Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Прямые низкомолекулярные антикоагулянты естественного происхождения. Природа и механизм действия

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Прямые низкомолекулярные антикоагулянты естественного происхождения. Природа и механизм действия"

РГ6 од - / МАР 2003

РГ Б ОД

НаЬрав&'^рукщЦГёи

Русакова Ольга Александровна

Прямые низкомолекулярные антикоагулянты естественного происхождения. Природа и механизм действия.

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Уфа - 1999

)

Работа выполнена в Тюменской государственной медицинской академии

Научные консультанты:

член-корреспондент АЕ и МАИ, заслуженный изобретатель РФ, доктор медицинских наук, профессор А.Ш. Бышевский, доктор медицинских наук, профессор В.Н. Ананьев

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Т.Г. Нигматуллин Доктор биологических наук, профессор С.А. Башкатов Доктор медицинских наук, профессор В. В. Соломатин

Ведущее учреждение:

Гематологический научный центр РАМН

Защита состоится " января 2000 г на заседании диссертационного Совета Д 084.35.01. при Башкирском государственном медицинском университете (425000, г. Уфа, ул. Ленина, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан

. д.

декабря 1999 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук,

профессор Х.М. Насыров

РЩ- 111-!, о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Система гемостаза выполняет в организме ряд жизненно важных функций - поддерживает кровь в жидком состоянии, препятствует тромбообразованию и блокаде микроциркуляции в органах, предотвращает кровоточивость и обеспечивает купирование уже развившихся геморрагий и т.д. /Кузник Б.И., Скипетров В.П., 1974; Гаврилов O.K., 1981; Баркаган З.С., 1988/.

Нарушения системы гемостаза играют ключевую патогенетическую роль • при таких патологических процессах, как инфаркт миокарда, ишемический инсульт, тромбоэмболии различной локализации, воспалительные заболевания, шок и др. /Макаров В.А., 1989; Ферстрате М., Фермилен Ж., 1986/, т.к. при указанных ситуациях именно свертывающая система и клеточный гемостаз в значительной мере предопределяет развитие геморрагий, тромбогемор-рагий, ишемических изменений в органах, создавая предрасположенность к тромбозам/Gabor, 1982; Wanga, Herkwardt, 1984/.

Таким образом, профилактика и лечение тромбоэмболий - является одной из важнейших задач современной медицины /Ушкалова Е.А. и соавт., 1989/. Между тем, клиники еще не располагают достаточным количеством высокоэффективных средств регуляции плазменного и клеточного гемостаза /Макаров В.А., 1989; Kastello, Maillet, 1981/.

Для снижения активности тромбоэмболических процессов используются в основном следующие группы препаратов: ингибиторы агрегации тромбоцитов (антиагреганты), антикоагулянты непрямого действия, вещества, удаляющие фибриноген из кровотока (дефибринаторы) или стимулирующие эндогенную фибринолитическую систему (фибринолитики) /Метелица В.И., 1987; Ферстрате М., Фермилен Ж., 1986; Weis, 1988/. Причем если каждую из первых трех групп представляют по меньшей мере 3-4 препарата, то подгруппа наиболее важных антикоагулянтов прямого действия в клинике многие годы представлена лишь гепарином (или его производными), отличающимся сильным, но кратковременным эффектом.

Хотя гепарин и является средством выбора, он отличается рядом недостатков. К важнейшим из них можно отнести способность вызывать агрегацию тромбоцитов /Bertele е.а., 1983; Cimo е.а., 1979/ и тромбоцитопению /Ansell, Deykin D„ 1980; Borg е.а., 1986; Griffiths, Dzik, 1997; Wang e.a., 1999; Blank e.a., 1999/. Известно и о существовании гепаринорезистентности /Баркаган З.С. и соавт., 1982; 1988/. Нередко отмечаются тромбоэмболические осложнения после отмены гепарина /Brase, Fareed, 1987/.

В связи с этим исследования в области поиска естественных или создания новых средств направленного воздействия на гемостаз не прекращаются уже много лет. Активно изучаются ингибиторы тромбина (TP) /Markwardt, 1974/, активаторы фибринолиза и фибринолитики /Терешин И.М., Гринберг Г.Е., 1981; Андреенко Г.В., 1981/, иммобилизированные ферменты и комплексные препараты /Мамедов Я.Д. и соавт., 1981/.

Не остались в стороне и растения, как источники веществ, модифицирующих гемостаз, среди которых найдены как активаторы /Турова А.Д., Са-пожникова Э.Н., 1983/, так и ингибиторы свертывания крови /Колхир В.К., Соколов С.Я., 1982; Wang е.а., 1984/.

В последние годы все активнее изучаются так называемые молекулы средней массы - пептиды, являющиеся ингибиторами фактора Ха, /Al-Obeidi, Dstrem, 1998/. Среди них можно отметить AST, полученый из мексиканской пиявки/Dunwiddie е.а., 1989; Ohta, Brush, Jacobs, 1994/, клещевой пептидный антикоагулянт (ТАР) /Schaffer е.а., 1991; Vlasuk е.а., 1991; Sitko е.а., 1992; Vlasuk, 1993; Fioravanti е.а., 1993; Мао е.а., 1995; Lynch е.а., 1995/ и пептидный ингибитор, выделенный из слюны медицинской пиявки /Kornowski е.а, 1996/.

Регулирующим воздействиям может подвергаться взаимодействие уже сформировавшегося TP с фибриногеном (ФГ) и, что особенно важно, процесс самосборки фибрина (ФБ), т.е. этап, не имеющий альтернативного пути, с помощью воздействия на который можно предотвратить образования тромба на конечной стадии этого процесса /Чирягьеа Е.А., 1990; Бышевский А.Ш., 1991/. В известной мере таким действием обладают пептиды, выделенные из плазминового гидролизата ФГ или ФБ /Takagi, Susuki, 1979/, из тканей человека и животных /Бышевский А.Ш. и соавт., 1990/ или синтезированные в лабораторных условиях /Vincente е.а., 1984/, но все они оказались либо недостаточно эффективными, либо высокотоксичными.

Таким образом, уже в течение многих лет остается актуальным поиск и изучение альтернативных средств воздействия на гемостаз и оказывающих быстрый и достаточно продолжительный эффект, т.е. новых антикоагулянтов прямого действия.

Цель исследования. Изучить возможность получения антикоагулянтов прямого действия из растительного сырья и сапропеля, установить их природу и механизм действия, оценить перспективы создания на их основе новых средств направленного воздействия на гемостаз.

Задачи исследования. 1. Установить механизм ограничения пептидными ингибиторами животного происхождения взаимодействия тромбина с фибриногеном и, в частности, процесса аутополимеризации мономерного фибрина. 2. Определить изменения в системе плазмокоагуляции при внутривенном введении пептидов животного происхождения лабораторным животным (белые крысы). 3. Изучить флору Сибири на содержание антикоагулянтов и отобрать наиболее перспективные виды растений. 4. Разработать приемы очистки носителей антикоагулянтной активности из растений. 5. Установить природу ингибиторов. 6. Разработать способ количественного определения антикоагулянтов из растений. 7. Установить механизм ограничения свертывания крови антикоагулянтами растительного происхождения. 8. Изучить влияние растительного антикоагулянта на гемокоагуляцию лабораторных животных (противосвертывающий эффект и защитное действие при экспериментальной тромбопластинемии). 9. Сопоставить противосвертывающий эф-

фект антикоагулянта из растений и гепарина. 10. Провести токсикологическое исследование растительного антикоагулянта. 11. Разработать способ получения пептидных ингибиторов из сапропеля. 12. Разработать приемы их очистки. 13. Определить природу носителей антикоагулянтной активности из сапропеля. 14. Установить механизм ограничения плазмокоагуляции ингибиторами из сапропеля. 15. Охарактеризовать гемокоагуляционные изменения, вызываемые внутривеным введением пептидных антикоагулянтов из сапропеля лабораторным животным.

Научная новизна и практическая ценность. Получены новые данные о механизме торможения самосборки мономерного ФБ пептидным ингибитором, выделенным из плазмы крови человека. Показано, что ингибитор активнее взаимодействует с мономерами и олигомерами ФБ ранней степени зрелости, степень ассоциации снижается по мере созревания полимеров, а в момент агрегации ингибитор перестает взаимодействовать с ФБ. Взаимодействие пептида с мономерами реализуется за счет электростатических связей.

Показано, что при внутривенном введении лабораторным животным ингибитора животного происхождения гипокоагулемия обнаруживается только на 3-й мин после инъекции, что позволяет использовать пептидный ингибитор как инструмент изучения механизмов гемокоагуляции, но не как средство фармакологической корреции гемостаза.

Впервые установлено, что в тканях растений содержатся ингибиторы свертывания крови пептидной природы, реализующие свой эффект на этапе катализируемого тромбином превращения ФГ в ФБ. Определены наиболее перспективные растения - источники ингибиторов.

Разработан способ изоляции носителей ингибиторной активности и установлено, что они являются гликопептидами, углеводная часть которых представлена остатками глюкозы. Установлен их аминокислотный состав.

Показано, что ингибиторы ограничивают скорость III свертывания путем преимущественной блокады этапа самосборки ФБ.

Впервые установлено, что при внутривенном введении пептидных ингибиторов растительного происхождения развивается стойкая (до 18 ч) дозаза-висимая гипокоагулемия при отсутствии кумулятивного эффекта. Растительные ингибиторы обладают низким токсическим потенциалом на органы и системы лабораторных животных.

Впервые установлено, что донные иловые отложения - сапропели - содержат пептидные ингибиторы аутополимеризации мономерного ФБ. Разработан способ изоляции ингибиторов из сапропеля, установлен механизм их действия. Показано, что антикоагулянты из сапропеля при внутривенном введении вызывают стойкую (до 12-16 ч) дозазависимую гипокоагулемию. Их превентивное введение эффективно предотвращает гибель животных при экспериментальном тромбозе.

Таким образом, выявлена принципиальная возможность создания нового средства фармакологической коррекции гемостаза с точкой приложения на заключительном этапе и показано, что сырьем для получения новых антикоа-

гулянтов могут служить ткани некоторых растений, а также сапропель - че-резвычайно дешовый с неограниченными запасами источник.

Практическая значимость исследования заключается в разработке способов изоляции и очистки носителей антикоагулянтной активности из растительного сырья и сапропеля, которые позволяют получать их в достаточных для исследовательской работы количествах и могут явиться основой для промышленного способа.

Практическая значимость работы заключается и в том, что ее результаты свидетельствуют о целесообразности детального изучения описанных нами антикоагулянтов по схеме, предусмотренной Фармакологическим Комитетом для антикоагулянтов прямого действия.

Полученные материалы исследований внедрены в учебный процесс и работу научных лабораторий кафедр биохимии, технологии лекарств и фармакогнозии Тюменской медицинской академии, в работу клинико-диагностической лаборатории 1 городской клинической больницы г. Тюмени.

Материалы работы использованы при написании монографии «Растения и свертывание крови» (Тюмень, 1999, автор Е.А. Чирлтьев).

Основные положения, выносимые на защиту. 1. В тканях некоторых растений содержатся гликопептидные ингибиторы коагуляционного превращения ФГ, ограничивающие скорость самосборки мономерного ФБ за счет образования комплексов с мономерами и полимерами ранней степени зрелости посредством электростатических связей.

2. Внутривеное введение гликопептидов лабораторным животным вызывает стойкую, дозазависимую гипокоагулемию, ограничивает развитие тромбоза при экспериментальной тромбопластинемии, не оказывает кумулятивного и заметного токсического эффекта на органы и ткани животных.

3. Пептидные ингибиторы самосборки фибрина содержатся в сапропеле. Их механизм действия и основные параметры, характеризующие изменения в системе плазмокоагуляции при внутривенном введении лабораторным животным, сходны с ингибиторами растительного происхождения.

Это обусловливает перспективность использования эффекторов растительного происхождения и эффекторов из сапропеля как основы для создания новых средств воздействия на гемостаз.

Апробация и публикации. Основные положения диссертации доложены на совместном заседании кафедр биохимии, фармакологии, физиологии, фармакогнозии, фармакологии и клинической фармакологии Тюменской медицинской академии. Отдельные фрагменты работы доложены на съездах, конференциях и симпозиумах, указанных в списке трудов по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 27 работ.

Объем и структура работы. Материалы работы (включая указатель литературы) изложены на 339 страницах машинописного текста. В работе содержатся 63 рисунка и 51 таблица. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследований, главы (содержащей 14 подразделов), в которой изложены результаты собственных

исследований, заключения и выводов. Указатель литературы представлен 195 отечественными и 316 иностранными работами.

Материалы и методы исследований

Фибринмономер (ФМ) получали диссоциацией нестабилизированного фибрина раствором мочевины (3,3 - 5,0 М). Полученные препараты способны к многократной повторной полимеризации, при этом скорость образования ФБ не изменяется /Brosstad, Godai, 1977; Godai е.а., 1978/.

Препараты ФМ содержали не менее 96% свертываемого белка. Концет-рацию ФМ определяли спектрофотометрически, принимая Е28о= 15,67 /Угарова Т.П., Белицер В.А., 1978/. Скорость самосборки ФБ определяли в системе, содержащей 0,5 мл 0,075 M боратного буфера с рН 7,6, 0,1 мл исследуемого препарата и 0,1 мл 1x10"6 раствора ФМ. В контроле исследуемый препарат заменяли равным объемом растворителя.

Ингибиторы самосборки ФБ пептидной природы выделяли из плазмы крови по А.Ш. Бышевскому, Е.А. Чирятьеву /1983/. Кровь получали при плановом отборе, стабилизируя 3,8% раствором цитрата натрия 1:9.

В качестве источников ингибиторов использовали растительное сырье, заготовленное на юге Тюменской области, и также сапропель оз. Бурунчук и Тарас-Куль Тюменской области.

Ингибиторы гидролизовали 6 H хлористоводородной кислотой при 110°С /Шталь Э., 1965/. Проявитель - нингидриновый реактив.

Гомогенность ингибиторов оценивали хроматографией на бумаге FN-11 (Filtrak) в системе бутанол:уксусная кислота:вода (4:1:1 и 4:1:5), на пластинках Silufol ("Kavalier"), на пластинках Fixion 50x80 ("Chinoin"), а также на ЖХВД (Миллихром-1) после обработки ингибиторов фенилизотиоцианатом (колонка Сепарон С-18, элюент - метанол:вода 1:1, 256 нм).

Для определения аминокислотного состава пептиды гидролизовали 6 M хлористоводородной кислотой в среде аргона при 110°С (24) ч в присутствии 0,01% фенола и (3-меркаптоэтанола. Гидролизаты анализировали на автоматическом аминокислотном анализаторе LKB-4101 (Швеция) по одноколоночному методу в трехбуферной натриевой системе на колонке 6x500 мм с ионообменной смолой Durrum DC 6А (D. Chemical Corporation). Колонку калибровали стандартной смесью аминокислот ("Serva").

Ферментативный гидролиз проводили по Дэвени Т., Гергей Я. /1976/.

Углеводный компонент гидролизатов исследовали на поляриметре круговом СМ-2, хроматографией на бумаге FN-11 в системе н-бутанол-уксусная кислота-вода 4:1:5 и на пластинках Silufol в системе пиридин-этилацетат-уксусная кислота-вода (5:5:1:3). Проявитель - анилинфталат /Э. Шталь, 1965/.

Антикоагулянтную активность препаратов оценивали по влиянию ингибиторов на скорость реакций. Результаты выражали в значениях эффективности торможения (i) по формуле i =1-V(/Vb где V0 и Vk - скорость реакции в опыте и контроле соответственно.

Оценку состояния плазмокоагуляции in vitro и in vivo производили по изменению времени рекальцификации (BP), протромбинового (ПТВ), тром-бинового времени (ТВ) и продолжительности самосборки фибрина (ВС) в плазме крови. Содержание продуктов деградации фибрина (ПДФ) определяли по Габитову С.3. и соавт., 1982; Шафер В.М., 1989. Количественную оценку тканевого тромбопластина - по Дементьевой И. А. /1991/.

Эксперименты проводили на беспородных белых крысах, содержавшихся на лабораторном рационе. В опытах использовано 870 крыс обоего пола, массой от 120 до 240 г. В пределах одной серии опытов масса животных не отклонялась от средней более, чем на 20 г, при этом средняя масса животных контрольной и подопытной групп существенно не отличалась.

Исследования на животных проводили под легким эфирным наркозом, за исключением регистрации ЭКГ, где в качестве наркотического агента использовали оксибугират натрия (интраперигонеально, 200 мг/кг).

При функциональных исследованиях изучали: 1. Острую токсичность при внутривенном, внутримышечном и внутрибрюшинном путях введения. Ориентировочную DL-50 определяли путем введения животным нескольких доз и принятие за DL-50 минимальной дозы, вызывающей летальный исход /Саноцкий И.В., 1970/; формулу Першина Г.Н. LD50 = Z[(a+b)x(m-n)]/200, где а и b - величины смежных доз, тип- соответствующие этим дозам частоты смертельных исходов в процентах; метод Кербера по формуле: LD50 = LDioo -[£(zxa)]/n, где LDioo - Доза изучаемого вещества, которая вызвала смерть у всех животных подопытной группы, a - интервал между каждыми двумя смежными дозами, z - среднее арифметическое из числа животных, у которых наблюдалась смерть под влиянием каждых двух смежных доз, п — число животных в каждой группе. 2. Состояние функции печени оценивали по: а) активности ферментов ACT, АЛТ; б) активности щелочной фосфатазы и содержанию общего билирубина. Активность этих ферментов определяли спек-трофотометрически в сыворотке крови с помощью стандартных наборов БиоТест "Lahema" /Bessey е.а,, 1946; Reitman., Fraenkel., 1957/. 3. Для оценки сохранности функции почек использовали интегральные показатели уровня эндогенного креатинина и мочевины сыворотки крови. Уровень эндогенного креатинина сыворотки крови определяли колориметрически по Loken /1954/ с использованием стандартных наборов "Lahema". Уровень мочевины сыворотки крови определяли уреазным методом по Lorentz., с использованием наборов "Lahema" /Комаров Ф.И. и соавт., 1981/. Уровень белка в моче определяли по Геллеру /Трахтенберг И.М. и соавт., 1978/. 4. Биоэлектрическую активность миокарда регистрировали на многоканальном электрокардиографе 6 НЭК (Германия). Регистрацию ЭКГ проводили в трех стандартных, трех усиленных от конечностей и трех грудных отведениях. Игольчатые электроды вводили подкожно: четыре конечности и район грудной клетки на уровне верхушечного толчка в 3-х позициях: по средней линии грудины и отступив 1 см вправо и влево от среднего электрода, что приблизительно соответствует стандартным позициям грудных электродов Vb V3 и V¡. ЭКГ регистрировали

при скорости 100 мм/с и чувствительности каналов 20 мм/мВ. 5. Состояние периферической крови оценивали с помощью общепринятых в клинико-диагностических лабораториях методик (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, содержание гемоглобина, уровень СОЭ и лейкоцитарная формула) /Предтеченский В.Е., 1960/. 6. Изменение массы тела животных и весовых коэффициентов внутренних органов при введении ингибиторов оценивали путем взвешивания.

Результаты исследований подвергали математической обработке методом вариационной статистики для малых рядов наблюдений /B.C. Бессмертный, 1967; И.Г. Венецкий 1970/. Достоверность различия между средними величинами определялась с использованием критерия Хг, критерия Стьюдента, различия принимали за достоверные при значениях вероятности (Р) меньше 0,05 /Беленький М.Л., 1963/.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Физиологические пептидные ингибиторы животного происхождения. Ранее проведенные исследования /Чирятьев Е.А. и соавт., 1975-1990/ свидетельствуют о наличии в плазме крови и других тканях человека и животных физиологических регуляторов III фазы свертывания крови - пептидов с молекулярной массой 1 470, 1 183 и 895 Да. Авторами детально исследован аминокислотный состав пептидов, их последовательность в молекуле, содержание в тканях у животных в процессе фило- и онтогенеза. Изучена биологическая роль пептидов, проведен их сравнительный анализ с другими известными эффекторами III фазы свертывания крови.

Мы исследовали механизмы взаимодействия пептидов и ФМ, а также выясняли их влияние на состояние плазмокоагуляции при внутривенном введении лабораторным животным.

Прежде всего изучили в динамике изменения степени взаимодействия ингибитора и субстрата в процессе самосборки, используя для этого метод "тестирования стадий", предложенный В.А. Белицером и Т.В. Варецкой /1975/. Метод заключается в том, что ингибитор вносят в реакционную смесь, через кратные интервалы (5 с) времени от начала самосборки. Это рассматривается как тест, в ходе которого производится изменение условий реакции в разные моменты от начала самосборки, что позволяет различить в ней два этапа - до и после внесения ингибитора, и использовать графический способ анализа в системе координат (рис. 1), где абсцисса - продолжительность первого этапа (до внесения ингибитора), ордината - экспериментально установленное время образования ФБ без ингибитора и при внесении ингибитора в разные сроки от начала процесса. Точки, соответствующие ВС при максимальной продолжительности первого (Ti) и второго (Т2) этапов процесса, соединены прямой, которая характеризует изменение ВС в случае, если все ее этапы равно чувствительны к действию ингибитора. Экспериментально установленное ВС при запаздывающем внесении инги-

битора (т.е. при изменении продолжительности первого и второго этапов) представлено кривой, которая отражает неодинаковую чувствительность разных этапов процесса самосборки к действию ингибитора. Нисходящая часть кривой отклоняется вниз от теоретической, что свидетельствует о снижении чувствительности процесса к ингибитору с увеличением продолжительности первого этапа самосборки: чем больше его продолжительность, тем больше расстояние между теоретической и экспериментальной линиями. Начиная с точки, соответствующей 0,43 части всей продолжительности первого этапа, участок экспериментальной кривой ларалелен оси абсцисс, следовательно, все доли превращений, приходящиеся на последние 0,57 части продолжительности самосборки, одинаково чувствительны к действию ингибитора. Этот уровень чувствительности сохраняется, вероятно, до появления видимых нитей ФБ.

-Б

Рисунок 1. Время самосборки фибрина в опытах с внесением ингибитора (1,8 моль/л) в разные сроки от начала процесса. Поясения в тексте.

Из вышеуказанного эксперимента ясно, что ингибитор активнее взаимодействует с ранними продуктами самосборки, а по мере созревания протофибрилл активность образования ассоциатов снижается, и, в конечном счете, ингибитор вытесняется из фибринового сгустка.

Для подтверждения этого положения ФМ (активность 650 с) для провокации самосборки разбавляли боратным буфером, содержащим [|3|1]-инги-битор (2,1 ммоль/л, 3 500 имп/сек в 1 мл). ВС в присутствии ингибитора составляло 120 с. В отдельных пробах самосборку прерывали каждые 10 с, добавляя 15% раствор ТХУ (1:1). Осадок белка отделяли центрифугированием и исследовали радиоактивность надосадка, т.е. содержание ингибитора в нем.

Отделение белка на ранних этапах самосборки заметно снижает радиоактивность надосадка. Начиная с 20 с (1/6 всей продолжительности самосборки) удаление ингибитора совместно с ФБ уменьшается. Через 500 с после образования сгустка (620 с от начала самосборки) весь ингибитор определяется в надосадке, т.е. вытесняется из сгустка.

Следовательно, торможение самосборки является результатом взаимодействия ингибитора с ФМ, ослабляющимся по мере усложнения полимеров, и сохраняющем постоянный, но заметно меньший уровень по достижении полимерами высокой степени зрелости. В период агрегации ингибиторы вытесняются из комплекса.

Для определения характера сил, обеспечивающих взаимодействие пептида с ФМ, мы изучили влияние на эффективность торможения самосборки ФБ условий среды.

Факторами, влияющими на продолжительность самосборки и ее торможение известными ингибиторами являются изменения ионной силы, рН, температуры, а также присутствие в среде самосборки мочевины /Луговской Э.В., Белицер В.А., 1971; Белицер В.А., Варецкая Т.В., 1975/.

Ионную силу изменяли, используя для провокации самосборки ФБ бо-ратный буфер (0,075 М, рН 7,6) с различным содержанием натрия хлорида. При этом обнаружена выраженная зависимость между значениями эффективности торможения самосборки и ионной силы. Вероятно ингибитор, активнее взаимодействуя с ФМ и продуктами ранних стадий полимеризации, при высокой ионной силе может длительнее взаимодействовать с формирующимися полимерами.

В полимеризации ФБ важную роль играют электростатические взаимодействия между мономерами. Если ингибитор также взаимодействует с мономерами и полимерами различной степени зрелости за счет электростатических связей, то возможность осуществления самосборки должна уменьшаться при увеличении ионной силы параллельно возможности взаимодействия между мономерами и ингибитором, а эффективность торможения не должна нарастать. Нарастание же эффективности торможения в наших наблюдениях является следствием того, что электростатические взаимодействия мономер-ингибитор слабее, чем мономер-мономер - при высокой концентраци ингибитора эффективность торможения меньше зависит от ионной силы.

Повышение ионной силы и сдвиг рН в щелочную зону влияют на самосборку ФБ равнозначно. В связи с этим мы изучили влияние изменений рН на самосборку без (контроль) и с ингибитором. Значения рН в системе самосборки создавали, используя для провокации самосборки 0,075 М боратный буфер с различными значениями рН . Установлено, что скорость самосборки ФБ в контроле нарастает с повышением рН, достигая максимума при значении, близком к 7,5, круто снижаясь в дальнейшем. В присутствии ингибитора с ростом рН, начиная с 7,0, скорость самосборки существенно ограничивается. При рН 6,8 ингибитор не изменяет скорости реакции, а при снижении рН до 6,3 скорость самосборки ФБ повышается.

Рост эффективности торможения с увеличением рН до 7,5 свидетельствует о роли электростатических взаимодействий в образовании комплекса ингибитор-фибрин. Об этом же свидетельствует и то, что ингибитор способен ограничивать самосборку и на самых последних ее этапах, когда ведущей силой являются именно электростатические взаимодействия.

Подтверждением этому является равновесный диализ ФМ и пептидного ингибитора через мембрану Т-100, проницаемую для пептида и не проницаемую для ФМ: по установлении равновесия по мере повышения рН в среде ФМ, от 5,5 до 8,0 наблюдается прогрессивное снижение количества ингибитора от 0,4+0,001 до 0,2±0,0 моль/л.

Особенностью изучаемых пептидов является наличие большого числа аминокислот с ионогенным радикалом /Чирятьев Е.А., 1990/. Например, в меньшем по массе пептиде 6 из 8 аминокислотных остатков способны находиться в ионизированном состоянии при физиологических условиях, т.е. способны к электростатическим взаимодействиям. Характер зависимости скорости самосборки от значения рН среды и результаты равновесного диализа позволяют предположить, что пептидные ингибиторы являются донорами отрицательно заряженных функциональных групп для образования связи с мономерным фибрином - уменьшение экранирования отрицательных зарядов (повышение рН) ведет к росту антиполимеризационной активности. Об этом же свидетельствует изменение эффекта на прямо противоположный при рН 6,3 - пептид приобретает свойство активировать самосборку при существенной блокаде способности к ионизации отрицательно заряженных функциональных групп.

Торможение пептидным ингибитором животного происхождения реакции ТР с ФГ. Изучая влияние пептидного ингибитора на коагуляционное превращение ФГ под действием ТР, мы инкубировали при 37°С 0,8% раствор ФГ в 0,14 М растворе натрия хлорида, содержащем ТР (1 мг/мл) и мочевину (3,3 М), предотвращающую самосборку образующихся молекул ФМ. Через равные интервалы времени отбирали аликвоты смеси, провоцировали в них самосборку ФБ разбавлением мединаловым буфером (0,03 М, рН 7,6) и фиксировали момент образования сгустка. В части опытов пептидный ингибитор (1,6 ммоль/л) добавляли в реакционную смесь одновременно с ТР (оценивается его суммарное влияние на ферментативную и неферментативную фазы превращений ФГ), в части - ингибитор (0,76 ммоль/л) вносили в момент провокации самосборки (влияет только на полимеризацию ФМ) (рис. 2).

Ингибитор тормозит обе стадии превращений ФГ. Скорость самосборки растет по мере увеличения времени инкубации ФГ с ТР как в контроле, так и в опытах, но с разной динамикой. Если принять скорость самосборки без ингибитора на каждом этапе опыта за 100%, то на 5 мин инкубации в случае, где ингибитор влияет на обе стадии процесса, скорость реакции составляет 70%. При взаимодействии ингибитора уже с образовавшимся ФМ, этот показатель равен 100% (как и контрольная величина), что однозначно свидетельствует о торможении пептидным ингибитором самосборки ферментативной стадии перехода ФГ в ФБ. На 10-й мин скорость самосборки составляет 58,3 и 83,3%, на 20-й - 55,4 и 75,7%, на 30-й - 60,0 и 73,3, на 40-й - 67,7 и 72,9% на 50-й и 60-й минутах инкубации - 70,0 и 70,0% соответственно по отношению к контролю.

Рисунок 2. Зависимость скорости самосборки фибрина от продолжительности инкубации смеси ФГ-ТР. Абсцисса - продолжительность инкубации, мин; ордината - скорость реакции -с"'х1 ООО. 1 - ингибитор отсутствует в реакционной смеси, 2 - ингибитор внесен в реакционную смесь одновременно с ТР, 3 - ингибитор внесен одновременно с провокацией самосборки.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что по мере накопления ФМ скорость самосборки в условиях, обеспечивающих воздействие ингибитора на обе стадии фибринообразования, ниже, чем при воздействии ингибитора только на стадию полимеризации. Начиная с 50-й мин инкубации ход всех кривых параллелен оси абсцисс. Это свидетельствует о полном превращении молекул ФГ в ФМ. Существенно, что в этот момент скорости обеих реакций равны между собой, оставаясь ниже скорости реакции в системе без ингибитора.

Торможение ферментативного этапа превращений ФГ может реализоваться путем образования ассоциатов либо с ферментом, снижая его активность, либо с ФГ, что за счет конформационной модификации замедляет его расщепление тромбином.

Для разрешения этого вопроса к раствору ФГ (9,0 мг/мл, 0,5 мл), прибавляли равный объем ингибитора (1,8 ммоль/л), меченного изотопом [,311] (14 330 имп/мин в 1 мл) и инкубировали (37°С, 30 мин). Смесь фильтровали на колонке с Сефадексом 0-15 (элюент- 0,14 М раствор натрия хлорида), определяли оптическую плотность элюатов при 280 нм, их радиоактивность и способность тормозить самосборку ФМ. При этом ФГ и ингибитор были элюированы в разных объемах (5 и 17 мл соответственно).

Отсутствие комплексообразования между ФГ и пептидом подтвердили фильтрацией радиомеченного пептидного ингибитора через 12% полиакри-ламидный гель с иммобилизованным ФГ.

Для выяснения возможности комплексообразования пептидного ингибитора с ТР [ш1]-пептид (1,8ммоль/л, 14 330 имп/мин в 1 мл) смешивали с ТР (2 мг/мл), инкубировали и фильтровали на Сефадексе С-15, регистрируя выход продуктов. И в этом случае ТР и ингибитор элюированы в разных объемах (6 и 17 мл соответственно). Следовательно, ни с ФГ, ни с ТР пептид не образует ассоциатов.

Мы показали, что ингибитор способен образовывать ассоциаты с мономерами и полимерами разной степени зрелости. Это дает основание предположить, что предпосылкой комплексообразования является структурная модификация молекул ФГ, возникающая при отщеплении первых фибринопептидов. Образующиеся в этот момент ассоциаты не способны в полной мере активироваться TP за счет нарушения комплементарности фермента и субстрата, что ведет к снижению скорости активации ФГ. Замедляется и скорость полимеризации образовавшихся молекул ФМ.

Мы изучили влияние ингибитора на полимеризацию частично активированного ФГ - лишенного фибринопептидов А, но сохраняющего фибринопептиды В (дезАА-фибринмономер). Этот вид мономера сохраняет способность полимеризоваться с образованием геля, по морфологии существенно не отличающегося от "полноценного" фибринового сгустка Шутовской Э.В. и соавт., 1978/.

Раствор ФГ (0,8%) в присутствии 3,3 М мочевины инкубировали с 2 NIT рептилазы, отбирая через равные промежутки времени аликвоты смеси и определяя их способность к самосборке. Оценивали скорость самосборки, выделяя ферментативный и неферментативный этапы превращения ФГ (рис. 3).

При инкубации смеси ФГ и рептилазы с пептидным ингибитором (рис. 3, кривая 2), скорость полимеризации дезАА-фибринмономера ниже контрольной скорости (в отсутствие ингибитора) в начальные моменты инкубации. Начиная с 40-й мин скорость полимеризации не зависит от количества образующегося дезАА-фибринмономера: к этому времени активируется весь содержащийся в смеси ФГ. Однако суммарная скорость реакции превращения ФГ в ФБ под действием рептилазы к этому моменту ниже контрольной величины на 56,6%, т.е. полимеризация дезАА-фибринмономера, образующегося в присутствии ингибитора, чувствительна к ингибитору самосборки фибрина.

14

о

5 10 20 30 40 50 60

Рисунок 3. Зависимость скорости самосборки ФБ от продолжительности инкубации смеси ФГ-рептилаза. Абсцисса - продолжительность инкубации, мин; ордината - скорость реакции с-'х 1 000. 1 - ингибитор отсутствует в реакционной смеси, 2 - ингибитор внесен одновременно с рептилазой, 3 - ингибитор внесен в реакционную смесь одновременно с провокацией самосборки.

При внесении в реакционную смесь в момент начала самосборки, ингибитор не тормозил полимеризации.

Результаты этого эксперимента проверили, инкубируя 0,8% раствор ФГ, содержащий 20% мочевины, с рептилазой в присутствии ингибитора и без него, определяя время образования сгустка после провокации самосборки. Полученные показатели сравнивали с соответствующими значениями в эксперименте, в котором место рептилазы занимает ТР. Полученные данные согласуются с предыдущими: дезААВВ-фибринмономер, образующийся после активации ФГ тромбином, способен взаимодействовать с ингибитором.

ДезАА-мономеры, полученные из ФГ после инкубации с рептилазой, в зависимости от того, вносится ли ингибитор одновременно с ферментом или только на стадии полимеризации, по разному относились к ингибитору самосборки: дезАА-мономер, сформировавшийся в отсутствие ингибитора, не чувствителен к нему не зависимо от концентрации. Так, увеличение концентрации пептида от 0,35 до 1,3 ммоль/л не изменяло времени полимеризации этой формы мономерного фибрина.

Результаты, показывают, что для коплексообразования пептида с ФМ не имеет значение высвобождение фибринопептида В: дезАА-мономер, сформированный в присутствие ингибитора, образует с ним ассоциаты, что сопровождается торможением полимеризации. По-видимому, важна предварительная структурная модификация молекул ФГ ферментом, создающая условия для образования комплекса. Активация ФГ не свойственным организму ферментом - рептилазой не обеспечивает оптимальных условий взаимодействия ингибитора с фибринмономером. В отличие от этого модификация ФГ физиологической протеазой - тромбином, создает выгодные условия для взаимодействия пептида с дезААВВ-фибринмономерами, что сопровождается возникновением более прочного комплекса.

Для подтверждения этого нами был получен дезАА-мономер в 0,02 М ацетатном буфере (рН 5,2), содержащем 3,3 М мочевины. ДезАА-мономер инкубировали с раствором тромбина (1мг/мл) и во время инкубации через кратные интервалы отбирали аликвоты смеси, провоцировали в них самосборку и учитывали время образования сгустка (контроль). В опыте реакционная смесь содержала пептидный ингибитор (1,2 ммоль/л) (рис. 4).

Как следует из хода кривых, отражающих зависимости скорости реакции от количества образующегося субстрата, ингибитор тормозит образование дезАА-мономерного фибрина. Поскольку в этом эксперименте отщепляется фибринопептид В, то торможение ферментативного этапа является результатом способности ингибитора задерживать высвобождение фибринопептида В.

Влияние инъекций пептидных иигибиторов самосборки фибрина животного происхождения на состояние плазмокоагуляции. В этой серии экспериментов мы вводили ингибиторы лабораторным животным. Ингибиторы в количестве, в 5 раз превышающем их содержание в крови животных

(0,4 моль/л), вводили в яремную вену. Отбор проб крови производили через 3, 10, 20 и 30 мин после инъекции и определяли ВР, ПТВ, ТВ и ВС. Контрольной группе животных вводили растворитель (табл. 1).

Рисунок 4. Зависимость скорости самосборки фибрина от продолжительности инкубации смеси дезААмономер-ного фибрина с ТР. Абсцисса - продолжительность инкубации, мин; ордината - скорость реакции, с"'х1 ООО. 1 -ингибитор отсутствует в реакционной смеси, 2 - ингибитор внесен одновременно с ТР.

-1-1-г-

5 10 20 30 40 50

Таблица 1

Изменение ВС, ПТВ, ТВ и ВС после однократной инъекции раствора

Исследуе- Пробы крови отбирали через:

мый показа- 3 мин 10 мин 20 мин 30 мин

тель (с)

ВС 198±3,5* 112±2,0 108+2,0 110±1,5

(112+2,0) (108+1,5) (110+0,5) (108+1,0)

ПТВ 22±0,5 23±0,5 22±1,0 24±1,0

(22±0,5) (22±1,0) (21±1,0) (22±2,0)

ТВ Зб±0,5* 22±1,0* 15±0,5 16±0,5

(16+0,5) (16+1,0) (15+1,0) (16±1,0)

ВС 60+3,0* 32±1,0* 24±0,6 24±0,5

(22+0,5) (22±0,5) (23+1,0) (21±0,5)

В скобках приведены значения исследуемых показателей у контрольной группы животных. Здесь и далее знаком (* ) отмечены достоверно различающиеся результаты (Р< 0,05).

Как следует из таблицы 1 ВР через 3 мин после инъекции увеличилось на 77%, ТВ и ВС на 25 и 123% соответственно. ПТВ не изменилось. На 10-й минуте после инъекции ВР, ПТВ и ТВ равны контролю, а оставалось на 45,5% выше контрольного. К 20-й мин все показатели нормализовались.

Таким образом, введение ингибиторов самосборки в кровоток животным лишь в первые минуты после инъекции вызывает гемокоагуляционные сдвиги, причем наиболее чувствительным к введению препарата оказалось ВС. С учетом того, что формирование сгустка ФБ во всех исследованных тестах

протекает через этап самосборки, можно еще раз утверждать, что самосборки ФБ - одна из главных точек приложения пептидов-ингибиторов.

По свидетельству Е.А. Чирятьева /1988/ ингибитор содержится во всех тканях внутренних органов животного. Поэтому не исключена возможность быстрого его перераспределения при дополнительном введении в кровоток между кровью и другими тканями.

Для проверки этого предположения радиомеченный ингибитор вводили в вену (0,5 мл, 138 ООО имп/мин на 100 г массы) и периодически измеряли уровень радиоактивности в крови и других тканях. В крови через 30 с после инъекции радиоактивность составила 21 540 имп/мин в 1 мл, через 1,5, 3, 5, 11, 20 и 60 мин - 52,8, 16,2, 15,8, 14,8, 8,4 и 6,5% соответственно от этой величины. Радиоактивность органов (печень, легкое, сердце, почки, селезенка, тонкая кишка, поперечно-полосатая мышца и подкожная клетчатка) через 1 ч после инъекции колебалась от 75 до 550 имп/мин в 1 г влажной ткани. Следовательно, ингибитор быстро, но с неодинаковой интенсивностью, извлекается различными тканями из крови.

При подкожном введении радиомеченного ингибитора (0,5 мл, 111 200 имп/мин) уже через б мин радиоактивность крови составила 665 имп/мин в 1 мл, не изменяясь достоверно в течение 2-х ч. Радиоактивность тканей через 2 ч была (имп/мин на 1 г влажной ткани): легких 400±32, сердца - 176+19, печени - 250+21, тонкой кишки - 396±30, поперечно-полосатой мышцы -290+19, головного мозга - 176+11, почки - 545±46, селезенки - 452141, подкожной клетчатки - 370+32. Можно утверждать, что из подкожной клетчатки ингибитор непрерывно поступает в кровоток и с такой же интенсивностью извлекается из крови исследованными органами при его избытке.

Итак, ингибитор самосборки ФБ посредством электростатических связей образует ассоциаты с ФМ и полимерами преимущественно ранней степени зрелости, что вызывает ограничение скорости самосборки. Торможение осуществляется по конкурентному типу и ингибитор в состав фибринового сгустка не включается. Торможение реализуется за счет взаимодействия отрицательно заряженных функциональных групп в молекуле пептида с положительно заряженными участками ФБ. Пептид ограничивает скорость ферментативного этапа коагуляционного превращениния ФГ, задерживая высвобождение фибринопептида В под действием ТР.

Ингибиторы самосборки животного происхождения, несомненно, выполняют роль регулятора коагуляционного превращения ФГ и могут использоваться как инструмент для изучения процессов плазмокоагуляции. Однако они мало пригодны для использования в качестве средства воздействия на гемостаз, так как избыток ингибитора очень быстро исчезает из кровотока. Вместе с тем весьма вероятно, что структуры, сходные с ингибитором, но способные длительно циркулировать в крови, могут явиться перспективными антикоагулянтами прямого действия, ограничивающими реакцию коагуляционного превращения ФГ.

Пептидные ингибиторы растительного происхождения. Ранее было показано, что экстракты ряда растений могут ограничивать фибринообразо-вание /Бышевский А. А., Герберт И.Я., 1983/.

Экстракты готовили как описано в разделе «Материалы и методы исследований». Сухие экстракты растворяли в Трис-НС1 буферном растворе (0,01 М, рН 7,6, 10 мг/мл), контролируя при этом значения рН.

Определяли влияние экстрактов из 200 растений на ВР и ТВ пулирован-ной цитратной донорской плазмы. Оказалось, что около 43% исследуемых экстрактов более, чем в 2 раза увеличивали ВР, и около 19% - ТВ. Произвольно нами отдано предпочтение тем растениям, экстракты из которых удлиняли ВР в 2 раза, а ТВ - в 1,5 раз и более.

Исследование экстрактов в концентрации 2 мг/мл показало, что в ряде случаев антикоагулянтная активность либо исчезала совсем, либо оказывалась не значительной. В итоге были определены 11 видов растений, которые могли бы представить интерес для дальнейшей работы: рябина обыкновенная, морошка обыкновенная, ива бредина, черника обыкновенная, кошачьи лапки, нонея темная, окопник лекарственный, кривоцвет полевой, медуница мягчайшая, лиственница сибирская, кукушкин лен.

Далее мы продолжили изучение эффекта разведения экстрактов (от 0,25 до 6 мг/мл) на ВР, ТВ и ВС. Установлено, что зависимости эффективности торможения ВР от концентрации экстрактов описываются практически совпадающими между собой кривыми. Зависимость эффективности торможения ТВ от концентрации эффекторов для нонеи, кривоцвета, окопника, медуницы и кошачьих лапок описывается совпадающими между собой кривыми. Слабее эффект при всех значениях концентраций оказывают рябина, морошка и кукушкин лен, а действие ивы, черники и лиственницы на ТВ выражено значительней. При концентрации 0,25-0,5 мг/мл только экстракты из нонеи, медуницы, окопника и кривоцвета ограничивают ВС. Следовательно, из исследованных нами 200 видов растений наиболее эффективными в отношении влияния на свертывание крови являются нонея, кривоцвет, медуница и окопник, которые обладают выраженным действием ¡п уПго не только на ВР и ТВ, но и на ВС.

Очистка и природа антикоагулянтов из экстрактов нонеи темной, окопника лекарственного, медуницы мягчайшей и кривоцвета полевого.

Для выбора способов очистки ингибиторов и контроля их гомогенности, мы провели определение основных групп биологически активных веществ, содержащихся в экстрактах /Гринкевич Н.И., 1983/: экстракты содержат один и тот же набор веществ растительного происхождения — полисахариды, фе-нольные и нингидринположительные соединения.

Мы проводили очистку экстрактов органическими растворителями, реагентами, взаимодействующими с теми или иными группами соединений и образующих нерастворимые осадки, адсорбционной колоночной хроматографи-

ей на силикагеле и полиамиде, тонкослойной и бумажной хроматографией и другими приемами.

Наиболее результативным оказалось применение гель-фильтрации на Сефадексе в-50 (колонка 20x500 мм, элюент - 0,05 М аммонийно-ацетатный буфер, рН 7,6): антикоагулянтная активность элюируется в объеме 25-30 мл крутым пиком (внешний объем колонки - 15 мл), а основная масса феноль-ных соединений (регистрация на спектрофотометре при 280 нм) - в объеме 42-50 мл.

Фракции, содержащие антикоагулянт, объединили, удалили летучий буфер и сухой остаток растворили в Трис-НС1 буферном растворе (0,05 М, рН 7,6) в объеме, равном введенному, и подвергли анализу, как описано выше. Выход антикоагулянта составил 66% от исходного, в объединенной фракции отсутствовали полисахариды, но присутствовали соединения фенольной природы.

Объединенную активную фракцию подвергли рехроматографии в тех же условиях. В этом случае выход антикоагулянта составил 96% от внесенного в колонку, а в активных фракциях присутствовали лишь следовые количества флавоноидов.

Ранее полученные в нашей лаборатории данные /Е.А. Чирятьев, 1990/ позволили предположить, что носителями антикоагулянтной активности являются соединения, имеющие пептидную природу. В пользу этого говорит и то, что при хроматографии экстрактов на бумаге или в тонком слое обнаруживается нингидринположительная зона (хотя свободные аминокислоты в экстрактах отсутствуют), а после кислотного гидролиза возникают свободные аминокислоты.

Для определения аминокислотного состава антикоагулянтов мы использовали экстракты, очищенные трехкратной гель-фильтрацией на Сефадексе 0-5 0. Оценку гомогенности, гидролиз и анализ гидролизатов с помощью автоматического аминокислотного анализатора осуществляли, как описано в разделе «Материала и методы исследований» (табл. 2).

Поскольку в растениях часто биологически активные вещества находятся в виде гликозидов, мы провели гидролиз носителей антикоагулянтной активности из медуницы и нонеи 1 Н серной кислотой с последующей двукратной хроматографией гидролизата на бумаге РИ-11 в системе н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5). Проявитель - кислый анилинфталат. В качестве свидетелей использовали глюкозу, рамнозу, ксилозу, арабинозу, фруктозу, маннозу и сахарозу, значения которых составили 0,29, 0,54, 0,37, 0,31, 0,60, 0,48 и 0,21 соответственно. Сахар, содержащийся в гидролизатах, при хроматогра-фировании в обоих случаях мигрировал в виде одного пятна, значение Кг которого было близко к Лг глюкозы и составляло 0,28. Более объективный способ идентификации Сахаров - поляриметрия (поляриметр круговой СМ-2) подтвердил наличие в гидролизатах остатков глюкозы. Угол вращения плоскости поляризации сахаров-свидетелей составил +0,47, +0,20, +0,29, +1,21, -0,50, +0,23 и +0,80. Угол вращения Сахаров гидролизатов составил +0,47.

Таблица 2

Аминокислотный состав антикоагулянтов, выделенных из нонеи, окоп-

Антикоагулянты выделены из

Нонеи Окопника Медуницы Кривоцвета

Asp (2 остатка) Asp (4 остатка) Asp (6 остатка) Asp (2 остатка)

Ser Ser (2) Ser Ser

Thr (2) Thr (3) Thr Thr (2)

Glu (2) Glu (6) Glu (6) Glu (2)

Pro Pro Pro (2) Pro

Gly(2) Gly(4) Gly(5) Gly(2)

Ala (2) Ala (4) Ala (2) Ala (2)

Val Val (2) Val Val

He Ile Ile He

Leu Leu Leu (2) Leu

Gys Gys (2) Lys (3) Gys

Lys Lys (2) Lys

1 738 Да 3 292 Да 3 195 Да 1 738 Да

Таким образом, их травы нонеи, окопника, медуницы и кривоцвета выделены антикоагулянты, представляющие собой (по крайней мере для ингибиторов из медуницы и нонеи) гликопептиды.

Механизм ограничения свертывания крови антикоагулянтами растительного происхождения. В этих экспериментах нами использованы вы-сокоочищенные фракции экстрактов из изучаемых видов растений.

Мы выяснили на какой из этапов свертывания растительные пептиды оказывают преимущественное влияние. Для этого плазму доноров делили на две части. Одну часть подвергли дефибринированию нагреванием на водяной бане (56°С, 3 мин), другую - высаливанием сульфатом натрия (8% насыщения), отделяли ФГ центрифугированием и надосадок диализовали против физиологического раствора (1:500, 2°С, 20 ч). Таким образом мы получали два образца плазмы, лишенной ФГ. Полноту осаждения проверяли, добавляя к аликвотам образцов 0,55% раствор Са++ - в обоих случаях в течение 5 ч сгусток ФБ не образовывался. В то же время плазма не теряла способности генерировать ТР: добавление к плазме, активированной Са++ или тромбопла-стин-кальциевой смесью (ТКС), ФГ, вызывает свертывание последнего.

В одной серии опытов к 0,1 мл дефибринированной одним из вышеописанных способов плазмы прибавляли 0,1 мл раствора ФГ, 0,1 мл раствора антикоагулянта и 0,1 мл 0,55% Са++ или 0,1 мл ТКС, приготовленной по В.П.Балуда /1980/ (оценивается возможный суммарный эффект антикоагулянтов на свертывающий потенциал плазмы крови). В другой серии - к 0,1 мл плазмы прибавляли 0,1 мл Са" или ТКС и инкубировали в течение времени, достаточном для образования ТР. По завершении активации плазмокоа-

гуляции к смеси прибавляли по 0,1 мл растворов антикоагулянта и ФГ (оценивается эффект ингибиторов только ка тромбинзависимое превращение фибриногена). В контроле антикоагулянт заменяли на физиологический раствор (табл. 3). Для исключения ошибки, связанной с возможной частичной инактивацией ф. V, во все пробы добавляли концентрат ф. V, полученный по Я.В. Велик, E.JI. Ходоровой /1957/.

Таблица 3

Эффективность торможения свертывания ФГ при внесении растительных антикоагулянтов в тромбингенерирующую систему (дефибри-

Антикоагу- Антикоаг улянт внесен

лянт из... в Одномоментно с По завершении

концентрации инициацией тромбиногенеза тромбиногенеза

(мг/мл 10"3) Тромбиногенез инициирован

Са^ ТКС ТКС

Нонеи

0,16 0,70±0,02* 0,54±0,00* 0,52+0,008* 0,40±0,00*

0,20 0,72+0,008' 0,56±0,03* 0,53±0,00* 0,44+0,004*

0,29 0,75+0,032* 0,65±0,02* 0,65±0,03* 0,59±0,00*

Окопника

0,39 0,57+0,03 0,44+0,009 0,57+0,02 0,42±0,01

0,50 0,63±0,04 0,46+0,025 0,63+0,04 0,45±0,00

0,68 0,68±0,04 0,50±0,04 0,7210,06 0,48±0,00

Медуницы 0,18 0,72+0,02* 0,51±0,00* 0,54±0,002* 0,41±0,00*

0,24 0,75±0,003* 0,53±0,01* 0,56±0,00* 0,45±0,001*

0,32 0,79±0,03* 0,60+0,02* 0,62±0,03* 0,57±0,00*

Кривоцвета 0,17 0,56±0,00* 0,48±0,01* 0,50+0,00 0,42±0,00*

0,22 0,60±0,06 0,44±0,00 0,55±0,03 0,48±0,04

0,30 0,64±0,042 0,49±0,04 0,61±0,02 0,46±0,06

Из таблицы 3 следует, что растительные антикоагулянты из нонеи, медуницы и кривоцвета преимущественный эффект оказывают на этап тром-бинзависимого превращения ФГ, и, в существенно меньшей степени, на этапы, предшествующие образованию ТР. Так, если принять за 100% реализацию антикоагулянтных свойств препаратов результаты теста, в котором ингибиторы были внесены одномоментно с инициацией, то на долю эффекта, имеющего точкой приложения заключительную фазу свертывания, при концентрации ингибитора из нонеи 0,16x10'3 мг/мл приходится около 75%, а при концентрации 0,29x10"3 мг/мл уже около 87% проявляемого общего антикоа-гулянтного эффекта. Преимущественное влияние антикоагулянта из нонеи на

этап тромбинзависимого превращения ФГ наблюдается и при активации тромбиногенеза ТКС: для указанных концентраций ингибитора доля из общего проявляемого эффекта составила около 75 и 90% соответственно.

Ингибитор, выделенный из окопника лекарственного оказывает влияние только на этап превращения ФГ в ФБ.

Обращает на себя внимание то, что по мере повышения концентрации антикоагулянтов из нонеи, медуницы и кривоцвета, одновременно повышается ингибиторный эффект, реализующийся на этапе превращений ФГ; увеличение концентрации антикоагулянтов в 1,8 приводит к увеличению доли ингибиторного эффекта в 2 раза. Такая чувствительность этапа коагуля-ционного превращения ФГ к изменению концентрации антикоагулянтов также свидетельствует о преимущественном их влиянии на заключительную фазу свертывания.

При проведении подобного эксперимента, в котором в качестве тром-бингенерирующей смеси служила плазма крови, освобожденная от ФГ высаливанием, получены сходные результаты.

Взаимодействие ТР с ФГ включает в себя два этапа: ферментативный, приводящий к образованию ФМ, и непосредственно самосборку мономеров. Влияние ингибиторов на самосборку можно считать установленной. В то же время полной ясности в вопросе о их влиянии на ферментативный этап этого процесса.

Мы инкубировали раствор ФГ (120 мг/мл) в 0,14 М растворе хлорида натрия, содержащем ТР (1,5 мг/мл) и мочевину (3,3 М), предотвращающую самосборку. Через равные интервалы времени отбирали аликвоты смеси, провоцировали в них самосборку ФБ и фиксировали момент образования сгустка. В части опытов ингибиторы (З,0х10"3, 3,3х10'3, З,2х10"3 и 7,5x10"3 мг/мл из нонеи, медуницы, кривоцвета и окопника соответственно) добавляли в реакционную смесь одновременно с ТР (оценивается их суммарное влияние на ферментативную и неферментативную фазы превращений ФГ), в другой части - ингибиторы (1,0х10"3, 1,06х10"3, 1,1х10"3 и 2,5x10° мг/мл соответственно) вносили в момент провокации самосборки (влияние только на полимеризацию ФМ) (рис. 5, ингибитор получен из нонеи).

Как следует из рисунка 5, ингибитор тормозит обе стадии превращений ФГ: график скорости суммарной реакции (рис. 5, кривая 2) находится ниже графика скорости реакции, протекающей при воздействии ингибитора только на этап самосборки. Если допустить, что ингибитор из нонеи оказывает влияние на какой либо один из этапов превращения ФГ, обсуждаемые кривые совпадали бы. Аналогичная картина наблюдается при использовании антикоагулянтов из других растений.

Преимущественное влияние ингибиторов на аутополимеризацию ФМ несомненно: если принять за 100% реализацию антикоагулянтного эффекта ингибиторов из нонеи и медуницы опыт, в котором ограничиваются обе фазы превращения ФГ, то на долю самосборки приходится около 85-87% от общего антикоагулянтного эффекта, а при использовании в качестве эффекторов

антикоагулянтов из кривоцвета и окопника в изученных концентрациях - 94 и 90% от общего антикоагулянтного эффекта соответственно.

Рисунок 5. Зависимость скорости самосборки фибрина от продолжительности инкубации смеси ФГ-ТР. Абсцисса - продолжительность инкубации, мин; ордината - скорость реакции, с"'х100. 1 - ингибитор отсутствует в реакционной смеси, 2 - ингибитор внесен в реакционную смесь одновременно с ТР, 3 - ингибитор внесен одновременно с провокацией самосборки.

Самосборка ФМ также включает в себя два этапа: формирование из мономеров протофибрилл и последующую их агрегацию. В связи с этим нам представляется интересным выяснить, как зависит эффект ингибиторов от количества постоянно образующегося ФМ с одновременным формированием протофибрилл в субфизиологических условиях, а также на какие этапы в процессе формирования протофибрилл они оказывают влияние.

Для решения первого вопроса мы осуществляли взаимодействие ФГ (200 мг%, 0,1 мл) и ТР (1 мг/мл, 0,1 мл) в 0,14 М растворе натрия хлорида. Одновременно, и через равные интервалы времени после начала реакции, к смеси прибавляли по 0,1 мл растворов ингибиторов (0,64x10"3, 0,68x10"3, 1,1 хЮ'3 и 1,25x10"3 мг/мл для эффекторов из нонеи, медуницы, кривоцвета и окопника соответственно). В контроле вместо ингибиторов вносили по 0,1 мл физиологического раствора. В этих условиях в результате взаимодействия ТР с ФГ продуцируется ФМ. В случае, когда ингибиторы вносятся в реакционную смесь одномоментно с остальными компонентами реакции, они оказывают влияние на весь процесс формирования протофибрилл. В последующем ингибиторы не только взаимодействуют с образующимся мономером, но и полимерами различной степени зрелости (рис. 6).

-и-2

Рисунок 6. Зависимость скорости реакции взаимодействия ТР с ФГ, с'хЮО (ордината) при внесении ингибитора из нонеи темной в реакционную смесь через равные интервалы времени после инициации реакции, с (абсцисса). 1 - контроль, 2 -опыт.

Как следует из рисунка 6 в случае внесения ингибитора в реакционную смесь одномоментно с ТР и ФГ, скорость образования фибринового сгустка снижается на 44,5%. При запаздывающем внесении ингибитора скорость образования сгустка через 5, 10, 15, 20 и 25 с после инициации реакции ниже контрольной на 30, 15,5, 7,1, 3,1 и 0,0% соответственно. Если принять за 100% время, за которое образуется сгусток в отсутствие ингибитора, то время влияния ингибитора на процесс формирования протофибрилл составляет 77% от контрольного, т.е. при достижении протофибриллами достаточно высокой степени зрелости ингибитор перестает оказывать влияние на их дальнейший рост и агрегацию.

Похожими кривыми описывается скорость формирования ФБ при воздействии на этот процесс ингибиторов из остальных растений.

Таким образом, можно сделать заключение, что даже с учетом ограничения скорости взаимодействия ТР с ФГ наблюдается преимущественное влияние ингибиторов на более ранние стадии формирования протофибрилл, уменьшение этого влияния в процессе роста волокон и полное его отсутствие при прохождении около 2/3 пути от момента появления первых мономеров и до образования фибринового сгустка.

Это положение мы проверили, исследуя влияние ингибиторов непосредственно на самосборку ФБ по методу В.А. Белицера /1975/ (рис. 7). Прямая 1 характеризует изменение ВС в случае одинаковой чувствительности всех ее этапов к действию ингибиторов. Кривая 2 - экспериментально установленное ВС. В эксперименте использован мономерный фибрин (2x10"6 М) и ингибиторы из нонеи, медуницы, кривоцвета и окопника (0,64x10"3, 0,68x10"3, 1,1x10' 3 и 1,25x10"3 мг/мл). Самосборку провоцировали 0,075 М боратным буфером с рН 7,6 .

Представленные на рисунке 7 графики свидетельствуют, что наиболее восприимчивы к действию ингибиторов мономеры фибрина и его олигомеры. По мере созревания протофибрилл ингибирующий эффект снижается и по ис-

течении 62,5% времени, необходимого для завершения образования ФБ, действие ингибитора самосборку прекращается.

Рисунок 7. Время самосборки ФБ в опытах с внесением ингибитора из нонеи темной в разные сроки от начала процесса. 1 - теоретически расчи-танная кривая; 2 - экспериментальная кривая; 3 - контроль. Пояснения в тексте.

—В—2

-д-з

О 7,5 15 22,5 30 37,5 45

Наиболее вероятно участие во взаимодействии ингибиторов с ФБ электростатических сил. Так, анализ аминокислотного состава пептидов показывает, что ингибиторы, полученные из нонеи и кривоцвета на 41,2% состоят из аминокислот, функциональные группы которых способны к диссоциации в физиологических условиях. У ингибитора из медуницы - на 45%, а из окопника - на 46,9%.

Участие электростатических взаимодействий подтвердилось изучением зависимости эффективности торможения самосборки от значений рН среды: эффективность торможения скорости самосборки фибрина нарастает с повышением рН, достигая максимума при 7,6, и не изменяясь при рН от 7,6 до 9,0. Это свидетельствует о роли электростатических взаимодействий в образовании комплекса ингибитор-фибрин. Из этого же следует, что со стороны ингибитора во взаимодействии принимают участие отрицательно заряженные функциональные группы - повышение степени их диссоциации приводит к увеличению эффективности торможения.

Влияние экстракта из нонеи темной на гемокоагуляцию лабораторных животных. Прежде всего мы уточнили эффективную, но не вызывающую кровоточивости, дозу экстракта. Для этого животным вводили в яремную вену раствор экстракта в дозах 0,05, 0,10, 0,30 и 0,50 мг/кг массы (контрольным животным - 0,85% раствор хлорида натрия). Пробы крови отбирали через 30 мин, 1, 3, 6, 9, 12, 24 и 36 ч, оценивая антикоагулянтную активность экстракта по его влиянию на ВР, ТВ и ПТВ (табл. 4).

Введение экстракта в дозе 0,05 мг/кг массы приводило к угнетению ге-мокоагуляции в течение 2-х ч с последующей нормализацией ее активности. Введение экстракта в дозе 0,1 мг/кг привело к более интенсивному угнетению гемокоагуляции: уже через 30 мин ВР увеличилось на 24,7%, ПТВ - на 21,6%, ТВ-на 18,3%,ачерез 1 ч - на 41, 30,1, 26,6% соответственно. Далее гипокоа-

гулемия уменьшается, хотя достоверные отличия от контроля выявляются и через 9 часов после введения экстракта.

Таблица 4

Влияние экстракта нонеи темной на показатели гемокоагуляции

Время рекальцификации, с

Контроль 0,05 мг/кг 0,1 мг/кг 0,3 мг/кг 0,5 мг/кг

30 мин 70,4+1,8 78,813,6* 89,1+2,2* 139,2+1,6* 256,112,7*

1 час 68,2±1,5 78,2+3,4* 96,7±2,2* 147,3±1,6* 261,8±1,2*

3 часа 71,5±2,1 72,4±2,4 97,3±2,1* 150,1+2,1* 262,412,8*

6 часов 69,5±1,2 68,4+4,1 94,5±2,8* 106,2±2,6* 204,212,7*

9 часов 68,2±2,1 70,1+2,4 85,7+3,3* 94,2±1,5* 181,312,6*

12 часов 71,6±1,2 - 74,8±2,6 77,7±2,1* 107,7+3,4*

24 часа 68,6+2,6 - 72,6±2,8 74,2±2,3 85,3±1,6*

36 часов 69,5±1,2 - 71,2+4,1 69,4+2,3 71,311,4

Громбиновое время, с

30 мин 30,4+1,9 35,1+2,6' [_35,912,7* 52,7±2,9* 77,011,7*

1 час 30,4+1,4 36,0+1,8' 38,5+2,6* 53,2±2,1* 80,3+1,6*

3 часа 31,7+2,7 30,4±2,4 38,4±1,2* 54,9+2,8* 82,4+1,3*

6 часов 29,2+2,4 29,4+1,8 32,8±2,9 36,2±2,6* 64,312,2*

9 часов 30,2+2,9 29,6+2,4 33,2±1,4 34,5±1,2 41,712,7*

12 часов 31,2±2,2 - 31,8±2,6 32,4+2,8 34,012,2

24 часа 29,2±1,6 - 30,2+2,2 30,6±1,1 31,211,8

36 часов 29,8+2,4 - 30,1±1,4 30,2+2,3 29,6+1,2

Протромбиновое время, с

30 мин 16,2+1,8 16,8±3,5 19,7±2,6* 33,0±3,7* 50,8+5,2'

1 час 15,6±1,6 16,5±2,4 ^20,3+2,8* 33,2+2,4* 51,612,8*

3 часа 15,1+2,2 15,8+2,7 20,5±2,3* 32,7±4,1* 51,1+4,2'

6 часов 16,3+1,6 15,1+1,2 18,9+1,6 21,4+1,6* 42,311,5'

9 часов 15,2+2,7 15,0+2,2 15,7+1,6 18,5+1,4* 29,213,7'

12 часов 16,3+1,9 - 15,9±2,2 17,212,8 18,4+2,6

24 часа 16,2±1,4 - 16,1+1,1 16,2±2,8 17,4+2,7

36 часов 14,6± 1,7 - 14,2+1,8 14,6±2,2 15,411,2

Экстракт в дозах 0,3 и 0,5 мг/кг вызывает еще большие отличия в показателях, а выраженная гипокоагулемия сохраняется и через 24 ч после введения экстракта в дозе 0,5 мг/кг (ВР остается увеличенным на 24,3%). Независимо от использованных доз, через 36 ч от момента введения экстракта происходит нормализация изучаемых показателей.

Считается, что эффективной дозой прямых антикоагулянтов должна быть доза, удлиняющая ВР в 1,5-3 раза. В нашем случае это 0,1- 0,5 мг/кг.

В следующих экспериментах мы изучали состояние гемокоагуляции в течение 14 дней при ежедневном однократном введении экстракта. Экстракт вводили внутривенно в дозе 0,5 мг/кг массы (экстракт вводили в 8-9 ч утра, кровь отбирали через 6 ч после введения экстракта).

Результаты опыта показали, что при ежедневном однократном введении экстракта гемокоагуляционные сдвиги достигают максимума к 4-6 дню (ВР увеличивается по сравнению с контролем в 3,3 раза, ТВ - в 2,1 раза). В последующие дни введения экстракта гипокоагулемический эффект сохраняется и остается равным по интенсивности гипокоагулемии, вызванной первой инъекцией. Таким образом, повторные введения экстракта не вызывают ни ослабления, ни существенного усиления эффекта.

Далее мы сравнили динамику изменений свертывающей активности после первой и после четырнадцатой инъекцией антикоагулянта в дозе 0,5 мг/кг массы. При этом динамика гипокоагулемии примерно одинакова после первой инъекции и после инъекции, выполненной в 14-й раз: после первой инъекции ВР удлинялось через 1, 6, 12 и 24 ч соответственно в 3,8, 3,0, 1,5 и 1,2 раза, ТВ - в 2,6, 2,3, 1,1 и 1,1 раза; после 14-й инъекции ВР увеличивалось в 3,8,3,0, 1,5 и 1,2 раза, а ТВ-2,6,2,2, 1,1 и 1,1 раза.

Важным показателем, определяющим ценность антикоагулянтных препаратов, является их способность предотвращать гибель животных от тром-богенных факторов. Для создания экспериментального тромбоза мы использовали экзогенную тромбопластинемию. Препарат тканевого тромбопластина (активность 22,8 с) вводили в яремную вену в дозе 40 мг/кг массы тела (контроль - изотонический раствор хлорида натрия) через 30 мин после предварительного введения экстракта из травы нонеи в дозе 0,1 мг/кг и 0,5 мг/кг. Регистрировали количество погибших животных в каждой группе, а также время наступления их гибели (табл. 5).

Таблица 5

Частота гибели животных при введении тромбопластина на фоне предварительного воздействия экстракта нонеи темной

Экстракт в дозе Число крыс Выжило Погибло Частота гибели, % Р

Контроль - 30 11 19 63,3 -

Опыт 0,1 мг/кг 30 21 9 30,0 <0,05

0,5 мг/кг 30 26 4 13,3 <0,05

Из таблицы 5 видно, что экстракт в дозах 0,1 и 0,5 мг/кг снижает частоту гибели подопытных животных в 2,1 и 4,8 раза соответственно.

Мы уточнили механизм действия экстракта, в частности, оценили интенсивность внутрисосудистого превращения ФГ под влиянием тромбопластина на фоне предварительного введения экстракта.

Опыты проведены на трех группах животных. Первой и второй группам вводили изотонический раствор хлорида натрия, третьей - экстракт в дозе 0,5 мг/кг. Через 30 мин животным второй и третьей групп вводили по 30 мг/кг взвеси тромбопластина, через 30 мин после инъекции отбирали пробы крови и определяли содержание ПДФ и BP.

У животных, не получавших тромбопластин, ПДФ не выявлялись. У животных 2-й группы значение BP снизилось с 88,0 до 62,2 с, а показатель ПДФ равен 0,14 г/л, что отражает достаточно выраженное его накопление. У животных 3-ей группы количество ПДФ по сравнению с предыдущей группой было снижено практически в 3 раза. При этом BP в 2,5 раза превышало соответствующие показатели у животных второй группы и почти в 2 раза - у животных контрольной группы. Это позволяет связать защитное действие экстракта из нонеи при введении тромбопластина с его способностью замедлять активацию превращений ФГ (отражаемую уровнем ПДФ), провоцируемую ускоренным образованием ТР.

При оценке потенциальной перспективности любого прямого антикоагулянта принято сравнивать его эффект с эталонным препаратом этой группы -гепарином. Поэтому в следующей серии опытов мы сравнивали противосвер-тывающее действие экстракта (по BP) с таковым эффектом гепарина in vitro и установили, какие дозы гепарина по мощности соответствуют дозам экстракта (табл. 6).

Таблица 6

Эффективность торможения времени рекальцификации донорской плазмы гепарином и экстрактом из нонеи темной

Концентрация в исследуемой Эффективность торможения в

плазме присутствии

Гепарин, ЕА/мл Экстракт, мг/мл Гепарина Экстракта

1 0,05 0,1610,01* 0,2110,01*

2 0,1 0,30+0,02* 0,3910,03*

4 0,15 0,43+0,02* 0,5810,02*

8 0,2 0,6410,02* 0,7610,03*

16 0,25 0,8710,03* 0,9110,03*

При анализе таблицы видно, что соотношение мощности препаратов не носит линейного характера. Так, для торможения ВР на 30-40% необходимо ввести в систему гепарин в дозе 2 ЕА, что в пересчете на мг соответствует 0,015 мг гепарина /Лакин К.М., Балуда В.П., 1981/, а экстракт - в дозе 0,1 мг, т.е. доза гепарина в 5 раз ниже. В то же время, для торможения времени рекальцификации на 90% необходимо ввести в систему 16 ЕА гепарина (0,12 мг) и 0,25 мг экстракта, т.е. в данном случае доза гепарина ниже всего в 2,1 раза. Таким образом, несмотря на очевидно меньшую активность экстракта в

дозах, необходимых для клинически значимых эффектов, различие антикоагулянтов по мощности вполне сравнимо.

Для детального сравнения гепарина и экстракта ряд опытов был проведен in vivo. Мы использовали гепарин в дозах 100, 200 и 300 ЕА/кг, а экстракт из нонеи - 0,1, 0,3 и 0,5 мг/кг. Отбор проб крови проводили через 30 мин после введения антикоагулянтов (табл. 7).

Таблица 7

Эффективность торможения времени рекальцификации гепарином и экстрактом из травы нонеи темной

Доза п репарата Увеличение ВР в .... раз

Гепарин, ЕА/кг Экстракт, мг/кг Гепарина Экстракта

100 0,1 1,52 1,25

200 0,3 2,45 2,6

300 0,5 4,03 3,59

Как видно из таблицы, доза экстракта, необходимая для получения эффективности торможения на 120-150% всего в 0,13 раз превышает необходимую дозу гепарина, а для достижения 400% эффективности торможения доза гепарина превышает дозу антикоагулянта в 4,62 раза .

Специальная серия опытов была посвящена динамическому сравнению активности гепарина и экстракта на протяжении 12 часов после однократного их введения. Для исследования были выбраны дозы препаратов, которые через 30 мин давали приблизительно 3-х кратное увеличение ВР. Дозы гепарина (200 ЕА/кг) и экстракта (0,3 мг/кг) вводили подопытным животным внутри-

после инъекции (рис. 8).

Рисунок 8. Время рекальцификации (с) после введения животным гепарина или экстракта (ордината) в разное время после инъекции (абсцисса); 1 - после введения экстракта; 2 - после введения гепарина; 3 - контроль.

Как видно из рисунка 8, в первые 3 часа после введения антикоагулянтов происходят приблизительно одинаковые изменения ВР - в 2,5 раза по сравнению с контролем. Однако, уже через 9 часов после введения гепарина ВР воз-

вращается к исходному результату, а после введения экстракта оно остается увеличенным в 1,9 раза и возвращается к исходным величинам лишь через 18-20 часов.

Известно, что площади, описываемые кривыми (в пределах координат и над линией контрольного значения), пропорциональны эффективности сравниваемых препаратов /Соловьев В.Н. и соавт., 1980/. При анализе рисунка 8 видно, что эффективность экстракта выше, чем эффективность гепарина. В первом случае площадь составляет 10,6 смг, во втором - 3,1 см2. Принимая во внимание то, что действие экстракта сохраняется до 24 часов (хотя и в меньшей степени), разница эффективностей еще выше.

Таким образом, противосвертывающий эффект экстракта отличается от эффекта гепарина прежде всего стабильностью: гипокоагулемия вызванная гепарином, кратковременна - снижение в 2 раза по сравнению с максимальным значением через 7 часов, а гипокоагулемия после инъекции экстракта стабильна в течение 6-8 часов и лишь через 12 часов приближается к уровню, составляющему около половины первоначального эффекта.

Токсикологическая характеристика экстракта из нонеи темной.

В первой серии опытов мы исследовали токсичность экстракта при внутривенном введении. С этой целью крысам вводили экстракт из расчета от 5 до 30 мг/кг массы тела и наблюдали за ними в течение 8 дней (табл. 8).

Таблица 8

Результаты наблюдения над животными, получившими внутривенно различные дозы экстракта

Доза экстракта, Кол-во Погибло Время Частота ги-

мг/кг животных гибели бели, %

Контроль 10 0 не гибли 0,0

5 10 0 не гибли 0,0

10 8 0 не гибли 0,0

15 13 7 за 20 ч 53,8

20 13 10 за 14 ч 76,9

25 8 8 за 8 ч 100

30 8 8 за 5 ч 100

Как видно из данных таблицы, животные погибали в первые сутки после введения экстракта в дозах, начиная с 15 мг/кг. Отсроченной гибели животных (позднее первых суток) не наблюдалось.

Имеются все основания считать, что причина гибели животных - гипо-коагулемический эффект: ей предшествовали кровотечения из мест прокола вен, при вскрытиях погибших животных в сосудистом русле обнаружили не-свернувшуюся кровь в сочетании с рыхлыми сгустками, кровоизлияния в легкие, сгустки крови в просвете тонкого кишечника.

Для подсчета ЭЬ5о экстракта при внутривенном пути введения экстракта нами использованы формулы Г.Н. Першина и Кербера, считая, что ориентировочная составила 15 мг/кг.

По формуле Г.Н. Першина ОЬ50= 16,0 мг/кг массы, по методу Кербера -16,25 мг/кг при величине стандартной ошибки (по Гэддаму) 1,57 мг/кг. Таким образом, ОЬ50 для экстракта нонеи составляет 16,111,57 мг/кг. Следовательно, минимальная эффективная доза экстракта, вызывающая значительное и достаточно длительное изменение гемокоагуляционных показателей при внутривенном введении равна 0,1 мг/кг, а ОЬ50 -16,1 мг/кг. Это создает достаточный коэффициент безопасности и позволяет рассматривать наш экстракт как эффективное гипокоагулемическое средство.

В следующих экспериментах оценивали острую токсичность экстракта при внутрибрюшинном и внутримышечном введении в высоких дозах (30 и 40 мг/кг), которые при внутривенном пути введения заведомо вызывали смертельный исход в 100% случаев. При оценке гемокоагуляционных показателей подопытной группы животных, они оказались идентичными контрольным показателям. По окончании срока наблюдения подопытных животных забивали под легким эфирным наркозом и визуально оценивали состояние внутренних органов и тканей. Каких-либо видимых изменений, в том числе следов кровоизлияний, обнаружено не было. Следовательно, исследуемый экстракт при внутримышечном и внутрибрюшинном введении оказался практически нетоксичным.

При проведении токсикологических исследований при субхроническом введении экстракта мы регистрировали общее состояние животных, их вид и поведение, характер потребления пищи и воды, изменение массы тела, картину периферической крови, функциональное состояния печени и почек, элек-тро-физиологическое состояние сердечной мышцы.

В наших экспериментах мы взвешивали животных до начала опыта и по его окончании, вводя экстракт в дозах: внутривенно 5 мг/кг массы тела 1 раз в день и внутрибрюшинно - 30 мг/кг также 1 раз в день, на протяжении 20 дней. За время 20 дней естественная прибавка массы контрольных животных составила в среднем 1,4 г в сутки, конечная масса увеличилась по отношению к исходной на 15,0%. У подопытных животных результаты были аналогичными (1,2 и 1,4 грамма; 12,6 и 14,9% соответственно).

Состояние периферической крови оценивали по общепринятым в клинико-диагностических лабораториях методикам (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, содержание гемоглобина, уровень СОЭ и лейкоцитарная формула). Предварительное гематологическое обследование проводили 2 раза с интервалом в 5 дней (для получения исходных данных по изучаемым показателям), а затем на 10 и 21 сутки после внутривенного введения экстракта в дозе 5 мг/кг массы тела и внутрибрюшинного введения 30 мг/кг (в обоих случаях - 1 раз в день).

Полученные данные свидетельствуют, что длительное введение экстракта не приводит к существенным различиям между показателями контрольной

и подопытных групп, за исключением незначительного уменьшения количества тромбоцитов у крыс, получавших антикоагулянт внутрибрюшинно в дозе 30 мг/кг (в среднем с 528- до 502х109/л).

При оценке влияния экстракта нонеи на функциональную способность почек животные были разделены на 3 группы. 1 -я группа - контроль: животным вводили внутривенно изотонический раствор хлорида натрия; 2-й - экстракт нонеи в дозе 30 мг/кг внутрибрюшинно один раз в день на протяжении 20 дней; 3-й - внутривенно в дозе 5 мг/кг 1 раз в день (20 дней).

До начала исследований и на на 21 сутки эксперимента исследовали количество мочи, выделявшейся за 3 часа, и содержание белка в моче. Для этого животным контрольной и подопытной групп вводили через зонд в желудок по 2 мл изотонического раствора хлорида натрия и исследовали порции мочи, собираемые за 3 часа после водной нагрузки. При этом существенных различий в исследуемых показателях не выявлено. Изучение биохимических показателей крови, отражающих функциональное состояние почек, показало, что каких-либо отклонений в уровне эндогенного креатинина и азота мочевины также не выявлялось.

Эту же схему эксперимента применили для исследования функциональной активности печени. В сыворотке крови животных определяли активность ферментов - маркеров синдромов цитолиза и холестаза (аспар-татаминотрансфераза, аланинаминотрансфераза, щелочная фосфатаза, содержание общего билирубина) до начала эксперимента и после его окончания. При этом обнаружено, что как исходные, так и конечные показатели в контрольной и подопытных группах на протяжении исследования существенно не меняются и не отличаются друг от друга.

Влияние экстракта на биоэлектрическую активность миокарда оценивали путем записи ЭКГ у крыс, подвергшихся введению раствора экстракта в дозе 30 мг/кг внутрибрюшинно и 5 мг/кг внутривенно один раз в день на протяжении 20 дней. При анализе результатов ориентировались на данные И.В. Са-ноцкого (1970), где представлены показатели нормальной электрокардиограммы белых крыс. Установили, что как в контрольной, так и в подопытных группах на протяжении эксперимента исследуемые показатели практически не менялись.

Пептидные ингибиторы коагуляционного превращения фибриногена, получаемые из сапропеля. Известно, что водные растения после отмирания естественным образом концентрируются в иловых донных отложениях озер - сапропелях. По сведениям Н.В. Кордэ в некоторых случаях они обеспечивают до 80% органической фазы сапропеля. В связи с этим мы избрали сапропель как предполагаемый источник биологически активных веществ растительного происхождения.

При разработке способа получения фракции сапропеля с антикоагулянт-ной активностью мы установили, что наиболее подходящим экстрагентом является 0,1 М водный раствор аммиака, экстракция должна производиться в течение 1 ч при 20°С и соотношении сырье:экстрагент 1:3.

Далее мы разработали оригинальную методику получения гомогенных носителей антикоагулянтной активности, включающую экстракцию сапропеля в вышеуказанных условиях, глубокое замораживание (~20°С, 24 ч) с последующим спонтанным размораживанием при 20°С, высаливание примесей сульфатом аммония при 100% насыщении, удаление сульфата аммония путем замены растворителя (этиловый спирт) и отгонка спирта. Конечным этапом служила гель-фильтрация на Сефадексе С-50 (рис. 9).

Рисунок 9. Хроматогра-фический профиль антикоагулянтной активности при гель-фильтрации фракции сапропеля, освобожденной от гуми-новых кислот на Сефадексе в-50. Абсцисса - №№ фракций; ордината - эффективность торможения.

П? ^

О о,\ <& (й Л Д (,\

При гель-фильтрации фракции сапропеля, освобожденной примесей, носитель антикоагулянтной активности элюируется в виде двух не накладывающихся друг на друга пиков, что свидетельствует о присутствии в полученной фракции носителей, различающихся по молекулярной массе.

Для выяснения природы носителей антикоагулянтной активности фракции экстракта, соответствующие I и II пикам антиполимеризационной активности, концентрировали и подвергали хроматографии на бумаге, как описано выше. После проявления хроматограммы нингидриновым реактивом на хро-матограмме не выявляются свободные аминокислоты, но имеется нингидрин-положительное пятно округлой формы.

При кислотном гидролизе происходило разрушение носителей (ингиби-торная активность исчезала), а в гидролизате появлялся спектр соединений, по характеру и окраске соответствующих аминокислотам. Эти данные, а также способность носителей к ферментативному гидролизу (как описано выше), указывают на пептидную природу ингибиторов (рис.10).

Механизм ограничения плазмокоагуляции ингибиторами из сапропеля. Наглядную информацию о влиянии антикоагулянтов на свертывание крови, мы получили при анализе электрокоагулограмм. Субстратом служила пулированная донорская плазма, а эффекторами - фракции сапропеля, содержащие ингибиторы, соответствующие I (1|) и II (12) пикам ингибиторной активности (по 100 ЕА/мл), а также совместно два пептида в естественной пропорции (рис. 11,12, 13 и 14).

Фракция 11+12 в достоверно не изменяет времени до начала свертывания, в 1,5 раза увеличивает продолжительность свертывания, в 2 раза уменьшает плотность сгустка, а скорость свертывания снижает в 2 раза.

Рисунок 10. Хро-матограмма гидролиза-тов ингибиторов из сапропеля. 1 - негидро-лизованный 11; 2 - гид-ролизованный 1ь 3 -стандартная смесь аминокислот; 4 - гид-ролизованный Ь; 5 -негидролизованный 12.

Фракция I] в 2,1 раза увеличивает время до начала свертывания, в 4,5 -продолжительность свертывания, в 2,5 раза ускоряет наступление ретракции и фибринолиза, в 4 раза снижает скорость свертывания, в 8 раз снижает плотность образующегося сгустка, в 20 раз снижает скорость ретракции и фибринолиза.

Рисунок 11. Электрокоагулограмма времени рекальцификации нормальной плазмы крови доноров. Обозначения (здесь и далее) Т| - время до начала процесса свертывания; Т2 - время от начала процесса и до конца свертывания; Т3 - начало ретракции и фибринолиза; Т - продолжительность процесса свертывания.

Фракция 1г достоверно не изменяет времени до начала свертывания, в 1,9 раза ускоряет наступление ретракции и фибринолиза, в 1,2 раза уменьшает скорость свертывания, в 1,2 раза снижает плотность образующегося сгустка, в

* § • 6

I 0 1 1

%

1

V

»

1 2 3 4 5

3 раза снижает скорость ретракции и фибринолиза. Следовательно, имеются существенные различия в механизме ограничения плазмокоагуляции изучаемыми эффекторами.

Рисунок 12. Электрокоагулограмма времени рекальцификации нормальной плазмы крови доноров в присутствии фракции I].

Рисунок 13. Электрокоагулограмма времени рекальцификации нормальной плазмы крови доноров в присутствии фракции 12.

ной плазмы крови доноров в присутствии фракции I] + Ь.

Данные, полученные при нефелометрическом исследовании процесса самосборки, подтверждают вышесказанное, и свидетельствуют о том, что I¡ тормозит преимущественно аутополимеризацию достаточно зрелых олигоме-ров, а 12 обладает выраженным ингибирующим действием на ранние стадии полимеризации.

Далее мы установили их взаимодействие между собой. С этой целью использовали систему, содержащую ТР(1 мг/мл) и ФГ (4 мг/мл). Определяли степень эффективности торможения. Величину синергизма (антагонизма или суммации) рассчитывали по Уэбб JI. /1966/.

Оказалось, что экспериментальная эффективность торможения существенно выше рассчитанной теоретически - на 42%, что свидетельствует о выраженном синергизме эффектов, проявляемых ингибиторами. Это же говорит о различии в механизме ограничения процесса коагуляционного превращения ФГ; в случае одинакового механизма вероятнее всего мы наблюдали бы сум-мацию эффектов (при недостатке эффекторов в системе), или антагонизм -при насыщении системы ингибиторами.

Мы не стали проводить подробное изучение каждого из пептидов в отдельности, полагая, что в плане создания на их основе нового средства фармакологической коррекции гемостаза наиболее оптимальной является их со-четанная комбинация в естественном соотношении.

Мы определили, на какой из этапов свертывания плазмы оказывают влияние ингибиторы, используя в качестве субстрата плазмы, дефицитные по ф. II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII и кининам. Выбор определяемых показателей обусловлен рекомендациями фирмы-изготовителя дефицитных плазм. В контроле использовали нормальную плазму той же фирмы.

Результаты экспериментов, свидетельствовали о том, что эффективность торможения скорости соответствующих реакций свертывания достоверно различается только в случае использования в качестве плазм, дефицитных по фактору II (рис. 15) и кининам, и эффект ингибитора не зависит от активности факторов V, VII, VIII, IX, X, XI и XII.

Выраженная зависимость степени эффективности торможения ингибитором от концентрации протромбина и отсутствие подобного эффекта в случае использования других фактор-дефицитных плазм, дополнительно свидетельствует в пользу предположения о преимущественном влиянии носителя ингибиторной активности на заключительную фазу процесса плазмокоагуля-ции; недостаток образующегося ТР приводит к удлинению процесса свертывания ФГ и, следовательно, увеличению времени, в течение которого ингибитор может реализовать свой эффект.

Что касается существенного увеличения степени торможения при использовании в эксперименте плазмы, дефицитной по кининам, то в данной работе эти сведения мы восприняли на уровне констатации факта, без попытки детального исследования механизма происходящего.

Рисунок 15. Эффективность торможения тромбопластинового времени плазмы, дефицитной по ф. II, фракцией антикоагулянта из сапропеля. Здесь и ниже - абсцисса - концентрация антикоагулянта (ЕА/мл); ордината - эффективность торможения (¡).

Дифференциация влияния ингибиторов на ферментативный и неферментативный этапы III фазы свертывания крови показала, что они тормозят обе стадии превращений ФГ, однако, до 67% общего антикоагулянтного эффекта приходится на самосборку. При этом наблюдается преимущественное влияние ингибиторов на более ранние стадии формирования протофибрилл, уменьшение этого влияния в процессе роста волокон и полное их отсутствие при прохождении около 2/3 пути от момента появления первых ФМ и до образования ФБ сгустка. Установлено, что ведущими силами в образовании комплекса мономер-ингибитор являются электростатические взаимодействия.

Таким образом, можно утверждать, что ограничение процесса коагуля-ционного превращения ФГ осуществляется по механизму, аналогичному для пептидов животного и растительного происхождения.

Гемокоагуляционные изменения при внутривенном введении экстракта из сапропеля лабораторным животным. Для проведения этих экспериментов мы получили фракции, содержащие II и 1г. II и 1г объединили в пропорциях, соответствующих их содержанию в сапропеле, поместили в стеклянный бюкс и высушили. Сухой остаток взвесили и сопоставили количество ЕА, содержащихся в 1 мг препарата. Установили, что 1 мг препарата ингибитора содержит 137,5 ЕА. В дальнейших экспериментах мы ориентировались на эти цифры.

При анализе общего состояния плазмокоагуляции в ответ на внутривенное ведение ингибиторов из сапропеля мы определяли ВР, ТВ и ВС, а также исследовали защитное действие при экзогенной тромбинемии, вызванной инъекцией взвеси тромбопластина.

Первоначально мы изучили зависимость проявляемого антикоагулянт-ного эффекта от дозы вводимого препарата (9,2, 7,0 и 4,8 мг/кг массы тела животного). Отбор проб производили через 30 мин после инъекции. Контрольным животным вводили физиологический раствор (табл. 9).

Таблица 9

ВР, ТВ и ВС при внутривенном введении антикоагулянта

Концентрация антикоагулянта, мг/кг Определяемый показатель ВР, с ТВ, с ВС, с

Контроль 64 ± 1,0 21 ±0,5 38 ± 1,5

4,8 122 ±2,0* 37 ±2,5* 138 ±2,0*

7,0 132 ±3,5* 69 ±2,5* 184 ±4,5*

9,2 248 ± 6,0' 72 ± 1,0* 312 ±4,0*

Приведенные в таблице 9 данные свидетельствуют о наличии выраженной дозозависимости антикоагулянтного эффекта, а эффективной дозой можно считать дозу 7,0 мг/кг массы тела животного, удлиняющую ВС при однократной инъекции в 2,1 раза.

Далее мы проследили динамику изменений изучаемых показателей свертывающей активности плазмы крови во времени. Лабораторным животным внутривенно вводили антикоагулянт в дозе 7,0 мг/кг массы, отбирая кровь через 3, 30 мин, 1, 3, 6,12 и 18 ч (табл. 10).

Таблица 10

ВР, ТВ и ВС в разные сроки после введения экстракта

Отбор проб Определяемый показатель

крови произво- ВР, с ТВ, с ВС, с

дили через:

Контроль 72+ 1,0 24 ± 1,5 38 ± 1,0

3 мин 108 ±2,5* 50 ± 2,0* 102 ±2,5*

30 мин 150 ± 1,5* 76 ±4,0* 184 ±2,5*

1 час 211 ±2,0' 89 ±2,5* 256 ±4,5*

3 часа 188 ±3,2* 74 ± 2,5* 224 ±5,0*

6 часов 113 ±2,5' 58 ± 1,5* 192 ±3,0*

12 часов 104 ±5,0* 44 ±3,0* 176 ±1,5*

18 часов 78 ±3,5 24 ± 1,0 121 ±3,0*

Уже на 3 мин после инъекции наблюдается угнетение плазмокоагуля-ции: ВР увеличилось на 150%, ТВ - на 208%, ВС - на 268%. Эффект антикоагулянта нарастает в течение первого часа, что характеризуется увеличением ВР на 293%, ТВ на 370%, ВС на 674%, при этом выраженная гипокоагулемия регистрируется в течение еще 12-ти часов. Обращает на себя внимание то, что

по истечении 18-ти часов наряду с нормализацией ВР и ТВ, ВС увеличено по отношению к контрольному значению на 318%.

В экспериментах следующей серии мы изучали состояние гемокоагуля-ции в течение 14 дней при ежедневном однократном введении ингибиторов. Антикоагулянт вводили внутривенно в дозе 7,0 мг/кг массы в 8-9 ч утра, кровь отбирали через 3 ч после введения. Результаты опыта показали, что в течение 2-х недель от инъекции к инъекции сдвиги изучаемых показателей практически не изменяются, отклоняясь максимально на 11% после первой инъекцией (для ВР), на 14% - ТВ и ВС. Таким образом, повторные введения экстракта не вызывают ни ослабления, ни существенного усиления эффекта.

При моделировании экзогенной тромболластинемии (табл. 11) внутривенное введение животным тромбопластина (40 мг/кг) вызывало летальность в 70% случаев. При этом основная часть животных гибла в течение первых 4-х часов. На фоне предварительного внутривенного введения ингибиторов из сапропеля в дозе 7,0 мг/кг массы летальность составила 26,6%, а при дозе экстракта 9,2 мг/кг - только 6,6%, причем гибель животных (в обеих группах) наблюдалась на протяжении 10 часов. Следовательно, экстракт в дозах 7,0 и 9,2 мг/кг массы тела снижает частоту гибели подопытных животных в 2,6 и 10,5 раза соответственно.

Таблица 11

Частота гибели животных при введении тромбопластина на фоне предварительного воздействия экстракта из сапропеля

Экстракт в дозе, мг/кг Число крыс Выжило Погибло Частота гибели, % Р

Контроль - 30 9 21 70,0 -

Опыт 7,0 30 22 8 26,6 <0,05

9,2 30 28 2 6,6 <0,05

Далее мы сопоставили противосвертывающий эффект ингибиторов из сапропеля и гепарина in vitro (табл. 12); для достижения 30% торможения ВР требуется внести гепарин в дозе 2 ЕА (0,015 мг/мл), а ингибиторов 0,02 мг/мл, т.е. в 1,33 раза выше. Это же соотношение доз сохраняется при достижении 40, 60% торможения, а при 80% торможении времени рекальцификации дозы уравниваются.

Мы также сопоставили противосвертывающий эффект ингибиторов из сапропеля и гепарина in vivo (табл. 13).

Анализ данных, представленных в таблице 13, показывает, что для увеличения ВР в 1,5-2 раза доза ингибиторов из сапропеля превышает таковую гепарина в 6,2 раза. При увеличении степени торможения реакции в 2-2,5 раза разница в дозах уменьшается до 4,6 раз, а при достижении 350-450% торможения ВР гепарина требуется всего в 2,25 раза меньше, чем ингибитора из са-

пропеля. Следовательно, для достижения примерно равных эффектов в ограничении ВР требуются отличающиеся в пользу гепарина, но вполне сопоставимые дозы антикоагулянтов.

Таблица 12

Эффективность торможения времени рекальцификации донорской плаз-

Концентрация в исследуемой плазме Эффективность торможения в присутствии

Гепарин,ЕА/мл 11+12, мг/мл Гепарина 11+Ь

1 0,01 0,16+0,01 0,25+0,015*

2 0,02 0,30+0,02 0,30±0,02

4 0,04 0,43+0,02 0,40±0,03

8 0,08 0,64±0,02 0,63±0,02

16 0,12 0,87±0,03 0,84±0,03

Таблица 13

Торможение времени рекальцификации гепарином и ингибитором из са-

Дозы антикоагулянтов Время рекальцификации, с

Контроль 64,9+0,65

Гепарин, ЕА/кг 1|+1г, мг/мл Гепарин 11+Ь

100 4,8 13812,2 12211,5*

200 7,0 16213,0 132+4,5*

300 9,2 279+2,0 24812,0*

В заключительной серии экспериментов мы сочли необходимым определить острую токсичность антикоагулянта из сапропеля.

Животным внутривенно вводили антикоагулянт из сапропеля в дозах от 7,0 до 55,2 мг/кг массы, контролировали ВР через 30 мин после инъекции и наблюдали за ними в течение недели (табл. 14).

Из таблицы 14 следует, что при высоких дозах антикоагулянта животные гибли в первые часы после введения. В более поздние сроки гибели животных не наблюдалось. Как мы указывали выше, при инъекциях антикоагулянта из сапропеля в дозах 7,0 и 9,2мг/кг ВР через 30 мин после введения увеличивалось в среднем в 2 и 3,5 раза соответственно. При дозе 18,4 мг/кг свертываемость плазмы уменьшилась в 4,9 раз, однако гибели животных не наблюдали. При дозе 27,4 мг/кг в течение 10 ч после операции погибла 1 крыса из 6, при этом свертываемость плазмы снизилась в 5,5 раза. При увеличении дозы до 36,8 мг/мл смертность животных составила 65% при увеличении ВР примерно в 7 раз. Следующие из исследованных доз (46,0 и 55,2 мг/кг) вызывали 100% гибель животных в течение 4-х и 1 ч после однократной инъекции соответственно. При дозе 55,2 мг/кг ВР точно установить не удалось - при добав-

лении к плазме Са++, сгусток не образовывался (появлялся редкий хлопьевидный осадок).

Таблица 14

Результаты наблюдения над животными, получавшими внутривенно различные дозы антикоагулянта из сапропеля __

Доза, мг/мл Кол-во Погибло Время Частота ги-

животных гибели, ч бели, %

Контроль 6 0 - 0,0

7,0 6 0 - 0,0

9,2 6 0 - 0,0

18,4 6 0 - 0,0

27,6 6 1 10 16,6

36,8 6 4 4 65,0

46,0 6 6 4 100

55,2 б 6 1 100

Для подсчета 50% летальной дозы антикоагулянта из сапропеля нами использованы формулы Г.Н. Першина и Кербера. При этом исходили, что ориентировочная М^о составляет 30 мг/кг.

ОЬ50, расчитанная по Г.Н. Першину составила 33,8 мг/кг, по методу Кербера - 33,7 мг/кг при величине стандартной ошибки по Гэддаму, равной 1,98 мг/кг. Следовательно, на основании полученных данных можно считать, что ОЬ50 для антикоагулянта из сапропеля равна 33,7511,98 мг/кг.

Подводя итог выполненной работы, можно заключить, что что антикоагулянты из растений и сапропеля могут явиться основой для получения новых препаратов прямых антикоагулянтов. Их механизм действия отличен от использующихся антикоагулянтов, они длительно циркулируют в кровотоке, создавая продолжительную гипокоагулемию, антикоагулянтный эффект дозазависим, не оказывают токсического действия на основные системы организма, имеют широкий терапевтический диапазон.

ВЫВОДЫ

1. Пептиды, выделенные из плазмы крови человека тормозят процесс полимеризации мономерного фибрина путем образования малоактивных комплексов с мономерами и полимерами ранней степени зрелости за счет электростатических взаимодействий.

2. Внутривенное введение пептидов животного происхождения белым крысам приводит к кратковременной (до 10 мин) гипокоагулемии. Кратковременность действия пептидов обусловлена их быстрым перераспределением между кровью и другими тканями организма.

3. В тканях растений содержатся гликопептиды, ограничивающие процесс коагуляционного превращения фибриногена, наиболее перспективными носителями таких гликопептидов являются нонея темная, медуница мягчай-

шая, окопник лекарственный и кривоцвет полевой. Механизм действия пептидов растительного происхождения идентичен таковому для пептидов, выделенных из плазмы крови человека.

4. Аминокислотный состав гликопептидов, полученных из нонеи темной и кривоцвета полевого - Asp (2 остатка), Ser, Thr (2 остатка), Glu (2 остатка), Pro, Gly (2 остатка), Ala (2 остатка), Val, Ile, Leu, Gys, Lys; из окопника лекарственного - Asp (4 остатка), Ser (2 остатка), Thr (3 остатка), Glu (6 остатков), Pro, Gly (4 остатка), Ala (4 остатка), Val (2 остатка), Ile, Leu, Gys (2 остатка), Lys (2 остатка); из медуницы мягчайшей - Asp (6 остатков), Ser, Thr, Glu (6 остатков), Pro (2 остатка), Gly (5 остатков), Ala (2 остатка), Val, Ile, Leu (2 остатка), Lys, (3 остатка). Простетическая группа представлена остатками глюкозы.

5. При внутривенном введении гликопептид из растительного сырья длительно циркулирует в кровотоке, вызывая стойкую дозазависимую гипокоа-гулемию (до 10-12 ч), постепенно уменьшающуюся к 20-24 ч.

6. Эффективная доза растительного антикоагулянта (0,3 мг/кг) при внутривенном введении меньше среднесмертельной (16,1 мг/кг) в 53,6 раза. При повторном введении антикоагулянт не проявляет кумулятивных свойств.

7. Антикоагулянт из растительного сырья обладает низким токсическим потенциалом: его длительное внутривенное и внутрибрюшинное введение в дозах, превышающих эффективную в 16,6 и 100 раз соответственно, не отражается на функционировании основных систем организма (прирост массы тела, клеточный состав крови, функциональное состояние почек, печени, биоэлектрическая активность миокарда, активность тканевого тромбопластина внутренних органов).

8. В сапропеле присутствуют пептиды, ограничивающие процесс коагу-ляционного превращения фибриногена, механизм антикоагулянтного действия которых идентичен пептидам животного и растительного происхождения.

9. Внутривенное введение лабораторным животным пептидов, полученных и очищенных из сапропеля,, вызывает стойкую (до 18 ч) дозазависимую гипокоагулемию. Кумулятивным эффектом пептиды из сапропеля не обладают.

10. Эффективная доза пептидов, полученных из сапропеля (7 мг/кг) при внутривенном введении меньше среднесмертельной (33,75 мг/кг) в 4,8 раза.

11. Сочетание высокой противосвертывающей активности пептидных антикоагулянтов из растительного сырья и сапропеля с их малой токсичностью, свидетельствует о целесообразности их детального изучения с целью создания нового средства фармакологической коррекции гемостаза по схеме, предусмотренной Фармакологическим Комитетом для антикоагулянтов прямого действия.

Список публикаций по теме диссертации

1. Изучение ингибиторов свертывания крови растительного происхожде-ния//Тез. докл. науч.-практ. конф. посвящ. 50-летию фарм. ф-та Томского мед.

ин-та. - Томск. - 1991. - Т. 1. - С. 201-203 (соавт. Чирятьев Е.А., Герберт И.Я. и др.).

2. К механизму влияния на плазмокоагуляцию антикоагулянтов растительного происхождения//Тез. докл. Всес. конф. "Физиология и патология гемостаза". - Полтава. - 1991. - С. 125-125 (соавт. Е.А. Чирятьев Е.А, Балабанова Л.Ф.).

3. К механизму ограничения реакции тромбина с фибриногеном ингибиторами растительного происхождения// В кн.: Обмен веществ в норме и патологии: сб. научн. трудов. - Тюмень. - 1992. - С. 112-112 (соавт. Чирятьев Е.А.).

4. Ингибитор коагуляционного превращения фибриногена из полыни обыкновенной// В кн.: Физиология и патология перекисного окисления липи-дов, гемостаза и иммуногенеза: сб. научн. Трудов. - Полтава. - 1992. - С. 4-4 (соавт. Чирятьев Е.А., Балабанова Л.Ф.).

5. Ограничение свертывающей активности крови ингибиторами растительного происхождения //В кн.: Физиология и патология перекисного окисления липидов, гемостаза и иммуногенеза: сб. научн. Трудов. - Полтава. -1992. - С. 71-71 (соавт. Чирятьев Е.А., Балабанова Л.Ф.).

6. Растения флоры Сибири как источники антикоагулянтов прямого действия//® кн.: Обмен веществ в норме и патологии. - Тюмень. - 1992. - С. 8484.

7. Природа и некоторые свойства прямого антикоагулянта растительного происхождения//Тез. докл. межвуз. и 49 науч.-практ. конф. проф. преп. состава. - Пермь. - 1993. - С. 122-123 (соавт. Кайб И.Д., Чирятьев Е.А. и др.).

8. Растения флоры Сибири как источники антикоагулянтов прямого дей-ствия//Тез. докл. межвуз. и 49 науч.-практ. конф. проф. преп. состава. -Пермь. - 1993. - С. 124-125 (соавт. Кайб И.Д., Чирятьев Е.А. и др.).

9. Фармакологическая характеристика антикоагулянта из окопника лекарственного/Лез. докл. межвуз. и 49 науч.-практ. конф. проф. преп. состава. - Пермь. - 1993. - С. 130-132 (соавт. Кайб И.Д., Чирятьев Е.А.).

10. Фармакологические свойства антикоагулянта прямого действия из травы нонея темная//В кн.: Актуальные проблемы фармации: сб. научн. трудов. - Тюмень. - 1994. - С. 153-158 (соавт. Губаев А.Г., Ортенберг Э.А.).

11. Виды флоры Сибири как источники антикоагулянтов прямого дейст-вия//Ж. Раст. ресурсы. - 1994. - вып. 4. - С. 21-28 (соавт. Чирятьев Е.А.).

12. К изучению ингибиторов коагуляционного превращения фибриноге-на//В кн.: Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии. Тез. докл. российск. конф. - С-Петербург. - 1995. - С. 125-126 (соавт. Чирятьев Е.А., Платонов Е.В. и др.).

13. Естественные ингибиторы коагуляционного превращения фибриногена: природы и механизм действия//Ж. Медико-биологический вестник им. Я.Д. Витебского. 1996. № 2. С. 26-27 (соавт. Чирятьев Е.А., Приймак Н.В. и ДР-)-

14. Новые ингибиторы свертывания крови пептидной природы//В кн.: Современное состояние и перспективы научных исследований в области

фармации. Тез. Докл. научн- практ. конф., посвященной 25-летию фармацевтического ф-та Самарского государственного медицинского ун-та. - Самара. -1996. - С. 257-258 (соавт. Чирятьев Е.А., Платонов Е.В. и др.).

15. Получение и характеристика фракции сапропеля с антикоагулянтной активностью/ЛМатериалы междунар. симп. «Медицина и охрана здоровья.» -Тюмень. - 1997. - С. 84-85 (соавт. Калинин Е.П., Галян C.JL).

16. Некоторые свойства новой группы пептидных антикоагулянтов и перспективы их исследования//Материалы междунар. симп. «Медицина и охрана здоровья.» - Тюмень. - 1997. - С. 355-357 (соавт. Чирятьев Е.А., Приймак Н.В.).

17. К вопросу о механизме ограничения свертывания крови антикоагулянтами из сапропеля// Материалы междунар. симп. «Медицина и охрана здоровья». - Тюмень. - 1998. - С. 76-76 (соавт. Калинин Е.П., Чирятьев Е.А.).

18. Выделение и предварительная характеристика ингибиторов свертывания крови из сапропеля//Ж. Вестник Тюменской медицинской академии. - 1999. - № 2. - С. 53-56 (соавт. Калинин Е.П., Чирятьев Е.А.).

19. Антиагрегационная активность низкомолекулярных ингибиторов из сапропеля in vitro и in vivo// Ж. Вестник Тюменской медицинской академии. -1999. - № 3-4. - С. 182-182 (соавт. Калинин Е.П., Чирятьев Е.А.).

20. Влияние прямых низкомолекулярных антикоагулянтов растительного происхождения на плазмокоагуляцию in vivo// Ж. Вестник Тюменской медицинской академии. - 1999. - № 3-4. - С. 182-182 (соавт. Калинин Е.П., Чирятьев Е.А., Южакова С.Ф.).

21. Изучение прямых низкомолекулярных естественных антикоагулянтов// Ж. Вестник Тюменской медицинской академии. - 1999. - № 3-4. -С. 181-181 (соавт. Калинин Е.П., Чирятьев Е.А., Герберт И.Я.).

22. Пептидные ингибиторы самосборки фибрина//В кн.: Ингибиторы коагуляционного превращения фибриногена/под ред. Е.А. Чирятьева. -Тюмень. - 1999. - С. 13-16.

23. Структура фибриногена, его активация тромбином и самосборка фибрина//В кн.: Ингибиторы коагуляционного превращения фибриногена/под ред. Е.А. Чирятьева. - Тюмень. - 1999. - С. 20-26.

24. Прямые ингибиторы превращения фибриногена в фибрин//В кн.: Ингибиторы коагуляционного превращения фибриногена/под ред. Е.А. Чирятьева. - Тюмень. - 1999. - С. 5-9.

25. Антикоагулянтная активность некоторых растений флоры Сибири//В кн.: Растения и свертывание крови: сб. научных трудов. - Тюмень. - 1999. -С. 19-20.

26. Природа антикоагулянтов из экстрактов нонеи темной, окопника лекарственного, медуницы мягчайшей и кривоцвета полевого//В кн.: Растения и свертывание крови: сб. научных трудов. - Тюмень. - 1999. - С. 21-23.

27. К механизму ограничения свертывания крови антикоагулянтами растительного происхождения//В кн.: Растения и свертывание крови: сб. научных трудов. - Тюмень. - 1999. - С. 23-26.

Используемые сокращения

ФГ - фибриноген

ФБ - фибрин

ФМ — фибринмономер

ТХУ — трихлоруксусная кислота

ПДФ - продукты деградации фибриногена

ПТВ - протромбиновое время

ВС - время самосборки

ВР - время рекальцификации

ТВ - тромбиновое время