Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная характеристика фрагментов, происходящих из С-концевых областей молекулы фибриногена

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная характеристика фрагментов, происходящих из С-концевых областей молекулы фибриногена"

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.В.ПАЛЛАДИНА

на правах рукописи

ЛПТШШОВИЧ СсргеИ Вячеславович

СТРУКТУРНО - ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФРАГМЕНТОВ, ПРОИСХОДЯЩИХ ИЗ С-К01ЩЕВЫХ ОБЛАСТЕЙ МОЛЕКУЛЫ ФИБРИНОГЕНА.

03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандида та биологических наук

Киса -1991

Работа выполнена 8 Ипституге биохимии им. А.В.Палладина АН Украины.

Научный руководитель: кандидат биологических паук

МЕДВЕДЬ Л.В.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

ДЕМЧЕНКО А.П.

доктор биологических наук РОЗЕНФЕЛЬД М.А.

Ведущая организация: Киевский I осуннверсигет

им. Т.Г.Шевченко

Защита состоится 26 декабря 1991 г. в №2 часов на заседании Специализированного совета К 016.07.01 в Институте биохимии им. А.В.Палладина АН Украины (252030,1. Киев-30, ул. Леоптовича, 9.)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан 26 ноября 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

КИРСЕНКО О.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Центральным белком системы свертывания крови является сложный мультидоменный белок - фибрииоген. Под действием тромбина фибриноген превращается в фибрин, который спонтанно полимеризуется, образуя фнбрииовую сеть - основу кровяного сгустка. Самосборка фибрина, а также выполнение фибриногеном и фибрином других физиологически важных функций обеспечивается наличием специфических центров взаимодействия, которые расположены в различных донепах молекулы. Домены имеют компактную структуру и являются относительно резистентными к ограниченному протеолизу. Поэтому протеолитические ферменты расщепляют в первую очередь доступные междоменные пептидные связи, в результате чего образуются дискретные фрагменты. Такие фрагменты, как правило, состоят из одного или нескольких доменов, сохраняющих структурную организацию, присущую им в целой молекуле, и специфические центры взаимодействия. Так, Е и Пц-фрагмеитм образуются при расщеплении фибриногена и «епрошитого фибрина плазмином (in viva) и другими протеазами (in vitro) и сохраняют активные центры полимеризации, а также центры взаимодействия с другими белками. Так как эти фрагменты имеют более простую организацию,' чем родительская молекула, они представляют собой простые модели для изучения структурно-функциональных особенностей фибршгогеиа.

За последнее десятилетие были достигнуты существенные успехи в изучении структурной организации молекулы фибриногена. Так, было показано, что фибриноген является мультидомеииым белком и состоит не менее, чем из 12 доменов (Privalov & Medved', 1982). Однако, ряд вопросов оставался невыясненным. В частности, вопрос о детальной доменной организации терминальных областей Молекулы фибриногена, из которых происходит Dn-фрагиенг, и границах между отдельными доменами. Этот вопрос имеет принципиальное значение, т.к. именно в этих областях сосредоточен ряд функционально важных специфических центров взаимодействия. П последнее время предпринимаются попытки экспрессиропагь отдельные цепи или участки полипептидных цепей фибриногена, содержащие активные urn up и взаимодействия (Bolyard and Lord, 1988, 1989). Однако, при этом возникает закономерный вопрос: способны ли эти полипешнды формировать апгопониые структуры - домены, аналогичные таковым в шишкой молекуле? Для такою рода работ необходимо знание

детальной доменной организации фибриногена. Учитывая вышеизложенное, были поставлены цели и задачи данного исследования.

Целью исследований было выяснение детальной доменной организации dh-фрагмеита, моделирующего терминальные области фибриногена, и структурно-функциональная характеристика его отдельных доменов. При этом необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать процесс ограниченного протеолиза DH-фрагмента молекулы фибриногена и выделить дискретные фрагменты его протеолиза.

2. Проанализировать N- и С-концевую аминокислотную последовательность полипентидпых цепей DH-фрагмента и фрагментов его протеолиза и локализовать их по первичной структуре.

3. Проанализировать процесс денатурации различных форм D-фрагментов, определить точное количество кооперативно плавящихся доменов, входящих в состав этих'фрагментов, и оценить границы между доменами.

4. Изучить функциональные свойства отдельных доменов молекулы фибриногена, используя в модельных исследованиях различные формы D -фрагментов.

Научная новизнУ

-Обнаружено, что независимо от вида протеаз при расщеплении Dh-фрагмснта фибриногена образуются характерные дискретные фрагменты: Dia, Du Dx, Dy, Dz. TSD.

-Выделен рад новых протеолитических фрагментов: Dla, Dx. Dy и Dz, образующихся при протеолизе DH-фрагмента.

-Проанализирован полипептидный состав и аминокислотные последовательности отдельных полипептидных цепей всех выделенных фрагментов. Предложена схема расщепления DH-фрагмента различными протеазамн.

-Выяснена доменная структура полученных фрагментов. Показано, что образование более низкомолекулярных дискретных фрагментов происходит путем последовательного о тщепления С-копцевых доменов от DH-фрагмента. -На основании полученных результатов предложена детальная модель доменной организации терминальных областей молекулы фибриногена. - Экспериментально доказано, что бг-цептр полимеризации фибрина находится в ßc и/или ß-доменах, образованных С-копцевым участком ß-цепи. -Установлено, что расщепление междоменпой связи ßLys393-Thr394 у различных форм D-фрагментов приводит к резкому увеличению

функциональной активности этих фрагментов за счет повышения доступности d2-neinpa самосборки фибрина.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты углубляют представления о структурной организации и о механизмах функционирования терминальных областей молекулы фибриногена. Они могут быть использованы для целенаправленной экспрессии отдельных доменов молекулы фибриногена, содержащих функционально важные центры.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на IV Симпозиуме СССР-Италия "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Киев, 1984г.); V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1985г.); V Украинском биохимическом съезде (Ивано-Франковск, 1987г.); Всесоюзной конференции по спектроскопии растворов биополимеров (Харьков, 1988г.); Международных симпозиумах по фибриногену (Милуокки, 1988г., Киото, 1989г.); II Симпозиуме Американского общества белковихов (Сан-Диего, 1988г.); на конкурсах молодых исследователей в Институте биохимии АН Украины (Киев, 1988,1989гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текст-» и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, изложенных в 4 главах, заключения, выводов, списка основной использованной литературы (197 источников). Работа иллюстрирована 23 рисунками и 3 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Фибриноген получали из плазмы крови быка высаливанием сульфатом натрия (Варецкая, 1960).

Вн. GlJi TSO фрагменты получали из бычьего фибриногена по методикам описанным ранее, (Prlvalov and Medved', 1982; Medved' et al„ 1982).

Щд фрагмент получали по методике, описанной в работе (Belitser et al. 1980), с дополнительной очисткой гель-фильтрацней на последней стадии выделения.

Etxj._D.iJ32 Фрагменты были получены в результате протеолиза Dh-фрагмента с последующей очисткой гидролнзатов при помощи оригинальных методик, описанных в разделе 1. Гомогенность препаратов проверялась электрофор?гнческн в присутствии додепилсульфата натрия (ДСН).

Gly-Hls-Ar^-Pro-NHICH?lR-NH-DNS модифицированный тетрапептид был синтезирован в Ленинградском /осуниверснтете группой В.Н.Калихевича.

Молекулярные массь'. фрагментов протеолиза фибриногена определяли в пативных условиях методом высокоскоростного равновесного центрифугирования (Yphantis. 1964), а также в денатурирующих условиях с помощью ДСН-электрофореза по маркерным белкам.

Разделение полипептидных цепей фрагментов фибриногена проводили, используя метод обратнофазпой .жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) па колонке "Nucleosel С18". Полипептидные цепи фрагментов восстанавливали И модифицировали по ранее описанной методике (Henschen, 1986).

Ы-копцевые последовательности аминокислотных остатков определяли в лаборатории Д-р.А.Хеишеи Калифорнийского университета (г.Ервайн, США) на газожидкостиом аминокислотном сиквеиаторе "Applied Blosystems -777"(США), по методике описанной в работе (Edroan and Henschen, 1975).

Равновесный диализ проводили против буфера: 0.05М TrlsHCl, рН 7.4. 0,1М NaCl С ImM СаС1г и 0,02% №N3, содержавшем 105 М пептида GHRP -DNS. Концентрации белков составляли 0,1-1 мг/мл. Для достижения равновесия диализ проводили в течение 24-х часов.

Флуориметрические измерения проводили на спектрофлуориметре Hitachi MPF-4 (Япония) при длине волны возбуждения к = 335 им и ширине щелей 10 нм.

Аитиполимеризационную активность фрагментов фибриногена определяли по задержке времени свертывания моиомерпого фибрина при добавлении фрагментов (Belltseret al. 1973).

Калориметрические измерения проводили на дифференциальном сканирующем калориметре ДАСМ-1М (Prlvalov. 1980) при скорости прогрева 1 о/мин и концентрациях белков в пределах 1-2 мг/мл. Часть экспериментов была выполнена в лаборатории термодинамики белка Института белка АН СССР (г.Пущино). Термодинамический анализ кривых плавления осуществляли как описано в работе (Prlvalov and Khechlnashvlll, 1974).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. ПОЛУЧЕНИЕ НОВЫХ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФРАГМЕНТОВ ИЗ Он-ФРАГМЕНТА ФИБРИНОГЕНА.

В связи с тем, что опубликованные ранее модели структурной организации молекулы фибриногена не дают представления о точном количестве доменов в терминальных областях этой молекулы, а также о том, какими участками полипептндпых цепей опи сформированы, мы провели детальные исследования структурной организации терминальны* областей молекулы фибриногена. В качестве простой модели был использован фрагмент протеолиза Оц, происходящий из этих областей. Полученный из пего и ранее описанный Оь-фраг менг, у которого отщеплен 13 кДа С-концевой участок у-цепи, формирующий компактный домен (Медведь и сотр., 1982), был подвергнут дальнейшему протеолизу различными гтротеазами. Было обнаружено, что независимо ог типа протеаз во всех случаях протеолиз происходит с образованием дискретных фрагментов, названных нами Их. и Х>% (рис. 1). Конечным продуктом протеолиза является ТЭО-фрагмент, описанный ранее (Мес^есГ е! а!.. 1983). Такой характер протеолиза указывает на дискретность структуры Пн-фрагмента, т.е. па то, что он, по-видимому, состоит из ряда компактных участков, которые в процессе протеолиза отщепляются ступенчато.

а б В

кДа кДа кДа

I ' 'го -

о"- & Ш «9-63 О»- —

оу~ И и в-бз

о,- — - »,-47

IV. ы

б а

Время гидролиза (час)

Рис. 1. Элемрофореграммы хода протеолиза Ис-фрагмента химогрипсином (а), эллстазой (б), фнпсниоч (в) и пепсином (г).

Все дискретные фрагменты, наблюдаемые при протеолизе DL-фрагмента, были выделены и охарактеризованы. Стратегия выделения заключалась в следующем:

а) ограничешмй протеолиз высокомолекулярного фрагмента протеазой, которая дает максимальный выход более низкомолекулярного фрагмента, и последующее выделение из гидролизата последнего с использованием различных хроматографических подходов;

б) дальнейший гидролиз выделенного фрагмента протеазой, которая дает максимальный выход следующего низкомолекулярпого фрагмента, последующая хроматографическая очистка последнего и т.д.

Такая стратегия позволила провести сравнение полппептпдного состава ряда фрагментов, полученных один из другого, и оценить, какие полипептидные цепи подвергаются расщеплению в процессе ступенчатого гидролиза.

При гидролизе Вь-фрагмента хнмотрипснном и эластазой в значительных количествах накапливается фрагмент Dy. Для получения Dy-фрагмента 10-часовый хнмотрипсиновый гидролизат (рис. 1,а) был заингибйрован фенилметнлсульфонилфлуоридом и пропущен через колонку (1,6 х 90 см), заполненную сефадексом G-100 SF.

„ а б и 21 <"1

{^SSEST-jg eus- 82

4L-E3 E3i-82 п.. КЗ «7Q ^ ¡-¡.jq

EV-C3— -63 1®**70 ^

Dz- ' sg tes-47 w fcl-47

M -28

•-12

V t. -12 »12 & ч

r^-12

0 48 144 0 30 0 24 48 0 15 120 0 2 6

Рис. 2. Электрофореграммы хода протеолиза Оу-фрагмеита эластазой (а), Оо-фрагмента трипсином (б), Рн-фрагмента плазмином в присутствии ионов кальция (в), ОьА-фрагмента химотрипсипом (г), Бх-фрагмеша химотрипсином (д). Под электрофореграммамн обозначено время гидролиза в часах (а, в, д) и п минутах (б, г). Молекулярные массы фрагментов обозначены в кДа.

Дальнейший протеолиз Ру-фрагмента эластазой приводит к образованию Вг-фрагмента (рис. 2,а). Иг-фрагмент был получепиз 144-часового гидролиза-та Иу-фрагмента афшшой хроматографией на фибрии-сефарозе с использованием буферов, описанных в работе (ВеШэег е1 а1. 1980), с последующей очисткой на сефадексе С-100 БР. Электрофоретический анализ показал, что он состоит из двух компонентов с М.м. 47 и 12 кДа, которые разделяются только в денатурирующих условиях.

Протеолиз Бь-фрагмента трипсином приводит к накоплению на ранних стадиях в достаточно больших количествах Ох-фрагмента (рис. 1,в и рис. 2,6). Ох-фрагмепт был выделен из ЗО-мимутпого трнпсинового гидролизага Пь-фрагмента (рнс. 2,6) гель-фильтрацией па сефадексе С-75 БГ и последующей афшшой хроматографией на фибрип-сефарозе. Следует отметить, что полученный препарат состоял из двух компонент с М м. 70 и 12 кДа, которые можно было разделить только в денатурирующих условиях.

Исследование кинетики протеолиза Бн-фрагмеита плазмнном в присутствии ионов Са2+- показало, что при длительном гидролизе Вц-фрагмента в гидролизате накапливаю гея продукты с мол.массой 82 и 12 кДа (рис.2,в). 48-часовый гндролизат был заингибпрован коптрнкалом (30 ед. па 1 к.е. плазмнна) и пропущен через Лмз-сефарозу для удаления плазмипа. Затем гндролизат был расфракциоииропагс па колонке с фибрин-сефарозой по методике, описанной в работе (ВеШкег еЬ а1. 1980). Компоненты с М.м. 82 и 12: кДа удалось разделить только в денатурирующих условиях, что указывает на то, что фрагмент - продукт данного гидролиза - состоит из двух компонент с М.м. 82 и 12 кДа, которые взаимодействуют между собой нековалентно в нативном фрагменте. Дополнительные исследования показали, что он обладает более высоким сродством к фибрии-сефарозе и повышенной антиполимеризациоипой ак тивностью, чем исходный Он-фрагмент, По этим свойствам он напоминает Пь2-фрагмент, выделенный ранее из триптического гидролизата фибриногена (ВеШзег й а1. 1980). Мы назвали данный фрагмент активным Оь-фрагментом (Оьл).

Дальнейший гидролиз Оьл-фрагмента химотрипсином приводит к появлению на электрофореграммах более иизкомолекуляриой полосы с М.м. 70 кДа, как у 1)х-фратмеиа (рнс. 2,в). 120-минутный гндролизат'бил подвергнут гель-филырации па сефадексе С-75. Как и в случае Ох-фрагмента, полученного из трнпсинового гидролизага фрагмента О^, этот фрагмент состоял из двух компонент с М.м. 70 и 12 кДа, которые разделялись только в денатурирующих условиях. Электрофоретический анализ образцов этого фрагмента и Ох-фрагмента, получепиог о из фра( меига Оь в восстановленных

условиях, показал идентичность их полипептидпого состава (Литвинович и Медведь, 1988), что позволяет сделать заключение об идентичности этих двух фрагментов.

Дальнейший протеолиз вышеуказанного Вх-фрагмепта химотрипсином приводит к образованию фрагмента с М.м. 47 кДа, аналогичного по электрофоретической подбижности Ог-фрагменту; в дальнейшем появляется ТБО-фрагмент (рис. 2,д). Анализ полипептидпого состава этог о фрагмента и Ог-фрагмента, полученного из эластолизного гидролизата фрагмента 1)у, подтвердил их идентичность. Этот фрагмент был выделен из 6-часового химотрипсинового гидролизата Ох-фрагмента (рис. 2,д) гель-фильтрацией на сефадексе 0-76 ЭР. Как и в случае эластолизного Ог-фрагмента, он состоял из двух компонент с М.м. 47 и 12 кДа, которые разделялись только в денатурирующих условиях.

На рис 3,а представлены электвофореграммы, демонстрирующие чистоту выделенных фрагментов, а на рис. 3,6 электрофореграммы этих же фрагментов, демонстрирующие их полипептидный состав. Сравнивая полипептидный состав пар фрагментов, полученных друг из друга фу изБь Ох из Оьд> и т.д.), можно заключить, что протеолиз в ряду Бц --> Оь --> Оу происходит путем одтцеплепия длинных участков у-цени. Поскольку ранее было показано, что ТБО-фрагмент, который япляется конечным продуктом протеолиза Сн-фрагмепта, состоит из М-копцевых участков всех трех полипептидиых цепей Он-фрагмепта, то наиболее вероятно, что при переходе Он —> Е>у происходит ступенчатое отщепление длинных С-копцевых участков у-цепи.

Сравнение полипептидпого состава Г3ь\, Т>х и Ог-фрагментов между собой, а также с Он-фрагментом позволяет заключить, что при переходе Он —> 1>1а. по - видимому, расщепляется Р - цепь, затем при переходе Юьа —> Ох и Ох —> Т>2 последовательно отщепляются длинные С-концевые участки уцепи.

Как было указано выше, Оьд, и Ог-фрагменты состоят из двух компонент, более низкомолекулярные из которых имели во всех случаях М.м. ~ 12 кДа. Эти компоненты, выделенные в денатурирующих условиях из фрагментов Оьа, Ох и Ог, имели идентичный спектр поглощения и, по-видимому, происходили из одной и той же области Он-фраг мента, скорее всего из С-концевого участка Р-цепи.

Для более детальной характеристики выделенных фрагментов и локализации их по первичной структуре были определены М- и С-концевые последовательности формирующих их нолипеп гидных цепей.

а кДа

кДа

95-ста __

82- 0

63--ет

О

■ 70 "47

-25

-12

Он С>1. 15у Оьл Ох Ъг ТЭБ

45383325-

О

а

КЗ

еэ

-25

12-

Рис. 3. Электрофореграм^ы выделенных фрагментов фибриногена в невосстановленных (а) и восстановленных (б) условиях.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ПОЛУЧЕННЫХ ФРАГМЕНТОВ.

Для локализации участков полипептидных цепей, входящих в состав различных форм О-фрагменгов, по первичной структуре необходимо определение их 14- и С-концевых. последовательностей аминокислотных остатков. Определение Ы-коицевых повледователыюстеП возможно путем прямого сик^еппроваиия как отдельных полипептидных цепей фрагментов, так и целых фрагментов, состоящих, как правило, из трех цепей: а, р и у. В

последнем случае необходимым условием является внутренняя гомогенность препаратов, т.е. отсутствие протеолитических форм данного фрагмента, возникших в результате альтернативного протеолиза нескольких пептидных связей в расщепляемом участке. Дополнительное хромагографичесяое разделение отдельных цепей требуется для анализа гетерогенных препаратов, а также фрагментов, состоящих более, чем из трех полипептидных цепей. ЗначитеЛьне более сложную проблему представляет определение С-концевых аминокислотных последовательностей. Несмотря па отдельные успехи в этой области, связанные с применением карбоксипелтидаз (Вгес1с1ат, 1986), в настоящее время ие существует высокоспецифиуного метода для С-концевого сиквенировашя пептидов. Для решения этой проблемы была поставлена задача получения коротких С-концевых пептидов индивидуальных полипептидных цепей исследуемых фрагментов и полное определение их первичной структуры путем ГЯ-к^ицевого сиквепирования. Применение высокоэффективных методов обратпофазиой хроматографии позволяет также идентифицировать изолированные интактные С-концевые пептиды путем сравнения их сродства к гидрофобным носителям со сродством соответствующих С-коицевых пептидов, полученных из интактных цепей фибриногена. •

Результаты определения 1Ч-ко1щевых последовательностей для полипептидных цепей всех полученных фрагментов представлены в таблице 1. Как видно из таблицы, при уменьшении молекулярной массы фрагментов Ы-концевые участки их а, р и у-цепей несколько укорачиваются. Однако, все последовательности начинаются в области между двумя дисульфидными кольцами К1 и Кг. Это свидетельствует о резистентности к протеолизу этих участков полипептидиых цепей И-фрагментов, в том числе цепей, входящих в состав конечного Продукта протеолиза - ТвО-фрагмеита. Полученные результаты ие являются неожиданными, поскольку, как было показано ранее (МебуесГ е1 а1., 1982), в состав ТБЭ-фрагмента входят И-концевые участки полипептидиых цепей Он-фрагмента.

Пептиды с молекулярной масой 12 кДа, выделенные из Бх и Ьг-фрагментов, которые, как было отмечено в предыдущей главе, происходят, по-видимому, из С-концевого участка (3-цепн, были также просиквенированы. У всех пептидов оказалась одинаковой И-копцевая последовательность Р(394)ПТ)Р. Таким образом, этот пептид действи тельно оказался С-коицепым участком Р-цепи. Мы назвали его рС-пептидом.

1'аблица 1. Результата сиквеиировапия N-концевих аминокислотных . последовательностей D-фрагмептов фибриногена.

I

а Р Т 100 110 120 130 140 NIVELMRGDrAKANNNDrilTKQINEDLHSRJEILRRJtVlEQVQRINVLQKNV.... 130 1-Ю 150 100 170 LKMM\VKCI!gNQVQDNENWNEVSSHLErajgLYlDETVliMNlPTKJ.RVl.RSl... 70 80 !Ю 100 ......A1QIS\'NPDQPSKPNN1EAATKNSKSMMEE1MKYETL1STHES11RFLQEV...... His JKUSC Viol CG1PC COEPC

и

а Ui Р 7 (1041ANNNDNTFK91NED........................................................... (1341CRQNQVQDNENVVN........................................................................ (G3)AIQISYNPDQP5KP........................................................................................... (851NSKSMMEE1MKYET.....................................

а Dia [3 Y (112)KQ!NEDL.......................................................... (134)GRQNQVQDNE................................................................................ [15611IQLY1DETVK.............................. (88)SMMEEIMKYET1.YS............................

а a е Y (112)KgiNEDlRSRieiL.......................................... [150)Y1DETVKNNIPTKL............... I85)NSKSMMEEIMKYET................................... IpSlSMMEEIMKYETUS...............................

а ^ Р Y (120)SFUEILRRKV.................................. (163|TVKNNirTKL............... (8S1SMMEEIM1CYE.....................................

а EV Р Y U23iviE9vgraifv............... [lGOIIDETVKNNIP...................... (881SMMEEMKYE......................................

а i>z р Y (123IV1EQVQH..................... (107)NllTri(]................. UODESTWLQE.......

а TSD Р 1 (13G11NVTQKNV... (lCelNNlPTKI-li............ (851NSKSMMEE.................................................. I8S1SMMEEIMK...........................................

I - последовательности участком а, р н уцелей фибриногена между лисульфндшмн

кольцами К] и Кг n coumeici ими с (Krieglsteln and Henshen, 1989; Chung et al„ 1981; Brown et al.„ 1989).

II - определимые N-комцевые мос.че/юнател/.иосш Дисульфидное кольцо ("К2) (Doolittie et al., 1978) заключена и рамку.

Для выяснения вопроса о расположении С-концевых аминокислотных остатков в полипептидных цепях полученных фрагментов были выделены и просиквенированы короткие С-концевые пептиды этих цепей. Пептид рЬуБ460-С1п468 с С-концевым глутамииом Р-цепи был выделен и просиквенирован из бромциаиовых гидролизатов Оь Иу-фрагментов и рс-пептидов Б^д и фрагментов. Поскольку Эх-фрагмент является промежуточным при гидролизе 1Э[А-фрагмепта до фрагмента Т>х, а Оц-фрагмент являлся исходным для получения остальных фрагментов, можно заключить, что фрагменты Он, Ъь. Ву, а также рс-пентиды Оьл. Ох и О г- фрагментов содержат иптактный С-концевой участок Р-цепи.

Для ответа на вопрос, происходит ли расщепление С-концевой области Р-цепи при переходе (Он —> Ох,а. Оь —> Ох> Оу -> Ог) путем расщепления единственной пептидной связи (5 ЬувЗЭЗ-ТЬгЗЭЗ или при этом выщепляегся короткий пептид, мы проанализировали пептиды, образующиеся при расщеплении высокомолекулярной часта р-цепи (¡5') фрагментов П^д и Ог. В этом случае С-коицевым пептидом оказался пептид ррЬеЗ 81-ЬувЗЗЗ. Следовательно, расщепление С-концевого участка р-цепи при образовании фрагментов О^л, Их. а также Ох происходит пу тем расщепления единственной пептидной связи рЬуо393-Т1тг394.

В некотормх случаях, когда полное енквеннрование С-копцевых пептидов было затруднено ( слишком длинный пептид, либо Л-концевой аминокислотный остаток блокирован) для идентификации этих пептидов был применен хроматографический подход, основанный на сравнении положений пиков при элюции интактпых С-концевых пептидов, происходящих из фибриногена, и пептидов, полученных в результате фрагментации исследуемых фрагментов. Известно, что идентичные пептиды при использовании обратнофазной НРЬС-хроматографии воспроизводимо элюируются при строго определенных концентрациях градиентного раствора. Так, при идентификации С-концов у-цепей Ъьа и он-фрагментов из бромциаиовых гидролизатов этих фрагментов мы выделили пептид с Ы-копцевым аминокислотным остатком ■уЬуз384. На рис 4 представлены НРЬС-хроматограммы, демонстрирующие положение пиков, в которых элюируется этот пептид при разделении бромциаиовых гидролизатов фибриногена, Ин и Ои\- фрагментов.Как видно из рисунка, указанные пептиды во всех трех случаях элюируется при стапдартой конце11храции градиентного буфера, что свидетельствует о его идентичности. Поскольку С-концевой участок 7-цеп и фибриногена (уЬуз384-Уа1410) не содержит пептидных связей, расщепляемых бромциапом, можно заключить,

Рис 4. Профили элюции броициаиовых фрагментов фибриногена (а),

Он-фрагмента (б), у-цепи Г)ь\- фрагмента (в). Посадочный раствор -0.1% трифТоруксусная кислот а (ТФУ), градиентный раствор -ацетоиитрил в 0.1 % ТФУ.

что выделенный пептид является С-коицевыи интактпым участком 7-цепн фибриногена и следовательно Иц и Оьа- фрагментов. Аналогично были определены С-концевые участки а- и 7-цепей Вг-фрагмеита.

На основании полученных данных мы предложили схему протеолиза Оц-фрагмента (рис. 5). Как видно из рисунка, протеолиз Он-фрагмента

происходит путем отщепления длинных С-копцевых участков его (5 и у-цепей вплоть до дщульфидиого кольца, сохраняющегося у ТвВ-фрагмеита.

(.15

.м

-Л-

>

Он

та>1 -¿А—«О-К»

\f--V4tO

Ей

Ах

1'ис. 5. Схема протеолиза Бн-фрагмснта фибриногена и расположение

расщепляемых пептидных связей. Над стрелками указаны ферменты, при помощи которых были получены фрагменты, у которых определяли Ы- и С-коицевые последовательности. В скобках указаны ферменты, с помощью которых могу г быть получены аналогичные фрагменты, сиквеш: для которых не определялся.* В препарате ТБО-фрагмента также был обнаружен пептид с М-концевым р\г245.

3. ИЗУЧЕНИЕ ДОМЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ПОЛУЧЕННЫХ ФРАГМЕНТОВ.

Поскольку полученные фрагменты являются Д1 скретными и сравнительно резистентными к дальнейшему протеолизу, следу яг ожидать, что они будут иметь компактную структуру, присущую натитой молекуле фибриногена. Для выяснения этого вопроса мы провели детальное исследование их тепловой денатурации. На рис.б представлены кривые плавления выделенных фрагментов, а в Табл. 2 - термодинамические параметры денатурацнонных переходов, наблюдаемых в этих фрагментах. Как

о

В

й 60 а

^ 40

60 40

40

20

40 20

Т/оС

Рис. 6. Температурные зависимости молярных теплоемкостей терминальных фрагментов фибриногена в 0,05 М глициновом буфере, рН 3,5.

видно из рисунка и таблицы, все исследованные фрагменты имеют высокотемпературный переход (ВТ), который, как было показало ранее,-

соответствует плавлению термостабилыюй структуры - TSD-домена (Privalov and Medved'. 1982). Отношение энтальпий (п), которое коррелирует с коли-

Табл. 2. Термодинамические характеристики плавления различных фрагментов фибриногена.

Пик нт ВТ

Фрагмент т дНкал п Т дНкал п

(¡V кДа)

Юн(95> 45,0 263 ют 2,4 89,0 XI5 XII 1,0

Сы(82+Х2) 40,0 239 101 2,4 В9,0 112 110 1,0

45,0 218 112 2,0 88,0 107 юз 1,0

^(70+12) 40,0 179 92 2,0 88,0 96 85 1,1

ЮуСбЗ) 41,3 ' 114 90 63,5 86 90 1,0

Рг(47+Х2) 33,0 93 71 1,3 81,0 71 74 1,0

130(28) 74,0 S3 79 1,0

дНКАЛ и днэф - калориметрическая и эффективная (Вант-Гоффовская) энтальпии, п - их отношение.

честном плавящихся кооперативных единиц (Рг1уа1оу, 1982), для этого перехода во всех случаях равняется единице, что однозначно указывает на плавление в этой области температур одного кооперативного участка - ТБО-домена. Как было показано ранее (Medved'. а1. 1982), этот домен образован М-концевыми участками трех полипепгидиых цепей, находящихся в суперсниральной копфориации.

Кроме описанного выше ВТ-перехода, все фрагменты, за исключением фрагмента ТвО, содержат термолабильпые структуры, которые плавятся в области низких температур (НТ-переход) (Рис. 6). Поскольку эти фрагменты отличаются от ТвИ-фрагмента в основном наличием длинных С-концевых участков полипептндных цепей у и/или |), начинающихся за дисульфидным ксльцом (рис. 5), термолпби шные структуры должны бып, образованы именно этими участками. Так у О*, -фрагмента, имеемся длинный С-копцевой участок р-цепи, который долл ен плавиться в области НТ-перехода. Огношение

калориметрической и Вант-гоффовской энтальпий для этог(. перехода у Иу-фрагмента (п=1,3)(Табл. 2) указывает на то, что в этом переходе может плавиться два сильно взаимодействующих домена. Это заключение подтверждается более детальным термодинамическим анали:эм этого пика. Деконволюция функции избыточной теплоемкости п> алгоритму, разработанному для анализа кривых плавления мультндомгнных белков (Филимонов и сотр., 1982), показывает, что НТ-переход Бу-фрагмента хорошо описывается двумя взаимозависимыми переходами (рис. 7), т.е., в данном

случае, НТ-переход отражает денатурацию двух сильно взаимодействующих доменов. Для НТ-перехода Иг-фрагмента, который имеет сходную с Оу-фрагментом химическую структуру (рис. 5), отношение энтальпий также равно 1,3. Следовательно, С-коицевой участок (3-цепи Иг-фрагмента также формирует два взаимодействующих домена. Причем, взаимодействие между этими доменами настолько сильно, что они не диссоциируют после расщепления пептидной связи рЬув393-ТЬг394. Химическая структура И], и Эх-фрагментов подобна. Отношение энтальпий для НТ-перехода этих фрагментов равно 2. Такое отношение, указывает па плавление в этом пике не менее двух доменов. Однако, необходимо учесть, что в состав этих фрагментов входит два сильно взаимодействующих домена, образованных С-концевым участком (5-цепи. Описанное междоменное взаимодействие может занижать величину отношения энтальпий,. Как было показано выше, превращение Бь —> Пу и Ох—> 1)г происходит путем отщепления длинного (М.м. ~ 16 кДа) С-концевого участка у-цепи. При этом резко падает энтальпия, указывая на потерю компактной структуры. Отношение эптальпий также уменьшается с 2 до 1,3. Эти факты указывают па то, что

Рис. 7. Деконволюция НТ-пика Бу-фрагмеита. (—) экспериментальная кривая, ( -•- ) переходы, полученные в результате деконволюции, ( — ) кривая, синтезированная из двух составляющих переходов.

и

30 40 Т/°С

50

участок у-цепн отщепляемый при переходе и^ -> Оу и Ох~> Ог, формирует компактный домен. Таким образом, в НТ-переходе и Ох-фрагментов плавится гри домеиа, два из которых сильно взаимодействуют между собой. Ранее было показано, что переход 1Эц--> Вь сопровождается потерей одного домеиа, образованного С-копцевым участком у-цеии с М.м. 13 кДа (Медведь и сотр., 1982). Учитывая это, можно заключить, что С-коицевой участок уцепи, начинающийся за дисульфидпым кольцом, формирует два компактных домена, которые последовательно отщепляются при переходе Оц--> Б:. --> Оу.

Из приведенных выше данных следует, что Бц-фрагмепт состоит из пяти доменов которые могут последовательно отщепляться в процессе протеолиза. На рис. 8 представлена модель доменной организации Пц-фрагмента и схема

^.доменрС-Домен

ТБО-домен (р^) . А

ь—

Ру Е^^^Н

тэп =ЦЩ=

о

Ох

тс. 8. Модель доменной организации Оц-фрагмента (а) и схема его ступенчатого протеолиза (б).

ею последовательной фрагментации до конечного продукта протеолиза - 1БН-фрагменга. ТермостабнльныП домен (ТБ1Э), плавящийся в области ВТ-перехода, как било гмкязаио ранее (МссК'есГ (.Ч а!.. 1982), образован М-

I 9

концевыми участками трех полипептидных цепей: а, Р и у. Ка; ;дый С-концепой участок у и Р-цепей образует по два домена: у, уС и р, рс. соответственно, причем,два последние сильно взаимодействуют между собой.

Электронномикроскопические исследования позволили обнаружить в каждой терминальной области молекулы фибриногена по две обособленные глобулы, которые, как было предложено, образованы С-концевими областями р н у-цепей (Williams, 1981; Mosesson et al., 1981; Doolittle. 1984). Как следует из вышеприведенных данных, каждый из этих участков Р и у-цепей формирует по два термолабильных доиена. Очевидно, что каждая терминальная глобула, наблюдаемая под электронным микроскопом, должна формироваться парой доменов, обнаруженных методом микрокалориметрни. Следует отметить, что в работах (Hewat et al., 1982, 1983) при исследовании кристаллов модифицированного фибриногена методом трансмиссионной электронной микроскопии в терминальных областях молекулы фибриногена было обнаружено по четыре области с повышенной электронной плотностью. По-видимому, они и соответствуют четырем термолабильным доменам, выявленным нами методами сканирующей микрокалориметрии и ограниченного нротеолнза.

Полученные экспериментальные данные позволили не только установить количество доменов в термолабилышх областях молекулы фибриногена, но и оценить, какими участками полипептидных цепей сформирован каждый домен. Поскольку, как было указано выше, протеолиз мультидоменных белков происходит путем расщепления их междоменпых областей, локализованные места расщепления при образовании дискретных фрагментов можно рассматривать в качестве примерных границ между доменами. Исходя из этого, границы между TSD и р и у-доменами должны находиться сразу за дисульфидным кольцом, граница между р и рс доменами находится в области расщепляемой связи pLys393- Thr394, а граница между у и уС доменами в области расщепляемой связи yLys301-Phe302, описанной ранее (Henschen et al., 1982).

4. ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ПОЛУЧЕННЫХ ФРАГМЕНТОВ.

Известно, что в терминальных областях молекулы фибриногена расположены активные центры самосборки фибрина di и d2, комплементарные Ei и ей-центрам центральной области молекулы. dh-фрагмент, происходящий

из термииальных областей фибриногена, содержит центры di и d2 , которые связываются с синтетическими пептидами - аналогами Ei и Е2-центров (Laudano and Dooltttle, 1980), и способен взаимодействовать с иммобилизованным фибрином (CJlexa and Budzynsky, 1981), а также тормоз!ггъ процесс полимеризации фибрина. Описанные выше новые фрагменты Dla, Dx, DynDz происходят из Dh-фрагмента. Поскольку они сохраняют нативную структуру (см. Гл. 3), следует ожидать, что они могут сохранять также и функционально активные di и d2,-центры полимеризации. Для проверки этого предположения мы провели исследования взаимодействия этих фрагментов с фибрин-сефарозой. Результаты этих исследований представлены на рис. 9. Для сравнительной оценки степени сродства D-фрагмеитов с расщепленным и интактпым С-копцевым участком (5-цепи на колонку наносились двухкомпонентные смеси фрагментов: Dh - Dla. Dl - Dx, Dy - Dz-Фрагменты Dla, Dx и Dz, которые выходили в 3-м пике, специфически связы-

Рис.9. Афипная хроматография на иммобилизованном фибрине 48-часового плазминового гидролизата Он-фрагмента (а), смеси Бь : Ох-фрагмепгов (70 : 30) (б), смеси Су : Рг-фраг меитов (50 : 50) (в). Стрелками указана смена элюирующих буферов. Хроматографию проводили при Т=22° С (а) и при Т=4° С (б,в).

вались с иммобилизовании». фибрином п элюнровались буфером с низким рН (5,3) и высокой ионной сп юй (1M NaCl). Dn-фрагменг и, в меньшей степени, фр:н менты Di, и Dy такт.е связывались с фибрином: они элюнровались но 2-м

пике (Dh) либо в 1-м и частично во 2-м (Dl м dy). Dl и dy-фрагменти связывались гораздо слабее, чем Dn-фрагмепт, т.к. основная масса этих фрагментов выходила с иесвязавшимся материалом в пике 1. Тем не менее это связывание было специфичным, т.к. дополнительные эк> перименты по светорассеянию показали, что внесение п полимеризующнйся р,'створ фибрина 10-кратных молярных избытков этих фрагментов приводи - к заметному торможению процесса полимеризации.

Известно, что d¡-центр сформирован С-концевым участком у-цепн (Laudano and Doollttle. 1980; Olexa and Budzynsky, 1981), т.е. у и/или yC -доменом. На основании гомологии между р и -у-цепями фибриногена было предложено, что d2-neirrp должен быть сформирован С-концевым участком р-цепи (Doolittle and Laudano. 1982), т.е. расположен в р и/пли [!С-доменах. Для

проверки этого предположения мы исследовали взаимодействие различных форм D-фрагмеичоп с дансшшронанпым тетрапептндом (GHRP-DNS), который, как было показано (Laudano and Doollttle, 1980), моделирует центр полимеризации Е2- На рис. 10 показаны спектры флуоресценции образцов исследованных форм D-фрагмен i ов, которые были отдиализопяим

D:),DL,DY

Рис. 10. Спектры флуоресценции дансмлированпого тетрапептида

GHRP-DNS (P2-DNS), демопсгри -рующие его связывание с фраг -ментами Dl , Dh. Dy при равновесном диализе.

500 " 560

А, (им)

против раствора, содержащего 105 М ОНИР-ОМБ. Е-фрагмеит был использован в качестве контроля. Как следует из рисунка. Он. Т)^ и Оу-фрагмеиты связывают меченый пептид при равновесном диализе, поскольку интенсивность флуоресценции дансилироваипого пептида в образцах этих фрагментов увеличивается по сравнению с интенсивностью флуоресценции этого пептида в диализной жидкости. Из приведенных выше результатов следует, что для Ег-йг-взаимодействия необходимо участие р и рс - доменов, присутствующих у Он, Ох, и Бу-фрагмеитов и отсутствующих у фрагмента ТБО. Следовательно, центр полимеризации <3г должен быть расположен в этих доменах. Поскольку, как было показано ранее, <)2-цеитр обладает более низкой афшшостыо к фибрину, чем -центр, низкая аптиполимеризационная активность и сродство к фибрип-сефарозе О^ и Бу-фрагментов может быть объяснено тем, что в их составе присутствует только с)2-центр, а более сильный центр с^ отсутствует. В то же время Их и Ог-фрагмеиты, имеющие структуру, подобную таковой и Ьу-фрагментов (Гл. 2), обладают повышенным сродством к фибрип-сефарозе. Единственным отличием последних от Оь и Бу-фрагментов является наличие расщепления в р-цепи в положении Р Ьув393-ТЬг394. Следовательно, повышенное сродство к фибрии-сефарозе у Ох и Пг-фрагмеитов связано с расщеплением именно этой связи. Аналогичное повышение аитиполимеризациоппой активности происходит при расщеплении этой связи у Оц-фрагмеита в случае образования фрагмента 01д. Наиболее вероятно, что в результате этого расщепления повышается доступность ёг-цептра к комплементарному ему Ег-цептру. Следует отметить, что такое расщепление связи между доменами р и рс приводит к дестабилизации плавящихся теряолабильных доменов (рис. 6, табл.2). Похожая дестабилизация структуры описана при активации некоторых проферментов (РгК-аЫ е1 а!., 1981; ИоуокЬату й а!., 1984).

В результате проделанной работы получен ряд протеолитических фрагментов, детальная характеристика которых позволила предложить детализированную модель доменной организации терминальных областей молекулы фибриногена, а также локализовать йг-ценгр полимеризации. Поскольку эти области молекулы, помимо активных центров полимеризации, содержат различные центры пзгшмодсйсшня, опнслнпыс выше фрагменты могут быть использованы для более точной локализации и структурно-функщшналыюй .характеристики этих цеп трон.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено, что независимо от вида протеаз 1>н-фрагмент фибриногена расщепляется на ряд дискретных протеолнтическ ix фрагментов. Выделены и проанализированы новые фрагменты : Dla. Dx. Dy и Dz-

2. Анализ первичной структуры выделенных фрагментов показал, что они образуются, в основном, за счет последовательного отщепления крупных С-коицевых участков (3 и/или у-цепсн.

3. Анализ процеса денатурации выделенных фрагментов методом сканирующей калориметрии показал, ч то С-конпевые участки у и 0-цепей формируют по 2 кооперативных домена (Р,РС ну,уС. соответственно), последовательное отщепление которых приводит к образованию новых дискретных фрагментов.

4. На основании анализа первичной структуры и доменной организации выделенных фрагментов предложена детальная модель доменной организации терминальных областей молекулы фибриногена.

5. Анализ связывания с выделенными фрагментами дансилированного тетрапептида Gly-His-Arg-Pro-DNS, моделирующего Ег-цептр полимеризации, комплементарный сЬ-ценгру, позволил доказать, что последний расположен в (1 и/или рс-доменах фибриногена.

6. Показано, что расщепление связи Lys393-Thr394 в Р-цепи выделенных фрагментов приводит'к резкому увеличению их функциональной активности

Основные положения диссертации опубликованы в работах:

1. Медведь JI.B., Литвинович C.B. Структурная организация D - фрагмента, полученного путем дальнейшего плазминового гидролиза фрагмента Du молекулы фибриногена // IVСимпозиум СССР-Италия "Макромолекулы в функционирующей клетке". - 1984 - Киев, Наукова Думка, - с.85.

2. Белицер В.А., Литвинович C.B., Медведь Л.В. Выделение и изучение структурной организации нового фрагмента молекулы фибриногена.

полученного путем гидролиза легкого Оь-фрагмента хнмотрипсипом И V Всесоюзный биохимический съезд - Тезисы - 1985 -М, Наука - 2 - с. 5-6.

3. Medved' L.V., Lltvinovich S.V., Privalov P.L. Domain organization of the

terminal parts in fibrinogen molecule // FEBS Lett.- 1986 - 202, N2. p. 298302.

4. Литвинович C.B., Медведь JI.B. Выделение нового протеолитического фрагмента из химотрипсинового гидролизата Dl - фрагмента молекулы фибриногена ¡¡Докл. АН УССР.- 1986 - сер. Б - N9 - с. 65-67.

5. Медведь Л.В., Лукипова Н.И., Литвинович С.В., Платонова Т.Н., Гусак Н.М. Структурная организация "сверхактивной" фракции D-фрагмеита молекулы фибриногена И Докл. АН УССР - сер. Б - N5 - с. 73-76.

6. Медведь Л.В., Литвинович С.В. Мультидоменная структура молекулы фибриногена // В сб.: Биохимия животных и человека - Киев, Наук. Думка -1988 - вып. 12 - с. 18-27.

7. Медведь Л.В., Угарова Т.П., Литвинович С.В., Калихевич В.Н. Локализация d2-ucinpa полимеризации фибрина с помощью флуоресцентного зонда Gly-His - Arg - Pro ~ DNS // VI Конференция no спектроскопии биополимеров -Тезисы - Харьков, 1988 - с. 205-206.

8. Литвинович С.В., Медведь Л.В: Схема лротеолиза Dh(95 кДа) фрагмента молекулы фибриногена // Молск. биология - 1988 - 22 - №4 - с. 934-943.

9. Medved' L.V., Lltvinovich S.V. Domain structure of different fragments

derived from fibrinogen Dh(95 kDa) fragment // Second Symposium of the American Protein Society - Abstracts - San-Diego - 1988 - p. 63.

10. Medved' L.V., Platonova T.N., Lltvinovich S-Y- Lukinova N.I. The cleavage of (J-chaln in bovine fibrinogen Dn-fragment (95 kDa) leads to a significant Increase in Its anticlotting activity - FEUS Lett. - 1988 - N1 - p. 56-60.

11. Medved' L.V., Lltvinovich S.V. The cleavage of (5-chain In bovine fibrinogen fragment Dh leads to destabilization of Us thermolabile domains and a significant Increasing of anticlotting activity // In: Fibrinogen Л. Biochemistry, biological Junctions , gene regulation and expression - M.Mosesson et al., Eds., Excerta Medlca, Amst., N.Y., Oxiord - 1988 - p.301-304.

12. Medved' L.V., Utvinovtch S.V., Ugarova T.P., Kalikbevieh V.N. localization and some properties of d2 polymerization site complementary to Gly-Hls-Arg-Pro(E2) site of bovine fibrinogen - Thrombos. Uaemost. - 1989 - 62 -N1 - p. 177.

J