Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение фибрин-мономера и анализ результатов фотометрического определения компонентов фибринолической системы крови

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение фибрин-мономера и анализ результатов фотометрического определения компонентов фибринолической системы крови"

?Т6 ОЛ

о м • '. V-'

на правах рукописи

ТИТАЕВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ ФИБРИН-МОНОМЕРА И АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ФОТОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ

КРОВИ

03.00.04 — Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

РЛОСКВА—1996

Работа выполнена в НИИ клинической кардиологии имени АЛ.Мясникова КНЦ РАМН.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук

Добровольский Анатолий Борисович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация — Московский Государственный Университет имени М.ВЛомоносова

заседании диссертационного Совета К 001.22.02

в Кардиологическом Научном Центре Российской Академии Медицинских Наук (121552, Москва, ул. 3-я Черепковская, 15А)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КНЦ РАМН

Оглоблина Ольга Геннадьевна

Кандидат физико-математических наук

Гурия Георгий Теодорозич

Защита диссертации состоится •хз- (¿¿ОлА 1996 г.-в " 1Г- ■ на

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат биолог

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Тромбоз является наиболее частой причиной эсложнений сердечно-сосудистых заболеваний, а результаты эпидемиологических исследований свидетельствуют о том, что . ряд компонентов системы гемостаза: фибриноген (Фг), фактор VII, тканевой зктиватор плазминогена (тАП) и его ингибитор (ИАП-1) могут эассматриваться и как факторы риска развитая атеросклероза. Это стимулирует разработку новых методов исследования системы гемостаза, поиск фармакологических препаратов, позволяющих корректировать выявленные нарушения, и совершенствование схем их применения.

Протеолиз является основной биохимической реакцией системы гемостаза, обеспечивающей • активацию проферментов и "кофакторов", превращение Фг в фибрин, растворение фибрина и ингибирование факторов. По механизму действия все ферменты системы гемостаза за исключением фактора XIII являются трипсиноподобными протеазами, но гидролизу ют только очень ограниченное количество связей в белках-субстратах и из-за низкого содержания в плазме прямое измерение их активности представляет зобой трудную задачу. Синтез хромогенных субстратов в середине 70-х годов збесг.ечил значительный прогресс коагулологических исследований, т.к. позволил использовать фотометрию для измерения компонентов системы -еыостаза. Однако, широкое использование хромогенных субстратов, представляющих собой р-нитроанилиды три- и .тетрапептидов, привело к накоплению данных, свидетельствующих о том, что синтетические субстраты не обеспечивают необходимой селективности измерений и проблема зазработки новых подходов к определению компонентов системы гемостаза эстается актуальней и на сегодняшний день.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы было: 1) изучить возможности использования фотометрии для исследования лизиса фибрина; 2) разработать методы эпределэния компонентов системы фибринолиза; 3} исследовать тАП и его 1чгибитор у больных сердечно-сосудистой патологией.

Исходя из поставленной цели предполагалось выполнить следующие задачи:

1. Выделить фибриноген, обладающий высокой свертываемостью и не содержащий примеси пшзминогена. Оценить его свойства.

2. Разработать способ получения фибрин-мономера.

3. Разработать метод фотометрической регистрации-лизиса фибрина.

4. Оценить состояние системы фибринолиза у больных с различными проявлениями атеросклеротических поражений сосудов.

Научная новизна и практическая значимость результатов.

Предложен метод турбидиметрической регистрации лизиса фибрина и на его основе разработаны метод определения концентрации плазминогена (Пг), отличающийся более высокой специфичностью по сравнению с широко используемым амидолитическим, и метод тестирования препаратов стрептокиназы (СК), который может использоваться для подбора наиболее оптимальных схем введения препарата. Разработанный простой способ солюбилизации фибрина открывает возможность определения у больных тАП и ИАП-1 без использования импортных диагности кумов. Определение этих показателей у больных острым инфарктом миокарда (ОИМ) и с различной выраженностью атеросклеротических поражений сосудов позволило выявить корреляции между уровнем активности ингибитора и временем от появления симптомов ОИМ, что может быть одной из причин низкой эффективности тромболизиса при более позднем его начале; между уровнем Д-димера и возрастом, а также между уровнем Д-димера и активностью тАП и ИАП-1, которые ' помогают понять взаимосвязь между внутрисосудистыми отложениями фибрина и изменениями в системе фибринолиза при атеросклерозе.

Апообания работы и публикации.

Материалы работы были доложены на IV Всесоюзной научной конференции "Противотромботическая терапия в клинической практике. Вопросы фибринолиза и тромболиза", Москва, 1990 г.; на Всесоюзной конференции "Физиология и патология гемостаза", Полтава, 1991 г.; на 2-ой Международной школе ангиологов, Монте-Карло, 1993 г.; на. XIV Конгрессе

Международного общества по тромбозам и гемостазу, Нью-Йорк, 1993 г.; на II Научной конференции Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром: современное состояние проблемы", Москва, 1995 г.; а также на межлабораторном семинаре НИИ экспериментальной кардиологии КНЦ РАМН 21 марта 1996 г.. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, включая авторское свидетельство.

Объем и структура работы. .

Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 162 источника. Работа включает 7 таблиц и 34 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ VI МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Фибриноген и плазминоген выделяли из плазмы крови человека. В качестве исходного для выделения Фибриногена использовали метод Vila et al., 1985. Перед началом выделения и на всех последующих этапах очистки к плазме добавляли е-аминокапроновую кислоту (еАКК) до конечной концентрации 15 мМ. Фг осаждали полиэтиленгликолем-8000 (80 г/л, равный объем), осадок собирали (15 мин. х 1600 д) и растворяли в 10 мМ №-фосфатном буфере, pH 7,4. Добавляли 1/2 объема 2М Na-ацетатного буфера, pH 4,6, собирали осадок (15 мин. х 1600 д), который растворяли в 36 мМ Na-фосфатном буфере, pH 7,8. Проводили фракционирование сульфатом аммония (1/3 объема 4M (NH4)2S04), осадок Фг (15 мин. х 11000 д), растворяли в 18 мМ Na-фосфатном буфере pH 7,8 и диализовали против этого же буфера в течение суток.

Плазминоген выделяли по методу, описанному Castellino и Powell, 1981.

Чистоту выделенных белков оценивали методом электрофореза (Laemmli, 1970) в линейном градиенте акриламида от 3,5 до 10%. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически, используя известные коэффициенты экстинкции для каждого из белков.

Сзертызаамость выделенного Фг оценивали по 1) изменению свето-пропускания при 500 нм после добавления к раствору Фг (1,3 мг/мл в 0,15 М

трис-HCI буфере рН 7,2, 475 мкл) тромбина (30 Е/мл, 25 мкл); 2) Kai отношение концентрации, определенной функциональным методом (Clauss 1957) к определенной спектрофотометрически; 3) а также по разнице A2bi исходного раствора Фг и супернатанта после удаления свернутого тромбинои белка.

Для определения содержания примеси Пг в выделенном препарат! определяли амидолитическую активность раствора Фг, 2,6 мг/мл, i присутствии 1000 Е СК и 1 мМ хромозима ПЛ; а та tace регистрируя лизис стимулированный СК.

Для определения тАП использовали метод Ranby et al., 1982, а ИАП-1 -метод Chandler et al., 1989.

Пг и Д-димео определяли с использованием коммерческих наборо! фирмы Берингер-Маннхейм. ч*

Статистическая обработка. При построении графиков использовал! программу линейной регрессии калькулятора "Хьюлетт Паккард 41CV" Результаты определения компонентов системы гемостаза у больны обрабатывали с использованием пакетов программ SPSS и представляли виде М±т. При сравнении групп использовали критерий t СтьюдентЕ Корреляция "между ИАП-1 и другими показателями определялась с помощы критерия Спирмана.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Оценка чистоты и активности выделенных препаратов.

Добавление к плазме перед началом выделения и на всех последующи этапах еАКК до конечной концентрации 15 мМ позволило освободить Фг с примеси Пг и в течение одного дня выделить из 1 л плазмы -700 мг й (выход -30%). Анализ свидетельствовал (Рис.1), что получен электрс форетически чистый препарат с содержанием белковых компоненте! близким к тому, которое имеется в плазме. Выделенный Фг (2,6 мг/мл в 0,1 M трис-HCI буфере, рН 7,2) сворачивается 1,5 Е тромбина в присутствии мМ Са2+ за 10 сек., а соотношение Агво исходного раствора Фг супернатанта после удаления сгустка свидетельствует, что свертываемое: полученного препарата составляет 90 ± 3%.

Исследование лизиса фибрина и амидолитической активности раствора Фг в присутствии СК и хромозима ПЛ показало, что Фг, выделенный по методу Vila et al, 1985 содержал Пг, т.к. СК вызывала полный лизис сгустка в течение 1 часа, а сгусток, полученный из Фг, осажденного в присутствии еАКК, не лизировался в течение всего времени наблюдения (Рис. 2) и добавление СК не приводило

2. Получение Фибрин-мономера (ФМ> и исследование его свойств. При инкубации Фг с рептилазой (1 мл Фг - 10 мг/мл в 0,15 М трис-HCI буфере, рН 7,2 и 0,02 Е рептилазы, 5 часов при 37°С), образуется дез-АА-фибрин, гсоторый солюбилизируотся при циглизе протиз 10 мМ HCI в течение ночи. О полной золюбилизаиии фибрина свидетельствует низкал впзкость и зовпгцение формы спектра з збласти 250 - 300 км полученного заствора и исходного Фг. ^олюбилизированный HCI ФМ >стаетсп в рзствсре. после ;азеедения дистиллированной

5

94 67 43 30 20,1 14,9

Рис.1. Денситограмма фибриногена, обработанного меркаптоэтанолом до электрофореза. '

к появлению амидолитической активности.

Рис. 2. Влияние СК (50 Е/мл) на стабильность фибрина. Фг,

выделенный по оригинальному (1) методу и в присутствии еАКК (2).

Т340(%)

90 100

водой в 100 раз, и преципитирует значительно медленнее (Рис. 3), чем растворенный мочевиной, после внесения в буфер, используемый для определениятАП. /

Для подбора оптимальных условий определения тАП и ИАП-1 с использованием полученных препаратов Пг и ФМ исследовали"" зависимость скорости активации Пг тканевым активатором от концентрации Пг (0,006 - 0,05 мг/мл) и "кофакторов" - ФМ (0,003 - 0,025 мг/мл) или BrCN-фрагментов Фг производства фирмы "Каби" (0,02 - 0,17 мг/мл). В качестве буфера использовали 0,1 М трис-ацетат, рН 8,3, конечная концентрация тАП составляла 0,1-0,2 МЕ/мл, а хромогенного субстрата S2403 - 0,5 мМ. Скорость реакции определяли как нарастание А405 за определенный промежуток времени (-60 мин.). Далее строили график зависимости 1 /V от 1 /[S] и по точке пересечения графика с осью абсцисс (-1/Кт) определяли кажущиеся Кт для Пг и ФМ. Данные одного из определений приведены в таблице 1.

с Таблица 1.

"Кофакторные" свойства ФМ и BrCN-фрагментов Фг в активации Пг

Рис. 3. Преципитация ФМ солюбилизированного 4 М мочевиной (1) и 10 мМ HCl (2).

фибрин-мономер BrCN-фрагменты фибриногена

концентрация плазминогена

при полумаксимальной 5,7 мкг/мл 9,8 мкг/мл

скорости i

концентрация "кофактора" при полумаксимальной скорости 3,7 мкг/мл 22,3 мкг/мл

од

0,6 1,» 1,4 фибриноген (м|^ыл)

Для определения тАП и ИАП-1 использовали концентрации Пг и ФМ в 5 -10 раз превышающие кажущиеся Кт. В этих условиях скорость активации Пг линейно нарастала при увеличении концентрации тАП до 0,25 МЕ/мл.

3. Турбидиметрическая регистрация лизиса Фибрина. Определение плазминогена и стоептокиназы.

Известно, что свертывание Фг сопровождается увеличением мутности. Для определения

количественных соотношений ™

между светопропусканием, концентрацией фибрина и длиной волны, к раствору Фг в 0,15 М трис-НС! буфере, рН 7,2, добавляли тромбин (0,3 мг/мл, Каунас) и через 5 мин измеряли светопропускание в диапазоне от 350 до 600 нм. Концентрацию фибриногена в пробе варьировали от 0,29 до 2,5 мг/мл. При

увеличении . длины волны (Рис. 4) ■ диапазон линейной -'зависимости расширяется и сдвигается в область более высоких концентраций фибрина. В качестве оптимальной для дальнейших исследований мы выбрали 500 нм

для исследования лизиса очищенного фибриногена и 600 нм при работе с плазмой. При этом линейная зависимость наблюдалась в диапазоне концентраций фибрина от 0,29 до 1,5 мг/мл. и «» Если к раствору Фг

. добавить Пг, тромбин и СК, то светопропускание сначала будет снижаться, что отражает

Рис. 4. Зависимость светопро-пускания от концентрации фибрина

%т

5 10

Рис. .5. Изменение светопро-пускания в процесса образования и последующего лизиса фибринового сгустка. Количество Пг соответствовало 15, 12, 9, 6 и 3 мкг/мл слава направо, соответственно.

Увикорд

полимеризацию фибрина, а затем постепенно нарастать. Причем в подобранных нами условиях в диапазоне от 60 до 90% нарастание линейно во времени, а его скорость (ДТ%/Д1МИН) пропорциональна количеству добавленного Пг (Рис. 5).

Для того, чтобы подтвердить, что нарастание светопропускания обусловлено расщеплением фибрина до растворимых фрагментов, использовали также проточную систему (Рис. 6). Фибриновую пленку, толщиной -3 мм полимеризовали на одной из рабочих поверхностей проточной кюветы

спектрофотометра, используя очищенные белки (4,6 мг/млФг, 0,13 мг/мл Пг и 1,5 Е/мл тромбина в 0,15 М трис-НС1, рН 7,2), или плазму, к которой был добавлен меченный I125-фибриноген. Систему

заполняли, соответственно, 0,15 М трис-НС1 буфером, содержащим Пг (0,13 мг/мл) или гепаринизированной плазмой. В циркулирующий раствор добавляли СК (100 Е/мл) и регистрировали одновременно изменение Тбоо пленки и ' нарастание А28о циркулирующего

Вначале нарастание А2во

Раствор с исслсдусшт лрсиарзтои

Фибриновая пл стсл

Рис. 6. Схема проточной системы.

буфера или радиоактивность плазмы, циркулирующего раствора опережает изменения светопропускания (Рис. 7), затем кривые идут практически параллельно. Корреляция между изменениями светопропускания и Агво Для участка кривой от 50 до 90% составляет -0,9. Аналогичный характер зависимости был получен при исследовании лизиса меченного фибрина (рисунок не представлен).

100

80 •

60

40

'600 ш

у ____—

N__

к 280

0,3

0,2

0,1

20

40

60

80

100

Опрежение А28о и выхода радиоактивности вначале лизиса, по-видимому, обусловлено вымыванием в раствор неполимеризованного фибриногена.

На основе измерения скорости лизиса фибрина по изменению светопропус-кания бып разработан метод количественного определения Пг в эуглобулиновой фракции плазмы. Для активации Пг использовали каталитические количества СК (40 Е/мл). Линейная зависимость между скоростью лизиса фибрина и содержанием Пг наблюдалась в пределах от 20 до 150% от нормы (Рис. 8), что перекрывает область большинства ' значений, определяемых у больных. Коэффициент корреляции между значениями Пг, определенными этим методом и амидолитическим, составлял 0,91 (Рис. 9). Следует отметить, что для сравнения 2-х методов мы специально использовали кроме нормальной плазму с высоким содержанием Фг и плазму больных на тромболи-тической терапии. То, что амидолитический метод давал более высокие значения Пг, хорошо согласуется с данными литературы о

Рис. 7. Изменения светопропускания фибриновой пленки (-•-) и оптической плотности циркулирующего раствора (—I—). Концентрация фибрина в пленке — 4,6 мг/мл; объем пленки — 0,5 мл. Циркулирующий раствор: 0,15 М трис-НС!, рН 7,2 при 37°, содержащий 0,13 мг/мл плазминогена. Скорость тока через кювету — 150 мл/час.

/ а <о и во ш I» »40 ил к

Рис. 8. Зависимость скорости лизиса фибрчка ({да = сЛ"5оо/сй) от содержания плазминогена (абсцисса). За 100% принималось содержание Пг в эуглобулиновой фракции стандартной плазмы.

завышении истинного содержания Пг при определении его с синтетическими

субстратами при некоторых видах патологии (Gram, Jespersen, 1985).

Таким образом, использование фибрина в качестве субстрата плазмина .позволяет избежать некоторых ошибок при определении плазминогена. Хотя этот метод более трудоемкий, чем амидо-литический, его использование в ряде случаев (например, аномальный Пг, плазминоген животных, высокий уровень Фг или продуктов его деградации) может быть оправдано.

График зависимости скорости лизиса фибрина от концентрации Пг _ (Рис. 10) выходит не из начала . координат, а величина отсекаемого от оси абсцисс отрезка тем больше, чем больше было добавлено CK. Другими словами, в присутствии CK некоторое количество Пг не превращается в плазмин. Из данных этих графиков рассчитали, что в точке их пересечения с осью абсцисс соотношение СК-Пг составляет -ЗОООО Е/1 мг. Титрование Пг CK в присутствии ацилирующего реагента р-нитрофенил-р'-гуанидинобензо-ата (McCIintock, Bell, 1971) показало, что при таком соотношении образуется экви-молярный комплекс СК-Пг (Рис. 11).

Рис. 10. Влияние CK на зависимость скорос лизиса фибрина от концентрации Пг.

Рис. 9. Корреляция между значениями Пг, определенными амидолитическим (ордината) и турбидиметрическим (абсцисса) методами

Таким образом, разработанный нами метод может использоваться для определения Пг и тестирования препаратов, содержащих СК.

концентрация

Рис. 11. Титрование активных центров комплекса СК-Пг.

4. Исследование компонентов системы фибринолиза у больных с атеросклеротическими поражениями сосудов.

. Подбор и обследование больных выполнялось врачами института клинической кардиологии д.м.н. Е.П.Панченко, к.м.н. ДАЗатейщиковым, к.м.н. М.Я.Каган-Пономаревым, к.м.н. К.К.Давлетовым и ЕВ.Сорокиным.

Время от начала болевого приступа (часы)

Рис. 12. Корреляция между активностью ИАП-1 и временем от появления ОИМ и забором крови.

4.1. ИАП-1 у больных коронарной болезнью сердца.

Мы провели сравнительное исследование активности ИАП-1 у больных с различными проявлениями сердечно-сосудистых заболеваний. Активность ИАП-1 у больных стенокардией была лишь незначительно выше, чем в контрольной группе и только у больных, госпитализированных в первые часы острого-инфаркта миокарда (ОИМ), он был достоверно выше, чем у других (рисунок не представлен). Мы обратили внимание на наличие достоверной корреляции между активностью ИАП-1 и временем от момента появления симптомов ОИМ до госпитализации и взятия крови на анализ (рис. 12). График пересекает ординату в точке, которая попадает в область средних значений ИАП-1, определенных нами в контрольной группе и у других больных ишемической болезнью сердца. ИАП-1 является белком острой фазы (Bachmann, 1987, Schleef, Loskutoff, 1988, Sprengers, Kluft, 1987, Wiman, Hamsten, 1990), его повышение может быть следствием, а не причиной развития ОИМ. Выявленная нами корреляция между активностью ИАП-1 и временем от момента появления симптомов ОИМ до госпитализации и взятия крови подтверждает это предположение.

Был проведен ретроспективный анализ содержания ИАП-1 у 163 больных, ■ госпитализированных . в клинику в течение первых 6-ти часов развития ОИМ. Больные были разделены на 3 группы: 1) со спонтанно восстановившимся кровотоком по инфаркт-связанной артерии; 2) с восстановленным кровотоком в первые 6 часов после тромболизиса; 3) и без признаков коронарной реперфузии за указанное время. Исходные значения ИАП-1 были достоверно выше у больных с не восстановившимся кровотоком. Однако, интервал времени от появления симптомов ОИМ до начала тромболизиса в этой группе также оказался достоверно больше (4,3 ± 0,2 часа протиз 3,3 ± 0,1 часа в группе с восстановленным в результате тромболизиса кровотоком). В группах со спонтанно и в результате тромболизиса восстановившимся кровотоком активность ИАП-1 достигла Максимального значения примерно к 9-му часу, а в группе • с невосстановившимся кровотоком - примерно к 12-му (рис. 13).

группа 1

" О- ■ ■ (споитвммже реперфузия)

,..____группа 2

(реперфузия после ТЛТ) группа 3 (без признаков реперфузми)

3 6 9 12 2 3 7 22 3 6 12 часы суп» месяцы

Рис. 13. Динамика ИАП-1 при ОИМ.

Как уже отмечалось выше, мы обнаружили положительную корреляцию между активностью ИАП-1 и временем от начала заболевания. Таким образом , одной из причин снижения эффективности тромболизиса при позднем его начале может быть возрастающая во времени активность ИАП-1.

4.2 Тромбообразование и Фибринолиз у больных с различной протяженностью атеросклеоотического поражения.

а)

О-дмиер (нг/нл)

Рис. 14. Корреляция между Д-димером и возрастом у больных с различной выраженностью атеросклеротических поражений сосудов.

Мы исследовали Д-димер как маркер внутрисосудистых отложений фибрина, тАП и его ингибитор (ИАП-1) у 88 больных с различной

выраженностью атеросклеротических поражений сосудов. Сравнивали больных: 1) без признаков атеросклероза; 2) с поражением только коронарных артерий; 3) артерий нижних конечностей; 4) мультифокальным атеросклерозом, т.е. сочетанием поражения в разных бассейнах. Д-димер оказался существенно выше у больных с периферическим и мульфокальным атеросклерозом. Известно, что с возрастом свертываемость крови повышается; мы исследовали корреляцию между Д-димером и возрастом. Анализ показал наличие слабой, но достоверной положительной корреляций между возрастом и Д-димером, г=0,2Э (рис. 14а). Часть больных явно выпадают из общего массива данных. Исключение из анализа 6-ти пациентов с наибольшими значениями Д-димера (все они имели наибольшую протяженность атеросклеротического поражения) усилило корреляцию между возрастом и Д-димером, г увеличился при этом до 0,44 (рис. 146). Таким образом, хотя с возрастом внугрисосудистое отложение фибрина нарастает, наличие атеросклеротических поражений магистральных сосудов существенно усиливает тромбообразование.

Анализ всего массива данных показал наличие достоверных (р < 0,05) и

I I Д-димер 0-149 иг/мл (ЗО бальных) ЕЕИ Д-димер 150-220 иг/мл (27 больных) Д-димер > 220 иг/мл (31 больной)

Рис. 15. Распределение ИАП-1 тАЛ по группам больных в зависимости от уровня Д-димера.

противоположных по знаку корреляций между Д-димером и тАП (г=0,34) и Д-димером и ИАП-1 (г=-0,29). Принимая во внимание эти данные мы"разделили больных на 3 примерно равные группы по содержанию Д-димера и провели анализ распределения ИАП-1 и тАП по этим группам (рис. 15). Оказалось, что выброс тАП при нагрузке возрастает с увеличейием Д-димера. Вероятно, этим объясняется тот факт, что в нашей выборке больные с наибольшим уровнем Д-димера имели наименьшую активность ИАП-1 и не имели признаков острого тромбоза. Повышенная секреция тАП предохраняла этих больных от развития окклюзирующего тромбоза. Таким образом, обнаружена взаимосвязь между фибринолизом и внутрисосудистым фибринообразованием. Выброс тАП находится в прямой зависимости от содержания Д-Димера. Относительно низкая активность ИАП-1 у больных с повышенным уровнем Д-Димера является следствием его нейтрализации секретирующимся активатором. У больных с мультифокальным атеросклеротическим поражением, даже при относительно благополучном состоянии, повышено содержание Д-Димера, что свидетельствует о внутрисосудистом отложении фибрина.

Таким образом, предложена модификация, метода выделения. .Фг, позволяющая получить высокоочищенные препараты белка, обладающего высокой свертываемостью и не содержащего примеси Пг. Разработаны оригинальные методы определения содержания Пг и СК, получен стандарт для определения Фг. Применение турбидиметрического метода регистрации лизиса фибрина позволило получить данные, свидетельствующие о том, что эквимолярный комплекс СК-Пг не обладает прямой фибринолитической активностью, а является только активатором Пг.

' Разработка метода получения ФМ сделала возможным определение таких важных показателей системы фибринолиза как тАП и его ингибитора без закупок дорогостоящих импортных диагностикумов.

Полученные результаты определения ИАП-1 у больных ОИМ позволяют сделать заключение, что его повышение в остром периоде у этой группы больных является скорее всего следствием заболевания. Выявленные положительная для тАП и отрицательная для ИАП-1 корреляция с уровнем Д-

димера у больных с атеросклеротическими поражениями сосудов дают дополнительную информацию о возможных механизмах тромбообразования при этой патологии.

ВЫВОДЫ

1. Предложена модификация метода выделения фибриногена, позволяющая получить белок с высокой степенью свертываемости, не содержащий примеси плазминогена.

2. Разработан способ солюбипизации дез-АА-фибрина. Исследованы его свойства как кофактора в реакции активации плазминогена тканевым активатором.

3. Разработан метод фотометрической регистрации лизиса фибрина, позволяющий количественно определять плазминоген и стрептокиназу.

4. Показано, что эквимолярный комплекс стрептокиназа-плазминоген является только активатором плазминогена и не обладает прямой фибринолитической активностью.

5. Среди обследованных групп'наибольшая' активность ИАП-1 обнаружена у больных острым инфарктом миокарда. Корреляция между активностью ИАП-1 и временем от начала болевого приступа свидетельствует о том, что повышение ИАП-1 является следствием заболевания и протекает по типу реакции острой фазы.

6. У больных с атеросклеротическими поражениями сосудов уровень Д-димера положительно коррелирует с активностью тАП и отрицательно с активностью ИАП-1.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Титаева Е.В., Добровольский А.Б., Титов В.Н. Способ определения содержания ппазминогена - Авт. свидетельство СССР - N1436073 - заявка N4035126 - приоритет 12.03.86 - 8 июля 1988 г.

2. Титаева Е.В., Добровольский А.Б., Титов В.Н. Простой метод выделения высокоочищенных препаратов фибриногена из плазмы человека -Лаб. дело - 1988 -N1.C.29-32.

3. Титаева Е.В., Добровольский А.Б., Титов В.Н. Турбидиметрический метод определения ппазминогена - Лаб. дело - 1991 - N1, с.32-35.

4. Титаева Е.В., Добровольский А.Б., Карпов Ю.А. Фотометрический метод определения концентрации стрептокиназы - Физиология и патология гемостаза. Тезисы Всесоюзной конференции (Полтава 20-23 ноября 1991 г.) Полтава - 1991 -с.240.

5. Каган-Пономарев М.Я., Добровольский А.Б., Староверов И.И., Кравец А.М., Подиновская Я.А., .Померанцев Е.В., Титаева Е.В., Руда М.Я. Коагулолсгические факторы, связанные с развитием повторного инфаркта миокарда - Кардиология - 19S4 - т.34, N2, с.118-122.

6. Каган-Пономарев М.Я., Добровольский А.6., Староверов И.И., Титаева Е.В., Кравец А.М., Померанцев > Е.В., Руда М.Я. Коагулологические особенности у больных инфарктом миокарда при раннем спонтанном и медикаментозном восстановлении коронарного кровотока - Кардиология -1994 -т.34, N11, с.4-10.

7. Titaeva Е., Dobrovolsky A. An assay of fibrinolytic enzymes by measuring turbidity changes of the fibrin gel - Thromb. Haemostas. - 1993 - v.69 (6) abstr 1044.

8. Panchenko E, Dobrovolsky A., Rogoza A., Sorokin E., Ageeva N., Markova L., Titaeva E., Anuchin • V., Karpov J., Saks V. The effect of exogenous phosphocreatine on maximal walking distance, blood rheology, platelet

aggregation, and fibrinolysis in patients with intermittent claudication - Int. Angiol. - 1994-v. 13, p.59-64.

9. Panchenko EL, Dobrovolsky A., Davletov K., Trtaeva E, Kravets A., Podinovskaya J., Karpov J. D-dimer and fibrinolysis in-patients with various degrees of atherosclerosis - Eur. Heart J. - 1995 - v.16, N1, p.38-42.