Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение моноклональных антител и изучение структурно-функциональных свойств энтеротоксина В St. aureus

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение моноклональных антител и изучение структурно-функциональных свойств энтеротоксина В St. aureus"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ

На правах рукописи

УДК 615.357.37.

ШЕМЧУКОВА Ольга Борисовна

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ И ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ЭНТЕРОТОКСИНА В 51.аигеи8

03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва — 1993

Работа выполнена во Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения.

Научные руководители: кандидат физико-математических наук П. Г. Свешников, кандидат химических наук В. Ю. Алахов.

Официальные оппоненты: доктор химических наук С. Н. Кочетков, доктор химических наук Л. В. Козлов.

Ведущая организация — ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Защита диссертации состоится « » 1993 г.

в часов на заседании Специализированного Ученого совета Д074.51.01 при Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения (113149, Москва, Симферопольский бульвар,8).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНЦ МДЛ.

Автореферат разослан < » 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета,

кандидат биологических наук В. В. Отраднова

0Б1АЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕНЫ. Стафилококковые энтеротоксины (БЕ) являются наиболее сильными природными Т-клеточныяи митогенами и способны индуцировать пролиферацию Т-лимФоцитов в концентрации 10<-9)Н и ниже. Эти токсины названы "суперантигенами" потому, что активируют не 0,01Х Т-клеток, как обычные антнгены, а 20-ЗОХ. Т-хелперы, являющиеся мишенью для БЕ. выделяют цитокины, которые активируют цитотоксические лимфоциты, избирательно убиваювие клетки, связанные с токсином. Ответ Т-клеток на БЕ требует присутствия антиген-презентирующих клеток, которые экспрессируют молекулы ННС класса II. !ЗЕ прямо связываются с ними, и этот комплекс узнается Т-клеточным рецептором, имеющим в своем составе определенные У-бета последовательности. Известно, что БЕ не требуют процессинга. Существует множество работ, посвященных изучению сайтов связывания для БЕ на У-бета домене.

В настоящее время многие исследователи занимаются изучением возможной роли суперантигепов в индукции аутоиммунных заболеваний. В организме суперантигены производят быструю экспансию и последующее уменьшение пула ЭЕ-активированных Т-клеток. Посла уничтожения большого числа Т-клеточных популяций определение и элиминирование раковых клеток механизмами иммунного надзора будет сильно затруднено.

Новые надежды связаны с использованием БЕ в качестве иммуномодуляторов. Селектированные ЗЕ могут оказывать воздействие на нежелательные Т-клеточные популяции и заглушить аутоиммунную атаку на нормальные ткани. Эксперименты на мышах с энтеротоксином В показали, что его введение позволяет завитить животных от развития аутоиммунных заболеваний или снизить их остроту. Это наводит на мысль, что можно спроектировать рекомбинантные суперантигены, подбирая фрагменты с определенными свойствами. Поэтому является актуальным установление взаимосвязи между структурными особенностями БЕ и их Функциональными характеристиками.

Ноноклональные антитела - весьма удобный инструмент для решения вышеуказанной задачи. Они позволяют идентифицировать эпитоп, с которым специфически связываются. Сопоставление биологических эффектов моноклональных антител с ^ их специфичностью к определенным антигенным детерминантам позволяет охарактеризовать функцию эпитопа.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью кастоявей работы было выявление на молекуле энтеротоксина В участков, отвечающих за иммуномодуляторные Функции, с использованием различных подходов, включая как выявление Функционально-активных Фрагментов токсина, образующихся в результате действия эндогенных протеаэ, так и исследование влияния монок,лональнЫх антител к определенным эпитопам на иитогеиную активность токсина.

В соответствии с зтим в план работы входило' 1) выделение Фрагментов токсина; 2) локализация Фрагментов на полипептидной цепи токсина; 3) исследование митогенной активности Фрагментов на культуре мононуклеарных лейкоцитов периферической крови! 4) получение моноклональных антител к энтеротоксину В; 5) локализация их антигенных детерминант на молекуле токсина! 6) исследование биологического действия антител на культурах клеток.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Определена локализация на молекуле токсина фрагментов, обраэуюяихся в результате действия эндогенных протеаэ. Впервые выделен Фрагмент энтеротоксина В, являющийся сильным стимулятором человеческих мононуклеаров. Впервые получены и охарактеризованы ноноклональные антитела к N-концевому участку токсина, точно определена их зпитопная специфичность. Эти антитела применялись для идентификации в иммуноблоттинге рекомбинантного энтеротоксина В и определения его суммарного выхода с помощью dot-ELIZA. В дальнейшем ноноклональные антитела могут быть применены для аффинной очистки рекомбинантных пептидов на основе энтеротоксина В St.aureus,

которые предполагается использовать в качестве

иммуномодул яторов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты работы были доложены на семинаре департамента биотехнологии BHU молекулярной диагностики и лечения (1993). По материалам диссертации опубликованы 2 печатные работы.

СТРУКТУРА И ОБЬЕН РАБОТЫ. Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, описание материалов' и методов, результаты и обсуждение, выводы и список литературы, изложена на страницах машинописного текста и

включает 9 рисунков и 4 таблицы.

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ. SEB - стафилококковый знтеротоксин В; НоАТ - моноклональные антитела; НЛПК - мононуклеарные лейкоциты периферической крови человека.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ НАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Выделение Фрагментов SEB и исследование их свойств.

Процедура очистки SEB иэ культуральной жидкости штампа FRI722(H> S. aureus включала хроматографию на Bio-Rex-70 (Bio-Sad), КН-целлвлозе (Uhatman) и ВЭКХ на иирокопористой обращенной Фазе Ultrapore Св. По данным 12,5% ПААГ-SDS, на заключительной стадии был получен гомогенный препарат SEB. Когда хроматография на Bio-Rex-70 проводилась при комнатной температуре, был получен препарат SEB, расщепленного в области цистеиновой петли. Она была восстановлена при обработке ЮОмН дитиотреитолом за 2ч при комнатной температуре.

Гель-алектрофорее проводился no Laemuli(1970) в 12, 5Х ПААГ-SDS с применением следующих белков-маркеров: альфа-лактальбумин (14,4 kDa), ингибитор трипсина (20,1 kDa), карбоангидраэа (30 kDa) (Pharaacia). Гель окрашивался Кумасси бриллиантовым голубым R 250.

Фрагменты SEB были выделены посредством ВЭЖХ на вирокопористой обращенной Фазе Bakerbond WPC18 в О,IX ТФУ.

Злюция производилась с использованием линейного градиента аиетонитрила от О до 75%.

N-концевые -аминокислотные последовательности Фрагментов SEB были определены посредством автоматической деградации по Эдману на секвенаторе типа 477А (Applied Biosystem) с.н.с. отдела биомембран ВНЦ ЦДЛ Колосовым Н.И.

НЛПК выселялись по методу Boyum (1968) на градиенте фиколла (Pharmacia) и вносились в 96-луночные планшеты для тканевых культур в концентрации 10(6) кл/мл в среде RPMI 1640 с 10% Фетальной сыворотки. Клетки культивировались с SEB и его фрагментами в течение 72ч. Пролиферация измерялась по включению ,Н-тимидина в ДНК клеток. *Н-тимидин использовался в конечной концентрации 1 mkCí/ил.

Получение и характеризация НоАТ к SEB.

Для получения гибридом, продуцирующих НоАТ к SEB, мыии линии BALB/c были дважды иммунизированы в подушечки лапок SEB (50 мкг/мышь), инактивированным кипячением течение 30 мин. Гибридомы были получены при слиянии лимфоцитов от подколенных лимфоузлов с миеломой линии X63-Ag8-653 в присутствии полиэтиленгликоля 4000 IHerk) во Galtre (1977). Гибридомы были клонированы дважды методом лимитирующих разведений в DMEH с 15% фетальной сыворотки, 5% кондиционированной макрофагами среды, антибиотиками и 2 мМ L-глютамином. Скрининг гибридом производился посредством ELIZA в 96-луночных планветах для микротитровання с использованием полученного SEB и пероксидаэного конъюгата анти-мышиных IgG, истопенных на сыворотке кролика.

НоАТ были очищены из асцитной жидкости преципитацией сульфатом аммония с последующей иммуноаФФинной хроматографией на SEB-CNBr-сефароэе (Schneider, 1982).

Определение специфичности НоАТ к фрагментам SEB проводилось с помощью иммуноблоттинга (Kenner, 1988). Эпитопная специфичность НоАТ S5 была определена Dr. Sara Rothman (Walter Reed Army Institute of Research, Washington, DC) путем ELIZA с

использованием 8-членных твердофазным методом.

5 ' пептидов

SEB,

сии тезированных

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение фрагментое SH3.

Нами установлено, что в процессе выделения SEB подвергается ограниченному прогеолиэу. Для исследования биологического действия Фрагментов, образующихся при расщеплении токсина, мы предприняли попытку выделить эти Фрагменты, локализовать их на полнпептидной цепи токсина и провести определение их активности.

Как показано на рис. 1, в отсутствие восстанавливающего агента SDS-электрофореэ выявляет только одну полосу в препарате токсина, соответствующую 28кДа. Восстановление SEB

дитиотреитолом приводит к появлению трех добавочных полос с молекулярной массой 17, 16 и И кДа.

Фрагменты, образующиеся после восстановления SEB, были выделены при помощи ВЭЖХ на широкопористой обращенной фазе Bakerbond UPC 18 (рис.2а). Препарат токсина наносился на колонку и разделялся в О,IX ТФУ при линейном градиенте концентраций ацетонитрила от О до 75Х. Анализ полученных фракций путем SDS-электрофореэа (рис.26) показывает, что фракция 1 содержит 11-кДа пептид. Фракция 2 - целый энтеротоксмн, и фракция 3 - смесь 16-кДа и 17-кДа фрагментов с преобладанием 16-кДа Фрагмента. Стафилококковые энтеротоксины устойчивы к действию протеаэ, но в цистеиновой петле, локализованной в центральной части полипептидной цепи, находится регион, чувствительный к протеолиэу. В частности, обработка нативного SEB ведет к его расщеплению по Lys97-Thr98. SEC1 также подвергается ограниченному протеолиэу под действием трипсина и расщепляется в области цистеиновой петли (Schmidt, 1983). SEA более устойчив к действию трипсина, но расщепляется папаином с образованием пептидов, которые могут быть выделены только после восстановления S-S связи (Ezepchuk, 1985). Не раз сообщалось.

ЗОкДа

20к Да

14кЛа

а О

Рис.1. Электрофорез препарата SEB в 12,5Х ПААГ-SDS. (a) SEB, восстановленный литиотреитолом эа 2ч при копнатной температуре; (б) SEB, не обработанный восстанавливающим агентом.

что препараты токсинов содержат некоторое количество расщепленного контаминируюоими протеаэами материала, который сходен по молекулярной массе с Фрагментами токсинов, получаемыми при гидролизе трипсином (Spero, 1973; Thompson,1964).

Можно заключить, что SEB расщепляется по крайней мере в двух сайтах, лежащих в области цистеиновой петли, что подтверждается числом фрагментов. Образование фрагментов SEB, показанных на рис. 1, вызвано действием контаминируппих протеаэ, выделяющихся- вместе с токсином. Этот результат также ;• поддерживает заключение, что область цистеиновой петли наиболее чувствительна • к протеолиэу. Известно, что этот регион характеризуется наибольшей степенью структурного сходства у всех стафилококковых энтеротоксинов (Вау1ез, 1989).

время (пин)

б - -

ЗОкДа

20к Да

И.Я1МП 14к Да

1 2 3

Рис.2. Выделение фрагментов, образующихся при восстановлении БЕВ, при помощи ВЭЖХ на ■ирокопористой обращенной Фазе (а) и анализ полученных фрагментов посредством

электрофореза в 12,5* ПААГ-ЭСЭ.

Локализация Фрагментов SEB в первичной структуре молекулы.

В табл. 1 приведена аминокислотная последовательность пептидов, полученных при Фрагментации токсина. 11-кДа пептид во Фракции 1 соответствует N-концевому участку SEB. В препарате также содержится примесь пептида с последовательностью, начинающейся со второго аминокислотного остатка SEB. Следовательно, частичная деградация, при которой образуются 11-кДа, 16-кДа и 17-кДа пептиды, сопровождается отщеплением N-концевого Glu. Данные, изображенные на рис.2а, и результаты определения N-концевой аминокислотной последовательности Фракции 2 показывают, что этот препарат содержит гомогенный нерасцепленный SEB.

Во Фракции 3 присутствуют 16 и 17-кДа пептиды (рис.26). Существенное различие ч содержании этих пептидов в препарате позволило нам определить их N-концевые последовательности (табл.1). Путем сравнения этих последовательностей с первичной структурой SEB (рис.3) пы смогли локализовать 11-кДа, 16-кДа и 17-кДа пептиды на полипептидной цепи токсина и идентифицировать сайты протеолиэа.

Как показано на рис.3, SEB расщепляется по Азп100-Аар101 и Gin106-Thr107, что приводит к образованию N-концевого Фрагмента с молекулярной массой около 11 кДа и двух С-концевых пептидов с Мм 16 и 17 кДа. Обнаружение только одного N-концевого Фрагмента может объясняться тем, что Фрагменты 1-100 и 1-106 не могут быть разделены примененными нами методами, или, вероятнее всего,'фрагмент 1-106 нестабилен о участке 100106 и деградирует до Фрагмента 1-100. ' Нужно заметить, что SEB расщепляется с образованием фрагментов, которые имеют С-концевой Gin и Asn. Возможно, это обусловлено действием стафилококковой глютаминовой протеаэы (Houmard, 1972), которая может присутствовать в препарате SEB как эндогенный контаминант, что подтверждаетсч также отщеплением N-концевого Glu, происходящим при образовании 11-кДа пептида.

Номера Фракций 1 2 3

Аминокис- С1и Бег 01 и ТЬг Азр

лотные Эег С 1п Бег Азр Не

последова- С1 п Рго й 1 п Ьуг Азп

тельности Рго Аэр Рго Аг§ Эег

Азр Рго Азр Ьуз Н13

Рго Ьуэ Рго ТЬг в1п

Ьуя Рго Ьуг СуБ ТЫ

Рго Азр Рго Мег Азр

Азр С1и Азр Туг Ьуз

С1 и Ьеи С 1 и С 1 у Аг §

Ьеи Н1З Ьеи Й1у Ьуг

Н15 Ьуэ Н1 з Уа 1 ТЬг

Ьуз Эег Ьуз ТЬг Суз

Эег Бег Зег С1и Туг

Эег 1.уз Зег Шг Туг

Содержание пептида во Фрахции (X) 82 18 100 72 28

Табл.1. Ы-концевые аминокислотные последовательности ЭЕВ и его фрагментов. Номера Фракций

соответствуют указанным на рис.2а.

11-кДа

N

Е-3-(5-Р-1>-Р-К-Р-0-Е-1,-Н-К-3-3-. . .

17-кДа _I_

93 100

...-С-С-У-Р-З-К-К-Т-О-

101

106 107

16 - к Да 113 С

и.

Р-1-М-З-Н-С{-Т-Р-К-К-К-Т-С-Н-У-О-С-У-Т-С-Н-...'| -'

Рис.3. Локализация фрагментов ЭЕВ на полипептидной цепи токсина.

Таким образом, с точки зрения структурной организации, молекула БЕВ может быть представлена как два домена, образованные М- и С-кониевыми регионами токсина, соединеннымй цистеиновой петлей, хоторая содержит участок, чувствительный к протеолиэу.

Функциональные свойства Фрагментов БЕВ.

Молекулы МНС класса II могут высокоаффинно связывать стафилококковые энтеротоксины с последующей презентацией V бета-домену Т-клеточного рецептора. Это приводит к активации пролиферации Т-клеток. На рис.4 показано, что нативный БЕВ и БЕВ, расщепленный в области цистеиновой петли проявляют практически одинаковую митогенную активность по отношению к мононуклеарным клеткам человека. Ы-концевой 11-кДа пептид также активирует пролиферацию, хотя и в меньшей степени. Влияние С-концевого 16-кДа пептида на пролиферацию незначительно. Слабый

Включение

3Н-тииидина (имп./мин10(3)

10

-11

-10

-9

1§Спепт.3(Н)

Рис.4. Зависимость скорости включения Н-тимидина в ДНК человеческих мононуклеаров от концентрации нативного ( О ) и восстановленного ( О ) ЗЕВ, 11-кДа ( Л ) и 16-кДа ( • ) пептидов.

митогенный эффект, наблюдаемый при высокой концентрации этого Фрагмента, очевидно, ' обусловлен присутствием в препарате 16-кДа пептида примеси SEB ( не более 1% ), не определяемой SDS-электрофореэом и аминокислотным анализом.

Тахим образом, можно заключить, что область, отвечающая за митогенный эффект токсина и, следовательно, эа его взаимодействие с молекулами МНС класса II и с Т-клеточным рецептором, расположена в N-концевой части молекулы.

В литературе, посвященной изучению доменной специфичности стафилококковых энтеротоксинов, встречаются противоречивые данные об участках, отвечающих эа их пролифератнвное действие. В работе Fraser (1989) показано, что расщепление SEA бромцианои в области S—S петли по Неt107-Thr103 значительно снижает его митогенную активность. Состав продуктов расщепления е этой работе не анализировался. Отличие этих результатов от полученных нами может объясняться тем, что рецептор-уэнающие участки SEA и SЕВ расположены в разных частях токсина, и в случае SEA цистеиновая петля включается во взаимодействие, или же обработка бромцианом приводит к модификации N-кониевой части токсина и, следовательно, к ее инактивации.

Более ранние исследования по влиянию ферментативного гидролиза на функции SEA, SEB и SEC1 ( имеющего высокую степень гомологии с SEB ) позволили предположить, что N-концевая область токсинов связана с их митогенным действием, а С-концевая - с токсическим (Spero, 1978; Noskova, 1984). К примеру, в работе Spero (1978) показано, что N-концевой 6,5-кДа Фрагмент SEC 1 обладает митогенными свойствами, в то время как С-концевой остаток молекулы с молекулярной массой 19-кДа отвечает эа токсическое действие. Однако Bohach (19891 заключает, что первые 59 аминокислотных остатков не требуются для осуществления митогенной Функции SEC1, а С-концевой пептид, содержащий 180 аминокислотных остатков, запускает пролиферацию Т-лимФоцитов. Нужно заметить, что сапа но себе обработка трипсином, примененная в этих опытах, снижает биологическую

активность SEC 1 по сравнению с нативным, а различное содержание примеси интактного токсина во фракциях ' может привести к ошибочной интерпретации результатов.

. Hedlund (1991) с применением рекомбинантных фрагментов SEA показал, что С-концевой фрагмент 107-233 связывается с МНС II-несущими человеческими клетками, но не активирует Т-клетки. Pontzor (1989, 1991) при помЬпи синтетических пептидов идентифицировал участок SEA, важный для стимуляции пролиферации и индукции II.-1 и IFN гамма. N-концевой пептид 1-27, но не 2845, нейтрализовал иитогенную активность SEA на НЛПК. Эффект был специфическим, так как пептид 1-27 не ингибировал индукцию пролиферации под действием ФГА. Этот пептид также конкурировал с нативным SEA за связывание с ННС II-несущими клетками.

Б работе Grossman (1991), с использованием рекомбинантных токсинов на основе SEA с заменами в области цистеиновой петли и Фланкирующих участках, было показано, что этот регион не участвует в узнавании V-бета последовательностей Т-клеточного рецептора и, скорее всего, его структура важна для стабилизации молекулы и влияет на авидность токсина для этого рецептора.

Химерный и сайт-направленный мутагенез не прямо идентифицирует сайты связывания для Функциональных областей молекулы, так как изменения в одной области могут влиять на конформацию других участков, расположенных на расстоянии от измененных. Исследование Функции того или иного участка на основе конкурентного анализа требует экстремально высоких концентраций пептида по сравнению с нативным белком. В работах Pontzer (1989, 1991) и .Hedlund (1991), не обнаружившего пролиФеративного эффекта рекомбинантных Фрагментов SEA 1-125 и 126-233, использовались концентрации пептидов, в 600-1000 раз превышающие те, в которых активен интактный токсин. Тем не менее получанные данные говорят о том, что на молекуле токсина существует несколько участков связывания с молекулами МНС класса II и, возможно, с рецептором Т-клеток. Пролнферативное действие нашего 11-кДа пептида но отношению к НЛПК может быть

обусловлено сохранение« части сайтов, достаточных для обеспечения взаимодействия как с молекулами МНС класса II, так и с Т-клеточным рецептором.

Изучение свойств МоАТ к SEB.

Нами была получена панель МоАТ к энтероюксину В. Пять МоАТ были протестированы на их способность нейтрализовать митогенный эффект токсина. Преципитироианные сульфатом аммония иэ асцитной жидкости антитела преинкубироваяись с токсином в течение часа и затем вносились в культуру МЛПК. Только одни иэ МоАТ, обозначенные S5, были способны нейтрализовать действие токсина на клетки (табл.2).

На рис.5 приведены результаты иммуноОлоттинга, иллюстрирующие специфичность МоАТ S5 в отношении Фрагментов SEB. Представленные данные ясно показывают, что эти антитела взаимодействуют с 11-кДа N-концевым Фрагментом SEB. Другие антитела, использованные в пролиФеративном тесте, не связывались в иммуноблоттинге ни с SEB, ни с его Фрагментами. Вероятно, их антигенные детерминанты разрушаются в условиях ПААГ-SDS.

Для более точного определения эпитопной специфичности HoAT S5 были исследованы методом ELIZA с синтетическими пептидами, перекрывающими всю аминокислотную последовательность токсина "скользящей восьмеркой". Только пептиды 8(8-15) н 9П0-16) связываются с МоАТ S5, определяя таким образом положение эпитопа.

Наши данные позволили идентифицировать один иэ эпитопое! молекулы SEB, расположенный на N-конце и ответственный за пролиФеративный эффект токсина, хотя не установлено, блокируют ли МоАТ S5 связывание SEB с молекулами МНС класса II или с T- . клеточным рецептором.

Известно, что поликлональнне антитела се яэиваюгся, как правило, с интактными токсинами или с С-концевып участком молекулы (Spero, 1973). В работах, посвященных изучению влиянии

Компоненты Включение ^-тимидина (инп./мин)

1,3 10(-9)Н 1,3 10(-10)Н 1,3 10(-11)Н

НоАТ НоАТ НоАТ

Б1+БЕВ 12670+607 10123+913 11016+723

Б2+БЕВ 11944+1454 12560+776 11114+1008

Б10+БЕВ 9188+992 9752+752 12258+840

Б13+БЕВ 10135+695 13016+849 11625+443

Б5+БЕВ; 223+22 6865+443 10965+821

БЕВ 11620+963

контроль 249+37

Табл.2. Влияние НоАТ Б5 на БЕВ( Ю(-Ю)Н) к активации НЛПК.

способность

ЗОкДа

—— —.

,20кДа

14кДа в=а

—"

Рис.5. Результаты имнуноблоттинга препарата восстановленного БЕВ с НоАТ 35 (а) и анализа восстановленного ЭЕВ в 12,5Х ПААГ-ЗЬЭ <б).

Включение Н-тимидина (имп./мин ) X 10(3) 0 1 2 3 4 5 25

S5 контроль

Рис.6.Подавление пролиФеративного ответа НЛПК на стафилококковые энтеротоксины (10< — 10)Н), ФГА (Юмкг/ил), и СопА (10мкг/мл> моноклональными антителами S5 (10(-9)Н)... SEB* выделен от щтамма FRI7221H) S. aureus.

SEA SEB SEC 1 SEC2 SED' SEE ФГА ConA

2 100 7 76 29 0 0 0

Табл.3. Кроссрвактивность MoAT S5 со стафилококковыми энтеротоксинами (Serva), ФГА и СопА в ELIZA (X).

Клетки Нитоген Включение 'н-тииидина Ингибирование

(имп./мин)X 10(3) X

-НоАТ S5 +MoATS5

Jurkat 4237+68 983+138 77

НЛПК

1 донор 455+38 600+46 0

2 донор 790+82 648+57 0

1 донор ФГА 5436+320 2966+131 45

2 донор 14349+549 1569+198 89

1 донор. СопА 12419+668 1375+117 89

2 донор' 19651+732 1117+130 94

Табл.4. Действие ИоАТ S5 (10(-9)М) на пролиферацию .клеток Jurkat и HЛПК, лрестимулированных ФГА (Юмкг/ил) и СопА •( Юпкг/ил ).

моноклональных антител на пролиферацию Т-линФоцитов, также использовались антитела, специфичные к С-концевону участку молекулы или к целому токсину, и исследователями был сделан вывод о неиммуногенности М-концевого участка (Thoapson, 1984! Lin, 1988). Полученные ими НоАТ, преципитированные из асцнтной жидкости сульфатом аммония, подавляли митогенный эффект токсинов, будучи взяты в концентрациях, в 100-1000 раэ превышающих те, которые использовались в навих опытах.

Несмотря на то, что антигенная детерминанта НоАТ S5 была определена однозначно, мы исследовали их реактивность по отновению к другим типам стафилококковых энтеротоксинов, а также к СопА и ФГА в ELIZA (табл.3). Для того, чтобы убедиться, что ингибируювее действие антител является специфическим, НоАТ S5 были выделены иэ IgG-Фракции путем хроматографии на CNBr-

сефарозе с иммобилизованным ЗЕВ. Как оказалось, они были

способны ингибировать пролиферацию Н/1ПК, вызванную другими типами стафилококковых энтеротоксинов, а также митогенами СопА и ФГА (рис.6). Кроме того, эти антитела подавляли пролиферацию человеческой Т-лимфомы линии .Лдгкаг и КЛПК, престимулированних ФГА и СопА в течение 48 часов (табл.4).

Исходя из этих данных, мы предположили, что НоАТ 55 могут связываться с секретируемыми культурой МЛПК Факторами или кросс-реактивными БЕВ мембранными белками Т-лимФоцитов, обладающими способностью регулировать их пролиферацию.

ВЫВОДЫ.

1.Выделены Фрагменты стафилококкового энтеротоксина В, образующиеся в результате действия эндогенных лротеаэ, определена Л-концевая аминокислотная последовательность этих Фрагментов и их расположение на полипептидной цепи токсина.

2.Показано, что митогенная активность стафилококкового энтеротоксина В обусловлена его Ы-концевым доменом, содержащим участки, включающиеся во взаимодействие с МНС Н-несущими клетками и Т-лимфоцитами.

3.Получены и охарактеризованы моноклональяме антитела к ЭЕВ, определена локализация их антигенных детерминант на молекуле токсина.

4.Показано ингибирующее влияние НоАТ Э5 на питогенную активность стафилококкового энтеротоксина В в отношении мопонуклеарных клеток человека.

5.Выдвинуто предположение о том, что подавление пролиферации человеческих Т-лиифоцитов МоАТ Б5 может определяться существованием регулирующего пролиферацию белка, кросс-реактивного БЕВ.

Основные результаты диссертации изложены в следующих * печатных работах:

1.V.Yu.Alakhov, Е. Yu.Klinsky, H.I.Kolosov, I.Haurer-Fogy, E.Yu.Moskaleva, P.C.Sveshnlkov, L.P. Pozdnyakova, 0.B.Shenchukova, E.S.Severin. "Identifikation of funktionally active fragments of staphylococcal enterotoxin B." - Eur. J. Blochen., 1992, v.209, p.823-828.

2.К.Б.Игнатов, Л.Г.Чистякова, О.В.Шемчукова, С.Б.Городецкая, В.И.Киселев. "Клонирование гена эитеротоксииа В Staphylococcus aureus методом полимераэной цепной реакции и его экспрессия в клетках Esherlchia coli.*'- Биоорганическая химия, 1993, т. 19', N1, с.75-80.