Доменная структура фибриногена и функциональная роль его отдельных доменов

Медведь, Леонид Васильевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Доменная структура фибриногена и функциональная роль его отдельных доменов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Доменная структура фибриногена и функциональная роль его отдельных доменов"

/6 О

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУНШ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК у УКРАИНСКОЙ ССР ¿/Ъ/

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИОХИ1АИИ иц. А.В.ПАЛЛАДШ

На правах рукописи

МЕДВЕДЬ Леонид Васильевич

УДК 577Л12

ДОМЕННАЯ СТРУКТУРА ФИБРИНОГЕНА И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ ЕГО ОТДЕЛЬНЫХ ДОМЕНОВ

(03.00.04 - Биохимйй)

ДИССЕРТАЦИЯ

на Ооисканиа ученой степени лектора биологически* наук в форме научного доклада

Киев - 1989

Работа выполнена в Институте биохимии им. А.В.Палладина АН УССР (г. Киев) и в Институте белка АН СССР (г. Пущино).

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор ВЕРЕМЕЕИКО К.Н.

доктор биологических наук, профессор РОЗЕНФЕЛЬД М.А.

Доктор физико-математических наук, профессор МРЕВЛИШВИЛИ Г.М.

Ведущая орг&низация: Московский государственный университет вы. М.В.Ломоносова

Бащита состоится "_"_19 г. в__чао.

на заседании специализированного совета Д 016.07.01 при Институте биохимии им. А.В.Палладина АН УССР (252030, г. Кие! ул. Леонтовича, 9).

С диссертацией иокно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан "

19 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

¿^¿^/е^-^ИРСЕНКО о л

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Системы свертывания крови и фибринолиза являются важнейшими" элементами гемостаза. Их правильное функционирование обеспечивает поддержание жидкого состояния крови, защиту организма от кро-вопотерь и эффективное удаление нежелательных отложений полимерного фибрина, приводящих £ образованию тромбов и закупорке кровеносных сосудов.

Основная функция системы свертывания крови заключается в защите организма от потерь крови при повреждении кровеносных сосудов. Она включает в себя каскад биохимических реакций, направленных на превращение мономерного фибриногена в полимерный • фибрин, являющийся основой кровяного сгустка. Различные нарушения в этой системе, связанные с сердечно-сосудистыми заболеваниями, могут приводить к серьезным последствиям для организма, например, тромбозам. Для успешной борьбы с ними необходимо глубокое понимание молекулярных механизмов свертывания крови, требующее знания структуры и функций отдельных белковых компонентов этой системы.

Фибриноген является важным белком, принимающим участие в поддержании гемостаза. Уже на первой стадии свертывания крови он взаимодействует с тромбоцитами, способствуя их агрегации, которая является первичным процессом в закупорке поврвждечньк. сосудов. После активации тромбином фибриноген ПрэвращазтЫ в мономерный фибрин. Последний спонтанно полимерйзуется и образует фибриновую сеть, которая является основой кровных сгустков, закупоривающих места повреждения и препятствующих потере крови организмом. Полимерный фибрин участвует в активации фибриноли-Тической системы, а именно, является матрицей, на которой плаз-миноген активируемся в плазмин при помощи тканевого активатора. Алазминогена. Фибриноген также ускоряет активаций ХШ фактора Обертывания крови и взаимодействует с рядом белков: фибронекти-йом, тромбоспондином, коллагеном (тип 1У) и др. Это далеко не г1олный перечень процессов и взаимодействий, в которые вовлечен фибриноген. .

Вообще, для таких крупных белков, как фибриноген, характерна полиФункциональнссть. Такая полифункпиональиость, как правило, связана с их мультидоменной структурой. Детальные знания

доменной структуры белков позволяю'!' глубже понять механизм их функционирования. Поэтому вопрос о структурной организации фибриногена является ключевым в понимании молекулярных механизмов самосборки фибрина и роли фибриногена в поддержании гемостаза.

Цель и задачи исследования: Целью данной работы явилось выяснение доменной организации молекулы фибриногена и изучение функциональной роли его отдельных доменов.

Для достижения этой цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить детально процесс тепловой денатурации фибриногена и его фрагментов.

2. Проанализировать отдельные температурные переходы в фибриногене и его фрагментах и выяснить количество доменов в молекуле фио'риногена.

3. Изучить структурные характеристики отдельных доменов и выяснить, какими участками полипептидных цепей они сформированы.

4. Изучить функциональную роль отдельных доменов и механизм их участия во внутримолекулярных и межмолекулярных взаимодействиях.

Научная Новизна работы. Детально изучен процесс тепловой денатурации фибриногена методом дифференциальной сканирующей калориметрии. 'Кроме известных низко- и высокотемпературного переходов были обнаружены второй низкотемпературный и второй высокотемпературный переходы. Показано, что С-концевые участки двух .Arf-цепей, вопреки существовавшим представлениям, образуют компактные структуры UC-домены), которые взаимодействуют между собой и денатурируют б области второго низкотемпературного перехО' да. Ограниченным протеолизом в^-фрагмента получен термостабильный участок фибриногена (тзп-фрагмевт), плавящийся в области второго высокотемпературного перехода. Экспериментально показано,, что он представляет собой тройную суперспиральную структуру, существование которой было предсказано ранее (Cohen, 1951: Doolittle et в1„ 1£78). Обнаружен дискретный характер дальнейшего протеолиза ^-фрагмента, соответствующего терминальным областям фибриногена, и получен ряд новых протеолитических фрагментов- (it., Dy, D„, TSC), отличающихся Друг от друга набором докеиое. На основании термодинамического анализа отдельных дека

турационных переходов в фибриногене и его фрагментах и анализа процесса протеолиза Б^-фрагмента показано, что молекула фибриногена состоит не из. трех, как предполагалось ранее, а из 14 доменов, которые имеют различную стабильность и денатурируют независимо в четырех температурных областях. Выяснено, какими участками полипептидных цепей сформированы отдельные домены. Предложена модель доменной организации молекулы фибриногена* Фибриноген явился первым крупным белком со сложной химической структурой, для которого была Еыяснена детальная доменная структура методами сканирующей калориметрии и ограниченного протеолиза. Часть обнаруженных нами доменов била впоследствии визуализирована методом электронной микроскопии другим! исследователями.

Изучена роль «сС-доменов в гроцессе самосборки фибрина. Показано, что они несут дополнительные центры полимеризации, взаимодействие между которыми существенно ускоряет самосборку фибрина в разбавленных растворах.

Показано, что термостабильные структуры оуперспирального типа (ТБС-домены) фибриногена имеют плазминоген-связывающий участок, комплементарный лизин-связывающему участку, расположенному в области первых трех крингловых структур плазминогена.

Установлено, что под действием плазмина в присутствии Са -фрагмент фибриногена превращается в Б^д-фрагмент, имеющий в 3,5 раза более высокую аятиполимериоационную активность, сто превращение происходит путем расщепления связи Аргд^-Тре^з в его /5-цепи и напоминает процесс активации профермента в фермент. Обнаруженное явление, по-видимому, представляет дополнительный механизм регуляции процесса самосборки фибрина путем повышения антиполимеризационной активности продуктов его протеолиза.

Апробация результатов работы. Материалы диссертации докладывались на: ЭТи Всесоюзной конференции по калориметрии и химической термодинамике (Иваново, 1979); 1У Всесоюзном биохимическом съезде (Ленинград, 1979); У Всесоюзном совещании по конформаци- -онным изменениям биополимеров в растворах (Телави, 1980); Всесоюзной конференции молодых уче!';'* (Баку, 1981); Международном симпозиуме по биокалориметрии (Тбилиси, 19Ь1); '1У Украинском биохимическом съезде (Днепропетровск, 1982); У1 Двустороннем симпозиуме СССР-Франция (Цхалтубо, 19ь2); У1 Всесоюзном симпозиуме "Химия белков и пептидов" (Рига, 15ЬЗ); 1У Симпозиуме СХР-Ита-

лия "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Киев, 1984); У Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1985); У Украинском биохимическом съезде (Ивано-Франковск, 1987); Всесоюзной конференции по спектроскопии растворов биополимеров (Харьков, 1988); Международном симпозиуме по фибриногену Шилуокки, 1988; Киото, 1989); II Симпозиуме Американского общества белковиков (Сан-Диего, 1988); ХП Конгрессе Международного общества Тромбозов и гемостаза (Токио, 1989), а также в лабораториях д-ра М.Мосессона (Милуоки, 1988), д-ра Р.Дулиттла (JIa-Хойя, 1988), д-ра А.Будзинского (Филадельфия, 1988), д-ра Б.Бломбака (Нью-Йорк, 1988), д-ра К.Коэн (Бостон, 1989).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Фибриноген й фрагменты его протеолиза x2, DH, Е получали по методикам, описанным ранее (Варецкая, I960; Belitser et al., 1968; Privalov and Medved', 1982). Гомогенность препаратов проверялась электрофоретически.

Калориметрические измерения проводили на дифференциальном сканирующем калориметре ДАСМ-1М (Privalov, 1980). Термодинамический анализ кривых осуществляли как описано в работе (Privalov and Khechinashvili, Î974).

Спектральные исследования проводили на спектрофлуориметре Hitachi МРР-4, спектрофотометрах Specord UV-VI3 и Specord М-4С, спектрополярчметре Jasco J-4I А.

Электронномикроскопические исследования проводили на электронном микроскопе JEM 100 СХ (Jeol).

Молекулярные массы (MjJ фрагментов фибриногена определяли в нативных условиях методом высокоскоростного равновесного центрифугирования (ïphantis, 1964), а также в денатурирующих условиях с помощью ДСП-электрофореза по белкам-маркерам.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ РАЗДЕЛ I.

Доменная организация молекулы фибриногена

Фибриноген (ML— 340 кДа> представляет собой химический дм-

мер, состоящий кз двух идентичных субъединиц, соединенных дисульфидными связями. Каждая субъединица образована тремя неодинаковыми полипептидкыми цепями: Аы, В/3 и У,- также соединенными между собой дисульфидными связями (рис. 1а). ВЦ-концевых участ-

ФИБРИНОГЕН

Х2-$РАГМЕНТ

ВН-$РАШЕНТ Е-ФРАГМЕНТ

Он-«РАГМЬ1Г

Рис. I. Г-хомг'тччпское изображение химической структуры фибриногена и продуктов его протеолиза, (а), а также трехглсбуляр-ной модели молекулы фибриногена (б).

А и- В г- фибринопептиды, отщепляемые тромбином. К^ и ~ "дисульфидные кольца" в соответствии с (НооИШе б!., ГЗТв).

к ах А<< и В д цепей находятся короткие А и В пептиды, которые отщепляются тромбином при переходе фибриногена в фибрин. Первичная структура всех трех цепей человеческого и бычьего фибриногена полностью расшифрована.

Длительное время наиболее популярной моделью фибриногена была трехглобулярная структура, предложенная Холом и Слейтером 11959) на оснований электронномикроскопических исследований (рис. 16). Многочисленные результаты по протеолитической фрагментации фибриногена и анализу его физико-химических свойств, полученные до середины 70-х годов, находились, в основном, в соответствии с этой моделью. Так, было показано, что при ограниченном протеолизе от фибриногена в первую очередь отщепляются длинные С-концевые участки Ас<-цепей (мр ~ 45 кДа какдый), в результате чего образуется Х-фрагмент. В дальнейшем этот фрагмент расщепляется до двух идентичных фрагментов В и одного Е, происходящих из периферических и центральной части соответственно (рис. 1а). Было также установлено, что И и Е-фрагменты имеют компактную конформа-цию и сохраняют некоторые функции, присущие целой молекуле. Методом иммуноэлектронной микроскопий было прямо показано, что центральная глобула фибриногена соответствует фрагменту Е, а две периферические - фрагментам И. Таким образом, в литературе утвердилось представление о том, что молекула фибриногена состоит из трех доменов: центрального домена Е и двух идентичных терминальных доменов и, которым соответствуют три глобулы, обнаруженные Холом и Слейтером методом электронной микроскопии. Донован и Ми-хали (1974), изучая процесс денатурации фибриногена методом дифференциальной сканирующей калориметрии, обнаружили два температурных перехода при 61°С и Ю0°С, которые были отнесены к плавлении в и Е доменов соответственно. Было сделано заключение о том, что Полученные данные подтверждают трехдоменную модель фибриногена.

Наш попытки воспроизвести эти данные, используя метод епектрофлуориметрии, дали неожиданные результаты: высокотемпературный переход был обнаружен не только з фибриногене и 2-фрагме-нте, но и в 1>-фрагмекте (Злма и др., 1979). Стало ясно, что до: менная организация фибриногена является более сложной, чем описывала трехдоменная модель. Поэтому нами были предприняты детальные исследования доменной организации молекулы фибриногена методами дифференциальной сканирующей калориметрии высокого рззря-

тения, ограниченного протеолиза и другими физико-химическими методами. Калориметрические исследования были проведены совместно с лабораторией П.Д.Привалова, в которой были разработаны новые высокочувствительные микрокаяоркметры и развиты подходы для термодинамического анализа структуры белков на основании данных сканирующей калориметрии.

1.1. Исследование тепловой денатурации фибриногена и его иротеолитичееких фрагментов.

Изучение структурной организации сложных белков сопряжено с большими трудностями, связанными с неоднозначностью интерпретации полученных даньых. Преодоление этих трудностей возможно путем изучения наряду с целой молекулой её высокомолекулярных фрагментов протеолиза. Процесс денатурации интактной молекулы и её отдельных фрагментов несёт информацию об их структуре: чем сложнее построен белок, тем сложнее протекает процесс его разрушения.

Для исследования тепловой денатурации фибриногена и его фрагментов были подобраны условия, при которых агрегационные эффекты были минимальными. На рис. £ представлен^ температурные зависимости молярных теплоемкостей фибриногена и его фрагментов при рН 8,5 и 3,5. При рН 8,5 (рис. 2а) картина плавления фибриногена напоминает таковую, опубликованную Донованом и Мнхали (1974), Однако, при рН 3,5 картина плавления значительно более информативна (рис. 26). Во-первых4 у фибриногена появляется второй высокотемпературный пик теплопоглощения (НТ2), и» во-вторых, низкотемпературный пин разделяется на две состава, .зщие (ЬТ1 и Ьтг). Из полученной картины плавления следует существенный вывод о том, что в фибриногене имеются структуры четырех типов, которые плавятся в различных температурных областях, т.е. ийеют различную стабильность.

Сопоставление кривы* плавления целого белка и отдельных фрагментов позволяет локализовать плавящиеся структура в целой иголекуле. Так* в области первого высокотемпературного.пика ШТ1) в фибриногене выплавляются термостяЛильные структуры, имеющиеся в Е-фрагменте; в области второго высокотемпературного пика ШТ2) - термостабильные структуры» имеющиеся в Р-фрагмёНтах; в области первого низкотемпературного пика (ЬТ1) - тёрмолабильнее структуры, также имеющиеся в Р-фрагмейтах. Второй слабый пик теплопог-

Ср (ккал-К-* моль-*)

40 60 80 100 Температура (°С)

Рис. 2. Температурные зависимости молярных теплоёмкос-тей фибриногена (р) и его фрагментов х2, Е^и Е в 0,05 М глициновом буфере, рН 8,5 (а) и 3,5 (б).

лощения (LT2) имеется только у фибриногена и отсутствует у всех .фрагментов, в том числе и у Х2~фрагм8нта (рис. 25). Поскольку Х^-фрагмент лишен длинных С-концевых участков А «¿-цепей, пик ьтг соответствует выплавлению образуемых ими компактных структур. Кз вышеприведенного следует, что, во-первых, С-концевые участки Аы-цепей образуют компактные упорядоченные структуры, а, во-вторых, в D-фрагменте, а следовательно я в соответствующих частях молекулы фибриногена, имеются два совершенно различных типа структур с различной стабильностью; центральная часть молекулы также состоит из обособленных структур, плавящихся независимо.

1.2. Кооперативные области в молекуле фибриногена.

Плавление фибриногена в четырех различных температурных интервалах само по себе не означает, что каждый пик теплойоглоще-

Таблица I.

Термодинамические характеристики плавления фибриногена и различных фрагментов его протеолиза.

Пик- ьи ш ни Н22

Бдлаг • Рй. т а. Т £Л1иВЛ ЛЙаФ и Т дН^дН3^ П 1 дЫкалдНэ$ о

Фибриноген-■ Х-^-фрагиш* Пд-фрагмен* Е-фрагыеит 3,5 3,5 3,5 3.5 3,5 3.? а,5 45.а 54а 1тз' 55,а ЕЭ 555 5.2 45,0 535 116 4,6 «.г газ иа г,* 56,0 354 141 2.4 .;.ч........»и ... ....... 56,г 103 76 1,4 ф 30.2 294 254 1,2 35,0 311 222 .1,4 85,0 75 Л 203 161 1,3 92.2 255 гю 1,3 100,5 252 127 2,0 35,0 •»* аз.2 119 116 1,0 **

Т '-' температура перехода; .дНлаз идН3^ - калориметрическая и Вакт-Гоффсвская энтальпии; П - их отнесение. ■ . -'• ■ •

* - 112 пик на -наблпдаатся вслздствкз сильного перекрывания с БГ1 пиком. *»- НТ2 пик нз наблюдается',слздатвие сильной агрегации в области Ю0°С. »«•■*- дН^1 + дН^ л 510 'каал-моль""*, однако Вант-Гсффозская энтальпия не может бкть рас-^чптаиа вследствие гетерогенности термостабильных участков.

ни я отражает плавление отдельной кооперативной единицы - домена. Как было показано (Preire and Biltonen, 1978; Privalov, 1979, 1962), кооперативность процесса может быть проанализирована только ¡¡а основе количественного анализа функции энтальпии для каждого перехода. Е простейшей форме ето может быть сделано путем сравнения калориметрической энтальпии процесса (лНкал), определяемой из площади под пиком теплопоглоцения, с аффективной Вант-Гоффовекой) энтальпией (дНэ$), определяемой из остроты перехода. Совпадение этих величин.-для любого-данного пика отражает плавление одной кооперативной единицы (домена), которая йодвер- . гается декатурациоНноыу переходу между двумя макроскопическими состояниями. Превышение же калориметрической энтальпии над эффективной означает, что данный пик отражает плавление более одной кооперативной единицы, причем их количество иногда может быть / рассчитано из соотношения этих энтальпий. Калориметрическую эн- 4 талыгаю можно рассчитать из площади под пиком теплопоглощения, а эффективную - из формы кривой по модифицированному уравнении Вант-Гоффа (Privalov, 1979):

''аяориУеярйческие и эффективные энтальпии для температурных Переходов в фибриногене к ato фрагментах при различных рН представлены в табл. I. Из таблицы видно, чтс отношение близкое к единице, поручается только для высокотемпературного . перехода в „О^рагыенте. Плавление этой структуры к тому же полностью обратимо. Поэтому имеющееся совпадение калориметрической и эффективной энтальпий означает,что структура, плавящаяся в .этом пике, представляет собой единый кооперативной участок - домен. Для соответствующего.перехода в фибриногене отношение

близко к двум, что указывает на присутствие в нём .двух таких доменов и находится в соответствии с наличием Двух (¡TpyiciypHux блоков D в молекуле фибриногена. ¡. Для перехода HTI отклонение отношения

от единицы

довольно значительно для E-фрагментов, полученных различными путями (privalov and Tiedved1, 1982). Причем такое же отклонение от единицы (as ЗСШ было обнаружено для соответствующего перехода ;в интактном фибриногене. Поэтому, можно заключить, что наблюдаемое отклонение отношения

от единицы связано не с гетерогенностью изучаемых препаратов, а с внутренними свойствами данной системы, а именно, с тем, что К-фрагмент и соответствую-

щая ему центральная область фибриногена состоят, по крайней мере, из двух сильно взаимодействующих кооперативных участков. Зтот вывод хорошо .согласуется с химической структурой Е-фрагмен-: та, представляющего собой димер, соединенный дисульфяднымн связями.

Количественный анализ пика Ы2, где плавятся структуры, образованные С-концевыми участками А<*-цепей, затруднен из-за его малой интенсивности и перекрывания с пиком lti. Однако, применив специальный подход, описанный в работах (iiedvedr et al,, 1983; 19®), удалось выделить зтот пик и рассчитать термодинамические параметры соответствунцего ему перехода. Как видно из таблицы I, отношение АЙкалДН&Ф для 1>Т2-пика выше 1,0, но ниже 2,0. Такое отклонение величины отношения от целого значения для двух идентичных структур может быть объяснено только предположением, что эти структуры, как и в случае с Е-фрагментом, не- являются независимыми. Это значит, что С-концевке участки А<*-цепей формируют 2 кооперативных участка - ctC-домена -, которые взаимодействуют между собой, формируя единый структурный блок.

Возможность прямого термодинамического анализа первого низкотемпературного перехода (lti) усложнена его необратимости», в отличие от переходов LT2, HTI и ПТ2, которые частично иди полностью обратимы. Однако, так как рассматриваемый переход происходит1 при четко определенной температуре, определяемой внеонимв. условикш!, и не зависит существенно от скорости прогрева (что специально проверялось), то наблюдаемая необратишеть исходного состояния является результатом вторична* явлений, таких как слабла агрегация "расплавленного" состояния, кэомеризацид яролинов и др., в то время как процесс денатурации является равноввеяш. Как было показано ранее» для анализа таких необратимых' переходов можно применять уравнения равновесной термодинамики (Privalor and Hsdved', 1932;. Msnley et al., 1985$ frivalev-eni Potaf-hin, "• 1986; Saoches-Ruia et al., 1985).

Как видно из таблицы I, для пика ЪТ1 ч фибриногене величина ;. дНкалдиэф равна 4.8 при рН 3,5 и уведшмвается до 5,2 срй рН 8,5' скорее всего вследствие слияния пиков Х.ТХ и 112. Для с.'ОТветстЕуяъ-¡дето пика у отношениелНкал/дН5Ф равна 2,4, т.е.* в два раза ; ни«э, чем для Ml пика у фибриногена, что согласуется е кодкчиеч . двух ^-фрзтаентов в составе молекулы фибриногена. Величина этого

отношения для белка, состоящего из нескольких независимых идентичных доменов, отражает, как правило, количество таких доменов, плавящихся в данном переходе. Однако, если домены неодинаковы по величине, взаимодействуют между собой и/ми процесс их денатурации необратим, как в случае ЬТХ пика в фибриногене и ^-фрагменте , эта величина только приблизительно коррелирует с их количеством. Для выяснения точной доменной организации такого белка необходимо применение дополнительных подходов.

Таким образом, на основании предварительного термодинамического анализа LTI пика фибриногена, и D^-фрагмента можно сделать заключение о том, что в каждой tos двух терминальных областей фибриногена плавится не менее трех кооперативных участков. Точную доменную организацию этих областей удалось установить путем дальнейшей протеолитичеокой фрагментация соответствующего им DH-фрагмента и последующего структурного анализа новых более низкомолекулярных фрагментов.

1.3. Доменная структура D^-фрагмента.

Ограниченный йротеслиз белков является' широко распространенным подходом для выяснения их доменной структуры. При протео-члизе, как правило, в первую очередь подвергаются расщеплению наиболее доступные пептидные связи денатурированных структур, либо междоменных областей, в результате чего образуются стабильные фрагменты, состоящие Из одного или нескольких доменов. Наличие в Djj-фрагменте термолабильных и термоцтабильных структур позволило подобрать условия и избирательно отщепить менее стабильные из ни плавящиеся в области LTI-пика (Медведь и Угарова, 1982). Это было достигнуто обработкой Иу-фрагмента пепсином в условиях, где термолабильные структуры сильно дестабилизированы (рН 2,5; t 25°С). При этом уже на ранних стадиях протеолиза наблюдалоы 'появление ряда фрагментов, которые быстро расщеплялись до фрагме нта с И,, «sí 28 кДа, резистентного к дальнейшему прстеовизу. Детальный анализ этого фрагмента показал, что ом состоит из к-конце-вых участков всех трех цепей <*,/} и {" примерно одинакового Эразме ра (¿ir— 9 кДа;, соединенных дисульфидным:- связям!!, и представляет собой один кооперативный участок, плодящийся при высокой температуре, т.е. является термостабильной частью Ьг-фрагмента ÍMedved' et al., I9¿2). Он был назван ТSí-фрагментом. Таким обр;

зом, и-концевой термостабильный домен (тзй-домен) ь^-фрагмента . является конечным продуктом его протеолиэа.

Как было показано, в отсутствие ионов кальция плазмин отщепляет от фрагментов Dj или Dcate (аналоги ^-фрагмента) С-конце-вой участок f-цепи с м <=■ 13 кДа, в результате чего образуется D^ или ВЕ5,1д-фрагм.знт (Kavei-kate and Timan, 1977), Аналогичный фрагмент (l>L) был получен нами из пепсинового гидрслизата D¿J-фрагмеита, Сравнение термодинамических параметров низкотемпературного перехода 1Д?1 в DH и D^-фрагментах позволило заключить, что С-концевой участок |'-цепи (мг а 13 кДа) формирует независимо сворачивающийся домен (Медведь и др., 1902; Privalov and Uedved', I9B2).

Длительный гидролиз фибриногена трипсином в присутствии ионов кальция приводит к появлению наряду с Вц и и^-фрагментами также фрагмента который обладает повышенной, по сравнению с By, антиполийеризационной активностью (Belitaer et al,, I960),' и, по-видимому, происходит из Вд-фрагмен'га. Мы проанализировали структурную организацию триптического dl2 (d.¿a по нашей терминологии)-фрагмента и установили, что по сравнению о Рд-фратаентом его/í-цспь расщеплена в положении Арг^-Тред^ (Медведь .и др., 1987), Причем, С~концевоЙ участок/J-цепи с М„ ¡к 12 нДа (/ЗС-йеп-тид), образующийся при этом расщэплении, не етдалязтся от в^-фрагмекта в нативных условиях вследствие сильного взаимодействия с последним. Таким образом, фрагмента % и являются первыми высокомолекулярным* продуктами протеолиза сн-фрагм&нта, образую-щтется вследствие расщепления пептидных связей в " я ^-цепях соответственно.

Дальнейший'протеолиз и оьд-фрагментов приводит к появлению оолее ниэяомолекулярнмх фрагментов. На рис. 3 представлена кинетика протеолиэа о^-фрагмента различными протеазами: химотри-псином, эластазой^ трипсином и пепсином. Как видно из рисунка, независимо от типа прстеазы, расщепление до. üSD-фрагмента происходит, с образованием трех проузжуточних дискретных фрагментов: Dx, Dy и Ds. Такой дискретный характер протеолиэа мо;?ет указывать на дискретность структуры Cj-фрагмента, при. которой тоявлениз каждого нового фрагмента можно объяснить последоват^ль-¡ш/ отоплением дискретньтс структур - доменов. Чтобы проверить )то предположение, in выделили все обнаруженные фрагменту и прс-

кОо

кОа

5= в» «31 gгч-

о, ш g Г. К.^ез

о г в ю

Ч!

0 2 6 8

-'ml

О I 3 т

с -

»1-63

З-гв

6 О

0 12 3

Время гидролиза (час.)

Рис. 3. Электрофореграшы, отражающие ход протеолиза , D^-фрагмента химотрипсином (а), эластазой (б), трипсином (в) и пепсином (г).

анализировали их структуру (Medved1 et al., 1986; Mod-red' and s Mtvinovich, 1988; Литвинович и Медведь 1988).

Dj-фрагмент был выделен из 30-минутного триптического гид-ролизата Ь^-фрагмента гель-фильтрацией на колонке (2,5 к 60 с?,?) с Сефадексом 6-75 SF. Аналогичный фрагмент был выделен также иг 120-минутного химотриптического гидролизата ВтА~фрагмента гель-фильтрацией на колонке (2,5 х 60 см) с Сефадексом g-75 SP. Оба препарата JD-^-фрагментов состояли из двух компонентов с Мг & 70 и 12 кДа, скрепленных нексвалентними связями, и имели одинаков! полипеп'гкдкый состав.

Dj-фрагмент был выделен из 10-часового химотриптического гидролизата D^-фрагмента гель-фильтрацйеЙ на колонке (2.5 х 90 см) с Сефадексом G-IOO 3?.

в „-фрагмент, как и D^, был получен двумя путями: гель-филз трацией 6-часового химотриптического гидролизата ^-фрагмента. i колонке (2,5 х 50 см), заполненной Сефадексом g-ioo sf, а такк1 из 144-часового эластазного гидролизата т>у-фрагмента аффинной хроматографией на фкбрин-Сефароэе с послецумгяй гель-фяльтраци ей на коленке (2,5 х 93 см) с Сефадексом g-ЮО SP. Оба Э7-Фраг

мента состояли из двух компонентов с мг 47 и 12 кДа, скреплен-них нековалентно, и имели одинаковый полипептидный состав.

На рис. 4 представлены электрофореграммы выделенных фрагмент кДа ~МГ, кДа

82— 823 m __ —82

63 — еэ

ч70

D -47

Ш —28

-12

dh dl dy dla dx dz î3d

Рис. 4. Электрофореграммы различных фрагментов фибриногена.

итов, демонстрирующие их чистоту. Как видно иэ рисунка, у фрагментов dla, dx и Dj,, кроме высокомолекулярного компонента, присутствует низкомолекулярный £мг —12 кДа), предст-..зляющай С-кон-деьой участок /î-цепи, который прикреплен нековалентно к высокомолекулярному фрагменту и отделяется только е денатурирующих условиях. Диализ полипептидного состава высокомолекулярных компона-îToa показал ступенчатое уменьшение размеров f-цэпи в ряду В1Д—~

ч- ^читывгл5 что tsd-фрагмент соответствует н-концевому. гчастку Djj-фрагмента и является конечным продуктом протеолиэа, »бразование ^-фрагмента из происходят путем ступенчатого от-(епления С-концевых порций j'-цепи. При этом связь ^Рг372~^Ре373 i/9-цгпи dla, dx и d^-фрггнентов расцеплена (Дитвйновкч и Мед-■едь, 1988),, йиал! ; полипеитидного. состава Вг и В-^-фрагментов анже показал ступенчато? уменьшение размеров f-цепи путем отще-ления её С-концевж .участков» При этом/З-цепь- остается кнтаят-

ной и расщепляется по связи Арг372~^Ре373 в последнюю очередь пр1; переходе Яу в ^-фрагмент.

На. рис, 5 представлены кривые плавления полученных фрагмен-

' Т т

С„ {ккал-К-1. моль )

60 40

40 20

•-Л-

J_I_I_I * I *

I I I I I I < I I

тзо

1 I_I_1_

20 40 60 80 100 Температура (°С)

Рис. 5. Температурные зависимости молярных теплоемкостей различных фрагментов фибриногена в 0,05 М глициновом буфере, рН 3,5.

тов, а в табл. 2 - термодинамические парал!етры их отдельных переходов.. Как видно из таблицы, длл высокотемпературного перехода (КТХ).'во всех случаях калориметрическая й Вант-Гоффовская энтальпии совпадают, в то время как для низкотемпературного перехода (ЬТ1) калориметрическая энтальпия уменьшается ступенчато с уменьшением молекулярной массы фрагмента. Отношение лНка-УлНрФ отражающее количество доменов, при этом также уменьшает«; с с,4 для Вн-фрагмента до 1,3 для Детальный анализ гюлипептидного состава выделеннкх фрагментов и термодинамический днз_!П!з юг кривых плавления позволил выяснить доменную структуру й^-фрагмеита

Таблица 2.

Термодинамические характеристики плавления различных фрагментов молекулы фибриногена.

Пик Ш ни

Фрагмент (мг, кДа) T дНкал дИэ$ n т дНкал ДНЭФ п

DH(95) 45,0 263 107 2,4 39,0 1X5 IXI 1,0

Dl.(82+I2) 40,0 239 101 2,4 89,0 1X2 110 1,0

Dl(02) 45,0 2X0 1X2 2,0 88,0 107 103 1,0

70+12) 40,0 179 92 2,0 . 88,0 96 35 1,1

D^(63) 41,3 114 90 1.3 83,5 86 90 1,0

Dz(47+12) 33,0 93 71 1,3 81,0 71 74 1,0

TSD(28) 74,0 83 79 1,0

Т - температура перехода;дНкал идП3® - калориметрическая и Вант-Гоффовпкая энтальпии соответственно, п - их отношение.

и предложить схему ступенчатого протеолиза Ejj-фра! кен-та до T3D-фрагмента (рис. б). В соответствия с этой схемой Од-фрагмент состоит из пяти доменов: термостабильного TSD и четырёх термолабильных fC и /3, jSC, образованных G-концерыми участками f и Д- . цепей соответственно. Причем, /3 и /ЗС-доыены, как било показано |4а основании термодинамического анализа LTl-пика D^-фрагмента, сильно взаимодействуют между собой (Hedved1 et ьХ.» 1966). Именно, поэтому /3С-домен ассоциирован с DLA, Dx и ^-фрагментам!? и..не удаляется в неденатуриругоцих условиях после расцепления сеязи-Аргз72-Трез7з< Дальнейший г.ротеолиз Яд-фрагментов протекает путей последовательного отщепления fC, )Г, а затэм /ЗС и/З-доменов, приводя в конечной ктоге tí образования тзо-фрагмекта.

A ft С

r rc

tJ—

МбзИ

...........

\ V

тэЬ(га)

D„(47+12)

Рис. 6. Схема ступенчатого протеолиза Djj-фрагмента ' до TSD-фрагмента.

1.4. Границы между доменами в молекуле фибриногена.

' Учитывая высокую степень, гомологии человеческого и бычьего фибриногена, особенно их /3 и р-Цвпей <brieglstein and Henschon,

1989), следует ожидать, что их доменная организация является сходной. Поскольку протеолитическое расщепление фибриногена приводит к образованию компактных фрагментов, состоящих из наборов различных доменов, как было показано,выше, места преимущественного протеолиза можно рассматривать в качестве примерных границ между индивидуальными доменами. Места протеолитического расщепло ния локализованы в основном для человеческого фибриногена. Они представлены схематически на рис. 7. Очевидно, эти места должны быть расположены на границах между доменами. При переходе человеческого фрагмента dhj(d.[.) в dl (DJ расщепляется f-цвпь в по-' ложении Лиззо2~Фензоз (Herrschen, 1981). При переходе бычьего рн-фрагмента в расщепляется /3-цепь в положении ^Pr372"^Ps373 (в/9-цепи фибриногена человека эта связь находится в положении А5г365-ТР8366^ Медведь и др., 1987). Известно, что f и ß-цепи происходят от одного предка и имеют высокую степень гомологии (Dooüttle, 1983). В процессе эволюции в некоторых областях этих цепей произошло либо выпадение, либо вставки отдельных аминокислотных остатков. Если это учесть и расположить последовательности ß и {'-цепей так, ,чтобы гомологичные участки совпадали, то оказывается, что места расщепления ß и, у-цепей в положении $365-366 (для фибриногена быка £372-373) и {"302-303 точно совпадают (Лит-винович и Медведь, 1988). Поскольку ß и f-цепи гомологичны и должны иметь подобную структуру (действительно,, каждый С-концевой участок ß и f-цепей фибриногена формирует по два домена); такое совпадение является серьёзным аргументом в пользу того, что именно здесь находится граница между доменами ß и ßG, а также jf и у С. - "

Граница между доменом T3D и ß и f-доыенами находится за дисульфидным кольцом поскольку именно здесь происходит

расщепление Л и f-цепей при образовании isu-фрагмекта (Uedved1 et al., 1982). Здесь же находится граница между о( С-даманом и SSD-доменом в соответствии с местами протеолиза Ad-цепи при пе- , реходе фибряногепа. в Х~фраг-менг„ Граница между TSE и TSD доменами находится посредине между двумя дисульфидныыи кольцами Kj и Kg, где находится ряд доступных протэазам связей, расщэпляеыых ' при образовании и Е-фрагментов (рис. 7).

На рис. 7 также представлены места расположения интронов t генах, кодирующих d, ß и f-цепи фибриногена в соответствии с

Т5Е-домен

__л.

ТЯЗ-домен

«С-домея

"v-

ТБЕ-домен

ТЖ-домен

СС-домен-

Рис. 7. Схематическое изображение полипептидных цепей Ас(, В/3 и формирующих субъединицу фибриногена. Участки цепей, входящих в состав Од и Е фрагментов, а также С-концевого фрагмента АсС-цепи (Мг — 45 кДа) обозначены черным цветом. Границы между участками полипептидных цепей, формирующими отдельные домены, - заштрихована» я£Эг5 - дисул^фидные связи;

ЕЕНИЗ - места выпадения отдельных аминокислотных остатков в С-концевых участках Вуз и ,-*-цепей;

* - места преимущественного протеолиэа в соответствии с Хешен и др. (1982); ф- места расположения кнтронов в соответствии с Крэбтри и др. (1985).

м о

(Crabtree ot al., 1985), После открытия экзон-интронной структуры генов было предложено, что зкзоиы кодируют участки полипептидных цепей, формирующие, отдельные домены (Gilbert, 1978; Blako, 1979), Последующий анализ соответствия экзон-интронной структуры генов доменной структуре кодируемых ими белков показал, что для ряда белков эта гипотеза подтверждается, но во многих случаях такого соответствия обнаружено не было (Blake, 1983). Это видимое противоречие можно объяснить следующим образом. Поскольку в процессе эволюции происходит отбор функционально активной конформации белков, то любые изменения структуры генов, как то выпадение интро-нов или встраивание новых в любом положении, не влияющие на первичную структуру белков, которая определяет их-наливную конформации, могут закрепляться. В таком случав следует ожидать иэсоотве-' тетвия между границами энзонов .и доменов для некоторых белков вследствие независимой эволюции конформации белков и кодирующих их генов. Для проверки этого предположения фибриноген Является' удобным объектом. Все три его цепи произошли от общего предка, причем, pf-цепь дивергировала на белее ра:¡них этапах эволюции, чем fl и {•' (Doolittle, 1983). Сравнение структуры кодирующих их генов показывает высокую эволюционную консервативность позиций интронов в участках, кодирующих Е-кснцезые области всех полипептидных цепей: в двух положениях позиции интронов совпадают для всех трех цепей, а в третьем - для ft и f-цепей (ркс, В участках, кодирующих С-концевые области,.такого совпадения нет» По мнения авторов (crabtree et al.,. 1985), в процессе эволюции здесь.произошло либо беспорядочное внедрение нитронов, либо ммадмме. Наиболее ин-тэресным является тот факт, ч*о в У-концввоЙ части примерные границы между доменами ТЗЕ и тзи, а также между T3D и (i и ^доменамй совпадают с положениями вышеуказанных интронов, т.е. границами экзонов. В С-концевой области фибриногена такого совпадения нет. Напрашивается вывод о том, что эволюция экзон-интронной структуры генов, кодирующих отдельные цепи фибриногена, и эволюция его до-' менной структуры происходили независимо, причем, участки генов, кодирующие к-концевые области всех трех цепей* оказались 'в зтом; плане наиболее консервативными. В таком случае места совпадающих интронов ot 103-104. /5134-135, j"76-77 и /3210-211, f152-153 можно , ' рассматривать в качестве границ мэкду.тЗЕ и ТЗВ-домена>ги и между TSD и /3 и /"доменами соответственно.,

Таким образом, анализ мест протеолиза при образовании про теолитических фрагментов наряду с анализом экзон-интронной структуры генов, кодирующих полипептидные цепи фибриногена, позволил оценить границы ь>ежду доменами в молекуле фибриногена, т.е. выяснить, какими участками полипептидных цепей сформированы отдельные домены. Это, в свою очередь, дает возможность рассчитать молекулярные массы отдельных доменов (см. Литвинович и Медведь. 1983).

1.5; Структурные характеристики отдельных доменов.

Знай молекулярные массы доменов, плавящихся в отдельных переходах, и энтальпии их плавления, можно рассчитать удельные энтальпии плавления этих структур. Их значения, полученные при различных рН, представлены на рис. 8 в виде зависимостей от тем-

Рис. 8. Температурные зависимости удельных энтальпий плавления термолабильных (М?1)и термостабильных (НТ2) участков в Пи-фрагменте и термостабильных участков Е-фрагмента (ни).

дН (кал-Н г-1)

12 8 4

40 60 80 100 Температура (°С)

пературы для LTI, HTI и ПТ2 переходов. Как видно из рисунка, эти зависимости близки для ни и HS2 переходов, где плавятся термостабильные TSE и TSD-домены, и сильно отличаются для ыг перехода, где плавятся термолабильные /3, ßO, у и ГС-домены. Различия в наклонах соответствуют наблюдаемым различиям в теплоемкости (лСр) нативного и денатурированного состояний для низкотемпературного и высокотемпературных переходов (рис. 2)'. Известно, что увеличение теплоемкости при денатурации компактной белковой структуры связано, в основном, с экспонированием внутренних гидрофобных групп водэ {Keuznwm. 1353; Privalov, 1979). Поэтому, меяй

заключить, что концентрация внутренних гидрофобных групп в термолабильных структурах Djj-фрагмента выше, чем в термостабильных структурах Е-фрагментов.

Судя по наклону функции удельнрй энтальпии, насыщенность термолабильных структур гидрофобными контактами весьма 'близка к компактным белк'ам глобулярного типа (Privalov, 1979). Вдобавок, эти структуры и компактные глобулярные белки имеют близкие величины удельной энтальпии при высоких температурах (12 кал-г-* при П0°С), что может рассматриваться в качестве показателя обширного насыщения компактной структуры гидрофобными и Ван-дер-Ваальсовы-ми силами (Privalov, 1979). Таким образом, из вышеуказанного следует, что термолабильные участки фибриногена, плавящиеся в области LTl-перехода, являются структурами глобулярного типа, т.е. они компактны и имеют хорошо развитое гидрофобное ядро. Этот вывод хорошо согласуется с наличием терминальных глобул в молекуле фибриногена по данным электронной микроскопии.

Что касается термостабильных структур DH и Е-фрагментов, то они имеют более низкое значение дСр, т.е. меньше внутренних гидрофобных групп, и более низкую величину удельной энтальпии при П0°С (7-8 кая-г-^). По значениям этих характеристик они напоминают суперспиральныа структуры белков сократительного аппарата (Потехин и Привалов, 1978; Потехин и др., 1979). Этот факт находится з хорошем соответствии с моделью, предложенной К.Коэн (1361), и детализированной Дулиттлом и сотр. <1978) на основании теоретического анализа аминокислотной последовательности фибриногена. Согласно этой модели, в каждой половине молекулы III еии-токчслотных остатков каждой цепи, расположенные между дисульфид-■адмк кольцами Kj и Kg (рис. I), находятся в ¿«-спиральной конфор-нации и "закручены" друг на друга, формируя тройнуп суперспирйль 3 неупорядоченной областью посредине, которая легко расщепляется •фотеолитичзским* ферментами при гидролизе фибриногена до Е и D-фрагментов. В таком-случае TSD-фрагмент, состоящий из трех IT- ■ сонцевых участков Ы, ß и {'-цепей, скрепленных дисульфидным кольцом, должен представлять собой участок такой суперспиралй. Действительно, содержание еС-спиральных структур в 'iSD-фрагменте !пг 2Ü кДа), рассчитанное Haj.ni из спектров кругового дихроизма 1ГД), составляет ииЗ по сравнению с 44^ для о^фрагмента, из ко-•орого TSD-tfparMeHT был полнен (Medved' et al., 1982). Учиты-

вая, что в соответствии с моделью Коэн-Дулиттла суперспиральная часть ^¿-фрагмента должна иметь молекулярную массу 15-20 кДа, т.е. 50-70% массы тзв-фрагмента, последний, несомненно, включает в себя часть о(-суперспиральных структур фибриногена. Приведенные виде экспериментальные результаты являются серьёзным аргументом в пользу вышеупомянутой модели.

Следует отметить, что дальнейший протеолиз Т50-фрагмента О.у^'28 кДа) химотрипсином приводит к образованию более низкомолекулярного фрагмента (мг» 21 кДа), имеющего, по данным КД, 83% ¿-спиральных структур (неопубликованные результаты). Он, по-видимому, и представляет собой практически "чистую" тройную супер- спираль. Аналогичный суперспиральный участок, согласно предложенной модели, должен входить в состав каждой из двух идентичных половин Е-фрагмента (каждого ТЗЕ-домена). Термодинамические характеристики соответствующего ему перехода НИ (значение дСр и удельной энтальпии при 110°, рис. 8) находятся в соответствии с этим предположением. Однако, в формирование кооперативной структуры каждого ТЗЕ-домена существенный вклад вносят не только аминокислотные остатки суперспиральных участков, но также и и-конце-вые области всех трех полипептидных цепей, расположенные в центральной части молекулы между дисульфидными кольцами "К^". Хотя вероятность образования здесь и и /3-структур, по данньм теоретического анализа, проведенного наш (Медведь и Литвинович, 1968), низка, наличие компактной структуры в центральной области молекулы (Е-фрагмента) не вызывает сомнения. Во-первых, эта область .насыщена дисульфидными связями, часть из которых находится вку~. три структуры и недоступна действию тиоредуктазы (ВХогаЪас! с г а1., 1974). Во-вторых, за исключением М-концевых участков/3-цепей, центральная область резистентна к дальнейшему протеолизу. И,.в-третьих, по нашим данным, часть триптофанилов в центральной уасти Е-фрагмента находится в.недоступном растворите;® состоянии, поскольку для его температурно-пертурбационного дифференциального спектра обнаруживается максимум при 305 им, характерный для компактных белков, который исчезает после денатурации ■ 8М хлористым гуенидином. Дополнительно методом динамического тушения флуоресценции нами было установлено, что из четырех триптофанилов, расположенных и центральной части, растворителю доступны только два (Зима к др.1980).

Наиболее интересной является структурная организация с'С-д менов. Как указывалось выше, эти домены плавятся в области 1Тупика с энтальпией, равней 105 ккал-моль-^ (табл. I) с ярко, выраженным скачком Теплоемкости лСр 5,98 ккал-К-^. моль-*, рассчитанными на,моль фибриногена (ы^ — 340 кДа). Принимая во внимание, что фибриноген включает два о(С-домена (м — 45 кДа каждого), удельная энтальпия их плавления и удельный скачок теплоёмкости составляет примерно 1,17 кал.г-* и 0,07 кал-К-*. соответственно. Эти величины существенно ниже соответствующих значений для компактных глобулярных белков. Различия между рассматриваемыми структурами и компактными глобулярными белками становятся особенно очевидными яри сравнении удельных энтальпий плавления, экстраполированных к 1Ю°С при помощи уравнения:

т ,

ЛН(Т) » лп(1т) + J АСр ¿т,

ш . ф <

т .

где Д1!(тт) - удельная энтальпия плавления при температуре плавления Тт; Т - любая температура, для которой рассчитывается зн~ тальпия плавления лН(Т).

. Для с(С-доменов удельная энтальпия плаэления при П0°С, рассчитанная таким путем, составляет 4,7 кал-г""'', что составляет только 36% величины, характерной для компактных глобулярных белков (Рг1уа1оу, 1979). Это отклонение можно объяснить либо менее компактной структурой «<С-доменов, стабилизированной меньшим, количеством вторичных связей, либо наличием в оСС--доменах компактных и некомпактных участков, как в гистоне Н| (Т1к1;ори1о et а!,, 1962). Детальный анализ аминокислотной последовательности рассматриваемого участка Ы-цеШ показал неравномерное распределение полярных и неполярных остатков в различных ег~ частж. Так первая половина этого участка практически лишена неполярных остатков и насыщена серином, глицином* треонином и пролином, которы? не способствуют формированию компактной структуры. Большинство неполярных остатков, которые характерны для компактных структур, сконцентрировано во второй половине С-концевого участка АоС-цеин (рис.. 9), Компьютерный анализ вероятности образования регулярных--структур, проведенный совместно с А.Финкельштейком по алгоритму, предложенному ранее (РПЬзуп тй РШко^еа1983), Также пока-

Рис. 9. Распределение неполярных остатков (а), пролинов (б) и вероятность образования регулярных структур ,(в) С-концевьш участкам Ас(-цепи молекулы фибриногена. Вероятность образования сС-спиральных структур обозначена сплошной линией,$-структур - пунктиром.

зал высокую вероятность формирования Ы и /3-структур на участке между 390-550 остатками, в то время как на участке между 250-320 остатками такая вероятность практически равна нулю (рис. 9). Таким образом, только вторая половина рассматриваемого участка Ао<-цепи (остатки 390-550 или 40% массы «лС-домена), формирует компактную кооперативную структуру, в то время как остальные участки, .по-видимому, находятся в неупорядоченной конформации. В этом случае удельная энтальпия плавления компактной части о(С-домена, составляющей 4С$ его.массы, будет близка к таковой для типичных глобулярных белков. Это значит, что каждый лС-домен имеет компактную область глобулярного типа, соединецную с остальной частью молекулы при помощи длинной неупорядоченной полипептидной связки, составляющей около половины массы с(С-домена, причем, как было показано выше, глобулярные области двух <<С-доменов взаимодействуют между собой, формируя единый структурный блок. Такая структурная организация обеспечивает «<С-доменам независимую по отношению к ;другим структурам молекулы Подвижность, что играет существенную' роль при реализации некоторых их функций, в частности, при ;учас~

тии в процессе самосборки фибрина (см. раздел П). Независимо от нас к подобному заключению о структуре с<С-доменов пришли Эриксон И ФоуЛер (1983), обнаружившие методом электронной микроскопии дополнительную, четвертую, глобулу в молекуле фибриногена, которая располагается возле центральной глобулы и, по мнению авторов, образована С-концевыми участками Ас{-цепеЙ.

На основании полученных данных мы предложили модель-схему расположения кооперативных участков (доменов) в молекуле фибриногена (рис. Юа) (Privalo • andMedved', 1982; Медведь, 1985).

а АА УВ

Р Privalóv and Medved''.(+982) г ур„оотть ,(1985)

^^J А

láoseascm et al. (l98l)

Weiael et al. (1985)

Рис. 10. Предлагаемая модель-схема доменной организации

молекулы фибриногена (а), а также некоторые модели, предложенные другими авторами (б, в)-(см. текст).

Согласно схеме, в центральной части молекулы, откуда происходит фрагмент Е, находятся два взаимодействующих ТЗК-домена, каждый из которых сформирован тремя и-концевыми участками полкпзптидных цепей А<<, Вр, и В периферических частях молекулы, из которых происходят он-фрагментьг, находится по одноуу термостабмльнсму

- 2b

суперспкральному ISD-домену, сформированному из трах полипептидных цепей, и по четыре термолабильньк домена глобулярного типа. Два из них, f и /"С, сформированы С-концевым участком Г-цепи, два других, /3 и /ЗС, сформированы С-концевым участком /3-цепи и взаимодействуют между собой. Кроме того, имеется два взаимодействующих между собой «(С-домеча, сформированные С-концевыми участками iW-целей, Всего в молекуле фибриногена имеется 14 доменов, по V в каждой из двух идентичных субъединиц.' Эта модель не учитывает форму молекулы фибриногена к её отдельных доменов, однако позволяет понять, какие участки полипептидных цепей сворачиваются независимо, формируя отдельные'домены. Поскольку долгое время считали, что .фибриноген - трехдоменная структура, его центральному домену соответствует фрагмент Е, а терминальным доменам - фрагменты D, то в литературе утвердилась соответствующая терминология: центральный домен Е и два идентичных терминальных домена D. Фактически же эти области являются крупными структурно и функционально обособленными блоками, состоящими из отдельных кооперативных участков - доменов. Последние, по нашим данным, денатурируют и, по-видимому, сворачиваются независимо или квази-независимо и мо-'гут быть избирательно отщеплены протеазаыи без'существенного нарушения компактной структура соседних кооперативных участков. Более того, кооперативные участки коррелируют со структурно обособь ленными участками в фибриногене, обнаруженными методом электронной микроскопии в последнее время. Так, после нашего-предсказа-ния более сложной доменной структуры фибриногена (Медведь и Тик-топуло, 1979; Медведь и др. t 1980), Вайсел и сотр. ('1981) * используя данные анализа электронно-микроскопических картин упорядоченных кристаллических форм фибриногена, предложили модель молекулы в виде семи линейно расположенных глобулярных доменов, соединенных палочковидными сегментами. Разделение периферических глобул на две подструктуры было затем продемонстрировано в ряде работ (Williams, 1981; Мозезэоп et el.) 1981; Erickson and Fo- ■ viler, 1983) (рие. Юб). Проанализировав новые электронно-микроскопические данные по форме молекулы фибриногена, а также результаты собственных исследований, полученных методом электронной микроскопии и рентгенструктурного анализа кристаллов модифицированного фибриногена^ Вайсел и сотр. (1985) предложили грубую .трехмерную модель молекулы фибриногена (рис. Юв),.Сравнивая эту

модель с предложенной нами, нетрудно представить, что f и fC-домены формируют дистальнуга глобулу фибриногена, а ß и /зС-домены проксимальную. Следует ожидать, что при более детэльных исследованиях в. каждой из этих глобул будут визуализированы по две подструктуры, соответствующие Г, /*С и /г, /ЗС~доменам. Предварительные исследования кристаллов фибриногена действительно указывают на . наличие двух глобулярных единиц в проксимальной глобуле (O.Cohen, персональное сообщение), Выяснение соответствия меиду калориметрически определенными доменами в фибриногене и глобулярными структурами, обнаруживаемыми электронной микроскопией, явилось бы существенным вкладом в развитее представлений о трехмерной структуре фибриногена. ;

Полученные данные позволили выяснить детальную доменную структуру молекулы фибриногена и уже на новом уровне подойти к пониманию некоторых механизмов функционирования этого1 белка.

РАЗДЕЛ П.

Функциональная воль отдельных доменоб молекулы фибриногена

Фибриноген является полифункциональным белком. Такс я полифункциональность тесно связана с его мультидоменной структурой. . Различные домены фибриногена выполняют различные функции, определяющие важную роль этого белка в системе гемостаза. Так, термостабильные домены, по-видимому, образуют своего рода жесткий суперспиральный "скелет" молекулы, который придает механическую прочность фибриневеку сгустку. Кроме того, на TSE-доменая-находятся центры взаимодействия с тромбином и ллазминогеном, которые реализуются в процессе свертывания крови и фибринолиза. Здесь также локализованы основные центры полимеризации £j и Eg, которые "открываются" после отщепления фибринопептидов А и В тромбином при активации фибриногена в фибрин. Термолабильные глобулярные домены несут активные центры полимеризации <ij и d2l комплементарные Ej и Ео-центрам iSB-доменов,'а также различные центры взаимодействия, локализованные в основном в с<С-домене. <*С-домены участвуют во взаимодействии фибриногена с фибронектином, ускоряют активацию фактора ХШ, участвуют в акгквацки плазмикогбна в плазмин и других процессах. Этот перечень функциональной роли

отдельных доменов далеко не полный. Некоторые функции, присущие .'фибриногену, пока не локализованы в отдельных домжах. Между тем, возможность получения из фибриногена различных протеолитических фрагментов, состоящих из одного или группы доменов, позволяет это сделать. Знание более детальной структуры отдельных доменов фибриногена также крайне важно для понимания механизмов его функционирования.

Целью дальнейших исследований явилось выяснение функциональной роли и механизмов функционирования отдельных доменов фибриногена.

2.1% Роль и(С-доменов в процессе самосборки фибрина.

Поскольку С-концевые участки Aof-цепей легко доступны проте-азом, в крови человека в норме обнаруживается фракция фибриногена с укороченными Ао(-цепями. При некоторых патологических состояниях содержание этой фракции увеличивается. Показано, что такое повреждение Art-цепей приводит к нарушению нормального хода полимеризации фибрина (Sherman et al., 1969; Phillips, 1981). Это значит, что с<С-домены принимают участие в процессе самосборки фибрина.' Однако, их роль в этом процессе оставалась невыясненной. Для решения этого вопроса мы изучили детально процессы полимеризации мономерного фибрина с интактными и поврежденными е(С-доме-наш.

Наиболее подходящим кандидатом, моделирующим фибрин-мономер с поврежденными eCC-доменами, является ранний продукт протеолиза фибриногена - Х-фрагмент. Известны два вида Х-фрагментов; Xj (Мр os 290 кДа) и Х2 (Мр« 240 кДа), причем, свертываемость первого достаточно высока для проведения функциональных исследований.

. Xj-фрагмент был выделен из раннего плазминового гидролизата фибриногена ступенчатым высаливанием' сульфатом аммония по модифицированной методике Филипса (1981), описанной в работе (Медведь и др., 1966).. Анализ полипептидного состава показал, что один С-концевой участок его Ао<-цепи 42 кДа) полностью отщеплен, у

второго отсутствует участок с мгсг 12 кДа, т.е. один ¿С-домен отсутствует, второй существенно поврежден (Горкун и Медведь, 1984), Несмотря на высокую свертываемость i&92%) такой Xj-фраг-мент после обработки тромбином образует в низких концентрациях

(0,05 мг/мл) аномальные (дефектные) сгустки (Горкун и Медведь, 1983). Поскольку причиной образования таких сгустков могли быть несвертывающиеся примесг. выступающие в качестве ингибиторов полимеризации, мы подвергли дальнейшей очистке полученный Х^-фраг-мент путем его полимеризации тромбином с последующим "выкручиванием" сгустка и растворением его в уксусной кислоте при +4°0 (Несшей' et а1., 1985; Медведь и др., 1986), используя процедуру, описанную для получения мономерного фибрина (Варецкэл, 1955), Такая процедура позволила получить мономерный Хт--фрагмент, который, как и мономерный фибрин, был практически полностью свертываем, и в широком интервале ".онцентраций (0,05-0,2 мг/мл) образовывал гель, визуально неотличимый от такового, образуемого фибрин-мономером. Сравнительные электронно-микроскопические исследования процесса полимеризации фибрик-мономера и Х^-мономера показали, что протеолитическое повреждение <<С-доменов не вызывает заметных искажений в упаковке протофибриял внутри фиб|!йнового волокна (ыеагеа' et &!., 1985; Медведь И др., 19а5). В то же время скорость полимеризации исследуемых препаратов различалась.

На рис. II представлены кривые изменения мутности при поли-

е350 ' Рис. II. Кривые изменения мут-

0,15

ности в процессе политизации мономерного фибрина (сплошная линия) и Х-^-мономера (пунктирная линия) при концентрациях

0,05

белков, равных 0,2 (а) и 0,05 мг/мя (б).

0,01

0,03

J_^ I

5 15

Время (мин.)

Меризацил фибрин-мономера и Xj-мономера. Как было показано (Нап-igan et alf, 1980), такие кривые отражают различиje стадии процесса самосборки фибрина. Задержка в росте мутности (лаг-фаза) соответствует стадии формирования протофибрилл, в которых два ряда молекул фибрина смещены относительно друг друга на половину длины, образуя "нити" толщиной в ДЕе молекулы. Резкий подъем мутности соответствует второй.стадии, при которой протофибриллы латерально агрегируют, формируя фибриновое волокно. На этой же стадии происходит формирование из отдельных волокон трехмерной фибриновой сети, т.е. образуется сгусток. Время появления сгустка (*св) легко определить визуально. В качестве характеристики первой стадии полимеризации мокно выбрать длительность задержки подъема светорассеяния (лаг-фаза, *лаг), для характеристики второй стадии - максимальную скорость нарастания мутности (vwa!£c) • Kar. видно из рис. На, при сравнительно высоких концентрациях ( > 0,2 мг/'мл) различия в кривых полимеризации фибрин-мономера и Xj-мономера незначительны, однако они существенно возрастают ' при разбавлении растворов до 0,05 мг/мл (рис. 116). На рис. 12 показаны величины отношений. ьла1,, vMä[£c и tCB для этих белков в

Рис. 12. Соотношение скоростей

первой ( £»---) и второй

( °-о ) фаз самосборки, а также времен свертывания ( о.....о )

для мономеров фибрина и Xj-фраг-меята в зависимости от разбавления раствора.

отношение

10 б 2

5 15 Разбавление (мг/мл)

зависимости от разбавления раствора. Такие координаты позволяют наиболее удобно представить различия в скоростях самосборки Х^-мономера и фибрин-мономера. Как видно из рисунка, процесс сама-сбсрта Ху^сномера значительно чувствительнее к разбавлению, чем фибрин-мономера. Так, четырехкратное разбавление исходной смеси (с 0,2 до 0,05 мгД-л) увеличивает различия между скоростями об-

разования протофибрилл мономерным фибрином к Х2~фрагчеитом з б раз, а различия в скоростях формирования волокон и фибриновой сети в 9-10 раз (рис. 12). Отсюда следует, что протеолитическое повреждение «>(С-доменов ведет к резкой задержке процесса самосбо1-рки фибрина при разбавлении раствора. Очевидно, что «нтактные о<С-домены, которые имеются у мокомерного фибрина и отсутствуют у Х^-мономера, имеют центры полимеризации, которые вносят вполне определенный вклад в увеличение специфического сродства между Молекулами фибрина, ускоряя процесс их упорядоченной агрегации. Это особенно сильно проявляется в разбавленных растворах. Таким образом, <*С~домены принимают участие в формировании фибринового сгустка не как структурные -»лементы, а как фактор, ускоряющий. сборку сложной структуры. Причем, они вносят свой вклад как на первой, так и на второй стадии самосборки фибрина.

Учитывая, что компактные части с<С-доменов взаимодействуют между собой и соединйются с остальными структурами молекулы при помощи длинных неупорядоченных участков полипепт..дНых цепей, придающих им определенную подвижность по отношений к целой иоле-куле (рис. 13а), можно предложить следующий механизм участия с<С-доменов в самосборке фибрина. Взаимодействие между¿С-доменами, по-видимому, может осуществляться не только внутримолбпулярмо, но и межмолекулярно, причем, у мономерного фибрина, в отличие от фибриногена, межмолекулярное взаимодействие между «¿С-доменами оказывается преимущественным и обеспечивает образование мехмоле-кулярных связей (рис. 13б). Это дает возможность основным центрам йолимеризации, находящимся в центральных и периферически:: доменах, взаимодействовать быстро и точно при построении протофибрилл (рис. 13п). Аналогичным образом <*С-доменм ускоряют к латеральную агрегацию протофибрилл. Таким образом, оСС-домекы наполняют роль "щупалец", несущих дополнительные центры мсжмолекуля-рного взаимодействия. Эти "щупальца" способствуют быстрому нзхо- . ждению и ориентированному сближения мономерных молекул. Их роль особенно сильно проявляется в разбавленных растворах, где они существенно уменьшают расстояние между молекулами. В концентрированных же растворах расстояние между молекулами достаточно для быстрого взаимодействия между основными центрами, к вклад л'й-домэ-нов в скорость самосборки здесь несз-щественен.

Дополнительный исслррсщанкя показали, что по аналогичному

в к

Рис. 13. Схематическое изображение молекул фибриногена (а), мономерного фибрина (б) и протофибриллы (в). oiC-домены обозначены черным цветом, основные активные центры центральных и периферических доменов заштрихованы.

механизму ofC-домены ускоряют реакцию сополимеризации фибриногена с Н-концевым дисульфидным узлом (н-DSK) фибрина (Рыбачук и сотр., 1988). Причем, сильная зависимость этого процесса от ионной сиял указывает на преимущественно электростатический характер взаимодействия междуогС-доменавд. Аналогичный механизм, возможно, характерен и для взаимодействия фибриногена с тромбоцитами, имеющими рецепторы, взаимодействующие с С-концевыми участками {" и с(-цепей.

2.2. Изучение взаимодействия ТЗ&-домена с плазминогеном.

Растворение нежелательных отложений фибрина является важной биологической функцией фибринолитической системы. Фибринолиз является высокоупорядоченным процессом, в основе которого лежит «взаимодействие компонентов фибринолигической системы с фибрино- . -дам ^сууетксн посредством так называемых лизин-связывахщих участ-

ков, что обеспечивает строгую локализацию процесса активации плазминогена в плазшн на фибриновом сгустке. Пефермеятная часть плазминогена, состоящая из пяти крингловых доменов, содержит ли-зин-связывающие участки, играющие основную роль во взаимодействии плазминогена с фибрином. После посадки на фибрин плаэминоген активируется в плазшн под действием тканевого активатора плазминогена и расщепляет фибриновый сгусток до растворимых продуктов протеолиэа: Х-олигомеров, D-димеров, D и В-фрагментов и т.д. Понимание механизмов взаимодействия плазминогена с фибрином иг-, рает важную роль в выяснении молекулярных механизмов фибринолиза. В настоящее время ведутся гнтенсивные исследования по локализации фийрин-связывавдих участков в плазминогена и их природы. . Меньие известно о локализации и природе комплементарных им участков на фибрине. Удобными моделями для изучения взаимодействия плазминогена с фибрином и локализаций центров взаимодействия являются их протеолитические фрагменты. Благодаря изучению такого взаимодействия на уровне отдельньк фрагментов был внесен существенный вклад в понимание механизмов фибриколиза. Выделение новых фрагментов фибриногена, описанное в предыдущей главе, позволило получить дополнительную информацию о взаимодействии плазминогена с фибрином.

Как было показано, Е-фрагмент фибриногена содержит участок, комплементарный лизин-связывающему участку плазминогена (Varady and Patthy, 1983; Кудинов и Яежен, 1984). Причем, плазминоген-связываищий участок Е-фрагмента был локализован в С-концевнх частях его суперспиральных структур (Varady and Patthy, I9B4). Поскольку было известно, что D-фрагмент также имеет плазжноген-связывающий участок (Varady and Patthy, 1983), следовало ожидать, что он может быть локализован на его суперспиральной части, т.е. в TSD-домене. Поэтом!' мы изучили взаимодействие плазминогена с TSD-фрагментом (Lezen et al., 1986).

На рис. 14 представлены результаты аффинной хроматографии Лиз-плазминогена на колонке с иммобилизованным tsd-фрагментсм, демонстрирующие наличие плазминоген-связывапцего участка на последнем. Отсюда следует, что tsd-домены молекулы фибриногена (фибрина) имеют плазминоген-связывающие участки.

Известно, что d-j- -фрагмент содержит слабый плазминоген-СБяоызающкй участок; отщепление С-концеаого участка (М = 13 ггДзД

Е280

hie. 14. Афинная чроматография Диз-плазминогена на иммобилизованном 1'30-фрагменте. Стрелка показывает начало злюции раствором 3 мМ е-аминокапроновой кислоты.

0,6

0,4

20 40 Объем (мл)_

его f-цепи (fC-домена) приводит к II-кратному увеличению сродства вновь образующегося ИЕ!,ТА-фрагмента (D^) к Лиз-плазминоген-сефарозе (Varady and Patthy, I9Ü4). Наши детальные исследования показали, что тзо-фрагмент, так же, как и -фрагмент, имеет один центр связывания с такой же константой диссоциации, равной 0,44^М. Отсюда следует, что оба фрагмента имеют один и тот же . плаэминоген-евязывающий участок, который не повреждается в процессе протеолиза Ei^-фрагмента в tsd, Роль этого участка в процессе фибринолиза пока неясна. Тем более, что он "экспонируется" на стадии протеолиза Вн-фрагмента в D^, который, по-видимому, является редким продуктом протеолиза фибрина in vivo. Однако, вполне вероятна, что он реализуется в фибрине, образование которого, по-видимому, сопровождается конформационными изменениями й области терминальных домеНов, приводящими к экспозиции рассмат-. риваемого центра.

2.3. Повышение антиполимеризационной активности

^.¡-фрагмента при расщеплении связи Аргз^р-Тред^д.

Некоторые продукты расщепления фибринойого сгустка: X, У, Uj,-фрагменты, ц-димер - содержат активные центры dj и а£ и способны взаимодействовать как с мономерным, так и с' полимерным Фибрином. Однако, поскольку такие молекулы не содержат полного на бора центров, обеспечивающих самосборку фибрина, vx связывание

растущими полимерами фибрина приводит к заметному замедлению процесса полимеризации. Ингибирование самосборки фибрина продуктами его деградации, по-зидимому, является одним из механизмов регуляции этого процесса 1п у!то.

Юц-фрагмент является эффективным ингибитором полимеризации. Однако, в триптическом гидролизате фибриногена, содержащем ионы кальция, наряду с Бн-фрагмектом (мг^95 кДа), был обнаружен и ^-фрагмент (ы 82 кДа), имеющий более высокую антиполимериза-ционную активность (веНЛзег et а1., 1980). Мы показали, что он. отличается от Р^нфрагмента наличием расщепленной связи Арг372-Тре373 в /З-цепи, причем, С-иокцевой участок /3-цепи не удаляется из молекулы, тая что молекулярные массы сн и ^-фрагмента, определенные в нативных условиях, одинаковы (Медведь и др., 1937). Мы предположили, что такой фрагмент может образовываться из Г>я-фрагмента при плазмолизе. Чтобы проверить это предположение был изучен процесс расщепления Эу-фрэгмента плазминоад'в присутствии ионов кальция.

На рис. 15 представлены кривые, отражающие ёнтиполимериэа-

Рис. 15. Антипояимеризацион-ный эффект 1)н-фрагмеЧта (А), 24-часового (о) и 4 3-часового (о ) гидролизата 1>я-фраг-мента и очищенного ^-фрагмента

Конц. ингибитора (мг/мл)

ционный эффект Од-фрагмента и его плаэминового гидролизата, из которых можно рассчитать антиполимеризационкый эффект в удельных единицах, как было предложено в работе (Ве11*вег е* а1., 1973). Как видно из рисунка, удельная аятиполимеризационная активность гидролизата возрастает во врем<?ни_(в соответствии с рассчетамк с 13,3 единиц для Вн-фрагмен7а дб 33,4 единиц для 48-часового гидролизата). Увеличение активности сопровождается накоплением в

гидролизате продуктов протеолиза с молекулярной м?ссой 82 к 12 кДа. Наиболее активная фракция гидролизата, выделенная кз 48-часового гидролизата аффинной хроматографией на фибрин-сефарозе по методике, описанной в работе Белицера и сотр. (1980), состояла из двух компонентов с Ur 82 кДа и 12 кДа и имела удельную активность 45,4 ед., т.е. в 3,5 раза эыше, чем у исходного вк-фрагме-нта. По данным электрофореза и Н-концевого анализа эта фракция отличалась от ^-фрагмента наличием расщепленной связи Aprg^g-^)Ь373' пРичем, как и в случае 2jj2-фрагмента (см. предыдущий раздел) , С-концевой /jC-пептид (Мг а 12 кДа) был ассоциирован с остальной частью молекулы Ыг ** 82 кДа) при помощи нековалентных связей (lledved' et al,_, 1988), т.е. новый фрагмент (D^) ничем не отличается от В^-фрагмента, выделенного из триптического гидролизата. Таким -образом, в присутствии ионов кальция Ец-фрагмент под действием плазмина превращается в более активный D^-фрагмент путем расщепления связи Аргз72"^Р®373 в /3-цепи.

Калориметрические исследования показали, что расщепление этой связи приводит к дестабилизации термолабильных структур в В^д-фрагменте по сравнению с Х>н-фрагментом (рис. 5). Известно, что активация Яиз-плазминогена, заключающаяся в расщеплении только одной связи ^Рг5б0"^ал561 веДет к аналогичной дестабилизации доменов, формирующих активный центр (Novakhatny et al., 1984). превращение пепсиногена ь пепсин также сопровождается дестабилизацией структуры пепсина (Privalov et al., 1981). Напрашивается предположение о том, что обнаруженная нами активация Djj-фрагмента в D^ путем расщепления связи Aprgrjig-Tpeg^g имеет некоторое сходство с активацией профермента в фермент. Б связи с этим мы проанализировали процесс активации некоторых факторов свертывания крови. Оказалось, что при активации протромбина в тромбин одной.из расщепляемых связей является %'r27j_^Pe272 (Degen et al,, 1983), причем, эта связь.расположена в участке . Acnogj-'SeHggj, который имеет высокую степень гомологии с участком /J-цепи бычьего и^-фрагмента, где расположена расщепляемая связь ^P^g-Tpeg^ (рис. 16). В обоих белках эти участки расположены между доменами. Это указывает, на то, что оба „участка произошли от одного предка и в процессе эволюции, ло-ви-димрвдг, попали в протромбин и фибриноген .для обеспечения выполнения 'одинаковых функций, а именно, активации путем, ограниченно-

го протеолиза.

Представленные выше данные показывают, что существенное увеличение антипслимеригиционной активности ^-фрагмента после

гтти

г 265 | 275 ,

„ 365 1 375

- 360 --♦— — 370 —

001

..':' Рис. 16. Схема, демонстрирующая гомологию между последовательностями 21-члекных участков протромбина (а) и /3-цепи бычьего.и человеческого 1>н-фрагмента (б), содержащих расщепляемую связь Арг-Тре.*Стрелками указаны места расщепления.

расщепления его /3 А-ртд^-Тредуз пептидной овязи не является слу~' Чайным феноменом, а, возможно, представляет собой физиологически важный механизм регуляции процесса самосборки фибрина путем повышения антиполимеризационной активности продуктов его протеолиза (рис. 17). Для проверки этой возможности нужны дальнейшие ■: исследования. _

2.4. Механизм повышения антиполимеризационной активности;' %-фрдгмента и его возможная роль в процессе самосборки фибрина.

Как было показано ранее, С^концевсй участок /'-цепи (¿'С-до-

ФИБРИНОГЕН

тромбин

ФИБРИН-МОНОМЕР

— — УЙН ингибиторы

ПОЛИМЕРНЫЙ ФИБРИН ПРОДУКТЫ РАСЩЕПЛЕНИЯ ФИБРИНА (Х-олигоМеры, |Оц| , D-D И др.

ингибирование ..............LIJ-- — I плаэмин

более сильный ингибитор

Рис. 17. Схема, демонстрирующая процесс самосборки, фибрина и его регуляцию путем торможения продуктами деградации фибрина* Пунктирная линия показывает возможный дополнительный путь регуляции, предлагаемый в данной работе.

мен) принимает участие в формировании активного центра &lt который ответственен за связывание Dj tcH)-фрагмента с фибрин-Сефаро-эой (OXexa aod BudzynsJcl, 1981). Протеолитическое отщепление этого участка от %-фрагмента, приводящее к образованию ^-Фрагмента, ведет.к потере последним способности связываться с фибрин-Сефарозой. Однако, мы обнаружили, что в высоких концентрациях DL-фрагмент способен тормозить процесс сэж:сборки фибрина, по-видимому, благодаря наличию активного центра &г. Последний, -как бьшо предложено, располагается в G-концевом участке <9-цепк по аналогии с dj-центром (Doolittle and Laudano, 1980). Используя синтетический пептид Арг-Гис-Арг-Про-Даксйл, который моделирует активный центр Е^» комплементарный d2-центру, мы показали, что он взаимодействует- с Ву-фрагь:ентом и не взаимодействует .с TSD-фрагментo.v.

откуда следует, что а2-цеьтр действительно расположен в С-кониэ-вом участке/З-цзпи (/3 и/или /ЗС-доменах) (Медведь и др., 1988; Kedved' et al., 1989). В таком случае повышение антиполимериэанионной активности и^-фрагмента по сразнению с фрагментом можно было бы объяснить конформацконннми изменениями, приводящими к повышению доступности а2~центра после расщепления связи /ЗАРГ372-Tpeg^g в последнем. Действительно, ^-фрагмент, полученный из »^-фрагмента при помощи протеолиза к отличающийся от исходного 1>ь-фрагмента наличием расщепления в положении /JAp^^g-Tpeg^, приобретает способность связываться с фибрин-Сефароэой (Medved1 and Litvinovieh, 1986). Это значит, что сродство d^-qeHTpa к фибрину существенно возрастает после расщепления вышеуказанной связи.

Представленные выше данные указывают на то, что активация ь ^-фрагмент путем расщепления связи /ЗАргду^-Трззуз сопровождается конформационными изменениями в термолабияьйых. доменах, ведущими к дестабилизации структуры последних и ¿кепонироЕанип dg-центра, который отвечает за повышение энтиполимериззционной активно сти ^д-фсагмзнта.

Природа таких конформационных изменений неясна. Однако, они могут вызываться, по-видимомуне только расщеплением сгязи между /3 и/зС-доиенада (Мр^й'^р^з)» Недавно было показано, что удаление углеводного компонента фибриногена, прикрепленного возле расщепляемой связи к /ЗАспдвд (Acng^j з /3-цепи бычьего фибриногена) , приводит к существенному увеличению скорости полимеризации фибрина (Langer et al., I98B). Напрашивается предположение о том, что удаление углевода приводит к подобным информационным изменениям, приводящим к экспонированию d^-центра, который отвечает за увеличение скорости самосборки фибрина. Не исключено, что аналогичные конформациоиные изменения происходят в области термолабильных доменов фибрина при взаимодействии Ej-dj-центров,. приводящем к формированию протофибриллы. В таком случае экспонирование d,-центров может приводить к формированию своего рода центров латеральной агрегации повышенного сродства, способствующих ускорении процесса самосборки фибрина. Необходимо отметить, что ноны кальция также играют существенную роль в ускорении са- ' мосборки фибрина. Причем, связывание происходит только пос-jje отщепления фнбринопептндов A (Mihaiyi, 1988), т.е. после фор-

мирования протофибрилл, которое в соответствии с вышеизложенным предположением должно сопровождаться экспонировгнием ¿2-центров вследствие конформационных изменений. Пока неясно, участвует ли в индукции таких изменений или же "закрепляет" новую конфо-рмацию, "наведенную" взаимодействием Е1-<1-). и способствующую латеральной агрегации протофибрилл.

Экспериментальное доказательство вышеизложенной гипотезы явилось бы существенным вкладом в выяснение тонких молекулярных механизмов самосборки фибрина.

ВЫВОДЫ

I. Детально изучен процесс тепловой денатурации фибриногена. Показано, что молекула фибриногена состоит из участков различной стабильности, которые плавятся в четырёх температурных областях. На основании анализа кривых плавления интактного белка и его фрагментов протеолиза установлена последовательность выплавления отдельных структурных участков в молекуле фибриногена.

- Р.. Получен ряд новых фрагментов протеолиза фибриногена, имеющих компактную структуру,й установлена их доменная организация. На основании термодинамического анализа отдельных, дек&тураци-онных переходов в фибриногене и его фрагментах протеолиза установлено, что молекула фибриногена состоит из 14 кооперативных участков - доменов. Предложена модель-схема доменной организации фибриногена.

3. На основании анализа доменной структуры молекулы фибриногена, расположения мест протеолиза, связанных с отщеплением её отдельных, доменов, а также известной окзон-интронной структуры

, генов, кодирующих отдельные полипе.чтидные цепи фибриногена, установлено, какими участками полипептидных цепей фибриногена формируются его отдельные домены.

4. Обнаружено, что по термодинамическим параметрам денатурации с содержанию Ы-спиратьных структур ТЗС-домены фибриногена соответствуют структурам суперспирзлъного типа, что является экс-•аериментальным доказательством модели суперспиральной укладки

, ролшептидных цепей в отдельных участках молёкулы фибриноген^

предложенной ранее на основе теоретических рассчетов.

5. Изучена детально структурная организация С-концевых участков А<<-цеией фибриногена. Показано, что, в отличие от ранее существовавших представлений о неупорядоченном характере их кон-формации, две кы-цет формируют две компактные кооперативные структуры -с<С-домены которые взаимодействуют между собой и соединены с остальной частью молекулы при помощи неупорядоченных участков полипептидных цепей.

6. Установлено, что о(С-домены фибриногена несут дополнительные центры полимеризации, межмолекулярное взаимодействие между которыми приводит к суще1 твенному увеличению скорости полимеризации фибрина в разбавленных растворах. Предложен механизм участия е<С~доменов в процессе самосборки фибрина.

7. Методом афинной хроматографии показано, что плазминогенсоязы-вающий участок ¡^-фрагмента фибриногена расположен1 в его ТЗБ-домене *

8. Показано, что расщепление связи Арг'372""^Ре373 в /3-цепи бычьего йу-фрагмента приводит к существенному увеличению его анти-полимеризационной активности. Такое увеличение связано с кон-формационными изменениями в терминальных термолабильн лх доме-' нах, приводящими к повышению доступности второго поли.^ермза-ционного Центра и2).

Список работ, опубликованных по теме диссерт ¿ции:

1. Зима В.Л,, Медведь Л.В., Варецкая Т.В., Коваль В.Г. Флуоресцентные исследования температурных переходов в фибриногене и его фрагментах // Докл. АН УССР.-1979-сер.Б.-№5-С. 712-714.

2. Медведь Л.В,, Тиктопуло Е.И. Микрокалориметрические исследования плавления фибриногена и его фрагментов // УП Всесоюзная конференция по калориметрии и химической термодинамике - Тез. докл.-Иваново, I979-2-C. 421-422.

3. Привалов ПЛ., Медведь Л.В., Тиктопуло Е.И., Зима В.Л., Варецкая Т.В. Исследование температурных переходов в фибриногене и его протеолитических фрагментах // 1У Всесоюзный биохимический съезд - Тез.докл.-Ленинград, 1979-М: Наука-1-С. 6-7.

4. Медведь Л.В., Тиктопуло Е.И., Привалов П.Л., Варецкая Т.В. Микрокалсрйметрические исследования температурных переходов в фибриногене и его протеолитических фрагментах // Молек.биология.-1980-14-вып.4-С. 835-842.

5. Медведь Л.В., Зима В.Л., Привалов П.Л., Горкун О.В., Варецкая Т.В. Структурная организация центрального домена молекулы фибриногена по данным спектрофлуориметрии и микрокалориметрии // У Совещание по конформационным изменениям биополимеров в растворах - Тез.докл.-Телави, I980-C. 91.

6. Зима В.Л., Луговской Э.В., Медведь Л.В., Гоголинская Г.К., Привалов П.Л. Структурная организация илокализация С-конце-вых участков «¿-цепей в молекуле фибриногена // Докл. АН СССР. -1981-256, №2-С. 480-482.

7. Medved' L.V., Privalov P.L. Microcalorimetric study.of domanial organization of fibrinogen molecule // International symposium on biocalorymetry.-Tbilisi, I93I-P. 19.

8. Медведь. Л.В., Угарова Т.П. Получение термостабильного участка домена d молекулы фибриногена // Докл. Ail УССР.-1982-рер.Б-JP0-C. 67-70. .

9. МедвХдь Л,В., Новохатн1й В.В., Варецька Т.В. Досл1дження структурно! орган1зац11 активно1 та неактивно1 форм D-фрагменту молекулн ф1бриногена // 1У Укр.б1ох1м.з'1зд - Тези доп.-Дн1-г.ропетровськ, I982-K: Наук.Думка-ч.2-С. 95,

10. Privalcv P.L., Medved1 L.V. Domains in the fibrinogen molecule // J.Wol.Jiiol.-ISb2-I59, N4-F. 665-683.

11. Медведь Л.В., Нойохатний В.В., Привалов П.Л. Получение и исследование структурной организации активной и неактивной форм D-фрагмента молекулы фибриногена // Молек.биология.-1982-16-вып.б-С. I195-1202.

12. Medved' L.V., Privalov P.L.,'Ugarova T.P¿ Iao'Xation of thtr-mostabls structure from the fibrinogen D-fragment // PEBS Lett.-1982-146, H2-P. 339-342.

13. Медведь Л.В, Структура D-фрагмента молекулы фибриногена и влияние на неё ионов Са^+ // У1 Двусторонний симпозиум СССР-Франция- Тезисы-Цхалтубо, I982-C. 119.

14. Горкун О.В., Медведь Л.В. Роль </С-доменов молекулы фибриногена в реакции свертывания, вызываемой тромбином //.Докл. АН УССР.-1983-сер.Б.-JM-C. 67-70.

15. Iäedved' L.V., Gorkun O.V., Privalov P.l. Struötüral organization of G-terminal parts of fibrinogen Aoi-chaina // PEBS Lett.-1983-160, HX.2-P. 291-295. !

16. Медведь Л.В., Горкун O.B. Исследование структурной организации oíC-доменов молекулы фибриногена и их роли в процессе полимеризации фибрина // У1 Всесоюзный симпозиум "Химия белков и пептидов" - Тезисы -Рига, I983-C. 124-125. :

Í7. Горкун О.В., Медведь Л.В. Структурная организация ранних продуктов плазминового гидролиза фибриногена Xj и Хр-фрагме-нтов /7 Докл. АН УССР.-1984-сер.В.-№3-С. 57-61.

18. Медведь Л.В., Горкун О.В., Белицер В,А. Функциональная роль с<С-доменов молекулы фибриногена // Докл. АН УССР;-1984-. eep.B.-Jß-C. 74-77.

Î9. Медведь Л.В., Литвинович C.B. Структурная организация d-фра-гмента, полученного путем дальнейшего плазминового гидролиза фрагмента DH молекулы фибриногена // 1У Симпозиум СССР-Италия "Макромолекулы в функционирующей клетке".-1984, Киев-К., Наукова Думка-С. 85.

20. Medved' 1.7., Gorkun O.V., Hanyakov V.l\, Eelitser V.A, The role of fibrinogen «(C-domains in fibrin assembly prqcoss //

• FEBS Lett.-I985-I8Ï, MI-P. I09-II2-.

21. Медведь Л.В. Структурная организация молекулы фибриногена // Укр. биохим. жури. -1985-57, ]й-С. 3Ô-49.

22. Медведь Л.В. Доменная структура фибриногена // У Всесоюзный биохимический съезд - Тезисы -Киев, I985-I-C. 17.

23. Дежен Т.И., Медведь Л.В., Кудинов С.А. Плазминогенсвязываю-щие свойства термостабильного участка D-фрагмента молекулы фибриногена // У Всесоюзный биохимический съезд -Тезисы -Киев, 1985-М.. Наука-2-С. 47-48.

24. Белицер В.А., Литвинович С.В., Медведь Л.В. Выделение и изучение структурной организации нового фрагмента молекулы фибриногена, полученного путем гидролиза легкого D^-фрагмента химотрипсином // У Всесоюзный биохимический съезд - Тезисы -Киев, 1985-М., Наука-2-С. 5-6.

25. Медведь Л.В., Горкун О.В., Маняков В.Ф., Белицер В.А. о<С-домены молекулы фибриногена как структуры, ускоряющие самосборку, фибрина // Молек.биология.-1986-20-ВЫП.2-С. 461-470.

26. Lezen T.I., Kudinov З.А., Medved' Ij.V. Plasminogen-binding iiite of fibrinogen fragment D thermostable region // FBBS Le«.-ISS6-I97, NI.2-P. 59-62.

27. Medved1 L.V., Litvinovich S.V., Privslov P.L. Domain organization of. the terminal parts in fibrinogen molecule // FEB3 Lett.-1986-202, N2-P. 298-302. '

'28. Литвинович С.В., Медведь Л,В. Выделение нового протеолитиче-ского фрагмента из химотрипсинового гидролизата оь-фрагмента молекулы фибриногена // Докл. АН УССР.-1986-сер.Б.-Ш-С. 6567.

29. Медведь Л.В., Лукинова Н.И., Литвинович С.В., Платонова Т.Н., Гусак 11.М-. Структурная организация "сверхактивной" фракции' D-фрагмента молекулы фибриногена // Докл. АН УССР.-1987-сер,В.-!Й-С. 73-76.

30. МедвХдь Л.В. Вивчення доменно! орган1зац11 молекули ф1брино-гену // У Укр.б1ох1м.з'1зд.- Тези доп. -1вано-Франк1вськ, 19ЕГ7-Ч.1-С. 105-106.

31. Рыбачук В.Н., Позднякова Т.М., Горкун О.В., Медведь Л.В., Белицер В.А. Роль ыС-доменов в реакции сополимеризацш фибриногена с н-концевым дисульфидным кольцом фибрина // Докл. АН УССР.-1988-сер.В.-!,"4-С. 70-73.

.32, Медведь Л.В., литвинович С.В. Мультидоменная структура молекулы фибриногена // п сб.: Бчсхимия животных и человека -К., ;!зук.,Ду.>.жа-19Ь8-вып.I2-C. 18-27.

S3, •м'.т.ведъ Л.В., Угарова Т.П., Литгинович С.В., Калихевич В.Н. •Локализация ¿„-центра полимеризации фибрина с помощью флуо-

ресцентного зонда (Uy-Hia-Arg-Pro-lffiG // У1 Конференция по спектроскопии биополимеров - Тезисы - Харьков, I988--C. 205206.

34. Литвинович С.В., Медведь Л.В. Схема протеолиза DH(95 кЦа) фрагмента молекулы фибриногена // Молек.биология.-1988-22, М-С. 934-943.

35. Medved' L.V., Litvinovich S.V. Domain Structure Of different fragments derived from fibrinogen D;j(9i kBa) fragment // Second Symposium of the American Protein Society - Abstracts -San-Diego, I9E8-P. 63.

36. Medved1 L.V., Platonova Т.К., Litvinovich S.V. Lukinova W.I. The cleavage of /З-chuin in bovine fibrinogen Ejj xranient

(95 kDa) leads to a significant increase in ita anticlotting activity // PE3S Lett.-1983-232, NI-P. 56-60.

37. Medved* L.V., Litvinovich S.V. The cleavage of/3-chain in bovine fibrinogen fragment Dj; leads to dsatabilization of its the.rmolabile domains and a significant increasing of an-ticlotting activity // in: Fibrinogen 3« Biochemistry, biological functions, gene regulation and expression - К.Мозеа-scn et al. Eds. - Excerta Kedica, Лязfc.-II.~L.-Oxford - 1989 -P. 301-304.

3S. Medved' L.V., Litvinovich S.V., Ugarova Д'.Р., Kalithevich V. Localization and some properties of d« polymerization site complementary to Gly-Hia-Arg-l'ro (E0) 3ite of bovine fibrinogen // Thrombos. Haemostaa.-19З9-62, KI-P. 1771

Информация о работе

Медведь, Леонид Васильевич
доктора биологических наук
Киев, 1989
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Доменная структура фибриногена и функциональная роль его отдельных доменов ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Доменная структура фибриногена и функциональная роль его отдельных доменов"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Доменная структура фибриногена и функциональная роль его отдельных доменов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия