки стрептокнназы катепсинами, свидетельствует о том, что 5-мин. обработка не приводит к заметному изменению показателей фибринолиза (при количестве фермента 0,05-0,211) по сравнению с контролем. Это можно объяснить сохранением достаточного количества неповрежденных молекул стрептокнназы. С другой стороны, после 30 мин. обработки лизис сгустка не регистрируется даже при минимальном количестве катепсинов - 0,05и. Это свидетельствует о полной утрате стрептокииазой плаз м и ноген-а кти в ирующей способности. Пели рассматривать изменення показателей в промежуточные сроки, то увеличение продолжительности обработки и/или количества катепсинов приводит к торможению фибринолиза. На рисунке 2 представлены кривые свертывания и фибринолиза для случая, когда количество ферментов, взятых для обработки стрептокнназы, составляло 0,2 и. Первоначально (рис. 2, кривая 3) отмечается увеличение в 4,5 раза показателя ТЛЦ10 Эта величина характеризует проиесс накопления активного плазмина, так как лизис сгустка начинается только тогда, когда концентрация активированною фермента достигнет определенного уровня. Таким образом, первоначально происходит снижение скорости активации плазмииогена из-за уменьшения в ходе деградации количества молекул стре1гт0киназы, способных образовывать актнваторный комплекс. Однако, их еще достаточно, чтобы активировать весь имеющийся плазм н но ген, о чем свидетельствуют неизменность времени и скорости лизиса (рис. 2, кривые 1,2 и 3). Эти величины определяются количеством активного плазмина. Кроме того, лизис фибрина, как уже отмечалось, может осуществляться под действием самого активаторного комплекса, в том случае, если продукты протеолиза стрептокиназы способны еще его образовать. После 18 мин.обработки стрептокнназы препаратом катепсинов (рис. 2, кривая 4) наряду с 11-кратным увеличением времени сохранения максимума с вето поглощения происходит и заметное увеличение продолжительности фибринолиза: показатель Тли, увеличивается в 1,5 раза, что можно объяснить уменьшением не только скорости образования комплекса стрсп-токиназа-плазминогеи, но и количества активированного плазмина. В этот период процесс образования активированного плазмииогена начинает ли-
мигироваться количеством функционально активной стрептокиназы, Вероятно, стрелтокиназа еше способна образовать активаторный комплекс, но активация интактного плазм иногена нарушается. После 30 мин.обработки препарата катепсинами (рис, 2, кривая 5) лизиса сгустка не наблюдается. Следует отметить, что при количестве катепсина 0,4 и эта зависимость имеет иной характер. Уже при 5 мин. обработке показатель Тплк, увеличивается в 2 раза. А изменение показателя Тлн, наступает уже при 10-м и и. обработке. После 18 мин. обработки лизис не регистрируется.
BpeMt, с
Рис. 2. Влияние продолжшельности oGpaGoiMt стрсшокишиы (250 ME) кзгеисшмч 1) (ОД U) на процесс фибрииолига: 1-0 чин; 2-5 мтг; 3 -10 мин; 4- IS мин; 3- 30 мнн
В следующей серии экспериментов была исследована зависимость величин показателей функциональной активности стрептокиназы от количества цисте и новых катепсинов. Эти опыты показали, что наблюдается линейная зависимость показа геля ТПД11<1 от количества катепсинов. На рисунке 3 представлены данные для эксперимента, в котором время инкубации составляло 10 мин, а количество фермента в пробе варьировали от 50 до 400 mU. В этом диапазоне концентраций была выявлена линейная зависимость показателя Т „„„ от количества катепсинов. Поскольку, указанная величина наиболее точно отражает количество стрептокиназы в пробе, была рассчитана удельная активность цисте и новых катепсинов в отношении стрептокиназы. Она составила (3900±110) МЕ/мг белка препарата цистенновых катепсинов. Изменение же времени лизиса в зависимости от количества катепсинов имеет «пороговый» характер: при уровне катепсинов от 50 до 200 mU время лизиса сохраняется неизменным, а при увеличении количества фермента до 0,4U показатель Тлл увеличивается в 1,3 разз.
Полученные данные свидетельствуют о быстрой инактивации стрептокиназы при обработке ее пистеиновыми катепсинами. Наиболее вероятной причиной инактивации белка является его нротеолиз.
кагепсин В, тЦ
—♦—время сохранения максимума светопоглої нем и я
—О- время фибринолиза
Рис. 3. Зависимость показзлелей фиОриколіпа от количества каїепсина П (при 10 мин, обработке).
Исследование продуктов деградации стрептокиназы
Результаты электрофоретического разделения продуктов протеолиза стрентокиназы под действием цистеиновых катепсинов представлены на рисунке 4. Видно, что инкубация стрептокиказы с препаратом цистеиновых катепсинов приводила к постепенному разрушению белка (в контроле стрентокиназа не подвергалась спонтанному распаду в течение как минимум 120 мин). Уже после 5 мин,-обработки, наряду с интастными молекулами стрептокиназы (89 кДа), отмечается появление низкомолекулярных пептидов (8,5-10 кДа) и продуктов с молекулярной массой около 50 кДа. Последние затем также расщепляются, так как после 10 мин. обработки количество их снижается, отмечается увеличение количества низкомолекулярных пептидов (4,5-8,5 кДа) и появление продуктов с молекулярной массой 32 кДа. Количество этих продуктов в свою очередь снижается после 18 мин. инкубации стрентокиназы с катепсином В, а продукты с молекулярной массой 50 кДа полностью исчезают. К этому времени еще сохраняется небольшое количество неповрежденных молекул стрептокиназы, хотя количество низкомолекулярных пептидов продолжает увеличиваться.
После 30 мнн. обработки обнаруживаются, в основном, низкомолекулярные неактнвныеные пептиды (4,5-8,5 кДа), а также небольшое количество продуктов с молекулярной массой 32 кДа; последние разрушаются после 45 мин. инкубации. Таким образом, обработка стрептокиназы цистеиновы-мн катепсинами приводит к постепенной деградации этого белка до низкомолекулярных неактивных продуктов.
Результаты хроматографического разделения контрольной и опытных (10 и 30 мин. инкубации) проб представлены на рисунке 5. Стрептокиназа из контрольной пробы выходит одним пиком (Уе = 10 мл). Ее плазминоген-
активирующая способность полностью сохраняется. После 10-минутиой обработки препаратом катепсинов наблюдается смешение этого лика и его расширение (Уе " 12 мл), что указывает на уменьшение размеров части молекул. Плаз ми ноген-актнв иру юшая способность в этом пике может быть обусловлена как наличием неповрежденных молекул стрептокииазы, так и крупных продуктов протеолиза, возможно, еще обладающих активностью (рис. 4,3-я электрофореграмма).
Затем появляется пик низком олекулярных пептидов (4,5-8,5 к Да). Ои не обладает плазми но ген-актив и рутошей способностью. После 30-мин.обработки появляется пик (Уе~1б мл, соответствует молекулярной массе 32 кДа) и увеличивается и расширяется ник низ ком олекулярных пептидов (4,5-8,5 кДа). Эти пики не обладают нлазминогсн-активыруюшей способностью.
J4C-I \
• - г у-.
■. -s.i.si v:.У.oVt--'
''¿''■i-i* •'■'b.'v i;'
И'!
I**
■ > <■>„ i' ■.'W- i v'l-'-i "'-'J
iV/VCRf-'/if:
J.-i'i'--
fflii:
о, f*'
:
уЩ;Ч
? i s •
ЙВЙ!^
, M 1 1 -
■■ V')',.
Ш
ffis sst
r~>*< i«
■V, ... ^ i f
.^ПДг'.
шм f* p* i
'b'^i'riU
0(K) 5 *Vo 18 30 45 (чин) Рис, 4, ПЛЛГ - электрофорез продуктов деградации стрегпскмнаш <250 MB) иистси новыми кагспсинами (200 mU).
www";
> ■ - 1. - , .in '
Основным ферментативным компонентом полученного нами из почки человека препарата цистеиновых катепсинов является катепсин В. Кагеп-снн В имеет наибольшую специфичность к связям, образованным основными аминокислотами, особенно, к связям арг-арг и лиз-арг. При анализе первичной структуры стрептокииазы обращает на себя внимание то, что в
кон tic вы х областях стрептокиназы действительно имеются связи, образованные парами основных аминокислот. Кроме того, такие связи расположены в а-домене, между участками связывания с интактным плазминогеном и участком связывания с плазминогеном комплекса, [Jackson K.W. et al., 1982; Wang X. et al., 1998]. Полученные нами данные о сохранении плазминоген-астивирующей способности белка на начальных этапах ферментной обработки свидетельствуют о том, что первоначально расщепление стрептокиназы идет в концевых областях молекулы. По-видимому, очень быстро в процесс деградации вовлекается и функционально значимый а-ломен, обладающий потенцихтьными сайтами для нротеолитичсского действия ка-тепсина В, В связи с этим наступает, сначала частичная, а затем и полная инактивация стрептокиназы.
Рис. 5. Гель-фшырзцнч на Акркдексс Р-60 (33,5X1,1) продуктов деградации стрептокиназы (250 МН) ш<стеи новыми кэте псинами (200 mU)
Стрсптокиназа широко применяется в медицине в качестве тромболи-тика. Известно, что время ее существования в кровяном русле находится в диапазоне 1-3 часов. После введения в кровоток большая часть стрептокиназы образует с циркулирующим плазминогеном активаторный комплекс, который адсорбируется на фибрине. Часть стрептокиназы может связываться с антителами, и образующиеся иммунные ком апексы удаляются из кровотока. Можно предположить, что эти комплексы подвергаются эндошгтозу и дальнейшей деградации в лизосомах. Наши данные свидетельствуют о возможности быстрого протсолиза стрептокиназы in vivo под действием лизосомапышх катепсинов.
Имеющиеся в настоящее время в литературе данные о белковых субстратах цисте)!новых катепсинов не достаточны для широких обобщений по этому вопросу. Наши исследования позволили исключить ряд белков (фактор D, С1-ИНГ, тромбин, фибрин, плазмин) из числа возможных субстратов цистсиовых катепсинов и включить в него стрептокиназу. Стрепто-киназа может служить удобным белковым субстратом для исследования
с во ¡Id в цист с и новы х кате пс и нов, поскольку се деградация может быть легко оценена разработанным нами турбидиметрнческим способом.
ВЫВОДЫ
1. Разработан способ выделения и очистки цистеиновых катепсинов из почки человека, обеспечивающий сокращение и упрощение процедуры очистки, а также существенное увеличение выхода ферментативной активности.
2. Цнстенновые катепсины из почки человека не вызывают инактивации очищенных препаратов Cl-ингибнтора и фактора D системы комплемента, тромбина и ил аз ми на, а также не вызывают лизиса фибрнновых cry* стков.
3. Показатель ТЛ„га на турбилиметрнческой кривой свертывания крови
— фибринолгаа находится в обратной зависимости от концентрации интакт-ной стрешокнназы и можег быть использован для исследования катаболизма активаторов плазминогена.
4. Стрелтокиназа является хорошим субстратом для действия цистеиновых катепсинов из почки человека, и подвергается глубокому протсолизу до низкомолекулярных пептидов.
5. Динамика изменения функциональной активности стрептокиназы и появления продуктов протеолиза в ходе инкубации препарата с цистсино-выми катепсинами свидетельствует о ведущей рати кате пси на В в деградации этого белка.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Щербак И.Г., Субботина Т.Ф., Фаенкова В.П. Способ выделения пне-теинов их катепсинов из экстрактов тканей.— Патент РФ на изобретение, Si 2126684 приор, от 15.11.95. Опубл. 27.02.1999. - Бюл. № б.
2. Фаенкова В.П., Тарасова Ю.В., Симкнна Н.Б., Субботина Т.Ф. Устойчивость функциональной активности белков системы комплемента — С1-ингибитора и фактора Д - к протеолитнческому действию катспспна В.
- В сб. Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии. -Труды науч. конф.иосвЛОО-летию каф.биохимии СПбГМУ. — СПб. — 1998, — Т.1.-С. 95-97.
3. Турбидиметрнческий метод одновременной регистрации свертывания крови и фнбринолиза. / Субботина Т.Ф., Гриценко В.В., Орловский П.М. и др. - В сб. Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии. - Труды науч. конф. поев. 100-лстию каф, биохимии СПбГМУ. — СПб. - 199$.-т. 1.-С. 118-123.
4. Оценка параметров гемостаза у Сольных с механическими искусственными клапанами сердца турбид и метр ич ее к и м экспресс-методом. / Субботина Т.Ф., Гриценко B.Ii., Орловский П.И. и лр. - В сб. Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии. - Труды науч. конф.носв. 100-летию каф. биохимии СПбГМУ. - СПб. - 1998. - т.2. - С. 507-511.
5. Субботина Т.Ф., Фаенкова В.П., Щербак И.Г. Деградация стрептоки-назы кате пси ном В почек человека. — В сб.Лктуальные вопросы клиники, диагностики и лечения..— Тез. докл. науч. конф., поев. 200-летию BMA. — СПб. - 1999. - С. 473-474.
6. Возможности турбидиметрического экспресс-метода в оценке дисбаланса системы гемостаза у больных с механическими искусственными клапанами сердца / Субботина Т.Ф., Фаенкова B.II., Кадинская М.И. и др. - В сб. Актуальные проблемы сердечно-сосудистой, легочной и абдоминальной хирургии. - Труды науч.конф..посв. 95-летию акал. РАМН Ф.Г. Углова. -Из-во СПбГМУ. - 1999. - С. 143-144.
7. Щербак ИХ., Субботина Т.Ф., Фаенкова В.П., Рюмина Е.В. Турби-диметрнческий анализ процесса полимеризации фибрина в плазме крови. / Вопр. мед. химии. — 2000, т.46 — С. 486-487, (Тезисы конференции «Структура и функции протеолитических ферментов». Москва, 11-13 октября 2000).
8. Щербак И.Г., Субботина Т.Ф., Фаенкова В.П. Влияние катепсина В почек человека на плазминоген-активирующую способность стрептокина-зы. - В сб. Научное наследие академика И.Н. Буланкина и его развитие в современной биохимии. Труды науч.конф.поев. 100-летию со дня рождения, /ред. П. А. Калиман-Харьков,2001.-С. 100-101.
9. Щербак П.Г., Субботина Т.Ф., Фаенкова В.П., Рюмина Е.В. Турби-диметрнческнй анализ полимеризации фибрина в плазме крови. / Вопр. мед. химии.— 2001. —Т.7, вып. 1.-С. 80-89.
10. Subbottna T.F., Fayenkova V.P., Galebskaya L.V. Cathepsin В catalyzed degradaion of the streptokinase preparation. International conference Biocatalysis - 2002: Fundaments & Applications. June, 22-27. Department of Chemical Enzym ology, Moscow, Abstracts.— P. 131.
11. Fayenkova V.P., Subbotina T.F., Galebskaya L.V. The degradation of streptokinase by renal cathepsin В. Н Вестник МГУ. - 2003. - в печати.
ФАЕНКОВА В.П. Исследование компонентов протеолитичес ких систем крови в качестве субстратов цистеиновых катепсинов // Автореф, ... канд. биол. наук: 03.00,04. - СПб.: Изд-во НИИХ СПбГУ, 2003. - 18 с.
Подписано в лечэть с оригинал-макета 13.11.2003, Объем 1 усл. п. л. Гарнитура тайме. Бумага офсетная. Печать рюогр. Тираж 100 экз. Отпечатано в отделе оперативной полиграфии НИИХ СПбГУ СПб., Ст. Петергоф, Университетский пр., 26.
Ш2006*
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фаенкова, Вера Петровна
1. ВВЕДЕНИЕ.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1. Цистеиновые катепсины лизосом.
2.1.1. Особенности строения и физико-химические свойства цистеиновых катепсинов.
2.1.2. Методы выделения и очистки цистеиновых катепсинов.
2.1.3. Ингибиторы цистеиновых катепсинов.
2.1.4. Субстратная специфичность цистеиновых катепсинов.
2.1.4.1. Субстратная специфичность цистеиновых катепсинов в отношении низкомолекулярных субстратов.
2.1.4.2. Протеолитическое действие цистеиновых катепсинов на белковые субстраты.
2.1.4.3. Участие цистеиновых катепсинов в протеолизе белков в норме и при ^ патологии.
2.2. Общая характеристика важнейших протеолитических систем крови.
2.2.1. Белковые компоненты протеолитических систем крови как возможные субстраты цистеиновых катепсинов.
2.2.2. Физико-химические свойства и функции фактора D системы комплемента.
2.2.3. Физико-химические свойства и функции С1-ингибитора системы комплемента.
2.2.4. Физико-химические свойства и функции тромбина.
2.2.5. Строение и свойства фибрина.
2.2.6. Строение и физико-химические свойства стрептокиназы.
2.2.7. Превращение плазминогена в плазмин под действием стрептокиназы.
СОБСТВЕННЫЕ ДАННЫЕ
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
3.1. Аппаратура и реактивы.
3.2. Источники белковых препаратов.
3.3. Определение активности цистеиновых катепсинов.
3.3.1. Определение БАПНА-гидролазной активности.
3.3.2. Определение активности цистеиновых катепсинов в отношении Z-Lys-0-Np*HCl).
3.3.3. Определение активности цистеиновых катепсинов в отношении Z-Phe-Arg-NHMec.
3.4. Выделение и очистка белков системы комплемента.
3.4.1. Получение Cls' субкомпонента.
3.4.2. Получение С1-ИНГ.
3.4.3. Получение фактора D системы комплемента.
3.4.4. Получение сыворотки, частично истощенной по фактору D системы комплемента (RD).
3.5. Обработка белковых препаратов цистеиновыми катепсинами.
3.6. Определение функциональной активности компонентов протеолитических систем крови.
3.6.1. Регистрация активности фактора D.
3.6.2. Регистрация активности Cls' и С1-ИНГ.
3.6.3. Регистрация активности плазмина.
3.6.4. Турбидиметрический метод регистрации процессов свертывания - фибринолиза.
3.7. Количественное определение белка.
3.8. Электрофорез в полиакриламидном геле.
3.9. Изучение продуктов протеолиза стрептокиназы методом гель-фильтрации.
3.10. Ионообменная хроматография на КМ-целлюлозе-32.
3.11. Методы математической обработки.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Получение очищенных препаратов цистеиновых катепсинов и исследование их некоторых свойств.
4.1.1. Разработка способа выделения и очистки цистеиновых катепсинов из почки человека.
4.1.2. Исследование активности цистеиновых катепсинов в отношении низкомолекулярных субстратов.
4.1.2.1. Изучение зависимости активности цистеиновых катепсинов от рН и продолжительности хранения.
4.1.2.2. Исследование активности цистеиновых катепсинов в отношении БАПНА.
4.1.2.3. Исследование активности цистеиновых катепсинов в отношении Z-Lys-0-Np*HCl.
4.1.2.4. Исследование активности цистеиновых катепсинов в отношении Z-Phe-Arg-NHMec.
4.2. Исследование действия цистеиновых катепсинов на компоненты системы комплемента.
4.2.1. Исследование действия цистеиновых катепсинов на функциональную активность фактора D системы комплемента.
4.2.2. Влияние цистеиновых катепсинов на функциональную активность С1 - ингибитора.
4.3. Турбидиметрическая регистрация процессов свертывания и фибринолиза.
4.4. Исследование действия цистеиновых катепсинов на белковые компоненты системы свертывания крови и фибринолиза.
4.4.1. Турбидиметрическая регистрация показателей свертывания и фибринолиза с использованием интактной и обработанной цистеиновыми катепсинами плазмы.
4.4.2. Исследование действия цистеиновых катепсинов на тромбин.
4.4.3. Исследование действия цистеиновых катепсинов на фибрин.
4.4.4. Исследование действия цистеиновых катепсинов на плазмин.
4.4.5. Исследование функциональной активности стрептокиназы в ходе ее обработки цистеиновыми катепсинами.
4.5. Изучение протеолитического действия цистеиновых катепсинов в отношении стрептокиназы.
4.5.1. Исследование продуктов деградации стрептокиназы электрофоретическим методом.
4.5.2. Гель-фильтрация продуктов протеолиза стрептокиназы под действием цистеиновых катепсинов.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование компонентов протеолитических систем крови в качестве субстратов цистеиновых катепсинов"
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Белки биологических жидкостей человека находятся в состоянии постоянного обновления, то есть их катаболизм уравновешен процессом тканевого биосинтеза. Различают два механизма катаболизма белков: (1) внеклеточный ограниченный протеолиз, наблюдаемый в ходе функционирования протеолитических систем крови, и (2) внутриклеточный лизосомальный протеолиз. Внеклеточнный протеолиз приводит к осуществлению функционального эффекта протеолитических систем и к настоящему времени достаточно хорошо изучен. Продукты внеклеточного протеолиза являются достаточно крупными белками или полипептидами и могут подвергаться дальнейшему катаболизму в клеточных лизосомах, в которые они поступают в результате эндоцитоза [5, 17, 26, 110]. Ведущую роль в лизосомальном протеолизе играют цистеиновые катепсины. Эти ферменты осуществляют тотальный протеолиз белков в лизосомах, обеспечивая и регулируя процессы клеточного питания и обновления белковых структуру, 26]. Они участвуют в процессинге многих внутри- и внеклеточных белков [1, 33, 70, 75, 89, 106, 112, 157, 164, 179, 186]. Катепсины вовлечены во многие патологические процессы: при воспалении, злокачественном росте и других патологических процессах они выходят из клеток и появляются во внеклеточном матриксе и в плазме крови. При этом они могут воздействовать на белки крови и изменять их свойства [16, 92, 95, 100, 102, 107, 117]. Определение катепсинов в биологических жидкостях организма и биоптатах тканей имеет важное прогностическое значение, поскольку уровень их коррелирует с ростом и метастазированием опухолей [20, 22, 29, 95, 107, 143].
Изучение протеолитических ферментов лизосом, к которым относятся цистеиновые катепсины, является одним из важнейших и интенсивно развивающихся направлений современной биохимии [5, 17, 26, 41], однако спектр белковых субстратов, применяемых для их исследования, весьма ограничен. В литературе практически отсутствует информация о воздействии цистеиновых катепсинов на белковые компоненты протеолитических систем крови. Кроме того, отмечается, что катаболизм многих белков плазмы не ясен и нуждается в дальнейшем изучении [17, 26]. Вместе с тем, разработанные на кафедре биохимии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова методы их исследования [12, 25, 44, 53] позволяют оценить возможность протеолиза по изменению функциональных свойств отдельных компонентов указанных систем.
Некоторые участники протеолитических систем используются (плазмин, активаторы плазминогена) или могут использоваться (фактор D, С1-ингибитор комплемента) в качестве медицинских препаратов, поэтому исследование участия катепсинов в фармакокинетике таких препаратов представляется особенно важным.
Актуальность изучения участия цистеиновых катепсинов в деградации белковых компонентов протеолитических систем крови обусловлена не только возможностью получения новых данных об их субстратной специфичности, но и выяснением функционального значения цистеинового протеолиза.
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Главной целью настоящей работы явилось выяснение спектра протеолитического действия цистеиновых катепсинов в отношении белковых компонентов протеолитических систем крови. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Разработка достаточно простого, нетрудоемкого способа выделения тканевых цистеиновых катепсинов с высоким выходом ферментов.
2. Исследование влияния цистеиновых катепсинов на функциональную активность фактора D и С1-ИНГ комплемента, тромбина, плазмина, а также активатора плазминогена стрептокиназы. Усовершенствование методов регистрации функциональной активности этих компонентов.
3. В случае обнаружения протеолиза исследованных белков под действием цистеиновых катепсинов, анализ продуктов их деградации.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Разработан новый способ выделения и очистки цистеиновых катепсинов из экстрактов тканей, обеспечивающий высокий выход ферментов, ускорение и упрощение процедуры очистки. Впервые обнаружено, что цистеиновые катепсины вызывают деградацию стрептокиназы, что приводит к снижению, а затем и к полной потере ее плазминоген-активирующей способности. Обнаружено, что тромбин, плазмин, фибрин, фактор D и С1 — ингибитор системы комплемента устойчивы в действию цистеиновых катепсинов. Усовершенствована методика турбидиметрической регистрации процессов свертывания крови и фибринолиза. Разработан новый метод регистрации эффективности процесса активации плазминогена.
ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ. Обнаружение способности цистеиновых катепсинов вызывать деградацию стрептокиназы развивает представление об их специфичности в отношении белковых субстратов. Быстрый протеолиз этого белкового препарата, используемого для активации фибринолиза in vivo, может быть причиной кратковременности его действия.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Практическую значимость имеют методы, разработанные и использованные в работе. (1) Способ выделения и очистки цистеиновых катепсинов может служить основой для получения индивидуальных катепсинов, а также ферментного препарата, перспективного для энзимотерапии ран. (2) Способ определения активности активаторов плазминогена с использованием турбидиметрии может быть использован для исследования фармакодинамики активаторов плазминогена.
Кроме того, он удобен для контроля состояния у больных с нарушениями системы свертывания и фибринолиза; метод позволяет одновременно и быстро определить ряд диагностически важных показателей.
Обнаруженная нами устойчивость тромбина, плазмина, фибрина, фактора D и С1-ИНГ к действию цистеиновых катепсинов можно рассматривать как благоприятный факт в случае применения катепсинов для местной энзимотерапии.
НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ следующие основные положения:
1. При выделениии цистеиновых катепсинов из тканей замена общепринятой процедуры фракционирования экстракта ткани сульфатом аммония проведением ионообменной хроматографии позволила упростить метод выделения ферментов и увеличить их выход.
2. Тромбин, плазмин, фактор D комплемента и С1 - ингибитор сохраняют свою функциональную активность при обработке их цистеиновыми катепсинами. Не происходит лизиса фибриновых сгустков под действием цистеиновых катепсинов.
3. Стрептокиназа является хорошим субстратом цистеиновых катепсинов и разрушается под их действием с полной потерей своей активности.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены на научной конференции, посвященной 100-летию кафедры биохимии СПбГМУ (Санкт-Петербург, 1998); на научной конференции, посвященной 200-летию Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург, 1999); на научной конференции «Структура и функции протеолитических ферментов», (Москва, 2000); на научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика Н.И. Буланкина (Харьков, 2001); на биохимическом конгрессе Biocatalysis-2002 (Москва, 2002).
ВНЕДРЕНИЕ. Разработанные методы внедрены и используются в практике научных исследований и в учебном процессе на кафедре биохимии Санкт-Петербургского Государственного медицинского Университета имени акад.И.П.Павлова и могут быть рекомендованы к внедрению в научных учреждениях, занимающихся исследованием системы свертывания крови (ЦНИИ гематологии и переливания крови (Москва), Кировский НИИ гематологии и переливания крови МЗ РФ, НИИ особо чистых биопрепаратов (Санкт-Петербург)).
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ.
Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, общего заключения и выводов; включает 12 таблиц, 18 рисунков и список литературы, содержащий 222 источника, в том числе 164 зарубежных.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Фаенкова, Вера Петровна
6. ВЫВОДЫ
1. Разработан способ выделения и очистки цистеиновых катепсинов из почки человека, обеспечивающий сокращение и упрощение процедуры очистки, а также существенное увеличение выхода ферментативной активности.
2. Цистеиновые катепсины из почки человека не вызывают инактивации очищенных препаратов С1-ингибитора и фактора D системы комплемента, препаратов тромбина и плазмина, а также не вызывают лизиса фибринового сгустка.
3. Показатель Тплато на турбидиметрической кривой свертывания крови -фибринолиза находится в обратной зависимости от концентрации интактной стрептокиназы и может быть использован для исследования катаболизма активаторов плазминогена.
4. Стрептокиназа является хорошим субстратом для действия цистеиновых катепсинов из почки человека и подвергается глубокому протеолизу до низкомолекулярных пептидов.
5. Динамика изменения функциональной активности стрептокиназы и появления продуктов протеолиза в ходе инкубации препарата с цистеиновыми катепсинами свидетельствует о ведущей роли катепсина В в деградации этого белка.
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Цистеиновые катепсины играют ведущую роль в лизосомальном протеолизе. Поскольку эти протеиназы обладают широким спектром действия в отношении белковых субстратов, можно предположить их участие в катаболизме компонентов протеолитических систем.
В настоящей работе нами усовершенствован метод выделения цистеиновых катепсинов, источником ферментов служили почки человека, полученные в ранние сроки после вскрытия.
В ходе выделения и очистки катепсинов мы произвели замену этапа фракционирования экстракта ткани сульфатом аммония процедурой ионообменной хроматографии. Это позволило не только сократить и упростить метод выделения и очистки цистеиновых катепсинов, но и увеличить выход ферментов. На этом этапе очистки выход ферментов достиг. 130-160%, в то время как в общепринятых процедурах выделения цистеиновых катепсинов [53, 74, 169, 176, 200] после высаливания сульфатом аммония он составлял всего 30-60%.
Разработанная нами схема очистки цистеиновых катепсинов может быть применена в качестве основной процедуры для получения отдельных катепсинов. Кроме того, суммарно цистеиновые катепсины весьма перспективны в качестве лекарственных препаратов. В настоящее время для очистки ран широко применяют трипсин [8,14, 56, 57]. Подобно трипсину, цистеиновые катепсины обладают широкой субстратной специфичностью. Их преимуществом перед трипсином является большой диапазон рН-оптимума в кислой среде, которая характерна для очагов воспаления. В дополнение к этому, как это было нами показано, препараты цистеиновых катепсинов чрезвычайно стабильны при хранении.
Возможность применения цистеиновых катепсинов в медицине делает проблему изучения их субстратной специфичности еще более актуальной. В настоящее время описано небольшое количество белковых субстратов цистеиновых катепсинов (Таблица 1). Мы попытались расширить перечень возможных объектов лизосомального цистеинового протеолиза за счет компонентов протеолитических систем крови, катаболизм которых в настояшее время мало изучен. У всех исследованных нами белков имеются потенциальные сайты для действия цистеиновых катепсинов (Таблица 3 ). Возможное действие протеаз можно было оценить в функциональных тестах. Один из функциональных тестов, а именно, способ определения активности стрептокиназы на основе турбидиметрической регистрация процесса свертывания и лизиса фибринового сгустка был разработан нами. Этот метод прост в исполнении и может быть использован для определения и других активаторов плазминогена. Он был применен, наряду с другими стандартными лабораторными тестами для оценки коагуляционного статуса и фибринолиза у больных с механическими искусственными клапанами сердца.
Инкубация компонентов комплемента (фактор D, С1-ингибитор) с цистеиновыми катепсинами не повлекла за собой изменений функционирования системы. По-видимому, цистеиновые катепсины не играют решающей роли в катаболизме этих белков. И хотя в нашем исследовании не удалось получить информации о механизмах лизосомальной деградации компонентов комплемента, выявленный нами факт устойчивости белков этой системы к цистеиновым катепсинам можно рассматривать как благоприятный в случае их использования для местной энзимотерапии.
После обработки цистеиновыми катепсинами плазмы крови нами не было выявлено изменения ни показателей свертывания, ни показателей фибринолиза. Также не было зарегистрировано каких-либо изменений показателей свертывания после предварительной обработки цистеиновыми катепсинами препарата тромбина, используемого для активации свертывания. Кроме того, нами было показано, что плазмин полностью сохранял свою эстеразную активность после обработки цистеиновыми катепсинами.
По данным литературы, только один из белков системы гемостаза, а именно, фибриноген был испытан в качестве субстрата катепсина В. Авторы [92, 117] описали , что катепсин В, полученный из печени человека вызывает деградацию in vitro как дегликозилированного, так и гликозилированного фибриногена. В нашем случае, цистеиновые катепсины не вызывали лизиса сформированного в ходе свертывания фибринового сгустка. Поскольку фибриноген подвергается катаболизму в кровяном русле, вряд ли его гидролиз цистеиновыми катепсинами играет существенную роль.
В противоположность эндогенным белкам протеолитических систем экзогенный активатор плазминогена - стрептокиназа - подвергалась быстрой инактивации в ходе ее обработки цистеиновыми катепсинами.
Это проявлялось в изменении показателей фибринолиза, а затем и в полном его прекращении. Разработанный нами метод регистрации функциональной активности стрептокиназы позволил наблюдать за динамикой процесса. При исследовании характера изменения показателей фибринолиза от продолжительности обработки стрептокиназы (250 ME) цистеиновыми катепсинами (0,2U) нами было установлено, что первоначально (10 - минутная обработка) отмечается увеличение только одного показателя - Тплато - времени сохранения максимума светопоглощения. Так как этот показатель характеризует процесс образования и накопления активного плазмина, то есть зависит от количества молекул стрептокиназы, способных образовать активаторный комплекс, то его увеличение свидетельствует о том, что первоначально происходит снижение скорости активации плазминогена из-за уменьшения количества функционально активных молекул стрептокиназы. Однако, на первоначальном этапе обработки их еще достаточно, чтобы активировать весь имеющийся плазминоген. Это подтверждается неизменностью времени и максимальной скорости лизиса (показатели - Тлиз и Улиз). Указанные величины определяются количеством активного плазмина, образованного из плазминогена под действием активаторного комплекса. При увеличении продолжительности обработки стрептокиназы (18 мин) препаратом катепсинов наряду с дальнейшим увеличением показателя Тплато происходит и заметное увеличение показателя Тлиз (времени лизиса), то есть снижение скорости фибринолиза. Это можно объяснить уменьшением не только скорости образования комплекса стрептокиназа-плазминоген, но и количества активированного плазмина. Таким образом, в этот период процесс образования активированного плазминогена начинает лимитироваться количеством функционально активной стрептокиназы. После 30 минутной обработки стретокиназы лизиса сгустка не наблюдается, то есть она полностью теряет свою плазминоген - активирующую способность.
Исследование зависимости показателей фибринолиза от количества цистеиновых катепсинов, использованных для обработки стрептокиназы (в диапазоне концентраций от 50 до 400 mU, при 10-мин. инкубации) выявило линейную зависимость в отношении показателя ТплаТо (времени сохранения максимума светопоглощения). Поскольку, величина этого показателя наиболее точно отражает количество активной стрептокиназы в системе, была рассчитана удельная активность цистеиновых катепсинов в отношении стрептокиназы. Она составила (3900+110) ME " мин*1 ' мг"1 белка препарата цистеиновых катепсинов.
Изменения же показателя Тлиз (времени лизиса) в зависимости от количества катепсинов имела "пороговый" характер: при уровне катепсинов от 50 до 200 mU время лизиса сохранялось неизменным, а при дальнейшем увеличении количества ферментов этот показатель начинал возрастать.
После обнаружения инактивации стрептокиназы при ее обработке цистеиновыми катепсинами нами была исследована связь динамики процесса с протеолизом белка.
С помощью электрофореза и гель-фильтрации нами было установлено, что стрептокиназа действительно подвергается глубокому протеолизу под действием цистеиновых катепсинов, в то время как в контроле она сохраняет первоначальную активность и не подвергается спонтанному распаду в течение как минимум 120 мин. Обработка стрептокиназы препаратом цистеиновых катепсинов приводила к постепенному разрушению белка. Первоначально, наряду с неповрежденными молекулами стрептокиназы (89 кДа), обнаруживались низкомолекулярные неактивные пептиды (4,5-8,5 кДа) и достаточно крупные фрагменты (около 50 кДа), возможно еще обладающие плазминоген-активирующей способностью. Последние в дальнейшем также подвергались распаду до более мелких неактивных фрагментов (32 кДа). В результате исчерпывающего протеолиза в среде оставались только неактивные низкомолекулярные пептиды.
Как известно [108, 163, 183], активация плазминогена идет только в составе активаторного комплекса со стрептокиназой. В литературе [98, 104] имеются данные о том, что для образования полноценного активаторного комплекса необходимо наличие всех трех (а, Р, у) доменов стрептокиназы. у -Домен участвует в экспонировании активного центра в плазминогене активаторного комплекса, а а - домен участвует в связывании интактного плазминогена. Последний под действием активаторного комплекса превращается в активный плазмин, способный расщеплять фибрин, но не способный к аутокатализу. Известно также [116, 183], что утрата аминокислот (15 и 20, соответственно) с N - и С — концевых частей не отражается на функциональной активности стрептокиназы. А более короткие фрагменты [205] являются неактивными.
Анализ первичной структуры стрептокиназы показывает, что в концевых областях имеются связи, образованные парами основных аминокислот. Такие же связи имеются в а-домене, между участками связывания с интактным плазминогеном и плазминогеном комплекса. Полученные нами данные о динамике изменения активности стрептокиназы при ее обработке цистеиновыми катепсинами и о характере продуктов протеолиза свидетельствуют о том, что первоначально расщепление идет в ее концевых областях. Как известно [79, 80], наибольшую специфичность к таким связям имеет катепсин В, который является основным компонентом полученного нами препарата цистеиновых катепсинов.
Стрептокиназа широко применяется в медицине в качестве тромболитика. Известно, что время ее существования в кровяном русле находится в диапазоне 1-3 часов [50]. После введения стрептокиназы возникает несколько разных конкурирующих биохимических механизмов [50]. Она связывается с циркулирующим плазминогеном с образованием активаторного комплекса, который адсорбируется на фибрине. Кроме того, часть стрептокиназы может связываться с антителами, и образующиеся иммунные комплексы удаляются из кровотока. Можно предположить, что эти комплексы подвергаются эндоцитозу и дальнейшей деградации в лизосомах. По данным [116], некоторое количество белка подвергается частичному протеолизу в комплексе с плазмином. Однако, этот процесс отличается низкой скоростью: за 2 часа инкубации наблюдали частичный протеолиз примерно 25% стрептокиназы. В наших же экспериментах за 30 минут происходила глубокая деградация стрептокиназы с образованием низкомолекулярных пептидов. Наши данные позволяют объяснить быструю инактивацию стрептокиназы in vivo ее лизосомальным протеолизом.
Имеющиеся в настоящее время в литературе данные о белковых субстратах цистеиновых катепсинов не достаточны для широких обобщений по этому вопросу. Наши исследования позволили исключить ряд белков (фактор D и С1-ингибитор комплемента, плазмин, тромбин, фибрин) из числа возможных объектов действия цистеиновых катепсинов и включить в перечень их субстратов (Табл. 1) еще один белок, а именно стрептокиназу. Стрептокиназа в качества субстрата цистеиновых катепсинов имеет целый ряд преимуществ по сравнению с другими белками. Первое преимущество связано с доступностью этого белкового препарата, производство которого во всем мире осуществляется в широких масштабах. Во-вторых, процесс протеолиза стрептокиназы происходит достаточно быстро - в течение нескольких минут, в то время как протеолиз наиболее широко применяемых субстратов, таких как (азо)казеин, гемоглобин, альбумин, протамин и гистоны, осуществляется медленно, в течение нескольких часов [5, 39, 77, 80]. Кроме того, нами разработан метод определения стрептокиназы по ее функциональной активности. Метод характеризуется простотой исполнения и является строго количественным. С помощью предложенного нами метода можно исследовать протеолиз стрептокиназы и под действием других ферментов, а также изучать процесс катаболизма и других активаторов плазминогена.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фаенкова, Вера Петровна, Санкт-Петербург
1. Азарян А. В., Галоян А. А. Катепсин В головного мозга как дипептидилкарбоксипептпдаза, превращающая провазопрессорные, проопиоидные и модельные пептиды // Вопр. мед. химии. — 1987. - Т. 33, вып. 5.-С. 78-81.
2. Айсина Р. Б., Житкова Ю. В., Федоренко Я. Э., Казанская Н. Ф. Каталитические свойства плазмина и эквимолярного комплекса плазмин стрептокиназа в реакциях с различными субстратами и ингибиторами // Укр. биох. журн. - 1991.- т. 63, №1. - С. 13-20.
3. Активация ключевых проферментов системы свертывания крови Е — фрагментом фибрина / Платонова Т. М., Сломинский О. И., Черниченко Т. М. и др. // Укр. биох. журн. 2002. - т. 74, №2. - С. 25 -29.
4. Андреенко Г. В. Регуляция фибринолиза в экспериментальных услових В сб: Стрептокиназа и другие протеолитические ферменты (Биосинтез, очистка, экспериментальные и клинические испытания) -Минск.-1979.-С. 10-26.
5. Баррет А. Д., Хит М. Ф. Лизосомальные ферменты В кн.: Лизосомы. Методы исследования. - М.: Мир. - 1980. - С. 25 - 156.
6. Баскова И. И. Белки системы гемостаза - В кн.: Белки и пептиды: В 2т. отв. ред. Иванов В. Т., Липкин В. М. - М.: Наука. - 1995. - Т. 1. - С. 397-419.
7. Белицер В. А. Домены крупные, функционально важные блоки молекул фибрина // Биох. человека и животных. - 1982. - №6. -С. 38 - 57.
8. Березов Т. Т. Применение ферментов в медицине // Соросовский образовательный журнал 1996. - №3. - С. 23 - 27.
9. Бышевский А. Ш., Мухачева И. А., Терсенов О. А., Кинетика активации протромбина фактором Ха // Укр. биох. журн. — 1981. -т. 53, №4.- С. 30-34.
10. Бышевский A. ILL, Галян С. JI. Витамин К зависимые белки системы свертывания крови // Успехи соврем, биол. - 1983. - №2. — С. 272 -280.
11. Бышевский A .ILL, Терсенов О. А., Галян С. JL, Чирятьев Е. А., Левен П. И. Биохимические компоненты свертывания крови // Свердловск: Из-во Урал. Ун-та, 1990. 212 с.
12. Галебская Л. В. Регуляция и саморегуляция альтернативного пути активации комплемента: Автофер. дисс. докт. мед. наук. СПб. - 1996. -31 с.
13. Галебская Л. В., Щербак И. Г., Бельтюков П. ., Рюмина Е. В. Строение и свойства протеиназ системы комплемента // Укр. биохим. журнал 1990. - Т 62. - № 6. - С. 5 - 15.
14. Даниличев В. Ф. Офтальмология: Энзимотерапия и экстракорпоральная гемокоррекция. Руководство для врачей СПб.: Гуманистик. -2002.-310 с.
15. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты М.: Мир. - 1982. - 118 с.
16. Дилакян Э.А. Цистеиновые протеиназы при неопластической трансформации // Вопр. мед. химии. 2001. - Т. 47, вып. 1. - С. 490491.
17. Дин Р. Процессы распада в клетке. М.: Мир, 1981. - 120 с.
18. Дорофейков В. В. Влияние некоторых факторов на функциональную активность первого компонента комплемента человека: Авторефер. дисс. канд. мед. наук. СПб. - 1992. - 19 с.
19. Дорофейков В. В. Белок белковые взаимодействия альфа — 2 — макроглобулина человека и их функциональные последствия: Авторефер. дисс. докт. мед. наук.- С.П. - 2000. - 34 с.
20. Жорданиа JI. С., Козырева Е А., Басалык К. И. и др. Прогностическое значение определения активности катепсина В в злокачественных опухолях яичников // Вопр. мед. химии. 1994. — Т. 40, № 1. — С. 25 -27.
21. Кинины и сердечно-сосудистая система / Медведев М. А., Киселев В. И., Панченко A. JI и др.//Новосибирск. Наука.- 1992. - 190 с.
22. Кирпиченок JI. Н., Гидранович Л. Г., Шиленок В. Н. Активность протеолитических процессов при заболеваниях щитовидной железы / Вопр. мед. хим. 2000. - 46, вып. 5 - с. 518-519.
23. Козлов JI. В., Соляков JT. С. Получения из сыворотки крови человека факторов В и D альтернативного пути активации комплемента // Биоорганическая химия. 1982. - т.8, №3. - с. 342 - 348.
24. Козлов JI. В. Белки системы комплемента. В кн.: Белки и пептиды: В 2т. отв. ред. Иванов В. Т., Липкин В. М. М.: Наука. - 1995. - Т.1. - С. 385 - 396.
25. Концентрационно функциональные взаимодействия в альтернативном пути активации комплемента / Галебская Л. В. и др. // Биохимия. - 1993.-т.5, вып. 11. - С. 1796- 1800.
26. Короленко Т. А. Катаболизм белка в лизосомах Новосибирск: «Наука».-1990.- 189 С.
27. Лежен Т. И., Соколовская Л. Т., Прусская В. В., Кудинова С. А. Турбидиметрический экспресс микрометод одновременной оценки параметров свертывания и фибринолиза в плазме крови // Укр. биох. журн. - 1993. - т. 65, № 2. - С. 23 - 30.
28. Локшина Л. А., Гуреева Т. А., Лубкова О. Н., Орехович В. Н. Характеристика двух активных в нейтральной среде тиоловых протеиназ селезенки // Биохимия. 1982. - Т. 47, № 6. - С. 1299 -1307.
29. Локшина Л. А. Протеолитические ферменты в процессах онкогенеза // Вопр. мед. хим. 1991.-Т. 37, №6.-С. 15-21.
30. Лычев В. Г. Диагностика и лечение диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови -М.: Медицина. 1993. - 160 с.
31. Макогоненко Е. М. Трехмерная модель молекулы фибрин(оген)а и фибриновых фибрилл // Укр. биох. журн. 1997. - т. 69, №5 - С. 2432.
32. Максименко А. В., Тищенко Е. Г. Комбинированный тромболизис — новое направление исследования активаторов плазминогена третьего поколения // Вопр. биол. мед. и фарм. химии. 2000. - №1. - С. 6 - 10.
33. Маянская Н. Н., Панин Л. Е., Николаев Ю. А. и др. Некоторые механизмы вовлечения лизосом в процессы тканевого повреждения // Вопр. мед. хим. 1990. - Т. 36, № 6. - С. 5 - 8.
34. Медведь Л.В. Структурная организация молекулы фибриногена // Укр. биох. журн. 1985. - т. 57, №5. - С. 36-49.
35. Медведь JI. В., Новохатний В. В., Привалов П. Л. Получение и исследование структурной организации D фрагмента молекулы фибриногена // Молек. биол. — 1982. - вып. 6. - С. 1195 - 1202.
36. Мосолов В. В. Белки ингибиторы протеолитических ферментов. - В кн.: Белки и пептиды: В 2т. отв. ред. Иванов В. Т., Липкин В. М. - М.: Наука. - 1995. -Т. 1. - С. 170 - 182.
37. Никандров В. Н. Значение исследований структурно-каталитической специфики стрептокиназы для технологии получения ее препаратов. В сб: Стрептокиназа в регуляции свертывающей и противосвертывающей систем крови. Минск. — 1985. —С. 43 -58.
38. Никандров В. Н. Структурная организация молекулы стрептокиназы // Биоорг. химия. 1993. - С. 169 - 179.
39. Никандров Н. Н. Протеолитическое действие катепсина В на гистоны тимуса теленка: Авторефер. дисс. канд. биол. наук.- Л. 1986. - 22 с.
40. Остерман Л. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: "Наука" 1985. - 536 с.
41. Панин Л. Е., Маянская Н. Н. Лизосомы: роль в адаптации и восстановлении - Новосибирск: «Наука».- 1987.-73 с.
42. Панченко Е. Н. Тромболитические средства // Клиническая фармакология и терапия. 1998. - Т. 7, № 1.
43. Сазонова И. Ю., Айсина Р. Б., Мухаметова Л. И., Варфоломеев С. Д. Кинетические свойства активаторных комплексов плазмин -стафилокиназа и плазмин(оген) стрептокиназа in vitro // Биохимия. - 1999. -Т. 64, вып. 1 - С. 83 - 93.
44. Симкина Н Б. Многообразие проявлений антипротеолитического действия С1-ингибитора в системе комплемента: Авторефер. дисс. канд. мед. наук.- СПб. 2001. - 19 с.
45. Скоупс Р. Методы очистки белков М.: "Мир". - 1985. - 358 с.
46. Соляков JI. С., Козлов JI. В. Эффективный метод одновременного получения из сыворотки крови человека высокоочищенных факторов В и D альтернативного пути активации комплемента // Биоорганическая химия. 1983. - Т.9, N 4. - С. 462 - 469.
47. Способ получения микробного ингибитора протеолитического фермента террилитина / Кашкин А. П., Стати JI. Б., Дмитриева Г. В. и др. А.С. 777058 СССР. - Опубл. 07.11.80. С12Д 13/00 - Бюл.№41.
48. Струкова С. М. Тромбин регулятор процессов воспаления и репарации тканей // Биохимия.— 2001. — т. 66, вып. 1.- С.14-27.
49. Тутельян В. А., Гуткин Д. В., Васильев А. В. Современные представления о биогенезе лизосомальных белков в норме и при паталогии // Вопр. мед. химии. — 1992. Т. 38, вып.25. - С. 4 - 13.
50. Фибринолиз. Современные фундаментальные и клинические концепции. Под. ред. П. Дж. Гаффни, С. Балкув Улютина. - М., Медицина. - 1982. - 240 с.
51. Халяпин Б. Д., Прокопьев А. А., Кинетический метод количественного определения комплемента // Иммунология. 1986. -№ 3. - С. 66 - 69.
52. Хомяков Ю. Н., Надежкина А. В., Северин С. Е. Тромбин: биологическое значение и пути регуляции активности // Вопр. биол. мед. и фарм. химии. 2000. - №3. - с. 3 - 14.
53. Щербак И. Г., Жлоба А .А. Активация катепсина В восстановленными формами пиридиннуклеотидов и тиоловыми соединениями -Биохимия. 1979.- Т. 44, №12.- С. 2218-2226.
54. Щербак И. Г., Никандров Н. Н., Фаенкова В. П., Кирпиченок JI. Н. Исследование продуктов протеолитического действия катепсина В на некоторые белковые субстраты // Вопр. мед. химии. — 1987. — Т. 33, вып. 5. С. 115-119.
55. Щербак И. Г. Протеолитический каскад каскад порогов // Ученые записки: Изд. СПбГМУ им.акад. И. П. Павлова. - 1997. - Т.4, № 1. - С. 43 - 50.
56. Эфендиев А. И., Толстых П. И., Дадашев А. И., Марщава О. М. Местная пролонгированная энзимотерапия гнойных // Хирургия. -1992.-№7.-С.48 -50.
57. Яковенко Э. П. Ферментные препараты в клинической практике // Клинич. фармакология и терапия. 1998. - Т. 1 - С . 17-20.
58. Яровая Г. А. Калликреин кининовая система: новые факты и концепции //Вопр. мед. химии. —2001. - Т. 47, вып.1. - С. 20 - 42.
59. A new purification procedure of human kidney cathepsin H, its properties and kinetic data / Popovic Т., Brzin J., Kos J., et al. // Biol. Chem. Hoppe Seyler. 1988.-V. 369.- P. 175-183.
60. A selective inhibitor of cathepsin В in vivo / Towatari T. et al. // FEBS Lett. 1991.-V. 280.- P. 311 -315.
61. Abrahamson M, Alvarez-Fernandez M, Nathanson С. M. Cystatins // Biochem Soc Symp. 2003. - V. 70. - P. 179-199.
62. Action of cathepsin L on oxidized В chain of bovine insulin /KargelH. J., Dettmer R., Etzold G. et al. // FEBS Lett. - 1980. - V. 114, N2. - P. 257 - 260.
63. Action of human liver cathepsin В on the oxidized insulin В chain / Mc Kay M. J., Offermann M. K., Barrett A. J., Bond J. S. // Biochem. J. -1983. V. 213, N2. - P. 567 - 571.
64. Al Jassabi S. Purification and characterization of cathepsin L from skeletal muscle of the lizard Agama stellio stellio // Biochemistry. - 2000.- V. 65, N 8. P. 959 - 962.
65. Alvin E., Davis A. E. CI inhibitor and hereditary angioneurotic edema // Ann. Rev. Immunol. 1988. - V.6. - P. 595 - 628.
66. Amino acid sequens of human D of the alternative complement pathway / Niemann M. A., Brown A. S., Bennett J. S. et al. // Biochemistry. 1984.- V. 23, №1. P. 2482-2486.
67. Amino acid sequens of the human kidney cathepsin H and L / Ritonja A., Popovic Т., Kotnik M. et al. // FEBS Lett. 1988. - V. 228. - P. 341 -345.
68. Arlaud G. J., Reboul A., Meyer C., Colomb M. G. Purification of proenzymic and activated human Cls free of Clr. Effects of calcium and ionic strength on activated Cls // Biochim. Biophis. Acta. 1977. - V. 485, № 1. -P. 215 -226.
69. Arlaud G. J., Sim R. В., Duplaa A., Colomb M. G. Differential elution of Clq, Clr and Cls from human CI bound to immuno aggregates // Mol. Immunol. 1979. - V. 16, №7. - P. 445-450.
70. Aronson N. N., Barrett A. J. The srecifity of cathepsin В // Biochem. J. -1978.-V. 171.- P. 759-765.
71. Astrup T. S. Arch. Biohem. Biophys. - 1952. - V. 40, №2. - P. 345-351.
72. Azaryan A, Barkhudaryan N, Galoyan A. Some properties of human and bovine brain cathepsin В // Neurochem Res. 1985. - V. 10. - P. 1511 -1524.
73. Azaryan A, Galoyan A. Human and bovine brain cathepsin L and cathepsin H: purification, physico-chemical properties, and specificity // Neurochem Res.- 1987. -V.12, N2.- P. 207-213.
74. Baici A., Gyger Marazzi M. The slow, tight-binding inhibition of cathepsin В by leupeptin // Eur. J. Biol. Chem. - 1982. - V. 129, № 1. -P. 33-41.
75. Bansal R. In vitro conversion proinsulin to insulin by cathepsin В antibodies // Acta diabetol. Lat. 1980. - V. 17, N 3 - 4. - P. 255 - 256.
76. Barrett A. J. Human cathepsin Bl. Purification and some properties of the enzyme // Biochem J. 1973. - V. 131, N4.- P. 809 - 822.
77. Barrett A. J. Cathepsin В and other thiol proteinase In: Proteinases in mammalian cells and tissues — Amsterdam — Elsevier. North - Holland Biochemical Press. - 1977. - P. 181 -208.
78. Barrett A. J. Protein degradation in health and disease. Introduction: the classification of proteinases // Ciba. Found. Symp. 1979. - V. 75. - P. 1 -13.
79. Barrett A. J. Fluorimetic assays for cathepsin В and cathepsin H with methil-coumarylamide substrates // Biochem. J. 1980. - V. 187, №3. -P. 909-912.
80. Barrett A. J., Kirschke H. Cathepsin B, cathepsin H and cathepsin L // Meth. Enzymol. -1981. -V. 80.- P. 535 -561.
81. Barrett A. J. The cystatins: A diverse superfamily of cysteine peptidase inhibitors // Biomed. Biochem. Acta. 1986. - V. 45, № 11 - 12. - 1363 -1374.
82. Bell W. R. Therapeutic agents pharmacokinetics and pharmacodynamics // Rev. Cardiovasc. Med. - 2002. - V. 3, Suppl 2. - P. 34 - 44.
83. Bedi G. S, Balwierczak J., Back N. Rodent kinin forming enzyme systems - I. Purification and characterization of plasma kininogen // Biochem. Pharmacol. - 1983. - V. 32. -P. 2061 - 2069.
84. Biochemical properties and intracellular processing of lysosomal cathepsins В and H / Nishimura Y., Tsuji H., Kato K. et al. // Biol Pharm. Bull.-1995.-V. 6. P. 829 - 836.
85. Bode W., Huber R. Natural protein proteinase inhibitors and their interaction with proteinases // Europ. J. Biochem. — 1992. V. 204, № 2. -P. 433 -415.
86. Bretz U., Dewald В., Ruch W. Cellular mechanisms of proteinases release from inflammatory cells and the degradation of extracellular proteins In: Protein degradation in Health and Disease. Amsterdam - 1980. - P. 105 -121.
87. Bock S. C., Skriver K., Nielsen E., Thogersen H.C. et al. Human CI inhibitor: primary structure, cDNA cloning, and chromosomal ocalization // Biochemistry. 1986. - V. 25. - P. 4292 - 4301.
88. Brower M. S., Harpel P. C. Proteolytic cleavage and inactivation of 2-plasmin inhibitor and CI inactivator by human polymorphonuclear leukocyte elastase // J. Biol. Chem. 1982. - V. 257. - P. 9849 - 9854.
89. Burleigh M. C., Barrett A. J., Lazarus G. S. Cathepsin Bl. A lysosomal enzyme that degrades native collagen // Biochem J. 1974. - V. 137.1. P. 387-398.
90. Carbohydrate composition of the second, third and fitht components and factors В and D of human complement / Towana M., Niemann M. A., Garner G. et al. // Mol. Immunol. 1985. - V. 22, №2.-P. 107-111.
91. Carrell R. W., Boswell D. R. Serpins: the superfamily of serine protease inhibitors // Proteinase Inhibitors. 1986. - P. 403 -420.
92. Catabolitic properties of aglycofibrinogen synthesized by tunicamycin-treated human hepatoma (HepG2) cells and rabbit hepatocytes / Barsigian C., Gilman P., Base W. et al. // Biochim. Biophis. Acta. 1986. - V. 833, № 1. - P. 552-558.
93. Catanese J., Kress L. F. Enzymatic inactivation of human plasma CI -inhibitor and 1 antichimotrypsin by Pseudomonas aeroginosa proteinase and elastase // Biochem. Biophys. Acta. - 1984.- V. 789. - P. 37-43.
94. Cathepsin В and L in sinovial fluids from patients with rheumatoid arthritis and the effect of cathepsin В on the activation of pro — urokinase / Ikeda Y., Ikata M., Mihiro T. et al. // J. Med. Invest. 2000. - V.47.-P. 61 -75.
95. Cathepsin В indicator for the release of lysosomal cysteine proteinases in severe trauma and inflammation / Assfalg - Machleidt I., Jochum M., Nast - Kolb D. et al. // Biol Chem Hoppe Seyler. - 1990. - V. 371, Suppl. - P. 211 -222.
96. Cathepsin H: an endoaminopeptidase from rat liver lysosomes / Kirschke H., Langner J., Wiederanders B. // Acta. Biol. Med. Ger. 1977. - V. 36. -P. 185-199.
97. Cathepsin L. A new proteinase from rat-liver lysosomes / Kirschke H., Langner J., Wiederanders B. et al. // Eur. J. Biochem. 1977. - V. 74. P. 293-301.
98. Chimerism reveals a role for the streptokinase Beta domain in nonproteolytic active site formation, substrate, and inhibitor interactions / Gladysheva I. P, Sazonova I. Y, Chowdhry S. A, et al // J. Biol. Chem. -2002.-V. 277.- P. 26846-26851.
99. Characterization of porcine plasma fibronectin and its fragmentation by porcine liver cathepsin В / Isemura M., Yosizawa Z., Takahashi K. et al. // J. Biochem. 1981. - V. 90, № 1. - P. 1 - 9.
100. Cicardi M., Mannucci P. M., Castelli R., Rumi M. G., Agostoni A. Reduction in transmission of hepatitis С after the introduction of a heat-treatment step in the production of CI inhibitor concentrate // Transfusion.- 1995.- V.35,N.3.- P.209-212.
101. Complement actuvation by the alternative pathway is modifld in renal failure: the role of D / Pascual M., Paccaud J. P., Macon K. et al. // Clin. Nephrol.- 1989.-V. 32, № 4.-P. 185 193.
102. Concentrations of lysosomal cysteine proteases are decreased in renal cell carcinoma compared with normal kidney / Kirschke H., Clausen Т., Gohring B. D., et al. // J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 1998. - V. 124. P. 60-61.
103. Cristal structure of the Catalitic Domain of Human Plasmin Complexed with Streptokinase / Wang X., Lin X., Loy J. A. et al. // Science. 1998. - V. 281. - P. 1662 - 1665.
104. Cysteine Proteinases and Inhibitors. / Machleidt W., Machleidt J., Muller-Esterl W. et al. In: Proc. Int. Symp., Portoroz, Sept. 15 - 18, 1985. Berlin; New York. - 1986. - p. 705 - 717.
105. Degradation of exracellular-matrix proteins by cathepsin В from normal and tumour tissues / Buck M. R., Karustis D. G., Day N. A. et al. // Biochem J. 1992. - V. 282. - P. 273 - 278.
106. Determination of cathepsin В and H in sera and synovial fluids of patients with diffent joint diseases / Gabrijelcic D., Annan-Pran A., Rodic B. et al. // J .Clin. Chem. and Clin. Biochem. 1990. - V. 28, №3. -P. 149- 153.
107. Domain interactions between streptokinase and human plasminogen.1.y J. A, LinX, Schenone M., et al. // Biochemistry. 2001. - V. 40. - P. 14686-14695.
108. Ericksson L. E., Glaumann H. // Plasma protein secreted by the liver London.; N. - Y.: Acad. Press. - 1983. - P. 55 - 94.
109. Etherington D. J. Bovine spleen cathepsin B1 and collagenolytic cathepsin. A comparative study of the properties of the two enzymes in the degradation of native collagen // Biochem J. 1976. - V. 153, N. 2. - P. 199209.
110. Evans P., Etherington D. J. Characterisation of cathepsin В and collagenolytic cathepsin from human placenta // Eur. J. Biochem. 1978. - V. 83, N. 1. - P. 87 - 97.
111. Evidence for the interaction of valine — 10 in cystatin С with the S2 subsite of cathepsin В / Lindahl P., Ripoll D., Abrahamson M. et al. // Biochemistry. 1994. - V. 33, №14. - P. 4384 - 4392.
112. Faktor D in the alternative pathway of complement activation, physicochemical characterization and functional role / Dierich M.P., Hadding U., Konig W. et al. // Immunochemistry. -1974. V. 11. - № 9. -P. 527 - 532.
113. Fuchs R., Machleidt W., Gassen H.G. Molecular cloning and secuencing of cDNA coding for mature human kidney cathepsin H // Biol. Chem. Hoppe Seyler. - 1988. - V. 369. - P. 469 - 475.
114. Function of streptokinase fragments in plasminogen activation / Shi G.Y., Chang В. I., Chen S. M. et al. // Biochem. J. 1994. - V. 304. - P. 235-241.
115. Gabrijelcic D., Gollwitzer R., Popovic Т., Turk V. Proteolitic cleavage of human fibrinogen by cathepsin В // Biol. Chem. Hoppe -Seyler 1988. - V. 369. - P. 287 - 292.
116. Gray R. J. Texas Heart Institute Journal. - 1996. - V. 23. - p. 36 -41.
117. Generation of matrix-degrading proteolytic system from fibronectin by cathepsins B, G, H, L / Blondeau X., Lambert V. S., Emod I. et al. // BioI.Chem. Hoppe-Seyler. 1993. - 374, № 8. - P. 651 - 656.
118. Hager К., Nenfanger S., Vogle Т., Piatt D. Age-dependency of the fibrinolytic system // Blut. 1990. - V. 60. - N. 2. - P. 115 - 120.
119. Hanada K.} Tamai M., Adachi T. et al. // Proteinase inhibitors: Medical and biological aspects Tokyo: Japan Sci. Soc. Press; Berlin: Springer - Verlag. - 1983. - P. 25-36.
120. Нага K., Kominami E., Katunuma N. Effect of proteinase inhibitors on intracellular processing of cathepsin В, H and L in rat macrophages // FEBS Lett. 1988. - V. 231. - P. 229 - 231.
121. Harpel P.C., Cooper N.R., Studies on human plasma Cl-inactivator-enzyme interactions. 1. Mechanisms of interaction with С Is, plasmin and trypsin // J. Clin. Invest. 1975. - V. 55. - P. 593 - 604.
122. Hashida S., Towatari Т., Kominami E., Katanuma N. Inhibition by E-64 derivatives of rat liver cathepsin В and cathepsin L in vitro and in vivo // J. Biochem. 1980. - V. 88, N. 6. - P. 1805- 1811.
123. Hill R. E., Shaw P. H., Boyd P. A., Baumann H., Hastie N. D. Plasma protease inhibitors: divergence within the reactive centre region // Nature. -1984.- V.311.-P. 175- 177.
124. Hu L.-Y., Abeles R. H. Inhibition of cathepsin В and papain by peptidyl a ketoeters, a keto amides, a - diketones, and a — ketoacid // Arch. Biochem. and Biophys. - 1990. - V. 281, № 2. - P. 271 - 274.
125. Human cisteine proteinases and their protein inhibitors stefms, cystatins and kininogens / Turk V., Brzin G., Kotnik M. et al. // Biomed. Biochem. Acta. - 1986. -V.45,№11-12. -P. 1375- 1384.
126. Jackson K.W., Tang J. Complete Amino Acid Sequence of Streptokinase and Its Homology with Serine Proteases // Biochemistry. -1982. V. 21, N26. - P. 6620 - 6625.
127. Jarvinen M., Hopsu Havu V. K. Alpha - N - benzoylarginine - 2 -naphthylamide hydrolase (cathepsin Bl?) from rat skin. I. Preliminary experiments with skin extract // Acta Chem. Scand. B. - 1975. - V. 29, N. 6. P. 671 -676.
128. Jonson D. M. A., Gagnon J., Reid К. В. M. Amino acid sequence of human factor D of the complement system, similarity in sequence between factor D and proteases of nonplasma origin // FEBS Lett. 1984. - V. 116, №2. - P. 347-351.
129. Jonson D. M. A., Gagnon J., Reid К. В. M. Factor D in the alternative patway of human complement, purification, aligment and N -terminal acid sequences of the serine residue at active site // Biochem. J. -1980. V. 187, № 3. - P. 863 - 874.
130. Kaplan A. P., Joseph K., Shibayama Y. et. al. Bradykinin formation // Clin. Rev. Aller. Immunol. 1998. - V. 16. - P. 403 - 429.
131. Katayama K., Fujita T. // Biochim. Biophys. Acta. 1974. - V. 336, № 2. - P. 191-200.
132. Kim D. M., Lee S. J., Yoon S. K., Byun S. M. Specificity role of the streptokinase С terminal domain in plasminogen activation // Biochem. Biophys. Res Commun. - 2002. - V. 290, N 1. - P. 585-588.
133. Kim S., Narajana S.V. L., Volanakis J.E. Mutational analysis of the substrate binding site of human complement factor D // Biochemistry. -1994.-V. 33, № 48.-P. 14393 14399.
134. Kim S., Narajana S.V.L., Volanakis J.E. Catalytic role of a surface loop the complement serine protease factor D // J. Immunol. 1995. - V. 154, № 11.-P. 6073-6079.
135. Kinetic study of the interaction between rat haptoglobin and rat liver cathepsin В / Pagano H., Engler R., Gelin M. et al. // Can. J. Biochem. -1980.-V. 58, N5.-P. 410-417.
136. Kininogens as thiol proteinase inhibitors / Sasaki M., Ohkubo I., Hidashiyama S. et al. In: Cysteine Proteinases and Inhibitors. Proc. Int. Symp., Portoroz, Sept. 15 - 18, 1985. Berlin; New York. - 1986. - p. 393 -412.
137. Kirschfink M., Nurnberger W. CI inhibitor in anti inflammatory therapy: from animal experiment to clinical application // Molecular Immunology. - 1999. - V. 36, N. 4 - 5. - P. 225 - 232.
138. Kirschke H. Lysosomal cysteine peptidases and malignant tumours // Adv. Exp. Med. Biol. 1997. - V. 421. - P. 253 - 257.
139. Kirschke H, Schmidt I, Wiederanders B. Cathepsin S. The cysteine proteinase from bovine lymphoid tissue is distinct from cathepsin L (EC 3.4.22.15) // Biochem. J. 1986. -V. 240, N. 2. - P. 455-459.
140. KooistraT., Duursma A. M., Bouma J. M. W., Gruber M. // Biochim. Biophys. Acta. 1980.-V.631, № 3.-P. 439-450.
141. Kress L. F., Catanese J., Hirayama T. Analysis of the effects of snake venom proteinases on the activity of human plasma CI esterase inhibitor, 1-antichymotrypsin, and 2 antiplasmin // Biochim. Biophys. Acta. - 1983. -V. 745.-P. 113-120.
142. Lisosomal cysteine proteinases / Kirschke H., Langner J., Rieman S. et al. In: Protein degradation in Health and Disease. Amsterdam, 1980 . -P. 73 - 93.
143. Localization of cysteine proteinases and an endogenous cysteine proteinase inhibitor in cultured muscle cells / Bird J. W., Wood L., Sohar I., et al. // Biochem. Soc. Trans. 1985. - V. 13, N6.-P. 1018-1021.
144. Maack Т., Johnson V., Kau S. et al. // Kidney Int. 1979. -V. 16, № 3.-P. 251 -270.
145. Mason R. W., Green G. D., Barrett A. J. Human liver cathepsin L // Biochem. J. 1985. - V. 226, N 1. - P. 233 - 241.
146. Membrane permeable fluorogenic rhodamine substrates for selective determination of cathepsin L / Assfalg Machleidt I., Rothe G., Klingel S. et al. // Biol. Chem. Hoppe - Seyler. - 1992. - V. 373, N 7. - P. 433 -440.
147. Molecular cloning of human с DNA for cathepsin K: novel cysteine proteinase predominantly expressed in bone / Ionaka Т., Bilbe G., Ishibashi O. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1995.- V. 206. -P. 89-96.
148. Lepow I. H., Ratnoff O. D., Levy L. R. Studies on the activation of a proesterase associated with partially purified first component of human complement // J. Exp. Med. 1958. - V. 107. - P. 451 - 474.
149. Lowry J. H., Rosebrough N. J., Farr., Randell R. J. Protein measuriment with the Folin reagent // J. Biol. Chem. 1951. - V. 193. - N. 1.- P. 265-275.
150. MacGregor R. R., Hamilton J. W., Shofstall R. E., Gohn D. V. Isolation and characterization of porcine parathyroid cathepsin В // J. Biol. Chem. 1979a. - V. 254, № 11. - P. 4423 - 4427.
151. Medicus R., Chapius R. The physiological mechanism of CI -activation // Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. - 1981. - V. 362, N. 1. - P. 30-35.
152. Nishimura Y., Kawabata Т., Yano S., Kato K. Intracellular processinh and activation of lysosomal cathepsins In.: Soc. Histochem. and Citochem. - Kyoto. - 1989. - P. 53 - 64.
153. Novel physiological functions of cathepsins В and L on antigen processing and osteoclastic bone resorption / Katunuma N., Matsunaga Y., Matsui A. et al. // Adv. Enzyme. Regul. 1998. - V. 38. - P. 235 - 251.
154. Nurnberger W., Heying R., Burdach S., Gobel U. CI esterase inhibitor concentrate for capillary leakage syndrome following bone marrow transplantation // Ann. Hematol. 1997. - V. 75. - N 3. - P. 95 -101.
155. Okada К., Ueshima S., Fukao H., Matsuo O. Analysis of complex formation between plasmin(ogen) and staphylokinase or streptokinase // Arch. Biochem. Biophys. 2001. - V. 393, N. 2. - P. 339 - 341.
156. Okitani A., Matsukura U., Kato H. Purification and some properties of a myofibrillar protein degrading protease, cathepsin L, from rabbit skeletal muscle // J. Biochem. - 1980. - V. 87, N 4. - P. 1133 - 1143.
157. Otto K, Riesenkonig H. Improved purification of cathepsin B1 and cathepsin B2 // Biochim. Biophys. Acta. 1975. - V. 379, N 2. - P. 462 -475.
158. Patston P. A, Hauert J., Michaud M., Schapira M. Formation and properties of CI inhibitor polymers // FEBS Lett. - 1995. - V. 368, N. 3. -P. 401 -404.
159. Pensky J., Levy L. R., Lepow I. H. Partial purification of a serum inhibitor of CI esterase // J. Biol. Chemistry. - 1961. - V. 236, N 6. - P. 1674- 1679.
160. Pike R. N., Coetzer Т. H, Dennison C. Proteolytically active complexes of cathepsin L and a cysteine proteinase inhibitor; purification and demonstration of their formation in vitro // Arch. Biochem. Biophys. -1992. V. 294, N. 2. - P. 623 - 629.
161. Popovic Т., Puizdar V., Ritonja A., Brzin J. Simultaneous isolation of human kidney cathepsins В, H, L and С and their characterisation // J. Chromatogr. Biomed. Appl. 1996. - V. 681, N. 2. - P. 251 - 262.
162. Porter R. R. The proteolytic enzymes of complement system // Meth. Enzymol. 1981. - V. 80. - P. 3 - 5.
163. Prandini M. H., Reboul A., Colomb М. G. Biosynthesis of complement CI inhibitor by HepG2 cells. Reactivity of different glycosylated forms of the inhibitor with Cls // Biochem. J. 1986. - V. 237. - P. 93 - 98.
164. Preparation of novel streptokinase mutant with improved stability / Shi G. Y., Chang В. I., Su S. W. et al. // Thromb. Haemost. 1998. - V. 79, N 5. - P. 990 - 997.
165. Protease Inhibitors / Barrett A. J., Rawlings N. D., Davies M. E. et al. // Elsever Science Publicher BV (Biomedical Division). 1986. - P. 515 -560.
166. Proteolytic activity of human osteoklast cathepsin K. Expressio, purification, activation and substrate indefication / Bossard M. J., Tomaszek T. A., Thompson S. K. et al. // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271.- P. 12517- 12524.
167. Purification and some properties of cathepsin В from rabbit skeletal muscle / Okitani A., Matsuishi M., Matsumoto T. et al. // Eur. J. Biochem.- 1988.-V. 171,N. 1-2.-P. 377-381.
168. Putter J., Otto K. Inaktivierung der L Asparaginase durch Kathepsin // Arzneimittel - Forch. - 1972.- V.22,№10.-S. 1743-1746.
169. Quantification of complement factor D in human cerum by a solid-fase radioimmunoassay / Barnum S. R., Niemann M. A., Kearney J. F. et al // J. Immunol. 1984. - V. 67, №2. - P. 303 - 309.
170. Quinn P. S., Judach J. B. Calcium dependet Golgi - vesicle fusion and cathepsin В in the conversion of proalbumin to albumin in rat liver // Biochem. J. - 1978. - V. 172. - P. 301 - 309.
171. Rawlings N. D., Barret A. J. Evolutionary families of peptidases // Biochem. J. 1993.- V. 290. -P. 205 - 218.
172. Reboul A., Arlaud G. J., Sim R. В., Colomb M. G. A simplified procedure for the purification of CI inactivator from human plasma. Interaction with complement subcomponents Clr and Cls // FEBS Lett. -1977.-V. 79.-P. 45-50.
173. Reboul A., Prandini M., Bensa J., Colomb M. G. Characterisation of Clq, Cls and CI inhibitor synthesized by stimulated human monocytes in vitro // FEBS Lett. 1985. - V. 190. N 1. - P. 65 - 68.
174. Reed G. L., Lin L. F., Parhami Seven В., Kussie P. Identification of a Plasminogen Binding Region in Streptokinase - Plasminogen Activator Complex //Biochemistry.- 1995.-34.-P. 10266- 10271.
175. Reid К. В. M., Porter R. R. The protheolytic activation systems of complement // Annu. Rev. Biochem. 1981. - V. 50. - P. 433 - 464.
176. Salvatierra A., Velasco F. CI esterase inhibitor prevents early pulmonary dysfunction after lung transplantation in the dog // Am. J. Respir. Crit. Care. Med. - 1997. - V. 155, N. 3. - P. 1147 - 1154.
177. Sawicki G., Warwas M. Cathepsin H from human placenta I I Acta. Biochim.- 1989. V. 36, № 3 - 4. -P. 343 -351.
178. Schmidt M. Т., Kirschke H. Degradation of proteoglicans by cathepsin L and H In: Proteinases and their Inhibitors: Regul Cell. Metabol. — Rabko, Yugoslavia - 1990. - № 19. - P. 117 - 126.
179. Schnellman O. A studi of the reaciviti of the thiol group of cathepsin B. In: Tissue Proteinases. - Amsterdam.; London.; N - Y.; North - Holland Publishing Company // American Elsevier Publishing Co. Inc. - 1971. - P. 29 - 44.
180. Schwartz W. N, Barrett A. J. Human cathepsin H // Biochem. J. -1980. V. 191, N 2. - P. 487 - 497.
181. Shaw E., Kettner C. The specifity of cathepsin В // Acta. Biol. Med. Germ. — 1981. V. 40, № 10-11.- P. 1503 - 1511.
182. Sloane B. F. Cathepsin В and cystatins: evidence for a role in cancer progression //Semin. Cancer. Biol. 1990.-V. 1, №2. -P. 137- 152.
183. Sloane B. F., Honn К. V. Cysteine proteinases and metastasis // Cancer and Metastasis Rev. 1984. - V. 3, № 3. - P. 249 - 263.
184. Sloane B. F., Moin K., Krepela E., Rozhin J. Cathepsin В and its endogenous inhibitors: the role in tumor malignancy // Cancer and Metastasis Rev. 1990. - V. 9, № 4. p. 333 . 352.
185. Study of the functional share of lysosomal cathepsins by the development of specific inhibitors / Katunuma N., Matsui A., Kakegawa T. et al. // Adv. Enzyme. Regul. 1999. - V. 39. - P. 247 - 260.
186. Sturfelt G. Complement factor D concentration in normal sera: comparition of inmmunochemical and functional determinatiuon // Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. 1983. - V. 91, № 6. - P. 383 - 384.
187. Takahashi K., Isemura M., Ikenaka T. Isolation and characterization of three forms of cathepsin В from porcine liver // J. Biochem . 1979. - V. 85, N 4. - P. 1053 - 1060.
188. Takahashi S., Murakami K., Miyake Y. Purification and characterization or porcine kidney cathepsin В // J. Biochem. 1981. - V. 90, N. 6. - P. 1677 - 1684.
189. Takahashi Т., Yonezawa S., Dehdarani A. H., Tang J. Comparative studies of two cathepsin В isozymes from porcine spleen. Isolation, polypeptide chain arrangements, and enzyme specificity // J. Biol. Chem. -1986. V. 261, N. 20. - P. 9368 - 9374.
190. The alternative patway C3 / C5 convertase: chemical basis of factor В activation / Lesavre P. H., Hugli Т. E., Esser A. F. et al. // J. Immunol. -1979. - V. 123, № 2. - P. 529 - 534.
191. The amidolytic activity of the SK plasminogen complex is enhanced by a potentiator which is generated in the presence of vascular plasminogen activator - role of fibrin degradation products / Soria J., Soria C., Bertrand
192. О. et al. // Thromb. Haemost. 1982. - V. 47, N. 3. - P. 193 - 196.
193. The degradation of proparathormone by parathyroid and liver cathepsin В / Mac Gregor R. R., Hamilton J. W., Kent G. N. et al. // J. Biol. Chem. 1979. - V. 254, № 11. - P. 4428 - 4433.
194. The domain organization of streptokinase: nuclear magnetic resonance, circular dichroism, and functional characterization of proteolytic fragments / Parrado J., Conejero Lara F., Smith R. A. et al. // Protein Sci.- 1996. V. 5, №4. - P. 693 - 704.
195. The limited proteolysis of rabbi muscle aldolase by cathepsin Bj / Nakai N., Wada K., Kobashi K. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1978. V. 83, №3.-P. 881 -885.
196. The proteolytic fragments of streptokinase / Yong K. S., Shi G. Y., Chang Y. F., et al. // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 29601 -29609.
197. The role of the kininogens as cysteine proteinase inhibitors in local and systemic inflammation / Assfalg-Machleidt I., Billing A., Frohlich et al. // Agents. Actions. Suppl. 1992. - V. 38 ( Pt 1). - P. 312 - 321.
198. The structure of cistatins and their interaction with cognate cysteine proteinases / Bode W., Stubbs M., Musil D. et al. // J. Cell. Biochem -1994.-Suppl. 18 d.-P. 123.
199. Tolleshaug H. Receptor-mediated endocytosis and degradation of asialo glicoproteins in isolated hepatocytes // Thesis. University of Oslo.- Oslo.- 1980. -52p.
200. Towatari Т., Kawabata Y., Katunuma N. Crystallization and properties of cathepsin В from rat liver // Eur. J. Biochem. 1979. - V. 102, N. 1.-P. 279-289.
201. Towatari Т., Tanaka K., Yoshikawa D., Katunuma N. Purification and properties of a new cathepsin from rat liver // J. Biochem. 1978. - V. 84, N. 3. - P. 659 - 672.
202. Tosi M., Duponchel C., Bourgarel P., Colomb M., Meo T. Molecular cloning of human CI inhibitor: sequence homologies with alpha 1-antitrypsin and other members of the serpins superfamily // Gene. 1986. -V. 42, N. 3. - P. 265 - 272.
203. Villers C. L., Arlaud G. J., Colomb M. G. Doman structure and associated functions of subcomponents Clr and Cls of the first component of human complement // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1985.-V. 82, № 13.-P. 4477-4481.
204. Wuillemin W. A., Minnema M., Meijers J. C. et al. Inactivation of factor XIa in human plasma assessea by measuring factor XIa protease inhibitor complexes: major role for CI-inhibitor // Blood. - 1995. - V. 85, N. 6. - P. 1517- 1526.
205. Wuthrich В., Devay J., Spath P. Hereditary or acquired andioedema caused by functional defeciency of CI inhibitor a still unfamiliar disease picture // Schweiz. Med. Wochenschr. - 1999. - V. 129, N. 7. - P. 285 -291.
206. Yamaguchi H., Weidenbach H., Luhrs H., Lerch M.M., Dickneite G., Adler G. Combined treatment with CI esterase inhibitor and antithrombin III improves survival in severe acute experimental pancreatitis // Gut. -1997. V.40, N.4. - P. 531 - 535.
207. Yamamoto К., Takeda M., Kato Y. Characteristics of activation of cathepsin В by sodium salicylate and comparison of catalytic site properties of cathepsins В and H // J. Pharmacol. 1985. - V. 39, N. 2. -P. 207-215.
208. Yamashita M., Konagaya S. Purification and characterization of cathepsin L from the white muscle of chum salmon // Compar. Biochem. and Physiol. B. 1990. - V. 96 B, № 2. - P. 247 - 253.
209. Yeung Laiwah A. C., Jones L., Hamilton A. O., Whaley K. Complement subcomponent CI inhibitor synthesis by human monocytes // Biochem. J. - 1985. - V. 226. - P. 199 - 205.
210. Zhai P., Wakeham N., Loy J. A., Zhang X. C. Functional roles of streptokinase С terminal flexible Peptide in active site formation and substrate recognition in plasminogen activation // Biochemistry. - 2003. -V. 42, N. 1.- P. 114-120.
211. Zuraw B. L., Curd J. G. Demonstration of modified inactive first component of complement (CI) inhibitor in the plasmas of CI inhibitor-deficient patients // J. Clin. Invest. 1986. - V. 78, N 2. - P. 567 - 575.
-
Фаенкова, Вера Петровна
-
кандидата биологических наук
-
Санкт-Петербург, 2004
-
ВАК 03.00.04
- Активность катепсинов L и H при заболеваниях вен нижних конечностей
- Изменение активности лизосомальных цистеиновых протеиназ у больных хроническими лейкозами в динамике заболевания
- Протеиназы лизосом и гормональная функция щитовидной железы
- Окислительная модификация белков и лизосомальный цистеиновый протеолиз иммунокомпетентных органов крыс в условиях модулирования синтеза оксида азота
- Изучение комплекса протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов в грене тутового шелкопряда
