Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование процесса самосборки фибрина на модельных системах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование процесса самосборки фибрина на модельных системах"

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ни. А.В.НАЛЛАД1ША

На правах рукописи

ВЕКЛИЧ ЮрпИ Иванович

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА САМОСБОРКИ ФИБРИНА НА МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ

(03.00.04 - биохимия.

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание учётов степени кандидата биологических наук

КИЕВ - 1991

Работа выполнена в Институте биохимии им. Л. В. Палладнпа АН Украины

Научный руководитель:

кандидат биологических паук МЕДВЕДЬ Л. В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук КИБИРЕВ В. К.

докюр медицинских наук, СКИБО Г. Г.

Ведущая организация:

Институт химической физики АН СССР

Защита состоится " ноября 1991 юда е час. на заседании

Специализированного совета К.016.07.01 n llnciinyie биохимии им. А .В.Палладнпа АН Украины ( 252030 г. Киев, ул. Леотопича, 9)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ипсти гута

Автореферат разослан

октября 1991i ода

Учёный секретарь iç> .

Специализированного совета КИРСЕНКО О. В.

Û

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Акту^ьность проблемы, редок фибриноген является основным компонентом системы свертывания кропи. При поврежденной кровеносных сосудов генерируемы!} в песте повреждения рротеолИтический фермент тромбин превращает фибриноген в активную форму - мономерный фибрин. Последний способен спонтанно полимернзойаться с образованием фибриновой сети - основы кровяного сгустка. Система свертывания крови, несмотря на сложность и мнотокомпопентпость, функционирует чрезвычайно эффективно, обеспечивая поддержание гемостаза. Однако, йри различных патологических состояниях свертывание крови Може1* нарушаться, что приводит к образованию внутрисосудистых тромбов или к обильным кровотечениям. Для борьбы с этими явлениями необходимо знать тонкие молекулярные механизмы формирования фибриновой сети. Изучение самосборки фибрина представляет' также большой теоретический интерес, так как этот процесс яляется сравнительно простой моделью для выяснений механизмов формирования специализированных надмолекулярных структур.

Несмотря на большое количество данных по различным биохимическим аспектам формирования фибрннового сгустка, многие структурно-функциональные вопросы этого сложного процесса все еще остаются без ответа. Так, до сих пор не выяснена тонкая структурная организация промежуточных продуктов полимеризации фибрина - протофибрилл. До конца не ясна роль центров полимеризацйи {Е2), активируемых при отщеплении фибрин опептидов В. Противоречивы литературные данные о механизмах образования ранних олигомероа фибрина. Наконец, Неоднозначно оценивается роль в процессе самосборки С-кшЩеых уЧаЬткбв Аа-цепей фибриногена.

Противоречивость результатов, полученных в разных лабораториях при изучении самосборки фибрина, Может быть отчасти объяснена тем, что большинство этих исследований проведено На систеМе фибриноген + Тромбин. Поскольку и активация фибриногена +ромбпноМ, и сг&Дйй самосборки фибрина не яляются дискретными процессами, а в •пачительной степени перекрывают друг друга, это усложняет их изучение и затрудняет интерпретацию и сопоставлений результатов, полученных в различных экспериментальных условиях. Использование препаратов актированных форм фибриногена и его фрагментов (модельных систем) позволяет изучать процесс самосборки фибрийа без еГо фермента-ЫвноЙ фазЫ.

В связи с вышеизложенным и возникла необходимость в исследовании процесса самосборки фибрина На моделыЫх системах с привлечение^ современных методов электронной микроскЬНйи й сочетаний с различными биохимическими подходами.

Целью работы явилось Изучение на модельных сйстемых различных этапов процесса самосборки фибрина И роли его отдельных Иен+ров полимеризации в этом процессе. При йьнюлнейии |зЯботы КеобходНмЬ было решить следующие задачи:

- изучить процесс формирований й топку к( структуру ранних продуктов

полимеризаций мошмермго фибрина; ' • - исследовать на модельных системах роль Ез-Цейтров фибрина Ь процессе его самосборки; , ' •:«• • '

получить экспериментальные доказательства Предложенного ранее механизма участия аС-Доменов молекул фибрина в процессе его самосборки;

- на модельной системе изучить влияние аС-доменов фибрина на процесс петвлеНия фибрИлл,

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований впервые показано,что длинные индивидуальные протофибриллы фибрина имеют твистирующую структуру, предсказанную теоретически ранее. Показано, что процесс bôpaïoBatMjt Олигомеров фибрина на ранних стадиях самосборки носит упорядоченный характер, который определяется не разной скоростью отщепления фйбршюпептидов А, как было Предложено ранее, а другими механизмами. Установлено, что задержка в активации Ej-ueiiTpoe необходима для того, чтобы изменения, происходящие в молекуле фибрина при отщеплении фнбрипопептидов В, Проявлялись больше на стадии латеральной агрегации, чем ttd ранйих этапах самосборки фибрина. Впервые получены данные, эксперймейФаДый) подтверждающие существование взаимодействия между аС-домеиами, возможность их внутримолекулярной ассоциации/ диссоциации и образования межмолекулярных аС-аС конт актов. Доказано, что аС-домеИы не определяют Процесс ветвления фибрилл, но их частичное или полное отсутствие, приводит к увеличению толщины фибрилл, формирующих ГЕЛЬ.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты углубляют представления о молекулярных механизмах самосборки фибрина и могут быть использованы при построении модели процесса самосборки фибрина на молекулярном уровне.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на VIII Всесоюзной конференции по электронной микроскопии (Звенигород, 1988), lia XIII Конгрессе Международного общества по тромбозам и гемостазу (Амстердам, 1991), на Научных семинарах отдела структуры и функций белка Института биохимии им. А.В.Палладина АН Украины и лаборатории д-ра Дж. Вайзеля (Филадельфия, 1991). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста и состоит из введения, двух глав обзора литературы, описания методов исследования, трех глав экспериментальных исследовании И их обсуждения, заключения, выводов. Список литературы содержит 172 источника. В диссертации 1 таблица и 20 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Фибриноген получали из- плазмы крови крупного рогатого скота высаливанием сульфатом натрия (Варецкая, I960).

X) и Х^-фрагменты- фибриногена были получены научным со г рудником отдела структуры и функции белка Института биохимии АН Украины Горку ном О.В..

Фибрин-мономер desAABB. X, И Х2-моиомеры получали обработкой фибриногена и Х-фрагментов тромбином с последующим растворением

образовавшегося сгустка в 0,125% уксусной кислоте и реполимеризацией мономеров белка (Belitser et al., 1968; Medved' et al., 1983).

Фибрии-моиомер desAA получали аналогично фибрин-мономеру desAABB, но вместо тромбина был использован анцистрон-Н - тромбинопообный фермент, избирательно отщепляющий фнбринопептиды А, полученный из яда Щитомордника обыкновенного в Институте биохимии АН Украины (Угарова и др., 1989).

Моноклоиальные антитела G-8, связывающиеся с С-концевым участком (150 аминокислотных остатков) Аа-цепи человеческого фибриногена, были любезно предоставлены д-ром Ньювецхаузеном (Нидерланды).

Кривые нарастания мутности при самосборке исследуемых белков регистрировали на спектрофотометрах "Specord M 40" ("Карл Цейс, Йена", ГДР) и "Lambda 4" ("Perkin Emier",США) при длине dojihü 350 им. Лаг-период (t lag) и максимальную скорость нарастания мутности (Vmax) рассчитывали из кривых изменения мутности, как было описана ранее (Furlan et al., 1981). Временные промежутки 0,3, 0,5, и 0,75 лаг-пёриода были определены как части t lag.

Электронно-микроскопические исследования проводили на микроскопах Н-600 Hitachi (Япония) и Philips 400 (Голландия) (просвечивающая электронная микроскопия) и Amray 1400 (США) или JEOL JSM 35 (Япония) (сканирующая электронная микроскопия). Образцы готовили как описано ранее (Williams 1981, Erickson et al., 1983, Langer et al.,1988).

Измерение длины протофибрилл проводили на электронных микрофотографиях с использованием компьютера Macintosh H (Apple, США) и программы MacMeasure.

Статистическую обработку и графическое представление полученных данных проводили при помощи программы Statvtew (Brainpower, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАННИХ ПРОДУКТОВ

ПОЛИМЕРИЗАЦИИ ФИБРИН-МОНОМЕРОВ des ААВВ и des АА.

Ход процесса полимеризации фибрина может быть охарактеризован по кривым нарастания мутности полимеризующегося белка. Как было показано ранее (Hantgan et al., 1979), такие кривые отражают двустадийность процесса самосборки. Период от начала полимеризации до резкого нарастания светорассеяния соответствует стадии образования протофибрилл. Резкий подъем светорассеяния отражает вторую стадию - латеральную агрегацию протофибрилл в фибриновые- волокна. Латеральная ассоциация протофибрилл сопррвождается формированием из отдельных волокон трехмерной фибриновоИ сети, т.е образованием сгустка фибрина. В качестве характеристики первой стадии полимеризации можно выбрать длительность задержки подъема светорассеивания (лаг-период или t lag), второй стадии -максимальную скорость нарастания мутности (Vmax) и максимально достигаемую мутность (рис.1). Работы Хантгана и сотр. (1980) продемонстрировали, что комбинированное использование в исследованиях процесса . полимеризации фибрина методов светорассеяния и электронной Микроскопии

имеет большие преимущества fio сравнению с другими методами структурных исследований. Метод светорассеяния позволяв* получить усредненную или общую характеристику хода полимеризации, в то время как электродная микроскопии выявляет особенности индивидуальных струк1ур - молекул, Протофибрилл И фибрилл.

Рис. 1 Кривые нарастания мутности при полимеризации fm des ААВВ и fm desAA.Стрелками обозначены точки отбо -ра образцов для электонной микроскопии (0,3, 0,5, и 0,75 t lag). Vmax определяли как tga.

ВРЕМЯ (дан)

Для визуализации ранних продуктов полимеризации мономериого фибрина desAABB lira deSAABB) ti desAA (fm desAA) пробы для электронно-микроскопических НссЛеДоцаНиЙ отбирались во временных промежу тках, составляющих 0,3, 0,5, И 0.1S лаг-яериода полимеризации каждого из препаратов (рис.1). Электронно-Микроскопические картины, полученные во всех этИх временных точках лаЬпериода fm desAABB и fm desAA, полнос тью соответствовали ранее ЬйЛсШЫой схеме полимеризации фибрина при активаций фибриногена ФромЗШШм (фибрин-мономер олигомеры -*■ длинные протьфибрИллы). fl Противовес Недавним данным (Hanziker et al., 1983, 19ЭО) «ЯШМ результаты подтвердили ранее существовавшие представления о том, Что Двунитчатые прбтофибриллы не являются артефактом приготовления образцов для электронно-микроскопических исследований. Однако, при всем сходстве между лротофибриллами, образованными fm desAABB и ftti desAA, были обнаружены и структурные различия между НИМИ. Протофнбриллы, сформированные fm desAABB, в общей массе вы глядели ТшотШ уйакованиымй в отличие от болеее "рыхлых" протофибрилл frrl tlesAA (рис.2). Эти различия В структуре протофибрилл

Рис.2 Схематическая ин терпрет ация наблюдаемой структуры протофибрилл, образующихся при полимеризаций fm des ААВВ (a), fm desAA (б), и при активации фибриногена тромбином (в).

были наиболее очевидными в точке 0,3 лаг-периода полимеризации фибрина и практически исчезали в конце лаг-периода. Полученные в качестве контроля изображения протофибрилл, обраэущихся при активации фибри-

ногена тромбином, были подобны нротофибриллам, сформированным из fm desAA. Это позволило нам сделать вывод о том, что использование в наших экспериментах мономерных препаратов фибрина не является причиной "рыхлой" структуры fm desAA протофибрилл, а обусловлено различной степенью активации молекул фибрина. Этот вывод полностью согласуется с литературными данными (Blombach et al., 1978), свидетельствующими о том, что отщепление фибринопептида А начинается сразу с максимальной скоростью при действии тромбина, в то время как отщепление В-пептида начинается на фоне интенсивной полимеризации. Поэтому в случае активации фибриногена тромбином в самом начале полнмеризациоппого процесса мы имеем по сути дело с тем же fm desAA. Более компактная структура fm desAABB, обнаруженная в наших препаратах, является визуальным подтверждением литературных данных о том, что активация двух пар центров полимеризации фибрина приводит к упрочению и стабилизации протофибрилл (Shatnoff et al., 1983).

При более детальном анализе изображений протофибрилл, образованных фибрнн-мономерами desAABB и desAA, было замечено, что хотя короткие протофибриллы (от 4 до 6 молекул длиной) выглядят как параллельные цепочки, многие из них имеют явные перекресты. Схемы, представленные на рис.3, иллюстрируют интерпретацию двух таких изображений как закручивание двух цепочек вокруг друг друга с образованием твистирующей

Рис 3. Схематическая интерпретация укладки молекул в протофибриллах, ^приводящей к твистировапшо.

протофибриллы. В этой серии экспериментов мы впервые обнаружили,что длинные протофибриллы также имеют твистирующий характер. Эта структурная особенность оказалась характерной для всех препаратов изучаемых фибриноп. Для дальнейшего изучения природы вероятных точек перекреста филаментов п протофибрилле мы идентифицировали 165 таких точек на 45 лучших микрофотографиях протофибрилл. Все точки на этих микрофотографиях были отцифрованы и измеренные плотности в точках перекреста были сопоставлены с плотностями в других точках вдоль протофибриллы. Полученные данные показали, что средняя плотность в точках перекреста в 1,8 раза превышает среднюю плотность в точках соприкосновения цепочек протофибриллы, в которых перекресты отсутствовали. Этот результат свидетельствует о том, что в точках перекреста две молекулы лежат одна на другой, что и приводит к образованию твистирующей, а не просто нерегулярно упакованной протофибриллы. Проведенный дополнительно анализ картин оптической дифракции полученных с элекгроннограмм протофибрилл показал, что расположение рефлексов является характерным для спиралей.

Твистирующая структура фибрилл, формирующих в различных экспериментальных условиях фвбриновый гель, была описана ранее в ряде работ (Mosesson е<: al., 1987, Muller et al., 1984). На основе данных, полученных при изучении твистиига фибрилл, был сделан выво'д о том, что такие фибриллы должны формироваться из твистирующих протофибрилл (Weisel et al., 1987). Однако в работах, в которых были визуализированы

иротофибриллы, их детальная структура или не была описана вовсе, (Fowler et al., 1981), или же tie был четко показан твистирующиИ характер длинных Индивидуальных протофибрилл (Williams, 1981). Полученные нами данные являются первым экспериментальным доказательством выдвинутого рапсе теоретического предположения о твистирующем характере структуры протофибрилл. ' . •

2. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА

ПОЛИМЕРИЗАЦИИ ФИБРИН-МОНОМЕРОВ desAABB и desAA.

При исследовании процесса образования ранних продуктов полимеризации фибрина на электронных микрофотографиях, полученных в различных временных точках лаг-периода, были измерены длины протофибрилл сформированных фибринамн desAA и desAABB, а также протофибрилл, образующихся при активации фибриногена тромбином. Для каждого из образцов во временных промежутках, составляющих 0,3, 0,5 и 0,75 лаг-периода, было подсчитано количество мономеров, димеров и чримеров и . измерена длина протофибрилл. Гистограммы, демонстрирующие распределение размеров проанализированных структур, приведены па рис. 4. Ось X представляет размеры наблюдаемых структур в единицах количества молекул, па оси Y представлено количество молекул, вовлеченных п образование структур (протофибрилл) данного размера. Для корректного сравнения разных препаратов эти величины представлены в процентах от общего Числа молекул в выборке.

10 15 20 25 * J0 "I 5 10 15 20 25 30

А В

Рис 4. Гистограммы распределения размеров структур, образующихся при полимеризации fm des ААВВ (А) и fin desAA (Б) в течении лаг-периода .

Для фибрин-мономера desAABB в начала процесса самосборки, в точке 0,3 (. lag, уменьшение количества протофибрилл с увеличением их длины идет но экспоненте, что характеризует процесс образования протофибрилл как случайную полнкондепсацию, т.е. бимолекулярную реакцию бифункциональных молекул. Ранее такое заключение было сделано на основании данных, полученных при измерении светорассеяния в остановленном потоке в течение первой фазы самосборки фибрина в работе Iiantgan el.al., 1983. Однако в дальнейшем, в точке 0,5 t lag распределение уже не выглядит как случайное: лротофлбриллы размером 8-1] молекул образуют явный пик распределения. Это характеризует процесс образования протофибрилл как упорядоченный, т. е. регулируемый специфическим механизмом. Распределения, полученные для fm desAA в соответствующих точках лаг-периода, также не является случайными и имеют пики для протофибрилл длиной 5-6 мопомеров(0,3 t lag) и 11-13 мономеров(0,5 t lag).

Гистограммы распределения размеров протофибрилл, образующихся при активации фибриногена тромбином (рис.5), находятся посредине между таковыми для fm desAABB и fm desAA. Следует отметить следующие их

35-1

0.5 Над

JlillllillliHuL

Рис 5. Гистограммы распределения размеров структур, образующихся после активации фибриногена тромбином в течении лаг-периода полимеризации .

особенности: в точке 0,3 t lag в препарате содержится значительно больше димеров фибрина, чем при полимеризации мономерных фнбринов, а образующиеся олигомерм имеют меньшую длину. В точке 0,5 t lag распределение размеров протофибрилл наиболее сходно с таковым у fm desAABB. Наблюдаемый в этой точке пик распределения находится в области тех же значений, что и у мономерных фибринов, что также свидетельствует об упорядоченности процесса формирования протофибрилл. Изучая кинетику образования ранних олигомеров в системе фибриноген + тромбин, Дженни и др. (1983) также пришли к заключению, что этот процесс носит упорядоченный характер, однако, по их данным, упорядоченность определяется тем, что два фибрипопептида А отщепляются последовательно, причем скорость отщепления второго выше чем первого. Из наших

•

данных следует, что это объяснение не имеет силы для фибрин-мономеров desAABB и desAA, имеющих симметричные центры связывания.Та-ким образом, полученные нами результаты позволяют сделать заключение о том, что процесс образования протофибрилл является упорядоченным и регулируется сЬецифическими механизмами, отличными от предложенных ранее.

Как было доказано В работе (Hantgan et al„ 1980), длина протофибрилл является той критической величиной, которая определяет начало их латеральной агрегации. Одинаковые границы распределений размеров протофибрилл, сформированных при активации фибриногена тромбином и при полимеризации фибрии-мономеров desAABB и desAA в точке 0,5 t lag, свидетельствуют о Том, Что критическая длина образующихся в этих препаратах протофибрилл одинакова и составляет 9-12 молекул. На основании этого мы Предположили, что изначально активированные Е2-центры fm desAABB проявляются не столько в усилении латеральной агрегации (следствием чего должно быть построение более толстых фибрилл), сколько в ускорении роста протофибрилл в длину на самых ранних этапах полимеризации и упрочении их структуры. Для проверки этого предположения была детально изучена стадия латеральной агрегации протофибрилл.

Кривые нарастания мутности, полученные при продолжительной (в течении 2 часов) полимеризации Исследуемых мопомерных фибрипов (рис.6), подтвердили наше предположение. Хотя значение максимальной скорости

E3S0 0.08

0.07 O.OS . 0.05 0.03 0.02 0 01 0.00

О 40 S0 120

' ВРЕМЯ (МИК)

нарастания мутности у fm desAABB было существенно выше, чем у fm desAA, . мутности сгустков через два часа отличались незначительно. Электронно-микроскопические препараты сгустков, приготовленных из fin desAABB и fm desAA, также не выявили между ними существенных различий. От состояли из сети ветвящихся фибрилл, по своей толщине более тонких, чем те, хоторые образуются при добавлении к фибриногену тромбина и, независимо от количества активированных цен тров, не имели отличий, характерных для сгустков, образованных при действии на фибриноген тромбина и репгилазы (Shen et al., 1977). Единственное

Рчс.6 Кривые нарастания мутности при полимеризации fm des ААВВ, fm desAA. и при добавлении к fm desAA тромбина.

сущесгпенное отличие между ними состояло в том, что только половина фибрилл, образованых Гт ¿еяЛАВВ, обнаруживала поперечную исчерчен-ность; остальные фибриллы были апериодичпы. В противоположность Гт desЛABB-фибpиллaм, все Гт desAЛ-фибpиллы имели четкую поперечную исчерченность, идентичную ранее наблюдаемо!! в сгустках, образованных добавлением тромбина к фибриногену.

Получив таким образом подтверждение нашему наблюдению того, что изначальная активация двух пар центров в молекуле Гт desЛЛBB не приводит к усилению латеральной агрегации фибрилл, т.е. к их утолщению, мы предприняли попытку смоделировать последовательную активацию этих центров в ходе полимеризации фибрина и выяснить, как это отразится на характере образующегося сгустка. С это» целью в заранее выбранные временные промежутки в среду полимеризующегося Гт desAA добавлялся тромбин. Данные, пол ученные методом светорассеяния (рис.6) показали, чго отщепление тромбином фибрннопептидов В у молекул (т desAA в процессе их полимеризации приводит к увеличению скорости латеральной агрегации образуемых ими протофибрилл и к значительному возрастанию мутности сформированног о сгустка. Анализ электронных микрофотографий сгустков, образующихся в этих эспериментальных условиях, подтвердил данные сеторассеяния. Степень латеральной агрегации фибрилл значительно увеличилась и сформированный ими сгусток был практически идентичен описанному ранее грубому сгустку, формирующемуся при активации фибриногена тромбином. Все фибриллы, входящие в состав сгустка, в этом эксперименте имели че ткую периодичность.

Имеющиеся на сегоднешний день литературные данные об участии Ег-центров молекулы фибрина в процессах латеральной агрегации фибрилл весьма противоречивы. С одной стороны, па основании кинетических исследований процесса отщепления тромбином ог фибриногена фибрипопеп гидов А и В в ходе его полимеризации (В1отЬаск е1 а1., 1958), выдвинуто предположение о том, что активация Е2-центров при отщеплении фибринопептидов В вызывает латеральную ассоциацию фибрилл. С другой стороны показано, что активация Е2-центров не является обязательной предпосылкой латеральной ассоциации (Наг^ап е! а1.,1979), а Е2 -взаимодействие лишь усиливает междоменное Д-Е связывание в процессе самосборки фибрина, что проявляется в упрочении структуры протофибрилл (БИаШоН е1 а1., 1983. М1Ьа1у1 е1 а1., 1985). Полученные нами результаты показывают, что в ходе самосборки фибрина Е2 - центры могут проявлять себя на различных стадиях и являются дополнительными центрами, выполняющими регуляторную функцию. Их участие в одном или другом процессе зависит от кинетики их активации. В случае, когда фибри-нопептиды В отщепляются от молекул фибрина, уже входящих в состав протофибрилл (фибрилл), изменения, которые при этом происходят (кон-формациоиные изменения, увеличение связывания ионов Са2+), облегчают латеральную агрегацию между протофибриллами и фибриллами. Если же Е2-це»тры активированы изначально, как у Гт desAABB, то молекулы фибрина агрегируют значительно быстрее, образуя более тонкие фибриллы с невысокой степенью их латеральной ассоциации.

Таким образом можно заключить, что нормальная задержка в активации Е2-центров необходима для того, чтобы изменения, происходящие в

молекуле фибрина при отщеплении фибрииопепгидов В, больше проявлялись на стадии латеральной агрегации, чем на ранних этапах самосборки фибрина. Другими дополнительными центрами полимеризации фибрина, как было предложено ранее (МссЬес!' е1 а!., 1985), могут выступать аС-домены молекулы фибрина. Изучению их роли в процессе самосборки посвящена следующая часть работы.

3. СТРУКТУРНОЕ ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ аС-ДОМЕПОВ ФИБРИНА В ПРОЦЕССЕ ФОРМИРОВАНИЯ СГУСТКА.

Для определения местоположения аС-доменов в составе молекул фибриногена и фибрина методами роторного оттеиешш и негативного контрастирования были получены и проанализированы эллектронные микрофотографии этих молекул в нейтральной (рН 7,4) и кислой (рН 3,5) среде. В качестве контроля были использованы препараты X,- и Х2-мопомеров имеющие в своем составе один аС-домен и лишенные аС-доменов, соответственно. В препарате фибриногена (рН 7,4) были обнаружены типичные трехглобулярные молекулы, подобные описанным ранее . Особое внимание было уделено анализу дополнительных структурных образований в центральной и терминальных областях молекул. В Табл.1 приведены результаты этого анализу Среди проанализированных молекул 9% имели

Таблица 1.

Структура молекул фибриногена, фибрина и Х-мономсров, наблюдаемая при различных экспериментальных условиях

% молекул различной структуры

Препарат Кол-во мол.

фибриноген, pH 7,4 370 84 9 6 1

фибриноген, pH 3,5 383 16 0 30 54

фибрин, pH 3,5 378 13 4 24 59

X,-мономер 250 76 0 24 0

Xj-мопомер 345 100 О 0 0

дополнительную глобулу в центральной части, как было описано ранее (Erickson et al., 1983), представляющую собой структуру, образованную взаимодействующими С-концевыми участками Аа-цспей. В то же время другие 7% обнаруживали более мелкие структуры у одной или обоих концевых глобул молекулы. Однако, 84% молекул не выявляло никакой дополнительной'массы, что соответствует наблюдениям других авторов (Weisel J.W., персональное сообщение). При изучении препаратов человеческого фибриногена, инкубированного с моноклональнымн антителами G8, связывающимися с 150-члениой ампокислотной последовательностью С-клщевой часта Аа-цепи, было обнаружено, что большинство антител связывается с центральным доменом фибриногена.

Некогорые из них находились в соприкосновении с центральной частью молекулы, в то время как другие были расположены на небольшом расстоянии от нее. Это свидетельствует о том, что структуры, образованные С-копцевыми участками Au-цепеИ фибриногена (аС-домены) могут быть либо незначительно удалены, либо связаны с центральным доменом н не выявляться у большинства молекул (84%) в виде дополнительной глобулы у центра.

В препаратах фибриногена при рН 3,5 у 84% молекул были обнаружены небольшие структуры, расположенные па концах терминальных глобул (в 30% одна, 54% - две). Аналогичные результаты были получены и при изучении электронно-микроскопических препаратов фибрин-мономера (рП 3,5): 83% молекул фибрина имели одну (24%) или две (59%) небольшие структуры у терминальных глобул, 4% молекул имели одну крупную дополнительную глобулу в центральной области, и 13% молекул не выявляло дополнительных структур. В отличие от фибриногена и фибрин-мономера, в препарате Х2-мопомера île было обнаружено никаких дополнительных структурных образований, в то время как 24% молекул Х,-мономера имели в своем составе одну небольшую дополнительную структуру.

Оценка размеров выявленных структур позволяет -заключить, что они образованы разделением одиночной дополнительной глобулы, расположенной в центральной Иасти молекул фибриногена при нейтральном рН (ассоциированных аС-доменов), на две меньшие индивидуальные структуры в терминальных областях фибрина и фибриногена при кислом рН (диссоциированных аС-доменов). Кроме того, в препарате фибрина при рН 7,4 были визуализированы молекулы, взаимодействующие через аС-домепы. В этих случаях молекулы располагались вблизи друг друга, но не находились в контакте, как это было в случае их взаимодействия через комплементарные центры связывания. •

Таким образом, в результате проведенной работы нами впервые были визуализированы разомкнутые и взаимодействующие аС-домены в составе молекул фибрина/фибриногена при кислом и нейтральном рН раствора. При кислом рН аС-домены выявляются преимущественно как свободно плавающие глобулярные домеиы в препаратах и фибриногена, и фибрина (рис.7). При нейтральном рН они взаимодействуют друг с другом. В препара-

Рис.7 Схематическая интерпретация расположения «С-доме-нов в молекулах фибриногена (Fg) и фибрина (fm) при изменении рН среды и при активации фибриногена тромбином (Thr), а также m отщепление плазмнном (Рш) при образовании X,- и Х2-мономеров (Х,т и Х2ш).

тах фибриногена (pH 7,4) большинство из них также, по-видимому, ассоциированы с центральной глобулой. В некоторых случаях наблюдается взаимодействие аС-домеиов разных молекул фибрина. На основании количественной оценки диссоцироваппых и взаимодействующих форм аС-доменов в молекулах фибриног ена и фибрина мы экспериментально доказали выдвинутую ранее гипотезу (Medved' et al., 1985) о механизме их участия в процессе полимеризации. Нарушение ассоциации между аС-доменами при рН 3,5 позволяет предположить, что их взаимодействие может иметь электростатическую природу. В этом случае диссоциация аС-доменов от центрального домена молекулы может наблюдаться в результате потери электроотрицательных фибринопептидов. Освободившиеся аС-домены могут принимать участие в реализации межмолекулярных взаимодействий. Функциональные последствия таких взаимодействий были исследованы на препаратах X,- и Х2-мономеров.

Полученные из ранних Х|- и Х2-фрагмеитов фибриногена Xt- и Х2-моно-меры и fm desAABB имели практически 100% свертываемости. По данным ДСН-электрофореза молекулярные массы X,- и Х2-фрагментов составляли 295 и 260 кДа, т.е. были соответственно на 45 и 80 кДа меньше М.м. фибриногена. На основании анализа плазмин-чувствигельных участков Аа-цсии фибриногена мы заключили, что плазмин отщепляет две трети С-концевой части Аа-цепи, что соответствует аС-домену с М.м. 40-45 кДа. Однако, ДСН-электрофорез препаратов X, - и Х2-фрагментов в редуцирующих условиях не выявлял интактиой Аа-цепи (рис.8). В обоих препаратах были получены полосы, соответствующие Bp-, 7-цспям, и значительно укороченной Аа-цепи (М.м. 26 кДа). Наиболее вероятное объяснение

Рис. 8 ДСН-электрофореграм-мы восстановленных препаратов фибриногена^), и Х-фраг-ментов (Х[ и Х2), а также их ,мономеров, полученных при обработке тромбиномОт.Х^, Xjin). Отдельные полипептид-иые цепи Аа, Bp и 7 иденгифи-цироваиы в соответствии с (Горкун и Медведь, 1984).

этого факта, как было, предложено ранее (Горкун и Медведь, 1984), заключается в том, что в случае Х| фрагмен та один аС-домеп отщепляется полностью, в' то время как у другого отщепляется короткий участок в Скопце Аа-цепи и остаток Аа-цепи приобретает в этом случае М.м., близкую по значению к таковой для Вр и/или -у-цепей. Во фрагменте Х2 оба аС-домена (М.м. 40 кДа) отсуствуют полностью. На рис.8 также представлены

Аа_—__а

ВДВЗ __р

A aL

-а'

F in Ki Xim Хг хг«

электрофореграимы фибрин-, X,- и Х2-мопомеров, полученные в редуцирующих условиях, в срапнении с фибриногенов, X,- и Х2-фрагментами, соответственно. Увеличенные элетрофореТические подвижности а (а) и р-цепей обработанных тромбином белков указывают на то, что фибрино-пептиды А и В, присутствующие в исходных молекулах фиСриногена, X, и Х2-фрагменТов, отщеплены тромбнНом. Таким образом, в то время как Гт вевЛЛВВ, используемый в пашей работе, содержит оба иптактнЫх аС-домена, Х,-мономер содержит один частично поврежденный аС-домен, а Х2-мономер не содержит аС-доменов. ИспоЛЬзуеМый в нашей работе препарат Х2-мономера является новым, ранее не описанным модельным белком. Полученный из раннего Х2-фрагмента, он имеет, так же как й Х,-Мономер, практически 100% свертываемости, что свидетельствует осохраниости Я-копцов его Вр-цепи. Применение в работе этих белков Дало нам возможность исследовать роль аС-домеиоп на качественно новом уровне.

Для изучения роли аС-домеиов в процессе формирования фибрииового сгустка были использованы методы светорассеяния, а также просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии. В то время, как просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) негативно коитрастнро-ваппых образцов давала нам детальную картину структуры фибрилл, образующих сгусток, сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) высушенных в1 критической точке и напыленных препаратов позволяла выявлять трехмерную архитектуру фибриновой сети. Оба типа исследуемых образцов также давали информацию о степени ветвления фибрилл, образующих гель.

Данные, полученные при измерении нарастания мутности во время полимеризации Х-мономеров и Гт с1сбЛАВВ при низких концентрациях (0,09 мг/мл), выявили существенные различия в ходе полимеризации этих белков (рис.9). При полимеризации Гт бейЛАВВ обнаруживается короткий лаг-

fm des ДА В В

s' У

( / /' *2m

/ / '

Рис.9 Кривые нарастания мутности при полимеризации fm des ААВВ (fm), X,- и Х-мономеров (Х,т, Х2т).

О S 10 15 20 23 10 33 ВРЕМЯ (шя)

период (29 сек), отражающий формирование двухцепочечных протофибрилл, после чего мутность быстро увеличивается, Что соответствует процессу латеральной агрегации протофибрилл, формирующих фибриллы, и наконец выходит на плато с максимальным значением, зависящим от концентрации белка. При полимеризации X|in t lag значительно удлиняется и составляет

к

04

□

1 мин 16 сек, после чего мутность нарастает медленее, чем у fm desAABB, хотя ее максимальное значение выше. При полимеризации Х2т длительность t lag составляет более 4 минут, а максимальная мутность была еще выше, чем у Xjm-сгустков. При полимеризации fm, Х|Ш и Х2ГП при высокой концентрации различия в длительности лат-периодов и максимальных скоростях нарастания мутности между ними значительно снижались, что соответствовало ранее опубликованным данным для полимеризации Х,-мопо-мера (Медведь и др., 1986). Из этого следует, что один протеолитически модифицированный аС-дОмен в Х|-фрагмеите функционально активен и ускоряет процесс полимеризации Xj-мономера по сравнению с Х2-мопомером.

Анализ электронных микрофотографий, полученных ПЭМ и СЭМ, по-, казал, что сгустки, сформированные как fm desAABB, TaKjiXpiiXj-мономерами,' представляют собой сети имеющие сравнимое количество точек ветвления фибрилл. Однако, толщина фибрилл и характер их поперечной исчерчешшсти различались у разных препаратов. Поперечные полосы у фибрилл, образованных Х-мономерами, имели слегка волнистый вид, что говорит о меньшей продольной упорядоченности фибрилл, а прерывистость полос в латеральном направлепинии указывала на то, ч то промежутки между протофибриллами могут быть больше. Кроме того, было замечено, что толщина фибрилл, образующих сеть, увеличивается по мере отщепления аС-доменов. Для получения количественной информации на электронных микрофотографиях было измерено несколько сотен таких фибрилл. Их средний диаметр составлял для fm desAABB - 95 им, Х^ - 100 им, Х2т -143 им, что коррелируете данными, полученными при измерении мутности этих сгустков.

Имеющиеся на сегодняшний день данные о роли аС-доменов в процессе формирования фибрииового сгустка противоречивы. С одной стороны, при сопоставлении процессов полимеризации растворимого фибрина и Хр мономера, имеющего в своем составе один аС-домеи, было показано, чго аС-домены ускоряют формирование лротофибрилл, фибрилл и фибриповой сети (особенно в разбавленных растворах), но не оказывают существенного влияния на окончательную структуру сгустка (Medved' et al.. 1985 ). С другой стороны, при изучении сгустков, полученных при добавлении тромбина к препаратам раннего Х-фрагмепта, были получены данные, свидетельствующие о том, что эти сгустки менее стабильны и образуются из фибрилл со значительно меньшей степенью ветвления, чем нормальные (Weisel and Papsun, 1987). По мнению последних авторов, недостаток стабилизирущих сгусток точек ветвления фибрилл был связан с отсутствием аС-домепов в Х-фрагмеите; ими было высказано предположение о необходимости присутствия в молекуле фибриногена аС-доменов для образования ветвящихся фибрилл и стабильного трехмерного геля. Следует отметить, что сверываемость препаратов Х-фрагмецтов, описанных в литературе, существенно ниже, чем у фибриногена, в то время как у Х-мономеров, получаемых путем полимеризации - реполимеризации X-фрагментов (см. Материалы и методы) она приближается к таковой мономерного фибрина. Поэтому наши результаты позволяют объяснить вышеизложенные противоречия различиями в качестве использованных

препаратов. По-видимому, даже очень небольшие количества несвертывающегося материала, всегда присутствующие в препаратах X-фрагментов и удаляемые в процессе его реполимеризации, могут драматически влиять па формирующийся сгусток, значительно ослабляя процесс образования точек ветвления. Различия в ходе процесса самосборки фибрин- и Х-мопомеров, выявлейиые при использовании новс го модельного белка (Х2га), являются новым подтверждением ранее полученных данных о том, что аС -домены ускоряют процесс самосборки фибрина. Присутствие в Молекуле фибриногена аС-доменов не является необходимым условием для нормального протекания процесса ветвления фибрилл, но их частичное или полное отщепление сказывается па кинетике процесса самосборки и конечной структуре фибрилл.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые экспериментально продемонстрирован твнстирукнций характер структуры длиных протофибрилл, предсказанный ранее теоретически.

2. Показано, что процесс образования олигомеров фибрина на ранних стадиях самосборки носит упорядоченный характер. Однако, эта упорядоченность определяется не разной скоростью отщепления фибрннопептидов А, как было предложено ранее, а другими механизмами.

3. Установлено, что активация Е2-центров на стадии формирования протофибрилл приводит к усилению их латеральной агрегации.

4. Экспериментально подтверждено взаимодействие между оС-домеиами, возможность их внутримолекулярной ассоциации/диссоциации и образования межмолекулярных аС-аС контактов. Полученные результаты представляют собой новое доказательство гипотезы о роли аС-доменов в процессе самосборки фибрина.

5. Доказано, что аС-домены не определяют процесс ветвления фибрилл, но их частичное или полное отсутствие приводит к увеличению толщины фибрилл, формирующих гель.

Основные положения диссертации опубликованы в работах:

1. Веклич Ю.И., Угарова Т.П., Лукинова Н.И. Электронно-микроскопическое исследование этапов полимеризации фибрина // vlll Всесоюзная конференция по электронной микроскопии - Тезисы докладов -Москва, 1988 -с. 40.

2. Угарова Т.П., Веклич Ю.И., Лукинова Н.И., Медведь Л.В. Электронно-микроскопическое изучение структуры протофибрилл//Докл. АН УССР-1989 - сер."Б"- N 5 - с, 79-82. '

3. Medved'. L., Ugarova, T., Vekllch. Yu., Luklnuva. N.. Weisel, J. Electron microscope Investigation of the early stages of fibrin assembly: twisted protofibrils and fibers // J. Mol. Biol. - 1990 - 216 - p. 503-509.

4. Weisel, J., Veklich, Y., Gorkun, Q., Nagaswami, C., Medved', L. Structural studies on the influence of the aC-cjoraains of fibrin in clot formation //Thromb. Haemostas.- 1^91 - 65 - N6 - p.676.

Пчдп. Ьпеч. 18.10.91. Формат 60x84/16. Бумага тип. Офс. печать. Усл. печ.л. 0,93 Усл.кр.-отт.0,?3. Уч.-изд.л.0,8 Тираж ЮОэкз.Заказ 3G3. Бесплатно.

Отпечатано в Институте математики АН Украины. 252601 Киев 4, ГСП, ул. Репина, 3. i