Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антикоагулянты растительного происхождения, природа и механизм действия

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Антикоагулянты растительного происхождения, природа и механизм действия"

РГб од

/ ир, л

Н1СГЕРСТВО ЗДРАВ00ХРАШМЯ РОССЛЙСКСЙ ФЕДЕРАЩ1И БАШКИРСКИЙ ГОСУДАГС/ПЗЕКИШ НЕДЙ11,ИНШ!Й ИНСТИТУТ

На гранях рукопмсн

РУСАКОВА Опьга Александровна

УДК 615.273.53:615.322

АНГИКОАГУЛЯИНТЫ РАСТИТЕЛЬНОГО ГРОИСХОЭДЕШП ПРИРОДА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ

03.СХЗ.04 - Биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой стсмыт кандидата биологических наук

У|м - !!Ш

>

Работа выполнена а Тюменском Гссударстзеьмзм медицинском института

НАУ-Ш4 РУКОВОДИТЕ^ доктор биологических наук, профессор Е.А.Чирятьез

0<ГЩИАЛзН>£ СГПСИЕНТЫ доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки республики Башкортостан Т.Г.Нигматудлин доктор медицинских наук, профессор А.Ш.Бышевсхий

ВЕДУЩЕЕ У^^ОДЕШЕ Санкт-Петербургский НИИ Гематологии и Переливания крози

' ^ '^^^^-^гэдз г.

Защита состоится уу 993 г. з _часов

на заседании специализированного Ученого Ссаета K-GS4.35.02 при Башкирском государственном медицинском институте имени 15-летия ВЖСТ (450СШ, г. Уфа, ул. Ленина, 31.

С диссертацией ознакомиться а библиотеке Башкирс-

кого государственного медицинского института.

Автореферат разослан * 93 г.

Ученый секретерь специализированного Ученого Совета профессор Э.Г.Давлетсз

. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ГРОБЛЕШ. Исследования в области поиска естественна клк создания синтетических средств направленного воздействия на гемостаз не прекрацавтсн уве много лет. he остались в стороне к растения, как источники ееиесгв, модифицирующих гемостаз, среди которых найдены как активаторы /А.Д. Турова. Э.К. Сапокни-коб£, 1963/, так и ингибиторы свертывания крови /В.К. Колхир. С.Я. Соколов, 1982; Hang е.а., 1984/. Однако большинство исследований посвящены поиску средств фармакологической коррекции гемостаза, направленных либо на ограничение трокбкногенеза, дезагрегацию тромбоцитов, либо на якзис уже сформировавшегося фибрина.

Б последние годы показано, что регулирующим воздействиям иокет подвергаться взакыодействке сфорнировавпегося тромбина с фибриногеном и, что особенно ваано, нефермектативный процесс саыосборки фкбрина, т.е. этап, с помощью воздействия на который монет быть реализована последняя возиоеность предотвращения образования тромба /Е.А. Чкрятьев, 1990; A.I. Бышевскнй и соавт., 1991/. Такими эффекторами могли бы слуинть короткоцепочные пептиды, в частности, выделенные кз плазнинового гндролизата фибриногена или фибрина /îakagi, Suzuki, 1979/, из тканей человека и еивотных /Leger е.а., 1985; А.Ш. Бишевскив к соаЕТ., 1990/ или синтезированы в лабораторных условиях /C.B. Зубаи и соаЕТ., 1983; Vincente е.£., 1984/, но большинство из них оказались либо малоэффективными, либо бысокотоксичными.

Единичные работы, выполненные в лаборатории кафедры биохимии Тюменского медицинского института, свидетельствуют о том, что некоторые растения, в частности медуница мягчайшая, могут явиться источником нового фармакологически активного средства, ограничивающего коагуляционные превращения фибриногена /И.Я. Гер-

берт.1990; Я.А. Дементьева. 1991/. Остается актуальным расшиоемае ассортимента растении, соцаряаших подобные вещества, на Разе которых возможно создание принципиально иоаого средства ксорекиии гемостаза, и детальной исследование их влияния на сзертизание крови.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Изучить антикоагуляционнуя активность извлечений из растении ^лоры Сибири, установить накоолее пгсспектизкые зили. выделить антикоа гулянты, изучить *х приезду и охарактеризовать противссзертьгвашуя активность.

ЗАДАЛИ ИССЛЕДС6АНИЯ. 1. Ерозеста скрининг 200 залез »астении злоры Сибири на предмет выявления -з них антикоагуляятоз. опередить наиболее перспективны? зела и аодзвргнуть л:с летальному рас-смстоенки. 2. Разработать особ количеотзеннсгэ определения содержания антиксагуляктоз. 3. Зылелить антиксагулянти з нндианду-альном виде и изучить их химачесху» природу. -V. Изучить механизм ограничения процесса ноагуляционнсго превращения фисрнногена." 5. Дать предварительную оценку состояния гемскоагуляцни лрк внутривенном введении экспериментальны» .зизотним эффектороа из растений.

НАУЧНАЯ НС6ИЗНА. Впервые устаяозлеко, что траза нонеи темной, окопника лекарственного и нонасинета ¡толевого содержа? антякоагу-лянты прямого действия, реализуяшия сзой эффект на этапе коагуля-циояного лреарааеиия фибриногена. Зпераыа определена их химическая природа и провидено сопоставление механизма тооноаяшего фекта in vivo и in vitro.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Пседлсяек сгюсос количественного определения антикоагуляата зо фракциях .экстрактов из трапы ясняи гом-ной, окопника лекарственного ч кривсцвета полевого игоиооятчто?-аая справка на изобретение М 3014961 от 22.03 .'53). позаал.чюкки выражать содержание антнкоагулянта з чесивмх единицам. Сдсесо

позволяет стандартизовать фракции экстрактов по содержанию актикоагулянта.

Выявлены виды растений.флори Сибири, из которых возможно полу~ чение принципиально нового актикоагулянта прямого действия.

Получены данные, которые обосновывают-целесообразность глубокого биохимического к фармакологического исследования препаратов актикоагулянта из травы ноиеи темной, окопника лекарственного к кривоцвета голевого по схеме. предумотренвои фармакологическим комитетом для доклинических испытаний актикоагулянтов прямого действия.

АГР05ДЦИЯ И ПУБЛИКАЦИИ. Основные положения диссертации доло-кены >.г проблемной комиссии "Фармация" Тюменского медицинского института, региональной конференции, посвященной 50-летию фармацевтического факультета Томского медицинского института (Томск, 1991), Всесоюзной науной конференции "Физиология и патология гемостаза'". (Полтава, 1992), опубликованы в материалах названных конференций, а также в сборнике "Обыен вещесть ь норме и патологии' {1952).

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Материалы работы, включая указатель литаргтурк. из.яо£ены ка 3 44 страницах машинописного текста. £• тексте работы содеркитсг. 2Ь рксункэь к 1С таблиц. Диссертация состоит из введений, обзора литературы, главы с описанием материалов в методов исследовании, гласу (солержавей Ь подразделов), ь которой изложены результаты собственных исследований, заключения к ЕизодоЕ.. Указатель литератур!»' представлен 102 отечественными к 136 иностранными авторами.

содержание; работы

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДЭЗШлЙ .■ Сухие экстракты получали спо-сс-бок,. заключавшимся в экстр&киик растительного материала 0,01 К рас:ворэк вккиака в соотнтенм. 1:20 и а кюшесй водяной бане с

— ó —

>6ратным холодильноксм в тэчении i ч, отделении экстракта, лов-горной экстракции там ае объемом зкстрагента, ультоафильграции .'бъедияенного экстракта на мембране гидратцеллюлознон для гемодл-деза Т-100, концентрировании не длализующейся фракции экстракта ,ia ротационном испарителе и высуииаанни з вакуум-сушильном зжафу при температуре 100"С я разренении 0.1 атм. Гомогенные носители днтикоагулянтной активности чз экстрактов получали путем гель-фильтрации не диализутавихся фракций экстоактсз на саОаагкса '3-50 (колонка 20x500 мм.- олюеит - 0,01 М аммонийно-ацетатный буфер, рН 7.6} с последующей рехроматографиеи з тах же условиях фракций, ооладаюцих наиоольаеи антикоагулянткои акткпностью и удалением летучего буфера зыпариваниеа на кипяцеи зодяной бане. Степень гомогенности препаратов оценивали хроматографией зодных растзороз на бумаге FS—2 ÍFiltrak) з системе растворителей бута-иол:уксусная кислота:зола а соотношении 4:I:1 и 4:1:5. на пластинках Siiuíol ÍЧехослозания) а тех ае системах растворителей я пластинках Fixion 50x8 (Хиноин Яадьтетень) з питратяых буферных растворах /Т. Дзвени, Я. Гергей, 1976У, а тзкзе на яидкостном хроматографе высокого давления Миллихром-L по количеству пиков оптической плотности (256 им) после обработки индивидуальных ингибиторов фенилизотиоцианатом (колонка Сеяаоон С-18, злсент метанол :вода 1:1).

Для определения аминокислотного состава носители антикоагулян-тной активности гидролизонали ь М хлороводородной кислотой a сзе-де аргена при ИС'С ч течений 24 ч з поасутстзии С. 01% фенола а /з-меркаптозтанола. Гидролизаты подвергали аминокислотному анализу на автоматическом аминокислотном анализаторе LKB-4101 (Звепия) по одноколоночному методу в трехоуферной натриевой системе на колонке 6x500 мм с ионообменной смолой Durrum DC 6А. Колонку калибровали стандартной смесью 18 аминокислот (Serva)

Количественное содержанке антикоагулянтов (б весовых единицах) оценивали путек измерения степени светспоглоиенкя гидролкзатов ингибиторов, окрашенных кобальт-кингидркковык реактивом в язопро-паколе. при глине еолкк 45Б кк. Расчет количества антикоагулкнток производили по калибровочной кривок. построенной по смеси аминокислот (Реахик), качественный у. количественный состав которой поЕГоряет аминокислотный состаЕ оцениваемых соединении.

Ангккоэгуляктнут активность фракции экстрактов оценивали m vitre н ar; vivo во к>; влияние иг неактивированное время рекаль-икфикатп*., тромбкноБое Еремк, время сакосборки мономерного фибрина пулкроЕакнок плазмы крови донороЕ, стабилизированной 3,8% нат-ркя цитратом 9:1, скорости свертывания фибриногена тромбином, а такае по уровню фибриногена. ПД<3- к малой коагулограмме /В.П. Ба-луда и соавт.,1930/. Результата выражали в значениях эффективности торконеник (i) по фориуле i = l- Vo/VK, где i - эффективность тзрмаьеккя. Vo к Vk - скорость саносборкк в контроле к опыте соответственно.

Препараты гктккаагулккток животным вводили б яремную веку после эфирного наркоза. В опытам: кзпользовано 250 белых беспородны:-; крыс Е возрасте 4 - Ь недель весок 100 - 140 г. Ь пределах одной 'серии опыта вес енвотных ке различался более, чем не 15 г.

Мономеркый фибрин получали кз нефракционированнои бычьей плазмы по Jí.fc. Радзевкч, Е.А. Ходорэвой /1969/. Концентрацию мокомер-ного фибрина определял-/, спектрофотометрически, приникая 'Еоог>=15,67 /Т.П. Угарова, В.А. Велкцер, 1975/. Используемые препараты кономерного фибрина содержали не менее 95% свертываемого белка.

Е составе фракции экстракта оценивали флавоноиды, фенодокисло-ты. кукарины, дубильные вкаества, алкалоиды. восстанавливающие сахара и полисахариды. Качественный анализ проводили на бумаге

FN-2 или пластинках Silufoi з системах растворителей. предназначенных для разделения этих вецестз. с лослец'ухпин их проявлением специфическими реагентами /Н.И. Гри.чкезич, Л.Н. Сафронич, 1.Ч'5, Р. Досон и соаат., 1991/.

Все цифровые материалы подвергнуты математической обработка методами вариационной статистики зля малых рллоа наблюдении /М.Л. Беленький. B.C. Бессмертный, 1967/.

АНТИХОАГУЯЯНТНАЯ АХГИЕНССТЪ ЗКСТРАКТСЗ ИЗ НЕКОТОРЫХ РАСТЕНИЙ ФЯСРЫ СИБИРИ. Зкстсакты готовили как описано з разделе "Материалы л методы исследований'. Сухие экстракту растворяли з Трис-HCi оу-ферном растворе i'0,01 Ч, рН 7.6, 10 чг/мл), контролируя при этса значение рН. Определяли влияние раствсроа экстрактов из 200 растений на зремя рекальцификацхн и троябиновое зремя пулирозанной донорской плазмы. Оказалось, что около 43% исследуемых экстрактов эслее, чем з два раза увеличивали зремя сзертывания рекальцифици-рованной плазмы, и около 19% - громбинсзое зремя. Произвольно нами отдано предпочтение тем растениям. экстракта чз которых задергивали образозанне фибрина з гесте "зреня рекальцафикации" з 2 раза н более с одновременным удлинением тромбннсвого времени з 1,5 раз и более. Исследование экстрактов з тех зе условиях, но з концентрации 2 мг/мл показало, что ч ряде случаен антикоагулянт-ная активность либо исчезала созсем. либо сказывалась ке значительной. 3 итсгэ были определены 10 зидоа растении, которые могла бы представить интерес для дальнейшей работа (.табл. 1).

Далее мы продолжили изучение эффекта разведения экстрактов {от 0,25 до 6 мг/мл) на зремя рекальцификации, трсмбинозоа зремя я самосборку мономерного фибрина".

Зависимости эффективности торможения зремёни рекальцификации от концентрации экстрактоа описываются практически сазаадазг.ижмч менду собой кривыми. Зазисимость эффективности тзрмсяения тромоя-

_ о -

нового времени от концентрации эффекторов для нонеи, кривоцвета окопника и кокачьих лапок такке описывается совпадавшими межд; собой кривыми. Более слабый эффект при всех значениях концентрации экстрактов оказывает рябина. коротка к кукушкин лен, а действие ивы. чевникк и лиственницы не тромбиновое время выражено зкг. чнтельнеи. При концентрации 0,25 - 0,5 мг/мл только экстракты и: нонек кривоцветг и окопнике ограничивают полимеризацию мономеров ъ при более высоких концентрациях Ют 0,75 кг/мл и выше,! слабый тормозящий эффект появляется у экстрактоь из кошачьих лаг.ок, лиственницы. квы к черники. Следовательно, из исследованных нами 200 вндое растений, го-крайней мере, 10 представляются перспективными в в отнесении влияния на свертывание крови, но наиболее эффективными является нонея темная, кривоцвет полевой и окопник лекарственный .

ТАБЛИЦА 1

Влияние экстрактов из растений (2 мг/кл) ка время рекалыдификации и тромОкновое время плазмы крови доноров б % к контролю.

Название растениия Время рекальии- Тромбиновое

оикаиии время

Рябина обыкновенная £15 ........Л ¡ои —Л- и

Коротка обыкновенная 489 " ч 0

Ива Ьредика 296 2 281 й

Черника обыкновенная 2 о У 4 200 С

Кошачьи лапки 641 4 °17 г V»

Ьонея темная 373 с 162 £

Окопниик лекарственный 398 1 70

Кривоцвет полевой 4 203

Лиственница сибирская 10- 5 •159 4

Кукушкин лен 2Ъ'с г, V' 14^ -

ОЧИСТКА И ПРИРОДА АНТИКОАГИБНГОВ ИЗ ЭКСТРАКТОВ НОНЕИ, ТЕМНОЙ, ОКОПНИКА ЛЕКАРСТВЕННОГО И КРИЗОЦВЕТА ПОЛЕВОГО. С целью выбора способов очистки аитикоагулянтов, обеспечения контроля их гомо-

генности, мы провели определение основных групп биологически активных вешесть, содержащихся в-экстрактах, с помощью качественных реакций /Гринкевич Н.К., 1963/. Все три изучавших экстракта содержат одинаковый набор веществ растительного происхождения - по-

лисахариды, флавоноиды. гидролизуемые дубильные зешестза. реиоло-кислоты и нингидринпслснительные соединения. з саязя с чем мы попытались провести дополнительную их очистку с поиоаью фнтохими-ческих методов, включающих экстракции органическими растворителями, хроматографию на бумаге я з тонком слое, колоночную абсообин-онную хроматографию. Это не привело к желаемому результату: очистки либо не происходило, либо сна сзпрсвонлалась значительной потерей антикоагулянтной активности. Неудачной оказалась и попытка освободиться от'балластных зедестз с помоаью ионоосменнои хроматографии на гелях ОЕАЕ Тоуореаг!. ОЕЛЕ ЗерЬааях Л 25 и С.М 2ео11а-аех Л 25.

Более результативным оказалось применение для очистки аитикоа-гулянтов гель-фильтрации на ЗерЬааех с различной степеньз исключения : С—15,. 0-25, С-50 и 0-75 (колонка 20x500 мм, злпент - 0,05 М аммонийно-ацетатный буфер, рН 7,6!. Элюат собирали фракциями по 2 мл, регистрировали оптическую плотность при длине золны 230 на и антиксагулянтнуи активность по влиянию на взаимодействие троа-бина с фибриногеном. Установили, что при использовании Зерпас!ех С-50 антнкоагулянтная активность олзируется за внешним объемом достаточно крутим диком (внешний объем колонки - 15 ал К а основная масса фенольных соединений злиируется в объеме 42-50 мл (ряс. I). Фракции, содераашие антикоагулянт, объединяли, удаляли летучий буфер выпариванием на водяной бане и сухой остаток растворяла а Трис-НС! буферном растворе (0.05 М, рН 7,6) з объеме, равном заеденному в колонку и подвергли анализу, как описано зыше. Оказалось, что выход антикоагулянта составил 66% от исходного, з объединенной фракции полностьп отсутствовали долисахасиды, з незначительных количествах присутствовали фенолокислотн. флавоноиды и дубильные вещества гидролизуе.чой группы. Объединенную активную фракция подвергли рехроматографии з тзх условиях. В этом слу-

час- выход антикоагулянга составил 96% ст внесенного в колонку, а ь активных фракцию; полностью отсутствовали примеси в виде вышеупомянутых соединений, за исключением следовых количеств флавонок-

Ркс. :. Хромгтографнческик профиль актикоггулянтной активности (неярерьгнк&я линия! к оптическо!1. плотности (прерывистая линия) при фракционировании экстракта коней теккои ка Сефадексе . С-50. Абсцисса - объем элвата, кл; ордината слева - эффективность тср-нокения. справа - оптическая плотность.

Данный эксперимент мы повторили с экстрактами акоггнкка лекарственного к кривоивета полевого: получены аналогичные результаты.

Ранее полученные в кашей лаборатории данные /Е.А. Чирятьеь, 1990/ позволили предположить, что носителями антикоггулянтной активности могут явиться соединения пептидно? природы. В пользу такого прсдпояоЕения говорит и то. что при хроматографии экстрактов нг 6у».г:ге оокаруниваетсь нингидринпслогигслъкая зона.которая сохраняется и после очистки экстракта от фенольных соединении, а поеле- кислотного гидролиза возникает спектр свободных аминокислот .

Для определения аминокислотного состава антикоагулянтов мы использовали экстракты, очищенные трехкратной гель-фильтрацией на Бер'пай&х С-50. Оценку гомогенности, гидролиз и анализ гидроли-заток с помощью автоматического аминокислотного анализатора осу-

дестзляли как списано в разделе 'Материалы л четолы" 'табл.

7 А 3 Л И Ц А

Аминокислотный состаз антикоагулячтэв. выделенных из тразы темной, окопника лекарственного ;i кризоцзета полевого

Антик о а г у л чнты из:

Нонеи темной Окопника лекаоствеиногс Кривоцзета полевого

Asp {2 остатка) Asp ¡4 остатка.! Лзр i 2 остатка;

оег ( Ser ¡2 остатка) Ser

Thr í 2 остатка) Ihr i3 остатка) Thr '.2 остатка;

Glu Í2 остаткаJ Glu ib остатков ; Glu 12 остатка)

р ¡™ Р^О

Gly í 2 остатка) Gl'/ < 4 остатка! G1 у ¡ 2 остатка)

Ala ■ 2 остатка,1 Ala ; 4 остатка.1 л1а í." остатка/

Val Val 2 остатка i Val

ils Ha [i¿ ■

Leu Leu L¿u

j y

Gуз : 2 остатка) Gvî

ьуз Lys •остатка.) s

Так:;« образом, антикоагулянта, уыделенные из нонея теммои и кривоцзета полевого, имеет един и тот .не качественный и количественный ами.чокислотныи состав молекулявяал масса составила

1 738 Да. Антикоагулянт из окопника лекаостзенного имеет такой зе набор аминокислот, но существенно отличается лоличестном аминокислотных остатноз; на 1 остаток йодьае содержится ГЬг, аа 2 -Asp, Ser. Ala, Val, Cys a Lys, на i - Glu и Gly. Молекулярная масса этего антикоагуляята составила 2 2?2 Да.

X0/WEC7BEHHCE ОГРЕДЕЛБЧИЕ АЯПХОАГУЛШТСВ ВО ФРАКЦИЯХ 2ХСТ-РАК ICS Н0НВ1 ГЕ'^СЙ, СХСП-ЖА ЛЕКАРСТЕЕЧЮГО И КРИЕОДЗЕТА П0ЛЕ50-ГО. Нами разраСотан способ количественной сценки антикоаг'/ляктов

з очищенных фракциях, заключааяиясч з еледумаем. Готовили смесь аминокислот, хачестзенно и .чсличлстнеинс ловтеолших состаз ангн-коагулянтов из растении. Яосле тщательного яаргчезязания к части смесей, равных по весу 10 чакремоляа янтякоагуляятоз (17. ♦ мг для антикоагулянтсв из нокеи ч кривоцзета и 32,° мг - аля окопника; прибавляли 0,5 мл 0, гг. раствора ккнпшрина з 0,2% тетрагидрот^?-. рацианокобальтата (II) аммония яа ззопреланоле и емеоя зылеэяи:»! -

ли при 60°C e течение 30 икн Образовавшиеся окрашенные сухие остатки растворяли в 5 кл этанола. Кз раствора брали аликвоты в объеме от С,005 до 0,2 кл и доводили их этанолом до объема 5 мл. Полученные серии разЕесении стандартных смесей фотометрировали при длине волны 458 нм в кювете с рабочей гранью 1 см. По результатам полученных данных строили график зависимости величины све-топоглокекия. от концентрации сиесп аминокислот. Эти графики мы использовали в качестве калибровочных при определении концентрации антикоагулянтоь.

Активность высокоочищенных фракций актикоагулянтоЕ стандартизовали к системе, содергащей тромбин и фибриноген. После этого часть ¡уракцкй (по 3 клгидролизовали. как описано выше. Гидролизам количественно переносили на выпарительную чашку и удаляли соляную кислоту ка кипящей водяной бане. С сухим остатком производили те ке операции. что и со стандартной смесью аминокислот. Конечно}'-; операцией являлось определение величины светопсглошения гкдролизатамк антикеггуляктов. Определив величину светопогдощения гидролкзата актикоагулякта. по калибровочному графику находив его концентрацию в молях 4или е весовых единицах').

Вторув часть фракций разбавляли физиологическим раствором в 1,5, 2.0, 2,5, 3.0, 3,5 и 4,0 раза и находили зависимость эффективности ториокеиия скорости взаимодействия тромбина с фибре-ногеном от концентрации антикоагуляпта и строили кривую этой зависимости (ряс. 2), которую использовали как калибровочную при количественном определении антккоагулянтог в последукжкх экспериментах .

МЕХАНИЗМ ОГРАНИЧЕНА СЗЕРТЪВАНКЯ КРОВИ АНТЖОАГУЛШТА® РАСТИТЕЛЬНОГО ГРОГ.аХОЖДЕКИЯ. Во всех последупвдх экспериментах в качестве препаратоз актикоагулянтов использованы фракции экстрактов После однократной хроматографии на геле Sephadex G-50.

С целью исключения влияния фенольных производных на скорость образования фнбриноаого сгустка препараты из растений подвергали трипсиновоку, папаикоЕому и последовательному трипсиново-папаино-вому гидролизу по Т. Дэвенп, Я. Гергей /1976/. Антикоагулянтную активность по зазераекки гидролиза оценивали по влиянию кг скорость взаимодействия фибриногена с тромбином. При тркпсинсвон гидролизе антикоагулякгаая активность сохраняется на 100%.- При папаинооом наблюдается снижение ее активности в среднем на 15-18°». Последовательное- триптяческое и папаиновое переваривание препаратов приводит к практически полной потере актикоагулянтной активности препаргтоЕ - на 92-°4%.

Поскольку февольвые соединения ке содержат езязей, доступных П'ротеолитическии ферментам, иокно утверждать, что антккоагудянт-ньгй эффект препаратов обусловлен наличием в них пептидного материала. При раегшфрозке механизма ограничения свертывающей активности плазмы крови растительными антикоагулянтами прегде всего выяснили, на какой йз этапов свертывания они оказывают преимущественное влияние. Для этого пулированнута цитратную плазму доноров делили на две части. Одну часть подвергли дефибринировашпо

нагреванием ка водяной баке (56°С. 3 мин), из другой фибриноген удаляли высаливанием сульфатом натрия (8% насыщения), отделяли фибриноген центрифугированием и надосадок тотчас диалкзовали против больного количества физиологического раствора при 2°С в течение 20 ч. Полученная подобнш образом плазма не теряла способности генерировать тромбин: добавление к плазгле,. активированной кальцием (Са^-*") или тромбопластян-кальциевой смесью (ТКС), фибриногена, вызывает свертывание последнего.

Для дифференцированной оценки злияния антикоагулянтов на этапы, соеспечиваюцие тромбиногенез и тромбинзаЕисимое свертывания фибриногена к 0,1 мл дефибринированной одним из вышеописанных способов плазмы прибавляли .0,1 мл раствора фибриногена. 0,1 мл раствора антикоагулянта и 0,1 ил 0,55% Са" или 0.1 мл ТКС, приготовленной как рекомендовано З.П. Балуда и соавт. /1980/ (оценивается возможный суммарный эффект актикоагулянтов ка свертывающий потенциал плазмы крови). В контроле антикоагулянты занещали равным объемом физиологического раствора.

В другой серии экспериментов к 0,1 мл дефибринированной плазмы прибавляли 0,1 ял Са+"'~ или ТКС и инкубировали в течение Бремени, достаточном для образования тромбина. После завершения активации плазмокоагуляции к смеси прибавляли г.о 0,1 мл растворов антикоагулянта к фибриногена. 8 контроле антикоагулянт заменяли ¡¡а физиологический раствор. Эта часть экспериментов позволяет оценить эффект ингибиторов только аа тромбанзависимое превращение фибриногена. Для исключения ошибки, связанной с зозмоаной частичной инактивацией ф.У, во все пробы добавляли концентрат ф.У, полученный по Я.В. Зеляк, £.1. Ходоровой /1957/.

Как следует из таблицы 3. растительные антикоагулянты ис но-кеи, окопника и кривоцвета преимущественный эффект оказызаят на пап тромбин зависимого превращения фибриногена, и, а существенно

меньшей степени, на этапы, проднествуюаие образован:® тромбине..

ТАБЛИЦ Л 3

Эффективность мрмояення свертывания фибриногеяг при внесекш: растительных антикоагуляктов в тромбинтенеркруюцую систему (де-фибринированную нагреванием плазму) до и после образования тромбина

Ангико- ~ 1 й Т И К О А /г У Л Я Н 7 В' К Е С £ К агулянт

кз .... Одномоментно с книаи- По завершении тромбиноге-

б кон- ацкей грокбиногенеза неза

центра-

цяио (кг/мл 1ро,чбиксгенез инициирован

10'5) Са ТКС Са ТКС

ЕШЕ1ГТШШ ~

0,16 0,70*0,02 0Г54*0.ОС" 0,52-0,008" 0,40-0,00"

0,20 0,72-0,005" 0,56^,03" 0,53=^0.00" 0,44-0,004"

0.29 0,75*0,032" 0,65^0,02" 0,65*0,03" 0,59-0,00"

ОКОПНИКА ЛЕКАРСТВЕННОГО

0,39 0,57^0,03 0.44-0,009 0.56:!-0,02 0.42-0,01

С',50 0,63-0,04 0,46-0,025 0,63^0,04 0,45-0,00

0,68 0,68-0.04 0,50-0.04 0.72-0,06 0,48-0,00

КРИВОЦБЕТА ПОЛЕВОГО -

0,17 0,56г0,00" 0,48-0,01" 0.50-0,00" 0,42*0,00"

0.22 0,60-0,06 0.44-0,00 0.55-0,03 0,4с-0.04

0.30 0,64-0.042 0,49^0,04 0,61-0,02 0,46-0,06

Примечание: здесь к далее знаком " помечены достоверно различавшиеся между собой данные СР<0.05>

При проведении подобного эксперимента, в котором в качестве тромбивгенерирушей смеси служила плазма крон!':, освобожденная от фибриногена высаливанием, получена сходные результаты. Актикоагу-лянт из окопника оказывал влияние только на этап тромоикзависимо-го преврашен'кя фибриногена, г ингибиторы из ноне-к и кривоцвета -как на этапы, предшествующие тромбиносбразовакию (в объеме 5-10« от общего антикоагулянтного эффекта), так и на заключительный этап свертывания крови, восприимчивость которого к антикоагулян-' там составила от 90 до 95%.

Взаимодействие тромбина с фибриногеном включает в себя два этапа: ферментативный, приводящий к образов-анию мономерного фибрина, и непосредственно самосборку'мономеров. Влияние ингибиторов на самосборку »окно считать установленной. Для уточнения ю:

влияния на ферментативный этап ш инкубировали при 37°С раствор фибриногена (120 мг/мл) в 0,14 И растворе хлорида натрия, содержащем тромбин (1,5 мг/мл)-и мочевину (3,3 М), предотвращающую самосборку мономерного фибрина. Через равные интервалы времени отбирали аликвоты смеси, провоцировали в них самосборку фибрина разбазлением боратнкм буфером (pH 7,6, 0,075 М) и фиксировали момент образования сгустка. Б части опытов ингибиторы (3,0-10 3,3» Ю-"3 и 7,5-10~J мг/мл из нонеи, кривоцвета и окопника соответственно) добавляли в реакционную смесь одновременно с тромбином (оценивается их суммарное влияние на ферментативную и не-

феркентативную фазы превращений фибриногена), в другой части ин-

-Ч -я -ч

гибиторы (1,0-10 , 1,1*10 а 2,5-10 ° иг/ мл соответственной

вносили в момент провокации самосборки - в этом случае они влияют

только на полимеризацию мономерного фибрина (на рис. 3 приведены

данные для нонеи темной).

Рис. 3. Зависимость скорости самосборки фибрина от продолжительности инкубации смеси фибриноген-тромбин. Абсцисса -' продолжительность- инкубация, мин; ордината - скорость реакции. 1 - ингибитор отсутствует в реакционной смеси, 2 - ингибитор внесен- в реакционную смесь одновременно с тромбином, 3 - ингибитор внесен одновременно е провокацией самосборка.

Как следует из ртсунка 3 ингибитор из нонеи тормозит обе стадии превращений фибриногена: график скорости суммарной реакции (кривая 2) находится ниже графика скорости реакции, протекающей

при воздействии ингибитора только на этап самосборки фибрина. Аналогичная каптина наблюдается при использовании ингибитора, полученного из кривоцвета полевого и окопника лекарственного.

Б то же время несомненно преикувественное влияние изучаемых ингибиторов на аутополимеризацию мономерного фибрина. Так, если принять за 100%-ю реализацию антикоагулянтного эффекта ингибитора из нонеи опыт, в котором ограничиваются обе фазы коагуляционного превращения фибриногена, то на долю торможения самосборки приходится около 57% от общего антикоагулянтного эффекта, а при использовании в качестве эффекторов антикоагулянтов из кривоцвета к окопника в изученных концентрациях - 94 и 90% соответственно.

Самосборка мономерного фибрина также Еклвчает в себя два этапа: формирование из" мономеров протофибрилл и последующую их агрегацию.

Мы исследовали влияние ингибиторов на самосборку мономерного фибрина по методу, предложенному В.Д.. Блицером /1975/, суть которого . заключается б том, что эффекторы вносят в реакционную смесь (раствор мономерного фибрина) в разные интервалы времени от момента инициации процесса, т.е. от монента разведения фибрннмоно-мера. Это позволяет различить в ней два этапа - до к после внесения ингибитора. и использовать графический способ анализа в системе координат, где абсиисса - сбиая продолжительность этапа до внесения ингибитора, ордината - экспериментально установленное время образования фибрина при внесении ингибитора в разные сроки от начала процесса. Точки, соответствующие времени самосборки при Внесении ингибиторов в иомеят инициации процесса (Т2) к в момент его завершения (Т^> соединены пряной, которая характеризует изменение времени самосборки в случае, если все ее этапы равно чувствительны к действии ингибиторов. Экспериментально установленное время самосборки прй запаздыващек внесении ингибиторов представ-

лено кривой (а), которая отражает неодинаковую чувствительность разных этапов процесса самосборки к действию изучаемых эффекторов. Прерывистой линий представлено время самосборки нономерного фибрина в контроле (рис. 4).

Рис. 4. Время самосборки фибрина в опытах с знесением ингибиторов в разные сроки от начала процесса. Пояснения в тексте Ингибитор получен из нонеи тем-15 30 с ной.

Как видно из рисунка 4 экспериментальная кривая отклоняется вниз от теоретической, что свидетельствует о неодинаковой чувствительности к ингибиторам разных эталон процесса самосборки. Представленные выше данные с полной определенностью свидетельствует, что наиболее восприимчивы к действию ингибиторов мономеры фибрина н его олигоиеры, а по мере созревания протофибрилл инги-бирухщий эффект антикоагулянтов снизается и по истечении 62,5% времени, необходимого для завершения образования фибрина, действие на процесс самосборки .ингибитора из яонеи прекращатся. Для ингибиторов из кривоцзета и окопника этот период составил 77,5 и 88.9% соответственно от общей продолжительности этого процесса а целом, что подтвердило высказанное выше предполсаение о преимущественном влиянии изучаемых антикоагулянтоБ на начальные этапы неферментатавного процесса коагуляционного превращения фибриногена.

Анализ аминокислотного состава пептидов показывает, что ияги-

битеры, полученные из нонеи н крнвоцвота на 41,2% состоят из азл:-яоккслот. -функциональные группы которых способны к диссоциации г Физиологических услоЕиях. У ингибитора из окопника этот показатель еше выше - 46,9%. В связи с этим наиболее вероятным представляется участие , электростатических сил в обеспечении?! взаимодействия ингибиторов с мономерным фибрином. Это предположение проверено путем изменения рК среды, в которой происходит комплек-сообразование ингибиторов и субстрата (ряс. 5).

6.0 6,5 7,0 7,5 8,0 рН среды (абсцисса).

Как видно из рисунка 5.эффективность торконення скорости самосборки фибрина нарастает с повышением рК, достигая максимума при значении, близком к 7,6, и не изменяясь при рп от 7,6 до 9,0. что . свидетельствует о роли электростатических взаимодействий ь образовании комплекса ингибитор-фибрин. Из этого ее эксперименте следует, что со стороны ингибитора но -взаимодействии приникают участие отрицательно заряненные функциональные группы - повышение их степени диссоциации приводит к увеличению степени эффективности торможения, а при полной ш; диссоциации (щелочная зона) эффективность торможения не изменяется.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ 0ЦЕКА СОСТОЯНИЯ ПЛАЗШСОАКУЛЯДИИ ПРИ ВНУТРИВЕННО',! СВЕДЕНИИ РДСТИТЕПЬКУХ АКТККОАГУДШТОВ ЛАБОРАТОРНОМ ЖИ20Т-[2;"!. Прежде всего ки выяснили, влияют ли на • свертнЕаЕщув гктив-

0.5

гибитораки, полученными кз нонеи (1), крквопвета (2) и окопника (3) от рН

Рис. 5. Зависимость эф-фективностии термонения

самосборки (ордината) ин-

ность плазмы балластные вещества, содеряащиеся в препаратах антикоагулянтов, использующихся для внутривенных инъекций. Для этого группе нивотяых инъецировали-фракции экстракта, полученного из нонеи ■ (см. стр. 13) в дозе 14,4*10 мг/кг массы животного (п=5, опыт 1), другой - то не количество антикоагулянта, но после предварительного трипсиново-папаинового гидролиза (п=5, опыт 2). Контрольным животным вводили растворитель. Отбор проб крови производили через 30 я 180 мин после инъекции. Время рекальцификаци (ВР) и тромбиновое время (ТВ) з контроле составило 96+3 с и 24±2 с соответственно. Б опыте 1 через 30 мин после введения ВР аозрасло до 182+4 с. ТВ - до 36+3 с (в опыте 2 - 98±3 и 26 + 3 с соответственно), а через 3 ч ВР составило 195+4 с, ТВ - 2213 с (опыт 2 -98±2 и 26+2 с соответственно). Следовательно, балласт не оказывает влияния на плазмоноагуляиию.

Наглядно проявление антикоагуляятной активности демонстрируется при анализе аутокоагуляционного теста (АКТ) после введения ла-оораторным животным ингибитора яз нонеи в дозе 20,0-10 мг/кг (отбор проб крови через 1 ч после инъекции) (рис. 6). В контроле аивотным вводили растворитель.

Как следует аз рис. 6, в опыте уменьшилась максимальная свертывающая активность {НЛ2) на 68%, время достижения максимальной свертывающей активности (Т2) возрасло на 225%. Подробно проанализировать аутокоагулограмыу не представляется возможным из-за специфичности дейстзиия антикоагулянта, но приведенные данные с полной определенностью свидетельствуют о существенном замедлении свертывания крови, наступающем в следствие внутривенного введения антикоагулянта.

Далее животным вводили фракцию экстракта из нонеи темной з дозе 10,2*10 л мг пептида/кг массы и производили отбор проб в разные сроки после инъекции. Определяли ВР, ТЗ, время самосборки

фибрина в плагме (ЕС), количество -фибриногена (ФГ) к продуктов деградации!! фибриногена/фибрина (ПДФ) (табл. 4).

С, с

Рис. 6. Аутокоагулограикз лабораторных шивотних до (1) и пойте (2) введения антиксагулянта кз' нонек. темной. Пояснения в тексте.

Как видно из таблицы 4, БР возрастает уке на 3 кин после инъ-екци актикоагулянта, достигая максимума в период между 1 и 3 ч, снижаясь к 18 ч, но оставаясь*достоверно вкше контрольного значения. ТВ было также удлинено, но з векькей степени и не столь про, далжительно. БС удлинилось наиболее значительно, оставаясь собственно выше контрольного и через 15 ч после инъекции (а о,4 раза) . Уровень фибриногена достоверно ке изменился. ко имел тенденцию к снижению. Количество ПДФ возраслз в герксд с 1 по 6 ч.

ТАБЛИЦА л

5?, ТЕ. ВС. ФГ к ПД<1' к разные срока после введения апткксыугчзтг кз нонек темной, (п = 40'

ироои .

орали - - - --

через: Б?, с

]ПГГГТ1ГГТТТПГ2 1ПГГТ~ТТТТХь~ ТВ, с ЕС, с £Г, г/л ПДФ, кг;

Контроль 2Ьт.2,2 44±4.0 тг-, 5-0, о (.

3 мин 112=6.0" 34*2.0" 172+6,0" 23, 6±0.5 8. .0+-0. ,3

1 ч 162=3,5" 220±8,0~ 20, 1+0.3 .к. .о-, о.

3 ч 155+2,0" За±2.0" 565+16. С." 20, 0+0,С 12, , 9-0.

г. ч 14 ¥ г 4,0" 3?, 7+0,5 3 3, , 5-0, 4"

12 ч 3 50+ 6.0" 24=2 ,4 2-29+12 .0' 20. 2=0.6 1 Л .210, 7"

18 ч 13 ОгО,3" 2510,0 ■ 2&0;9,С~ 19, 51.0.5 ' 0г0, 0

Б следующей серии эксперимент:о? тгьучилк :и,20г,г»ш5сйкист1, гптк-

коагулянтного эффекта: антиноагулянт, полученный из нонея (5,2-10 , 14,4-10 , 20,0-10 " и 26.0-10 6 мг пептида/кг массы животного), вводили а яремную вену, отбирали пробы крови через 1 ч после инъекция (на максимуме аяткксагулянтного эффекта) и определяли те не показатели (табл.5).

Т А 5 Я И Ц А 5

Изменения ЗР, ТБ, БС, -ФГ и ПДч> при введении антиксагулякта из нолей з различных дозах

ЦозПнтй^ ДЕЛЯЕ.МЫИ 1ГТТТТ1ГТТТ^

коагулянта, -----------------------------

иг»10~^ пептида ВР,с ТЗ.с ВС.с ФГ.г/л !Ш.мг*

КшТроль 4о?4"72 ¿072^1 Г77ТЛ7Г

5.2 5Ы,5~ 23:0.3 63:5.3" 20,0:0.5 о.4:0.3

14.4 187:3,5" 36:1.3" . 180=6,7" 17,4:0,3 10.2:0.5"

20,0 192±4,0" 38:2.1" 240±6.0" 17,0:0,7 11.4:0,3"

26,0 220±3,5" ' 42:2,6" 320:6,7" 17,2:0,5 10.3:0.4"

Как следует из таблицы 5, наблюдается достаточно выраженная дозозависимость анткоагулянтного эффекта: ар.-и возрастании дозы антикоагулянта в 5 раз ВР возрастает в 4.3, ТВ - в 1,8, БС - з 5,1 раза, уровень фибриногена достоверно не изменяется, хотя наблюдается -тенденция к его снизению, количество ПДФ возрастает з 1,6.

Той же направленности результаты были получены при использовании антикоагулянтов из кривоцвета полевого и окопника лекарствен- ■ ноге.

ВЫВОДЫ

1. Растения флоры Сибири содеркат антикоагулянты пряного действия . Наибольшим содержанием антикоагулянтов отличаются нонея темная, оког.ник лекарственный и кривоцвет полевой.

2. Разработан способ количественного определения аитккоагуляптов во фракциях экстрактов из нонеи темной, кривоцвета полевого я окопника лекарственного, позволяющий стандартизовать фракции экстрактов по содерйанкю ангикоагулянгов.

3. Носителями ангикоагулянгной активности является пептиды, содераащне Asp (2 остатка), Ser, Ihr (2 остатка), Glu (2 остатка), Pro, Gly (2 остатка), Ala (2 остатка), Val, Ile, Leu, Gys, Lys (нонея темная и кривоцвет полевой); Азр (4 остатка), Ser (2 остатка), Thr (3 остатка), Glu (6 остатков), Pro (1 остаток), Gly (4 остатка). Ala (4 остатка), Val (2 остатка), Не, Leu, Gys (2 остатка). Lys (2 остатка) (окспезк лекарственный).

"4. Антикоагулянты кз нонеи текной, крявсцпета полевого н окопника лекарственного необраткко ограничивает нефермекгагггвнай гтап процесса коагуляционного превращения фибриногена - скорость самосборки мономерного фибрина й.полккеров ранней степени ера-лости - путем образования калоактивных кокплексоз за счет электростатических взаимодействий.

5. Внутривенное введение антикоагулянтов лабораторный Еивог:аа4 вызывает стойкуо (до 16 ч), дозозависимую гкпокоагулеккю.

СШССК РАБОТ, СПУБЛкКОВАННЫХ ПО ТВ,iE ДИССЕРТАЦИЯ

1. Чирятьев Е.А., Левей П.И. Герберт И.Я. Дементьева И.А. Ба

лабанова Л.Ф. Русакова O.A. Шаяырина A.A. /Изучение ингибиторов свертывания крови растительного происхоадениия //Тез. дскл. Томск. - 1991. - С. 201-202.

2. Русакова O.A. Растения флоры Сибири как источники антикоагулянтов прямого действия // В сб. Обмен веществ в норые и патологии.- Тюмень. - 1992. - С. 84-84.

3. Чирятьев Е.А. Русакова O.A. К механизму ограничения реакции тромбина с фибриногеном ингибиторами растительного происхоадения // Тан ае. - С. 112-112.

4. Балабанова Л.Ф. Русакова O.A. Чирятьев Е.А. Ингибитор коа-гуляцнонного превращения фибриногена из полыни обыкновенной //В сб. Фазиологня и патология перекасного окисления липидов. гемостаза я иммуногенеза. - Полтава. - 1992. - С. 4-4.

5. Русакова O.A. Балабанова Л.Ф. Чирятьев Е.А. Ограничение свертывавшей активности крови ингибиторами растительного происхождения //Там же. - С. 71-71.

6. Русакова O.A., Наиб Я.Д., Чирятьев Е.А., Чабанов М.К. Природа и некоторые свойства антикоагулянта прямого действия растительного происхоадення // В сб: тгз. меавузовскои .и 49 науч.-пргкт. хонф. проф.-преп. состава. - Пермь. 1993. - С 122-123.

7. Русакова O.A., Миколэнко Л.Ф., Кайб И.Д.. Чирятьев Е.А. Растения флоры Сибири как источники антикоагулянтоа прямого действия. // Тая se. - С. 124-125.