Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Природа и свойства антикоагулянтов из сабельника болотного

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Природа и свойства антикоагулянтов из сабельника болотного"

""""СГЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

Нохрина Наталья Эдуардовна

УДК 615.273.53 : 615.322

ПРИРОДА И СВОЙСТВА АНТИКОАГУЛЯНТОВ -ИЗ САБЕЛЬНИКА БОЛОТНОГО

03. 00. 04 - биологиче 'ая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа - 1993

Работа выполнена на кафедре биологической химии в Тюменском государственном медицинском институте

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ доктор медицинских наук, профессор А.Ш.Бышевский

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ доктор биологических наук, профессор Е.А.Чирятьев

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских наук,

профессор Р.И.Лифшиц доктор биологических наук, профессор Р.Р.Ахметов

БУДУЩЕЮ УЧЕРЕВДШИЕ Всероссийский гематологический Научный Центр (БГНЦ), Москва

Защита состоится "_" _ 1993 г. в_

часов на заседании специализированного Ученого Совета К 084. 35. 02 при Башкирском государственном медицинском

институте имени 15-летия ЕЛКСМ/450000, г.Уфа, ул.Ленина, 3/

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного медицинского института

Автореферат разослан " " 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета, профессор

Э.Г.Давлетов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Тромбоэмболии сопровождают заболевания сердечно-сосудистой системы, являясь наиболее распространенным осложнением и нередко служат причиной., тяжелых-исходов' /В. М. 1кнченко, 1970;._3. С.Баркаган, 196«/. Часто встречаются тромбозм-— болические состояния и в хирургической практике /Б.В. Петровский и др., 1961/. Растет коагуляционная активность крови при гиподинамии /В.Л.Скипетров и др., 1961/, вообще при экстремальных воздействиях /А.Ш.Вышевский, В.Н.Кожевников, 1566/. Наклонность к громбообразованию при перечисленных состояниях - следствие чрезмерной активации свертывания или результат недостаточности про-швосвертываюшего потенциала /В. (1. Скипетров, В.И.Куэник, 1У73/.

Предупреждение и коррекция тромбогемморагий достигается с помошью антикоагулянтов. Одни из них угнетают биосинтез факторов свертывания (антибиотики и цитостатики), другие тормозят формирование -зависимых прокоагулянтов на пострибосомальной стадии (антивитамины К), что обеспечивает медленно развивающуюся стабильную гипокоагулемию. Практическая медицина требует, как правило, быстрого эффекта, обеспечиваемого антикоагулянтами прямого действия. С этой целью чаще других применяется гепарин, отличающийся сильным, но кратковременным действием /Б.А.Кудряшов и др., 1981/. Хотя гепарин и является средством выбора, он не лишен ряда недостатков. К ним можно отнести способность вызывать агрегацию тромбоцитов / ЗаЪа е.а. , 1979/ И тромбоцитопению / Ргапгапх е.а., 1975/. Существует и устойчивость к гепарину /3.С.Баркаган и др., 19Ь2, 1988/, нередко отмечаются тромбоэмболические осложнения после отмены гепарина - "эффект бумеранга" /ыогаоп е.а. , 1981/. Можно контролировать внутрисосудиетое свертывание крови на этапе самосборки фибрина, не имеющем, в отличие от предыдущих стадий альтернативных путей /А.Ш.Вышевский и др., 1986/. На это указывают данные о способности фрагмента Д молекулы фибриногена замедлять самосборку. Аналогично действие пептидов с последовательностью С1у-Рго-А^-/Киуаа' г,оо111;'(;1е , 1983; ¡Лiгaglia , Сгее-

пЬеге , 1985/. Их недостаток - быстрая элиминация из кровотока /Г.Л.Чипенс, 1982/, которую не устраняет модификация структуры / Киуаз, ЬооПШо , 1983/.

В плазме крови человека и высших животных обнаружены пептиды с указанной последовательностью /А.Ш.Вышевский и др., 1986/. Они тормозят самосборку, взаимодействуя с мономерным фибрином /Е.А.Чирятьев и др., 1989/ и при введении в кровоток вызывают, к сожалению, лишь кратковременную гипокоагулемию, что также обусловлено быстрой их элиминацией /Е.А. Чирятьев, 1990/.

В лабораториях кафедр биохимии, фармакогнозии и фармакологии Тюменского медицинского института установлено наличие в экстрактах некоторых растений Западной Сибири пептида, сходного по аминокислотному набору с пептидами животного происхождения /Е.А. Чирятьев и др., 1989/.

Перспективный источник пептида-антикоагулянта - трава сабельника болотного. Ее водные извлечения, полученные в виде сухого экстракта, длительно сохраняют противосвертывающую активность. Наши предварительные исследования указали на целесообразность изучения травы сабельника болотного в качестве источника антикоагулянта, действующего на уровне заключительной фазы свертывания.

Цель работы. Установление химической природы противосверты-ваюшего компонента водных экстрактов из травы сабельника болотного, изучение механизмов его влияния на гемокоагуляцию in vitro и в организме животных.

Задачи.исследования.

1. Выделение и очистка противосвертываюшего компонента из водных экстрактов сабельника болотного.

2. ^учение химической природы антикоагулянта.

3. Установление этапа свертывания, лимитируемого антикоагулянтом.

4. Изучение влияния экстрактов, обогащенных антикоагулянтом на свертывание крови в эксперименте.

5. Изучение влияния этих же экстрактов на течение экспериментальных гиперкоагулемий.

Научная новизна. Впервые установлено, что при диализе водно-аммиачного экстракта сабельника через целлофан Т-ЮО недиализую-шая фракция сохраняет более 5(% противосвертывающей активности, свойственной первичному экстракту, и что сухой экстракт из недиа-лизуюшейся фракции, хорошо растворяется в воде и 0,14 М растворе хлорида натрия, отличаясь высокой противосвертывающей активностью, не влияя при однократном и многократном введении на морфологические показатели крови, на вьщелительную функцию почек и на вес внутренних органов.

Впервые установлено, что противосвертываюшая активность не-диалиэующейся фракции экстракта связана с пептидами, отличающимися высоким содержанием аминокислотных остатков с радикалами, способными к ионизации в физиологических условиях. Показано также, что большие дозы экстракта при внутривенных инъекциях вызывают кровотечения, приводящие к гибели, а при других путях введения не вызывают кровоточивости, не оказывают токсического действия.

Практическая ценность. Получены данные, свидетельствующие о целесообразное , i и необходимости глубокого фармакологического исследования преь фатов из травы сабельника болотного, по схеме, предусмотренное Фармакологическим комитетом для доклинических испытаний 'ангикоагулянтов прямого действия.

Апробации и публикации. Материалы работы доложены на конференции молодых ученых-медиков и специалистов здравоохранения (Тюмень, 19d8), на Всесоюзной конференции "Новые лекарственные препараты из растений Сибири и .Дальнего Востока" (Томск, 19tí9), на конференции биохимических обществ Урала, Сибири, Поволжья, посвяшенной проблемам биохимии (Пермь, I9ü9), на Всесоюзной конференции молодых ученых "Физиология и патология перекисного окисления липидов, гемостаза и иммуногенеза" (Полтава, 1991, 1992) и конференции "Обмен вешеств в норме и патологии" (Тюмень, 1992).

Структура и объем диссертации. Диссертация представлена на 146 страницах машинописи, содержит 18 рисунков, 23 таблицы, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, выводов и списка литературы (107 отечественных и 105 иностранных источников).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований.Мстительное сырье (трава сабельника болотного) заготавливали в фазу цветения (1989-1990 гг) в окрестностях г.Тюмени, высушивали на открытом воздухе, зашитая от прямого воздействия солнца. В исследованиях использовали сухой экстракт, получая его с помощью разработанного нами способа (см. ниже). Индивидуальный препарат антикоагулянта выделяли хроматографией на колонке с Сефадекс ДЭАЭ А-25; Тойопал HW - 50 (см.ниже). Чистоту препаратов контролировали разделением на бумагерК - II в двойной системе растворителей (н-бутанол-уксусная кислота-вода 4:1:5 и 4:5:1) и на пластинках "Фиксион 50x60". В последнем случае для разделения использовали смесь - пропись № 2 фирменной инструкции (Хиноин-Надтетень). Фракции, содержащие однородный антикоагулянт, обессоливали на колонке с гелем Сефадекс G - 15. Гомогенные антикоагулянты гидролизовали 6 н соляной кислотой в среде аргона при П0°С (24 ч) в присутствии 0,01 фенола и j>- мерка-птоэтанола /Т.Дэвени, Я.Гергей, 1970/.

Аминокислотный состав гидролизатов изучали с помощью автоматического анализатора аминокислот lKB-4I0I (Швеция): для разделения применяли трехбуфврную систему, колонки 6x500 мм, ионообменную смолу Durrum- 6А. В качестве метчиков использована стандартная смесь, содержащая 18 видов аминокислот ( Serva ).

Противосвертываюшую активность изучаемых материалов устанавливали по их влиянию на время рекальцификации, тромбиновое время (Балуда и др., 1980/ и на скорость самосборки фибрина. Результаты выражали в секундах или в значениях эффективности торможения по формуле 1=1- У0/Ук, где I - эффективность торможения, У0 и Ук - скорость реакции в присутствии антикоагулянта и без него (скорость - величина, обратная продолжительности реакции). Умножая эффективность торможения на 100, получали степень торможения в процентах /Л.Уэбб, 1966/. Для выражения активности использовали также условные единицы - ЕА: I ЕА удлиняет время рекальцификации 0,1 мл плазмы в 2 раза.

Скорость самосборки фибрина определяли в системе : 0,4 мл 0,075 М боратного буфера (рН 7,6) +0,1 мл исследуемого материала + 0,1 мл 1.10""^ М раствора мономерного фибрина. В контрольных пробах исследуемый материал заменяли растворителем (0,14 М раствор хлорида натрия, реже - дистиллированная вода - в зависимости от того, в чем растворяли исследуемый материал).

Мономерный фибрин выделяли из нефракционированной бычьей плазмы, обработанной тромбином /И.М.Радзевич, Е.Л.Ходорова, 1969; Е.А.Чирятьев, 1963/.

В опытах все болезненные манипуляции проводили под эфирным наркозом. Всего использованы 1443 белые крысы массой от 110 до 130 г, пробы крови отбирали из яремной вены, в те же вены вводили исследуемый материал.

Состояние обшей свертывающей активности контролировали по значению неактивированного и активированного времени рекальцификации /ВР и АВР/, а также активированного частичного тромбоплас-тинового времени /АЧГВ/ /В.П.Балуда и др., 1980/; общий противо-свертывающий потенциал - по тромбиновому времени плазмы с пересчетом на общую антитромбиновую активность /А.Ш.Еышевский, 1967/, которая позволяет оценить общую антиполимеризационную активность плазмы из индивидуальных проб крови. Фибринолитическую активность устанавливали методом фибриновых пластин /В.П.Балуда и др., 1980/. Протромбиновый комплекс оценивали по В.П.Балуда и др. /1980/. В опытах с провокацией диссеминированного внутрисосудис-того свертывания определяли кроме того содержание продуктов деградации фибрина /да/ /В.И. Шафер, 1989/.

Агрегацию тромбоцитов, индуцируемую АДФ, определяли с помощью агрегометра /В.П.Балуда и др., 1980/. Получение недиализуюшейея фракции экстракта из сабельника.

На основании данных о кислой природе антикоагулянта из тра-

вы сабельника болотного, для получения экстракта использовали водно-аммиачный экстрагент, экспериментально определив оптимальную к |Щентрациш_аммиака,-объем и рН. Применив ультрафильтрацию -на"мембране Т-100, обнаружили, что недиализуюшаяся фракция содержит более 50% суммарной противосвертывагацей активности, менее токсична и не имеет ряда примесей.

Ь окончательном виде способ получения очишенного экстракта сабельника болотного выглядит следующим образом:

1. К 50 г сухой травы сабельника болотного добавляют 500 мл 0,01 ;.1 раствора аммиака и экспонируют на кипяшей водяной бане 1ч;

2. Извлечение процеживают через двойной слой марли и повторяют экстракцию с новой порцией экстрагента, проделывая операцию еще один раз (всего 3 последовательных извлечения);

3) Извлечения объединяют и оставляют в холодильнике на 12 ч;

4. Извлечения упаривают на водяной бане до 50 мл (соотношение к сухой траве 1:1);

5. Объединенный экстракт диализуют против дистиллированной воды через целлофан Т-100 в соотношении 1:50 со сменой диализуе-мой жидкости через 12 ч в течение 72 ч;

6. Недиализуюшиеся фракции объединяют, упаривают на водяной бане до смолообразной консистенции, обрабатывают трижды 5-кратным объемом ацетона;

7. Полученный порошок растворяют в дистиллированной воде, отделяя осадок центрифугированием при I 500 об/мин, 15 мин;

Ь. Сконцентрированный выпариванием надосадок смешивают с 60 мл геля Сефадекс ДЭАЭ-25, уравновешенного 0,05 М аммонийно-ацетатнш буфером (рН 7,6), экспонируют при комнатной температуре 20 мин;

9. Гель, связавший антикоагулянт вносят в колонку (30x120)

и после формирования столбика элюируют, последовательно пропуская буферные растворы (I мл/мин): аммонийно-ацетатный буфер рН 7,50,05 М, рН 7,0 - 0,10 М, рН 6,5 - 0,15 Ы, рН 6,0 - 0,20 М,рН 5,50,25 М, рН 5,0 - 0,30 М, рН 4,5 - 0,35 М (по 100 мл каждый). Последний элюент - I 000 мл;

10. Фракции с антикоагулянтной активностью объединяют и освобождаются от сопутствующих солей фильтрацией на колонке с Сефадекс с- 15. Элюент - аммонийно- ацетатный буфер с рН 7,6 и

0,05 М;

11. После гель-фильтрации на Сефадексе й- 15, фракции с антикоагулянтной активностью объединяют и подвергают гель-фильтрации на колонке с Тойопал Н ж - 50, элюируют аммонийно-ацетат-

- б -

ным буфером с рН 7,6 0,02.М, собирая порции по 2 мл. Порции, содержащие антикоагулянт, объединяют и удаляют растворитель на водяной бане до получения сухого порошка - целевой продукт.

Для сопоставления противосвертываюшей активности экстрактов на животных приготовили растворы суммарного экстракта, его диали-зуйюшейся и недиализуюшейся фракций одинаковые по активности (I ООО ЕА/кг) и их вводили крысам внутривенно.

Т а б л и ц а I.

Эффект внутривенного введения суммарного экстракта, его фракции (по 10 крыс в группе).

Вводили экстракт

Время рекальци-фикации, с_

Тромбиновое время, с

Погибло за 3 ч.

Суммарный экстракт

Недиализуюшаяся фракция

Диализуюшаяся фракция

Контроль (вводили физ. раствор

228,10+1.41 (15^,32+2,16)

205.68+3.BI (I9&,55+2,91)

176.75+4,23 (15!,41+4,11)

6d,5I+I,43 (72,12+1,83)

51.20+1.60 (3§,41+2,II)

47.31+2,65 (43,53+1,d7)

45.21+2.12 (40,21+1,95)

24.31+1,60 (2d,4T+l,SI)

6 из 10

3 из 10

Примечание: Определения проводили тотчас и через I ч после инъекции - в скобках.

На основании полученных данных продолжили изучение недиализуюшейся фракции экстракта сабельника болотного, как отличающейся высокой противосвертываюшей активностью при малой токсичности или ее отсутствии. Существенно, что недиализуюшаяся фракция содержит более 1/2 от суммарной активности общего экстракта.

Оценка обшей токсичности сухого экстракта недиализуюшейся фракции экстракта сабельника болотного.

В первую очередь, мы уточнили данные относительно токсичности экстракта при внутривенном введении (табл.2).

Введение экстракта в дозах 500 и I ООО ЕА/кг массы вызывает устойчивую гипокоагулемию без гибели животных. Гибель наблюдали, начиная с дозы I 500 ЕА/кг через 24 ч после инъекции. С увеличением дозы нарастала частота гибели.

У крыс, погибших после введения больших доз экстракта (2 500 и 3 ООО ЕА/кг), на вскрытии макроскопически обнаружены кровоизлияния (1x2, 1x3, 3x4 мм) в средостении, в нескольких случаях - обширные кровоизлияния в области желудочка сердца, в 2-х случаях - небольшие кровоизлияния в легких, 5 - кровоизлияния в селезенке. У большинства животных обнаружена мелена. Гистологи-

0

ческие исследования подтвердили наличие кровоизлияний.

Т а б л и ц а 2

Результаты наблюдения над животными, получавшими-внутривенно разные дозы экстракта. _______________________

дозы,-йА,кг Лолпчество животных Лз них погибли Время гибели животных Частота гибели, %

250 5 0 не гибли 0,0

500 5 0 не гибли 0,0

I 000 7 0 не гибли 0,0

Т г^л 1 ии^ Ь 10 за 24 ч 47,4

2 000 У 6 за 20 ч об, 6

2 500 в б за 16 ч 100,0

3 000 9 9 за 14 ч 100,0

3 500 5 5 за в ч 100,0

Внутрибрюшинное введение крысам (5 ООО ЕА/кг) экстракта не вызывало гипокоагуляции и не изменяло поведения животных. Это убедило нас в том, что гибель животных при введении больших доз экстракта вызвана кровоточивостью, тем более, что кровотечения во внутренние органы присуши антикоагулянтам при их передозировке /Е.М.Чазов, К.М.Лакин, 1977/.

фи ежедневном введении экстракта (5 ООО ЕА/кг в сутки, 10 дней) прирост массы тела в контроле и опыте практически одинаков (0,30 и 0,23 г/сут), несушественно изменился вес легких, сердца, селезенки, почек; показателей клеток крови. Не отразилось 10-дневное введение экстракта и на выделительной функции почек (табл.3).

Достаточная чувствительность и специфичность используемых тес-юв /И.В.Саноцкий, 1970, 1976/ позволили отказаться от более детального исследования в этом направлении.

Микроструктура печени, почек, тонкого кишечника, селезенки, легких, сердца у крыс, получавших по 5 000 ЕА/кг экстракта внутри-брюшинно (10 дней) одинакова с контрольными.

Представленные данные свидетельствуют о низкой токсичности экстракта, тем более, что исследуемые дозы экстракта в 3-7 раз выше эффективной.

Механизм противосвертываюшего действия недиализуюшейся фракции Для ориентировочной оценки ступени ферментативного каскада свертывания, на которой реализуется противосвертываюший эффект недиализуюшейся фракции экстракта, провели опыты с протромбиновым комплексом, добавляя к нему экстракт в разные интервалы после инициации тромбиногенеза (табл.4). Оказалось, что торможение лишь на 22% реализуется за счет влияния на тромбинообразование, а 78$

эффекта связаны с влиянием ингибитора на коагуляционные превращения фибриногена.

ТаблицаЗ

Влияние экстракта сабельника болотного на диурез и состав мочи после введения водно-солевой нагрузки (5 ООО ЕА/кг, 10 дней внутрибрюшинно).

Показатели Контроль Опыт Р

Объем мочи, выделившейся за 3 ч, мл 4,4±0,5 5,5*0,7 0,05

Белок, г/л 0,72±0,01 0,83*0,09 0,05

Сахар не рН открывается 5,9*0,2 не открывается 4,8*0,4 0,05

¡эпителиальные клетки в п/з 3-4 4-5

Лейкоциты, в п/з 2-3 1-2

Таблица4 Влияние исоледуемого экстракта на тромбиногенез в зависимости от интервала между инициацией процесса и внесением экстракта.

Интервал между инициацией тромбиногенеза и внесением экстракта, мин ьремя свертывания ителень торможе-фибриногена, с ния (против контроля, %)

Контроль (без ингибитора) Без интервала I мин 14,2*0,4 75,8*0,7 74,1*1,2 0,0 81,3 80,8

3 мин 71,4*0,8 80,1

5 мин 65,0*0,9 78,1

10 мин 55,2*0,8 74,3

20 мин 41,8*1,2 66,1

30 мин ■ 37,6*1,2 62,3

Далее мы изучали зависимость скорости самосборки мономерного фибрина от концентрации экстракта (Р^с.1) от рН и ионной силы, а также влияние экстракта на продолжительность самосборки в цельной плазме. Скорость самосборки падает пропорционально увеличению концентрации экстракта сабельника и при достаточно высокой концентрации приближается к нулю, максимальный эффект ингибитора - при рН 7,8 (Рис.2), эффективность самосборки тем выше, чем выше ионная сила (Рис.3).

В плазме концентрационная зависимость повторяет обнаруженную в "чистой" системе (в растворе фибринмономера)/сравнить рис.4 и I/. Это подтверждает преимущественное влияние экстракта на самосборку.

УсV&оо

то] 50.

30

,0 ^ы»,,^ Рис.4. Зависимость самосбор-

- ки фибрина в плазме (ордина-

..... та) от концентрации экстрак-

'-?5-¿5 'вл/мк*" та (абцисса).

• Итак, антикоагулянт из недиализуюшейся фракции экстракта сабельника болотного, тормозит преимущественно коагуляционные превращения фибриногена, главным образом, самосборку фибрина. На это указывают результаты опытов с добавлением экстракта в изолированные фибринобразуюшие системы на разных стадиях процесса (в разные сроки от его инициации), а также сходство кривых зависимости торможения от концентрации экстракта в опытах с цельной плазмой и в системе, содержащей только фибриноген и тромбин.

По механизму действия антикоагулянт сходен с пептидами животного происхождения, которые тормозят самосборку, образуя ас-социаты с мономерным фибрином /Е.А.Чирятьев, 1990/. На это указывают рН- зависимости и зависимость от ионной силы. Можно предположить, что торможение ферментативного этапа превращений фибриногена реализуется путем образования неактивных ассоциатов ингибитора либо с ферментом (тромбином), либо с субстратом (фибриногеном) .

В случае хранения экстракта при комнатной температуре активность незначительно падает через 2 и заметнее через 3 года, а при -16®С - не изменяется в течение 2-х лет.

Природа антикоагулянтов из недиализуюшейся фракции экстракта

Раствор сухого экстракта первоначально подвергли хроматографии (Сефадекс ДЭАЭ А-25). Элюент - аммонийно-ацетатный буфер: рН 7,5-0,05 М, рН 7,0 - 0,10 М, рН 6,5 - 0,15 М, рН 6,0- 0,20 М, рН 5,5 - 0,25 М, рН 5,0 - 0,30 М, рН 4,5 - 0,35 М. Элюент собирали порциями по 2 мл, контролируя выход антикоагулянта по влиянию

- II -

на время свертывания рекальцифицированной плазмы.

Для обессоливания антикоагулянта использовали колонку с Сефадексом_о-15_(265х30). олюент - аммонийно-ацетатный буфер с — рН 7,6 , 0,02 М. Злюаты собирали по 2 мл и контролировали выход антикоагулянта по торможению самосборки фибрина. Профиль антикоагулянта - пик с плоской вершиной. При регель-фильтрации (Тойо-пал Нда - 50, 16x340 мм, элюент - аммонийно-ацетатный буфер с рН 7,6, 0,02 М; хроматограф высокого давления) собирали элюент по 2 мл, определяя антикоагулянтную активность п оптическую плотность при 254 нм. Антикоагулянт элюировался в форме двух пиков (Рис.5).

5 40 44 Л9

Рис.5. Хроматографический профиль антикоагулянтов после очистки гель-фильтрациеи на колонке с Тойопал Ни/ -50 продукта, полученного в результате хроматографии на колонке с Сефадексом ДЗАЭ А-25. Абцисса - номер фракций, ордината слева - оптическая плотность, непрерывная линия - эффективность торможения, прерывистая - оптическая плотность.

Калибровка декстраном голубым, цианкобаламином, рибонуклеа-зой, НАД и рибофлавином позволила установить молекулярную массу антикоагулянтов: 6 000 и 4 000 Да.

Продукты (тяжелого) и II (легкого пиков освободили от буфера и подвергли гель-фильтрации на той же колонке еше 2 раза (дополнительная очистка) (Рис.6).

По результатам хроматографии на бумаге - II и на пластинках "Фиксион 8x50" после 3-й гель-фильтрации не найдены примеси аминокислот, что позволило анализировать их аминокислотный состав. С этой целью гидролизаты антикоагулянтов разделили на колонке автоматического анализатора, прокалибровав стандартной смесью аминокислот.

Анализ хроматограмад (Рис.7 и 8) позволил установить, что

антикоагулянты являются пептидами, определить их аминокислотный состав и рассчитать молекулярную массу (Табл.4).

Рис.6. Хроматографические профили антикоагулянта фракции I (А) и фракции II(Б) на колонке Тоиопал Ш - 50. Обозначения те же, что и на рис.5.

Рис.tí Хроматограмма антикоагулянта фракции II.

Таблица4

Аминокислотный состав и молекулярная масса антикоагулянтов из фракции I и II

Аминокислоты количество остатков аминокислот

Антикоагулянт фракции 1 фракции 11

Азр Thr а I 4

Glu 14 12

Pro 4 2

Gly 21 7

Ala 5 2

Val 2 I

lie I I

Leu 2 2

Lya I I

Phe 2 2

Молекулярная масса по данньм: -гель-фильтрации б ООО

-аминокислотного состава 5 678,2

4 ООО 3 625,0

В молекулах обоих антикоагулянтов велико число аминокислотных остатков с ионогенными радикалами: в молекуле антикоагулянта фракции I из 61 остатка 23 являются ионогенными (аспарагино-вой - 8, глютаминовой - 14, лизина - I); в молекуле антикоагулянта фракции II из 34 остатков 17 представлены ими (аспарагино-вой - 4, глютаминовой - 12, лизина - I). Это согласуется с предположением о возможности взаимодействия антикоагулянтов с моно-

мерным фибрином аа счет электростатических связей, в которых со стороны ингибитора участвуют ионогенные радикалы аминокислот.

Итак, в недиализуюшейся фракции экстракта сабельника болотного содержатся два антикоагулянта, отличающиеся набором аминокислотных остатков в молекулах.

Противосвертываюшее действие экстракта в опытах на животных.

Изучение начали с уточнения эффективной, но не вызывающей кровоточивости, дозы: 250, 500, I ООО, I 500, 2 ООО.ЕА/кг (табл.5).

1 а б л и ц а 5

Общая свертывающая активность плазмы крови при введении животным разных доз антикоагулянта.

т Время рекальцификации, с 5 мин 60 мин Степень 5 мин торможения, 1о 60 мин

250 99,0*5,4 (бё,4+2,7) 92,6+4.2 (6&,6±$,6) 34 26

500 I69,8-t6,0 • (68;6+2;9) 161,8±4,3 (72;8±2|0) 60 55

I 000 210,6*10,2 (61|0±2,ё) (68)0*3,3) 71 66

I 500 332,6*9,4 (65',8±3;4) 295,2*9,5 (70|4+3,7) 81 76

2 000 744,8±13,6 (73,2*2,6) 686,4*11.9 (74,2±1,ё) 91 89

Примечание:1 р скобках приведены контрольные значения (животным вводили растворитель. 2- Все отличия от контроля достоверны (Р 0,05). 3. Всего - 108 крыс.

С увеличением дозы повышается степень торможения свертываемости плазмы - от 26% при дозе 250 ЕД/кг до 89-91% при максимальной. Одинаковая степень изменения активированного и неактивированного времени рекальцификации исключает влияние экстракта на контактную фазу. Преимущественное влияние на тромбиновое время и время самосборки фибрина указывает, что экстракт действует на Ш фазу свертывания, в частности, на самосборку фибрина (как наблюдали in vitro). Это же подтвердило определение активированного частичного тромбопластинового времени (активация тромбиноге-неза по внутреннему пути) и тромбопластинового времени (активация по внешнему пути). При дозе 500 и I 000 ЕД/кг оба теста в плазме крыс изменились в равной степени.

Таким образом, экстракт тормозит свертывание на этапе, расположенном ниже тромбиногенеза. При исследовании АД$-индуцируе-мой агрегации тромбоцитов обнаружилось, что в эффективных дозах (500 и I 000 ЕА/кг) экстракт снижает агрегацию в 1,2 - 1,4 раза, причем заметное влияние оказывает на фазу дезагрегации.

Далее мы изучали гемокоагуляцию в течение 10 дней при ежедневном внутривенном введении экстракта. Обнаружили, что максимальный эффект приходится на 5-6" "день."" "" ------------------

1 б л и ц а 6

Обшая свертывающая активность экстракта в разные сроки после однократного и десятикратного введения в дозе I ООО ЕД/кг.

Пробы взяты Время рекальцпфпкацип, с

через после i-го введения после iU-ro введения

3-5 мин I95,o+7,t/ (70,0+1,6) 164,0+4,7 (63,0+1,1)

I ч 169,9+4,4 (б6,о+1,5) 150,9+3,4 (63,6+1,5)

3 ч 124,4+3,3 (73,4+1,9) 123,2+3,6 (69,071,4)

6 ч 97,9+3,2 (63 2+1 3 112 0+3,5 (65 8+0 8)

12 ч 113,0+2,6 (76,6+1 7 109,5+5,у (75 0+1,2

24 ч у7,1+3,2 (72,6+0,у) 96,2+2,6 (65,0+1,6)

Примечание: ü скобках - контрольные значения; в каждой группе по 5-6 животных, всего - 136 крыс.

Динамика изменения гипокоагуляционных сдвигов после первой и десятой инъекции примерно одинакова (табл.6). Повторное введение экстракта в течение 10 дней воспроизводит противосвертывающий эффект, наблюдавшийся после первой инъекции. При повторных введениях (через 24 ч) выявляется небольшое усиление эффекта, связанное с остаточным действием предыдущих инъекций. Защитное действие экстракта при угрозе тромбоза.

Экзогенную тромбопластинемию использовали как модель, позволяющую оценить эффективность экстракта на уровне организма /В.А. Нудряшов, 1975/. Препарат тканевого тромбопластина (активность 22 с) вводили в яремную вену (40 мг/кг) в разные сроки после введения экстракта. Учитывали частоту гибели животных в течение суток (табл.7). Т а б л и ц а 7 Частота гибели животных при введении взвеси тромбопластина животным, предварительно инъецированных экстрактом (I 000 ЕД/кг)

Время от момента Число Вышло погибло Частота гибели, введения экстракта крыс_%_

3-5 мин 50(30) 28(16) 22(I4j 44(46)

I ч 30 30 24 16 6(14) 20(46

3 ч 30(30) 30(16) 0 0(46)

6 ч 25(30) 23(15) 2(15) d 50

12 ч 25(25 22(13 3(12) 12 52)

24 ч 30(30) 22(15) 6(15) 27(50)

Примечание: и скооках - контроль; всего - оьо крыс.

Экстракт снизил частоту гибели животных на 56% (введение за I ч). ^же через сутки гибель животных снижена на 46%. Можно полагать, что в такой же степени повышена толерантность животных к угрозе тромбоза, вызываемого ускорением тромбиногенеза.

Инъециируя тромбопластин в дозе 30 мг/кг, изучили защитное действие экстракта по содержанию ЦЦФ. В контроле через 0,5 ч

после инъекции тромбопластина содержание ЦЦФ - 0,02+0,001, на фоне экстракта - 0,04+0,0015 г/л. Ото позволяет связать защитное действие экстракта при введении тромбопластина со способностью антикоагулянта тормозить превращения фибриногена, провоцируемые ускоренным образованием тромбина.

Сопоставление противосвертываюшего эффекта экстракта и гепарина.

In vitro установили, что I ЕА экстракта соответствует по противосвертываюшему эффекту 0,001 ЕА гепарина, ото позволило сопоставить в организме эффекты гепарина и экстракта в дозах, одинаковых по активности, эффективной принято считать дозу гепарина, удлиняющую в 3 раза время рекальцификации при внутривенном введении /Е.А.Чазов, 1966/. Идентичную по действию дозу экстракта использовали в тех же целях, сопоставляя их эффекты в течение получаса и откладывая результаты в координатах: время рекальцификации (ордината) от времени после инъекции (абцисса). Плошади, описываемые кривыми (в пределах координат и контрольного значения) пропорциональны эффективности сравниваемых препаратов /В.Н.Соловьев и др.,1980/.

а

1 г з ч 5 б 7 § 3 55 '

Рис.9. Время рекальцификации после введения гепарина или экстракта (ордината) в разные сроки после инъекции(абцисса).

На рис.9 видно, что плошадь, очерченная графиком, отражающим эффект гепарина, в 6,6 раза меньше плошади, отражающей эффект экстракта.

Если учесть длительность эффекта экстракта (более 24 ч), то разница еще существеннее. Кроме того, после гипокоагулемии, вызванной введением экстракта, не наблюдается компенсаторная гипер-коагулемия, характерная для инъекции гепарина.

В заключении отметим следующее. В недиализуюшейся фракции экстракта сабельника болотного содержатся антикоагулянты, ограничивающие Ш фазу свертывания, преимущественно неферментативный

- 17 -

этап. Эффект антикоагулянтов по результатам сопоставления свойств с - ранее изученными ингибиторами самосборки животного и растительного происхождения,"^ можно- объяснить_способностью антикоагулянтов образовывать ассоциаты с мономерным фпбрином7 что --задерживает аутополимеризацию.

Противосвертываюшая активность недиализуюшейся фракции высока, продолжительность эффекта значительна, отсутствует эффект бумеранга. Выражена способность фракции повышать толерантность животных к тромбину. Все это свидетельствует о необходимости детального изучения недиализуюшейся фракции экстракта сабельника болвтного согласно рекомендациям Фармакологического комитета для антикоагулянтов прямого действия.

ВЫВОДЫ

1. Вьщелен и очишен противосвертываюший компонент из недиализуюшейся фракции экстракта сабельника болотного, который при - 1В°С сохраняет противосвертывающую активность в течение 2-х лет, вызывает при внутривенном введении устойчивую гипокоагуле-

мию и снижает частоту гибели животных при экзогенной тромбопла-стинемии.

2. Противосвертываюшая активность экстракта обусловлена двумя пептидами, содержащими а и 4 остатка аспарагиновой кислоты, 14 и 12 глютаминовой, 4 и 2 пролина, 21 и 7 глицина, 5 и 2 алани-на, 2 и I валина, по 2 - лейцина, по I - изолейцина, по 2 - фени-лаланина, по I - лизина и I - треонина (в тяжелом пептиде).

3. Противосвертываюший эффект экстракта реализуется на стадии коагуляционных превращений фибриногена, преимущественно на этапе самосборки фибрина и, в меньшей степени, на этапе активации фибриногена тромбином.

4. Высокая противосвертываюшая активность при малой токсичности, воспроизведение противосвертываюшего эффекта при многократном введении и отсутствие компенсаторной гиперкоагулемии свидетельствует о целесообразности изучения экстракта по схеме, прямого действия.

С П И С О К

научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Нохрина Н.Э. Влияние экстракта сабельника болотного на гемокоагуляцию //Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины:Тез.докл. областной конференции ученых-медиков и специалистов практического здравоохранения,- Тюмень, 1988. - С.6В --68.

2. Нохрина Н.Э., Нешта И.Д. Об антикоагулянтной активности экстракта сабельника болотного//Новые лекарственные препараты из

растений Сибири и Дальнего Бостока:Тез.докл. Всесоюзн. научн. конф. - Томск, 1989.-С. 54-54.

3. Нохрина Н.Э. Антикоагулянтная активность извлечений из травы сабельника болотного//Конференция биохимических обшеств Урала, Сибири, Поволжья, посвященной проблемам биохимии . Пермь, 1989. - 92-93.

4. Нохрина Н.Э. Противосвертывашая активность недиализи-руемой фракции экстракта сабельника болотного//Физиология и патология перекисного окисления липидов, гемостаза и иммуногенеза: Тез.УП Всесоюзной конф. молодых ученых. - Полтава, 1991.-С. 61-

5. Нохрина Н.Э., Леонова О.П. Антиполимеризационный компонент растительного происхождения//Обмен веществ в норме и пато-логии:Тез. Всесоюзн.конф.- Тюмень, 1992. - С. 71-71.

6. Нохрина Н.Э., Ельдецова С.Н. Об антиоксидантном эффекте экстракта сабельника болотного//Там же.- С. 70-70.

. 7. Нохрина Н.Э., Ельдецова С.Н. О защитном влиянии экстракта сабельника болотного при экзогенной тромбопластинемии//Физио-логия и патология перекисного окисления липидов, гемостаза и иммуногенеза:Тез. УШ Всесоюзн.конф. молодых ученых.- Полтава, 1992.~С. 54-54.

-62.

Подписано к печати 01.04.1993 г.

Заказ 45.Тираж 100. Ротапринт