Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антикоагулянтная активность фракции сапропеля. Получение, природа и механизм действия

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Антикоагулянтная активность фракции сапропеля. Получение, природа и механизм действия"

Министерство здравоохранения России

Башкирский государственный медицинский университет

На правах рукописи

ЯКОВЛЕВА Наталья Владимировна

АНТИКОАГУЛЯНТНАЯ АКТИВНОСТЬ ФРАКЦИИ САПРОПЕЛЯ. ПОЛУЧЕНИЕ, ПРИРОДА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа - 1998

Работа выполнена в Тюменской государственной медицинской академии

Научный руководитель

доктор биологических наук профессор Е.А. Чирятьев

Официальные оппоненты

доктор биологических наук профессор Т.Г. Нигматуллин доктор биологических наук профессор С.А. Башкатов

Ведущее учреждение

Челябинская государственная медицинская академия

Защита состоится .» иСеЛс/гЛ 1998 г в _ часов

заседании специализированного Ученого Совета К-084.35.02 п Башкирском государственном медицинском университете (450000, г. Ус ул. Ленина, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирскс государственного медицинского университета.

Автореферат разослан « >о » О*'г^? 1998 г.

/У » оЯ&Ръ

Ученый секретарь специализированного Ученого Совета, профессор

Э.Г. Давлетс

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы определяется необходимостью дальнейшего поиска средств направленного воздействия на гемостаз, поскольку ассортимент антикоагулянтов прямого действия существенно ограничен. Широко применяемый в медицинской практике единственный официальный прямой антикоагулянт - гепарин, отличающийся сильным, но кратковременным действием, не лишен ряда недостатков, а именно: сложность дозирования, способность вызывать агрегацию тромбоцитов /Bertele V. et al., 1983; Cimo P. et al., 1979/ и тромбоцитопению /Ansell J., Deykin D., 1980; Borg J., 1986/, эффект «бумеранга» /Nordon et al., 1981/ и др. Известны случаи гепаринрезистентности /Баркаган З.С. и соавт., 1982; 1988/.

Гепарин, угнетая активность тромбина, в некоторой степени тормозит и скорость аутополимеризации фибринмономеров /Кудряшов Б.А. и соавт., 1975/. Однако ингибиторы, ограничивающие неферментативные превращения фибриногена и имеющие практическое применение, до настоящего времени не известны. Эффекторы такого типа упорно исследуются. Так, Laudano A., Doolittle R. (1978; 1979) получили серию пептидов - аналогов N-концевого участка а-цепи фибриногена, имеющих последовательность Gly-Pro-Arg и способных ингибировать полимеризацию мономерного фибрина. Подобные пептиды могут быть выделены из плазмы крови и тканей внутренних органов человека и животных /Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А., 1980 - 1991/. В то же время применение этой группы пептидов в качестве антикоагулянтов прямого действия невозможно вследствие их быстрой элиминации из кровотока /Чипенс Г.И., 1982; Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А., 1991/.

В лабораториях кафедр Тюменской медицинской академии установлено, что в ряде растений содержатся антикоагулянты прямого действия, представляющие собой гликопептиды, чей эффект реализуется на уровне заключительной фазы свертывания. По данным И.А. Дементьевой, O.A. Русаковой и А.Г. Губаева /1991 - 1996/ растительные гликопептиды действуют достаточно продолжительно (до 24 ч после однократной инъекции), не вызывают гиперкоагулемии и не обладают токсическим действием.

Известно, что водные растения, (в т.ч. ряска, стрелолист, сине-зеленые водоросли и др.) обеспечивают до 80% органической фазы донных иловых грязей. Эти растения не отличаются высоким содержанием пептидов-антикоагулянтов, однако процесс естественного концентрирования путем формирования сапропелей, может принести свой результат. В связи с этим, а также принимая во внимание неограниченность сырьевых запасов

сапропелей, представляется интересным их изучение как альтернативных источников антикоагулянтов прямого действия.

Цель исследования - изучение возможности получения фракции сапропеля, обладающей антикоагулянтной активностью, предварительная характеристика эффектора свертывания и механизма влияния на плазмокоа-гуляцию.

Задачи исследования. 1. Разработать способ получения из сапропеля экстракта, обладающего антикоагулянтной активностью. 2. Разработать способ количественной оценки антикоагулянтной активности. 3. Выделить носитель антикоагулянтной активности и установить его природу. 4. Расшифровать механизм ограничения свертывающей активности плазмы крови полученной фракцией. 5. Дать предварительную оценку состояния гемокоа-гуляции при внутривенном введении фракции экстракта сапропеля лабораторным животным.

Научная новизна. Впервые установлено, что сапропель содержит антикоагулянты прямого действия. Впервые разработан способ выделения фракции сапропеля, обогащенной по антикоагулянту. Определена природа носителя антикоагулянтной активности и механизм действия. Показана перспективность исследований по созданию нового средства фармакологической коррекции гемостаза.

Практическая ценность. Впервые предложен "Способ получения средства, обладающего антикоагулянтной активностью" (Патент №2101023, зарегистрирован в Государственном реестре изобретений 10 января 1998 г), который позволяет получать его в достаточных для исследовательской работы количествах и может явиться основой для промышленного способа.

Выявлена принципиальная возможность создания нового средства фармакологической коррекции свертывающей активности крови с точкой приложения на заключительном этапе фибринообразования и показано, что источником нового антикоагулянта прямого действия может служить сапропель, ресурсные запасы которого не ограничены.

Получены данные, которые обосновывают перспективность и целесообразность дальнейшего глубокого фармакологического и биохимического исследования ингибитора свертывания сапропеля по схеме, предусмотренной Фармакологическим комитетом для доклинических испытаний антикоагулянтов прямого действия, и могут быть использованы в лабораториях, занимающихся поиском новых средств фармакологической коррекции гемостаза.

Апробация и публикации. Основные положения диссертации доложены на проблемной комиссии "Фармация" Тюменской медицинской ака-

демии, опубликованы в материалах конференции "Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины" (Тюмень, 1994), конференции, посвященной 25-летию фармацевтического факультета Самарского медицинского университета (Самара, 1996), а также в межвузовском сборнике научных трудов "Актуальные проблемы фармации" и Медико-биологическом вестнике им. Я.Д. Витебского.

Объем и структура работы. Материалы работы, включая указатель литературы, изложены на 141 странице машинописного текста. В тексте работы содержится 37 рисунков и 15 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследований, главы (содержащей 7 подразделов), в которой изложены результаты собственных исследований, заключения и выводов. Указатель литературы представлен 128 отечественными и 91 иностранным авторами.

Содержание работы

Материалы и методы исследований. Материалом для исследования послужил сапропель озер Бурунчук и Большой Тарас-Куль, расположенные в Тюменской области.

Фракции экстракта получали разработанным нами способом. Более подробно способ описан в разделе "Собственные исследования".

Гидролиз носителя антикоагулянтной активности осуществляли 6Н хлористоводородной кислотой при 110°С, 24 ч. Гидролизат хроматографиро-вали на бумаге FN-2 в системе растворителей н-бутанол, уксусная кислота, вода в соотношении 4:1:2, используя в качестве проявляющего реагента нингидриновый реактив /Шталь Э., 1965/.

Ферментативный гидролиз проводили по Дэвени Т., Гергей Я. /1976/.

Мономерный фибрин получали из нефракционированной бычьей плазмы по Радзевич И.М., Ходоровой Е.А. /1969/ в модификации Чирять-ева Е.А. /1990/. Концентрацию мономерного фибрина определяли спек-трофотометрически, принимая Е28о=15,67 /Угарова Т.П., Белицер В.А., 1978/. Скорость самосборки фибрина определяли в системе , содержащей 0,5 мл 0,075М боратного буфера с pH 7,6, 0,1 мл исследуемого препарата (или растворителя) и 0,1 мл lxlО 6 М раствора мономерного фибрина.

Антикоагулянтную активность фракций экстракта оценивали in vitro по его влиянию на скорость реакции взаимодействия тромбина с фибриногеном в чистой системе. In vivo предварительную оценку состояния плазмо-коагуляции производили по изменению активированного времени рекальци-фикации, тромбиновому времени и продолжительности самосборки фибри-

на в плазме крови экспериментальных животных. Результаты выражали в значениях эффективности торможения (i) по формуле i = 1 - V0/Vj<, где V0 и Уц - скорость реакции в опыте и контроле соответственно. Количественно содержание антикоагулянта во фракциях выражали в условных единицах активности (ЕА), используя для этой цели калибровочный график зависимости количества единиц активности от эффективности торможения.

Препараты антикоагулянта лабораторным животным вводили в яремную вену после эфирного наркоза. В опытах использовано 125 белых беспородных крыс весом 180 - 220 граммов. В пределах одной серии опыта вес животных не различался более чем на 20 г. Все болезненные манипуляции выполнялись на наркотизированных животных.

Результаты исследований подвергались математической обработке методом вариационной статистики для малых рядов наблюдений /B.C. Бессмертный, 1967; И.Г. Венецкий, 1970/.

Собственные исследования

Количественная оценка антиполимеризационной активности фракции сапропеля.

Прежде чем приступить к разработке приемов выделения и очистки антикоагулянтной фракции из сапропеля, мы сочли необходимым разработать способ количественной оценки ингибиторной активности, в доступной для данного случая форме - в условных единицах активности (ЕА), что позволило бы устанавливать изменения удельного содержания ингибиторов в процессе выделения и контролировать их содержание в экспериментах in vivo и in vitro.

Для этого использовали фракцию сапропеля, полученную настаиванием 50 г цельного сапропеля со 150 мл дистиллированной воды при постоянном перемешивании в течении 1 ч. Смесь оставляли для отстаивания на 2 суток и декантировали надосадок. Полученный экстракт упаривали в 10 раз с помощью ротационного испарителя под вакуумом при температуре 48-50°С и твердые частицы удаляли центрифугированием (3 000 g, 30 мин). Для освобождения от неорганических солей супернатант диализовали против дистиллированной воды через гидратцеллюлозную мембрану Т-100 в соотношении 1:150 в течении суток.

В качестве тест-системы использовали систему, содержащую 0,1 мл раствора коммерческого фибриногена (4 мг/мл), 0,1 мл раствора тромбина (активность 15 с) в 0,05М Трис-HCl буферном растворе (рН 7,6) и 0,1 мл Трис-HCl буфера. Определяли время образования фибринового сгустка

(контроль). В опыте вместо 0,1 мл Трис-HCl буфера вносили равный объем раствора эффектора.

Полученную фракцию разбавляли тем же буферным раствором в 2, 4, 6 и 8 раз и определяли влияние разведений на время свертывания фибриногена тромбином. По результатам определений строили калибровочный график зависимости эффективности торможения от концентрации антикоагулянта, принимая за 100% концентрацию активность неразведенной фракции сапропеля. Количество ингибитора, обусловившее эффективность торможения, равное 0,3, приняли за условную единицу активности (ЕА) и построили график, где содержание ингибитора в ЕА является функцией эффективности торможения. Этот калибровочный график использовали для оценки содержания антикоагулянта в дальнейших исследованиях.

Разработка способа получения фракции сапропеля, обладающей антикоагулянтной активностью.

При выборе экстрагента мы использовали дистиллированную воду, 0,1М раствор аммиака, 0,1М раствор едкого натра, 40% этанол и 0,1М раствор уксусной кислоты. По получении конечного продукта во всех извлечениях значение рН приводили к 7,6 с помощью Трис-HCl буферного раствора. Эффективность извлечения антикоагулянта оценивали in vitro как описано выше.

Оказалось, что при равных условиях оптимальным экстрагентом является 0,1М раствор аммиака.

При выборе концентрации экстрагента были определены следующие концентрации раствора аммиака: 0,05М, 0,1М, 0,15М и 0,ЗМ. Установлено, что наиболее оптимальной является концентрация аммиака, равная 0,1М.

Далее нами были выбраны временные значения экстрагирования: 30, 60 и 180 мин. Как и в предыдущих случаях операцию проводили при комнатной температуре при постоянном перемешивании, используя 0,1М раствор аммиака. Определено, что наиболее оптимальным является время экстракции, равное 1 ч.

Выбор температурного режима экстракции (экстракцию проводили экстракцию при 5, 20 и 60°С) показал, что оптимальный температурный режим экстракции составляет 20°С.

При определении количественного соотношения сырье : экстрагент, соблюдая вышеуказанные параметры экстракции (0,1М раствор аммиака, 60 мин, 20°С), мы изучили влияние соотношений сырье:экстрагент на количественный выход антикоагулянта из сапропеля. При этом установили, что при соотношениях сырье:экстрагент 1:3, 1:5 и 1:7 антикоагулянт экстраги-

руется примерно в равных количествах. Однако увеличение количества экс-трагента влечет за собой существенное увеличение времени, затрачиваемого на остальные операции по выделению ингибитора (почти в 4 раза). Следовательно, оптимальным соотношением сырье:экстрагент является соотношение 1:3.

Таким образом, вышеприведенные эксперименты по разработке оптимального способа выделения фракции сапропеля, обладающей антикоагу-лянтной активностью, позволяют сделать заключение, что наиболее приемлемыми являются следующие параметры: соотношение сырье:экстрагент 1:3, температура экстракции - 20°С, время экстракции - 60 мин при использовании в качестве экстрагента 0,1М водного раствора аммиака.

Разработка приемов очистки антикоагулянтной фракции сапропеля.

Следует отметить, что предлагаемая нами схема выделения фракции сапропеля уже подразумевает частичную очистку носителя. Так, в процессе ультрафильтрации через полупроницаемую мембрану Т-100, фракции освобождаются от низкомолекулярных компонентов, а после концентрирования и центрифугирования осаждаются мелкодисперсные частицы.

Для максимальной очистки носителя ингибиторной активности исходную фракцию экстракта подвергали различным воздействиям, таким как обработка при высоких температурах, обработка органическими растворителями с различной степенью гидрофобности, осаждение примесей солями тяжелых металлов, связывание с фибрином и последующая диссоциация комплекса и др. Из всех операций заслуживающим внимания приемом оказалось глубокое и длительное замораживание фракции экстракта с последующим спонтанным размораживанием при комнатной температуре. При этом выпадает обильный осадок, легко удаляемый при центрифугировании при 3 ООО д.

Мы определили основные параметры этой операции (температура и время замораживания): замораживание следует вести при -20°С, а оптимальное время замораживания составляет 24 ч.

Следующим приемом выделения антикоагулянта мы избрали гель-фильтрацию на геле Сефадекс. С этой целью были опробованы гели с различным пределом исключения: 0-50, О-ЮО, 0-150 и 0-200. При использовании первых двух, фракции с антикоагулянтной активностью обнаруживались во внешнем объеме колонки совместно с пиком оптической плотности, т.е. очистки практически не происходило. Применение же гелей й-150 или 0-200 привело к разделению пиков антикоагулянтной активности и оптиче-

ской плотности. При этом степень очистки пиковой фракции по сравнению с исходным экстрактом достигла 110. Повторная рехроматография сконцентрированных активных фракций дополнительной очистки не принесла.

Таким образом, схема получения обогащенной по антикоагулянту фракции сапропеля, имеет следующий вид.

Сапропель

Экстракция 0,1М раствором ам-i миака, 1 ч, 1:3, 20°С, отстаивание, концентрирование, центрифугирование, ультрафильтрация на мембране Т-100

Фракция сапропеля

Замораживание при -20°С, 24 ч, I размораживание,

центрифугирование

Фракция сапропеля

Гель-фильтрация на Sephadex G-1 150, элюент - 0,05М аммонийно-ацетатньш буфер, рН 7,6 Конечный продукт (пиковая фракция элюата)

Мы накопили антикоагулянт, содержащийся в пиковой фракции элюата после гель-фильтрации на сефадексе G-150, и использовали его для изучения природы и механизма ограничения свертывания крови, а для предварительной оценки состояния гемокоагуляции при внутривенном введении ингибиторов лабораторным животным использовали объединенные активные фракции элюата, полученные в тех же условиях.

Состав фракции сапропеля, обладающей антикоагулянтной активностью, и природа носителя.

Для выяснения природы носителя антикоагулянтной активности нами были предприняты следующие шаги. Высокоочищенные фракции экстракта, полученные после гель-фильтрации на сефадексе G-150, концентрировали и подвергали хроматографии на бумаге FN-2 в системе растворителей н-бутанол, уксусная кислота, вода в соотношении 4:1:2. При просматривании хроматограммы в ультрафиолетовом свете обнаруживается пятно, флуоресцирующее голубовато-желтым цветом, а после проявления хроматограммы нингидриновым реактивом появляется нингидринположительное пятно округлой формы фиолетового цвета.

Далее мы повторили вышеописанный эксперимент с той разницей, что не проявляя хроматограмму нингидриновым реактивом, разделили ее на горизонтальные зоны шириной 3 см, начиная от линии старта. Каждую зону хроматограммы измельчали, элюировали дистиллированной водой, доводили объем элюатов до объема нанесенной на хроматограмму фракции и определяли эффективность торможения (табл. 1). При этом основная ингибитор-ная активность при хроматографии на бумаге фракции сапропеля оказывается сосредоточенной в области нингидринположительного пятна.

ТАБЛИЦА 1. Эффективность торможения элюатов различных зон хроматограммы на бумаге РЫ-2__

№ зоны (начиная от линии старта) Эффективность торможения (0

1 0,0 ± 0,00

2 0,15 ± 0,02

3 0,39 ± 0,02

4 0,50 ± 0,04

5 0,32 ± 0,01

6 0,26 ± 0,03

7 0,15 ± 0,04

Общеизвестно, что нингидриновый реактив является достаточно высокоспецифическим реагентом на Ы-концевые аминогруппы. Поскольку на хроматограмме не выявляются свободные аминокислоты, имеющие подобную функциональную группу, мы имеем все основания предполагать, что носитель ингибиторной активности из сапропелей имеет пептидный характер.

Это предположение мы проверили, гидролизовав высокоочищенную фракцию сапропеля, полученную после гель-фильтрации на сефадексе й-150, 6Н хлористоводородной кислотой при 110°С в течение 24 ч. После полного удаления кислоты и растворении сухого остатка в Трис-НС1 буферном растворе ингибиторная активность в гидролизате отсутствовала. Следовательно, в результате этой операции произошло разрушение носителя. В вышеуказанных условиях хроматографировали гидролизат, фракцию сапропеля до гидролиза и стандартную смесь аминокислот (рис. 1).

Как видно на рисунке 1, при гидролизе носитель антикоагулянтной активности распадается на ряд соединений, по характеру и окраске соответствующих аминокислотам. Это подтверждает высказанное выше предположение о пептидной природе ингибитора.

Линия старта

и

о

а

а

о

о

о £>

1

о §

8 А

с»

л

РИСУНОК 1. Схема хроматограммы очищенной фракции сапропеля (1), гидролизата носителя антикоагулянтной активности (2) и стандартной смеси аминокислот (3). Стрелкой показано направление движения растворителя.

Чтобы полностью исключить сомнения, касающиеся структуры носителя, очищенную фракцию сапропеля подвергли ферментативному гидролизу: трипсиновому, папаиновому и последовательно трипсиново-папаиновому в условиях, оптимальных для действия этих ферментов /Дэвени Т., Гергей Я., 1976/. После термической обработки гидролизата (нагревание на кипящей водяной бане в течение 30 мин) и удаления скоа-гулировавших белков центрифугированием, определяли ингибиторную активность (табл. 2).

ТАБЛИЦА 2. Эффективность торможения 0) трипсиновых, папаиновых и трипсиново-папаиновых дериватов носителя антикоагулянтной активности

Вид гидролиза Эффективность торможения Потеря активности, %

Контроль 0,77 ± 0,03

Трипсиновый 0,72 + 0,02 6,5

Папаиновый 0,27 ± 0,03 65,0

Трипсиново-папаиновый 0,0 ± 0,00 100

Известно, что трипсин обладает достаточно высокой специфичностью и расщепляет связи, образованные остатками аминокислот лизина и аргинина. Папаин - не специфический фермент, он лизирует различные

пептидные связи, например такие, как Глу-Глн, Цис-Сер, Глн-Лей, Глу-Асн и другие. В данном случае важно то, что вышеуказанные ферменты в оптимальных для них условиях действия не способны разрушать другие типы связей, кроме пептидных. Следовательно, основываясь на результатах этого эксперимента, а также других, изложенных выше, мы можем с полной уверенностью утверждать, что ответственной за антикоагулянтную активность фракции сапропеля является соединение, имеющее пептидную природу.

Необходимо отметить, что нам не удалось получить индивидуальный носитель антикоагулянтной активности даже при 3-х кратной повторной гель-фильтрации на сефадексах с различным пределом исключения, при использовании бумажной хроматографии и последующем элюировании зоны нингидринположительного пятна, а также при сочетании этих приемов. Это указывает на то, что пептид - носитель антикоагулянтной активности во фракции экстракта находится в виде достаточно прочного комплекса с каким либо другим соединением. Анализ в этом направлении высокоочищен-ной фракции показал, что постоянной примесью является комплекс гумино-вых кислот, не обладающих антикоагулянтной активностью.

Попытка отделения гуминовых кислот от носителя различными способами (в т.ч. гель-хроматографией БЕАЕ- или СМ сефадексах А 25 в ступенчатом градиенте рН, ионной силы и их комбинации) не привела к желаемым результатам. По-видимому, гуминовые кислоты, обладая выраженным электрическим зарядом, чрезвычайно прочно связываются с ингибитором.

Механизм ограничения свертывания крови антикоагулянтом из сапропеля.

Наглядную информацию о влиянии антикоагулянта на свертывание крови, можно получить при анализе электрокоагулограмм (коагулограф Н-334). В данном эксперименте в качестве субстрата использовали пулиро-ванную донорскую плазму, а в качестве эффектора - фракцию сапропеля, содержащую 100 ЕА/мл (рис. 2).

Как видно на рисунке 2, время, затраченное непосредственно на формирование сгустка (Т2 - Тх), в присутствии ингибитора составило 240 с, в отсутствие - 220 с, что больше на 8,3%. Одновременно, общая продолжительность свертывания (Т2) в опыте и контроле составила 840 и 300 с соответственно (различие - 64,3%), а время от момента инициации свертывания до начала формирования фибринового сгустка (Т[) соотносится в опыте и контроле, как 6:1.

Контроль

РИСУНОК 2. Электрокоагулограмма плазмы крови в отсутствие (контроль) и в присутствие (опыт) фракции сапропеля с антикоагулянтной активностью. Пояснения в тексте.

Далее мы выяснили не обладает ли носитель гепариноподобным действием. Для этого изучили эффективность торможения скорости реакции взаимодействия тромбина (Тр) (1,5 мг/мл) с фибриногеном (Фг) (4 мг/мл) исследуемым экстрактом (Ing) (24 ЕА/мл), гепарином (Геп) (10 ЕА), сывороткой крови, разведенной в 10 раз, как источника антитромбина III (Ат III), порознь, а также в сочетании гепарин-сыворотка, экстракт-сыворотка, экстракт-гепарин (табл. 3).

Расчет показал, что при совместном влиянии на реакцию тромбина с фибриногеном гепарина и сыворотки обнаруживается выраженный синергизм - экспериментально установленная суммарная эффективность торможения выше теоретической на 32,8%, а при исследовании пары экстракт-антитромбин III, мы наблюдали снижение эффективности торможения по

сравнению с теоретически рассчитанной - на 14,8%. Следовательно, механизм ограничения скорости реакции тромбина с фибриногеном гепарина и экстракта из сапропеля принципиально различается.

ТАБЛИЦА 3. Сравнительная оценка влияния антикоагулянта из сапропеля и гепарина на реакцию взаимодействия тромбина с фибриногеном

Схема опыта (все компоненты смеси в соотношении 1:1) Экспериментальная эффективность торможения в эксперименте Эффективность торможения, рассчитанная теоретически

Тр + 2Фр + Ing + Фг 0,82 ± 0,002

Тр + 2Фр + Геп + Фг 0,63 ± 0,012

Тр + Фр + АтШ + Фг 0,04 ± 0,000

Тр + Геп + АтШ + Фг 0,94 ± 0,007 0,64 ± 0,009

Тр + Ing + Геп + Фг 0,91 ± 0,010 0,93 ± 0,005

Тр + Ing + АтШ + Фг 0,72 ± 0,006 0,83 ± 0,007

Прежде чем приступить к детальной расшифровке механизма ограничения плазмокоагуляции полученной нами фракцией сапропеля, мы определили влияние различных ее концентраций на неактивированное время ре-кальцификации (ВР), активированное время рекальцификации (АВР), активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), тромбиновое время (ТВ) и время самосборки фибрина (ВСФ), используя для этой цели пу-лированную донорскую плазму (рис. 3).

РИСУНОК 3. Зависимость эффективности торможения ВР (1), АВР (2), АЧТВ (3), ТВ (4) и ВСФ (5) от концентрации ингибитора. Абсцисса -концентрация ингибитора (ЕА), ордината - эффективность торможения 0).

Как видно на рисунке, кривые, характеризующие влияние фракции сапропеля на неактивированное и активированное время рекальцификации, а также на активированное частичное тромбопластиновое время практически совпадают между собой. Это косвенно указывает на то, что носитель антикоагулянтной активности реализует свой эффект не зависимо от того, протекает ли свертывание по внутреннему или по внешнему пути. Отсюда же следует, что вероятнее всего фракция экстракта оказывает влияние на этапы, следующие за образованием тромбина. Об этом же свидетельствует тот факт, что те же количества экстракта обладают существенно большим ингибирующим эффектом на тромбиновое время и, особенно, на время самосборки мономерного фибрина.

На основании этих опытов нет возможности однозначно определить, на какой из этапов свертывания плазмы оказывает влияние антикоагулянт, что принципиально важно для расшифровки его механизма действия. В связи с этим мы провели серию экспериментов, используя в качестве субстрата фактор-дефицитные плазмы. Исследовали влияние фракции экстракта на свертывание плазм, дефицитных по факторам II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII и кининам.

Результаты экспериментов, свидетельствуют, что эффективность торможения скорости соответствующих реакций свертывания достоверно различается только в случае использования в качестве субстратных плазм, дефицитных по фактору II (рис. 4) и кининам, и не зависит от активности факторов V, VII, VIII, IX, X, XI и XII.

0,19

чЯН

á

0,82

о

□ Контроль В Опыт

0,35

0

i————i-—~—i-——i

63 ЕА/мл 44 ЕА/мл 22 ЕА/мл

1

РИСУНОК 4. Эффективность торможения тромбопластинового времени плазмы, дефицитной по ф. II, фракцией антикоагулянта из сапропеля. Абсцисса - концентрация антикоагулянта (ЕА/мл); ордината - эффективность торможения (0.

Выраженная зависимость степени эффективности торможения фракцией экстракта от концентрации протромбина и отсутствие подобного эффекта в случае использования других фактор-дефицитных плазм (за исключением плазмы, дефицитной по кининам), дополнительно свидетельствует в пользу ранее высказанного предположения о преимущественном влиянии носителя ингибиторной активности на заключительную фазу процесса плазмокоагуляции; недостаток образующегося тромбина приводит к удлинению процесса свертывания фибриногена и, следовательно, увеличению времени, в течение которого ингибитор может реализовать свой эффект.

Что касается существенного увеличения степени торможения при использовании в эксперименте плазмы, дефицитной по кининам, то в данной работе эти сведения мы восприняли на уровне констатации факта, без попытки детального исследования механизма происходящего.

В то же время, ингибитор из сапропеля способен ограничивать и фазы свертывания, предшествующие тромбинообразованию. Это было установлено в опыте с использованием в качестве субстрата дефибринирован-ной нагреванием плазмы крови.

Для дифференциации влияния ингибитора на этапы свертывания, обеспечивающие тромбиногенез и тромбинзависимое превращение фибриногена, мы провели следующий эксперимент. В одном случае к 0,1 мл дефиб-ринированной плазмы прибавляли 0,1 мл раствора фибриногена (4 мг/мл), 0,1 мл раствора антикоагулянта ( ЕА/мл) и 0,1 мл 0,55% раствора кальция хлорида, оценивая при этом возможный суммарный эффект ингибитора на свертывающий потенциал плазмы крови. В другом случае, для оценки влияния ингибитора на тромбинзависимое превращение фибриногена, к 0,1 мл дефибринированной плазмы прибавляли 0,1 мл 0,55% раствора хлорида кальция и инкубировали в течение времени достаточном для образования тромбина, после чего прибавляли по 0,1 мл растворов антикоагулянта и фибриногена (табл. 4).

Как следует из представленных в таблице данных, антикоагулянт из сапропеля оказывает преимущественный эффект на этап тромбинзависимого превращения фибриногена, и, в чуть меньшей степени, на этапы предшествующие образованию тромбина. Так, если принять за 100-процентную реализацию антикоагулянтных свойств препарата результаты теста, в котором ингибитор был внесен в тромбингенерирующую смесь одномоментно с инициацией тромбиногенеза, то на долю антикоагулянтного эффекта, имеющего точкой приложения заключительную фазу свертывания приходится около 60%, проявленного общего антикоагулянтного эффекта.

ТАБЛИЦА 4. Эффективность торможения свертывания фибриногена при внесении антикоагулянта в тромбингенерирующую систему (дефибри-нированную нагреванием плазму) до и после образования тромбина._

Концентрация антикоагулянта ЕА/ мл Антикоагулянт внесен

Одномоментно с инициацией тромбиногенеза По завершении тромбиногенеза

22 0,24 + 0,01 0,13 ± 0,02

44 0,40 ± 0,04 0,22 ± 0,01

63 0,54 + 0,03 0,29 + 0,02

Об ограничении антикоагулянтом из сапропеля скорости тромбино-образования свидетельствуют и результаты эксперимента в котором ингибитор вносили через равные интервалы времени от момента инициации плазмокоагуляции. В контроле через те же интервалы вносили физиологический раствор (рис. 5).

стка при внесении антикоагулянта в разные сроки от момента инициации плазмокоагуляции. Абсцисса - время от начала плазмокоагуляции; ордината - скорость образования сгустка в контроле (1) и опыте (2).

Из вышеприведенного графика видно, что при внесении антикоагулянта в реакционную смесь одномоментно с инициацией тромбиногенеза, скорость образования фибрина в опыте меньше, чем скорость образования фибрина в контроле, на 53%. При внесении антикоагулянта через 30, 60 и

-1680 сек эта величина составила 46, 38 и 23% соответственно. Следовательно, чем в более поздние сроки от момента провокации свертывания внесен антикоагулянт, тем ниже его ингибиторный эффект.

Взаимодействие тромбина с фибриногеном включает в себя два этапа: ферментативный, приводящий к образованию мономерного фибрина, и непосредственно самосборку мономеров. Влияние ингибитора на самосборку можно считать установленным. В то же время остается невыясненным вопрос о его влиянии на ферментативный этап этого процесса.

Для разрешения этого вопроса мы инкубировали при 37°С раствор фибриногена (6 мг/мл) в 0.14М растворе хлорида натрия, содержащим тромбин (1,5 мг/мл) и мочевину (З.ЗМ), предотвращающую самосборку образующихся молекул мономерного фибрина. Через равные интервалы времени отбирали аликвоты смеси, провоцировали в них самосборку фибрина разбавлением боратным буфером (рН 7,6, 0,075М) и фиксировали момент образования сгустка. В части опытов ингибитор (160 ЕА/мл) добавляли в реакционную смесь одновременно с тромбином (оценивается суммарное влияние на ферментативную и неферментативную фазы превращений фибриногена), в другой части опытов ингибитор вносили в момент провокации самосборки - в этом случае он влияет только на полимеризацию мономерного фибрина (рис. 6).

РИСУНОК 6. Зависимость скорости самосборки фибрина от продолжительности инкубации смеси фибриноген-тромбин. Абсцисса - продолжительность инкубации, мин.; ордината - скорость реакции. 1 - ингибитор отсутствует в реакционной смеси, 2 - ингибитор внесен в реакционную смесь одновременно с тромбином, 3 - ингибитор внесен одновременно с провокацией самосборки.

Как следует из графиков зависимости скорости реакции от количества образующегося мономерного фибрина, ингибитор из сапропеля тормозит обе стадии превращений фибриногена: график скорости суммарной реакции (кривая 2) находится ниже графика скорости реакции, протекающей при воздействии ингибитора только на этап самосборки фибрина. Если допустить, что ингибитор из сапропеля оказывает влияние на какой-либо один из этапов превращений фибриногена, обсуждаемые кривые совпадали бы.

На рисунке 6 видно, что скорость самосборки растет по мере увеличения времени инкубации тромбина с фибриногеном как в контроле, так и в опытах, когда ингибитор вносили одновременно с тромбином или после накопления мономерного фибрина. Если принять скорость самосборки без ингибитора (контроль) на каждом отрезке времени инкубации за 100%, то на 1 мин инкубации в случае, где ингибитор влияет на обе стадии процесса, скорость реакции составляет 38%. При взаимодействии ингибитора с уже образовавшимся мономерным фибрином, этот показатель равен 57%, что свидетельствует о торможении ингибитором ферментативной стадии перехода фибриногена в фибрин. Начиная со второй минуты инкубации ход всех трех кривых параллелен друг другу и разница между скоростью реакции в случае, когда ингибитор влияет на оба этапа коагуляционного превращения фибриногена, и когда он влияет только на процесс полимеризации, составляет в среднем около 33%. В то же время из вышеприведенного эксперимента следует, что преимущественное влияние изучаемый ингибитор оказывает на аутополимеризацию мономерного фибрина. Так, если принять за 100% реализацию антикоагулянтного эффекта ингибитора опыт, в котором ограничиваются обе фазы коагуляционного превращения фибриногена, то на долю торможения самосборки приходится около 67% от общего антикоагулянтного эффекта.

Самосборка мономерного фибрина также включает в себя два этапа: формирование из мономеров протофибрилл и последующую их агрегацию, приводящую к формированию трехмерной сети. В связи с этим представляется интересным выяснить, как зависит эффект ингибитора от количества постоянно образующегося мономерного фибрина с одновременным формированием протофибрилл в субфизиологических условиях, а также на какие преимущественно этапы в процессе формирования протофибрилл он оказывает влияние.

Для решения этих вопросов мы осуществили взаимодействие фибриногена (2 мг/мл) и тромбина (1 мг/мл) в 0,14М растворе хлорида натрия в пробирках, термостатированных при 37°С. Одновременно, а в последующем через равные интервалы времени после начала реакции, к смеси

прибавляли по 18,5 ЕА раствора ингибитора. В случае, когда ингибитор вносится в реакционную смесь одномоментно с остальными компонентами реакции, он оказывает влияние на весь процесс формирования протофиб-рилл. В последующем ингибитор взаимодействует не только с образующимися мономерами, но и с полимерами различной степени зрелости (рис. 7).

РИСУНОК 7. Зависимость скорости (V, с'хЮО) реакции взаимодействия тромбина с фибриногеном (ордината) при внесении ингибитора в реакционную смесь через равные интервалы времени (с) после инициации реакции (абсцисса). 1 - контроль, 2 - опыт.

Как следует из рисунка, в контроле скорость взаимодействия тромбина с фибриногеном (скорость образования фибрина) не изменяется на всем протяжении опыта. В опыте же этот параметр претерпевает существенные изменения и описывается параболической кривой. При использовании ингибитора в случае его внесения в реакционную смесь одномоментно с тромбином и фибриногеном, скорость образования фибринового сгустка через 5, 10, 15, 20, 25, 30 с после инициации реакции ниже контрольной на 52, 31, 26, 12, 5,1 и 0,0% соответственно.

Если принять за 100% время, за которое образуется фибриновый сгусток в отсутствие ингибитора или в случае его внесения в момент агрегации, то время влияния ингибитора на процесс формирования протофиб-рилл составляет 81% от контрольного, т.е. при достижении протофибрил-лами достаточно высокой степени зрелости ингибитор перестает оказывать влияние на их дальнейший рост и агрегацию.

Таким образом наблюдается явная тенденция влияния ингибитора на более ранние стадии формирования протофибрилл, уменьшения этого

3 л

1,5 • 1

0,5 -0 -

2,5 2

0 5 10 15 20 25 30 35

влияния в процессе роста волокон и полного его отсутствия при прохождении около 2/3 пути от момента появления первых мономеров до образования фибринового сгустка.

Это наблюдение мы проверили, исследуя влияние ингибитора непосредственно на самосборку мономерного фибрина по методу, предложенному В.А. Белицером /1975/, суть которого заключается в том, что эффектор вносят в реакционную смесь (раствор мономерного фибрина) в разные интервалы времени от момента инициации процесса, т.е. от момента разведения фибринмономера. Таким образом, производится изменение условий реакции в разные моменты от начала самосборки, что позволяет различить в ней два этапа - до и после внесения ингибитора, и использовать графический способ анализа в системе координат, где абсцисса - общая продолжительность первого этапа (до внесения ингибитора), ордината - экспериментально установленное время образования фибрина при внесении ингибитора в разные сроки от начала процесса. Точки, соответствующие времени самосборки при внесении ингибитора в момент инициации процесса (Т2) и в момент его завершения (Т|), соединены прямой, характеризующей изменение времени самосборки в случае, когда все этапы равно чувствительны к действию ингибитора. Экспериментально установленное время самосборки при запаздывающем внесении ингибитора представлено кривой (а), которая отражает неодинаковую чувствительность разных этапов процесса самосборки к действию изучаемого эффектора. Прерывистой линией представлено время самосборки мономерного фибрина в контроле (рис. 8).

60

55

50

45

40

35

30

25

20 -

15 -

Т[

0

5 10 15 20 25

РИСУНОК 8. Время самосборки фибрина в опыте с внесением ингибитора в разные сроки от начала процесса. Пояснения в тексте.

Как видно из приведенного графического материала, экспериментальная кривая отклоняется вниз от теоретической, что свидетельствует о неодинаковой чувствительности к ингибитору разных этапов процесса самосборки. Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее восприимчивы к действию ингибитора мономеры фибрина и его олигомеры, а по мере созревания протофибрилл ингибирующий эффект антикоагулянта снижается, и по истечении 74% времени, необходимого для завершения образования фибрина, действие ингибитора на процесс самосборки прекращается, что полностью подтверждает высказанное выше предположение о преимущественном влиянии изучаемого антикоагулянта на начальные этапы неферментативного процесса коагуляционного превращения фибриногена.

Далее мы попытались определить характер взаимодействия ингибитора с мономерным фибрином. Для этого изучали зависимость скорости самосборки фибрина от значения рН или ионной силы среды, в которой протекает процесс в отсутствие (контроль) и в присутствии экстракта. Необходимые значения рН в системе самосборки создавали, используя для разбавления фибринмономера 0,075М боратный буфер с различными значениями рН.

Скорость самосборки фибрина в контроле нарастает с повышением рН, достигая максимума при его значении, близком к рН 7,6, несколько снижаясь в дальнейшем. В присутствии ингибитора с нарастанием рН на всем интервале изучаемых значений, скорость самосборки существенно ограничивается. Это наблюдение свидетельствует о том, что ингибитор взаимодействует с мономерным фибрином за счет электростатических связей /Луговской Э.В. и соавт., 1978; Луговской Э.В., 1982/. Анализ результатов эксперимента указывает также на то, что при изменении среды самосборки от слабощелочной (рН 7,6) в кислую (до рН 6,5), тормозящий эффект ингибитора уменьшается, что свидетельствует об участии в образовании электростатических связей отрицательно заряженных функциональных групп.

Если взаимодействие действительно происходит за счет электростатических связей, то эффективность торможения самосборки должна изменяться и при изменении ионной силы /Белицер В.А., Варецкая Т.В., 1975/. Ионную силу в экспериментах изменяли, используя для провокации самосборки фибрина боратный буфер (0,075 М, рН 7,6) с различным содержанием хлорида натрия. При этом эффективность торможения самосборки фибрина фракцией сапропеля возрастает с повышением ионной силы в среде самосборки, что в сочетании с данными, полученными при изучении влия-

ния на скорость самосборки в присутствии ингибитора, однозначно свидетельствует о роли электростатических взаимодействий в реализации тормозящего эффекта фракции сапропеля.

Для выявления других возможных типов взаимодействий ингибитора с субстратом(водородных и гидрофобных), мы изучили скорость самосборки в присутствии мочевины, как соединения конкурирующего за водородные связи, и при изменении температуры среды самосборки. Полученные результаты указывают на то, что во взаимодействии ингибитор - мономерный фибрин водородные и гидрофобные связи существенной роли не играют.

Происхождение носителя антикоагулянтной активности, содержащегося в сапропеле

В этих исследованиях мы исходили из полученных ранее данных, что некоторые растения также содержат антикоагулянты прямого действия. Простейшими водными растениями являются сине-зеленые водоросли, которые обеспечивают значительную часть органического компонента грязи.

Сине-зеленые водоросли, собранные в летний период, высушили и подвергли экстракции способом, указанным выше. Полученные экстракты обладали выраженным ингибиторным эффектом на процесс коагуляционного превращения фибриногена.

Далее мы сопоставили механизм ограничения плазмокоагуляции активной фракцией сапропеля и экстрактом, полученным из сине-зеленых водорослей. Для этого оценивали влияние экстракта из водорослей на ферментативную фазу превращений фибриногена и непосредственно полимеризацию мономерного фибрина, и использовали "метод тестирования стадий" /В.А.Белицер, Т.В.Варецкая, 1975/(как описано выше для экстракта из сапропеля). Результаты экспериментов при одинаковых условиях их проведения практически полностью совпадают между собой.

Так же сходен механизм ограничения скорости самосборки фибрина изучаемыми антикоагулянтами в зависимости от рН и ионной силы среды, в которой протекает самосборка.

На основании проведенных экспериментов, результаты которых сопоставимы с данными, полученными при исследовании активной фракции сапропеля можно, с уверенностью утверждать, что антикоагулянт в сапропеле имеет растительное происхождение.

Состояние гемокоагуляции при внутривенном введении экстракта сапропеля лабораторным животным

В этом разделе исследований мы не пытались детально проанализировать состояние плазмокоагуляции в ответ на внутривенное ведение экстракта из сапропеля, полагая, что при позитивных предварительных результатах, подобная работа должна быть проведена как самостоятельное исследование.

В связи с этим мы определяли лишь те показатели, которые интегрально отражают общую свертывающую активность плазмы крови, скорость взаимодействия тромбина с фибриногеном и аутополимеризации мономерного фибрина, а также исследовали защитное действие антикоагулянта при экзогенной тромбинемии, вызванной инъекцией взвеси тромбопла-стина.

Оценку состояния плазмокоагуляции проводили по изменению времени рекальцификации (ВР), тромбинового времени (ТВ) и времени самосборки фибрина в плазме крови (ВС) до и после введения экстрактов белым беспородным крысам. Экстракты вводили наркотизированным животным в яремную вену. Первоначально мы изучили зависимость проявляемого антикоагулянтного эффекта от дозы вводимого препарата (1260, 960, 660 ЕА/100,0 г массы тела животного). Отбор проб производили через 30 мин после инъекции, контрольным животным вводили физиологический раствор (табл. 5).

ТАБЛИЦА 5. ВР, ТВ и ВС при внутривенном введении антикоагулянта в разных дозах. _

Концентрация антикоагулянта, ЕА/100,0 Определяемый показатель ВР, сек ТВ, сек ВС, сек

Контроль 64 ± 1,0 21 ±0,5 38 ± 1,5

1260 248 ± 6,0* 72 ± 1,0* 312 ± 4,0*

960 132 ±3,5* 69 ± 2,5* 184 ± 4,5*

660 122 ± 2,0* 37 ± 2,5* 138 ± 2,0*

Примечание: здесь и далее значком * показаны достоверные отличия.

Считается, что эффективной дозой прямых антикоагулянтов должна быть такая доза, которая удлиняет время рекальцификации в 1,5-3 раза. В нашем случае оптимальной дозой антикоагулянта, можно считать дозу 960 ЕА /100 г массы тела животного, удлиняющую время рекальцификации плазмы крови при однократной инъекции в 2,1 раза.

В следующей серии экспериментов мы проследили динамику изменений изучаемых показателей свертывающей активности плазмы крови во

времени. Лабораторным животным вводили антикоагулянт в дозе 960 ЕА/100 г массы, отбирая кровь через 3 мин, 30 мин, 1 , 3, 6, 12 и 18 часов (табл. 6).

ТАБЛИЦА 6. ВР, ТВ и ВС в разные сроки после введения экстракта

Отбор проб крови производили через: Определяемый показатель ВР, сек ТВ, сек ВС, сек

Контроль 72 + 1,0 24 ± 1,5 38 ± 1,0

3 мин 108 ± 2,5* 50 ± 2,0* 102 + 2,5*

30 мин 150 ± 1,5* 76 ± 4,0* 184 ± 2,5*

1 час 211 ± 2,0* 89 ± 2,5* 256 ± 4,5*

3 часа 188 ± 3,2* 74 ± 2,5* 224 ± 5,0*

6 часов 113 ± 2,5* 58 ± 1,5* 192 ± 3,0*

12 часов 104 + 5,0* 44 ± 3,0* 176 ± 1,5*

18 часов 78 ± 3,5 24 ± 1,0 121 ± 3,0*

Из таблицы 6 видно, что уже на 3 мин после внутривенной инъекции экстракта наблюдается явная тенденция снижения скорости реакции плаз-мокоагуляции: время рекальцификации увеличилось на 150%, тромбиновое время - на 208%, время самосборки фибрина - на 268%. Эффект антикоагулянта нарастает в течение первого часа , что характеризуется увеличением ВР на 293%, ТВ на 370%, ВС на 674%, при этом выраженная гипо-коагулемия регистрируется в течение еще 12-ти часов. Обращает на себя внимание то, что по истечении 18-ти часов наряду с нормализацией ВР и ТВ , время самосборки увеличено по отношению к контрольному значению на 318%.

В экспериментах следующей серии мы изучали состояние гемокоагу-ляции в течение 14 дней при ежедневном однократном введении экстракта. Экстракт вводили внутривенно в дозе 960 ЕА/100 г массы в 8-9 ч утра, кровь отбирали через 3 ч после введения экстракта. Для отбора проб крови на каждом этапе опыта использовалась отдельная группа животных.

Результаты опыта показали, что при ежедневном однократном введении экстракта в течении 2-х недель от инъекции к инъекции сдвиги изучаемых показателей практически не изменяются, отклоняясь максимально на 11% после первой инъекцией (для времени рекальцификации), на 14% -для тромбинового времени и времени самосборки мономерного фибрина.

Таким образом, повторные введения экстракта не вызывают ни ослабления, ни существенного усиления эффекта.

Мы использовали экзогенную тромбопластинемию как модель, которая позволяла оценить эффективность исследуемого экстракта из сапропеля

в качестве средства, повышающего толерантность животных к воздействиям, вызывающим активацию тромбиногенеза и, как следствие, внутрисосу-дистое тромбообразование.

В качестве подопытных животных использовались белые крысы. Коммерческий препарат тканевого тромбопластина (активность 20,5 с) вводили в яремную вену в дозе 40 мг/кг массы тела (контрольным животным вводили изотонический раствор хлорида натрия), через 30 мин после предварительного введения экстракта в дозе 960 и 1260 ЕА/100 г массы тела животного. Регистрировали количество погибших животных в каждой группе, а также время наступления их гибели. В предварительных опытах было установлено, что в случае выживания животного от указанной дозы тромбопластина, гибель после 24 часов не наступает, поэтому время наблюдения за подопытными животными было ограничено 24 ч. Полученные результаты представлены в таблице 7.

ТАБЛИЦА 7. Частота гибели животных при введении тромбопластина

Экстракт в дозе, ЕА/100 г Число крыс Выжило Погибло Частота гибели, % Р

Контроль 30 9 21 70,0

Опыт 960 30 22 8 26,6 <0,05

1260 30 28 2 6,6 <0,05

Согласно приведенным в таблице данным, при внутривенном введении подопытным животным тромбопластина (на фоне предварительного введения изотонического раствора хлорида натрия) летальность составила 70%. При этом основная часть животных (14 особей) гибла в течение первых 4-х часов. На фоне предварительного внутривенного введения экстракта из сапропеля в дозе 960 ЕА/100 г массы тела животного, после введения тромбопластина летальность составила 26,6%, а при дозе экстракта 1260 ЕА/100 г - только 6,6%, причем гибель животных (в обеих группах) наблюдалась на протяжении 15 часов. Следовательно, экстракт в дозах 960 и 1260 ЕА/100 г массы тела снижает частоту гибели подопытных животных в 2,6 и 10,5 раза соответственно.

Выводы

1. Установлен новый источник антикоагулянтов прямого действия -сапропель. Содержащиеся в нем антикоагулянты являются веществами рас-

тительного происхождения, в частности, продуктами жизнедеятельности сине-зеленых водорослей.

2. Разработан способ количественного определения антикоагулянт-ной активности во фракциях сапропеля, позволяющий стандартизировать фракции экстрактов по содержанию антикоагулянта.

3. Разработан способ получения и очистки фракции сапропеля с ан-тикоагулянтной активностью, включающий экстракцию 0,14 М водным раствором аммиака, вымораживание, ультрафильтрацию на полупроницаемой мембране и гель-фильтрацию на геле Sephadex G-150. Предложенный способ может явиться основой для полупромышленного получения антикоагулянта (Патент № 2101032 от 10.01.1998).

4. В качестве основного действующего вещества высокоочищенная фракция сапропеля содержит пептид, а в качестве сопутствующих примесей - гуминовые кислоты.

5. Антикоагулянтная активность преимущественно реализуется на III фазе свертывания крови - коагуляционном превращении фибриногена в фибрин. Носитель антикоагулянтной активности ограничивает процесс взаимодействия тромбина с фибриногеном, а также скорость аутополимери-зации фибрина путем образования малоактивных комплексов преимущественно с фибринмономером и полимерами ранней степени зрелости за счет электростатических взаимодействий.

6. Внутривенное введение фракции сапропеля, содержащей антикоагулянт, лабораторным животным вызывает стойкую (до 18 ч), дозозависи-мую гипокоагулемию, не изменяющуюся при ежедневном введении в течении 2-х недель.

7. Превентивное введение фракции сапропеля, содержащей антикоагулянт, лабораторным животным, предупреждает гибель животных от тромбоза, обусловленного инъекцией экзогенного тромбопластина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Яковлева Н.В. /Антикоагулянтная активность фракций экстракта сапропеля //В сб. Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины. - Тюмень. - 1994. - С. 85-86.

2. Платонов Е.В., Яковлева Н.В., Чирятьев Е.А. /Получение антикоагулянтов прямого действия из фракции сапропеля //В межвузовском сб., посвященном 30-летию фарм. фак-та ТГМИ Актуальные проблемы Фармации. - Тюмень. - 1994. - С. 180-180.

3. Яковлева Н.В., Платонов Е.В., Чирятьев Е.А. /Некоторые физико-химические свойства и природа антикоагулянтов прямого действия из фракции сапропеля / /Там же. - С. 189-190.

4. Чирятьев Е.А., Платонов Е.В., Яковлева Н.В. /К механизму ограничения свертывания крови антикоагулянтами из сапропеля //Там же. - С.

5. Яковлева Н.В., Платонов Е.В., Чирятьев Е.А., Зернова С.А. /Способ получения фракции сапропеля, обладающей антикоагулянтной активностью / /Матер. Международного симпозиума «Медицина и охрана здоровья». - Тюмень. - 1995. - Т. 1, С. 83-83.

6. Чирятьев Е.А., Приймак Н.В., Платонов Е.В. и др. /Естественные ингибиторы коагуляционного превращения фибриногена: природа и механизм действия / /Медико-биологический вестник им. Я.Д. Витебского. -Курган-Тюмень. - 1996. - С. 26-27.

7. Чирятьев Е.А., Платонов Е.В., Приймак Н.В. и др. /Новые ингибиторы свертывания крови пептидной природы //В сб. тез. науч-практ. конф., посвященной 25-летию Самарского гос. мед. ун-та. - Самара. - 1996. - С. 257-258.

8. Чирятьев Е.А., Бышевский А.Ш., Яковлева Н.В., Платонов Е.В. /Способ получения средства, обладающего антикоагулянтной активностью //Патент на изобретение №2101023, зарегистрирован в Государственном реестре изобретений 10.01.1998 г.

187-188.