Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Природа, свойства и механизм действия прямого антикоагулянта из травы окопника лекарственного

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Полле, Игорь Эрвинович

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. МОЛЕКУЛЫ СРЕДНЕЙ МАССЫ - ЭФФЕКТОРЫ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ (Обзор литературы).

2.1. Эффекторы свертывания крови растительного происхождения

2.2. Пептидные эффекторы свертывания крови.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Выделение, очистка и природа антикоагулянта из окопника лекарственного

4.2. Молекулярная масса и аминокислотный состав антикоагулянта из окопника лекарственного

4.3. Количественное определение антикоагулянта в очищенных фракциях экстракта из травы окопника лекарственного.

4.4. Механизм торможения процесса плазмокоагуляции антикоагулянтом, полученным из окопника лекарственного.

4.5. Противосвертывающая активность антикоагулянта, выделенного из окопника лекарственного, in vivo

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Природа, свойства и механизм действия прямого антикоагулянта из травы окопника лекарственного"

Актуальность проблемы. Система гемостаза выполняет в организме ряд жизненно важных функций - поддерживает кровь в жидком состоянии, препятствует тромбообразованию и блокаде микроциркуляции в органах, предотвращает кровоточивость и обеспечивает купирование уже развившихся геморрагий, несет ограничительную и защитную функции, препятствуя распространению из очагов поражения микрофлоры, а также гетеро- и аутоток-синов /Кузник Б.И., Скипетров В.П., 1974; Гаврилов O.K., 1981; Баркаган З.С., 1988/.

Нормальный гемостаз обеспечивается равновесием между постоянно осуществляемой с невысокой интенсивностью активацией факторов свертывания и их ингибиторов, и функционированием фибринолитической системы /Гаврилов O.K., 1981/. Однако при существенном напряжении гемостаза (причиной могут быть травмы, инфекционные процессы, атеросклеротические изменения сосудов, хирургические вмешательства и т.д. /Бышевский А.Ш., Кожевников В.Н., 1986/), свертывающий потенциал крови преобладает над противосвертывающим, в том числе антитромбоцитар-ным и фибринолитическим, что может привести к образованию тромба с последующей закупоркой кровеносного сосуда.

Для ограничения развития этого опасного процесса в настоящее время используются в основном следующие группы препаратов: ингибиторы агрегации тромбоцитов (антиагреганты); антикоагулянты непрямого действия, преимущественно замедляющие синтез прокоагулянтов; вещества, удаляющие фибриноген из кровотока (дефибринаторы) или стимулирующие эндогенную фибриноли-тическую систему (фибринолитики) и антикоагулянты прямого действия - соединения, ограничивающие интенсивность свертывания непосредственно в кровотоке /Метелица В.И., 1987; Ферстра-те М., Фермилен Ж., 1986; Weis, 1988/. Причем если каждую из первых трех групп представляют по меньшей мере 3-4 достаточно широко использующихся препарата, то подгруппа антикоагулянтов экстренного применения, т.е. антикоагулянтов прямого действия, представлена лишь гепарином, его производными (гепариноидами) и гирудином (гирудиноидами).

Широко известный антикоагулянт - гепарин хотя и является средством выбора, но отличается рядом недостатков. К важнейшим из них можно отнести непродолжительность действия, способность вызывать агрегацию тромбоцитов /Bertele е.а., 1983; Cimo е.а., 1979/ и тромбоцитопению /Ansell, Deykin D., 1980; Borg е.a., 1986; Griffiths, Dzik, 1997; Wang e.a., 1999; Blank e.a., 1999/. Известны данные и о существовании гепаринорезистентности /Баркаган З.С. и соавт., 1982; 1988/. Нередко отмечаются тром-боэмболические осложнения после отмены гепарина, связанные с так называемым "эффектом бумеранга" /Brase, Fareed, 1987/. В значительной степени выше сказанное относится и к производным гепарина.

Широкого практического применения гирудин и гирудиноиды, выделенные из тканей сосущих животных /Чазов Е.К., Лакин К.М., 1977; Ена Я.М., 1992/ и обладающие антитромбиновым действием /Markwardt, 1985; Kaiser, Markwardt, 1988/ не нашли из-за сложной и дорогостоящей технологии получения /Баскова И.П., 1991/.

В связи с этим исследования в области поиска естественных или создания новых синтетических средств, прямо ограничивающих активность свертывания, не прекращаются уже много лет.

В последнее десятилетие особое внимание исследователей привлекли относительно низкомолекулярные соединения (т.н. молекулы средней массы), по некоторым данным способные непосредственно участвовать в процессах свертывания /Чирятьев Е.А., 1990; Пасторова В.Е., Ляпина JI.A., Ашмарин И.П., 2000; Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Ашмарин И.П., 2001; Черкасова К.А., 2001/. Так, например, успешно изучается группа пептидов - антифакторов Ха, в частности Антистатин, состоящий из 119 аминокислот /Ohta, Brush, Jacobs, 1994; Ostrem е.a., 1998/, клещевой пептидный антикоагулянт, содержащий 60 аминокислот /Fioravanti е.а., 1993; Мао е.а., 1995; Lynch е.а., 1995/, полипептид (133 аминокислоты), выделенный из слюны медицинской пиявки /Kornowski е.а., 1996/ и др.

Несколько ранее исследовались пептидные ингибиторы, ограничивающие тромбинзависимое превращение фибриногена, имеющие в своем составе аналоги N-концевого участка a-цепи фибриногена с последовательностью GPR /Laudano, Doolittle, 1979; 1980/. Подобные пептиды выделены из плазмы крови и тканей внутренних органов человека и животных /Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А., 1982; 1986; 1990/. В то же время применение этой группы пептидов в качестве антикоагулянтов прямого действия in vivo пока невозможно вследствие их быстрой элиминации из кровотока /Чипенс Г.И., 1982; Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А., 1982; 1986; 1990/.

Не остались в стороне и растения, как источники веществ, модифицирующих гемостаз, среди которых найдены как активаторы /Турова А.Д., Сапожникова Э.Н., 1983/, так и ингибиторы свертывания крови /Колхир В.К., Соколов С.Я., 1982; Wang е.а., 1984/, а также соединения, влияющие тромбоцитарный компонент гемостаза /Fang-Rong Chang е.а., 1998; Tian Sung Wu е.а., 1998/, активность фибринолитической системы /Bum-Soo Hahn е.а.,

1999/ и реологические свойства крови /Плотников М.Б. и соавт., 2000/.

Работы, исходящие из лабораторий кафедр биохимии и фармакогнозии Тюменской медицинской академии, также свидетельствуют о том, что многие растения обладают способностью модифицировать гемостаз. Так, O.A. Русаковой /1993; 1999/ было исследовано влияние на плазмокоагуляцию более 200 экстрактов из растений флоры Западной Сибири. При этом установлено, что некоторые растения обладают про-, либо антикоагулянтной активностью /Русакова O.A., 1992; 1993; Чирятьев Е.А., Русакова O.A., 1994/. Антикоагулянтная активность извлечений из растений обусловлена содержанием в них гликопептидов /Русакова O.A., 1999/, механизм действия которых имеет сходство с N-концевыми аналогами участка а-цепи фибриногена, ограничивающими ферментативное превращение фибриногена в фибрин /Чирятьев Е.А. и соавт., 1996/. Интересен тот факт, что антикоагулянты растительного происхождения по механизму действия принципиально отличаются от использующихся в настоящее время прямых антикоагулянтов /Чирятьев Е.А., Русакова O.A., Приймак Н.В., Платонов Е.В., 1997/, не обладают выраженным токсическим действием на организм лабораторного животного и вызывают продолжительную гипокоагулемию /Дементьева И.А., 1991; Русакова O.A., Губаев А.Г., Ортенберг Э.А., 1994; Губаев А.Г., 1996/.

Таким образом, можно заключить, что остается актуальным поиск и изучение новых средств направленного воздействия на гемостаз, оказывающих быстрый и достаточно продолжительный эффект, т.е. новых антикоагулянтов прямого действия. Значительное место в этих исследованиях занимают растения, прежде всего потому, что содержащиеся в них фармакологически активные соединения прошли через своеобразный биологический фильтр и в следствие этого, по сравнению с синтетическими, отличаются наиболее благоприятным воздействием на организм человека.

Цель исследования. Изучить возможность получения антикоагулянта прямого действия из травы окопника лекарственного, установить его природу, охарактеризовать механизм действия, определить токсическую дозу и дать предварительную оценку состояния плазмокоагуляции при внутривенном введении очищенного антикоагулянта лабораторным животным (белые крысы).

Задачи исследования. 1. Выделить гомогенный антикоагулянт из травы окопника лекарственного. 2. Установить его химическую природу и определить значение молекулярной массы. 3. Расшифровать механизм ограничения антикоагулянтом из окопника свертывающей активности плазмы крови in vitro. 4. Определить эффективную дозу антикоагулянта и дать предварительную характеристику его влияния на плазмокоагуляцию при внутривенном введении лабораторным животным (противосвертывающий эффект и защитное действие при экспериментальной тромбопластинемии). 5. Определить токсическую дозу антикоагулянта, выделенного из окопника лекарственного.

Научная новизна. Впервые выделен из травы окопника лекарственного индивидуальное соединение, обладающее антикоагу-лянтной активностью in vitro и in vivo.

Впервые установлено, что это соединение по химической природе представляет собой гликопептид, углеводная часть которого представлена остатками глюкозы, а его молекулярная масса составляет около 3 ООО Да.

Впервые установлено, что антикоагулянт, полученный из травы окопника лекарственного, преимущественно ограничивает процесс коагуляционного превращения фибриногена путем его взаимодействия с мономерным фибрином и полимерами ранней степени зрелости за счет электростатических связей. Антикоагулянт не взаимодействут с центрами Д- и E-полимеризации, а связывается с положительно заряженными кластерами фибриногена, изменяя, по-видимому, оптимальную конформацию комплементарных центров полимеризации.

Впервые установлено, что внутривенное введение растительного антикоагулянта приводит к длительной и дозазависимой гипо-коагулемии, а его превентивное введение эффективно защищает лабораторных животных от гибели, вызываемой экспериментальной тромбопластинемией.

Впервые установлена средняя токсическая доза антикоагулянта - LD50 = 0,47±0,038 при минимальной эффективной 0,15 -0,20 мг/кг массы тела животного, что говорит о его достаточно широком терапевтическом действии.

Практическая ценность. Разработан способ получения антикоагулянта из травы окопника лекарственного, позволяющий получать индивидуальное соединение в количествах, достаточных для его изучения в лабораторных условиях.

Антикоагулянт из окопника способен эффективно ограничивать процесс плазмокоагуляции как in vitro, так и in vivo, что обуславливает его ценность как инструмента изучения процесса свертывания крови, и, в сочетании с широким терапевтическим эффектом, показывает перспективность создания на новых средств фармакологической коррекции гемостаза.

Полученные данные могут быть использованы научными учреждениями, занимающимися проблемами свертывания крови и поиском новых средств воздействия на гемостаз.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Трава окопника лекарственного содержит прямой антикоагулянт, который может быть получен в индивидуальном виде.

2. По химической природе антикоагулянт относится к глико-пептидам.

3. Механизм ограничения плазмокоагуляции исследуемым антикоагулянтом отличен от механизма известных прямых антикоагулянтов и реализуется на заключительном этапе свертывания крови - коагуляционном превращении фибриногена посредством образования электростатических связей.

4. Внутривенное введение антикоагулянта лабораторным животным приводит к стойкой, дозазависимой гипокоагулемии и не вызывает «эффекта бумеранга».

5. Превентивное внутривенное введение антикоагулянта лабораторным животным эффективно предотвращает их гибель при моделировании эндогенной тромбопластинемии.

Апробация и публикации. Фрагменты работы опубликованы в материалах международных симпозиумов «Медицина и охрана здоровья» (Тюмень, 2000, 2001); материалах XXXV юбилейной межвузовской конференции «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной и клинической медицины» (Тюмень, 2001); в «Вестнике Российского государственного медицинского университета» (Москва, 2001); в материалах международной конференции «Санкт-Петербургские научные чтения» (Санкт-Петербург, 2001); материалах второй международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2001); журнале «Тромбоз, гемостаз и реология» (2001), доложены на совместном заседании кафедр биохимии, фармакологии и фармакогнозии Тюменской государственной медицинской академии.

- 10

Объем и структура работы. Материалы работы, включая указатель литературы, изложены на 157 страницах машинописного текста. В тексте работы содержится 24 рисунка и 19 таблиц.

Работа состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследований, главы (содержащей 5 подразделов), в которой изложены результаты собственных исследований, заключения и выводов. Указатель литературы представлен 125 отечественными и 119 иностранными источниками.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Полле, Игорь Эрвинович

6. ВЫВОДЫ

1. Трава окопника лекарственного содержит антикоагулянт прямого действия - гликопептид, белковая часть которого содержит аминокислоты Asp (4 остатка), Ser (2 остатка), Thr (3 остатка), Glu (6 остатков), Pro, Gly (4 остатка), Ala (4 остатка), Val (2 остатка), Ile, Leu, Gys (2 остатка), Lys (2 остатка); углеводная -глюкозу.

2. Антикоагулянт, получаемый из травы окопника лекарственного, ограничивает процесс коагуляционного превращения фибриногена на этапе аутополимеризации фибринмономеров.

3. Торможение аутополимеризации реализуется преимущественно путем образования комплексов с мономерами и олигомерами ранней степени зрелости посредством электростатических сил. При этом донорами электронов является гликопептид.

4. При внутривенном введении лабораторным животным антикоагулянта, получаемого из травы окопника лекарственного, развивается дозазависимая гипокоагулемия, продолжающаяся до 12-15 ч, постепенно затухающая к 18-20 ч.

5. Минимальная эффективная доза антикоагулянта при внутривенном введении составляет 0,15 мг/кг массы тела животного при среднесмертельной - 0,48±0,038 мг/кг массы. Антикоагулянт из травы окопника лекарственного, не обладает кумулятивным действием.

6. Превентивное введение антикоагулянта растительного происхождения лабораторным животным эффективно снижает их гибель от тромбоза, обусловленного экзогенной тромбопласти-немией.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Поиск и изучение новых антикоагулянтов прямого действия остается одной из важнейших проблем гемостазиологии. Это объясняется тем, что, с одной стороны, во многих, даже развитых странах мира отмечается рост заболеваний (сердечно-сосудистая патология, травмы, хирургические вмешательства, ожоги и радиационные поражения и т.д.), тромбоэмболические осложнения которых являются наиболее частой непосредственной причиной смерти /Азарова JI.A., 1990; Баркаган З.С., 1988; Фролова М.А., 1991/; с другой - ограниченность ассортимента этой группы лекарственных препаратов.

Наибольшую известность и широкое применение в настоящее время имеет гепарин, представляющий собой гетерогенную смесь сульфатированных полисахаридных цепей, построенных из повторяющихся единиц D-глюкозамина и D-глюкуроновой или L-идуроновой кислот, а также его низкомолекулярные формы (НМГ). При внутривенном введении гепарина эффект наступает практически моментально, он дает мощный антикоагулянтный эффект, продолжающийся до б ч /Белоусов Ю.Б. и соавт., 1993/. Действие гепарина на свертывание крови поливалентно, поскольку он влияет на все основные фазы свертывания крови /Бышевский А.Ш., 1986/.

Однако, по мере накопления научных и практических данных о гепарине, появилась сдержанность в оценке его лечебных возможностей. Оказалось, что в природе нет гепарина строго определенного состава, а существует смесь моно-, ди- и трисернокислых эфиров гепарина. Гетерогенность гепарина определяется различной длиной цепи повторяющихся субъединиц дисахарида и проявляется полидисперсностью молекулы с широким диапазоном молекуляр

-ПОной массы (обычно между 9 и 15, а иногда даже 4 и 40 кДа /Мазаев A.B., Саргин К.Е., 1986; Stein R., Press D„ 1984/. Химическая структура гепарина до сих пор однозначно не определена, а из коммерческого гепарина с помощью электрофореза и хроматографии можно выделить более 100 различных компонентов /Ефимов B.C., Румянцева А.Г., 1992/.

По-видимому, с химической гетерогенностью связан ряд побочных негативных эффектов при применении гепарина в клинической практике.

Самым опасным и наиболее распространенным побочным эффектом гепарина являются кровотечения /Bick R., 1985/. По некоторым данным геморрагии возникают в 10-30% случаев /Frohlish Е., Alderman S., 1988/. Кровотечения наблюдаются при передозировках препарата, т.к. сложно подобрать индивидуальную эффективную начальную дозу и в последующем осуществлять контроль за его применением /Girdwood R., 1985/. Кроме того, риск появления геморрагий возрастает по мере увеличения продолжительности применения гепарина.

Распространенным побочным эффектом при введении полидисперсного гепарина является тромбоцитопения /Ansell J., Dey-kin D., 1980; Barradas M. et al., 1987/ с последующим гепаринин-дуцированным тромбозом /Башков A.C., 1993; Cohen M., 1999; Griffiths Е„ Dzik W„ 1997; Wang L. et al., 1999; Blank M. et al., 1999/.

На фоне терапии гепарином могут развиваться венозные тромбозы и тромбоэмболии /Кацадзе Ю.Л., 1981; Schafer А., 1985/. Они появляются чаще при прерывистом введении антикоагулянта подкожно или внутривенно в конце терапии при резкой отмене его, что связано с развитием синдрома «рикошета» /Brase L., Fareed J., 1987/.

Длительное применение гепарина может привести и к другим опасным эффектам, например, к развитию остеопороза /Verstrate М., 1984; Ефимов B.C., Румянцева А.Г., 1992/, повышению уровней аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы, что, в свою очередь, затрудняет диагноз инфаркта миокарда, тромбоэмболии легочной артерии или заболеваний печени /Назаров В.Г., 1993/. Нередко внутримышечное и подкожное введение гепарина сопровождается аллергическими реакциями, при этом возникают головные боли, рвота, кожная сыпь, бронхоспазм и даже анафилактический шок /Дмитриев В.В., 1991; Назаров В.Г.,1993/.

В последние годы появилось немало сообщений о гепарине с низкой молекулярной массой (НМГ). Молекулярная масса НМГ приблизительно равна 5 ООО - 6 ООО Да, по химической структуре они представлены фрагментами глюкозаминогликана /Hemker Н. et al., 1989; Schraden J., 1988/. Антитромбиновая активность НМГ связана с его способностью селективно инактивировать се-ринпротеазы типа фактора Ха и тромбина в присутствии антитромбина III /Caranobe С. et al., 1985; Hirsh J., Levine M., 1992/.

НМГ имеют ряд преимуществ перед обычными коммерческими гепаринами. Они, несмотря на значительно меньшую молекулярную массу, намного дольше циркулируют в крови и дают более продолжительный антитромботический эффект /Bergquist D. et al., 1987/. НМГ в меньшей степени и реже, чем обычный гепарин, повышают агрегационную функцию тромбоцитов /Bertele V. et al., 1983; Chong В. et al., 1989/.

Однако, многими авторами подчеркивается, что как и при введении нефракционного гепарина, отмечается широкая индивидуальная вариабельность в антикоагулянтном ответе на дозу НМГ /Cutter J., 1991; Rostin М. et al., 1990/, а данные о частоте геморрагических осложнений при профилактике тромбообразования

НМГ далеко неоднозначны /Levine М., 1989/. Еще более противоречива информация о способности НМГ активировать тромбоциты и вызывать вторичную тромбоцитопению и «рикошетные» тромбозы, т.е. провоцировать те осложнения, которые с высокой частотой встречаются при лечении обычным гепарином /Chong В. et al„ 1989; Dunn F. et al„ 1984/.

Имеет значение и то обстоятельство, что использование НМГ ограничивается высокой стоимостью препаратов.

К числу антикоагулянтов прямого действия относятся также гирудин и гирудиноиды - вещества, выделенные из тканей сосущих животных /Ена Я.М., 1992; Чазов Е.К., Лакин К.М., 1977/, в частности, из тканей пиявок. Секрет их слюнных желез содержит гирудин, ингибиторы трипсина, гиалуронидазу, дестабилазу и еще целый ряд активных соединений. Гирудин является мощным ингибитором тромбина, препятствует агрегации тромбоцитов и оказывает тромболитическое действие /Баскова И.П. и соавт., 1984; Исаханян Г.С., 1991; Hoffman F., Markwardt F., 1984/. Дестабила-за способна растворять тромбы, а ферменты бделлины, эглины, ки-ниназы обеспечивают обезболивающий и противовоспалительный эффекты, блокируя калликреинкининовую систему.

При внутривенном введении гирудина антикоагулянтный эффект проявляется моментально и продолжается 1-2 ч, при подкожном и внутримышечном - через 1-2 ч и длится 6-8 ч /Исаханян Г.С., 1991; Tanaka S., Tomoite Н„ 1988).

Исходным материалом для получения гирудина и других компонентов слюнных желез пиявок является обыкновенная медицинская пиявка (Hirudo medicinalis) /Агакишиев Д.Д., Абдуллаев Ш.Г., 1987; Каменев Ю.Д., 1993/, что создает определенные трудности. Разработан способ получения нативного средства слюнных желез медицинской пиявки, однако практического применения он не нашел из-за сложной технологии /Баскова И.П., 1991/.

Таким образом препятствиями для выхода в широкую практику препаратов гирудина являются: 1) дороговизна; 2) трудности в получении высокоочищенных ингибиторов из секрета пиявок; 3) синтезированные препараты значительно уступают природному ингибитору в антитромбиновой активности и имеют высокую токсичность /Alderman М., Harsen А., 1986; Stone S., 1987/.

Основываясь на сказанном становится понятно, почему исследования в области поиска естественных или создания новых средств направленного воздействия на гемостаз не прекращаются.

Большое количество исследований посвящены изучению влияния на свертывание крови так называемых молекул средней массы - пептидов. Среди наиболее успешных работ можно отметить изучение антистатина (AST) - быстрого пептидного антикоагулянта, являющегося ингибитором фактора Ха /Al-Obeidi F., Ostrem J., 1998/. Он представляет собой одиночную полипептидную цепь из 119 аминокислот, которая расщепляется ф. Ха в положении Arg34, образуя при этом малодисодиирующий комплекс ингибитор-фермент /Dunwiddie С. et al., 1989; Ohta N. et al., 1994/.

Другой мощный ингибитор фактора Ха был изолирован из мягкого клеща и назван клещевым пептидным антикоагулянтом (ТАР). ТАР является мономерным белком, состоящим из 60 аминокислот. На его базе был создан рекомбинантный ТАР (гТАР), который был столь же эффективен, как и гирудин /Schaffer L. et al., 1991; Sitko G. et al., 1992; Vlasuk J., 1993; Fioravanti C. et al., 1993; Mao S. et al., 1995; Lynch J. et al., 1995/.

Еще один естественный полипептидный ингибитор фактора Ха был выделен из слюны медицинской пиявки. Он содержит 133 аминокислоты, включая 22 остатка цистеина, которые формируют

11 дисульфидных связей. Период полужизни этого пептида составляет около 80 мин у мышей, крыс и кроликов и более 120 мин у павианов. Антикоагулянтный эффект рекомбинантного варианта этого пептида по сравнению с гепарином и гирудином в модели тромбоза у кролика в сочетании с тканевым активатором плазми-ногена, превосходил гепарин и гирудин почти на 50% /Kornowski R. et al., 1996/.

Весьма активно исследуются растения, как источники веществ, модифицирующих гемостаз. Из растений выделены как активаторы /Турова А.Д., Сапожникова Э.Н., 1983/, так и ингибиторы свертывания крови /Колхир В.К., Соколов С.Я., 1982; Wang J. et al., 1984/.

В последнее десятилетие систематическому изучению в этом плане была подвергнута флора южных районов Западной Сибири /Чирятьев Е.А., Герберт И.Я., Русакова O.A. и др., 1985-2001 гг./. Результаты этих исследований показали, что извлечения из растений могут явиться перспективными источниками эффекторов свертывания и, в частности, антикоагулянтов прямого действия.

В процессе этой работы установлено, что приоритетным семейством в этом плане является семейство бурачниковых, которое в вышеуказанных исследованиях было представлено медуницей мягчайшей, нонеей темной, кривоцветом полевым и окопником лекарственным. Если медуница и нонея подверглись сравнительно глубокому изучению, сведения об то антикоагулянтных свойствах кривоцвета и окопника существуют лишь на уровне констатации факта, что и побудило посвятить данное исследование одному из них, а именно окопнику лекарственному.

Прежде всего, основываясь на ранее полученных данных о выделении фракций экстрактов с антикоагулянтной активностью из растительного сырья /Русакова O.A., 1993/, приемом, включающим экстракцию травы окопника 0,01 М водным раствором аммиака (1:20), ультрафильтрацию на полупроницаемой мембране, сгущение и последующую сушку не фильтрующейся фракции, был получен сухой экстракт, который, в зависимости от целей, растворяли либо в дистиллированной воде, либо в 0,05 М Трис-HCl буферном растворе с рН 7,6. Это позволило без разработки способа глубокой очистки носителя активности установить влияние факторов среды на его антикоагулянтные свойства, что, безусловно, важно для проведения всех дальнейших исследований.

В процессе проведения этих работ выяснилась высокая стабильность предполагаемого антикоагулянта: он переносит нагревание до 100°С; многократное замораживание при -10°С с последующим размораживанием при комнатной температуре. Особенно важно то, что хранение раствора экстракта в замороженном состоянии в течение года не привело к изменению антикоагулянтной активности, хотя хранение не стерильного препарата при доступе микроорганизмов приводило к существенной ее потере.

Важен и тот факт, что ампулированный стерильный экстракт при его хранении в комнатных условиях в течение года также не терял антикоагулянтных свойств.

Очевидно, что указанные выше особенности носителя антикоагулянтной активности, позволили без ущерба проводить широкий спектр манипуляций, что существенно облегчило разработку приемов его выделения и очистки.

Как указано в разделе «Обзор литературы», антикоагулянтную активность проявляют самые различные вещества растительного происхождения: гликозиды /Колхир В.К., 1982; 1983/, полисахариды /Deacon-Smith et al., 1985/, сапонины /Соколов С.Я., 1986/, соединения фенольной природы /Tian-sung Wu et al., 1998/ и др. В связи с этим был проведен качественный анализ на содержание тех или иных биологически активных веществ в полученной фракции экстракта. При этом установлено, что экстракт травы окопника лекарственного содержит полисахариды, флаво-ноиды, дубильные вещества гидролизуемой группы, фенолокислоты и нингидринположительные соединения.

Ориентиром при разработке способа выделения и очистки носителя антикоагулянтной активности из травы окопника послужили ранее полученные данные о том, что подобными носителями, содержащимися в растениях семейства бурачниковых, в частности, медунице, являются вещества пептидной природы /Русакова O.A., 1993; Чирятьев Е.А. и соавт., 1990/.

Попытка очистки антикоагулянта из окопника фитохимиче-скими методами (экстракция органическими растворителями, обработка реагентами, избирательно взаимодействующими с теми или иными группами биологически активных веществ экстракта, хроматография на бумаге и в тонком слое, колоночная абсорбционная хроматография) не увенчалась желаемым результатом: очистки либо не происходило, либо она сопровождалась значительной потерей антикоагулянтной активности. Неудачной оказалась и попытка освободиться от балластных веществ с помощью ионообменной хроматографии на гелях DEAE Toyopearl.

Более результативным оказалось применение для очистки антикоагулянта метода молекулярных сит. Так, колоночная гель-фильтрация на Sephadex G-50 в летучем буфере позволила даже после однократной операции существенно повысить удельную активность при 30%-ной потере антикоагулянтной активности, а последовательная трехкратная гель-фильтрация в тех же условиях позволила получить продукт, содержащий только одну из ранее определяемых групп веществ - нингидринположительные соединения, хотя этот процесс дополнительно сопровождался 10%-ной потерей активности. Если учесть, что еще на этапе получения экстракта применен, на наш взгляд, эффективный прием очистки -ультрафильтрация, то схема выделения носителя активности выглядит следующим образом.

Растительное сырье

Последовательная двукратная экстракция 0,01 М раствором аммиака, 1:20, 1 ч

Водно-аммиачный экстракт

Концентрирование на ротационном испарителе

Водный экстракт 1

Ультрафильтрация через мембрану Т-100 против воды очищенной

Недиализующаяся

часть экстракта

Сушка в вакууме

Растворение в 0,075 М аммонийно-ацетатном буфере

Экстракт

Последовательная трехкратная колоночная гель-фильтрация на 5ер11ас1ех 0-50

Фракции с антикоагулянтнои активностью

Как сказано выше, конечный продукт содержал только нин-гидринположительные соединения. Однозначно можно сказать, что это не аминокислоты: ультрафильтрация обеспечивает их удаление. В то же время известно, что нингидринпозитивную пробу могут обеспечивать пептиды в случае, если они находятся в растворе в доступной для визуального проявления концентрации /Дэвени Т., Гергей Я., 1976/. Более того, как уже сказано, пептиды - ингибиторы плазмокоагуляции содержатся в медунице мягчайшей, растении - относящемуся к тому же семейству.

Эти два обстоятельства обусловили следующий шаг: концентрированные пиковые фракции с антикоагулянтной активностью были подвергнуты кислотному гидролизу с последующей бумажной хроматографией гидролизата. Результаты очевидны - монохроматическое пятно распадается на ряд нингидринположительных соединений, которые идентифицированы как аминокислоты (рис. 4).

Действительно ли нингидринположительное соединение обусловливает антикоагулянтный эффект? Ответ на этот вопрос был получен при анализе результатов трипсинового, папаинового и последовательного трипсиново-папаинового гидролиза по Т.Дэвени, Я.Гергей /1976/. При трипсиновом гидролизе антикоагулянтная активность сохраняется на 100%. При папаиновом наблюдается снижение активности в среднем на 52%. Последовательное трип-тическое и папаиновое переваривание ингибитора из окопника приводит к практически полной потере антикоагулянтной активности - на 92,5%. Поскольку вышеуказанные протеолитические ферменты способны разрушать только пептидные связи, можно утверждать, что антикоагулянтный эффект обусловлен наличием пептидного материала.

Гидролиз носителя антикоагулянтной активности 1 Н серной кислотой с последующим анализом гидролизата с помощью бумажной хроматографии и на круговом поляриметре СМ-2 в присутствии сахаров-свидетелей показал его гетерогенность: носитель в своем составе имеет простетическую группу - глюкозу. Важно то обстоятельство, что глюкоза не регистрируется в нативном продукте, следовательно можно утверждать, что антикоагулянт из окопника представляет собой гликопептид.

Оставался открытым вопрос, обеспечена ли антикоагулянтная активность индивидуальным соединением, или же смесью близких по химическому составу и свойствам веществ.

Ответ был получен при хроматографии на жидкостном хроматографе высокого давления носителя после его реакции с фенили-зотиоцианатом: ФТК-производные элюируются крутым одиночным пиком. Это свидетельствует в пользу того, что активность обусловлена химически индивидуальным веществом.

Для определения аминокислотного состава антикоагулянта использован экстракт, очищенный трехкратной гель-фильтрацией на Sephadex G-50. Оценку гомогенности, гидролиз и анализ гидроли-затов с помощью автоматического аминокислотного анализатора осуществляли как описано в разделе "Материалы и методы".

Аминокислотный анализ показал, что антикоагулянт, выделенный из окопника лекарственного имеет следующий набор аминокислот: Asp (4 остатка), Ser (2 остатка), Thr (3 остатка), Glu (6 остатков), Pro, Gly (4 остатка), Ala (4 остатка), Val (2 остатка), Ile, Leu, Gys (2 остатка), Lys (2 остатка). Молекулярная масса, расчитанная как сумма молекулярных масс аминокислотных остатков за вычетом массы высвобождающейся воды, составила 3 292 Да. имеющих массу от 376 (рибофлавин) до 23 ООО Да (трипсин). Молекулярная масса по данным гель-фильтрации составила 2 920+100 Да.

Разработка способа получения высокоочищенного продукта позволило накопить сухой антикоагулянт, а использование усредненного значения его молекулярной массы, полученного двумя независимыми приемами, в последующих экспериментах выражать концентрацию антикоагулянта в растворе в весовых единицах.

Показано, что изучаемый антикоагулянт практически в равной степени реализует свою активность независимо от того, протекает ли свертывание по внешнему или по внутреннему пути. Следовательно, вероятнее всего, носитель антикоагулянтной активности оказывает преимущественное влияние на этапах, следующих за образованием тромбина. Тем не менее мы провели серию экспериментов по выяснению влияния ингибитора на различные этапы плазмокоагуляции, используя в качестве субстрата фактор-дефицитные плазмы, а именно плазмы дефицитные по факторам И, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII и кининам.

Оказалось, что эффективность торможения скорости соответствующих реакций свертывания достоверно различается только в случае использования в качестве субстратной плазмы, дефицитной по фактору II и эффект ингибитора не зависит от активности факторов V, VII, VIII, IX, X, XI и XII (различия в контрольных и опытных тестах не достоверны).

Выраженная зависимость степени эффективности торможения изучаемой фракцией экстракта от концентрации протромбина и отсутствие подобного эффекта в случае использования других фактор-дефицитных плазм дополнительно свидетельствует в пользу ранее высказанного предположения о преимущественном влиянии носителя ингибиторной активности на заключительную фазу процесса плазмокоагуляции - тромбинзависимое превращение фибриногена; недостаток образующегося тромбина приводит к удлинению процесса свертывания фибриногена и, следовательно, увеличению времени, в течение которого ингибитор может реализовать свой эффект.

Преимущественное влияние антикоагулянта на заключительный этап плазмокоагуляции подтверждено следующим. Пулирован-ную цитратную плазму доноров подвергли дефибринированию нагреванием на водяной бане (5б°С, 3 мин), либо фибриноген удаляли высаливанием сульфатом натрия (8% насыщения). Полученная подобным образом плазма не теряла способности генерировать тромбин: добавление к плазме, активированной кальцием (Са++) или тромбопластин-кальциевой смесью (ТКС), фибриногена, вызывает свертывание последнего.

Для дифференцированной оценки влияния антикоагулянта на этапы, обеспечивающие тромбиногенез и тромбинзависимое свертывание фибриногена, к дефибринированной одним из вышеописанных способов плазме прибавляли растворы фибриногена, антикоагулянта и Са++ или ТКС, приготовленной как рекомендовано В.П. Балуда и соавт. /1980/ (оценивается возможный суммарный эффект антикоагулянта на свертывающий потенциал плазмы крови). В контроле антикоагулянт замещали равным объемом физиологического раствора.

В другой серии экспериментов к дефибринированной плазме прибавляли Са++ или ТКС и инкубировали в течение времени, достаточном для образования тромбина. После завершения активации плазмокоагуляции к смеси прибавляли раствор антикоагулянта и фибриногена. В контроле антикоагулянт заменяли на физиологический раствор. Эта часть экспериментов позволяет оценить эффект ингибиторов только на тромбинзависимое превращение фибриногена.

Установлено, что антикоагулянт из травы окопника оказывает эффект практически только на этап тромбинзависимого превращения фибриногена и не ограничивает скорость реакций, предшествующих образованию тромбина.

Сравнение зависимостей эффективности торможения скорости реакции взаимодействия тромбина с фибриногеном и скорости ау-тополимеризации фибрина позволило установить, что полимеризация фибрина почти в 2 раза более чувствительна к антикоагулянту, чем реакция взаимодействия тромбина с фибриногеном в целом. Однако это не исключает влияния антикоагулянта на ферментативный этап коагуляционного превращения фибриногена. Поэтому раздельно оценивалось суммарное влияние антикоагулянта как на ферментативный и неферментативный, так и только на неферментативный этапы взаимодействия тромбина с фибриногеном. При этом оказалось, что в среднем 90% антикоагулянтного эффекта реализуется на этапе полимеризации мономерного фибрина, что подтверждает предположение об антиполимеризационном действии ингибитора, получаемого из окопника лекарственного.

В то же время и самосборка мономерного фибрина включает в себя два этапа: формирование из мономеров протофибрилл и последующую их агрегацию. В связи с этим было исследовано влияние ингибитора на самосборку мономерного фибрина по методу, предложенному В. А. Белицером /1975/ (метод тестирования стадий). Проведенный анализ свидетельствует о неодинаковой чувствительности к ингибиторам разных этапов процесса самосборки. Полученные при этом данные с полной определенностью говорят о том, что наиболее восприимчивы к действию ингибитора мономеры фибрина и его олигомеры, а по мере созревания протофибрилл ингибирующий эффект антикоагулянтов снижается и по истечении почти 2/3 времени, необходимого для завершения образования фибрина, действие ингибитора на процесс самосборки прекращается. Следовательно, антикоагулянт активнее ограничивает начальные этапы неферментативного процесса коагуляционного превращения фибриногена, т.е. образование олигомеров, менее активно -формирование протофибрилл и не влияет на процесс их агрегации.

С какими участками молекул субстрата взаимодействует антикоагулянт? На первый взгляд, поскольку он преимущественно ограничивает образование олигомеров, условием взаимодействия должно быть наличие открытых активных центров самосборки -центров Б и Е. В молекуле фибриногена центры Э являются доступными для антикоагулянта, но центры Е заблокированы. В изолированном фрагменте Э открыты как так и Е-центры, а в сформировавшемся фибрине подобные центры отсутствуют. Следовательно, если выше сказанное предположение справедливо, антикоагулянт должен активнее связываться с фрагментом Б, возможно менее активно с фибриногеном и не связываться с фибрином.

Взаимодействие антикоагулянта с фибриногеном подтверждено: при концентрации фибриногена в растворе 8 мг/мл антикоагулянт, внесенный в реакционную смесь в количестве 2,5х10"3 мг/мл, связывается с фибриногеном почти на 82%, а при концентрации фибриногена 16 мг/мл после удаления белка антикоагулянта в супернатанте не остается. Сопоставимые результаты получены и при фильтрации антикоагулянта через полиакриламидный гель с иммобилизованным фибриногеном. Однако полученные данные не дают ответа на вопрос о взаимодействии антикоагулянта из окопника с центрами Б.

Имея открытыми О-центры полимеризации фибриноген сам является ингибитором самосборки /Э.В. Луговской и соавт.,

1978/. В то же время показано, что при совместном влиянии антикоагулянта и фибриногена на процесс сборки мономерного фибрина наблюдается синергизм эффектов /Л. Уэбб, 1966/. Если бы антикоагулянт блокировал самосборку, связываясь с фибриногеном по месту О-центров, между ними вероятнее всего наблюдался бы антагонизм.

Антикоагулянт и мономерный фибрин могут взаимодействовать и по месту Е-центров полимеризации, образующихся при отщеплении от фибриногена фибринопептидов под влиянием тромбина. Если это действительно так, то антикоагулянт должен активно связываться с изолированным фрагментом Б фибриногена, а при при их совместном ингибировании самосборки следует ожидать антагонизм эффектов.

Повторение вышеописанных экспериментов (инкубирование эффекторов с последующим отделением белкового материала, фильтрация через ПАГ с иммобилизованным фрагментом Б, изучение их совместного влияния на полимеризацию по Л. Уэбб) позволило сделать следующие выводы: растительный антикоагулянт связывается с фрагментом В примерно в той же степени, что и с фибриногеном; при совместном ингибировании самосборки они являются выраженными синергистами. Следовательно, нет оснований считать, что антикоагулянт из окопника избирательно взаимодействует с Е-центрами мономеров.

Доказательством отсутствия специфического взаимодействия ингибитора с центрами полимеризации Б и Е можно считать и тот факт, что он способен включаться в структуру сгустка фибрина: образование фибрина из фибриногена под действием тромбина в присутствии антикоагулянта и последующем удалении белка приводит уменьшению содержания антикоагулянта в супернатанте. По-видимому, ингибитор связывается с иными структурами фибриногена, что, возможно, приводит к изменению его конформации и, как следствие, создает стерические препятствия для оптимального процесса сборки молекул образующихся мономеров.

Анализ аминокислотного состава антикоагулянта, полученного из окопника лекарственного, показал, что по крайней мере 10 из 32 аминокислотных остатков представлены аспарагиновой и глута-миновой кислотами, которые при субфизиологических значениях рН находятся в диссоциированном состоянии (рКа=4,3 - 4,7), обусловливают присутствие отрицательного заряда на поверхности молекулы и способны к образованию электростатических связей.

Изучение зависимости скорости самосборки в присутствии или отсутствии антикоагулянта от таких факторов внешней среды, как значения рН и ионной силы, температуры и различных концентраций мочевины указало на то, что ведущими в комплексооб-разовании фибрин-антикоагулянт являются электростатические силы, причем донорами электронов со стороны антикоагулянта являются ионогенные отрицательно заряженные аминокислоты: эффективность торможения существенно увеличивается по мере улучшения условий для диссоциации свободных карбоксильных групп. Поскольку, как сказано выше, антикоагулянт из окопника примерно в равной степени взаимодействует с фибриногеном и фрагментом D, вероятнее всего он связывается с положительно заряженными кластерами, локализованными во фрагменте D фибриногена.

Важным критерием перспективности дальнейшего изучения новых антикоагулянтов прямого действия является их способность вызывать гипокоагулемию in vivo. В связи с этим очищенная двукратной гель-фильтрацией фракция экстракта из окопника была внутривенно введена белым беспородным крысам в дозах от 0,10 до 0,40 мг/кг массы тела животного. При этом через 1 ч после инъекции, судя по изменению интегрального показателя свертывающей активности крови - времени рекальдификации, развивается дозазависимая гипокоагулемия, а эффективная доза (количество антикоагулянта, увеличивающее время рекальдификации в 1,5-2 раза) в этих условиях эксперимента в среднем составляет 0,15 - 0,20 мг/кг массы.

Важной характеристикой прямых антикоагулянтов является и продолжительность их действия. Развившаяся в ответ на введение антикоагулянта в дозе 0,20 мг/кг, судя по изменению времени рекальдификации, тромбинового времени и времени самосборки фибрина в плазме крови, достигает максимума к 3-му часу эксперимента и сохраняется до 12-15 ч. Как и ожидалось, наиболее чувствителен к внутривенному введению антикоагулянта оказался тест "Время самосборки фибрина в плазме крови": через 18 ч от начала эксперимента время самосборки увеличено в 8,5 раза, и даже через сутки оно остается выше контрольного значения почти в 6,5 раза.

Таким образом, гипокоагуляционный эффект антикоагулянта из окопника при однократном внутривенном введении дозазависим и достаточно продолжителен, что выгодно его отличает от используемых в настоящее время, в частности, от гепарина.

Другими важными свойствами антикоагулянта из окопника является то, что он не обладает кумулятивным действием: его введение в дозе 0,25 мг/кг массы тела животного в течение 14 суток не приводило к сколько нибудь существенному изменению эффекта даже судя по наиболее чувствительному показателю степени интенсивности свертывания - времени самосборки фибрина в плазме крови. Характерно, что при этом не изменяется динамика изучаемых показателей: они имеют практически одинаковую направленность как после 1-й, так и после 14-й инъекции антикоагулянта.

Высокая эффективность антикоагулянта из окопника проявилась и его выраженным протективным действием при активации тромбиногенеза. Так, при внутривенных инъекциях тромбопласти-на в дозе, вызывающей гибель 50% подопытных животных в течение 4-х ч от начала эксперимента, предварительное введение антикоагулянта в дозе 0,20 мг/кг снизило частоту гибели подопытных животных до 33,3%, а в дозе 0,40 мг/кг массы тела животного -до 10%, т.е. выживаемость животных повысилась в 5 раз по сравнению с контролем. При этом следует отметить существенное снижение в опыте уровня продуктов деградации фибриногена (фибрина) по сравнению с контролем. Это позволяет сделать вывод о том, что защитное действие антикоагулянта при экзогенной тромбопластинемии связано с его способностью замедлять превращения фибриногена.

Таким образом, антикоагулянт из окопника можно рассматривать как эффективное средство предупреждения тромбозов путем его введения перед воздействием, сопровождающимся тромбопла-стинемией, например, перед травмирующей операцией.

Не менее важным аспектом действия лекарственных препаратов вообще и прямых антикоагулянтов в частности является вопрос о их острой токсичности. В связи с этим был определен показатель ЭЬйо, т-е- Д°за антикоагулянта, вызывающая гибель 50% животных. Для расчета ОЬбо животным внутривенно вводили антикоагулянт в дозах от 0,20 до 0,60 мг/мг, регистрируя в течение суток частоту гибели животных. Так, при дозе 0,40 мг/кг погибли 2 особи из 10; при дозе 0,50 мг/кг - 6 особей, а при дозе 0,6 мг/кг летальный исход ожидал всех подопытных животных. Важно отметить, что есть все основания полагать, что гибель связана с выраженной гипокоагулемией: наблюдались кровоте

- 128 чения из места прокола вен, массивные кровоизлияния в мозг и внутренние органы и т.д.

Для подсчета 50%-й летальной дозы антикоагулянта при его внутривенном введении использованы несколько различных приемов. Так, по Deichman и Le Blanc ориентировочная DL50 составила 0,40 мг/мг; по Г.Н. Першину - 0,47 мг/кг. То же значение DL50 получено при использовании метода Кербера при величине стандартной ошибки - 0,038 мг/кг. Таким образом пятидесятипроцентная летальная доза антикоагулянта составляет 0,47±0,038 мг/кг массы тела животного. Следовательно, средний терапевтический индекс антикоагулянта составляет 3,13, что говорит о достаточно широкой терапевтической эффективности разрабатываемого препарата.

Таким образом, вышеприведенные исследования свидетельствуют о том, что окопник лекарственный содержит антикоагулянт прямого действия гликопептидной природы, проявляющий свою активность in vitro и in vivo и принципиально отличающийся по механизму влияния на плазмокоагуляцию от применяющихся в медицинской практике в настоящее время. Это свидетельствует о целесообразности его более детального изучения согласно рекомендациям Фармакологического Комитета для антикоагулянтов прямого действия.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Полле, Игорь Эрвинович, Тюмень

1. Агакишиев Д.Д., Абдуллаев Ш.Г. Гирудинотерапия больных хроническим простатитом. Баку, 1987. - 7 с.

2. Азарова JI.A. Антикоагулянты прямого действия на основе химически модифицированных природных полисахаридов: Дисс. . канд. мед. наук. М., 1990. - С. 14.

3. Ашмарин И.П. Нейромедиаторы и нейромодуляторы. Эволюция соединений и эволюция гипотез//Журн. эвол. биохим. и физиол. 1979. - № 3. - С. 278-282.

4. Ашмарин И.П. Регуляторные пептиды, происхождение и иерархия//Журн. эвол. биохим. и физиол. 1982. - № 1. - С. 310.

5. Балабанова Л.Ф., Русакова O.A., Чирятьев Е.А. Ингибитор коагуляционного превращения фибриногена из полыни обыкновенной/ /В сб.: Физиология и патология перекисного окисления, гемостаза и иммуногенеза. Полтава, - 1992. - С. 44.

6. Балуда В.П., Баркаган З.С., Гольдберг Е.Д. и др. Лабораторные методы исследования гемостаза. Томск. - 1980. - 315 с.

7. Барабой В.А. Растительные фенолы и здоровье человека. -М„ Наука. 1984. - 160 с.

8. Баркаган З.С. Геморрагические заболевания и синдромы. -М.: Мед., 1988. 528 с.

9. Баркаган З.С., Лычев В.Г., Бишевский K.M. и др. Механизмы гепаринорезистентности и их клиническое значение/ /Терапевт, арх. 1982. Т. 54, № 8. - С. 77-82.

10. Баскова И.П. Механизмы регуляции гемостаза и фибрино-лиза секретом слюнных желез медицинской пиявки//В кн.: Биохимия животных и человека: Респуб. межвед. сб. науч. трудов АН Украины. Киев, - 1991. - С. 28-39.

11. Башков A.C. Низкомолекулярные гепарины//Эксперим. и клин, фармакология. 1993. - № 4. - С. 66-76.

12. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Л., 1963. - С. 34-38.

13. Белицер В.А., Варецкая Т.В. Модифицирование самосборки фибрина как путь к изучению механизма этого процесса//Укр. биохим. журн. 1975. - № 5. - С. 567-573.

14. Белоусов Ю.В., Моисеев B.C., Лепахин В.К. Клиническая фармакология и фармакотерапия. Руководство для врачей. М.: Универсум, 1993. - 240 с.

15. Бессмертный B.C. Математическая статистика в клинической, профилактической и экспериментальной медицине. М.: Медицина, 1967. - 303 с.

16. Болотина Т.Т. Определение молекулярного веса белка гель-фильтрацией на сефадексе//Успехи биол. хим. 1968. - т. IX. - С. 141-152.

17. Бышевский А.Ш., Зубаиров Д.М., Терсенов O.A. Тромбо-пластин. Новосибирск: изд-во НГУ. - 1990. - 281 с.

18. Бышевский А.Ш., Кожевников В.А. Свертываемость крови при реакции напряжения. Свердловск: Средне-Уральское кн. изд-во. - 1986. - 174 с.

19. Бышевский А.Ш., Умутбаева М.К., Чирятьев Е.А. Аминокислотный состав ингибитора самосборки фибрина из тканей крыс//Биохимия. 1984. - Т. 49. - № 12. - С. 1934-1939.

20. Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А. Ингибитор самосборки фибрина//Укр. биохим. журн. 1983. - Т. 55. - № 3. - С. 260-265.

21. Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А. Физиологический ингибитор аутополимеризации фибрин-мономера//В кн.: Система регуляции агрегатного состояния крови в норме и патологии: Тез. докл. Всесоюз. совещания, октябрь 1982. М., 1982. - С. 89-93.

22. Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А., Дементьева И.А., Левен П.И., Леонова О.П., Чабанов М.К. Антикоагулянты недиализую-щейся фракции аммиачного экстракта травы медуницы мягчайшей/ /Укр. биохим. журн. 1991. - № 6. - С. 26-33.

23. Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А., Умутбаева М.К., Тажу-динова С.И. Пептид регулятор агрегатного состояния крови на этапе самосборки фибрина//Гематология и трансфузиология. -1986. - № 6. - С. 26-31.

24. Варецкая Т.В. Строение и свойства фибриногена и фибрина: Дисс. . докт. биол. наук. Киев, 1977. - 357 с.

25. Васильева Г.В., Свиридова С.И. Синтез физиологически активного аналога цепи фибрина и его производных/ /В кн.: VI Всесоюз. симп. по химии белков и пептидов: тез. докл. Рига. -1983. - С. 344-345.

26. Венецкий И.Г. Вариационные ряды и их характеристика. -М.: изд-во Статистика, 1970. 158 с.

27. Воронцов В.В., Гершкович К.Б., Шаркова Т.С., Серебренникова Т.Н., Айсина Р.Б. Кинетические свойства очищенного фермента лонголитина из сапрофитного гриба Artrobotrys Longa//Тромбоз, гемостаз и реология. 2001. - № 1(5). - С. 83.

28. Габитов С.З., Воронина И.Е., Литвинов Р.И. Два простых способа обнаружения продуктов деградации фибрина в крови//Лаб. дело. 1982. - № 6. - С. 354-356.

29. Гаврилов O.K. Проблемы и гипотезы в учении о свертывании крови. М., 1981.

30. Герберт И.Я. К изучению антикоагулянтных свойств медуницы мягчайшей//В кн.: Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины. Тез. докл. конф. молодых ученых. Тюмень, 1983. - С. 120-121.

31. Герберт И.Я. Природа и свойства антикоагулянта прямого действия из травы медуницы мягчайшей: Дисс. . канд. биол. наук. Тюмень. 1989. - 121 с.

32. Герберт И.Я., Левен П.И., Бышевский А.Ш. Противосвер-тывающее действие полифенолсодержащей фракции из надземной части медуницы мягчайшей//Раст. ресурсы. 1988. Т. 22, № 3. - С. 429-434.

33. Гринкевич Н.И., Сафронич Л.А. Химический анализ лекарственных растений. М., Высшая школа, 1983. - 175 с.

34. Губаев А.Г. Фармакологические свойства антикоагулянта прямого действия из травы нонея темная: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Челябинск, - 1996. - 25 с.

35. Дементьева И.А. Защитное действие недиализующейся фракции экстракта медуницы при угрозе тромбоза//В кн.: Обмен веществ в норме и патологии. Тюмень, 1992. - С. 30.

36. Дементьева И.А. Природа и свойства антикоагулянтов из недиализирующейся фракции аммиачного экстракта травы медуницы: Дис. . канд. мед. наук. Тюмень. - 1991. - 139 с.

37. Дементьева И.А. Противосвертывающее действие недиализующейся фракции экстракта медуницы//Тез. докл. науч.-практ. конф. Полтава, 1989. - С. 275.

38. Дементьева И.А,, Левен П.И. Влияние водно-спиртовых экстрактов медуницы на образование фибрина в изолированных системах//В кн.: Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины. Тез. докл. конф. молодых ученых. Тюмень, 1988. - С. 153.

39. Дементьева И.А., Леонова О.П., Умутбаева М.К. Препарат противосвертывающего действия из медуницы мягчайшей//В кн.: Молодежь практ. здравоохранению. Тез докл. Всесоюзн. науч. конф. мол. ученых. - М., - 1990. - С. 42-43.

40. Дмитриев В.В. Гепаринотерапия ДВС крови при гнойно-воспалительных заболеваниях у детей//Анестезиология и реаниматология. 1991. - № 1. - С. 69-72.

41. Доменяка С.С., Краснов Е.А. Антикоагулянты растительного происхождения//В кн.: Вопросы физиологии и патологии иммуногенеза и гемостаза. Чита, 1982, - С. 78-79.

42. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды, белки. М.: Мир, 1976. - 364 с.

43. Ена Я.М. Всесоюзное совещание, посвященное применению пиявки//Врачебное дело. 1992. - № 5. - С. 115-117.

44. Ефимов B.C., Румянцева А.Г. Нежелательные эффекты длительного применения гепарина и подходы к их устранению/ /Эксперим. и клин, фармакол. 1992. - Т. 55, № 6. - С. 7376.

45. Зубаиров Д.М. Биохимия свертывания крови. М.: Медицина. - 1987. - 175 с.

46. Зубаиров Д.М. Молекулярные основы свертывания крови и тромбообразования. Казань: изд-во ФЭН. - 2000. - 368 с.

47. Ильина A.B., Давидович Ю.А., Рогожин C.B. Синтез аналога N-концевого пептида а-цепи фибрина с последовательностью Gly-Pro-Arg//В кн.: VI Всесоюз. симп. по химии белков и пептидов: тез. докл. Рига. - 1983. - С. 342-343.

48. Исакова Б.И., Омелич А.М., Филипова Л.И., Яковлева JI.B. Изучение противовоспалительной и желчегонной активности полисахаридов//В кн.: Актуальные вопросы поиска и технологии лекарств: тез. докл. Республ. науч. конф. Харьков, 1981. - С. 268-269.

49. Исаханян Г.С. Влияние гирудотерапии на агрегацию тромбоцитов у больных с острым инфарктом миокарда/ /Кровообращение. 1991. - Т. 24. - № 3. - С. 32-34.

50. Калинин Е.П. Влияние антикоагулянтных фракций сапропеля на плазмокоагуляцию и тромбоцитарный гемостаз: Дис. . канд. биол. наук. Тюмень, 2000. - 142 с.

51. Калинин Е.П., Русакова O.A., Чирятьев Е.А. Выделение и предварительная характеристика ингибиторов свертывания крови из сапропеля//Вестник Тюменской медицинской академии. Тюмень, - 1999. - № 2. - С. 53-56.

52. Калинин Е.П., Русакова O.A., Чирятьев Е.А. К вопросу о механизме ограничения свертывания крови антикоагулянтами из сапропеля//В кн.: Тез. докл. Междунар. симп. Медицина и охрана здоровья. Тюмень, - 1998, - С. 76.

53. Калинин Е.П., Чирятьев Е.А. Русакова O.A. Антиагрегаци-онная активность низкомолекулярных ингибиторов из сапропеля in vitro и in vivo//Вестник Тюменской медицинской академии. -Тюмень, 1999а. - № 2. - С. 182.

54. Каменев Ю.Я. Пиявки (гирудотерапия). С-Пб. мед. центр культуры здоровья им. А.С.Залманова, 1993. - 17 с.

55. Кацадзе Ю.Л. Тест толерантности плазмы к гепарину в диагностике тромбофилии/ /Лаб. дело. 1981. - № 7. - С. 411-414.

56. Киселева A.B. Медуница мягчайшая как возможный источник гепариноподобных средств//В кн.: Проблемы освоения лекарственных ресурсов Сибири и Дальнего Востока. Тез. докл. Всесоюзн. науч. конф. Новосибирск, 1983. С. 115-166.

57. Колхир В.К. Исследование влияния некоторых тритерпено-вых гликозидов на свертывающую систему крови//В кн.: Физиологически активные вещества в медицине. Ереван, 1983. - С. 148.

58. Колхир В.К., Соколов С.Я. Антикоагулянтные свойства галеновых препаратов левзеи//В кн.: Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока. Тез. докл. Всесоюзн. науч. конф. Томск, - 1986, - С. 80-82.

59. Колхир В.К., Соколов С.Я. Влияние некоторых препаратов, содержащих тритерпеновые гликозиды на свертывание крови/ /Хим. фарм. журнал. 1982. - № 5. - С. 532-537.

60. Кордэ H.B. Биостратификация и типология русских сапро-пелей. М.: Изд-во АН СССР. - 1960. - 219 с.

61. Кудряшов Б. А. Биологические проблемы регуляции жидкого состояния крови и ее свертывания. М.: Медицина. -1975. - С. 487-491.

62. Кудряшов Б.А. Фибринолитические и антикоагулянтные комплексы низкомолекулярного гепарина с тафцином//Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1992. - Т. 114. - № 12. - С. 609-611.

63. Кузник Б.И., Скипетров В.П. Форменные элементы крови.- М.: Медицина, 1974. С. 17.

64. Кузник Б.И., Цибиков H.H., Арушанян Л.Г. Полипептиды как регуляторы микроциркуляторного гемостаза / /Актуальные вопросы нарушений гемодинамики и регуляции микроциркуляции в клинике и эксперименте. М., 1984. - С. 185-186.

65. Левен П.И., Герберт И.Я. Антикоагулянты прямого действия из медуницы мягчайшей//В кн.: V Всесоюзн. биохим. съезд.- М„ Наука. 1986. - С. 280.

66. Левицкая Н.Г., Клейменов А.Н., Петросян М.Т., Розен-фельд М.А. и др. Влияние низкомолекулярных пептидов на процесс перехода фибриногена в фибрин//Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1987. - № 8. - С. 190-192.

67. Левицкая Н.Г., Петросян М.Т., Розенфельд М.А. Антикоагулянтные свойства низкомолекулярных пептидов//В кн.: Перспективы биоорганической химии в создании новых лекарственных препаратов. Рига, 1982. - С. 38-39.

68. Луговской Э.В., Гоголинская Г.К., Дерзская С.Г., Белицер В.А. Свойства двух форм мономерного фибрина, различающихся по степени активации тромбином. Характеристика последовательно образующихся активных центров//Биохимия. 1978. - № 6. - С. 1045-1053.

69. Лысенко А.И., Гончаров А.И., Чернявский В.И., Кулакова С.С. Влияние полисахаридного комплекса на синтез антител в эксперименте/ /В кн.: Микробиология, эпидемиология и клиника инфекционных болезней. Харьков, 1984. - С. 63-65.

70. Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Ашмарин И.П. Регуляторная роль пролин-содержащих пептидов в реакциях противосвертывающей системы//Тромбоз, гемостаз и реология. -2001.-№ 1(5). С. 50.

71. Мазаев A.B., Саргин К.Е. Клиническое применение гепарина и его низкомолекулярных фракций//Кардиология. 1986. -Т. 26, № 9. - С. 122-124.

72. Мальнева Г.В. Изучение продуктов триптического гидролизата фибриногена, специфично тормозящих полимеризацию мономерного фибрина: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Киев, 1969. - 27 с.

73. Мауер Г. Диск-электрофорез: Пер. с англ. М.: Мир, 1971. - 247 с.

74. Назаров В.Г. Лекарственные средства, влияющие на гемостаз/ /Акушерство и гинекология. 1993. - № 2. - С. 52-53.

75. Нохрина Н.Э. Природа и свойства антикоагулянтов из сабельника болотного: Дис. . канд. биол. наук. Тюмень, 1993. -130 с.

76. Нохрина Н.Э., Леонова О.П. Антиполимеризационный компонент растительного происхождения//В кн.: Обмен веществ в норме и патологии. Тюмень, 1992. - С. 71.

77. Панченко Е.П. Ингибиторы IIb/Illa рецепторов тромбоцитов новое направление в антитромботической терапии/ /Терапевт, архив - 1997. - № 9. - С. 66-71.

78. Пасторова В.Е., Ляпина Л.А., Ашмарин И.П. Участие пептидов в проявлении кровотечений//В кн: V Всесоюзн. конф.

79. Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдромы. Проблемы и лечение. М.:- 2000. С. 130-131.

80. Петросян М.Т., Розенфельд М.А., Петров А.К. Антикоагу-лянтные свойства пептидов аналогов N-концевого участка цепи фибрина//Система мозговых и внемозговых пептидов. - JL, -1984. - С. 67-68.

81. Плотников М.Б., Алиев О.И., Маслов М.Ю., Васильев A.C., Андреева В.Ю., Тюкавкина H.A., Калинкина Г.И., Краснов Е.А., Дмитрук С.Е.//Тромоз, гемостаз и реология. 2000. - № 3.- С. 32-35.

82. Радзевич И.М., Ходорова ЕЛ. Получение фибринмономера из нефракционированной плазмы крови//Укр. биохим. журн. -1969. № 4. - С. 367-370.

83. Русакова O.A. Антикоагулянты растительного происхождения. Природа и механизм действия: Дис. . канд. биол. наук. -Тюмень. 1993. - 142 с.

84. Русакова O.A. Прямые низкомолекулярные антикоагулянты естественного происхождения. Природа и механизм действия: Дис. . докт. биол. наук. Тюмень. - 1999. - 339 с.

85. Русакова O.A. Растения флоры Сибири как источники антикоагулянтов прямого действия//В кн.: Обмен веществ в норме и патологии. Тюмень. - 1992. - С. 84.

86. Русакова O.A., Губаев А.Г., Ортенберг Э.А., Чирятьев Е.А. Фармакологические свойства антикоагулянта прямого действия из травы нонея темная//В кн.: Актуальные проблемы фармации: сб. научн. трудов. Тюмень. - 1994. - С. 153-158.

87. Русакова O.A., Кайб И.Д., Чирятьев Е.А., Чабанов М.К. Природа и некоторые свойства прямого антикоагулянта растительного происхождения//В сб.: Тез. докл. межвуз. и 49 науч.-практ. конф. проф. преп. состава. Пермь, - 1993. - С. 122-123.

88. Русакова O.A., Калинин Е.П., Чирятьев Е.А. Влияние экстрактов из растений флоры Западной Сибири на некоторые показатели плазмокоагуляции//Науч. вестник Тюменской медицинской академии. Тюмень, - 2000. - № 4. - С. 30-31.

89. Русакова O.A., Калинин Е.П., Чирятьев Е.А., Южакова С.Ф. Влияние прямых низкомолекулярных антикоагулянтов растительного происхождения на плазмокоагуляцию in vivo//Науч. вестник Тюменской медицинской академии. Тюмень, - 1999а. - № 2. - С. 182.

90. Саноцкий И.В. Методы определения токсичности и опасности химических веществ. М.: Медицина. - 1970. - 343 с.

91. Скипетров В.П. Тканевое звено физиологической регуляции агрегатного состояния крови и клеточных структур//Успехи физиол. науки. 1986. - № 17. - С. 65-79.

92. Турова А.Д., Сапожникова Э.Н. Лекарственные растения СССР и их применение. М.: Медицина, - 1983. - С. 288.

93. Угарова Т.П., Белицер В.А. Исследование равновесной системы фибрин-фрагмент Д-протектор//Укр. биохим. журн. -1978. № 3. - С. 357-363.

94. Уэбб Л. Ингибиторы ферментов и метаболизма. М., Мир, - 1966. - 862 с.

95. Ферстрате М., Фермилен Ж. Тромбозы. М.: Медицина, -1986. - 250 с.

96. Фролова М.А. Поиск биологически активных веществ с предполагаемой антитромботической активностью среди N-замещенных имидазола//Сб. науч. тр.: Синтез и контроль качества лекарств. Рязань, - 1991. - С. 36-41.

97. Хайс И.М., Мацек К. Хроматография на бумаге. М., изд-во иностр. лит., - 1962. - 851 с.

98. Хушбактова З.А., Сыряв В.Н., Джухарова М.Х. и др. Исследования гиполипидемических свойств полисахаридов, выделенных из флоры Средней Азии//Хим. фарм. журн. 1987. - № 11. - С. 1348-1352.

99. Чазов Е.И. Тромбозы и эмболии в клинике внутренних болезней. М.: Медицина. - 1966. - 263 с.

100. Чазов Е.И., Лакин К.М. Антикоагулянты и фибринолити-ческие средства. М.: Медицина. - 1977. - 311 с.

101. Черкасова К.А. Влияние пептидов PGP и MEHFPGP (Се-макс) на показатели плазменного гемостаза//Тромбоз, гемостаз и реология. 2001. - № 1(5). - С. 139-140.

102. Чипенс Г.И. Дизайн лекарственных препаратов на базе пептидов//Перспективы биоорганической химии в создании новых лекарственных препаратов: сб. трудов. Рига: изд-во ун-та, 1982. - С. 7-9.

103. Чирятьев Е.А. Пептидные ингибиторы коагуляционного превращения фибриногена: Дисс. . докт. биол. наук. Тюмень, 1990. - 290 с.

104. Чирятьев Е.А., Бышевский А.Ш., Леонова О.П., Михалева И.В. Пептидные ингибиторы коагуляционного превращенияфибриногена//Укр. биохим. журн. 1991. - Т. 63. - № 1. - С. 2633.

105. Чирятьев Е.А., Дороднева Е.Ф., Патракова А.Н., Майда-нюк С.А. Антикоагулянтный эффект извлечений из некоторых растений Сибири и Дальнего Востока//В кн.: Тез. докл. Всесоюз. конф. СО АМН СССР. вып. 2. Томск, 1989. - С. 189-190.

106. Чирятьев Е.А., Калинин Е.П., Кортусов В.Л., Платонов Е.В., Русакова O.A. Некоторые свойства антикоагулянтов из сапропеля//Тромбоз, гемостаз и реология. Мат. VI национальной конф. «Атеротромбоз и артериальная гипертония». 2001, - № 1(5). - С. 140-141.

107. Чирятьев Е.А., Левен П.И., Дементьева И.А., Дороднева Е.Ф. АС на изобретение "Способ получения средства, обладающего антикоагулянтной активностью." № 1622981 от 22 сентября 1990 г.

108. Чирятьев Е.А., Леонова О.П., Бышевский А.Ш. Взаимодействие пептидного ингибитора с двумя формами мономерного фибрина, различающимися по степени активации/ /Укр. биохим. журн. 1989. - Т. 61. - № 1. - С. 3 - 9.

109. Чирятьев Е.А., Леонова О.П., Бышевский А.Ш. Механизм торможения самосборки фибрина ингибитором пептидной природы/ /Биохимия. 1988. - Т. 53. - № 6. - С. 1025-1032.

110. Чирятьев Е.А., Приймак Н.В., Платонов Е.В., Русакова O.A. Некоторые свойства новой группы пептидных антикоагулянтов и перспективы их исследования//В кн.: Тез. докл. Междунар. симп. Медицина и охрана здоровья. Тюмень, - 1997, - С. 355.

111. Чирятьев Е.А., Русакова O.A. Виды флоры Сибири как источники антикоагулянтов прямого действия//Раст. ресурсы. -1994. вып. 4. - С. 21-28.

112. Чирятьев Е.А., Русакова O.A. К механизму ограничения реакции тромбина с фибриногеном ингибиторами растительного происхождения//В сб.: Обмен веществ в норме и патологии. -Тюмень, 1992. - С. 112.

113. Чирятьев Е.А., Тажудинова С.И. Эндогенные пептиды -регуляторы самосборки фибрина//В кн.: Тез. докл. науч.-практ. конф. Актуальные проблемы фармации. Тюмень, - 1985. - С. 9192.

114. Чирятьев Е.А., Яковлева-Приймак Н.В., Русакова O.A., Платонов Е.В. Некоторые свойства новой группы пептидных антикоагулянтов и перспективы их исследования//в кн.: Материалы междунар. симп. «Медицина и охрана здоровья.» Тюмень. - 1997. - С. 355-357.

115. Чирятьев Е.А., Яковлева-Приймак H.В., Русакова О.А., Калинин Е.П. Естественные ингибиторы коагуляционного превращения фибриногена: природы и механизм действия//Медико-биологический вестник им. Я. Д. Витебского. 1996. - № 2. - С. 2627.

116. Шафер В.М. Коррекция гемокоагуляционных сдвигов при экспериментальной тромбопластинемии комплексом витаминов А, Е, С и РР: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Челябинск, 1989. -24 с.

117. Шталь Э. Хроматография в тонких слоях: Пер. с англ. -М.: Мир, 1965. - 508 с.

118. Achyuthman К., Dobson J., Greenberg Ch. Gly-Pro-Arg modifies the glutamine residues in the a- and y-chain in fibrinogen: inhibitor of transglutaminase cross-linking//Biochem. Biophys. Acta.- 1986. № 3. P. 261-268.

119. Alderman M., Hansen A. Effects of naturally occurring and synthetic thrombin inhibitors//Arch. Intern. Med. 1986. - Vol. 148.- P. 1400-1407.

120. Al-Obeidi F., Ostrem J. Factor Xa inhibitors by classical and combinatorial chemistry//DDT. 1998. - V. 3. - N 5. - P. 223231.

121. Ansell J., Deykin D. Heparin-induced thrombocytopenia and recurrent thromboembolism//Amer. J. Hemat. 1980. - Vol. 8. - P. 325-332.

122. Avenarius H., Deinhardt J. Durchfuhrung und Auswertung von Aggregationatesten//Prakt. Anwend. Thrombozytenfun-ktionsdiagn. Stuttgart-New-York. - 1980. - P. 57-68.

123. Bagdy D., Diozegi M., Sebestyent J. e.a. A D-Phe-Pro-Arg-A anticoagulants lemezke funktio ot gatlo Lataso in vivo/ /Kiserl. Or-voshud. 1984. - № 1. - P. 26-46.

124. Barker P., Bullens S„ Bunting S., Burdick D. Cyclic RGD peptide analogues as antiplatelet antithrombotica//J. Med. Chem. -1992. V. 35. - № 11. - P. 2040-2048.

125. Barradas M., Mikhailidis D., Epemolu O. et al. Comparison of the platelet proaggregatory effect of conventional unfractionated heparins and low molecular weight heparin fraction (CY-222)//Brit. J. Haemost. 1987. - Vol. 67. - N 4. - P. 451-458.

126. Bergquist D., Frisell J., Haibook T. et al. Anticoagulant effect of low molecular weight heparin//Thromb. Haemost. 1987. -Vol. 57. - Suppl. 1. - P. 1339a.

127. Bertele V., Roncaglioni M.C., Donati M.B., Caetano G. Heparin conteracts the antiaggregating effect of prostacyclin by potentiating platelet aggregation//Thrombos. Haemost. 1983. -Vol. 49, N 2. - P. 81-83.

128. Bick R. Disorders of haemostasis and thrombosis. Principles of clinical practice. New York, 1985.

129. Blank M., Eldor A., Tavor S., e.a. A mouse model for hepa-rin-induced thrombocytopenia//Semin. Haematol. 1999. - V. 36. - N 1. - P. 12-16.

130. Blomback B., Okada M. Fibrin gel structure and clotting time//Thromb. Res. 1982. - N 1/2. - P. 51-70.

131. Borg J.Y., Flecht B., Legendve M. et al. Heparin and low molecular weight heparins-induced thrombocytopenias/ /Thromb. Res. 1986: - Suppl. 6. - P. 96.

132. Brase L.D., Fareed J. Heparin-induced platelet aggregation (H-IPA) dose/response weight heparin preparations//Thromb. and Haemost. 1987. - Vol. 58, N 1. - P. 18.

133. Brosstasd F., Godal H. Qualitive changes in fibrinogen following exposure to agents used for preparation of fibrin monomers//Haemostasis. 1977. - № 3. - P. 149-156.

134. Brosstasd F., Godal H., Kierulf P. Preparation of fibrin monomers from human fibrinogen in urea, using soluble or in-solublized thrombin//Haemostasis. 1977a. - № 4. - P. 225-235.

135. Brosstasd F., Godal H., Kierulf P. Some characteristics of various fibrin monomer preparations made from dissolvea fibrin clots//Haemostasis. 1977. - № 4. - P. 213-224.

136. Bum-Soo Hahn, So Yean Cho, Song Ji Wu et all. Purification and characterization of serine protease with fibrinolytic activity from Tenodera sinensis//Biochim. Biophys. Acta. 1999. - V. 1430. - P. 376-386.

137. Caranobe C., Barret A., Gabaig A. et al. Disappearance of circulating anti-Xa acting after intravenous injection of standart heparin and of low molecular weight heparin (CY-216)//Thromb. Res. 1985. - N 1. - P. 129-133.

138. Chong В., Ismail F., Cade J. et al. Heparin-induced thrombocytopenia: studies with a new low molecular weight heparinoid, Opg. 10172//Blood. 1989. - Vol. 73. - N 6. - P. 15921596.

139. Chung-Nan Lin, Pao-Lin Huang, Jeh-Jeng Wang et all. Stereochemistry and biologicak activities of constituents from Cyan-chum taiwanianum//Bioch. et Biophys. Acta. 1998. - N 1380. -P. 115-122.

140. Cimo P.L., Moake J.L., Weiniger R.S. et al. Heparin-induced thrombocytopenia: association with platelet aggregation and arterial thrombosis//Amer. J. Hemat. 1979. - Vol. 6. - P. 125-133.

141. Cohen M. Heparin-induced thrombocytopenia and the clinical use of low molecular weight heparins in acute coronary syndromes//Semin. Haematol. 1999. - V. 36. - N. 1. - P. 33-36.

142. Coleman M., Vigliano E., Weksler M., Nachman R. Inhibition of fibrin monomer polymerization by lambda myeloma globu-luns//Blood. 1972. - V. 39. - P. 210-223.

143. Coilen D., Lijnen H. Molecular basis of fibrinolysis, as relevant for thrombolytic therapy//Thromb. Haemost. 1995. - V. 74. -№ 1. - P. 167-171.

144. Cox D„ Aoki T„ Seki J., Motoyama Y„ Yoshida K. The pharmacology of the integrins//Med. Res. Rev. 1994. - V. 14. -№ 2. - P. 195-228.

145. Deacon-Smith R., Lee-Potter., Rogers D. Platelet agregation in the presense of extracts of Britich marine algae//Med. Lab. Sch. 1985. - N 4. - P. 404-405.

146. Dennis S., Wallace A., Hofsteenge J., Stone S. Use of fragments of hirudin to investigate thrombin-hirudin interaction//Eur. J. Biochem. 1990. - V. 188. - № 1. - P. 61-66.

147. Dunn F., Soria C., Thomaidis A. et al. Interaction of platelet with standart heparin and low molecular weight fractions/ /Nouv. Rev. Franc. Hemat. 1984. - Vol. 26. - 249 p.

148. Fang-Rong Chang, Jia-Lin Wei, Che-Ming Teng, Yang-Chang Wu/ /Phytochemistry. 1998. - Vol. 49, N 7. - P. 20152018.

149. Finney C., Seale L., Sawyer R., Wallis R. Trigenin, a new peptidic inhibitor of factor XHIa, from the blood-suking leech Hae-menteria ghulianii//Biochem. J. 1997. - № 324. - P. 797-805.

150. Fioravanti C., Burkholder D., Francis B., Siegl P., Gibson R. Antithrombotic activity of recombinant tick anticoagulant peptide and heparin in a rabbit model of venous thrombosis//Thromb. Res. -1993. V. 71. - N 4. - P. 317-324.

151. Frohlish E., Alderman S. Heparin: chemistry and clinical usage//Lancet. 1988. - N 4. - P. 1349-1354.

152. Gabriel D., Smith L., Folda J. The influence of immunoglobulin on the assembly of fibrin gels//J. Lab. Clin. Med. 1983. - № 4. - P. 545-552.

153. Galanakis D., Ginzler E., Fikring S. Monoclonal Ig G anticoagulants delaying fibrin aggregation in two patients with systemic lupus erythematosus//Blood. 1978. - V. 52. - P. 1037-1046.

154. Gibbs A., Green G., Doctor V. Isolation and anticoagulant properties of polysaccharides of Typha angustata and Daemonorops species//Thromb. Res. 1984. - N. 3. - P. 97-108.

155. Girdwood R. Metabolism of antithrombin III (heparin cofactor)/ / Clinical pharmacology. London, 1985. - P. 474-479.

156. Godal H., Brosstad F., Kierulf P. Influence of Na2-EDTA and some compounds used for Dissolution of fibrin clots of the compounds used for dissolution of fibrinogen and fibrin//Bibl. Haematol. 1978. - N 44. - P. 151-155.

157. Griffiths E., Dzink W. Assays for heparin-induced thrombocytopenia//Transfus. Med. 1997. - V. 7. - N 1. - P. 1-11.

158. Hantgan R., Jerom W., Hursting M. No effects of clot age or thrombolysis on Argatrobans inhibition of thrombin//Blood. -1998. V. 92. - № 6. - P. 2064-2074.

159. Hemker H.C., Beguin S., Wielders S., Wagenvoord R. Practical consequence of modern insights in the mode of action of fraxiparine and other low molecular weight heparins//Fraxiparine Second International Symposium. Monte Carlo, 1989. - P. 24-25.

160. Hirsh J., Levine M.N. Low molecular weight heparin//Blood. 1992. - Vol. 79. - N 1. - P. 1-17.

161. Hoffman A., Markwardt F. Inhibition of the thrombin-platelet reaction by hirudin//Haemostasis. 1984. - Vol. 14. - N 7. -P. 164-169.

162. Hoots W., Carrel N., Wagner R., Cooper H., McDonagh G. A naturally occuring antibody that inhibits fibrin polymerization// New Engl. J. Med. 1981. - № 15. - P. 857-861.

163. Horng-Huey Ko, Jeh-Jeng Wang, Hsien-Cheng Lin, Jih-Pyang Wang, Chun-Nan Lin. Chemistry and biological activities of constituens from Morus australus//Bioch. et Biophys. Acta. 1999.- N 1428. P. 293-299.

164. Hsiech K., Mudd M., Wilner G. Fibrin polymerization. 1. Alkilating peptide Inhibitors of fibrin polymerization//J. Mtd. Chem.- 1981. V. 24. - P. 322-327.

165. Huang T., Holt J., Kirby E., Niewiarowski S. Trigramin: primary structure and its inhibition of von Willebrand factor binding to glycoprotein lib/Ilia complex on human platelets/ /Biochemistry.- 1989. V. 28. - № 2. - P. 661-666.

166. Huang T., Niewiarowski S. Disintegrins: the naturally-occurring antagonists of platelet fibrinogen receptor/ /J. Toxicol. Toxin Rev. 1994. - V. 13. - P. 253-273.

167. Joen-Rong Sheu, Ya-Chen Kan, Wei-Chun Hung, Ching-Hua Su et all//The antiplatelet activity of Rutaecarpine an alkaloid isolated from Evodia rutaecarpa, is mediated through inhibition of phos-pholipase C//Tromb. Res. 1988. - N 92. - P. 53-64.

168. Kaiser B., Markwardt F. Antithrombotic and haemorrhagic effects of the naturally occuring thrombin inhibitor hirudin/ /Folia Haemat. 1988. - Vol. 115, N 1-2. - P. 41-46.

169. Kausmann W. Some factors in the interpretation of protein-denaturation/ /Adv. Protein Chem. 1959. - V. 14. - P. 234.

170. Kosure T., Ishida H., Vamazaki H., Ishii M. Studies on active substances in the herbs used for Oketsu, blood coagulation, in Chinese medicine//J. Pharm. Soc. Japan. 1984. - V. 104. - N 10. - P. 1050-1053.

171. Kuyas C., Doolittle R. A syntetic Gly-Pro-Arg derivative that binds to plasma albumin and inhibits fibrin formation//Thromb. Haemost. 1983. - № 1. - P. 356-356.

172. Laudano A., Coffrell B., Doolittle R. Syntetic peptides modeled of fibrin polymerization sites//Molecular biology of fibrinogen and fibrin/ New-York. 1983. - P. 315-329.

173. Laudano A., Doolittle R. //Fed. Proc., Biochem. 1979. -V. 38. - P. 2968-2968.

174. Laudano A., Doolittle R. Studies on syntetic peptides that bing fibrinogen and prevent fibrin polymerization//Biochemistry. -1980. N 5. - P. 1013-1019.

175. Leger D., Karniguian A., Soria J. Inhibition of some activates of thrombin by a collagen-derived octapeptide//Haemostasis. -1985. N 5. - P. 293-299.

176. Levine M. Low molecular weight heparin/ /Agressologie. -1989. Vol. 30, N 6. - P. 347-348.

177. Lewis B., Grassman E., Wrona L., Rangel Y. Novastan anticoagulation during renal stent implant in a patient with heparin-induced thrombocytopenia//Blood Coagulation And Fibrinolysis. -1997. V. 8. - № 1. - P. 54-58.

178. Lynch J., Sitko G., Lehman E., Vlasuk G. Primary prevention of coronary arterial thrombosis with the factor Xa inhibitor rTAP in a canine electrolytic injuri model//Thromb. Haemost. 1995. -V. 74. - N 2. - P. 640-645.

179. Mao S„ Huang J., Welebob C., Neeper M., Garsky V., Shafer J. Identification and characterization of variants of tick anticoagulant peptide with increased inhibitory potency toward human factor Xa//Biochemistry. 1995. - V. 34. - N 15. - P. 5098-5103.

180. Marciniak E., Greenwood M. Acquired coagulation inhibitor delaying fibrinopeptide release//Blood. 1979. - V. 53. - P. 81-92.

181. Markwardt F. Hirudin as a inhibitor of thrombin//Meth. In Enzym. 1970. - V. 80. - P. 924-932.

182. Markwardt F. Pharmacology of hirudin, one hundred years after the first report of the anticoagulant agent in medicinal leeches//Biomed. Biochim. Acta. 1985. - Vol. 44, N 5. - P. 10071013.

183. Martin P., Robertson W„ Turk D„ Huber R„ Bode W„ Edwards B. The structure of residues 7-16 of the A alpha-chain of human fibrinogen bound to bovine thrombin at 2.3-A resolution//.!. Biol. Chem. 1992. - V. 267. - № 11. - P. 7911-7920.

184. Matsuda H., Kubo M. Pharmacological study on Panax ginseng C.A. Meyer. 1. Effects of red Ginseng on the experimental disseminated intravascular coagulation//J. Pharm. Soc. Japan, 1983, V. 103, N 12, P. 1269-1277.

185. Mattias F., Hocke G. On the separation of fibrinogen degradation products D and E//Biochim. Biophys. Acta. 1976. - V. 427. - P. 569-574.

186. Medved L., Gorcum O., Manyakov V., Belitser V. The role of fibrinogen aC-domains in the fibrin assembly process//FEBS Lett. 1985. - № 1. - P. 109-112.

187. Miraglia C., Greenberg C. Measurement of blood coagulation factor XHIa formation in plasma containing Gly-Pro-Arg-Pro/ /Anal. Biochem. 1985. - N 1. - P. 165-171.

188. Mitchell.R, Beller F. Quantitation of the coagulation inhibition in vivo due to brenkdown products of fibrin//Thromb. Diath. Haemorrh. 1970. - № 3. - P. 477-485.

189. Nair C., Shan G., Dhell D. Effect of temperature, pH and ionic strength and composition on fibrin network structure and its development//Thromb. Res. 1986. - N 6. - P. 809-816.

190. Nakamura T., Shosuke 0., Saito V., Kuwaki T., Maysumoto H. Characteristic inhibitions of thrombin and plasmin by active ingredients of chinense herbs//Thromb. a. Haemost., 1983, V. 50, N 1, -P. 199.

191. Niewiarowski S., McLane M., Kloczwiak M., Stewart G. Disintegrins and other naturally occurrimg antagonists of platelet fibrinogen receptors/ /Semin. Hematol. 1994. - V. 31. - № 4. - P. 289-300.

192. Niwa M., Vuasa K., Kondo Sh., Sakuragava N. Studies on Wakan-Wakus (tradithional herbal drags): especially on the effects of Gaivoh (Artemiae folium) on blood coagulation//Thromb. Res., 1985, V. 38, N 6, P. 671-673.

193. Ohta N., Brush M., Jacobs J. Interaction os antistasin-related peptides with factor Xa: identification of a core inhibitory sequence/ /Thromb. Haemost. 1994. - V. 72. - N 6. - P. 825-830.

194. Pastorova V., Liapina L., Smolina T., Ashmarin I. Anticoagulant and fibrinolytic effects of prolin-containing peptides//Izv. Akad. Nauk. Ser. Biol. 1998. - N. 3. - P. 390-394.

195. Petroni A., Blasevich M., Salami M., Papini N., Montedoro G., Galli C. Inhibition on platelet aggregation aqnde eicosanoid production by phenolic components of olive oil//Thromb. Res. 1995. -V. 78. N 2. - P. 151-160.

196. Phillips D., Scarborough R. Clinical pharmacology of eptifi-batide//Am. J. Cardiol. 1997. - V. 80. - № 4A. - P. 11B-20B.

197. Rostin M., Moutestruc J., Monin G. et al. Fraxiparine -clinical applications//Fundam. Clin. Pharmacol. 1990. - N 4. - P. 17-23.

198. Rouslahti E., Pierschbacher M. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins//Science 1987. - V. 238. - № 4826. -P. 491-497.

199. Ruggeri Z., Houghten R., Russel S., Zimmermann T. Inhibition of platelet function with synthetic peptides designed to be high-affinity antagonists of fibrinogen binding to platelets//Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1986. - V. 83. - № 15. - P. 5708-5712.

200. Schafer A. The hypercoagulable state//Ann. Later. Med. -1985. Vol. 102. - N 6. - P. 814-828.

201. Schaffer L., Davidson J., Vlasuk J., Siegl P. Antithrombotic efficacy of recombinant tick anticoagulant peptide. A potent inhibitor of coagulation factor Xa in a primate model of arterial thrombosis//Circulation. 1991. - V. 84. - № 4. - P. 1741-1748.

202. Schraden J. Nidermolekulare heparine // Arzmimittel therapie. 1988. - Bd. 6, N 5. - S. 147-155.

203. Stein R., Preiss D. Antikoagulatien//Krankenhous Arzt. -1984. Bd. 57. - S. 24-32.

204. Stone S.R. Effect of heparin on the interaction between thrombin and hirudin//Eur. J. Biochem. 1987. - Vol. 169. - N 2. -P. 373-376.

205. Stremberger A., Stohr R., Ziegler L., Blumel G. Actionof radix Salvia milthiorrhizae decoctions on cjagulation and fibrinoly-sis/ /Thromb. Haemost. 1983. - V. 50. - N 1. - P. 198-198.

206. Takagi K., Suzuki S. Anticoagulant peptides jbtained from human fibrinogen degradation products by plasmin//Thromb. Res. -1979. N 16. - P. 737-746.

207. Tanaka S., Tomoike H. Antithrombotic and haemorrhagic effects of hirudin//Jpn. Heart J. 1988. - Vol. 29. - P. 77-79.

208. Teng C., Huang T. Snake venom constituents that aftect platelet function//Platelets 1991. - V. 2. - P. 77-87.

209. Tian-Sung Wu, Hua-Chun Hsu, Pei-Lin Wu, Che-Ming Teng, Yang-Chang Wu//Phytochemistry. 1998. - Vol. 49, N 7. - P. 2001-2003.

210. Tsao P., Bozarth J., Jackson S., Forsythe M., Flint S., Mousa S. Platelet GPIIb/lIIa receptor occupancy studies using a novel fluoresceinated cyclic Arg-Gly-Asp peptide//Thromb. Res. -1995. V. 77. - № 6. - P. 543-556.

211. Uszynsky M. Anticoagulant activity peptides from the human placenta//Thromb. Res. 1979. - V. 16. - P. 689-694.

212. Van Zyl W., Pretorius G., Hartmann M., Kotze H. Production of a recombinant antithrombotic and fibrinolytic protein, PLATSAK, in Escherichia coli//Thromb. Res. 1997. - V. 88. - № 5. - P. 419-426.

213. Verstrate M. Clinical usage of heparin//Triangle. 1984. -Vol. 23. - N 2. - P. 49-55.

214. Vlasuk J. Structural and functional characterization of tick anticoagulant peptide (TAP): a potent and selective inhibitor of blood coagulation factor Xa//Thromb. Haemost. 1993. - V. 70. - № 1. - P. 212-216.

215. Walenga J., Fasanella A., Iqbal O., Hoppensteadt D., Ahmad S., Wallis D., Bakhos M. Coagulation laboratory testing in patients treated with argatroban//Semin. Thromb. Haemost. 1999. - V. 25. - Suppl. 1. - P. 61-66.

216. Wang J., Hsu M., Tery C. Antihemostatic effect of Hsien-Ho-Tsao (Agrimonia pilosa)//Amer. J. Clin. Med. 1984. - Vol. 12, N 1-4. - P. 116-121.

217. Wang L., Huhle G., Malsch R. Determination of heparin-induced Ig-G antibody in heparin-induced thrombocytopenia type II//Eur. J. Invest. 1999. - V. 29. - N 3. - P. 232-237.

218. Weinstein M., Deykin D. Quantitative abnormality of an a-Chain molecular weight from in the fibrinogen of cirrhotic pa-tients//Brit. J. Haematol. 1978. - V. 40. - P. 617-630.

219. Weis H.J. Antiplatelet therapy//N. Engl. J. Med. 1988. -Vol. 298. - P. 1344-1347.

220. Williams R. Morphology of fibrinogen monomers and fibrin protofibrils//Molecular Biology of fibrinogen and fibrin/NYAS, 1983. P. 180-194.

221. Yeh C„ Peng H„ Yih J., Huang T. A new short chain RGD-containing disintegrin, accutin, inhibits the common pathway of human platelet aggregation//Biochim. Biophys. Acta 1998. - V. 1425. - № 3. - P. 493-504.