Доменная структура фибриногена и функциональная роль отдельных доменов

Медведь, Леонид Васильевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Доменная структура фибриногена и функциональная роль отдельных доменов
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Доменная структура фибриногена и функциональная роль отдельных доменов"

СШвуИЛ^

АКАД1ШИЯ ИАУ ^УКРАИНСКОЙ ССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

МЕДВЕДЬ Леонид Иасильспич

УДК 577.112

ДОМЕННАЯ СТРУКТУРА ФИБРИНОГЕНА И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ГОЛ!» ОТДЕЛЬНЫХ ДОМЕНОБ

(Ш.ОО.ОЗ - Молекулярная биология)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени докюра бнилш ичсскнх паук и форме научно! о доклада

КИЕВ - 1991

Работа выполнена в Институте биохимии им. Л. В. Палладипа АН УСС (г. Киев) и в Институте белка АН СССР (г. Пущипо)

Официальные оппонепгы:

члеп-коррсспоидент АН УССР, доктор биологических паук, профессор ЕЛЬСКАЯ А. 11.

доктор биологических наук, профессор РОЗЕПФЕЛЬД М. А.

док гор биологических паук, КИБИРЕВ В. К.

Недущая организация: Московский государственны!) университет

им. М. В. Ломоносова

Защита состоится "24" СемГл^ОЛ 1991 года в ".

/О' час. па заседании

Специализированного совета Д.016.11.01 в Институте молекулярной биологии и генетики АН УССР (252627 г. Киев, ул. Забологпо! о, 150)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Автореферат разослан "_/_"

1991i ода

Учёны!) секретарь Специализированного совета

доктор медицинских паук , г/7

профессор ' • 'МкчН*' 0 КУЖИЕВСКАЯ Т. П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Системы свертывания крови и фибрииолнза являются важнейшими элементами гемостаза. Их правильное функционирование обеспечивает поддержание жидкого состояния крови, защиту организма от кровопогерь и эффективное удаление нежелательных отложений полимерного фибрина, приводящих к образованию тромбов и закупорке кровеносных сосудов.

Основная функция системы свертывания крови заключается в защите организма от потерь крови при повреждении кровеносных сосудов. Она включает в себя каскад биохимических реакций, направленных па превращение мономерног о фибриногена в полимерный фибрин, являющийся основой кровяного сгустка. Различные нарушения в этой системе, связанные с сердечно-сосудистыми заболеваниями, могут приводить к серьезным последствиям для организма, например, тромбозам. Для успешной борьбы с ними необходимо глубокое понимание молекулярных механизмов свертывания крови, требующее знания структуры и функций отдельных белковых компонентов этой системы.

Фибриноген является важным белком, принимающим участие в поддержании гемостаза. Уже на первой стадии свертывания крови он взаимодействует с тромбоцитами, способствуя их агрегации, которая является первичным процессом в закупорке поврежденных сосудов. После активации тромбином фибриноген превращается в мономерпый фибрин. Последний спонтанно полимернзуется и образует фнбрнновую сеть, которая является основой кровяных сг устков, закупоривающих места повреждения и препятствующих потере крови организмом. Полимерный фибрин участвует в активации фибрннолитической системы, а именно, является ма трицей, на ко юрой плазмнноген активирует ся в плазмиц при помощи тканевого акт иватора нлазминогена. Фибриноген также ускоряет- активацию XIII фактор» свертывания крови и взаимодействует с рядом бёлков: фиоронекмиюм, тромбоспонднном, коллагеном (тип IV) и др. Это далеко не полный перечень процессов и взаимодействий, в которые вовлечен фибриноген.

Вообще, для таких крупных белков, как фибриноген, характерна нолнфупкционалыюсть. Такая полифупкциопалыюсть, как правило, связана с их мулыидоменной структурой. Детальные знания доменной структуры белков позволяю г глубже поняп, механизм ич функционирования. Поэюму вопрос о структурной организации фибриногена является ключевым в понимании молекулярных механизмов снмосборкн фнбрнна н роли фибриио! ена н поддержании icMociaia.

Цель и задачи исследования: Целью данной работы явилось выяснение доменной организации молекулы фибриногена и изучение функциональном роли его отдельных доменов.

Для достижения эгой Цели,было необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить детально процесс тепловой денатурации фибриногена и ею фрагментов. Проанализировать отдельные температурные переходы в фибриногене и бго фрагментах и выяснить количество доменов в молекуле фибриногена.

2. Изучить структурные характеристики отдельных доменов и выясшпь, какими участками нолипентидных цепей они сформированы.

3. Изучить функциональную роль отдельных доменов и механизм их участия во внутримолекулярных и межмолекулярных взаимодействиях.

Научная новизна работы. В работе впервые детально изучен процесс тепловой дена+урации фибриногена Методом дифференциально!! сканирующей калориметрии. Кроме нзВест пых низко- и высокотемпературного переходов были обнаружены второй низкотемпературный н второй высокотемпературны/! переходы.

- Показано, что С-концевЫе участки двух Act - цепей, попреки существовавшим представлениям, образуют компактные структуры (аС-домены), которые взаимодействуют между собой и денатурируют в области второго низкотемпературного Перехода.

- Ограниченным Про+еоЛИзом Оц-фрагмеПта получен тсрмостабильпыИ участок фибриногена (TSD-фрагмент), плавящийся в области второго высокотемпературного перехода. Экспериментально показано, что он представляет собой тройную суперсииральпую структуру, существование которой было предсказано ранее (Cohen. 1961: Doolittle et al., 1978).

- Обнаружен дискретный характер дальнейше! о протеолпзп Оц-фрагмепга, соогветст вующего терминальным областям фибриногена, и получен ряд новых прогеолитических фрагментов (Dx, DY, Dz. TSD), отличающихся друг от друга набором доменов.

- На основании термодинамического анализа отдельных депатурацпоппмх' переходов в фибриногене и его фрагментах и анализа процесса пригеолпза Dn-фрагмента показано, что молекула фибрипщепа состой i не из трех, как предполагалось ранее, а из 14 доменов, которые имеют различную стабильность и денатурируют независимо в четырех температурных об пастях. Выяснено, какими участками нолппешпдпых цепей сформированы отельные домены. Предложена модель доменной организации молекулы фибриногена.

- Изучена роль аС-доменов в процессе самосборки фибрина. Показано, что они несут дополнительные центра полимеризации, взаимодействие между которыми существенно ускоряет самосборку фибрина в разбавленных растворах.

- Установлено, что под действием плззмииа в присутствии Са5+ Он-фра-гмент фибриногена превращается в П^д-фрагмент, имеющий в 3,5 раза более высокую антиполнмеризационную активность. Это превращение происходит путем расщепления пептидной связи в его Р-цепи и напоминает процесс активации профермента в фермент. Обнаруженное явление, по-видимому, представляет дополнительный механизм регуляции процесса самосборки фибрнпа путем повышения антиполнмериэациоиной активности продуктов его протеолнза.

Фибриноген явился первым крупным белком со сложной химической структурой, для которого была выяснена детальная доменная структура методами сканирующей калориметрии и ограниченного пратеолиза. Большинство обнаруженных нами доменов было впоследствии визуализировано методом электронной микроскопии другими исследователями.

Апробация результатов работы. Материалы диссертации докладывались на: VIII Всесоюзной конференции по калориметрии и химической термодинамике (Иваново, 1979); IV Всесоюзном биохимическом съезде (Ленинград, 1979); V Всесоюзном совещании по коиформационным изменениям биополнмерон в растворах (Телави, 1980); Всесоюзной конкуренции молодых ученых (Паку, 1981); Международном симпозиуме но биокалоримегрин (Тбилиси, 1981); IV Украинском биохимическом съезде (Днепропетровск, 1982); VI Двустороннем симпозиуме СССР-Франция (Цхалтубо, 1982); VI Всесоюзном симпозиуме "Химия белков и пептидов" (Рига, 1 983); IV Симпозиуме СССР-Италия "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Киев, 1984); V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1985); V Украинском биохимическом съезде (Ивано-Франковск, 1987); Всесоюзной конференции По спектроскопии растворов биополимеров (Харьков, 1988); Международных симпозиумах по фибриногену (Милуокки, 1988; Киото, 1989; Руаи, 1990); II Симпозиуме Американскою общее 1ва белковиков (Сан-Днего, 1988); XII Конгрессе Международного общества по изучению тромбозов и гемостаза (Токио, 1989), а 1акже в лабораториях д-ра М.Моссссона (Милуокки, 1988), д-ра Р.Дулипла (Ла-Хойя, 1988), д-ра А.Будзинского (Филадельфия, 1988, ' 1990), д-ра Б.Бломбака (Нью-Йорк, 1988), д-ра К.Коэн (Бостон, 1989).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Фибриноген И МоНомерный фибрин получал« из плазмы кропи быка по методикам, описанным ранее (Варецкая, i960: ВеШвег et al., 1968). Хь х2, Он. Dli Dla ,t>y ,Dz, IBD и E фрагменты были получены протсолитическим гидролизом бычьего фибриногена с последующей очисткой при помощи различных Diiiloa хроматографии по методикам, описанным ранее (Privalov and Medved', 1982), а также по оригинальным методикам, описанным и разделах I и II. Гомогенность препаратов проверялась электрофоретически п присутствии Додецилсульфата натрия (ДСН).

Молекулярные массы (Mt) фрагментов протеолиза фибриногена определяли а нативных условиях методом высокоскоростного равновесного центрифугирования (YphanUs, 1964), в также в денатурирующих условиях с Помощью ДСН-эЛекгрофореза по беЛкам-маркера.

N-коиЦевую аминокислотную последовательность определяли Дансил-хлориДПым методом (Weiner et al., 1972) совместно С U.M. Гусак (Институт Молекулярной биологии и генетики АН УССР).

Калориметрические измерения проводили на дифференциальном сканирующем калориметре ДАСМ-1М (Privalov, 1980) при скорости Прогрева 1 о/мин. И концентрациях белков в пределах 1-4 мг/мл. Термодинамический анализ кривых плавления осуществляли как описано в работе (Privalov and KhechlnashviH, 1974).

Спектральные исследования проводили на спектрофлуориметре Hitachi MPF-4, спектрофотометрах Specord UV-VtS и Specord М-40 (Carl Zeiss, Jena) и спектрополяриметре Jasco J-4.

ЭлекТрониомикроскопические исследования проводили на электронном микроскопе JEM 100 СХ (Jeol).

компьютерный анализ вероятности образования вторичных структур проводили совместно с А.Фипкельштейном (Институт белка АН СССР) по алгоритму, предложенному ранее (Ptltsyn and Finkclstein, 1983)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

раздел 1,

Доменная организация молекулы фибриногена

Фибриноген (Мг ~ 340 кДа) представляет собой химический димер, состоящий из двух идентичных субъедншщ, соединенных дисульфндными связями. Каждая субъединица образована тремя неодинаковыми поли-пептидпыми цепями: Ан, В(1 и 7 - также соединенными между собой дисульфндиымн связями (рис. 1а). В Ы-концевых участках А« и Вр цепей находятся короткие А и В пептиды, которые отщепляются тронбикрм при переходе фибриногена в фибрин. Первичная структура всех трех цепей человеческого и бычьего фибриногена полностью расшифрована.

Длительное время наиболее популярной моделью фибриногена была трехглобулярпая структура, предложенная Холом и Слейтером (1959) на основании электронпомикроскопнческих исследований (рис.16). Многочисленные результаты по протеолнтнческой фрагментации фибриногена и анализу его физико-химических свойств, полученные до середины 70-х годов, находились, в основном, в соответствии с этой моделью. Так, было показано, что при ограниченном протеолнза от фибриногена в первую очередь отщепляются длинные С-копцеиые участки Аа-цепей (Мг ~ 45 кДа каждый), в результате чего образуется Х-фрагмент, В дальнейшем этот фрагмент расщепляется до двух идентичных фрагментов Э и одного Е, происходящих из периферических и центральной части соответственно (рис. 1а). Было также установлено, что О и Е-фрагменты имеют компактную конформацию и сохраняют некоторые функции, присущие целой молекуле. Методом имиуноэлектронной микроскопии было Прямо показано, что центральная глобула фибриногена соответствует фрагменту Е, а две периферические - фрагментам О. Таким образом, в литературе утвердилось представление о том, что Молекула фибриногена состоит из трёх доменов*: центрального домена Е и двух идентичных терминальных доменов О,

* Под термином "домен" подразумевались крупные структурно и функционально обособленные участки молекулы фибриногена, которые наблюдались под электронным микроскопом в виде обособленных глобул и при ограниченном протеолизе выделялись в виде фрагментов О и Е, сохраняющих компактную структуру и некоторые функциональные свойства присущие интактной молекуле.

_/ч-^^ вкаав -а^р

ФИБРИНОГЕН

сг—

А__ /Э

х2-фрагмент

Б^-ФРАГМЕНТ Е-8РАГМЕНТ Он-ФРАГМЕНТ

Рис. 1. Схематическое изображение химической структуры фибриногена и продуктов его протеолиза (а), а также трехглобулярпой модели молекулы фибриногена (б).

А и В - фибрииопептиды, отщепляемые тромбином. К) и К2 -"дисульфидные кольца" в соответсгвии с (ОооПШе с1 а!.. 1978).

которым соответствуют три глобулы, обнаруженные Холом и Слейтером меюдом электронной микроскопии. Доноваи и Михалн (1974), изучая процесс депшуршщи (фибриногена методом дифференциальной сканирующей к.шоримегрнн, обнаружили два температурных перехода при 61°С и ЮОС, которые были отнесены к плавлению Г) и Е доменов соответственно. Было сделано заключение о том, что полученные данные подтверждают трехдомеипую модель фибриногена.

Наши попытки воспроизвести эти данные, используя метод спск-■ рофлуоримечрии, дали неожиданные результаты: высокотемпературный переход был обнаружен не только в (фибриногене и Е-фрагмеше, но и в П-фрагмеите (Зима и др., 1979). Стало ясно, что фибриноген содержит более двух видов структур с различно« стабильностью, и его структурная организация может быть более сложной, чем описывала трехдомегшая модель. Поэтому нами были предприняты детальные исследования структурной организации молекулы фибриногена методами дифференциальной сканирующей калориметрии высокого разрешения, ограниченного протеолнза и другими физико-химическими методами.

Калориметрические исследования были проведепы совместно с лабораторией П.Л.Привалова, в которой были разработаны новые высокочувствительные микрокалориметры и развиты подходы для термодинамического анализа структуры белков на основании данных сканирующей калориметрии.

1.1. Исследование тепловой денатурации фибриногена н его прогеолнтн-ческих фрагментов.

Изучение структурной организации сложных белков сопряжено с большими (рудноегями, связанными с неоднозначностью интерпретации полученных данных. Преодоление этих трудностей возможно путем изучения наряду с целой молекулой ее высокомолекулярных фрагментов протеолиза.

Процесс денатурации иптактной молекулы и се отдельных фрашешои несет информацию об их структуре: чем сложнее посфоен белок, тем сложнее протекает процесс его разрушения.

Поскольку разрушение компактной структуры белка связано с интенсивным тенлопоглощепием, и агрегация денатурированного состояния, являющаяся эндотермическим процессом, часто сопровождает дена!ураиню, искажая кривые |епдоио| лощения (плавления), п калпричегрнческих исследованиях важным этапом являе!ся подбор условий среды,

предотвращающих агрегацию белка после его денатурации. В центральной среде наблюдается интенсивная агрегация фибриногена в области е! о первого депагурационного перехода (около 60 "С). Поэтому для исследования тепловой денатурации фибриногена и его фрагментов были подобраны условия, при которых агрегационпые эффекты были минимальными или полиостью отсутствовали. На рис.2 представлены температурные зависимости молярных тсплоемкостей фибриногена и его фрагментов при рН 8,5 и 3,5. При рН 8,5 (рис.2а) картина плавления

Рис. 2. Температурные зависимости молярных теплоёмкости фибриногена (К) и ею фратспюв протеолпза Хг, Иц и Е в 0,05 М глицп-повом буфере, рН 8,5 (а) и рН 3,5 (б).

40 60 80 '100 Температура (°С)

фибриногена напоминает таковую, опубликованную Донопаном и МнхалН (1974). Следует также отметить, что в области 100 "С в этих условиях наблюдается начало агрегационных эф(|>сктов как у <|)нбрипо1 сна. так и у Оц-фрагмента. Однако, при рНЗ,5 каршна плавления значшельно более

ннформатинна (рис.26). Во-первых, у фибриногена появляется второй высокотемпературный пик теплопоглощеиия (НТ2), и, во-вторых, низкотемпературный пнк разделяется на две составляющие (LT1 и LT2). Агрегацнонные эффекты при рН 3,5 полностью отсутствуют в исследованной области температур. Из полученной картины плавления следует существенный вывод о том, что в фибриногене имеются структуры че1ырех типов, которые плавятся в различных температурных областях, т.е. имею/ различную стабильность.

Сопоставление кривых плавления целого белка и отдельных фрагментов позволяет локализовать плавящиеся структуры в целой молекуле. Так, в области первого высокотемпературного пика (НТ1) в фибриногене выплавляются термостабильные структуры, имеющиеся в Е-фрагмеите; в области вюрою высокотемпературного пика (НТ2) - термостабильные структуры, имеющиеся в D-фрагментах; в области первого низкотемпературно! о пика (LT1) - гермолабнльиые структуры, также имеющиеся в D-фра!ментах. Второй слабый пик теплопоглошення (LT2) имеется только у фибриногена и отсутствует у всех фрагментов, в том числе и у Х2-фрагмента (рис.26). Посколку Х2-фрагмент лишен длинных С-концевых участков Аа-цепей, пик LT2 соответствует выплавлению образуемых ими компактных структур. Из вышеприведенного следует, что, во-первых, С-концевые участки Аа-непей образуют компактные упорядоченные структуры, а, во-вторых, в Dn-фрагменге, а следовательно и в соответствующих частях молекулы фибриногена, имеются два совершенно различных типа структур с различной стабильностью; центральная часть молекулы также состоит из обособленных сфукттр, плавящихся независимо.

1.2. Кооперативные области в молекуле фибрииогепа.

Плавление фибрипо! епа в четырех различных температурных шмерпалах само по себе не означает, что каждый пик теплопог лощеиия отражает плавление отдельной кооперативной единицы . Как было показано (Frelre and Hiltonen, 1978: I'rivalov. 1979. 1982), кооператmmociь процесса может бы и, проаиа чизирована только па основе колнчестепно! о анализа функции энглныиш длч каждого перехода. В простейшей форме это может быть сделано пук'м сравнения калорнме1рнческой эщальнии процесса (ЛИ*1"), определяемой iq площади под пиком теплопоглощеиия, с эффсю нвной (Han 1 -Гоффонскои) зптальписй ( ДЦэФ), определяло» из ocsjwtj перехода. ( oBi.'ijiriuie jIи\ ¡1,:.;нчип Для любого данного огрзжает плавление

Таблица 1. Термодинамические характеристики плавления фибриногена и различных фрагментов его протеолиза.

Пик ЬТ1 ЬТ2 НТ1 * НТ2

Белок рн т ДН™ ЛН» п Т ДН— ДН"* п т ДН— дн-* п Т ДН"" ДН"" п

Фибриноген 3.5 8.5 45.8 56.0 540 802 113 156 4.8 5.2 56.2 103 76 1.4 90.2 95.0 244 311 254 222 1.2 1.4 100.5 252 127 2.0

Х^-фрагмент 3.5 45.0 535 116 4.6 85.0 *** 95.0 ***

Пи-фрагмгнт 3.5 8.5 45.2 56.0 263 350 110 143 2.4 2.4 89.2 119 116 1.0

Е-(\:рагмеиг 3.5 8.5 75.2 92.2 203 265 161 210 1.3 1.3

Т - температура нерсхола; ДПИЛ и ДН^ -калориметрическая и Бгшт-Гоффовская энтальпии: п - их отношение. * - ЬТ2 ппч не наблюдается »следствий сильного перекрывания с ЬТ1 пиком. - НТ2 г.;1К не наб';юл?ется р.сле.хтвме сильной агрегации ч области 100°С. - ДН,4'(гхТ1) -К'Ш"-'(НТ2) ~ 510 к кал/моль, о,шако Вачт-Гоффоьекая энтгльпия ие мо/кет бить рассчитана нслелстр.ие гсте?ог^нчосгн гермосгабнльныл участков.

одной кооперативной единицы, которая подвергается денатурацио/шому переходу между двумя макроскопическими состояниями. Превышение же калориметрической энтальпии над эффективной означает, что данный пик отражает плавление более одной кооперативной единицы, причем их количество иногда может быть рассчитано из соотношения этих энтальпий. Калориметрическую энтальпию можно рассчитать из площади под пиком теилопоглощения, а эффективную - из формы кривой по модифицированному уравнению Вапт-Гоффа (РгГгаЬ^ 1979).

Калориметрические и эффективные энтальпии для температурных переходов в фибриногене и его фрагментах при различных рН представлены в табл.1. Из таблицы видно, что отношение ДНкал/ДНэФ, близкое к единице, получается только для высокотемпературного перехода'в Г){!-фрагмепте. Плавление этой структуры к тому же полностью обратимо. Поэтому имеющееся совпадение калориметрической и эффективной энтальпий означает, что структура, плавящаяся в этом пике, представляет собой единый кооперативный участок. Для соответствующего перехода в фибриногене отношение ДНкал/ДНэФ близко к двум, что указывает па присутствие в нем двух таких участков и находится в соответствии с наличием двух структурных блоков О в молекуле фибриногена.

Переход НТ1 обратим как в фибриногене, так и в Е-фрагмепте. Для этого перехода отклонение отношения ДИк"л/ ДНЭФ от единицы довольно значительно для Е-фрагмептов, полученных различными путями (Рг1уп1т-апс! МесКсс!', 1982). Причем такое же отклонение от единицы (230%) было обнаружено для соответствующего Перехода в иптактиом фибриногене. Поэтому, можно заключить, что наблюдаемое отклонение отношения ДНка-"/ДНэФог единицы связано не с гетерогенностью изучаемых препаратов, а с внутренними свойствами данной системы, а именно, с тем, что Е-фрагмепт и соответствующая ему центральная область фибриногена состоят, по крайней мере, из двух сильно взаимодействующих кооперативных участков. Этот вывод хорошо согласуется с химической структурой Е-фрат мента, представляющего собой Димер, соединенный дисульфидпыми связями. Следует отметить, что это взаимодействие определяется сис1емой нековалеитпых связей, т.к. после восстановления межсубт,единичных дисульфидом* связей невозможно разделение фибриногена на две отдельные субъединицы (Ргосук & ШошЬаск. 1990).

Количественный анализ пнка ЬТ2, где плавятся структуры, образованные С-копцепыми участками Аа-цепей, за1руднен из-за его малой интенсивности и перекрывания с пиком ЬТ1. Однако, применив специальный

подхоД, описанный в р'аботе (Medved' at al., 1983), удалось выделить этот пик и рассчитать термодинамические параметры соответствующего ему Перехода. Как видно из таблицы 1, отношение ДНкал/Д№Ф для ЬТ2-пика выше 1,0 , но ниже 2,0. Такое отклонение величины отношения от целого значений для двух Идентичных структур может быть объяснено только предположением, что эти структуры, как и в случае с Е-фрагмеитом, не являются независимыми. Это Значит, что С-концевыс участки Аа-цепей формируют два кооперативных участка - аС-домена - которые взаимодействуют между собой, формируя единый структурный блок.

Возможность прямого термодинамического анализа первого низкотемпературного перехода (LT1) усложнена его необратимостью, в огличие от переходов LT2, НТ1 и НТ2, которые частично или полностью обратимы. Однако, так как рассматриваемый переход происходит при четко определенной темпера гуре, определяемой внешними условиями, и не зависит существенно от скорости прогрева (что специально проверялось), то наблюдаемая необратимость исходного состояния является результатом вторичных явлений, таких как слабая агрегация "расплавленного" состояния, изомеризация пролипов к др., тогда как процесс денатурации является равновесным. Как было показано ранее, для анализа таких необратимых переходов можно применять уравнения равновесной термодинамики (Prlvalov and Medved', 1982; Manley et al., 1985; Prlvalov and Potekhln, 1986; Sanches-Rulz et al.. 1988).

Как видно из таблицы 1, для пика LT1 в фибриногене величина ДНкал/ДНэф равна 4,8 при pH 3,5 и увеличивается до 5,2 при pH 8,5 скорее всего вследствие слияния пиков LT1 и LT2. Для соответст вующего пика у Du отношение ДН«ал/ДН3Ф равно 2,4, т.е. в два раза ниже, чем для LT1-пика у фибриногена, что согласуется с наличием двух Dn-фрагмептов в составе молекулы фибриногена. Величина этого отношения для белка, состоящего из нескольких независимых идентичных кооперативных участков, отражает, как правило, количество таких участков, плавящихся в данном переходе. Однако, если кооперативные участки неодинаковы по величине, взаимодействуют между собой и/или процесс их денатурации необратим, как в случае LTl-пика в фибриногене и Оц-фрагменте, эта величина только приблизительно коррелирует с их количеством. Для выяснения точной структурной организации такого белка необходимо применение дополнительных подходов.

Таким образом, па основании предварительного термодинамического анализа LT1 пика фибриногена и Df i-фрагмснт а можно сделать заключение

о том, что в каждой из дьух терминальных областей фибриногена плавится ие менее трех кооперативных участков. Точную структурную организацию этих областей удалось установить путем дальнейшей лротеолитической фрагментации соответствующего ни Пн-фратмепта и последующего структурного анализа новых более пизкомолекулярных фрагментов.

1.3. Структурная организация Рц-фрагмецта.

О1 рапиченньШ протеолиз белков является широко распространенным ■ подходом для выяснения их доменной структуры. При протеолнзе, как правило, в первую очередь подвергаются расщеплению наиболее доступные пептидные святи денатурированных структур, либо междомеппых областей, в результате чего образуются стабильные фрагменты, состоящие из одного или нескольких доменов. Так, первая модель трехдоменной структурной оришизации молекулы фибриногена базировалась также и па результатах ограниченного щ. .теолила фибриногена (си. выше). Однако из вышеприведенных экспериментальных данных следует, что крупные участки молекулы фибриногена, соответствующие его основным продуктам протеолнза - фрагментам Э и Е, которые обычно назывались Э и Е-доменпми, не являются простыми структурными единицами. Они представляют собой крупные структурные блоки, которые включают несколько более или менее независимых кооперат ивных единиц. В связи с ним вряд ли правомочно называть их доменами. Поскольку кооперативный учасюк денатурирует и,- следовательно, сворачивается независимо от остальных участков молекулы, он может рассматриваться в качестве элемеш арной структурной единицы - структурного домена - для любою белка. Это значит, чю П ц-фрагмепт, состоящий из нескольких кооперативных участков - доменов, может быть расщеплен, в принципе, до более мелких фрагментов, состоящих из меньшего числа доменов. Учитывая эт. были предприняты детальные исследования процесса протеолитической фрагментации Оц-фра1 мета различными протеашш.

Наличие в Оц-фрагмеи 1е термолг.бильшлх и термос обильных сгрукпр по)'.олп.чо подобрап. условия и изпиршельно отщемим, менее с обильные из них, плавящиеся в облает 1/П-пика (Медведь и Уырова, 1982). Эт было достигнут обработкой О ц-фрягмеш а пепсином в условиях, где термолабидьные структуры сильно дестабилизированы (рП 2,5; 1=25"С). При этом уже на ранних стадиях пртеолиза наблюдалось появление ряда фрагмента, хотрые быстро расшеилялн.-ь до фра!меи!а с Мг~ 28 кДа, ре ¡не !епт но! о к дальнейшему пршеолизу. Ле Iальный анализ паю

фрагмента показал, что он состоит из N-концевых участков всех трех цепей а, Р и у примерно одинакового размера (Mr ~ 9 кДа), соединенных дисульфидпыми связями, и представляет собой один кооперативный участок, плавящийся при высокой температуре, т.е. является термостабилыюй частью (термостабильным доменом) Dn-фрвгмснга (Medved' et al., 1083). Он был назван TSD-фрагментом. Таким образом, N-концевой термостабильный домен (TSD-домен) Он-фрагмента является конечным продуктом его протеолиза. Необходимо отметить, что он является не только структурным доменом, по и сохраняет плазминоген-связывающие свойства, присущие ему в составе Он-фрагмепга (Lezen et al., 1980), т.е. является И функциональным доменом.

Как было показано, в отсутствие ионов кальция плазмип отщепляет от фрагментов Dj или Dcate (аналоги Он-фрагмента) С-коицевой участок уцепи с МгГ_13 кДа, в результате чего образуется D3 или ВЕСТА-фрагмент (Haverkate and Timan, 1977), Аналогичный фрагмент (DL) был получен нами из пепсинового гидролнзата Он-фрагмеига. Сравнение термодинамических параметров низкотемпературного перехода LT1 в D„ и Оь-фрагмеп-тах позволило заключить, что С-концевой участок у-цспи (Мг~ 13 кДа) формирует независимо сворачивающийся домен (Медведь и др., 1982; Prlvalov and Medved'. 1982).

Длительный гидролиз фибриногена трипсином в присутствии попов кальция приводит к появлению наряду с DH и DL-фрагмеитами также фрагмента DL2, который обладает повышенной, по сравнению с D(I, аитнполнмеризациоиной активностью (Belltser el а!.. 1980), и, по-видимому, происходит из Он_фРагмеЧ'га- Мы проанализировали структурную организацию триптического Ьь2 (Dj^iio пашей терминологии) фрагмента и установили, что по сравнению с Он-фрагмептом его [i-цспь расщеплена (Медведь и др., 1987). Участок Р-цепи с Mrz_12 кДа фС-пеп гид), образующийся при этом расщеплении, не отделяется or 01Л-фрагмс1па в натпвпых условиях вследствие сильного взаимодействия с последним. Его можно удалить только в денатурирующих условиях (например: 4М мочевина, 2% Додецилсульфат натрия). Причём, оставшаяся часть молекулы содержит углевод, прикреплённый к Аспзц, а N-концсвой аминокислотой 12 кДа-пепгида является Тре. Поскольку трипсин, при помощи которого был получен D¡jv фраг мент, расщепляет .связи Арг-Х или Лиз-Х, то местом расщепления (i-цепи при образовании этого фрагмент является последовательность Арг-Тре либо Лнэ-Три. Такое сочетание аминокислотных остатков в р-цепи бычьего фибришхена находится в

положепнях Аргз72-Трез7з и Лизз9з-Трез94. Отсюда следует, что 12 кДа-фрагмеит представляет собой С-коцевой участок (i-цепи (РС-пептид), начинающийся в положении Трез7з или Трез94 (Медведь и др., 1987). Таким образом, фрагменты DL и П^д являются первыми высокомолекулярными продуктами протеолиза Оц-фрагмецта, образующимися вследствие расщепления пептидных связей в у- и р-цепях соответственно. При этом С-коицевой участок уцепи удаляется, в то время как С-коицевой участок (5-цепи (рС-непт нд) остаётся прикреплённым к остальной части молекулы при помощи нековалентних связей.

Дальнейший протеолиз VL и О^д-фрагментов приводит к появлению более пизкомолекулярных фрагментов. Па рис.3 представлена кинетика прогеолиза 1)|_-фрагмента различными протеазами: химотринсииом, элас газон, трипсином и пепсином. Как видно из рисунка, независимо от типа

1 W

Ù я»

у& -

Di-

tt El с,«-6Э Dt-n «» —

0 2 6 9

0[)tî 0 ] S T

.1 * и y

a о л

J Ч (1-м

□ 26

Нрсия гидролиза (час.)

Рис.3.-Элсктрофореграммы, отражающие ход протеолиза П|,-фрагмепга химшрнпсппом (а), элаегазой (б), трипсином (в) и пепсином (г).

протеазы. расщснлсине Г)[_ до ТвО-фрагмента происходит с образованием трех промежуточных дискрешых фрашенюв: Оу и Г32. Такой дискретный характер протеолиза может указывать на дискретность С1рук1уры П^-фра! мепта, при которой появление каждого новою фра!меша можно обьяспшь последовательным отщеплением дискрешых сфуктур - доменов. ЧюОы проверни, ло предположение, мы выделили псе

обпаруженные фрагменты и проанализировал)! их структуру (Мсс1уссГ е1 а)., 1586; МесЬгес!' апс1 иЫшМеЬ. 1988; Лнгвинович н Медведь, 1988).

Вх-фрагмент был выделен из 30-минутного триптнческого гидролизата О^фрагмента гель-фильтрацией на колонке (2,5 х 60 см) с Сефадсксом й-75 ЭР. Аналогичный фрагмент бы и выделен также из 120-минутпого химотриптического гидролизата Оц^-фрагмента гель-фильтрацией па колонке (2,5 х 60 см) с Сефадексом С-75 ЭР. Оба препарата Их-фрагмеитов состояли из двух компонентов с Мг~70 и 12 кДа, скрепленных пековалентными связями, и имели одинаковый полипептидпый состав.

е)у-фрагмент был выделен из 10-часового химотриптического гидролизата Оь-фрагмеита гель-фильтрацией на колонке (2,5 х 90 см) с Сефадексом 0-100 ЭР.

02-фрагмент, как и Ох, был получен двумя путями: гель-фильтрацией б-часового химотриптического гидролизата Вх-фрагмента па колонке (2,5 х 90 см), заполненной Сефадексом й-ЮО БР, а также из 144-часового эластазпого гидролизата Оу-фрагмепта аффиппой хроматографией па фибрин-Сефарозе с последующей гель-фильтрацией па колонке (2,5 х 90 см*

Мг, кДа Мг, кДа

95 8263-

ов

- 82 ~ 70

- 47

- 28

"** ~ 12 Он Оь Эьд Ох Оу 02 ТБО

Рис. 4. Электрофореграммы различных фрагментов фибриногена, полученных нз периферических частей молекулы.

с Сефадексом С-100 ЗР. Оба 02-фрагмента состояли из двух компонентов с Мг~ 47 и 12 к'Да, скрепленных нековалентно, и имели одинаковый полинептидный состав.

На рис. 4 представлены элекгрофореграммы выделенных фрагментов, демонстрирующие их чистоту. Как видно из рисунка, у фрагментов 01Л, Ох и кроме высокомолекулярного компонента, присутствует иизкомо-лекулярпый (Мг ~12 кДа), представляющий С-конневой участок [1-цепи, который прикреплен нековалентно к высокомолекулярному фрагменту и отделяйся только в денатурирующих условиях. Анализ полипептидного сост ава высокомолекулярных компонентов показал ступенчатое уменьшение размеров у цепи в ряду 0|Л=>0Х=»П2. Учитывая, что "ПЮ-фрагмент

Рис.5. Температурные зависимости молярных теплоёмкости различных Фрл! мен юв фибриногена в 0,05 М глициновом бу^хгре, р[ I 3,5.

Таблица 2. Термодинамические характеристики процесса плавления различных фрагментов фибриногена в 0,05 М глициновом буфере, рН 3,5.

Пик ЬТ1 ЬТ2

Фрагмент, (Мг, кДа) Т ДНкал ДНЭФ п Т ДНкал Д№Ф п

И,, (95) 45,0 263 107 2,4 89,0 115 111 1,0

Оич(82+12) 40,0 239 101 2,4 89,0 112 110 1,0

45,0 218 112 2,0 88,0 107 103 1,0

Ох(70+12) 40,0 179 92 2,0 88,0 96 85 1,1

Оу(63) 41,3 114 90 1,3 83,5 86 90 1,0

Ог(47+12) 33,0 93 71 1,3 81,0 71 74 1,0

ТЭО(28) 74,0 83 79 1,0

Т - температура перехода в °С; ДНкал и ДНЭФ - калориметрическая и эффективная энтальпии соответственно, п - их от ношение.

соответствует М-концевому участку Бц-фрагмента и является конечным продуктом лротеолиза, образование Юг-фрагмента из происходит путем ступенчатого .отщепления С-концевых порций у-цепи. При этом междоменная связь в Р-цепи 1)х и 02-фрагмептов расщеплена (Литвинович и Медведь, 1988). Анализ нолнпептидпого состава Оц, и Оу-фрагментов также показал ступенчатое уменьшение размеров уцепи путем отщепления ее С-концевых участков. При этом |3-цспь остается интактной и расщепляется в последнюю очередь при переходе в ХУ7-

фрагмент. ■ •

На рис.5 представлены кривые плавления полученных фрагментов, а в табл. 2 - термодинамические параметры их отдельных переходов. Как видно из таблицы, для высокотемпературного перехода (НТ1) во всех случаях калориметрическая й Вант-Гоффовская энтальпии совпадают, в то время как для низкотемпературного перехода (ЬТ1) калориметрическая

эитальпня уменьшается ступенчато с уменьшением молекулярной массы фрагмента. Отношение ДНкал/ДНэ4', отражающее количество доменов, при эт ом также уменьшается с 2,4 для Оц-фрагмента до 1,3 для Бу. Детальный анализ полипептндного состава выделенных фрагментов и термодинамический анализ их кривых плавления позволил выяснить доменную структуру Он-фрагмепта и предложить схему ступенчатого протеолиза Он-фрагмеита до "КЗО-фрагмеита (рис.6). В соответствии с этой

II,,(95)

^ /3 /ЗС

КО

Ст(82);

И -„-, -----82 + 12)

г гс

I I

ЛЗВ __

Пх(70+12)

,___¡ДР.

. --о -' аг(47+12)

тзисгв)

Рис. 6. Схема ступенчатого протеолиза Оц-фрагмента до ТЗЭ-фрагмеша.

схемой Оц-фрагме1гг состоит из пяти доменов: термострбильного ТЭО и четырех термолабильиых 7, уС и р, РС образованных С-копцевыми участками у и Р-цепей'соогветстпеппо. Причем, Р и рС-домепы, как было показано па основании термодинамического анализа ЬТ1-пика Оу-фр;и мента, сильно взаимодействуют между собой (МейуесГ е1 а1., 1980). Именно поэтому рс-домен ассоциирован с Ох и 02-фрагмен1ами и не

удаляется в неденатурируютцих условиях после расщепления пептидной связи в P-цепи. Дальнейший протеолиз О(гфрагмептов протекает путем последовательного отщепления уС, у, а затем PC и Р-доменов, приводя в конечном итоге к образованию TSD-фрагмента.

1.4. Границы между доменами в молекуле фибриногена.

Учитывая высокую степень гомологии человеческого и бычьего фибриногена, особенно их Р и у-цепе(» (Krleglstein and Henschen, 1989), следует ожидать, что их доменная организация является сходной. Поскольку протеолитическое расщепление фибриногена приводит к образованию компактных фрагментов, состоящих из наборов различных домепов, как было показано выше, места преимущественного протеолиза можно рассматривать в качестве примерных границ между индивидуальными доменами. Места протеолитического расщепления, локализованные для человеческого фибриногена, представлены схематически на рис.7. Места протеолитического расщепления для бычьего фибриногена различаются незначительно от таковых для человеческого (Henschen, 1990). Очевидно, эти места должны быть расположены па границах между доменами. При переходе человеческого фрагмента DH (Dt) в Dl (D3) расщепляется у-цепь в положении Лиззог-Фензоз (Henschen, 1981). При переходе бычьего Пц-фрагмепта в DIj4 расщепляется Р-цепь в положении Аргз72-Трез7з либо Лизз9Э-Трез94 (Медведь и др., 1987). Известно, что у и Р-цепи происходят от одного предка и имеют высокую степень гомологии (Doollttle, 1983). В процессе эволюции в некоторых областях этих цепей произошло либо выпадение, либо вставки отдельных аминокислотных остатков. Если это учесть и расположить последовательности Р и у-цепей так, чтобы гомологичные участки совпадали (Doollttle et al., 1979), то оказывается, что места расщепления р и у-цепей в положении Р365-366 (для фибриногена быка Р372-373) и у302-303 точно совпадают (Литвинович и Медведь, 1988). Поскольку р и у-цепи гомологичны и должны иметь подобную структуру (дсйс! ви тельпо, каждый С-концевой участок Р и у-цепей фибриногена формирует по два домена), такое совпадение является аргументом в пользу тою, ч то здесь находится граница между доменами р и PC, а также у и уС.

Граница между доменом TSD и Р и у-домспами находится за дисульфидным кольцом (К2), поскольку именно здесь происходит расщепление ¡5 и у-цепсЙ при образовании TSD-фрагмента (Mcdved' ct al.,

ТБЕ

Т80

Вр си

ТИЕ

ТШ

7с

. кс. 7. Схематическое изображение полипептидных цепей Асх, В(5 и у формирующих субъединицу фибриногена. Участки цепей, входящих в состав и Е-фрагмснтов, а также С-кс-.тевого фрагмента Лсх-цепи (Мг~45кДа) обозначены чёрным цветом. Границы между участкам! палииеигидних целей, формирующими отдельные домены, заш грихованы. Участки цепей, формирующие ТБЕ. ТЗО, аС, р, РС, у и уС домены отмечены фигурными скобками. - дисульфндние связи;

Е23.4 - места выпадения отдельных аминокислотных остатков в С-концсных участках ВР и у-цсней; Л -места расположения ишропов в соответствии с СгаЫтее е1а1. (1985); черными стрелками обозначены места совпадающих нитронов;

; -места преимущественного протеолиза в соответствии с НепьЬеп е1 а!. (1982); двойной стрелкой ( I }) отмечены места протеолиза при переходе Вн-фрагмента в Би(а1. текст).

1982). Здесь же находится граница между аС-домепом и TSD-домсиом и соответствии с местами протеолиза Аа-цепи при переходе фибриногена в X-фрагмепт. Граница между TSE и TSD доменами находится посредине между двумя дисульфидиыми кольцами К] и К2, где находится ряд доступных протеазам связей, расщепляемых при образовании 0ц и Е-фрагмеитов (рис.7).

На рис.7 также представлены места расположения нитронов в генах, кодирующих а , ß И у-цегш фибриногена в соответствии с (Crabtree et al.. 1985). После открытия экзои-интронпой структуры генов было предложено, что экзоны кодируют участки полипептидпых цепей, формирующие отдельные домепы (Gilbert, 1978; Blake, 1979). Последующий анализ соответствия экзоп-иптрошшй структуры генов доменной структуре кодируемых ими белков показал, что для ряда белков эта гипотеза подтверждается, по во многих случаях такого соответствия обнаружено не было (Blake, 1983). Это видимое противоречие можно-объяснить следующим образом. Поскольку в процессе эволюции происходит oiöop функционально активной копформации белков, то любые изменения структуры генов, как то выпадение нитронов или встраивание новых в любом положении, не влияющие на первичную структуру белков, которая определяет нх пативпую копформации), могут закреплят ься. В таком случае следует ожидать несоответствия между границами экзопов и доменов для некоторых белков вследствие независимой эволюции копформации белков и кодирующих их генов. Для проверки этого предположения фибриноген является удобным обьектом. Все три его цепи произошли от общего предка, причем, а-цепь дивергировала на более ранних этапах эволюции, чем ß и 7 цепи. (Doolittle, 1983). Сравнение структуры кодирующих их генов показывает высокую эволюционную консервативность позиций нитронов в участках, кодирующих N-концевые области всех полипептидпых цепей: в двух положениях позиции нитронов совпадают для всех трёх цепей, а в третьем - для ß и у-ценей (рис.7). В участках, кодирующих С-копцсвые области, такого совпадения нет. По мнению авторов (Crabtree et al.. 1985), п процессе эволюции здесь произошло либо беспорядочное внедрение нитронов, либо их выпадение. Наиболее интересным является тот факт, что в N-копцевоЙ части примерные границы между доменами TSE и TSD, а также между TSD и ß и у-домепами совпадают с положениями вышеуказанных консервативных нитронов, т.е. границами экзопов. В С-копцевой области фибриногена такого совпадения пет. Напрашивается вывод о том, что экзогьиитропиая структура генов, кодирующих отдельные

цепи фибриногена, и его доменная структура эволюционировали независимо на поздних этапах эволюции, причем, участки генов, кодирующие Г>1-концевые области всех трех цепеП, оказались в этом плане наиболее консервативными. В таком случае места совпадающих нитронов аЮЗ-104, Р134-135, у76-77 и Р210-211, 7152-153 можно рассматривать в качестве границ между ТЭЕ и ТЭО-домеиами и между ТЭО и Р и у доменами соответственно (Мебуеб', 1990).

Таким образом, анализ мест протеолиза при образовании протеолитических фрагментов наряду с анализом экзон-интронпой структуры генов, кодирующих полипептидпые цепи фибриногена, позволил оценить границы между доменами в молекуле фибриногена, т.е. выяснить, какими участками полипептидных цепей сформированы отдельные домены. Это, в свою очередь, дает возможность рассчитать молекулярные массы отдельных доменов (см. Литвииович и Медведь, 1988). Например, ТЭО-домеп, плавящийся в НТ2-переходе, составляет г 25% массы Оц-фрагмента, остальные 75% его массы приходятся на 4 термолабильных домена, плавящихся в ЬТ1 -переходе.

1.5. Структурные характеристики отдельных доменов.

Зная молекулярные массы доменов, плавящихся в отдельных переходах, и энтальпии их плавления, можно рассчитать удельные энтальпии плавления этих структур. Их значения, полученные при различных рН, представлены па рис.8 в виде зависимостей от температуры для ЦТ 1, НТ1 и НТ2 переходов.

аН (кал-К-1. г"1)

Рис.8. Температурные зависимости удельных энтальпий плавления гермо-лабнльпых (ЬТ) и терМостабильпых (НТ2) участков и Бн-фрагменте и терМостабильпых участков Е-фрагмента

(НТ1).

40 60 60 100 4 Температура (°С)

Как видно из рисунка, эти зависимости близки для НТ1 и НТ2 переходов, где плавятся термостабильные TSE HTSD-домепы, и сильно отличаются для LT 1 перехода, где плавятся термолабильные ß, ßC, у и уС-домены. Различия в наклонах прямых соответствуют наблюдаемым различиям в теплоемкости (ДСр) нативиого и денатурированного состояний для низкотемпературного и высокотемпературных переходов (рис.2). Известно, что увеличение теплоемкости при денатурации компактной белковой структуры связано, в основном, с экспонированием внутренних гидрофобных групп воде (Kauzmann, 1959; Prlvalov, 1979). Поэтому можно заключить, что концентрация внутренних гидрофобных групп в термолабильных структурах Он-фрагменга выше, чем в термостабильпых структурах DH и Е-фрагментов.

Судя по наклону функции удельной энтальпии, насыщенность термолабильиых структур гидрофобными контактами весьма близка к компактным белкам глобулярного типа (Prlvalov, 1979). Вдобавок, эти структуры и компактные глобулярные белки имеют близкие величины удельной энтальпии при высоких температурах (12 кал/г при 110 °С), что пожег рассматриваться в качестве показателя обширного насыщения компактной структуры водородными и Ван-дер-Ваальсоеыми силами (Prlvalov, 1979). Таким образом, из вышеуказанного следует, что термолабильные участки фибриногена, плавящиеся в области LT1-Перехода, являются структурами глобулярного типа, т.е. они компактны и имею т хорошо развитое гидрофобное ядро. Этот вывод хорошо сог ласуется с наличием глобулярных структур в терминальных участках молекулы фибриногена поданным электронной микроскопии.

Что касается термостабильпых структур 0ц и Е-фрагментов, то они имеют более низкое значение ДСр, т.е. меньше внутренних гидрофобных групп, и более низкую величину удельной энтальпии при 110 "С (7-8 кал/г). По значениям этих характеристик они напоминают супсрспиральпые структуры белков сократительного аппарата (Потсхип и Привалов, 1978; Потехип и др., 1979). Этот факт находится в хорошем соответствии с моделью, предложенной К.Коэп (1961), и детализированной Дулигглом и сотр. (1978) на основании теоретического анализа аминокислотной последовательности фибриногена. Согласно этой модели, в каждой половине Молекулы 111 аминокислотных остатков каждой цепи, расположенные между дисульфидпымп кольцами К] и К2 (рис.1), находятся в (х-сииралыюй коиформацин и "закручены" друг па друга, ¡формируя тройную супсрспнраль с .неупорядоченной областью посредине, которая легко расщепляется .протеолитнческими ферментами при гидролизе

фибрипогена до Е и О-фрагментов. В таком случае ТЭВ-фрагмепт, состоящий из трех М-концевых участков а, Р и 7-цепей, скрепленных дисульфидным кольцом, должен представлять собой участок такой суперспирали. Действительно, содержание а-спиральпых структур вТЗБ-фрагмснте (Мг ~ 28 кДа), рассчитанное нами из спектров кругового дихроизма (КД), составляет 65% по сравнению с 44% для Вн-фрагмента, из которого ТЭБ-фрагмент был получен (Ме^есГ е1 а1., 1982). Учитывая, что в соответствии с моделью Коэн-Дулиттла суперспиральная часть Бн-фрагмета должна иметь молекулярную массу 15-20 кДа, т.е. 50-70% массы ТЭТЭ-фрагмента, последний, несомненно, включает в себя часть а-супсрспнральиых структур фибриногена. Приведенные выше экспериментальные результаты являются серьезным аргументом в пользу вышеупомянутой модели.

Следует отметить, что дальнейший протеолиЗТвО-фрагмента (Мгг28 кДа) хнмотрипснпом приводит к образованию более иизкохолекулярного фрагмента (Мг~21 кДа), имеющего, по данным КД, 83% а-спиральпых структур (неопубликованные результаты). Он, по-видимому, и представляет собой практически "чистую" тройную суперспнраль. Аналогичный суперспиральный участок, согласно предложенной модели, должен входить в состав каждой из двух идентичных половин Е-фрагмепта (каждого ТБЕ-домеиа). Термодинамические характеристики соответствующего ему перехода Н'Г1 (значение ДСр и удельной энтальпии при 110"С) находятся в соответствии с этим предположением. Однако, в формирование кооперативной структуры каждого ТБЕ-домеиа существенный вклад вносят не только аминокислотные остатки суперспиральных участков, но также и [У-концевые области всех трех полипептндных цепей, расположенные в центральной части молекулы между дисульфидиымн кольцами К). Хотя вероятность образования здесь а и Р-структур, по данным теоретического анализа, проведенного нами (Медведь и Литвипович, 1988), низка, наличие компактной структуры в центральной области молекулы (Е-фрагмепта) не вызывает сомнения. Во-первых, эта область насыщена днеульфидпыми связями, часть из которых находится внутри структуры и недоступна дейст вию тиоредуктазы (В1отЬаск е1 а!.. 1974). Во-вторых, за исключением М-копцевых участков р-цепей, центральная область резистентна к дальнейшему протеолнзу. И, в-третьих, по нашим данным, часть триитофанилов в центральной части Е-фрагмента находится в недоступном растворителю состоянии, поскольку для его температурмо-пертурбацнонпого дифференциального спектра обнаруживается максимум

при 305 им, характерный для компактных белков, который исчезает после денатурации 8М хлористым гуапндипом. Дополнительно методом динамического тушения флуоресценции нами было установлено, что из четырех триптофаиилов, расположенных в центральной части, растворителю доступны только два (Зима и др., 1980).

Наиболее интересной является структурная орг анизация аС-домепов. Как указывалось выше, эти домены плавятся в области ЬТ2-пика с энтальпией, равной 105 ккал/моль (табл.1) с ярко выраженным скачком теплоемкости (АС Z5,9Н ккал/К-моль), рассчитанными на моль фибриногена (Мг ^340 кДа). Принимая во внимание, что фибриноген включает два аС-домеиа (Мг ~45 кДа каждого), удельная энтальпия их плавления и удельный скачок теплоемкости составляет примерно 1,17 кал/г и 0,07 кал/К-г) соответственно. Эти величины существенно ниже соответствующих значений для компактных глобулярных белков. Различия между рассматриваемыми структурами и компактными глобулярными белками становятся особенно очевидными при сравнении удельных энтальпий плавления, экстраполированных к 110 °С при помощи уравнения:

ДЫ(Т) = ДН(Тт) + /дер dT.

тт

где ДН(Тт) - удельная энтальпия плавления при температуре плавления Tm; Т - любая температура, для которой рассчитывается энтальпия плавления ДН(Т).

Для аС-доменов удельная энтальпия плавления при 110 иС, рассчитанная таким путем, составляет 4,7 кал/г, что составляет только 36% величины ДИ=13 кал/г, характерной для компактных глобулярных белков (Privalov, 1979). Это отклонение можно объяснить либо менее компактной структурой аС-доменов, стабилизированной меньшим количеством вторичных связей, либо наличием в аС-домепах компактных и некомпактных участков, как в гистоне Н1 (Tiktopulo et al., 1982). Детальный анализ аминокислотной последовательности рассматриваемого участка Аа-цепи показал неравномерное распределение полярных и ненолярных остатков в различных его частях. Так, первая половина этого участка практически лишена негшлярных остатков и насыщена сернпом. глицином, треонином и пролипом, которые не способствуют формированию компактной структуры. Большинство ненолярных остатков, которые

Рис. 9. Распределение неполярных остатков (а), пролинов (б) и вероятность образования регулярных структур (в) С-копцевым участком Аа-цепи молекулы фибриногена. Триптофаны и дисульфидные связи обозначены символами (-L) и (S-S) соответственно.

Вероятность образования а-спиральных структур обозначена сплошной линией, p-структур - пунктиром. ':

характерны для компактных структур, сконцеитриропано во второй половине С-концевого участка Аа-цепи (рис.9). Компьютерный анализ вероятности образования регулярных структур, проведенный по алгоритму, предложенному ранее (Ptitsyn and Finkelstein, 1983), также показал высокую вероятность формирования а и p-структур на участке между 390-550 остатками, в то время как на участке между 250-390 остатками такая вероятность практически равна нулю (рис.9). Таким образом, только вторая половина рассматриваемого участка Аа-цепи (остатки 390-550 или ~ 40% массы аС-домепа), формирует компактную кооперативную структуру, в то время как остальные участки, по-видимому, находятся в неупорядоченной конформацни. В этом случае удельная энтальпия плавления компактной части аС-домена, составляющей 40% его массы, будет близка к таковой для типичных глобулярных белков. Эго значит, что каждый аС-домеп имеет компактную область глобулярного типа, соединенную с остальной частью молекулы при помощи длинной неупорядоченной полинептпдпой связки, составляющей около половины массы аС-домепа, причем, как было показано выше, глобулярные области

двух аС-домеиов взаимодействуют между собой, формируя единый структурный блок (Мейуес! е1 а1., 1983) Такая структурная организация обеспечивает аС-доменам независимую по отношению к другим структурам молекулы подвижность, что играет существенную роль при реализации некоторых их функций, в частности, при участии в процессе самосборки фибрина (см.раздел II). Независимо от пас к подобному заключению о структуре аС-доменов пришли Эрцксон и Фоулер (1983), обнаружившие методом электронной микроскопии дополнительную, четвертую, глобулу в молекуле фибриногена, которая располагается возле центральной глобулы и, по мнению авторов, образована С-концевыми участками Аа-цепей.

На основании полученных данных мы предложили модель-схему расположения кооперативных участков (доменов) в молекуле фибриногена (рис.10а) (Prlvalov and Medved', 1982; Medved', 1985). Согласно схеме, в центральной части молекулы, откуда происходит фрагмент Е, находятся два взаимодействующих TSE-домена, каждый из кот орых сформирован тремя N-концевыми участками полнпептндиых цепей Аа, Dp и у. В периферических частях молекулы, из которых происходят Бц-фрагменты, находится по одному термостабнльному суперспнральпому TSD-домепу, сформированному из трех полипептидных цепей, и по четыре термолабильных домена глобулярного типа. Два из них, у и уС,

сформированы С-копцевым участком у-ценн, два других, р и PC', сформированы С-концевым участком Р-цепи и взаимодействуют между собой. Кроме того, имеется два взаимодействующих между собой аС-домена, сформированные С-копцевими участками Аа-цепей. Всего в молекуле фибриногена имеется 14 доменов, по 7 в каждой из двух идентичных су&ьедшшц.

Эга модель не учитывает форму молекулы фибриногена и се отдельных доменов, однако позволяет понять, какие участки полнпептндиых цепей сворачиваются независимо, формируя отдельные домены. Поскольку долгое время считали, что фибриноген - грехдомешшя структура, его центральному домену соответствует фрагмент Е, а терминальным доменам - фрагменты О, то в литературе утвердилась соответствующая терминология: центральный домен Е к два идентичных терминальных домена1 О. Фактически же эгн облает являются крупными структурно и функционально обособленными

блоками, состоящими из отдельных кооперативных участков - доменов. Последние, по нашим данным, денатурируют н, по-видимому, сворачиваются

S А .</*

Prlvalov and Medved' (1982) Медведь (1985)

Mosesson et al. (1981)

Weisel et al. (1985)

Рис 10. Предлагаемая модель-схема доменной организации молекулы фибриногена (а), а также некоторые модели, предложенные другими авторами (б, в) (см. текст).

независимо или квази-иезависимо и могут быть избирательно отщеплены протеазами без существенного нарушения компактной структуры соседних кооперативных участков. Более того, кооперативные участки коррелируют со структурно обособленными участками в фибриногене, обнаруженными методом электронной микроскопии в последнее время. Так, после нашего предсказания'более сложной доменной структуры фибриногена (Медведь и Тиктопуло, 1979; Медведь и др.,1980), Вайсел и сотр. (1981), используя данные анализа электронно-микроскопических картин упорядоченных кристаллических форм фибриногена, предложили модель молекулы в виде семи линейно расположенных глобулярных доменов, соединенных палочковидными сегментами. Разделение переферическнх Глобул на две подструктуры было затем продемонстрировано в ряде работ (Williams. 1981; Mosesson et al.. 1981: Erickson and I'owler. 1983) (рис.106). Проанализировав новые электроппомнкроскопнческие данные по форме

молекулы фибриногена, а также результаты собственных исследований, полученных методом электронной микроскопии и рентгенструктурного анализа кристаллов модифицированного фибриногена, Вайсел и сотр. (1985) предложили грубую трехмерную модель молекулы фибриногена (рис. 10а). Сравнивая эту модель с предложенной нами, нетрудно представит ь, что у и уС-домены формируют дистальную глобулу фибриногена, а ß и ßC-домеии - проксимальную. Следует ожидать, что при более детальных исследованиях в каждой из этих глобул будут визуализированы по две подструктуры, соответствующие у, уС и ß, ßC-домепам. Предварительные исследования кристаллических форм фибриногена действительно указывают па наличие двух глобулярных единиц в каждой из двух глобул (C.Cohen, 1990, персональное сообщение).

Полученные данные позволили выяснить детальную доменную структуру молекулц фибриногена и уже на новом уровне подойти к пониманию некоторых механизмов функционирования этого белка.

РАЗДЕЛ II.

Функциональная роль отдельных доменов молекулы фибриногена

Фибриноген является полифункциональным белком. Такая полифункциональпость тесно связана с его мультидоменпой структурой. Различные домены фибриногена выполняют различные функции, определяющие важную роль этого белка в системе гемостаза. Так, термостабильные домены, по-вндимому, образуют своего рода жесткий суперспиральный "скелет" молекулы, который придает механическую прочность фибриновому сгустку. Кроме того, на ТЭО и ТБЕ-доменах находятся центры взаимодействия с плазминогеиом. которые реализуются в процессе фибрииолиза. На ТБЕ-домеиах также локализованы основные центры полимеризации Е) и Е2, которые открываются после отщепления фибрниопептидов А и В тромбином при активации фибриногена в фибрин. Термолабпльные глобулярные домены несут активные центры полимеризации сЬ и сЬ, комплементарные Ех и Ег-центрам ТвЕ-доменов, а также различные центры взаимодействия, локализованные в основном в уС-домене. Так, после отщепления "уС-домена ог О^Ь^-фрагмепта теряется его аптиполнмерпзацноиная активность и способность связывать

тетрапептид Глн-Про-Арг-Про (синтетический аналог части активного центра Ei) (Doolittle & Laudano, 1980); после отщепления Р и рС-доиенов теряется способность связывать тетрапептид Гли-Гис-Арг-Про (синтетический аналог части Е2-центра) (Mcdved' et al., 1989). аС-домены участвуют во взаимодействии фибриногена с фиброиектином, ускоряют активацию фактора XIII, участвуют в активации плазмипогена в плазмин и других процессах. Этот перечень функциональной роли отдельных доменов далеко не полный. Некоторые функции, присущие фибриногену, пока не локализованы в отдельных домепах. Между тем, возможность получения из фибриногена различных протеолитнческих фрагментов, состоящих из одного или группы доменов, позволяет это сделать. Знание более детальной структуры отдельных доменов фибриногена также крайне важно для понимания механизмов его функционирования.

Целью дальнейших исследований явилось выяснение механизмов функционирования отдельных доменов фибриногена, принимающих участие в процессе самосборки фибрина.

2.1. Роль аС-доменов в процессе самосборки фибрина.

Поскольку С-концевые участки Аа-цепей легко доступны протеазам, в' крови человека в норме обнаруживается фракция фибриногена с укороченными Аа-цепями. При некоторых патологических состояниях содержание этой фракции увеличивается. Показано, что такое повреждение Аа-цепей приводит к нарушению нормального хода полимеризации фибрина (Sherman et al., 1969; Phillips, 1981). Это значит, что аС-домепы принимают участие в процессе самосборки фибрина. Однако, их роль в этом процессе оставалась невыясненной. Для решения этого вопроса мы изучили детально процессы полимеризации мопомерного фибрина с ннтактиыми и поврежденными аС-домеиаиш.

Наиболее подходящим кандидатом, моделирующим фибрин-мономер с поврежденными аС-доменами, является ранний продукт протеолиза фибриногена - Х-фрагмен т. Известны два вида Х-фрагментов: Xi (Mr ~ 290 кДа) и Х2 (Mr ~ 240 кДа), причем, свертываемость первого достаточно высока для проведения функциональных исследований.

Xi-фрагмент был выделен из раннего плазминового гидролизата фибриногена ступенчатым высаливанием сульфатом аммония по модифицированной методике Филипса (1981), описанной в работе (Медведь и др., f986). Анализ полипептидного состава показал, что одни С-копцевой

участок его Аа-цепн (Мг~ 42 кДа) полностью отщеплен, у второго отсутствует участок с Мг — 12 кДа, т.е. один аС-домен отсутствует, второй существенно поврежден (Горкун и Медведь, 1984). Несмотря на высокую свертываемость (-92%) такой Xt-фрагмеит после обработки тромбином образует в низких концентрациях (0,05 мг/мл) аномальные (дефектные) сгустки (Горкун и Медведь, 1983). Поскольку причиной образования таких сгустков могли быть несвертывающиеся примеси, выступающие в качестве ингибиторов полимеризации, мы подвергли дальнейшей очистке полученный Xj-фрагмент путем его полимеризации тромбином с последующим "выкручиванием1' сгустка и растворением его в уксусной кислоте при +4°С (Medved' et al.. 1085; Медведь и др., 1986), используя процедуру, описанную для получения мопомерпого фибрина (Варецкая, 1965). Такая процедура позволила получить моНомерный Xj-фрагмепт, который, как и мономерпый фибрин, был практически полностью свёртываем и в широком интервале концентраций (0,05-0,2 мг/мл) образовывал гель, визуально неот личимый от такового, образуемого фибрип-мопомером. Сравнительные электронно-микроскопические исследования процесса полимеризации фибрин-мономера и Xj-мономера показали, что прогеолитическое повреждение аС-домепов не вызывает существенных искажений в упаковке протофибрилл внутри фпбринового волокна (Medved' et al., 1985; Медведь и др., 1986). В то же время скорость полимеризации исследуемых препаратов различалась.

Па рис.11 представлены кривые изменения мутности при полимеризации фибрин-мономера и Х^мопомера. Как было показано ранее (Hantgan et al., 1980), такие кривые отражают различные стадии процесса самосборки фибрина. Задержка в росте мутности (лаг-фаза) соответствует стадии формирования протофибрилл, в которых два ряда молекул фибрина смещены относительно друг Друга па половину длины, образуя "нити" толщиной в две молекулы. Резкий подъем мутности соответствует второй стадии, при которой прогофибриллы латерально агрегируют, формируя фибриновое волокно. На этой же стадии происходит формирование из отдельных волокон трехмерной фибрииовой СсТи, т.е. образуется сгусток. Время появления сгустка (tCd) Легко определить визуально. В качестве характеристики первой стадии полимеризации можно выбрать длительность задержки подъема светорассеяния (лаг-фаза, (лиг), Для характеристики второй стадии - максимальную скорость нарастания мутности (VMaKC). Как видно из рнс.Па, при сравнительно высоких концентрациях (>0,2 мг/мл) различия в кривых полимеризации фибрин-мономера и Х^-мономера незначительны, однако оПн существенно иозраоаюг при разбавлении растворов до 0,05 мг/мл (рне.116). На рис.12 показаны величины отношений

Vмакс н ^са Для этих белков в зависимости о г разбавления раствора. Такие координаты позволяют наиболее удобно представить различия в скоростях самосборки X!-мономера и фибрин-мономера. Как видно из рисунка, процесс самосборки Х^мономера значительно более чувствителен к разбавлению, чем фибрин-мономера. Так, че трехкратное разбавление

Время (мин.)

Рис 11. Кривые изменения мутности в процессе полимеризации моиомер-пого фибрина (сплошная линия) и Хх-мономера (пунктирная линия) при концентрациях белков, рапных 0,2 (а) и 0,05 мг/мл (б).

отношение

10 6 2

Разбавление (мг/мл)

5 Т5

Рис. 12. Соотношение скоростей первой (Д----Д) 11 пторой (о-о)

фаз самосборки, а также времен свертывания (•.............■•) для мономеров фибрина и Х1-фрагмента в зависимости от разбавления раствора.

исходиой смеси (с 0,2 до 0,05 мг/мл) увеличивает различия между скоростями образования протофибрилл мономериым фибрином и Хг фрагментом в 6 раз, в различия в скоростях формирования волокон и фибриновой сети в 9-10 раз (рис.12). Отсюда следует, что протеолитическос повреждение аС-доменов ведет к резкой задержке процесса самосборки фибрина при разбавлении раствора. Очевидно, что шпактпые аС-домены, которые имеются у мономерного фибрина и отсутствуют у Х^мономера, имеют дополнительные центры полимеризации, которые вносят вполне определенный вклад в увеличение специфического сродства между молекулами фибрина, ускоряя процесс их упорядоченной агрегации. Это особенно сильно проявляется в разбавленных растворах. Таким образом, аС-домены принимают участие в формировании фибринового сгустка в основном не как структурные элементы, а как фактор, ускоряющий самосборку сложной структуры. Причем, они вносят спой вклад как па первой, так и па второй стадиях самосборки фибрина.

Учтивая, что компактные части аС-домснов взаимодействуют между собой и соединяются с остальными структурами молекулы при помощи длинных неупорядоченных участков полипептидных цепей, придающих им определенную подвижность по отношению к целой молекуле (рис.13а), можно предложить следующий механизм участия аС-доменов в самосборке фибрина. Взаимодействие между осС-домепами, по-видимому, может осуществляться не только внутримолекулярпо, по и межмолекулярпо, причем, у мономерного фибрина, в отличие от фибриногена, межмолекулярное взаимодействие между аС-доменами оказывается преимущественным и обеспечивает образование межмолекулярных связей (рис.136). Это дает возможность основным центрам полимеризации, находящимся в Нейтральных и Периферических доменах, взаимодействовать быстро и точно при построении протофибрилл (рис.13в). Аналогичным образом аС-домсны ускоряют и латеральную агрегацию протофибрилл. Таким образом, аС-домеПЫ выполняют роль "щупалец", несущих дополнительные Центры межМолекулярпого взаимодействия. Эти "щупальцы" способствуют быстрому нахождению и ориентированному сближению мопомерпых молекул. Их роль особенно сильно проявляется в разбавленных растворах, где они существенно уменьшаю т расстояние между молекулами. В концентрированных же растворах расстояние между молекулами достаточно для быстрого взаимодействия между основными центрами, и вклад аС-домспов в скорость самосборки здесь несущее гвенен, Дополнительные исследования показали, что по аналогичному механизму

Рис 13. Схематическое изображение молекул фибриногена (а),мономерного фибрина (б) и прогофибриллы (в). аС-домепы обозначены чёрным цветом, основные активные центры центральных и переферических доменов заштрихованы.

аС-домеиы ускоряют реакцию сополнмеризации фибриногена с Ы-коицевым дисульфидным узлом (N-DSK) фибрина (Рыбачук и сотр., 1988). Причем, сильная зависимость этого процесса от ионной силы указывает на преимущественно электростатический характер взаимодействия между аС-доменами. Аналогичный механизм, возможно, характерен и для взаимодействия фибриногена с тромбоцитами, имеющими рецепторы, взаимодействующие с С-концевыми участками у и а-цепей.

2.2. Повышение питиполимернзационной активности Рц-фрагменга при расщеплении пептидной связи в его Ц-цепи.

Некоторые продукты расщепления фибринового сгустка: X, У, 1)ц-фрагмептм, О-днмер - содержат активные центры с! 1 и d2 и способны взаимодействовать как с мономерным, так и с полимерным фибрином. Однако, поскольку такие молекулы не содержат полного набора центров, обеспечивающих самосборку фибрина, их связывание с растущими

полимерами фибрина приводит к заметному замедлению процесса полимеризации. Пнгибирование самосборки фибрина продуктами ею деградации, по-видимому, является одним из механизмов регуляции л ею процесса Ш ипю.

Оц-фрагмепт является эффективным ши ибитором полимеризации. Однако, в триптическом гидролнзате бычьего фибриногена, содержащем ионы кальция, наряду с Оц-фрагмеитом (Мг ~ 95 кДа), был обнаружен фрагмент (Мг ~ 82 кДа), имеющий более высокую антиполимеризациоппую активность (ВеШег ее а1., 1960). Мы показали, что он отличается от Оц-фрагмента наличием расщепленной пептидной связи в его Р-цепи в положении'Аргз72-Трез7з либо Лизз93-Трез94, причем, С-концевой участок (1-цепн не удаляется из молекулы, так что молекулярные массы Оц и фрагмента, определенные в нативных условиях, одинаковы (Медведь и др., 1987). Мы предположили, что такой фрагмент может образовываться из Оц-фрагмеита при нлаэминолизе. Чтобы проверить это предположение был изучен процесс расщепления Оц-фрагменти плазмииом ь присутствии ноной кальция.

На рис. 14 представлены кривые, отражающие антиполнмеризацноппий эффект Оц-фрагмента и ею плазминового гидролизата, из которых можно рассчитать ангиполимеризациоппый эффект в удельных единицах, как было предложено в работе (ВеШвег е! а1., 1973). Как видно из рисунка, удельная аптиполпмеризационная активность гидролизата возрастает во времени (в соответствии с рассчетами с 13,3 единиц для Оц-фрагмента до 33,4 единиц для 48-часового гидролизата). Увеличение активности сопровождается накоплением в гидролнзате продуктов протеолиза с молекулярной массой 82 и 12 кДа. Наиболее активная фракция гидролизата, выделенная из 48-часовою гидролизата аффинной хроматографией на фпбрин-сефарозе по

Рис. 14. Ангиполимеризациоппый эффект Оц-фрагмента (Д), 24-часового (о) и 48-часового (•) гидролизата Оц-фрагмента и очищенного Оьд-фрагмеша (А).

0,025 0,075 ,Кпдц, ингибитораЛмп/мл)

методнке, описанной в работе (ВеШвег е1 л1., 1980). сосюяла т двух компонентов с \1г ~ 82 кДа и 12 кДа и пмела удельную активность -15,4 ед., т.е. в 3,5 раза выше, чей у исходного Эн-фрагмепта. По данным электрофореза и 1М-концевого анализа эта фракция отличалась от 13,,-фрагмента наличием расщепленной связи в Р-цепи, причем, как и в случае Оь2-фрагмента (см. предыдущий раздел), С-копневой рС-пеитид (Мг~ 12 кДа) был ассоциирован с остальной частью молекулы (Мг ~ 82 к/Да) при помощи пековалеитных связей (Medved' е! а1., 1988), т.е. новый фрагмент (0,.А) ничем не отличается от О^-фрагмепта, выделенного из тршпического гидролизата. Таким образом, в присутствии ноиов кальция Оц-фрагиепт под действием плазмииа превращается в более активный 01-Л-фраг мент путем расщепления пептидной связи в Р-цепи.

Калориметрические исследования показали, что расщепление этой связи приводит к дестабилизации термолабильных структур в Ощ-фрагменте по сравнению с Оц-фрагмептом, что выражается в сдвиге ЬТ1-иика в област ь более низких температур на 4°С. (Ме(}уе(1 е1 а1., 1986) Известно, что активация Лиз-плазминогеиа, заключающаяся в расщеплении только одной связи Лрг5йо-йал5(Н ведет к аналогичной дестабилизации доменов, формирующих активный центр (МогокЪаЫу е1 а!., 1984), превращение пепенногепа в пепсин также сопровождается дестабилизацией структуры пепсина (Рг)уа1оу с1 а1., 1981). Напрашивается предположение о том, что обнаруженная нами активация Оц-фрагмента в 1Э[_д путем расщепления пептидной связи в его Р-цепи имеет некоторое сходство с активацией профермента в с}>ермент.

Представленные выше данные показывают, что существенное увеличение аитиполимернзациопной активности Он-фрагмента бычьего фибриногена после расщепления его р-цепи, по-видимому, не является случайным феноменом, а, возможно, представляет собой физиологически важный механизм регуляции процесса самосборки фибрина путем повышения аптиполнмеризацнонной активности продуктов его протеолиза. Предлагаемый возможный механизм регуляции представлен схематически па рис.15. Для проверки этой возможности нужны дальнейшие исследования.

2.3. Механизм повышения ангиполимеризационпой активности Рц-фраг-менга и его возможная роль в процессе самосборки фибрина.

Как было показано ранее, С-концевоМ участок у-цепи (уС-домен) принимает участ ие в формировании активного цен фа (11, который ответственен за

ФИБРИНОГЕН

тромбин

ФИБРИН-МОНОМЕР

плазмин

ингибиторы

ПОЛ5!?Д£РНЫИ ФИБРИН

ПРОДУЮТ РАСЩЕПЛЕНИЯ ФИБРИНА

/V -----. ■■^^^..yii.ui VKiioriillA

U-олигомеры, pjl , D-D и др.

ингибировалие

Плазмнн

ингиби^овЕип^е

'la

более сильный ингибитор

Рис. 15. Схема, демонстрирующая процесс самосборки фибрина и его регуляцию путем торможения продуктами деградации фибрина. Пунктирная линия показывав возможный дополнительный путь регуляции, предлагаемый в данной работе.

связывание 0](0ц)-фрагмента с фибрни-Сефарозой (Olexa and Budzyn.sk!, 1981). Прогеолитическое отщепление этого участка от Оц-фрагмента, приводящее к образованию Di/фрагмента, ведет к потере последним способности связываться с фибрии-Сефарозой. Однако, мы обнаружили, что в высоких концентрациях О^-фрагмент способен тормозить процесс самосборки фибрина, по-видимому, благодаря наличию активного центра Последний, как было предложено, располагается в С-копцевом участке |3-цепи по аналогии с di-центром (Doollttle and Laudano, 1980). Используя синтетический пептид Глн-Гнс-Лрг-Про-Дапсил, который моделирует активный центр Е2, комплементарный d2-nenTpy, мы показали, чго оп взаимодействует с Dy-фрагментом и не взаимодействует с TSD-фрагмеигом, откуда следует, что сЬ-чентр дейст вительно расположен в С-коицеяом участке р-цеин (Р и/или PC-доменах) (Медведь и др., 1988; Mcdvcd' et al„ 1989). В таком случае повышение Лпгинолимеризациопной активности Duv-фрагмснта по сравнению с фрагментом 1)ц можно бы ло бы обьяснни. копформацпонными изменениями, приводящими к повышению доступности d2-'i(enipa после растепления междоменной пешидиой спязн в

ß-цепи последнего. Действительно, Ох-фрагмент, полученный из DL-фрагмепта при помоши протсолнза и отличающийся от исходного Dj_-фрагмента наличием расщепления в ß-цепи, приобретает способность связываться с фибрии-Сефарозой (Medved' and Litvinovlch, 1988). Это значит, что сродство сЬ-центра к фибрину существенно возрастает после расщепления вышеуказанной связи.

Представленные выше данные указывают на то, что активация Du в DLA-фрагменг путем расщепления междоменной пептидной связи сопровождается конформационными изменениями в термолабильных доменах, ведущими к дестабилизации структуры последних и экспонированию йг-центра, который отвечает за повышение аптиполимеризациопной активности 0[Л-фрагмепта.

Природа таких копформапионных изменений неясна. Однако, они могут вызываться, по-видимому, не только расщеплением пептидной связи между Р и PC-доменами. Недавно было показано, что удаление углеводного компонента ß-цепи человеческого фибриногена, прикрепленного возле расщепляемой связи к Аспзб4 (Асп371 в ß-цепи бычьего фибриногена), приводит к существенному увеличению скорости полимеризации фибрина (Langer et al.. 1988). Напрашивается предположение о том, что удаление углевода приводит к подобным копформациоипым изменениям, приводящим к экспонированию сЬ-центра, который отвечает за увеличение скорое iи самосборки фибрина. Не исключено, что аналогичные конформациоппые изменения происходят в области термолабильпых доменов фибрина при взаимодействии Е i-di-центров, приводящем к формированию протофибрпллы. В таком случае экспонирование с12-цептроп может приводить к формированию своего рода центров латеральной агрегации повышенного сродст ва, способствующих ускорению процесса самосборки фибрина. Необходимо отметить, что попы кальция также играют существенную роль в ускорении самосборки фибрина. Причем, связывание Са2+ происходит только после отщепления фнбрипопептидов A (Milialyi, 1988), т.е. после формирования проюфнбрилл, которое в соответствии с вышеизложенным предложением должно сопровождаться экспонированием 02-Цептров вследствие конформационных изменений. Пока неясно, участвует ли Са^+ в индукции таких изменений или же "закрепляет" новую конформацию, "наведенную" взаимодействием Ei-di и способствующую латеральной агрегации протофибрилл. Экспериментальное доказательство вышеизложенной гипотезы явилось бы существенным «кладом в выяснение тонких молекулярных механизмов самосборки фибрина.

выводы

1. Детально изучен процесс тепловой денатурации фибриногена. Показано, что молекула фибриногена состоит из участков различной стабильности, которые плавятся в четырех температурных областях. На основании анализа кривых плавления интактного белка и его фрагментов протеолиза установлена последовательность выплавления отдельных структурных участков в молекуле фибриногена.

2. Получен ряд новых фрагментов протеолиза фнбршюгена, имеющих компактную структуру и установлена их доменная организация. На основании термодинамического анализа отдельных деиатурациоппых переходов в фибриногене и его фрагментах протеолиза установлено, что молекула фибриногена состоит из 14 кооперативных участков - доменов. Предложена модель-схема доменной организации фибриногена.

3. На основании анализа доменной структуры молекулы фибриногена, расположения мест протеолиза, связанных с отщеплением ее отдельных доменов, а также известной экзон-интронной структуры генов, кодирующих отдельные полипептидные цепи фибриногена, установлено, какими участками полипептидных цепей фибриногена формируются его отдельные домены.

4. Обнаружено, что по термодинамическим параметрам процесса денатурации и содержанию а-спиральных структур ТвО-домены фибриногена соответствуют структурам суперспиральиого типа, что является экспериментальный доказательством модели суперспиралыюй укладки полипептидных цепей в отдельных участках молекулы фибриногена, предложенной рацее на основе теоретических расчетов.

5. Изучена детально структурная организация С-концевых участков Аа-цепей фибриногена. Показано, что, в отличие от ранее существовавших представлений о неупорядоченном характере их копформации, две Аа-цепи формируют две компактные кооперативные структуры - аС-домепы , которые взаимодействуют между собой и соединены с остальной частью молекулы при Помощи неупорядоченных участков полннептндпых цепей.

6. Установлено, что аС-домены фибриногена несут дополнительные цетры полимеризации, межмолекулярное взаимодействие между которыми приводит к существенному увеличению скорости полимеризации фибрина в разбавленных растворах. Предложен механизм участия аС-доменов в процессе самосборки фибрина.

7. Показано, что расщепление междоменной пептидной связи в Р-цепи бычьего Оц-фрагмента приводит к существенному увеличению его антиполимеризационной активности. Такое увеличение связано с копформациоппымн изменениями в терминальных термолабильных доменах, приводящими к повышению доступности второго полимеризационпого центра (с1г).

Выражаю глубокую благ одарность акад. АН УССР В.А.Белицеру и чл,-корр. П.Л.Привалову - научным руководителям и' участникам этой работы, а также сотрудникам Института-биохимии АН УССР и Института белка АН СССР, принимавшим участие в разработке отдельных вопросов, за помощь и поддержку при выполнении данной работы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Зима В.Л., Медведь Л.В., Варецкая Т.В., Коваль В.Г. Флуоресцентные исследования температурных переходов в фибриногене и его фрагментах II Дом. АН УССР.-1979-сер.Б.-Ш-С.712-714.

2. Медведь Л.В., Тиктопуло Е.И. Микрокалориметрические исследования плавления фибриног ена и его фрагментов // УП Всесоюзная кош^сренция по калориметрии и химической термодинамике - Тез.докл. - Иваново, 1979-2-С.421-422.

3. Привалов П.Л., Медведь Л.В., Тиктопуло Е.И., Зима В.Л., Варецкая Т.В. Исследование температурных переходов в фибриногене и ег о протеоли-тичеекггх фрагментах // IV Всесоюзный биохимический съезд 1 Тез.докл,-Легппгград, 1979-М: Наука-1-С. 6-7.

4. Медведь Л.В., Тиктопуло Е.И., Привалов ПЛ., Варецкая Т.В. Микрокалориметрическне исследования температурных переходов в фнбрппо-геЛе и его прогеоли гических фрагментах // Молек.бчология.-1980-14-вып.4- С. 835-842.

5. Медведь Л.В., Зима В.Л., Привалов П.Л., Горкун О.В., Варенкая Т.В. Структурная организация центрального домена молекул фибриногена но данным сиектрофлуорнметрии и микрокалориметрии // У Совещание по конформациоиным изменениям биополимеров в растворах - Тез. док л.-Телави, 1980-С. 91.

6. Зима В.Л., ЛуговскоП Э.В., Медведь Л.В., Гоголнпская Г.К., Привалов П.Л. Структурная организация и локализация С-концевых участков а-цепей в молекуле фибриногена II ДоклЛИ СССЯ.-1981-256, N2- С. 480482.

7. Medved' L.V., Prlvalpv P.L, Microcalorlmetric study of doman organization of fibrinogen molecule // International symposium on blocalorymetry.-TbiliBl. 1981-P. 19.

8. Медведь Л.В., Угарова Т.П. Получение термостабильного участка домена Д молекулы фибриногена И Докл. АН УССР.-1982-сер.Б-Ы2-С. 67-70.

9. Медв1дь Л.В., Новохатшй В.В., Варенька 'Г.В. Дослщження структурно! opraubanit активно! та неактивно! форм D-фрагмепту молекули

. фибриногена IIIV Укр.бюх1М.з'1зд - Тези доп. - Дпшропегровськ, 1982 - К, Наук. Думка-ч.2-С. 95.

10. Prlvalov P.L.. Medved' L.V. Domains in the fibrinogen molecule //J. Mol. Biol. -1982-159. N4-P. 665-683.

11.Медведь Л.В., Новохатний В.В., Привалов П.Л. Получение и исследова-

■ кие структурной организации активной и неактивной форм D-фрагмента

молекули фибриногена //Молек. биология,-1982-1б-вып.б-С. 1195-1202.

12. Medved' L.V., Prlvalov P.L., Ugarova Т.Р. Isolation of thermostable structure from the fibrinogen D-fragment //FEDS Ml. - 1982-146. N2 - P. 339-342.

13. Медведь Л.В. Структура Д-фрагмепта молекулы фибриногена и влияние на нее ионов Са2+// VI Двусторонний симпозиум СССР-Франция- Тезисы-Цхалтубо, 1982-С. 119.

14. Горкуп О.В., Медведь Л.В. Роль аС-доменов молекулы фибриногена в реакции свертывания, вызываемой тромбином // Докл. ЛИ УССР.-1983 -сер.Б. - N4 - С. 67-70.

15. Medved'L.V., Gorkun O.V., Prlvalov P.L. Structural organization of C-termtnal parts of fibrinogen Aoc-chalns // ¡'EDS Left.-1983-160. N1,2 - P. 291-295.

16. Медведь Л.В., Горкун О.В. Исследование струк турной организации аС-доменов молекулы фибриногена и пх роли в процессе полимеризации фибрина // VI Всесоюзный симпозиум "Химия бе.шн* и пептидов" - Тезисы - Phi а, 1983 - С. 124-125.

17. Горкуи О.В., Медведь Л.В. Структурная организация ранних продуктов плазмннового гидролиза фибриногена Xj и Хг-фрагмепгов //Докл. ЛИ УССЯ.-1984-сер.Б.-N3-C. 57-61.

18. Медведь Л.В.. Горкун О.В., Белицер В.А. Функциональная роль аС-доменов молекулы фибриногена // Докл.ЛН УССР.- 1984-сер.Б - N3 - С. 74-77.

19. Медведь Л.В., Лигвшювич C.B. Структурная организация d-фрагмента, полученного путем дальнейшего плазминового гидролиза фрагмента Du молекулы фибриногена ЦIV Симпозиум СССР-Италия "Макромолекулы в функционирующей клетке",- 1984, Киев - К., Наукова Думка - С. 85.

20. Mcdved' L.V., C.orkun O.V., Manyakov V.F., Belltser V.A. The role of fibrinogen aC-domalns In fibrin assembly process // FEBS Lett. - 1985-181, N1 - P. 109-112.

21. МедпедьЛ.В. Структурная организация молекулы фибриногена // Укр. биохим. жури,- 1985 -57, N5 - С.36-49.

22. Медведь Л.В. Доменная структура фибриногена // У Всесоюзный биохимический съезд - Тезисы - Киев,- 1985 - 1- С.17.

23. Белииер В.А., Литвгшович C.B., Медведь Л.В. Выделение и изучение структурной организации нового фрагмента молекулы фибриногена, полученного путем гидролиза легкого О^-фрагмепта химотрипснном // V Всесоюзный биохимический съезд - ТсзисЫ - Киев, -1985 -М., Наука-2-С.5-6.

24. Медведь Л.В., Горкун О.В., Маняков В.Ф., Белицер В.А. аС-домены молекулы фибриногена как структуры, ускоряющие самосборку фибрина // Молек. биология. - 1986 - 20 - вып. 2 - С. 461-470.

25. Lezcn T.I., Kudinov S.A., Medved' L.V. Plasmlnogen-blndlng site of fibrinogen fragment D thermostable region// FEI3S lett..- 1986 -197. N1. 2 - P.59-62.

26. Medved' L.V.. Utvtnovich S.V.. Prlvalov P.L. Domain organization of the terminal patrs in fibrinogen molecule // FEOS Lett. - 1986 - 202, N2 -P. 298-302.

27. Лигвинопич C.B., Медведь Л.В. Выделение нового протеолитического фрагмента из хнмогрппеннового гндролнзата DL-([ipa¡Menia молекулы «фибриногена II Док.i. АН УССР,- 1986 -сер.Б,- N9 - С. 65-67.

28. Медведь Л.В., Лукннова Н.И., Литвипович C.B., Платонова Т.Н., Гусак U.M. Структ урная организация "сверхактивной" фракции D-фрагмста молекулы «фибриногена Ц Дом АН УССР.-1987- сер.Б,- N5 - С.73-76.

29. Мсдшдь Л.В. Внвчепня доменпо! оргашзацн мочекулн ф1бршшгспу // V Укр. 1'помм.з'йд - Тезн доп. - (влно-Фраишвськ, 1987-м. 1 -С. 105-106.

30. Рыбачук В.Н., Позднякова Т.М., Горкун О.В., Медведь Л.В., Белкцер В.А. Роль аС-домеиов в реакции сопалимеризации фибриногена с N-коицевым дисульфидпым кольцом фибрина II Докл. АН УССР.- 1988 -сер.Б,- N4 -С. 70-73.

31. Медведь Л.В., Литвипович С.В. Мультидомеппая структура молекулы фибриногена // в сб.: Биохимии животных и человека - К., Наук. Думка-1988 - вып. 12 - С. 18-27.

32. Медведь Л.В., Угарова Т.П., Литвипович С.В., Калихевпч В.П. Локализация (Зг-цеп гра полимеризации фибрина с помощью флуоресцентного зонда Gly-His-Arg-Pro-DNS // VI Конференция по спектроскопии биополимеров - Тезисы - Харьков, 1988 - С. 205-206.

33. Литвиновым С.В., Медведь Л.В. Схема протеолнза DH(95 кДа) фрагмент молекулы фибриногена II Молек. биология.- 1988 - 22 , N4 - С. 934-943.

34. Medved' I..V., Lltvlnovich S.V. Domain structure of different fragments derived from fibrinogen Dtl(95 kDa)l"ragment // Second Symposium oj the American Protein Sociciy - Abstracts - San-Diego. 1988 - P. 63.

35. Medved' L.V., Platonova T.N., Lltvlnovich S.V., Lultinova N.I. The cleavage of [5-chain In bovine fibrinogen D(1 fragment(95 kDa) leads to a significant increase in Its anticlotting activity // FEBS Lett.- 1088 -232, Nl-P. 56-60.

36. Medved' L.V., Lltvlnovich S.V. The cleavage of p-chain in bovine fibrinogen fragment Dt( leads to destabilization of its thermolabile domains and a significant Increasing of anticlotting activity // hi: Fibrinogen 3. Biochemistry, biological functions, gene regulation and expression - M. Mose-sson et al. Eds. - Excerta Medlca, Amst.- N.Y.-Oxford - 1988 - P. 301-301.

37. Metlved' L.V., Lltvlnovich S.V., Ugarova T.P.. Kalikhevlch V. N. Localisation and some properties of di polymerization site complementary to Gly-ilis-Argl'ro (Eo) site of bovine fibrinogen // Ttirombos. Haemoslas.- 1989-62, N1 - P. 177.

38. Medved' L.V. Relationship between exons and domains in the fibrinogen molecule // Blood Coagul. fibrinous. - 1990 - I-P. 439-442.

Информация о работе

Медведь, Леонид Васильевич
доктора биологических наук
Киев, 1991
ВАК 03.00.03

Автореферат

Похожие работы