Эффекторы свертывания крови из сапропеля: влияние на плазменный, тромбоцитарный гемостаз и некоторые жизненные функции лабораторных животных (экспериментальное исследование)

Бушин, Антон Евгеньевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Эффекторы свертывания крови из сапропеля: влияние на плазменный, тромбоцитарный гемостаз и некоторые жизненные функции лабораторных животных (экспериментальное исследование)
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Эффекторы свертывания крови из сапропеля: влияние на плазменный, тромбоцитарный гемостаз и некоторые жизненные функции лабораторных животных (экспериментальное исследование)"

На правах рукописи

003466254

БУШИН АНТОН ЕВГЕНЬЕВИЧ

ЭФФЕКТОРЫ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ ИЗ САПРОПЕЛЯ: ВЛИЯНИЕ НА ПЛАЗМЕННЫЙ, ТРОМБОЦИТАРНЫЙ ГЕМОСТАЗ И НЕКОТОРЫЕ ЖИЗНЕННЫЕ ФУНКЦИИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ (экспериментальное исследование)

03.00.04-биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

О » - —

2' -г

Тюмень - 2009

003466254

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор медицинских наук Сулкарнаева Гульнур Ахмеровна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор Высокогорский Валерий Евгеньевич,

ГОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

доктор медицинских наук Соловьев Владимир Георгиевич,

БУ ВПО «Ханты-Мансийский государственный медицинский институт ХМАО-Югры».

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита состоится » & ^_2009 г на заседании диссертационного

совета Д 208.101.02 при ГОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» по адресу: 625023, г. Тюмень, ул. Одесская, 54.

Автореферат разослан « //,> 01_2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

Орлов С. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Система гемостаза выполняет в организме ряд жизненно важных функций - поддерживает кровь в жидком состоянии, препятствует тромбообразованию и блокаде микроциркуляции, предотвращает кровоточивость, обеспечивает купирование развившихся геморрагий, несет ограничительную и защитную функции, ограничивая распространение из очагов поражения микрофлоры, а также гетеро- и аутотоксинов и т.д. (Кузник Б.И., Скипетров В.П., 1974; Гаврилов O.K., 1982; Баркаган З.С., 1988, Зубаи-ров Д.М., 2000). Нарушения в этой системе предопределяют развитие тромбо-геморрагий, ишемических изменений в органах, создают предрасположенность к тромбозам. Все эти нарушения являются промежуточным звеном патогенеза многих заболеваний, характеризующихся повреждением внутренней выстилки сосудов, нарушением взаимодействия эндотелия с клетками крови и плазменными ферментными системами, сдвигами реологии крови.

Независимо от этиопатогенеза тромбоэмболических осложнений одним из средств их предупреждения и коррекции являются антикоагулянты, введением которых достигается либо угнетение синтеза прокоагулянтов (антибиотики, цитостатики), либо ограничение пострибосомального формирования прокоагулянтов (антивитамины К).

Эти группы антикоагулянтов (антикоагулянты непрямого действия) используются для создания медленно развивающейся стабильной гипокоагуле-мии. Однако практическая медицина нуждается, как правило, в быстром эффекте, который обеспечивается антикоагулянтами прямого действия. Среди них чаще других применяется Г, отличающийся сильным, но кратковременным эффектом (Кудряшов Б.А., 1992). Хотя Г и является средством выбора, он отличается рядом недостатков. К важнейшим из них можно отнести способность вызывать агрегацию ТЦ (Bertele V. е.а., 1983; Cimo P.L. е.а., 1979) и тромбоцитопению (Ansell J., Deykin D., 1980; Borg J.Y. e.a., 1986). Известны данные и о существовании гепаринорезистентности (Баркаган З.С. и соавт., 1982; 1988). Нередко отмечаются тромбоэмболические осложнения после отмены Г, связанные с так называемым "эффектом бумеранга" (Nordon е.а., 1981).

К числу применяемых антикоагулянтов прямого действия относятся гирудин и гирудиноиды, выделенные из тканей сосущих животных (Чазов Е.К., Лакин K.M., 1977; Ена Я.М., 1992; Никонов ГЛ. и соавт., 1999) и обладающие AT-действием (Markwardt, 1985; Kaiser, Markwardt, 1988). Практического применения гирудин и его производные не нашли из-за сложной технологии получения и дороговизны (Баскова И.П., 1991).

В отношении ограничения агрегации ТЦ общая картина выглядит еще более удручающей, поскольку истинных эффекторов агрегации ТЦ, имеющих практическое применение, не существует, а применяемые антагонисты этой функции ТЦ помимо агрегации изменяют многие другие параметры систем организма (Бышевский А.Ш. и соавт., 1996; Jaffe, Weksler, 1979; Fuster, Jang, 1994)

-з-

Из экстракта С-грязей выделены эффекторы свертывания крови, влияющие на плазменный и ТЦ-гемостаз (Русакова O.A., Чирятьев Е.А., 2005). Однако эти исследования не затрагивали подробного исследования ТЦ-компонента свертывания крови, хотя известно, что ФГ — ключевой субстрат заключительной фазы свертывания, участвует в процессах агрегации и адгезии ТЦ, взаимодействуя с рецепторами ТЦ-мембран (Панченко Е.П., 1997). Кроме этого, не исследовалось наличие токсичности в эксперименте. Учитывая выше сказанное, и принимая во внимание неограниченность сырьевых запасов С, представляется интересным их изучение, как альтернативных источников антикоагулянтов прямого действия.

Цель исследования - изучить основные механизмы ограничения процесса плазмокоагуляции очищенными фракциями экстракта С, в частности, перехода ФГ в ФБ. Установить механизм влияния фракций на ТЦ-гемостаз. Определить острую и хроническую токсичность экстракта из С при введении разных доз лабораторным животным.

Задачи исследования. 1. Разработать способ получения очищенных фракций С, обладающих антикоагулянтной активностью. 2. Изучить их механизм действия на плазмокоагуляцию. 3. Изучить влияние эффекторов из С на агрегационную функцию ТЦ in vitro и in vivo. 4. Дать общую токсикологическую характеристику экстракта в эксперименте на лабораторных животных.

Научная новизна. Впервые разработан способ выделения двух индивидуальных эффекторов свертывания крови, обладающих антикоагулянтной активностью. Расшифрован механизм ограничения эффекторами процесса плазмокоагуляции: ингибирование фибринообразования реализуется преимущественно на уровне коагуляционных превращений ФГ. Впервые установлено, что полученные эффекторы из С угнетают АДФ- и адреналин-индуцированную агрегацию ТЦ in vitro. Установлено, что при внутримышечном и внутрибрюшинном введении эффекторов лабораторным животным проявлений токсичности не наблюдается. Установлена минимальная эффективная доза и доза, составляющая LD50.

Практическая ценность. Разработан способ получения антикоагулянтов из С - дешевого сырья с неограниченными запасами, позволяющий получать индивидуальные эффекторы свертывания в количествах, достаточных для их изучения в лабораторных условиях.

Эффекторы из С способны эффективно ограничивать как плазменный, так и ТЦ-компоненты гемостаза in vivo и in vitro, и не обладают острой и хронической токсичностью в эксперименте, что обусловливает их ценность, как перспективных средств коррекции гемостаза.

Полученные данные могут быть использованы научными учреждениями, занимающимися проблемами свертывания крови и поиском новых средств воздействия на гемостаз.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. В сапропеле содержатся эффекторы свертывания крови, которые могут быть получены в индивидуальном виде. 2. Механизм ограничения плазмокоагуляции исследуемыми эффекторами отличен от механизма из-

вестных прямых антикоагулянтов и реализуется преимущественно на заключительном этапе свертывания крови - коагуляционном превращении ФГ. 3. Эффекторы из С способны ингибировать агрегацию ТЦ в при ее индуцировании растворами АДФ и адреналина. 4. Эффекторы из С не обладают острой и хронической токсичностью при внутримышечном и внутрибрюшинном введении лабораторным животным, и отличаются широким терапевтическим диапазоном действия.

Апробация и публикации. Материалы работы опубликованы в журналах: «Медицинская наука и образование Урала», «Медицинская наука и образование Урала и Сибири», «Современные наукоемкие технологии», «Успехи современного естествознания», опубликованы на сайтах РАЕ.

Объем и структура работы. Материалы исследования, включая указатель литературы, изложены на 148 страницах машинописного текста. В работе содержатся 30 рисунков и 13 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (представленным 120 отечественными и 235 зарубежными авторами), главы (содержащей 5 подразделов), в которой изложены результаты собственных исследований, заключения и выводов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследования послужил С озера Большой Тараскуль, расположенного в Тюменской области. Экстракты из сырья получали способом, описанным в разделе «Собственные исследования».

ФМ получали по методу ИМ. Радзевич, Е.А. Ходоровой (1969) в модификации Е.А. Чирятьева (1990). Концентрацию ФМ определяли спектрофо-тометрически, принимая Ег8о=15,67 (Т.П. Угарова, В.А. Белицер, 1978). Скорость самосборки ФБ определяли в системе, содержащей 0,5 мл 0,075 М бо-ратного буфера с рН 7,6,0,1 мл исследуемого препарата и 0,1 мл 1x10 М раствора ФМ (опыт). В контроле исследуемый препарат заменяли равным объемом растворителя.

Антикоагулянтную активность фракций экстракта оценивали in vitro по его влиянию на: 1) скорость взаимодействия TP с ФГ; 2) скорость аутополи-меризации ФМ по Е.А. Чирятьеву (1989); 3) BP и ТВ по В.П. Балуда и соавт. (1980). Результаты выражали в значениях i по формуле: i = 1 - V/V^, где V0 и Vk - скорость реакции в опыте и контроле соответственно. Количественно содержание антикоагулянтов во фракциях выражали в ЕА, принимая за 1 ЕА количество эффектора с i = 0,3; 4) BP, определяемое с помощью электрокоа-гулографа Н-334 согласно инструкции по использованию прибора; 5) скорость и степень адреналин- и АДФ-зависимой агрегации ТЦ в богатой ТЦ плазме, определяемой с помощью анализаторов агрегации ТЦ "Биохиммак" и "Биола 230LA" согласно инструкций по использованию приборов.

Эксперименты проводили на беспородных белых крысах, содержавшихся в условиях вивария на лабораторном рационе. В опытах было использовано 430 крыс обоего пола, массой от 180 до 240 г. В пределах одной серии опытов

масса животных не отклонялась от средней более чем на 20 г. Все исследования на животных проводили под легким эфирным наркозом.

Растворы экстракта вводили в яремную вену (контрольным животным -соответствующие объемы 0,85% раствора хлорида натрия), кровь отбирали из яремной вены противоположной стороны, стабилизируя 3,8% раствором цитрата натрия (1:9), согласно правилам, принятым в коагулологических лабораториях (Балуда В.П. и соавт., 1980; Иванов Е.П., 1983).

Острую токсичность оценивали при внутривенном, внутримышечном и внутрибрюшинном путях введения экстрактов. Ориентировочную DL-50 определяли, используя Range finding test (прием Deichman и Le Blanc) - введение животным нескольких доз и принятие за DL-50 минимальной дозы, вызывающей летальный исход (Саноцкий И.В., 1970); формулу Першина Г.Н.

LD«n = -—-, где а и b - величины смежных доз, а ш и п - соот-

200

ветствующие этим дозам частоты смертельных исходов в процентах; а также метод Кербера, при котором определение LD50 производят по формуле:

LDS0 = LD100 - , где LDioo - доза изучаемого вещества, которая вып

звала смерть у всех животных подопытной группы, а - интервал между каждыми двумя смежными дозами, z - среднее арифметическое из числа животных, у которых наблюдалась смерть под влиянием каждых двух смежных доз, п - число животных в каждой группе (Беленький М.Л., 1963). Каждая группа состояла не менее, чем из 6-ти животных

В работе использованы следующие препараты и реактивы: 1. TP, ФГ (Каунас); 2. Г (Spofa); 3. Сефадекс G-2 5(Pharmacia); 4. Наборы для определения агрегационной активности ТЦ (Reanal, Биола); 5. Плазма крови доноров, стабилизированная 3,8% раствором натрия цитрата. 6. Патромтин® (Behring); 8. Тромборель® (Behring); 9. Стандартная плазма человека (Behring); 10. Фактор-дефицитная плазма (Behring).

Математическую обработку полученных данных проводили с помощью медико-биологической программы Biostar 4.03 (Гланц С.А., 1998) методом вариационной статистики для малых рядов наблюдений (И.Г Венецкий, 1970). Достоверность различия менаду средними величинами определялась с использованием критерия Х2, критерия Стьюдента, вычисляя среднюю арифметическую (М), среднюю ошибку средней арифметической (m) и средне-квадратическое отклонение (а). Различия принимали за достоверные при значениях вероятности (р) меньше 0,05 (Лаврова И.Г., 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Мы разработали способ получения фракций С, заключающийся в следующем: сапропель —> трехкратное экстрагирование водой очищенной с последующим центрифугированием —» упаривание на ротационном испарителе —> центрифугирование —» ультрафильтрация надосадка —» концентрирование

надосадка на кипящей водяной бане -» замораживание концентрата с последующим размораживанием —» обработка фракции сульфатом аммония —> осаждение солей заменой растворителя (этанол) удаление этанола -» гель-фильтрация раствора сухого остатка на геле БерЬаскх 0-25.

Антикоагулянтная активность элюировалась в виде двух отдельных пиков, свидетельствующих о присутствии в полученной фракции минимум двух индивидуальных носителей (I и II), отличных по молекулярной массе (рис.1).

фильтрации очищенной фракции С на сефадексе G-25. Абсцисса -№ фракций; ордината - эффективность торможения (i).

Мы проводили подробное изучение каждого из эффекторов в отдельности, полагая, что в плане создания на их основе нового средства фармакологической коррекции гемостаза наиболее оптимальной является их сочетанная комбинация. Поэтому в дальнейшем мы использовали комплекс ингибиторов в их естественном соотношении.

Показано, что изучаемый эффектор практически в равной степени реализует свою активность, независимо от того, протекает ли свертывание по внешнему или по внутреннему пути. Следовательно, вероятнее всего, антикоагулянт оказывает преимущественное влияние на этапах, следующих за образованием ТР. Тем не менее, мы провели серию экспериментов по выяснению влияния ингибитора на различные этапы плазмокоагуляции, используя в качестве субстрата плазмы дефицитные по факторам II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII и кининам. Оказалось, что эффективность торможения скорости соответствующих реакций свертывания достоверно различается только в случае использования в качестве субстратных плазм, дефицитных по фактору II и кининам, а эффект ингибитора не зависит от активности факторов V, VII, VIII, IX, X, XI и XII (различия в контрольных и опытных тестах были не достоверны) (рис. 2).

Выраженная зависимость степени эффективности торможения изучаемой фракцией экстракта от концентрации протромбина и отсутствие подобного эффекта в случае использования других фактор-дефицитных плазм (за исключением плазмы, дефицитной по кининам), свидетельствует в пользу предположения о преимущественном влиянии носителей ингибиторной ак-

тивности на заключительную фазу процесса плазмокоагуляции - ТР-зависимое превращение ФГ: недостаток образующегося ТР приводит к удлинению процесса свертывания ФГ и, следовательно, увеличению времени, в течение которого ингибитор может реализовать свой эффект. Что касается существенного увеличения степени торможения при использовании в эксперименте плазмы, дефицитной по кининам, то в данной работе эти сведения мы восприняли на уровне констатации факта, без попытки детального исследования механизма происходящего.

63 44 22

ЕА/мл ЕА/мл ЕА/мл

Рис. 2. Эффективность торможения ТП времени плазмы, дефицитной по ф. И, фракцией антикоагулянта из С. Абсцисса - концентрация антикоагулянта (ЕА/мл); ордината - эффективность торможения (¡).

Далее мы более подробно изучили влияние эффекторов I и II на свертывание крови. Для этого сначала исследовали процесс свертывания плазмы крови в присутствии эффекторов равной степени активности с помощью электрокоагулографа, что позволило получить общее представление о процессе свертывания от момента его инициации и до ретракции и фибринолиза (рис. 3).

Эффектор I в 4,5 раза увеличивает продолжительность свертывания (эффектор II - только в 1,4 раза). Эффектор I в 4 раза снижает скорость свертывания (эффектор II - в 1,2 раза). Различие во влиянии на свертывание подтверждается и коагулограммой, записанной в присутствии суммы эффекторов I и II: она существенно отличается от предыдущих электрокоагулограмм.

Выше мы показали, что чем архитектурно сложнее тест свертывания, тем больше требуется эффектора для достижения одной и той же эффективности торможения. Следовательно, не исключена возможность действия эффекторов на этапах, предшествующих коагуляционному превращению ФГ, на ко-

торых происходит потребление части эффекторов. В противном случае их концентрации в различных тестах были бы равны, или, по крайней мере, сопоставимы. Это сомнение усиливается тем, что, по данным электрокоагуло-грамм, эффектор I удлиняет период до начала формирования ФБ-сгустка.

Для разрешения данного вопроса мы использовали методику, позволяющую вычленить из общего каскада реакций свертывания процесс коагуляци-онного превращения ФГ. Суть этой методики заключается в том, что пулиро-ванную донорскую плазму освобождают от ФГ путем мягкой тепловой денатурации (56°С, 3 мин). Если к такой дефибринированной плазме прибавить ФГ, эффекторы и затем провоцировать свертывание, то эффекторы могут влиять на любой из этапов плазмокоагуляции. Если же в дефибринированной плазме сначала инициировать активацию каскада свертывания, а после сформирования ТР прибавить ФГ и эффекторы, то последние могут оказать влияние только на коагуляционное превращение ФГ.

Контроль

( Рис. 3. Электрокоагулограмма плазмы крови в отсутствии (контроль) и в при-I сутствии (опыт) фракции С с антикоагулянтной активностью.

I Результаты такого эксперимента показали, что эффективность тормо-

жения в обоих вышеописанных случаях практически равна между собой при ^ использовании как эффектора I, так и эффектора II. Следовательно, первоначальное предположение о том, эффекторы реализуются на уровне коагуляци-онного превращения ФГ, оказалось верным, а различия в механизме влияния эффекторов на свертывание наблюдаются именно на этапе превращений ФГ.

Затем мы исследовали процесс ограничения свертывания цельной донорской плазмы с помощью электрокоагулографа. Результаты экспериментов представлены на рисунках 4, 5, 6, и 7. Во всех случаях в экспериментальную систему было внесено одинаковое количество антикоагулянтной активности (I = 0,3±0,02).

Рис. 4. Электрокоагулограмма ВР нормальной плазмы крови доноров.

7////////

шиш

1111 1"'

Рис. 5. Электрокоагулограмма ВР нормальной плазмы крови доноров в присутствии эффектора I.

шшк

РвдШр

Рис. 6. Электрокоагулограмма ВР нормальной плазмы крови доноров в присутствии эффектора II.

I I I

Рис. 7. Электрокоагулограмма ВР нормальной плазмы крови доноров в присутствии суммы эффекторов I и II.

Таким образом, как следует из вышеприведенных рисунков, эффектор I в 2,1 раза увеличивает время до начала свертывания, в 4,5 раза увеличивает продолжительность свертывания, в 2,5 раза ускоряет наступление ретракции и фибринолиза, в 4 раза снижает скорость свертывания, в 8 раз снижает плотность образующегося сгустка, в 20 раз снижает скорость ретракции и фибринолиза.

Эффектор II достоверно не изменяет времени до начала свертывания, в 1,4 раза увеличивает продолжительность, в 1,9 раза ускоряет наступление ретракции и фибринолиза, в 1,2 раза уменьшает скорость свертывания, в 1,2 раза снижает плотность образующегося сгустка, в 3 раза снижает скорость ретракции и фибринолиза.

Сумма эффекторов 1 и II в тех же условиях достоверно не изменяет времени до начала свертывания, в 1,5 раза увеличивает продолжительность свертывания, в 2 раза уменьшает плотность сгустка, скорость свертывания снижается в 2 раза. Вышеописанные исследования указывают на явные различия в механизме ограничения плазмокоагуляции изучаемыми эффекторами. Особенно эти отличия касаются времени, затрачиваемого на рекальцификацию до начала образования ФБ-сгустка (фракция II не изменяет, а фракция I удлиняет в 2,1 раза, следовательно, не исключено ее влияние на этапы свертывания, предшествующие фибринообразованию). Об этом же свидетельствует тот факт, что электрокоагулограмма, зарегистрированная в присутствии суммы эффекторов, существенно отличается от электрокоагулограмм, записанных в присутствии эффекторов I и II порознь.

Другим отличительным признаком является различие в скорости ретракции и фибринолиза в присутствии эффекторов I и II (в 6,6 раза). Однако, данный показатель не отражает истинной ситуации. Более вероятно, что в данном случае мы имеем дело с резким нарушением морфологической структуры образующихся сгустков, а не со степенью активности фибринолиза. Суммировав полученные данные, с большой долей уверенности можно утверждать, что оба исследуемых эффектора ограничивают преимущественно заключительный этап плазмокоагуляции.

Различия выявились и при исследовании влияния ингибиторов на процесс коагуляционного превращения фибриногена другим объективным спо-

собом - с помощью нефелометра: I меньше влияет на ранние стадии формирования протофибрилл, а тормозит преимуществено аутополимеризацию достаточно зрелых олигомеров. П, наоборот, обладает выраженным ингибирую-щим действием на ранние стадии полимеризации. При их совместном влиянии на коагуляцию ФГ наблюдается синергизм эффектов, что подтверждает вышесказанное о различии в механизмах действия.

Таким образом, основной точкой приложения изучаемой антикоагулянт-ной активности можно считать заключительную фазу свертывания с преимущественным влиянием эффектора на самосборку ФМ.

Заключительным этапом этой серии опытов послужил эксперимент, в которых мы предприняли попытку сравнить их действие с единственным известным прямым антикоагулянтом - Г, ограничивающим, как известно, активность образовавшегося TP, аутополимеризацию ФМ, и являющимся си-нергистом AT III.

Для этого использовали коммерческий препарат Г (3 ЕА/мл), раствор TP (1 мг/мл), раствор ФГ (4 мг/мл), очищенные растворы эффекторов-ингибиторов I (1,60 ЕА) и П (0,53 ЕА) (Hi и И2 соответственно), 0,14 М раствор натрия хлорида. В качестве источника AT Ш использовали сыворотку самопроизвольно свернувшейся крови доноров, разбавленную в 20 раз. Все компоненты смешивали в соотношении 1:1:1:1 и определяли эффективность торможения. На основании полученных данных рассчитывали теоретическую эффективность торможения по Уэбб Л. (1966).

Состав экспериментальных смесей и результаты эксперимента представлены в табл. 1. Из представленной таблицы следует, что при совместном внесении в реакционную смесь Г и AT III, наблюдается синергизм антикоагу-лянтных эффектов, обусловленных каждым из компонентов порознь. Исследуемые же ингибиторы как по отношению к AT III и Г, так и к комплексу «Г-АТ III» проявляли выраженный антагонизм. Так, экспериментально установленная эффективность торможения реакции в присутствии Г и эффекторов, соответствующих I или II пику, на 27% ниже рассчитанной теоретически. Это свидетельствует о том, что изучаемые пептиды не обладают гепариноподоб-ным действием и механизм ограничения ими плазмокоагуляции отличен от известных прямых антикоагулянтов, способных в какой-то мере тормозить неферментативный этап коагуляционных превращений ФГ.

Еще более объективные сведения о различии в механизме действия эффекторов мы получили, наблюдая процесс коагуляционного превращения ФГ с помощью нефелометра с автоматической регистрацией этапов этого процесса.

Эффектор I, по сравнению с контролем, в среднем всего на 9,7% задерживает формирование олигомеров и на 81% увеличивает время, необходимое для формирования ФБ-сгустка. Так как агрегация протофибрилл - это практически мгновенный процесс, то эффектор I в основном тормозит аутополимеризацию достаточно зрелых олигомеров. В отличие от этого эффектор II преимущественно блокирует сборку мономеров и олигомеров — на нефело-грамме нет фазы увеличения агрегатов до критического значения. Однако при

этом время формирования ФБ-сгустка увеличивается в среднем на 70% по отношению к контролю.

Таблица 1

Ограничение реакции взаимодействия ТР с ФГ гепарином и АТIII совместно и порознь, и исследуемыми эффекторами

Экспериментальная Теоретическая

Реакционная смесь эффективность эффективность

торможения торможения

ФГ + Г + 2ФР+ТР 0,57±0,03

ФГ + АТШ+2ФР+ТР 0,20±0,01

ФГ + Г + АТШ + ФР + ТР 0,71 ±0,02 0,66

ФГ + И, +2ФР + ТР 0,48±0,01

ФГ + И2 + 2ФР + TP 0,16±0,00

ФГ + И, + Г + ФР + TP 0,б5±0,04 0,78

ФГ + И, + AT III + ФР +ТР 0,43±0,02 0,59

ФГ + Г + AT III + И, + TP 0,54±0,03 0,74

ФГ + И2 + Г + ФР + TP 0,52±0,03 0,64

ФГ + И2 + AT Ш + ФР +ТР 0,48±0,02 0,62

фг + г+атш + и2 + тр 0,50±0,01 0,71

Мы провели исследования влияния эффекторов из С (в равных концентрациях) на агрегационную функцию ТЦ. В качестве индукторов использовали АДФ (2,5 и 10 мкг/мл) и адреналин (раствор Тоногена), так как результаты значений интенсивности агрегации, вызываемые вышеуказанными индукторами, наиболее удовлетворительны, причем интенсивность агрегации, вызываемая АДФ, хорошо коррелирует с интенсивностью агрегации, вызываемой адреналином (Avenarius, Deinhardt, 1980).

Оба изучаемых эффектора в этих условиях ингибируют агрегацию ТЦ, но их механизм действия, как и влияние на процесс коагуляционного превращения ФГ, существенно различается.

! ! > i ; J*J 1 _____ 1 L ■

.—¡_—;— 1 ! .......Г"Т ! ! | Oii I! 1 • \i 1 ! 1 ; . ; n[

И Г |- ! ! i ' 1 ! ■ ! !

Рис. 8. Агрегатограмма нормальной плазмы (индуктор - раствор АДФ в концентрации 2,5 мкг/мл).

Далее мы получили агрегатограммы той же плазмы в присутствии эффекторов I и II (по 0,8 ЕА для каждого эффектора), индуктор - раствор АДФ в концентрации 2,5 мкг/мл.

Так, при использовании АДФ в концентрации 2,5 мкг/мл эффекторы I и II практически не изменяют первую волну агрегации, характеризующую агрегацию ТЦ под влиянием индуктора, но заметно угнетают вторую волну, характеризующую высвобождение внутренних медиаторов агрегации. Максимальные величины второй волны агрегации для эффекторов I и II практически не отличаются между собой и меньше контрольного значения на 33,8 и 37,5% соответственно. Эффекторы I и II укорачивают время, необходимое для достижения максимальной величины второй волны, но с разной интенсивностью - на 62,5 и 37,5% соответственно. Кроме этого, эффектор I активирует процесс дезагрегации, а эффектор II на него не влияет.

Еще более существенные различия в механизме антиагрегационного действия наблюдаются при повышении концентрации индуктора до 10 мкг/мл. В этом случае в контроле первой волны агрегации не наблюдается. Нет ее и в присутствии эффектора II, но первая волна агрегации появляется в присутствии эффектора I.

Максимальные величины второй волны агрегации для эффекторов I и II меньше контрольного значения на 46,9 и 33,2% соответственно. Эффектор II существенно не изменяет время наступления максимальной величины второй волны, а эффектор I увеличивает его в среднем на 17%.

При использовании в качестве индуктора адреналина эффектор I сглаживает первую волну агрегации, вполовину уменьшает максимальную величину второй и на 12,7% удлиняет время достижения ее максимума. В отличие от этого, эффектор II, не изменяя величины максимума первой волны агрегации, в два раза увеличивает время, необходимое для его достижения, на 50,4% уменьшает максимальную величину второй и на 20,6% удлиняет время достижения ее максимума.

В заключительной серии экспериментов мы попытались оценить состояние гемокоагуляции при внутривенном введении фракции С, содержащей антикоагулянт, лабораторным животным. Но прежде мы выразили количество антикоагулянта в весовых единицах, что необходимо для проведения экспериментов на животных и при определении острой токсичности.

Следует оговориться, что в данном случае мы не пытались детально проанализировать состояние плазмокоагуляции в ответ на внутривенное ведение экстракта из С, полагая, что при позитивных предварительных результатах, указывающих на перспективность дальнейшего изучения новых антикоагулянтов, подобная работа должна быть проведена как самостоятельное исследование. В связи с этим мы определяли лишь те показатели, которые интегрально отражают общую свертывающую активность плазмы крови (ВР), скорость взаимодействия ТР с ФГ (ТВ) и аутополимеризации мономерного фибрина (ВС).

Исследования показали, что ингибитор из С обладает противосверты-вающим действием не только т укго, но и в организме животных и что заметный эффект достигается при введении его в дозе, не обнаруживающей видимого токсического влияния. В связи с этим, обоснованным представилось изучить изменения вышеуказанных показателей плазмокоагуляции в зависимости от вводимой дозы. Оказалось, что при дозе вводимого эффектора свертывания 5,0 мг/кг массы тела животного ВР по сравнению с контролем увеличивается в 1,9 раза, ТВ - в 1,7 и ВС - в 3,6 раза. При увеличении дозы антикоагулянта до 10,0 мг/кг эти же показатели становятся выше контрольных значений в 2,1, 3,3 и 4, 8 раза. При дальнейшем увеличении дозы вводимого эффектора до 50,0 мг/кг массы тела животного ВР по сравнению с контролем возрастает в 3,9 раза, ТВ - в 3,4 и ВС в плазме крови - в 8,2 раза.

Ежедневное введение антикоагулянта из С в течение 14 дней в дозе 50,0 мг/кг и отборе проб крови через 6 ч после инъекции, сдвига изучаемых показателей относительно друг друга практически не наблюдается и составляют не более 11-14%. Это свидетельствует о том, что динамика гипокоагулемии оказалась примерно одинаковой как после первой единичной инъекции, так и после инъекции, выполненной в четырнадцатый раз (табл. 2).

Таблица 2

Изменение свертывающей активности после однократного и четырнадцатикратного введения экстракта

Пробы Время рекальцификации, с Тромбиновое время, с

взяты через Контроль после 1-й инъекции после 14-й инъекции Контроль после 1-й инъекции после 14-й инъекции

1 ч 68,2±1,5 259,6±4,8* 261,1±2,8* 30,4±1,4 80,3+2,2* 79,6±3,0*

6ч 69,5±1,2 207,8+2,7* 209,0±3,4* 29,2+2,4 66,4±2,2* 64,4±3,2*

12 ч 71,6±2,1 104,7±3,6* 110,2+2,8* 31,2±2,2 34,2+3,4 33,2±2,8

24 ч 68,6±2,б 83,4+2,1* 84,2±3,4* 29,2±1,6 31,2+1,8 32,4+2,0

Таким образом, наши исследования свидетельствуют, что С содержит антикоагулянты прямого действия, сходные по структуре и по механизму действия. Эффекторы из С принципиально отличаются от применяющихся в настоящее время в медицинской практике антикоагулянтов прямого действия, а в эксперименте на животных даже превосходят их. Далее мы провели предварительные эксперименты по изучению токсичности. Для проведения этой части работы животные выдерживались 10 дней в вивариуме с исключением из опыта тех, у которых выявлялось изменение внешнего вида или поведения. Учитывая наиболее вероятный путь введения антикоагулянта (в перспективе в клинической практике), в первой серии опытов мы исследовали токсичность экстракта при внутривенном введении. С этой целью крысам вводили внутривенно растворы экстракта из расчета от 50 до 300 мг/кг массы тела и наблюдали за ними в течение 8 дней (до полного заживления ранки на месте венесекции). Полученные результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3

Результаты наблюдения над животными, получившими внутривенно различные дозы экстракта

Доза экстракта, мг/кг Кол-во животных Погибло Время гибели Частота гибели, %

Контроль 10 0 не гибли 0,0

50 10 0 не гибли 0,0

100 8 0 не гибли 0,0

150 13 7 за 20 ч 53,8

200 13 10 за 14 ч 76,9

250 8 8 за 8 ч 100

300 8 8 за 5 ч 100

Как видно из данных таблицы, животные погибали в первые сутки после введения экстракта. Скорость наступления гибели в целом коррелировала с дозой введенного препарата. Отсроченной гибели животных (позднее первых суток) не наблюдалось.

Полученные в проведенной серии опытов данные подтвердили результаты об эффективном гипокоагулемическом действии выбранных нами доз экстракта. Экстракт в дозе 50 мг/кг, как это показано в предварительных опытах, вызывает значительную гипокоагулемию, но не вызывает гибели животных. Внутривенное введение экстракта в дозе 100 мг/кг еще в большей степени вызывало устойчивую гипокоагулемию, не приводящую к гибели животных. Время рекальцификации увеличивалось по сравнению с контролем в 5,2 раза, а тромбиновое время - в 2,1 раза. Еще более снижалась свертываемость, начиная с дозы 150 мг/кг массы тела (время рекальцификации увеличивалось в 5,9 раза, а тромбиновое время - в 3,1 раза), но при этом часть животных погибала. При использовании доз 150, 200, 250 и 300 мг/кг частота гибели животных составила соответственно 53,8, 76,9, 100 и 100%. Имеются все основания считать причиной гибели животных гипокоагулемический эффект, поскольку ей предшествовали кровотечения из мест прокола вен, остановить которые оказалось невозможным. У погибших животных (33 особи) обнаружены массивные кровоизлияния. При вскрытиях в сосудистом русле мы обнаруживали несвернувшуюся кровь в сочетании с рыхлыми сгустками, кровоизлияния в легкие, сгустки крови в просвете тонкого кишечника.

Для подсчета 50%-й летальной дозы экстракта при внутривенном пути введения нами использовано несколько методов.

Руководствуясь Range finding test, приемом Deichman и Le Blanc, мы отмечаем, что ориентировочная DL50 при внутривенном введении экстракта составила 150 мг/кг.

При вычислении DL50 по формуле Г.Н.Першина получен следующий результат:

= (100 + 150)-(53,84- 0) + (150 + 200)• (76,92 - 53,84)+ (200 + 250)■ (lOO- 76,92) мг/

50 ~ 200 ' МГ Результаты расчета DL50 по методу Кербера представлены в табл. 4.

Таблица 4

Обработка материала по изучению токсичности экстракта из сапропеля с помощью метода Кербера

Доза, мг/кг 100 150 200 250

Количество животных в 8 8 8 8

каждой группе

Выжило 8 5 1 0

Погибло 0 3 7 8

г 1,5 5,0 7,5

А 50 50 50

Для ориентировочной оценки величины стандартной ошибки БЬ50 в условиях применения метода Кербера мы воспользовались формулой Гэддама:

SdLj0 = > где s ~~ стандарт распределения, d - интервал между испы-

тываемыми дозами, п - число животных в каждой группе, к - постоянный коэффициент, равный 0,564.

Итак, при определении DL50 с помощью метода Кербера DL5o=162,5±15,7 мг/кг. Отметим, что DL50, рассчитанные тремя различными методами, приблизительно равны. Среднее арифметическое DL50 равно 157,37 мг/кг массы тела.

Гибель животных в серии опытов по определению DL50 наступала в результате специфического, т.е. противосвертывающего действия экстракта. Мы не могли исключить, что эти свойства могут изменяться под действием антикоагулянта, так же как они изменяются при различного рода экстремальных воздействиях или патологических процессах (Скипетров В.П., 1986), и решили проверить эту гипотезу.

В данной серии опытов животные получали внутривенно по 250 и 300 мг/кг массы тела исследуемого экстракта (дозы, вызывающие кровотечения и гибель подопытных животных), затем мы изучали активность тканевого тромбопластина через 1 ч после инъекции, т.е. в период, когда появляются кровотечения, но еще до гибели животных. У погибших животных отбор тканей проводили тотчас после наступления смерти. Одновременно исследовали ткани у контрольных животных, которым вводили адекватное количество изотонического раствора хлорида натрия.

Результаты определения активности тканевого тромбопластина приведены в табл. 5. Анализ результатов эксперимента свидетельствует об отсутствии изменений этого показателя под влиянием инъекции экстракта из сапропеля. Видимо, связывать кровотечения у подопытных животных можно лишь с изменением биохимического компонента гемокоагуляции, выражающегося блокадой превращений фибриногена.

В последующих экспериментах оценивали острую токсичность экстракта при внутрибрюшинном и внутримышечном введении в высоких дозах (200, 300 и 400 мг/кг), которые при внутривенном пути введения заведомо вызыва-. ли смертельный исход в 100% случаев. Результаты приведены в табл. 6 и 7. При динамическом наблюдении за животными в течение недели существенных отличий между контрольными и подопытными животными в потреблении пищи, подвижности, опрятности и групповом поведении обнаружено не было. Как видно из данных таблиц, из 60-ти подопытных животных, которым мы вводили высокие дозы экстракта погибли две (одна при внутрибрюшинном введении 400 мг/кг, вторая при внутримышечном введении 200 мг/кг). Две крысы погибли в контрольной группе, получавшей изотонический раствор хлорида натрия внутрибрюшинно.

Таким образом, S,

0,564-70-50

= 15,7 (мг/кг)

'o^'Í 8

Таблица 5

Активность тканевого тромбопластина (ЕА/г сырой ткани) у животных после введения им в вену экстракта из сапропеля (5 крыс в группе)

Доза экстракта, мг/кг Орган Контроль Через 1 ч после инъекции Тотчас после гибели

250 Почки 7114121 7091163 6954121

Легкие 10031163 9869186 9935167

Сердце 1380158 1412137 1301143

300 Почки 7114121 7001182 6981152

Легкие 10031163 10021183 9981153

Сердце 1380158 1421134 1349172

Примечание: контролем для обеих групп послужила одна и та же группа животных.

По окончании срока наблюдения подопытных животных забивали под легким эфирным наркозом и визуально оценивали состояние внутренних органов и тканей. Каких-либо видимых изменений, в том числе следов кровоизлияний, обнаружено не было.

Таблица 6

Оценка острой токсичности экстракта из сапропеля при

внутримышечном введении

Доза экстракта, мг/кг Количество животных Погибло Выжило

Контроль 10 0 10

200 10 1 9

300 10 0 10

400 10 0 10

Таким образом, исследуемый экстракт при внутримышечном и внутри-брюшинном введении оказался практически нетоксичным. При проведении ориентировочной оценки гемокоагуляционных показателей подопытной группы животных, они оказались идентичными контрольным показателям, что подтверждает связь гибели животных в предыдущей серии опытов со специфическим действием экстракта, а в данной серии опытов не дает оснований связывать гибель животных с этим эффектом; скорее всего, как и в контроле, она зависела от случайных причин.

Таблица 7

Оценка острой токсичности экстракта из сапропеля при внутрибрюшинном введении

Доза экстракта, мг/кг Количество животных Погибло Выжило

Контроль 10 2 8

200 10 0 10

300 10 0 10

400 10 1 9

Подводя итог серии опытов, оценивающих острую токсичность, отметим, что минимальная эффективная доза экстракта, вызывающая значительное и достаточно длительное изменение гемокоагуляционных показателей при внутривенном введении равна 10 мг/кг, а ОЬ50 - приблизительно 157 мг/кг. Это создает достаточный коэффициент безопасности и позволяет рассматривать наш экстракт как эффективное гипокоагулемическое средство.

Все вышесказанное свидетельствует о целесообразности дальнейшего изучения новых антикоагулянтов прямого действия из С и служит обоснованием необходимости их детального исследования согласно рекомендациям Фармакологического Комитета для антикоагулянтов прямого действия.

ВЫВОДЫ

1. Из сапропеля озер Тюменской области получены 2 фракции, обладающие антикоагулянтной активностью. Выделены и максимально очищены индивидуальные носители, представляющие собой молекулы средней массы.

2. Антикоагулянтная активность реализуется преимущественно на уровне III фазы свертывания крови - коагуляционном превращении фибриногена в фибрин.

3. Носители антикогуляционной активности ограничивают процесс взаимодействия тромбина с фибриногеном и скорость аутополимеризации фибрина путем образования малоактивных комплексов с фибринмономерами и полимерами ранней степени зрелости.

4. Механизм действия эффекторов I и II не идентичен между собой. Эффектор I ограничивает формирование из олигомеров протофибрилл, а эффектор II - образование олигомеров. При их совместном влиянии на коагуля-ционное превращение фибриногена наблюдается синергизм эффектов.

5. Эффекторы из сапропеля обладают антиагрегационной активностью, ограничивая АДФ- и адреналинзависимую агрегацию тромбоцитов. Эффектор I в большей степени ингибирует АДФ-индуцированную агрегацию, а эффектор II - адреналинзависимую, угнетая высвобождение внутренних факторов агрегации тромбоцитов.

6. Эффективная доза антикоагулянта ниже токсической в 15 раз. При повторных введениях экстракт проявляет минимальные кумулятивные свойства и не влияет на активность тканевого тромбопластина внутренних органов.

7. Сочетание высокой противосвертывающей активности с малой токсичностью, отсутствие компенсаторной гиперкоагулемии свидетельствуют о целесообразности дальнейшего изучения экстракта по схеме, предусмотренной Фармакологическим Комитетом для антикоагулянтов прямого действия.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

*1. Защитное действие экстракта из сапропеля при экспериментальной тром-бопластинемии /Чирятьев Е.А., Бушин А.Е., Шаповалов П.Я., Русакова O.A. // Медицинская наука и образование Урала. - 2008. - 3(53). - С. 185187.

*2. Токсикологическая характеристика антикоагулянтной фракции экстракта из сапропеля /Ортенберг Э.А., Бушин А.Е., Шаповалов П.Я., Русакова O.A., Чирятьев Е.А. // Медицинская наука и образование Урала. - 2008. -4(54).-С. 36-38.

*3. Антикоагулянтная активность фракций сапропеля. Механизм действия /Бушин А.Е. // Медицинская наука и образование Урала. - 2008. - 5(49). -С. 8-11.

4. Пептидные ингибиторы плазменного и тромбоцитарного гемостаза /Бушин А.Е., Чирятьев Е.А., Русакова O.A., Шаповалов П.Я. //Успехи современного естествознания. - 2008. - 2. - С. 80.

5.- Торможение пептидным ингибитором из сапропеля реакции тромбина с фибриногеном /Бушин А.Е. //Современные наукоемкие технологии. -2008.-2.-С. 38.

6. Пептидные ингибиторы плазменного и тромбоцитарного гемостаза /Бушин А.Е., Чирятьев Е.А., Русакова O.A., Шаповалов П.Я. //Заочная электронная конференция РАЕ, 12-20 января 2008.

7. Торможение пептидным ингибитором из сапропеля реакции тромбина с фибриногеном /Бушин А.Е. // Заочная электронная конференция РАЕ, 1220 января 2008.

* отмечены статьи, опубликованные в перечне изданий, рекомендованном ВАК для публикаций научных работ.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

AT III - антитромбин III

BP - время рекальцификации

ВС - время самосборки фибрина

Г - гепарин

ЕА - единицы активности

С - сапропель

ТВ - тромбиновое время

ТЦ - тромбоциты

ТП -тромбопластин

ФБ - фибрин

ФГ - фибриноген

I - эффективность торможения

БУШИН АНТОН ЕВГЕНЬЕВИЧ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 26.02.09. Усл. печ. л. 1,0. Бумага ГОЗНАК. Печать ризограф. Тираж 100 эхз. Заказ №236 Отпечатано в типографии ООО «Печатник» Лицензия ИД № 05386 от 10.07.2002 г.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Бушин, Антон Евгеньевич

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. АНТИКОАГУЛЯНТЫ ПРЯМОГО ДЕЙСТВИЯ 8 (Обзор литературы).

2.1. Гепарин и гепариноиды.

2.2. Гирудин и гирудиноиды.

2.3. Пептидные ингибиторы самосборки фибрина.

2.4. Ингибиторы агрегации тромбоцитов.

2.4.1. GP IIb/lIIa-рецепторы тромбоцитов.

2.4.2. Моноклональные антитела.

2.4.3. Непептидные ингибиторы IIb/IIIa-рецепторов тромбо- 36 цитов

2.4.4. Пептидные ингибиторы IIb/Illa-рецепторов тромбоци- 38 тов.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1. Выделение эффекторов свертывания из экстракта сапро- 47 пеля.

4.2. Действие эффекторов из сапропеля на плазмокоагуляцию

4.3. Влияние эффекторов из сапропеля на агрегационную 74 функцию тромбоцитов.

4.4. Противосвертывающее действие экстракта из сапропеля 82 в опытах на животных.

4.5. Токсикологическая характеристика экстракта фракции 87 сапропеля

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эффекторы свертывания крови из сапропеля: влияние на плазменный, тромбоцитарный гемостаз и некоторые жизненные функции лабораторных животных (экспериментальное исследование)"

Актуальность проблемы. Система гемостаза выполняет в организме ряд жизненно важных функций - поддерживает кровь в жидком состоянии, препятствует тромбообразованию и блокаде микроциркуляции в органах, предотвращает кровоточивость и обеспечивает купирование уже развившихся геморрагий, несет ограничительную и защитную функции, препятствуя распространению из очагов поражения микрофлоры, а также гетеро- и аутотоксинов (Кузник Б.И., Скипетров В.П., 1974; Гаврилов O.K., 1981; Баркаган З.С., 1988; Зубаиров Д.М., 2000). Нарушения в этой системе предопределяют развитие геморрагий, тромбогеморрагий, ишемических изменений в органах.7 создают предрасположенность к тромбозам. Все эти нарушения, как известно, являются промежуточным звеном патогенеза многих заболеваний, характеризующихся повреждением внутренней выстилки сосудов, нарушением взаимодействия эндотелия с клетками крови и плазменными ферментными системами, сдвигами реологии крови.

Независимо от этиопатогенеза тромбоэмболических осложнений одним из средств их предупреждения и коррекции являются антикоагулянты, введением которых достигается либо угнетение синтеза прокоагулянтов (антибиотики, цитостатики), либо ограничение по-стрибосомального формирования прокоагулянтов (антивитамины К).

Эти группы антикоагулянтов (антикоагулянты непрямого действия) используются для создания медленно развивающейся стабильной гипокоагулемии. Однако практическая медицина нуждается, как правило, в быстром эффекте, который обеспечивается антикоагулянтами прямого действия. Среди них чаще других применяется гепарин, отличающийся сильным, но кратковременным эффектом (Кудряшов Б.А., 1992). Хотя гепарин и является средством выбора, он отличается рядом недостатков. К важнейшим из них можно отнести способность вызывать агрегацию тромбоцитов (Bertele е.а., 1983; Cimo, 1979) и громбоцитопению (Ansell J., Deykin D., 1980; Borg J.Y. e.a., 1986). Известны данные и о существовании гепаринорезистентности (Баркаган З.С. и соавт., 1982; 1988). Нередко отмечаются тромбоэмболические осложнения после отмены гепарина, связанные с так называемым "эффектом бумеранга".

К числу применяемых антикоагулянтов прямого действия относятся гирудин и гирудиноиды, выделенные из тканей сосущих животных (Ена Я.М., 1992) и обладающие антитромбиновым действием (Markwardt, 1985; Kaiser, Markwardt, 1988). Практического применения гирудин и его производные не нашли из-за сложной технологии получения и дороговизны (Баскова И.П., 1986; 1991).

В отношении ограничения агрегации тромбоцитов общая картина выглядит еще более удручающей, поскольку истинных эффекторов агрегации тромбоцитов, имеющих практическое применение, не существует, а применяемые антагонисты этой функции тромбоцитов помимо агрегации изменяют многие другие параметры систем организма (Бышевский А.Ш. и соавт., 1996). К ним прежде всего относится ацетилсалициловая кислота, которая необратимо ингибирует циклоок-сигеназу тромбоцитов (Jaffe, Weksler, 1979), синтез тромбоксана А2 и простациклина (Vane, 1971; Burch e.a., 1978; Fuster, Jang, 1994). Однако поскольку эндотелиальные клетки способны к регенерации циклоокси-геназы, ингибирующее действие аспирина на эндотелиальный проста-циклин кратковременно, а агрегация тромбоцитов может происходить даже в присутствие аспирина, поскольку он мало влияет на другие важные активаторы тромбоцитов типа тромбина и АДФ. В то же время длительное применение аспирина в высоких дозах вызывает негативные явления - образование желудочных язв, внутричерепные и желудочно-кишечные геморрагии и др.

Из экстракта сапропелевых грязей выделены эффекторы свертывания крови, влияющие, как это показано ранее, (Чирятьев Е.А. и соавт., 2001; Чирятьев Е.А., Калинин Е.П., 2001) на плазменный и тромбоцитарный гемостаз. Однако эти исследования не затрагивали подробного исследования тромбоцитарного компонента свертывания крови, хотя известно, что фибриноген - ключевой субстрат заключительной фазы свертывания, участвует в процессах агрегации и адгезии тромбоцитов, взаимодействуя с рецепторами тромбоцитарных мембран (Панчепко Е.П., 1997). Кроме этого, не исследовалось наличие токсичности в эксперименте (белые беспородные крысы) изучаемых эффекторов и недостаточно исследовано их влияние на основные функции организма. ^

Учитывая выше сказанное, и принимая во внимание неограниченность сырьевых запасов сапропелей, представляется интересным их изучение, как альтернативных источников антикоагулянтов прямого действия.

Задачи исследования. 1. Разработать способ получения из С индивидуальных соединений с антикоагулянтной активностью. 2. Изучить их механизм действия на плазмокоагуляцию. 3. Изучить влияние эффекторов из С на агрегационную функцию ТЦ in vitro и in vivo. 4. Дать общую токсикологическую характеристику экстракта в эксперименте на лабораторных животных.

Научная новизна. Из С выделены два высокоочищенпых соединения, ограничивающих гемокоагуляцию. Впервые установлено что эффекторы из С тормозят BP при использовании плазмы, дефицитной 5 по ф. II, что свидетельствует о их влиянии на заключительный этап каскада свертывания крови - превращение ФГ в ФБ под действием ТР. Установлено, что полученные эффекторы из С угнетают АДФ- и адре-налин-индуцированную агрегацию ТЦ in vitro, причем механизмы ограничения агрегации ТЦ различаются между собой. Установлено, что при внутримышечном и внутрибрюшинном введении эффекторов лабораторным животным проявлений токсичности не наблюдается. Установлены минимальная эффективная доза и доза, составляющая LD50

Практическая ценность. Разработан способ получения антикоагулянтов из сапропеля - дешевого сырья с неограниченными запасами, позволяющий получать индивидуальные эффекторы свертывания — в количествах, достаточных для их изучения в лабораторных условиях.

Эффекторы из сапропеля способны эффективно ограничивать как плазменный, так и тромбоцитарный компоненты гемостаза in vivo и in vitro, и не обладают острой и хронической токсичностью в эксперименте, что обусловливает их ценность, как перспективных средств коррекции гемостаза.

Полученные данные могут быть использованы научными учреждениями, занимающимися проблемами свертывания крови и поиском новых средств воздействия на гемостаз. Основные положения, выносимые на защиту.

1. В сапропеле содержатся эффекторы свертывания крови, которые могут быть получены в индивидуальном виде.

2. Механизм ограничения плазмокоагуляции исследуемыми эффекторами отличен от механизма известных прямых антикоагулянтов и реализуется преимущественно на заключительном этапе свертывания крови - коагуляционном превращении фибриногена.

3. Эффекторы из сапропеля способны ингибировать агрегацию тромбоцитов при ее индуцировании растворами АДФ и адреналина.

4. Эффекторы из сапропеля не обладают острой и хронической токсичностью при внутримышечном и внутрибрюшинном введении лабораторным животным, и отличаются широким терапевтическим диапазоном действия.

Объем и структура работы. Материалы исследования, включая указатель литературы, изложены на 147 страницах машинописного текста. В работе содержатся 30 рисунков, 1 схема и 13 таблиц: Диссертация состоит из введения, обзора литературы (представленным 120 отечественными и 235 зарубежными авторми), главы (содержащей 5 подразделов), в которой изложены результаты собственных исследований, заключения и выводов.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Бушин, Антон Евгеньевич

6. выводы

3. Носители антикогуляционной активности ограничивают процесс взаимодействия тромбина с фибриногеном и скорость аутопо-лимеризациифибрина путем образования малоактивных комплексов с фибринмономерами и полимерами ранней степени зрелости.

4. Эффекторы из сапропеля угнетают агрегацию тромбоцитов, угнетая высвобождение внутренних факторов агрегации.

5. Эффективная доза антикоагулянта ниже токсической в 15 раз. При повторных введениях экстракт проявляет минимальные кумулятивные свойства и не влияет на активность тканевого тромбопласти-на внутренних органов.

6. Сочетание высокой противосвертывающей активности с малой токсичностью, отсутствие компенсаторной гиперкоагулемии свидетельствуют о целесообразности дальнейшего изучения экстракта по схеме, предусмотренной Фармакологическим Комитетом для антикоагулянтов прямого действия.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Недостаточность арсенала противосвертывающих средств, высокая потребность в них, связанная с ростом частоты заболеваний, осложняющихся тромбозами, определяет необходимость дальнейшего поиска антикоагулянтов, в том числе антикоагулянтов прямого действия, так как последние представлены по существу только гепарином и его производными.

Из большого количества веществ, изучающихся как модификаторы свертывающей активности "крови, для нас наибольший интерес представляют соединения с низкой молекулярной массой (от 500 до

10 ООО Да), сообщения о которых появились-в-последние-10—1-5-лет:----

Некоторые из них находятся на стадии доклинических и клинических испытаний. Это прежде всего Antistasin, ТАР и Yagin, получаемые из мексиканской пиявки (Haementeria officinalis), из мягкого клеща (Ornihtodoros moubata) и слюны медицинской пиявки (Hirudo medici-nalis) (Sitko е.a., 1992; Vlasuk, 1993; Fioravanti e.a., 1993; Mao e.a., 1995; Lynch e.a., 1995; Kornowski e.a., 1996). Все вышеуказанные препараты являются антифакторами Ха.

В литературе имеются данные, свидетельствующие о том, что пептидные биорегуляторы все активнее задействуются в регуляции свертывания крови. Так, приводятся сведения о выделении из слюны летучей мыши (Desmodus rotundus) гликопептида, который ингибирует фактор IXa (Fernandez e.a., 1998), пептида из морской звезды (Асап-thaster planci), получившего название Plancinin, который ограничивает скорость взаимодействия фактора Ха и протромбина (Коуата е.а., 1998).

Из слюнной железы пиявки Haementeria ghilianti получен новый пептидный ингибитор фактора XHIa Trigenin, имеющий молекулярную массу 7,3 кДа и состоящий из 66 аминокислот. По свидетельству авто

93 ров - это наиболее мощный избирательный ингибитор фактора XHIa из описанных, при этом Trigenin не оказывает влияния на предыдущие этапы свертывания крови.

Нельзя не отметить серию работ, посвященных клиническим испытаниям препаратов Argatroban и Novastan - низкомолекулярных прямых ингибиторов тромбина, изучающихся как альтернатива гепарину, и, по сведениям автором, по ряду параметров существенно его превосходящих (Lewis е.а., 1997; Hantgan, Jerome, Hursting, 1998; Walenga е.a., 1999; Jang e.a., 1999). Argatroban имеет молекулярную массу около 500 Да. Он задерживает взаимодействие фибриногена с тромбином и активацию тромбина, способен ограничивать агрегацию тромбоцитов у пациентов с гепарин-индуцированной тромбоцтрпе.-нией, усиливает фибринолитическую активность.

Процесс коагуляционного превращения фибриногена ограничивает гепарин и его комплексы с многочисленными биологически активными веществами (Кудряшов Б.А. и соавт., 1970 - 1988; Розенфельд М.А. и соавт., 1973; Литвинова Р.И. и соавт., 1981). Эти комплексы характеризуются однотипным действием: тормозят превращение фибриногена в фибрин на стадии самосборки и лизируют нестабилизирован-ный фибрин. Однако вопрос о физиологическом значении гепарина и его комплексов в ограничении самосборки фибрина остается открытым. Доказано лишь, что гепарин, в количестве, во много раз превышающем физиологическое, тормозит самосборку in vitro (Михалева И.В., 1988).

Ингибиторы самосборки фибрина могут появляться в кровотоке при некоторых заболеваниях, сопровождающихся активацией иммунной системы организма: возникающие антитела способны непосредственно вмешиваться в процесс полимеризации (Weinstein, Deikin, 1978; Hoots e.a., 1981; Gabriel e.a., 1983) и агрегации фибрина (Galanakis e.a.,

1978), или ограничивать скорость высвобождения фибринопептидов (Marciniak, Greenwood, 1979).

В литературе имеются указания на возможность тормозить в организме заключительный этап коагуляционных превращений фибриногена синтетическими пептидами (Kuyas, Doolittle, 1983), которые активно изучаются как перспективные антикоагулянты прямого действия (Miraglia, Greirberg, 1985).

Этот тип пептидов не только тормозит самосборку, но и инги-бирует взаимодействие фибриногена с тромбоцитами, что предотвращает их агрегацию (Васильева Г.А. и соавт., 1983), являются вазоак-тивными агентами, улучшая микроваскулярную проницаемость (Цей-тин В.М. и соавт., ,1982). ------— — -

Недостатком короткоцепочечных пептидов как антикоагулянтов прямого действия является их быстрая элиминация из кровотока (Чипенс Г.И., 1982).

Е.А. Чирятьевым и соавт. (1990) обнаружены и изолированы пептиды из плазмы крови человека и животных, тормозящие процесс самосборки фибрина in vitro и in vivo. Определена их физиологическая роль и значение. Установлено, что обнаруженные пептидные ингибиторы являются наиболее древними регуляторами коагуляционного превращения фибриногена: их уровень в крови и тканях животных уменьшается по мере филогенетического и онтогенетического «старения», т.е. по мере уменьшения удельной значимости коагуляционного превращения фибриногена в цепи реакций, ведущих к образованию фибрина. Это согласуется с теорией о том, что биологически активные пептиды относятся к наиболее древним регуляторам многих биохимических и физиологических процессов, протекающих в организме в целом и отдельной живой клетке (Ашмарин И.П. 1979, 1982; Климов П.К., 1984).

В то же время, использование пептидов животного происхождения с целью фармакологической коррекции гемостаза не представляется возможным: развивающаяся после инъекции пептидов гипокоагу-лемия чрезвычайно кратковременна в силу быстрой элиминации их из кровотока.

В литературе существует достаточно сведений о попытках использования в качестве прямых антикоагулянтов препаратов растительного происхождения. Растения и их действующие начала продолжают исследоваться как потенциальные источники препаратов с анти-коагулянтными свойствами. При этом в качестве "носителя" антикоа-гулянтной активности рассматриваются различные химические компоненты растений. Низкая токсичностьбольшинства из них, широкий-спектр биологического действия, делает их ценными для медицинской практики (Барабой В.А., 1984; Хушбактова З.А. и соавт., 1987). Однако, следует подчеркнуть, что большинство публикаций на эту тему носят фрагментарный характер, не позволяющий составить однозначное представление о влиянии тех или иных извлечений из растительного материала на свертывание крови.

В поисках антикоагулянтов с гепариноподобной активностью внимание исследователей привлекли красные морские водоросли, содержащие сульфатированные полисахариды (Ефимов B.C. и соавт., 1983). Из морской бурой водоросли (Laminaria sacharina L.) выделен сульфатированный полисахарид ламинарин, который подобно гепарину, снижает общую свертывающую активность и замедляет агрегацию тромбоцитов (Турова А.Д. и соавт., 1983; Deacon-Smith е.а., 1985).

Свойствами антикоагулянта обладает отвар из мелиссы лекарственной (Melissa officinalis L.): внутривенное введение отвара животным увеличивает время рекальцификации, тромбиновое время, уменьшает толерантность плазмы к гепарину и изменяет параметры тромбоэластограммы (Багинская А.И. и соавт., 1985).

Изучен эффект полисахаридов, полученных из драконовой крови - красного смолистого выделения из плодов различных видов Dae-monorops и из пыльцы Typha angustata Bory et Chaud. Их действие двояко: с одной стороны это прокоагулянты, активирующие фактор Хагемана, с другой - антикоагулянты, задерживающие высвобождение фибринопептидов под действием тромбина и ингибирующие полимеризацию фибрина (Gibbs е.а., 1984).

Настойка клубеньков стахиса (Stachis Sicboldi Mig.) при внутривенном и пероральном введении животным вызывает гипокоагуля-цию, которая выявляется по увеличению времени рекальцификации, удлинению параметров тромбоэластограммы, уменьшению максимальной амплитуды ее и снижением числа тромбоцитов (Трумпе-Т.Е. и-соавт., 1985).

Антикоагулянтный эффект обнаружили в первые часы после введения суммы гликозидов и из аралии манчжурской (Aralia mand-shurica rupr.): удлиняется время рекальцификации, снижается толерантность плазмы к гепарину и общая свертывающая активность. (Колхир В.Е., 1983).

Внимательному изучению подвергаются растения, издавна используемые для предупреждения тромбообразования в традиционной китайской медицине, обладающие антикоагулянтным эффектом. Это в частности Salvia miltirrhizabge, Rheum palmatum (Kosuge e.a., 1984).

При изучении водного экстракта репейничка волосистого японского (Argimonia piloza Ledeb subsp. Japónica (Mig)) отмечали, что при его внутривенном введении белым крысам увеличивается время свертывания крови. Экстракт не влияет на уровень тромбина и фибриногена в плазме, но существенно замедляет активированное тромбиновое время (Wang е.а., 1984).

Изучение отвара корня шалфея (Salvia sclacea L.) в эксперименте показало, что при его внутривенном введении увеличивается активированное тромбиновое время, причем ингибирующий эффект не зависит от уровня антитромбина III, также он существенно подавляет и активность плазмина. Выделен носитель ингибиторной активности -термостабильное соединение с молекулярной массой 5000 Да (Stremberger е.а., 1983).

Как мы отметили выше, большинство работ не имело логического завершения, тем более, не акцентировалось внимание на этапе коагуляционного превращения фибриногена.

O.A. Русаковой (2000) были получены сведения о том, что экстракты из нонеи темной, окопника лекарственного, кривоцвета поле- вого, медуницы мягчайшей обладают антикоагулянтной активностью. Выяснено, что носителями активности являются соединения глико-пептидной природы с массой около 3 000 Да.

Исходя из того, что сырьевые ресурсы растений с высоким содержанием прямых антикоагулянтов существенно ограничены, мы обратились к группе сине-зеленых водорослей. Этот шаг продиктован и тем, что по данным Н.В. Яковлевой (1998) основные характеристики антикоагулянтов из растений (в том числе и сине-зеленых водорослей) и из плазмы крови и тканей животных совпадают между собой.

Известно, что сине-зеленые водоросли после отмирания естественным образом концентрируются в иловых донных отложениях некоторых озер - в сапропелях. По сведениям Н.В. Кордэ (1960) до 80% органической фазы сапропелей может быть обусловлено сине-зелеными водорослями. В связи с этим источником антикоагулянтов мы избрали сапропель, как концентрат сине-зеленых водорослей.

Основываясь на ранее разработанных принципах выделения антикоагулянтов из растений (Русакова O.A., 2000; Русакова и соавт.,

2001; Поле И.Э. и соавт., 2001), мы разработали способ получения

98 фракций сапропеля, заключающийся в следующем (схема 1).

Схема 1

Мы проводили подробное изучение каждого из пептидов в отдельности, полагая, что в плане создания на их основе нового средства фармакологической коррекции гемостаза наиболее оптимальной является их сочетанная комбинация. Поэтому в дальнейшем мы использовали комплекс ингибиторов в их естественном соотношении.

Нами также показано, что изучаемый эффектор практически в равной степени реализует свою активность,независимо от-того,-проте-------кает ли свертывание по внешнему или по внутреннему пути. Следовательно, вероятнее всего, антикоагулянт оказывает преимущественное влияние на этапах, следующих за образованием тромбина. Тем не менее, мы провели серию экспериментов по выяснению влияния ингибитора на различные этапы плазмокоагуляции, используя в качестве субстрата фактор-дефицитные плазмы, а именно плазмы дефицитные по факторам II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII и кининам. Оказалось, что эффективность торможения скорости соответствующих реакций свертывания достоверно различается только в случае использования в качестве субстратных плазм, дефицитных по фактору II и кининам, а эффект ингибитора не зависит от активности факторов V, VII, VIII, IX, X, XI и XII (различия в контрольных и опытных тестах не достоверны).

Выраженная зависимость степени эффективности торможения изучаемой фракцией экстракта от концентрации протромбина и отсутствие подобного эффекта в случае использования других фактор-дефицитных плазм (за исключением плазмы, дефицитной по кининам), дополнительно свидетельствует в пользу ранее высказанного предположения о преимущественном влиянии носителя ингибиторной актив

100 ности на заключительную фазу процесса плазмокоагуляции - тромбин-зависимое превращение фибриногена: недостаток образующегося тромбина приводит к удлинению процесса свертывания фибриногена и, следовательно, увеличению времени, в течение которого ингибитор может реализовать свой эффект.

Что касается существенного увеличения степени торможения при использовании в эксперименте плазмы, дефицитной по кининам, то в данной работе эти сведения мы восприняли на уровне констатации факта, без попытки детального исследования механизма происходящего.

Далее мы более подробно изучили влияние эффекторов I и II на свертывание крови. Для этого сначала исследовали-процесс свертыва-— ния плазмы крови в присутствии эффекторов равной степени активности с помощью электрокоагулографа, что позволило получить общее представление о процессе свертывания от момента его инициации и до ретракции и фибринолиза в цифровом выражении.

Уже на этом этапе исследований стало ясно, что влияние изучаемых эффекторов на свертывание крови различно. Эффектор I почти по всем определяемым показателям оказался активнее эффектора II. Так, эффектор I увеличивает латентный период до начала свертывания в 2 раза, эффектор II его не изменяет. Эффектор I в 4,5 раза увеличивает продолжительность свертывания (эффектор II - только в 1,4 раза). Эффектор I в 4 раза снижает скорость свертывания (эффектор II - в 1,2 раза). Различие во влиянии на свертывание подтверждается и коагуло-граммой, записанной в присутствии суммы эффекторов 1 и И: она существенно отличается от предыдущих электрокоагулограмм.

101 ному превращению фибриногена, на которых происходит потребление части эффекторов. В противном случае их концентрации в различных тестах были бы равны, или, по крайней мере, сопоставимы. Это сомнение усиливается тем, что, по данным электрокоагулограмм, эффектор I удлиняет период до начала формирования фибринового сгустка.

Для разрешения данного вопроса мы использовали методику, позволяющую вычленить из общего каскада реакций свертывания процесс коагуляционного превращения фибриногена. Суть этой методики заключается в том, что пулированную донорскую плазму освобождают от фибриногена путем мягкой тепловой денатурации (56°С, 3 мин). Если к такой дефибринированной плазме прибавить фибриноген, эффекторы и затем провоцировать свертывание, .то эффекторы могут-влиять — на любой из этапов плазмокоагуляции. Если же в дефибринированной плазме сначала инициировать активацию каскада свертывания, а после сформирования тромбина прибавить фибриноген и эффекторы, то последние могут оказать влияние только на коагуляционное превращение фибриногена.

Результаты такого эксперимента показали, что эффективность торможения в обоих вышеописанных случаях практически равна между собой при использовании как эффектора I, так и эффектора II. Следовательно, первоначальное предположение о том, эффекторы реализуются на уровне коагуляционного превращения фибриногена, оказалось верным, а различия в механизме влияния эффекторов на свертывание наблюдаются именно на этапе превращений фибриногена.

Для подтверждения этого вывода мы определили эффективность торможения реакции взаимодействия тромбина с фибриногеном эффекторами' порознь и их суммой, сопоставляя при этом ожидаемый эффект (расчитан по Уэбб Л., (1966) и полученный фактически. Ожидаемый (теоретический) эффект был существенно ниже (в среднем на

70%), что говорит о синергизме эффекторов. Одновременно эти данные

102 свидетельствуют и о том, что механизм влияния исследуемых эффекторов на коагуляционное превращение фибриногена различен: в случае одинакового механизма мы наблюдали бы суммацию эффектов при недостатке эффекторов в системе, или антагонизм - при перенасышении системы эффекторами.

Еще более объективные сведения о различии в механизме действия эффекторов мы получили, наблюдая процесс коагуляционного превращения фибриногена с помощью нефелометра с автоматической регистрацией этапов этого процесса.

Эффектор I, по сравнению с контролем, в среднем всего на 9,7% задерживает формирование олигомеров и на 81% увеличивает время, необходимое для формирования фибринового сгустка. Так как агрегация протофибрилл - это практически мгновенный процесс, то эффектор I в основном тормозит аутополимеризацию достаточено зрелых олигомеров. В отличие от этого эффектор II преимущественно блокирует сборку мономеров и олигомеров - на нефелограмме нет фазы увеличения агрегатов до критического значения. Однако при этом время формирования фибринового сгустка увеличивается в среднем на 70% по отношению к контролю.

Мы провели исследования влияния эффекторов (в равных концентрациях) из сапропеля на агрегационную функцию тромбоцитов. В качестве индукторов использовали АДФ (2,5 и 10 мкг/мл) и адреналин (раствор Тоногена), так как результаты значений интенсивности агрегации, вызываемые вышеуказанными индукторами, наиболее удовлетворительны, причем интенсивность агрегации, вызываемая АДФ, хорошо коррелирует с интенсивностью агрегации, вызываемой адреналином (АуепагшБ, ОешЬагс!^ 1980).

Оба изучаемых эффектора в этих условиях ингибируют агрегацию тромбоцитов, но их механизм действия, как и влияние на процесс коагуляционного превращения фибриногена, существенно различается.

103

Так, при использовании АДФ в концентрации 2,5 мкг/мл эффекторы I и II практически не изменяют первую волну агрегации, характеризующую агрегацию тромбоцитов под влиянием индуктора, но заметно угнетают вторую волну, характеризующую высвобождение внутренних медиаторов агрегации. Максимальные величины второй волны агрегации для эффекторов I и II практически не отличаются между собой и меньше контрольного значения на 33,8 и 37,5% соответственно. Эффекторы I и II укорачивают время, необходимое для достижения максимальной величины второй волны, но с разной интенсивностью - на 62,5 и 37,5% соответственно. Кроме этого, эффектор I активирует процесс дезагрегации, а эффектор II на него не влияет.

Существенные различия ¡^механизме антиагрегационного-дей-~ ствия наблюдаются при повышении концентрации индуктора до 10 мкг/мл. В этом случае в контроле первой волны агрегации не наблюдается. Нет ее и в присутствии эффектора II, но первая волна агрегации появляется в присутствии эффектора I.

При расшифровке механизма ограничения свертывающей активности плазмы крови прежде всего мы с помощью объективного

104 способа (регистрация процесса свертывания плазмы в динамике коагу-лографом Ы 334) убедились, что полученные нами фракции сапропеля обладают выраженной антикоагулянтной активностью. При этом в качестве субстрата использовали пулированную донорскую плазму, а в качестве эффекторов - I и II совместно и порознь. При этом выявилось некоторые различия во влиянии носителей на рекальцификацию плазмы крови, особенно отражающиеся в изменении времени до начала свертывания, а также в скорости ретракции и фибринолиза.

Различия выявились и при исследовании влияния ингибиторов на процесс коагуляционного превращения фибриногена другим объективным способом - с помощью нефелометра: I меньше влияет на ранние стадии формирования протофибрилл, а тормозит преимуществено аутополимеризацию достаточно зрелых олигомеров. II, наоборот, обладает выраженным ингибирующим действием на ранние стадии полимеризации. При их совместном влиянии на коагуляцию фибриногена наблюдается синергизм эффектов, что подтверждает вышесказанное о различии в механизмах действия.

Таким образом, основной точкой приложения изучаемой антикоагулянтной активности можно считать заключительную фазу свертывания с преимущественным влиянием эффектора на самосборку мономерного фибрина.

В заключительной серии экспериментов мы попытались оценить состояние гемокоагуляции при внутривенном введения фракции сапропеля, содержащей антикоагулянт, лабораторным животным. Но прежде мы выразили количество антикоагулянта в весовых единицах, что необходимо для проведения экспериментов на животных и при оп-ределениия острой токсичности.

Следует оговориться, что в данном случае мы не пытались детально проанализировать состояние плазмокоагуляции в ответ на внутривенное ведение экстракта из сапропеля, полагая, что при позитивных

105 предварительных результатах, указывающих на перспективность дальнейшего изучения новых антикоагулянтов, подобная работа должна быть проведена как самостоятельное исследование. В связи с этим мы определяли лишь те показатели, которые интегрально отражают общую свертывающую активность плазмы крови (время рекальцифика-ции), скорость взаимодействия тромбина с фибриногеном (тромбино-вое время) и аутополимеризации мономерного фибрина (время самосборки фибрина в плазме).

Предварительные исследования показали, что ингибитор из сапропеля обладает противосвертывающим действием не только in vitro, но и в организме животных и что заметный эффект достигается при введении его в дозе, не обнаруживающей 1шдамшр токсического^влия--ния. В связи с этим, обоснованным представилось изучить изменения вышеуказанных показателей плазмокоагуляции в зависимости от вводимой дозы. Оказалось, что при дозе вводимого эффектора свертывания 5,0 мг/кг массы тела животного время рекальцификации по сравнению с контролем увеличивается в 1,9 раза, тромбиновое время - в 1,7 и время самосборки - в 3,6 раза. При увеличении дозы антикоагулянта до 10,0 мг/кг (в 1,4 раза) эти же показатели становятся выше контрольных значений в 2,1, 3,3 и 4, 8 раза. При дальнейшем увеличении дозы вводимого эффектора до 50,0 мг/кг массы тела животного время рекальцификации по сравнению с контролем возрастает в 3,9 раза, тромбиновое время - в 3,4 и время самосборки мономерного фибрина в плазме крови - в 8,2 раза.

Ежедневное введение антикоагулянта из сапропеля в течении

14 дней в той же дозе и отборе проб крови через 6 ч после инъекции, сдвига изучаемых показателей относительно друг друга практически не наблюдается и составляют не более 11-14%. Это свидетельствует о том, что динамика гипокоагулемии оказалась примерно одинаковой как после первой единичной инъекции, так и после инъекции, выпол

106 ненной в четырнадцатый раз.

Высокая эффективность фракции экстракта из сапропеля проявилась и его выраженным протективным действием при активации тромбиногенеза. Так, при внутривенных инъекциях тромбопластина в дозе 40 мг/кг, вызывающей гибель 70% подопытных животных, предварительное введение экстракта в дозе 7,0 мг/кг снизило частоту гибели животных на 73,4%, предварительное введение экстракта в дозе 9,2 мг/кг до инъекции тромбопластина вызывало гибель уже только 6,6% подопытных животных, т.е. в 10,5 раза меньшую в сравнении с контролем. Таким образом, экстракт можно рассматривать как эффективное средство предупреждение тромбозов путем его введения перед воздействием, сопровождающимся тромбопластинемией —

Таким образом, наши исследования свидетельствуют, что сапропель содержит антикоагулянты прямого действия пептидной природы, сходные по структуре и практически идентичные по механизму действия с пептидами растительного происхождения. Пептиды растительного происхождения и пептиды из сапропеля принципиально отличаются от применяющихся в настоящее время в медицинской практике антикоагулянтов прямого действия, а в эксперименте на животных даже превосходят их.

Все вышесказанное свидетельствует о целесообразности дальнейшего изучения новых антикоагулянтов прямого действия из сапропеля и растительного сырья, и служит обоснованием необходимости их детального исследования согласно рекомендациям Фармакологического Комитета для антикоагулянтов прямого действия.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Бушин, Антон Евгеньевич, Тюмень

1. Агакишиев Д.Д., Абдуллаев Ш.Г. Гирудинотерапия больных хроническим простатитом. Баку, 1987. - 7 с.

2. Азарова Л.А. Антикоагулянты прямого действия на основе химически модифицированных природных полисахаридов: Дисс. . канд. мед. паук. -М., 1990. С. 140.

3. Азарова Л.А., Сятковский В.А., Капуцкий Ф.Н., Торгашев В.И. Механизмы противосвертывающей активности новых полусинтетических гепариноидов// Гематология и трансфузиология. -1991. Т. 36, №4. - С. 23-25.

4. Андреев В.М., Анисимова И.А., Нугманова Ф.Р. Случай острого— гепатита от гепарина//Казапский мед. жури. 1983. - № 3. - с. 220.

5. Ашмарин И.П. Нейромедиаторы и нейромодуляторы. Эволюция соединений и эволюция гипотез//Журн. эвол. биохим. и физиол. 1979.-№3.-С. 278-282.

6. Ашмарин И.П. Регуляторные пептиды, происхождение и иерар-хия//Журн. эвол. биохим. и физиол. 1982. - № 1. - С. 3-10.

7. Балуда В.П., Баркаган З.С., Гольдберг Е.Д. и др. Лабораторные методы исследования гемостаза. Томск. - 1980. - 315 с.

8. Барабой В.А. Растительные фенолы и здоровье человека. М., Наука. - 1984. - 160 с.

9. Баркаган З.С. Геморрагические заболевания и синдромы. М.: Мед., 1988.-528 с.

10. П.Баркаган З.С. О применении фраксипарина для профилактики и лечения тромбоэмболии; с индуцированной гепарином тромбоци-топенией/ЛГер. арх. 1993. - Т. 65. - № 10. - С. 77-82.

11. Баркаган З.С., Лычев В.Г., Бишевский K.M. и др. Механизмы ге-паринорезистентности и их клиническое значение//Терапевт. арх.- 1982. Т. 54, № 8.-С. 77-82.

12. П.Баркаган З.С., Сердюк П.В. Невынашиваемость беременности и нарушения в системе гемостаза/ЛГематология и трансфузиология.- 1999. -№ 4.- С. 3-8.

13. Баскова И.П. Биологически активные вещества, продуцируемые медицинской пиявкой (Н.т.) и механизмы их действия: Автореф. дисс^.„ докт. биол. наук. М., 1986.^46 с.

14. Баскова И.П. Механизмы регуляции гемостаза и фибринолиза секретом слюнных желез медицинской пиявки. Биохимия животных и человека: Респуб. межвед. сб. науч. трудов /А.Н.Украины, 1991. - С. 28-39.

15. Баскова И.П., Миссельвид Ф., Никонов Г.И. и др. Секрет слюнных желез медицинской пиявки // Бюлл. эксперим. биол. и мед. -1984.-Т. 97, №6.-С. 696-697.

16. Башков A.C. Низкомолекулярные гепарины//Эксперим. и клин, фармакология. 1993. № 4. - С. 66-76.

17. Беленький M.JI. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Л., 1963. - С. 34-38.

18. Белоусов Ю.В., Моисеев B.C., Лепахин В.К. Клиническая фармакология и фармакотерапия. Руководство для врачей. М.: Универсум, 1993.

19. Бессмертный B.C. Математическая статистика в клинической, профилактической и экспериментальной медицине. М.: Медицина, 1967.-303 с.

20. Бочоришвили В.Г. Диагностика и лечение сепсиса//Воен. мед.110журн. 1983. - № 5. - С. 35-40.

21. Бычков С.М. Новые данные о гепарине//Вопросы мед. химии. -1981. Т. 27. - № 6. - С. 726-736.

22. Бышевский А.Ш., Галян C.J1., Дементьева И.А., Нелаева A.A., Соловьев В.Г. Тромбоциты. Тюмень, 1996. - 250 с.

23. Бышевский А.Ш., Галян С.Л., Левен П.И. и др. Регуляция коагу-ляционных превращений фибриногена. Свердловск: Средне-Уральское кн. изд-во, 1987. 205 с.

24. Бышевский А.Ш., Кожевников В.А. Свертываемость крови при реакции напряжения. Свердловск: Средне-Уральское кн. изд-во, 1986.- 174 с.

25. Валиев-Б.Н., Сабирова P.C. Нарушения гепаринового обмена-при-острой пневмонии у детей раннего возраста//Вопросы детской пульмонологии и аллергических заболеваний у детей. Ташкент. 1980.-Вып. 2.-С- 18-22.

26. Васильева Г.В., Свиридова С.И. Синтез физиологически активного аналога цепи фибрина и его производпых//У1 Всесоюз. симп. по химии белков и пептидов: Тез. докл. Рига, 1983. - С. 344-345.

27. Венецкий И.Г. Вариационные ряды и их характеристика. М.: Статистика, 1970.- 158 с.

28. Выгорская Я.И., Воробель A.B. Влияние гепарина на кининовую систему при остром внутрисосудистом гемолизе//Система свертывания крови и фибринолиз. Саратов, 1975. - С. 345.

29. Гаврилов O.K. Проблемы и гипотезы в учении о свертывании крови. М., 1981.

30. Гербильский Л.В., Майле-Августинович С.Г., Черненко Ю.П. Влияние гепарина на щитовидную железу // Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1983. - Т. 85, Вып. 8. - С. 57-61.

31. Гершкович A.A. Молекулярные основы взаимодействия гирудина с тромбином: Обзор // Биополимеры и клетки. 1992. - Т. 8, № 1. - С. 5-22

32. Дмитриев В.В. Гепаринотерапия ДВС крови при гнойно-воспалительных заболеваниях у детей // Анестезиология и реаниматология. 1991. -№ 1.- С. 69-72.

33. Дрозд H.H. Механизмы антикоагулянтного действия сернокислого эфира хитозана // Вопр. мед. химии. 1992. - Т. 38, № 5. - С. 12-14.

34. Ена Я.М. Всесоюзное совещание, посвященное применению пиявки // Врачебное дело. 1992. - № 5. - С. 115-117.

35. Ерзинкян K.JI., Розенфельд М.А., Тер-Макарян А.Г.идр.Спек-трофотометрические исследования реакции комплексообразова-ния фибриногена с антикоагулянтом гепарином // Изв. АН СССР, сер. Биол. 1974. - № 6. - С. 920-924.

36. Ефимов B.C., Румянцева А.Г. Нежелательные эффекты длительного применения гепарина и подходы к их устранению // Эксперим. и клин, фармакол. 1992. - Т. 55, № 6. - С. 73-76.

37. Ефимов B.C., Усов А.И., Ольский Т.С. Сравнительное исследование антикоагулянтной активности сульфатированных полисахаридов красных морских водорослей //Фармакология и токсикология. 1983. - № 3. - С. 61-67.

38. Ильина A.B., Давидович Ю.А., Рогожин C.B. Синтез аналога N-концевого пептида ос-цепи фибрина с последовательностью Gly-Pro-Arg // VI Всесоюз. симп. по химии белков и пептидов: Тез. докл. Рига, 1983. - С. 342-343.

39. Исаханян Г.С. Влияние гир.удотерапии-на-агрегацию -тромбоцитов у больных с острым инфарктом миокарда // Кровообращение. 1991.-Т. 24, №3.-С. 32-34.

40. Исаханян Г.С. Изменение некоторых показателей крови при ги-рудино-терапии // Эксперим. и клин, медицина. 1989. - Т. 29, № 2.-С. 107-111.

41. Калинин Е.П., Русакова O.A., Поле И.Э. Получение прямых низкомолекулярных антикоагулянтов из сапропеля. Тез. докл. 2 окружной конф. мол. уч. ХМАО. Сургут, 2001. - С. 171-172.

42. Калихевич В.И., Ардемасова З.А., Розенфельд М.А. Антикоагу-лянтные свойства синтетических пептидов // Докл. VI Всесоюзн. симп. по химии белков и пептидов: Тез. докл. Рига, 1983. - С. 391-392.

43. Каменев Ю.Я. Пиявки (гирудо-терапия). С-Петерб. мед. центр культуры здоровья им. А.С.Залманова, 1993. - 17 с.

44. Капелюшник H.JI. Опыт использования гирудотерапии в акушерской практике // Современные методы диагностики и лечения. -Казань, 1993. С. 252-253.

45. Кацадзе Ю.Л. Тест толерантности плазмы к гепарину в диагно113стике тромбофилии // Лаб. дело. 1981. - № 7. - С. 411-414.

46. Кириченко JT.J1. Лечение гепарином // Кардиология. 1986. - № 9. -С. 119-123

47. Климов П.К. Современное состояние исследований по физиологии пептидов//Система мозговых и внемозговых пептидов. Л., 1984.-С. 3-4.

48. Ковалев М.М. Синантрин. Киев: Наукова Думка, 1974. - 128 с.

49. Колхир В.К. Исследование влияния некоторых тритерпеновых гликозидов на свертывающую систему крови//В кн.: Физиологически активные вещества в медицине. Ереван, 1983. - С. 148.

50. Комиссаров И.Д., Логинов Л.Ф. К вопросу о молекулярной массе гуминовых кислот //В кн.: Гуминовые препараты: TraMeHcjoril сельскохозяйственный институт. Научные труды, том XIV. -Тюмень, 1971. С. 125-130.

51. Кордэ Н.В. Биостратификация и типология русских сапропелей. Издательство Академии Наук СССР. - М. - 1960. - 219 с.

52. Кудряшов Б.А. Биологические проблемы регуляции жидкого состояния крови и ее свертывания. М.: Медицина, 1975. - С. 487491.

53. Кудряшов Б.А. Фибринолитические и антикоагулянтные комплексы низкомолекулярного гепарина с тафцином // Бюлл. экспе-рим. биол. и мед. 1992. - Т. 114, № 12. - С. 609-611.

54. Кудряшов Б.А., Ляпина JI.A. Комплекс гепарин-мочевина и его физико-химические свойства // Вопр. мед. химии. 1975. - № 2. -165-168.

55. Кудряшов Б.А., Ляпина Л.А. Физиологические свойства комплекса гепарин-тромбопластин // Физиол. журн. СССР. 1979. -№6. -С. 771-776.

56. Кудряшов Б.А., Ляпина Л.А., Григорьева Е.А. Взаимодействие гепарина с фибринмономером и комплексом фибринмономер-фибриноген // Вопр. мед. химии. 1980. - № 3. - С. 318-321.

57. Кудряшов Б.А., Ляпина Л.А., Пасторова В.Е. Значение комплекса антитромбин III-гепарин-тромбин в защитной реакции противо-свертывающей системы // Вопр. мед. химии. 1988. - №. 2. - С. 38-42.

58. Кудряшов Б.А., Ляпина Л.А., Ульянов A.M. Наличие активного комплекса фибриноген-гепарин в суммарной фракции продуктов деградации плазмы крови//Биохимия. 1977. - № 3. - С. 451-459.

59. Кузник Б.И., Скипетров В.П. Форменные элементы крови. М.: Медицина, 1974. - С. 17.

60. Кузник Б.И., Цибиков H.H., Арушанян Л.Г. Полипептиды как регуляторы микроциркуляторного гемостаза//Актуальные вопросы нарушений гемодинамики и регуляции микроциркуляции в клинике и эксперименте. М., 1984.-С. 185-186.

61. Левицкая Н.Г., Клейменов A.M., Петросян М.Т., Розенфельд М.А. и др. Влияние низкомолекулярных пептидов на процесс перехода фибриногена в фибрин // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1987. -№ 8. - С. 190-192.

62. Левицкая Н.Г., Петросян М.Т., Розенфельд М.А. Антикоагулянт-ные свойства низкомолекулярных пептидов // Перспективы биоорганической химии в создании новых лекарственных препаратов. Рига, 1982. - С. 38-39.

63. Литвинов Р.И., Слабанов Ю.Д., Зубаиров Д.М. О механизме неферментативного фибринолиза// Вопр. мед. химии. 1981. - № 4. -С. 478-481.

64. ЛукинЕ.И. Фауна СССР.-Пиявки. Т. 1.-Пиявки-пресных-и солоноватых водоемов. Новая серия № 109 зоолог, инс-та АН СССР. -Л., 1976.

65. Лычев В.Г. Диагностика и лечение ДВС крови. М.: Медицина, 1993. - 114 с.

66. Ляпина Л.А. Влияние ингибиторов протеиназ и блокаторов гепарина на фибринолитические свойства комплексов гепарина // Вестн. Московского ун-та. 1980. - № 2. - С. 60-63.

67. Ляпина Л.А. Свойства продуктов лизиса нестабилизированного фибрина комплексом адреналин-гепарин // Вестн. Московского ун-та. 1981. -№ 3. - С. 42-46.

68. Мазаев A.B., Саргин К.Е. Клиническое применение гепарина и его низкомолекулярных фракций // Кардиология. 1986. - Т. 26, №9. - С. 122-124.

69. Мазур Н.М. Основы клинической фармакологии и фармакотерапии в кардиологии. М.: Медицина, 1988. - С. 194-195.

70. Малиновский H.H., Козлов В.А. Антикоагулянтная и тромболи-тическая терапия в хирургии. М.: Медицина, 1976. - 426 с.

71. Маркосян A.A. Физиология свертывания крови. М.: Медицина,1161966.-464 с.

72. Метелица В.И. Справочник кардиолога по клинической фармакологии. М.: Медицина, 1987. - С. 280-287.

73. Михалева И.В. Тканевой тромбопластин ингибитор гепарина, механизм действия, биологическое значение: Автореф. дис. . канд. биол. наук. - Ленинград, 1988. - 29 с.

74. Назаров В.Г. Лекарственные средства, влияющие на гемостаз // Акушерство и гинекология. 1993. - № 2. - С. 52-53.

75. Наумова В.И., Ефимов B.C., Деканбаева С.А. Принципы гепари-нотерапии при гломерулонефрите у детей // Актуальные вопросы диагностики, лечения и профилактики болезней почек у детей. -Куйбышев, 1985. С. 70-7,4

76. Нетяженко В.З., Амосова E.H., Гирина Л.А. и др. Противотром-ботическая терапия в клинической практике, новое в терапии, диагностике и лечении. М.: Медицина, 1982. - 87 с.

77. Нодельсон С.Е., Чехова Е.И., Фастовский ВЛ. Аллергические гепариновые инфильтраты и некрозы кожи, вызванные применением гепарина//Тер. архив. 1984. - № 6. - С. 48-51.

78. Нодельсон С.Е., Шитикова Б.Д. Аллергический гепариновый инфильтрат при подкожном введении // Актуальные проблемы онкологии и мед. радиологии. Минск, 1980. - Вып. IX. - С. 82-85.

79. Павлищук С.А. Новое о взаимоотношении гепарин-кровяные пластинки // Функциональное состояние тромбоцитов в норме и при патологических состояниях. Обнинск, 1975. - С. 65.

80. Панантеску Г., Понеску Э. Современная медикаментозная патология. М.: Медицина, 1976.

81. Панченко Е.П. Ингибиторы Ilb/IIIa рецепторов тромбоцитов -новое направление в антитромботической терапии //Терапевтический архив 1997. - № 9. - С. 66-71.

82. Папонов В.Д., Рузга Б.А., Самойлов О.Б. Влияние гепарина на

83. ДНК // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1985. - № 3. - С. 298-301.

84. Петросян М.Т., Розенфельд М.А., Петров А.К. и др. Антикоагу-лянтные свойства пептидов аналогов N-концевого участка цепи фибрина // Система мозговых и внемозговых пептидов. - JL, 1984. - С. 67-68.

85. Поле И.Э., Русакова O.A., Кортусов В.Л. Новые прямые антикоагулянты растительного происхождения. Мат. 2 междунар. науч.-практ. 2 конф. «Здоровье и образование в 21 веке». М., 2001. -С. 149.

86. Раби К. Локализованная и рассеянная внутрисосудистая коагуляция: Пер. с франц. М.: Медицина, 1974. - 17 с.

87. Радзевич И.М.,-Ходорова -Е.Л. Получение- фибринмономера из-------нефракционированной плазмы крови//Укр. биохим. журн. 1969. -№4.-С. 367-370.

88. Розенфельд М.А., Ерзинкян К.Л., Пирузян Л.А. Исследование молекулярного механизма реакции комплексообразования фибриногена с гепарином // Докл. АН СССР. 1975. - № 3. - С. 419427.

89. Розкин М.Я., Левина М.Н., Каменева Н.С. и др. Изучение механизма антикоагулянтного действия фукоиданов // Фармакология и токсикология. 1989. - № 3. - С. 48-51.

90. Русакова O.A. Антикоагулянты растительного происхождения: природа и механизм действия: Дис. . канд. мед. наук. Тюмень, 1993. - С. 63-64.

91. Русакова O.A., Поле И.Э., Калинин Е.П. Прямые низкомолеку118лярные антикоагуляпты растительного происхождения. Природа и механизм действия. Там же. - С. 196-198.

92. Рустамова Б.А. Влияние гепарина на реакцию образования фибрина // Вестн. Московского ун-та. 1970. - № 2, - С. 76-80.

93. Савельев B.C., Яблоков Е.Г., Кириенко А.И. Тромбоэмболия легочной артерии. М.: Медицина, 1989. - С. 263.

94. Саноцкий И.В. Методы определения токсичности и опасности химических веществ. М.: Медицина, 1970. - 343 с.

95. Скипетров В.П. Тканевое звено физиологической регуляции агрегатного состояния крови и клеточных структур // Усп. физиол. науки. 1986. - Т. 17. - С. 65-79.103Стрельников Ю.Е., Лабикова Н.П., Милевский Е.И- и-дрг

96. Сравнительное исследование биологических свойств ряда бактериальных полисахаридов // Радиобиология. 1986. - № 3. - С. 323-328.

97. Тажудинова С.И. Продолжительность самосборки фибрина при изменениях гемостатического потенциала: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Ленинград, 1987. - 20 с.

98. Турова А.Д., Сапожникова Э.Н. Лекарственные растения СССР и их применение. М.: Медицина, 1983. - С. 288.

99. Угарова Т.П., Белицер В.А. Исследование равновесной системы фибрин-фрагмент Д-протектор//Укр. биохим. журн. 1978. - № 3. -С. 357-363.

100. Ульянов A.M., Ляпипа Л.А. Образование комплекса фибриноген-гепарин при взаимодействии комплекса адреналин-гепарин ифибриногена in vitro и in vivo/УНаучн. докл. высш. школы. Биологические науки. 1973. -№ 9. - С. 44-49.

101. Ферстрате М. Проблемы и перспективы клинического применения гепарина// Кардиология. 1981. - № 8. - С. 28-31.

102. Ферстрате М., Фермилен Ж. Тромбозы. М.: Медицина, 1986.

103. Хомутов А.Е., Орлов Б.И. Физиологическая роль гепарина: Учебное пособие по специальному курсу "Современные проблемы физиологии и биохимии крови". Горький, 1987. - С. 77.

104. Хушбактова З.А., Сыряв В.Н., Джухарова М.Х. и др. Исследования гиполипидемических свойств„полисахаридов, выделенных-из флоры Средней Азии//Хим.фарм. журн. 1987. - № 11. - С. 13481352.

105. Чазов Е.И., Лакин K.M. Антикоагулянты и фибринолитиче-ские средства. М.: Медицина, 1977.

106. Чипенс Г.И. Дизайн лекарственных препаратов на базе пептидов // Перспективы биоорганической химии в создании новых лекарственных препаратов: Сб. трудов. Рига: Изд-во ун-та, 1982. - С. 7-9.

107. Чирятьев Е.А. Пептидные ингибиторы коагуляционного превращения фибриногена: Автореф. дис. . докт. биол. наук. М., 1990.

108. Чирятьев Е.А., Калинин Е.П. К вопросу о различиях в механизме действия ингибиторов свертывания крови из сапропеля. В кн.:

109. Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии. Мат.120конф. биохимиков Урала, Поволжья и Зап. Сибири. Ижевск. 2001. -С. 142-143.

110. Чирятьев Е.А., Калинин Е.П., Русакова OA. Способ получения антикоагулянта из сапропеля. Патент на изобретение № 2175552 от 10 ноября 2001 г.

111. Чирятьев Е.А., Поле И.Э., Калинин Е.П., Кортусов В.Л., Платонов Е.В., Русакова О.А. Некоторые свойства антикоагулянтов из сапропеля //Тромбоз, гемостаз и реололгия. 2001. - № 1 (5). - С. 140141.

112. Яковлева Н.В. Антикоагулянтная активность фракции сапропеля. Получение, природы и механизм действия//Дис. . канд. биол. наук.--=Тюмень.--^-1998.---141-с. — ---------

113. Abilgaard U. Inhibition of the thrombin-fibrinogen reaction by heparin in the absense of cofactor//Scand. J. Haemotol. 1968. - N 6. -P. 432-439.

114. Achyuthman K., Dobson J., Greenberg Ch. Gly-Pro-Arg modifies the glutamine residues in the a- and y-chain in fibrinogen: inhibitor of transglutaminase cross-linking//Biochem. Biophys. Acta. -1986.-№3. P. 261-268.

115. Alderman M.D., Hansen A.G. Effects of naturally occurring and synthetic thrombin inhibitors // Arch. Intern. Med. 1986. - Vol. 148. - P. 1400-1407.

116. Ansell J., Deykin D. Heparin-induced thrombocytopenia and recurrent thromboembolism // Amer. J. Hemat. 1980. - Vol. 8. - P. 325-332.

117. Asch A.S., Barnwell J., Silverstein R.L., Nachman R.L. Isolation of the thrombospondin membrane receptor //J. Clin. Invest. -1987. Vol. 79, N 4. - P. 1054-61.

118. Avenarius H.J., Deinhardt J. Durchfuhrung und Auswertung von Aggregationstesten // Prakt. Anwend. Thrombozytenfunktionsdi-agn. Stuttgart - New York, 1980. - P. 57-68.

119. Bagdy D., Diozegi M., Sebestyent J. e.a. A D-Phe-Pro-Arg-A anticoagulants lemezlce funktio ot gatlo Lataso in vivo//Kiserl. Or-voshud. 1984. - № 1. - P. 26-46.

120. Banssillion V., Besson L., Azzar D et al. Fraxiparine Analytical and Structural Data, Pharmacology, Clinical Trials. Paris, 1987. P.13.

121. Barker P.L., Bullens S., Bunting S., Burdick D.J., Chan K.S., Deisher T., Eigenbrot C., Gadek T.R., Gantzos R., Lipari M.T., et all Cyclic RGD peptide analogues as antiplatelet antithrombotics //J. Med. Chem. 1992. -Vol.35, N. 11.- P.2040-8.

122. Barradas M.A., Milchailidis D.P., Epemolu O. et al. Comparison of the platelet proaggregatory effect of conventional unfraction-ated heparins and low molecular weight heparin fraction (CY-222) // Brit. J. Haemost. 1987. - Vol. 67, N 4. - P. 451-458.

123. Barrowchiffe T.W., Merton R.E., Gray E., Thomas D.P. Heparin // Thrombos. Haemostas. 1988. - Vol. 60, N 3. - P. 434-436.

124. Bennett J.S. Structural biology of glycoprotein Ilb-IIIa //Trends. Cardiovasc. Med. 1996. - Vol.6, N.l. -P.31-36

125. Bergquist D., Frisell J., Haibook T. et al. Anticoagulant effect of low molecular weight heparin // Thromb. Haemost. 1987. - Vol. 57, Suppl. 1. - P. 1339a.

126. Bergquist D., Hedner U., Siorin E. et al. Anticoagulant effects of two types of low molecular weight heparin administered subse- -quently//-Thromb.-Res. -1983. N-3.—P.-381-391.

127. Berkowitz S.D., Harrington R.A., Rund M.M., Tcheng J.E. Acute profound thrombocytopenia after C7E3 Fab (abciximab) therapy //Circulation 1997. - Vol.95, N.4 - P.809-13.

128. Bertele V., Roncaglioni M.C., Donati M.B., Caetano G. Heparin conteracts the antiaggregating effect of prostacyclin by potentiating platelet aggregation // Thrombos. Haemost. 1983. - Vol. 49, N 2. -P. 81-83.

129. Bick R.L. Disorders of haemostasis and thrombosis. Principles of clinical practice. New York, 1985.

130. Boeckel A.A., Best M., Petiton M. et al. Pentasaccharides and tetrasaccharides antithrombotic activity. Патент 4841041 США. Опубл. 20.06.88. НКИ 536/1 18.

131. Borg J.Y., Flecht В., Legendve M. et al. Heparin and low molecular weight heparins-induced thrombocytopenias // Thromb. Res. -1986. Suppl. 6. - P. 96.

132. Bottiger L.E. The heparin story. To search of the early history of heparin // Acta Med. Scand. 1987. - Vol. 222, N 3. - P. 195-200.

133. Bousgust E., Doutremepuich C., Gestrean S., e.a. Activity thrombolutique de heparine et d'une fraction de las poids molecu-lar//Therapic. 1985. - № 1. - P. 13-16.

134. Brase L.D., Fareed J. Heparin-induced platelet aggregation (HIPA) dose/response weight heparin preparations // Thromb. and Haemost. 1987. - Vol. 58, N 1. - P. 18.

135. Browse N.L., Burnard K.G., Thomas M.L. Diseases of the veins. Pathology, diagnosis and treatment. London: Edward Arnold, 1988.

136. Burch J.W., Stanford N., Majerus P.W. Inhibition of platelet prostaglandin synthetase by oral aspirin //J. Clin. Invest. 1978. -Vol.61, N.2. - P314-9.

137. Calvete J.J. Clues for understanding the structure and function of a prototypic human integrin: the platelet glycoprotein Ilb/IIIa complex //Thromb. Haemost. 1994. - Vol.72, N1. - P. 1-15.

138. Calvete J.J., Schafer W., Mann K. Mass spectrometric analysis state of human platelet GP Ilia //Platelets. 1995.- 6.- 5.

139. Caranobe C., Barret A., Gabaig A. et al. Disappearance of circulating anti-Xa acting after intravenous injection of standart heparin and of low molecular weight heparin (CY-216) // Thromb. Res. -1985. -N 1. P. 129-133.

140. Carrigan J.J.Jr. Heparin therapy in bacterial septicemia // J. Pediatric. 1987. - Vol. 41. - P. 695-704.

141. Carteaux J.P., Steiner B., Roux S. Ro 44-9883, a new nonpeptidic GPIIb-GPIIIa antagonist prevents platelet loss in a guinea pig124model of extracorporeal circulation //Thromb. Haemost. 1993. -Vol.70, N.5-P.817-21.

142. Changeng R., Qingyn W.U., Wanga Z. et al. Antithrombotic effects of dextran sulfate // Med. J. Aust. 1986. - Vol. 44. - P. 17-21.

143. Chong B.H., Ismail F., Cade J. et al. Heparin-induced thrombocytopenia: studies with a new low molecular weight heparinoid, Opg. 10172//Blood. 1989.-Vol. 73, N6.-P. 1592-1596.

144. Cimo P.L., Moake J.L., Weiniger R.S. et al. Heparin-induced thrombocytopenia: association with platelet aggregation and arterial thrombosis // Amer. J. Hemat. 1979. - Vol. 6. - P. 125-133.

145. Cines D.B., Tomaski A., Tannenbaum S. Immune endothelialcells-injury- in-heparin-associated throbocytopenia // New Engl—Jt^

146. Med. 1987. - Vol. 316, N 10. - P. 581-589.

147. Cockar D.L., Pezz H.A., Gzaham M.F. Heparin induced specific protein release from human intestinal smooth muscle cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. - Vol. 142, N 2. - P. 542551.

148. Cohen M. Heparin-induced thrombocytopenia and the clinical use of low molecular weight heparins in acute coronary syn-dromes//Semin. Haematol. 1999. -V. 36. -N. 1. - P. 33-36.

149. Collen D., Lijnen H.R. Molecular basis of fibrinolysis, as relevant for thrombolytic therapy //Thromb. Haemost. 1995. - Vol.74, N.l -P.167-71.

150. Coller B.S. A new murine monoclonal antibody reports an activation-dependent change in the conformation and/or microenvironment of the platelet glycoprotein Ilb/IIIa complex //J. Clin. Invest. -1985.-Vol.76, N.l -P.101-8.

151. Coller B.S. Blockade of platelet GP Ilb/IIIa receptors as an antithrombotic strategy //Circulation 1995. - Vol.92,N.9. - P.2373-2380.

152. Coller B.S. GP II r III antagonists: pathophysiologic and thera-b a peutic insights from studies of c7E3 Fab //Thromb. Haemost. -1997. Vol.78, N.l. - P.730-735.

153. Copplestone A-, OscierD.G.Heparinrinducedthrombocyto-penia in pregnancy // Br. J. Haematol. 1987. - Vol. 56, N 2. - P. 248.

154. Cox D., Aoki T., Seki J., Motoyama Y., Yoshida K. The pharmacology of the integrins //Med. Res. Rev. 1994. - Vol.14, N2. -P.195-228.

155. Daves F. Heparin. New biochemical and medical aspects // Proceeding of the simposium 29 june 1 july 1981.- 1983. - N 4. - P. 4561.

156. Deacon-Smith R., Lee-Potter., Rogers D. Platelet agrégation in the presense of extracts of Britich marine algae//Med. Lab. Sch. -1985.-N4.-P. 404-405.

157. Dennis S., Wallace A., Hofsteenge J., Stone S.R. Use of fragments of hirudin to investigate thrombin-hirudin interaction //Eur. J. Biochem. 1990. - Vol. 188, N. 1. - P.61-6.

158. Dodt J., Schmitz Th., Schafen Th., Bergman C. Expression, secretion and processing of hirudin in E. coli using the alkaline phosphatase signal sequence // FEBS Letter. 1986. - Vol. 202. - P. 373377.

159. Dunn F., Soria C., Thomaidis A. et al. Interaction of platelet — —with-standart-heparin-and-low molecular—weight-fractions-//-Nouv.

160. Rev. Franc. Hemat. 1984. - Vol. 26. - 249 p.

161. Engelberg H. The effect of heparin on oxygen transport from blood to tissues in heparin-structur function, and clinical implication // Adv. Experim. Med. Biol. N.W., 1975. - Vol. 52. - P. 299-306.

162. Engelberg H., Brown K.D. Heparin: metabolism, physiology and clinical application. Springfield, 1983. - 77 p.

163. Fareed J. A prospect of firther developments of low molecular weight heparin in the 1990's // International Symposium on Low Molecular Weight Heparin and Related Polysaccharides. Munich, 1991. - P. 29.

164. Fareed J., Walenga J.M. Molecular composition of low molecular weight heparins: relevance to biochemical and pharmacologic effects // Fraxiparine. Second International Symposium. Monte Carlo, 1989. - P. 30-31.

165. Farrell D.H., Thiagarajan P. Binding of recombinant fibrinogen mutants to platelets //J. Biol. Chem. 1994. - Vol.269, N1. - P.226-31.

166. Farrell D.H., Thiagarajan P., Chung D.W., Davie E.W. Role of fibrinogen alpha and gamma chain sites in platelet aggregation //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - Vol.89, N22. - P. 10729-32.

167. Ferguson J.J. 3rd EPILOG and CAPTURE trials halted because of positive interim results news. //Circulation 1996. - Vol.93, N4. -P. 637.

168. Ficker A.M., Mauzac M. Studies on the site of action of prothrombin biosynthesis // Biomaterials. 1985. - Vol. 6. - P. 198202.

169. Fioravanti C., Burkholder D., Francis B., Siegl P., Gibson R. Antithrombotic activity of recombinant tick anticoagulant peptide and heparin in a rabbit model of venous thrombosis//Thromb. Res. 1993. -V. 71.-N4.-P. 317-324.

170. Fitzgerald D.J. Platelet inhibition with an antibody to GP Ilb/IIIa//Circulation. 1989. - 80. - 6.-P. 1918-1919.

171. Frohlish E.D., Alderman S.A. Heparin: chemistry and clinical usage // Lancet. 1988. - N 4. - P. 1349-1354.

172. Fuster V., Jang I-K. Role of platelet-inhibitor agents in coronary artery disease. In: Topol EJ, editor. Textbook of interventional cardiology. Philadelphia: W.B. Saunders; 1994. p. 3-22.

173. Gabriel D., Smith L., Folda J. The influence of immunoglobulin on the assembly of fibrin gels//J. Lab. Clin. Med. 1983. - N 4. - P. 545-552.

174. Galanakis D., Ginzler E., Fikring S. Monoclonal Ig G anticoagulants delaying fibrin aggregation in two patients with systemic lupus erythematosus//Blood. 1978.-V. 52.-P. 1037-1046.

175. Ganzer D., Gutezeit A., Mayer G. Prevention of thromboembolism as a cause of thromboembolic complications. A study of theincidence~ofheparin induced thrombocytopenia type-II//Z.-Orthop —1.re Grenzgeb. 1997. - V. 135. - N 6. - P. 543-549.

176. Gartner T.K., Bennett J.S. The tetrapeptide analogue of the cell attachment site of fibronectin inhibits platelet aggregation and fibrinogen binding to activated platelets //J. Biol. Chem. 1985. -Vol.260, N22. -P.l 1891-4.

177. Gibbs A., Green G., Doctor V. Isolation and anticoagulant properties of polysaccharides of Typha angustata and Daemonorops species//Thromb. Res. 1984. - N. 3. - P. 97-108.

178. Girdwood R.H. Metabolism of antithrombin III (heparin cofac-tor) // Clinical pharmacology. London, 1985. - P. 474-479.

179. Girdwood R.H. Metabolism of antithrombin III (heparin cofac-tor) // Clinical pharmacology. London, 1985. - P. 474-479.

180. Gonault-Helimann M., Huet Y., Adnof S. et al. Low molecular weight heparin fractions as an alternative therapy in heparin-induced thrombocytopenia//Haemostasis. 1987. - Vol. 17. - P. 134-140.

181. Grotemeyer K.H., Scharafinski H.W., Husstedt I.W. Two-year follow-up of aspirin responder and aspirin non responder. A pilotstudy including 180 post-stroke patients //Thromb.Res.- L9931. Vol.71, N.5.-P.397-403.

182. Gruel Y., Leroy J., Guerous C. et al. Thrombopenie et thrombose sour heparine. Neoessite destests d'agrégation avant le traitement par l'heparine de las poids moleculaire // Presse med. 1985. -Vol. 14. - P. 166-167.

183. Haas S., Blumel G. Prophylaxis of thromboembolism with various low molecular weight heparins // Haemostasis. 1988. - Vol. 18, Suppl. 3. - P. 82-87.

184. Hand E.L., Gilbert J.D., Yuan A.S., Olah T.V., Hichens M. Determination of MK-383, a non-peptide fibrinogen receptor antagonist, in human plasma and urine by radioimmunoassay //J. Pharm. Biomed. Anal. 1994. - Vol.12, N.8. - P.1047-53.

185. Hantgan R., Jerom W., Hursting M. No effects of clot age or thrombolysis on Argatrobans inhibition of thrombin//Blood. 1998. -V. 92,-N6.-P. 2064-2074.

186. Harrington R.A. Design and methodology of the PURSUITtrial: evaluating eptifibatide for acute ischemic coronary syndromes.

187. Platelet Glycoprotein Ilb-IIIa in Unstable Angina: Receptor Suppres130sion Using Integrilin Therapy //Am. J. Cardiol. 1997. - Vol.80, N.4A. - P.34B-38B.

188. Henschen A., Lottspeich E. Amino acid sequence of human fibrin. Frelitminary note on the y-chein sequence//Hoppe-Seulers Zeitschrift fur Physiologisch Chemie. 1977. - V. 358. - P. 935-938.

189. Hirano S., Kinngava J., Nishioka A. International Conference of Chitin and Chitosan, 3-rd: Proceedings. Ancoma, 1985. - P. 461 -467.

190. Hirsh J., Levine M.N. Low molecular weight heparin // Blood. -1992. Vol. 79, N 1. - P. 1-17.

191. Hoffman A., Markwardt F. Inhibition of the thrombin-platelet reaction by hirudin // Haemostasis. 1984. - Vol. 14, N 7. - P. 164169.

192. Hoots W., Carrel N., Wagner R., Cooper H., McDonagh G. A naturally occuring antibody that inhibits fibrin polymerization//New Engl. J. Med. 1981.-N 15.-P. 857-861.

193. Horellon M.H., Conrad J., Zecrulier C. et al. Persistent heparin-induced thrombocytopenia despite therapy with low molecular weight heparin//Thrombos. Haemost. 1984. - Vol. 51. - P. 134.

194. Hsiech K., Mudd M., Wilner G. Fibrin polymerization. 1. Alkylating peptide Inhibitors of fibrin polymerization//.!. Mtd. Chem. -1981.-V. 24. P. 322-327.

195. Huang T.F., Holt J.C., Kirby E.P., Niewiarowski S. Trigramin: primary structure and its inhibition of von Willebrand factor binding to glycoprotein Ilb/IIIa complexion human platelets //Biochemistry-- — 1989.-Vol.28, N2.-P.661-6.

196. Huang T.F., Niewiarowski S. Disintegrins: the naturally-occurring antagonists of platelet fibrinogen receptor //J. Toxicol. Toxin Rev. 1994.-Vol.13 -P.253-273.

197. Fluisse M.G. Thrombopenie incluite par l'heparine standard. Tentative therapeutique a l'aide il'une heparine de bas moleculaire // Press med. 1983. - Vol. 12. - P. 643-645.

198. Huisse M.G., Guillin M., Bereaud A. et al. Heparin-associated thrombocytopenia in vivo effects of different molecular weight heparin fractions // Ibid. 1982. - N 4. - P. 485-490.

199. Huul R.S. Therapeutic use of low molecular weight heparins: the knowledge to date and their application to therapy // International Symposium on Low Molecular Weight Heparins and Related Polysaccharides. Munich, 1991. - P. 21.

200. Hynes R.O. Integrins: a family of cell surface receptors //Cell. -1987.-Vol. 48, N4.-P. 549.

201. Jaffe E.A., Weksler B.B. Recovery of endothelial cell prostacyclin production after inhibition by low doses of aspirin //J. Clin. Invest. 1979. - Vol.63, N.3. - P.532-5.

202. Jaques L. The new underrstanding of drug heparin//Chest. — 1985.-V. 88.-N5.-P. 751-754.

203. Kaiser B., Markwardt F. Antithrombotic and haemorrhagic effects of the naturally occuring thrombin inhibitor hirudin // Folia Haemat. 1988. - Vol. 115, N 1-2. - P. 41-46.

204. Kelton J., Levine M. Heparin-induced thrombocytopenia // Sem. Thrombosis and Haemostasis. 1986. - Vol. 12, N 1. - P. 59-62.

205. Kelton J.G. Acute thrombocytopenia and thrombosis. Heparin-induced thrombocytopenia and thrombotic thrombocytopenic purpura // Amer. N.-Y. Acad. Sci. 1987. - Vol. 509. - P. 205-211.

206. Kher A., Bara L., Samama M. Les heparines de bas poid moleculaire // Pathol, biol. 1986. - Vol. 34, N 1. - P. 61-69.

207. King D.L., Kelton J.G. Heparin-associated thrombocytopenia // Ann. Intern. Med. 1984. - Vol. 100. - P. 535-540.

208. Krupinski K., Breddin H.K., Casu B. Anticoagulant and antithrombotic effects of chemically modified heparins and pentosanpoly-sulfate // Haemostasis. 1990. - Vol. 20, N 2. - P. 81-92.

209. Kuyas C., Doolittle R. A syntetic Gly-Pro-Arg derivative that binds to plasma albumin and inhibits fibrin formation//Thromb. Haemost. 1983.-N l.-P. 356-356.

210. Lam S. C.-T., Plow E.F., Ginsberg E.H. Platelet membrane GP lib heavy chain forms a complex with GP Ilia that binds Arg-Gly-Asp peptides//Blood. 1989. - 733. - 6. - P. 1513-1518.

211. Laudano A., Doolittle R. Syntetic pptide derivates that bing fibrinogen and prevent the polymerization of fibrin monomers//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978. - N 7. - P. 3085-3098.

212. Leake L.D. The leeches as a scientific tool // Endevour. 1983. -N7.-P. 88-93.

213. Leger D., Karniguian A., Soria J. Inhibition of some activaties of thrombin by a collagen-derived octapeptide//Haemostasis. 1985. -N 5.-P. 293-299.

214. Lerou J., Leelers M.H., Delahousse B. et al. Treatment of heparin associated thrombocytopenia and thrombosis with low molecular weight heparin (CY-216) // Semin. Thrombos. Haemost. 1985. -Vol. 11, N 3. - P. 326.

215. Leung L., Bennett J.S., Schwartz B. New antithrombotic agents //ASH Educational Materials 1998. - P.136-153.

216. Levine M. Low molecular weight heparin // Agressologie. -1989. Vol. 30, N 6. - P. 347-348.

217. Lewis B., Grassman E., Wrona L., Rangel Y. Novastan anticoagulation during renal stent implant in a patient with heparin-induced thrombocytopenia//Blood Coagulation And Fibrinolysis. 1997. - V. 8. - N. l.-P. 54-58.

218. Lewis S., Higgins D., Shafer J. Effect of EDTA, Gly-Pro-Arg-Pro and aminoacid replecement on the thrombin catalysed release of fibrinopeptides//Molecular biology of fibrinogen and fibrin. New York. - 1983.-P. 669-670.

219. Liem T.K., Teel R., Shulcla S., Silver D. The glycoprotein Ilb/IIIa antagonist c7E3 inhibits platelet aggregation in the presence of heparin-associated antibodies //J. Vase. Surg. 1997. - Vol.25, N. 1- P. 124-30.

220. Losito R., Losito C. Molecular weight of heparin versus biologic activity. Some additional considerations // Semin. thrombosis and hemostasis. 1985. - Vol. 11, N 1. - P.29-33.

221. Lynch J., Sitko G., Lehman E., Vlasuk G. Primary prevention of coronary arterial thrombosis with the factor Xa inhibitor rTAP in a canine electrolytic injuri model//Thromb. Haemost. 1995. - V. 74. -N2.-P. 640-645.

222. Machin S.J., Verstrate M. Clinical Usage of heparin. Present and future frends // Scand. J. Haematol. 1980. - Vol. 25. - P. 188.

223. Mahadoo J. Endothelial sequestration of heparin administered136by the intrapulmonary route 11 Atherosclerosis. 1981. - Vol. 38, N 7. -P. 197-200.

224. Mao S., Huang J., Welebob C., Neeper M., Garsky V., Shafer J. Identification and characterization of variants of tick anticoagulant peptide with increased inhibitory potency toward human factor Xa//Biochemistry. 1995.-V. 34.-N 15.-P. 5098-5103.

225. March N., Gaffney P., Stiff G. The effect of pentosan polysul-phate (SPSU) on the fibrinolytic enzyme system // Haemostasis. -1984.-Vol. 14, N 1.-P. 36-38.

226. Martin P.D., Robertson W„ Turk D., Huber R., Bode W., Edwards B.F. The structure of residues 7-16 of the A alpha-chain of human fibrinogen bound to bovine thrombin at 2.3-A resolution //J. Biol. Chem. 1992. - Vol.267, N.l 1.-P.7911-20.

227. Massonef-Castel S., Pelissier E., Dreyfus G. et al. Prophylaxic thromboembolism of low molecular weight heparin // Lancet. 1984. -Vol. 1. -P. 1182-1183.

228. McKay D., Laurell C. The interaction of heparin with plasma proteins. Demonstration of different binding sites for antithrombin III complex and clinical//Med. 1980. -V. 95.-N 11.-P. 69-80.

229. Meraihi Z., Lutz O., Frey A., Buch A.C. Heparin: biochemical acts // Arch. Int. Pharmac. 1989. - Vol. 297. - P. 286-293.

230. Miale J., Mende T. A syntetic iodinated polypeptides that inhibits polymerization of fibrinogen//Blut. 1971. - N 2. - P. 76-79.

231. Miraglia C., Greenberg C. Measurement of blood coagulation137factor XHIa formation in plasma containing Gly-Pro-Arg-Pro // Anal. Biochem. 1985. -N 1. - P. 165-171.

232. Morin Y. Fraxiparine: analytical and structural data. Pharmacology, clinical trials. Paris, 1987. - 14 p.

233. Mousa S.A., De Grado W.F., Mu D.X., Kapil R.P., Lucchesi B.R., Reilly T.M. Oral antiplatelet, antithrombotic efficacy of DMP 728, a novel platelet GPIIb/IIIa antagonist //Circulation 1996. -Vol.93, N.3.-P.537-43.

234. Newman P.J., Allen R.W., Kahn R.A. et al. Quantitation of membrane GP Ilia on intact human platelets using the monoclonal antibody // Blood. 1985. - 65. - 1. - P. 227-232.

235. Niewiarowski S., McLane M.A., Kloczwiak M., Stewart G.J. Disintegrins and other naturally occurring antagonists of platelet fibrinogen receptors //Semin. Hematol. 1994. - Vol.31, N.4. - P.289-300.

236. Nugaent D.J., Kunicki T.J., Berglund C. et al. A human monoclonal autoantibody recognizes a neoantigen on GP IIIA expressed on stored an activated platelets // Blood. 1987. - 70. - 1. - P. 16-22.

237. Okamoto S., Hijikata A., Kinjo K., Kikumoto R. A novel series of synthetic thrombininhibitors kaving extremeli potent and highly selective action// Kobe J. Med. Sci. 1977. - Vol. 21. - P. 43-51.

238. O'Toole T.E., Katagiri Y., Faull R.J., Peter K., Tamura R., Quaranta V., Loftus J.C., Shattil S.J., Ginsberg M.H. Integrin cytoplasmic domains mediate inside-out signal transduction //J. Cell. Biol.- 1994.-Vol.124, N.6- P. 1047-59.

239. Patrono C. Aspirin as an antiplatelet drug //N. Engl. J. Med. -1994. Vol.330, N. 18. - P.1287-1294.

240. Perutelli P., Pisano E., Mon P.Gr Inhibizione recettore specific della funzione piastrinica antagonisti delle GP Ilb/IIIa: Una rassegna // Gaslini. 1994. - 26. - 3. - P. 162-169.

241. Phillips D.R., Charo I.F., Parise L.V., Fitzgerald L.A. The platelet membrane glycoprotein Ilb-IIIa complex //Blood 1988. -Vol. 71 N4. -P. 831-43.

242. Phillips D.R., Scarborough R.M. Clinical pharmacology of epti-fibatide //Am. J. Cardiol. 1997. - Vol.80, N.4A. - P.l 1B-20B.

243. Pierschbacher M.D., Ruoslahti E. Cell attachment activity of fi-bronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule //Nature 1984. - Vol.309, N5963. - P30-33.

244. Plow E.F., D'Souza S.E., Ginsberg M.H. Ligand binding to GPIIb-IIIa: a status report //Semin. Thromb. Hemost. 1992. -Vol.18, N3.-P.324-32.

245. Plow E.F., Ginsberg M.H. Specific and saturable binding of plasma fibronectin to thrombin-stimulated human platelets // J. Biol. Chem. 1981. - Vol. 256, N18, - P. 9477-9482.

246. Plow E.F., Srouji A.H., Meyer D., Marguerie G., Ginsberg M.H. Evidence that three adhesive proteins interact with a common recognition site on activated platelets //J. Biol. Chem. 1984. -Vol.259, N9.-P.5388-91.

247. PRISM Study Investigators: Platelet Receptor Inhibition in Ischemic Syndrome Management. A comparison of aspirin plus ti-rofiban with aspirin plus heparin for unstable angina //N. Engl. J. Med. 1998. - Vol.338, N.21. - P.1498-505.

248. Root-Bernstein R., Westall R. Fibrinopeptide A binds Gly-Pro-Arg-Pro//Proc. Nat. Acad.Sci. USA. 1980. - V. 81. - P. 4339-4342.

249. Rostin M., Moutestruc J., Monin G. et al. Fraxiparine clinical applications // Fundam. Clin. Pharmacol. - 1990. - N 4. - P. 17-23.

250. Ruoslahti E., Pierschbacher M.D. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins //Science 1987.-Vol.238, N.4826. -P.491-7.

251. Samama M., Hemker H.C. Low molecular weight heparin -clinical use // Haemostasis. 1988. - Vol. 26, N 4. - P. 4-14.

252. Sandercock P. Antiplatelet therapy with aspirin in acute ischeamic stroke //Thromb. Haemost. 1997. - Vol.78, N.l. - P. 180182.

253. Sass G., Pepper D.S., Cashi J.D. Investigation on antithrombin in normal plasma and serum // Brit. J. Haematol. 1979. - Vol. 30, N 6. - P. 265-272.

254. Schafer A.I. The hypercoagulable state // Ann. Later. Med. -1985. Vol. 102, N 6. - P. 814-828.

255. Schraden J. Nidermolekulare heparine // Arzmimittel therapie. -1988.-Bd. 6, N5.-S. 147-155.

256. Schror K. Antiplatelet drugs. A comparative review //Drugs -1995. Vol.50, N. 1 - P.7-28.

257. Shafer J., Higgins D., Lewis S. Study steit kinetic parameters for the thrombin catalyzed conversion of human fibrinogen to fi-brin//Thromb. a. Haemost. 1983.-N 1.-P. 186-186.

258. Smith R., Green J. Actions and interactions of antithrombin and heparin//Brit. J. Haemotol. 1987. - V. 66, N 2. - P. 415-421.

259. Stein R., Preiss D.U. Antikoagulatien // Krankenhous Arzt. -1984. Bd. 57. - S. 24-32.

260. Stremberger A., Stohr R., Ziegler L., Blumel G. Actionof radix Salvia milthiorrhizae decoctions on cjagulation and fibrinoly-sis//Thromb. Haemost. 1983. -V. 50. -N 1. - P. 198-198.

261. Takagi K., Suzuki S. Anticoagulant peptides jbtained from human fibrinogen degradation products by plasmin//Thromb. Res. -1979.-N 16.-P. 737-746.

262. Tanaka S., Tomoike H. Antithrombotic and haemorrhagic effects of hirudin// Jpn. Heart J. 1988. - Vol. 29. - P. 77-79.

263. Tandon N.N., Kralisz U., Jamieson G.A. Identification of glycoprotein IV-(CD36) as-a-primary receptor for platelet-collagenjidiie^ sion //J. Biol. Chem. 1989. - Vol. 264, N 13. - P. 7576-83.

264. Teng C.M., Huang T.F. Snake venom constituents that affect platelet function //Platelets 1991. - Vol.2 - P.77-87.

265. The CAPTURE Study: Randomised placebo-controlled trial of abciximab before and during coronary intervention in refractory unstable angina//Lancet 1997. - Vol.349, N.9063 - P. 1429-35.

266. The EPIC Investigation. Use of a monoclonal antibody directed against the platelet glycoprotein Ilb/IIIa receptor in high-risk coronary angioplasty //N. Engl. J. Med. 1994. - Vol.330,N14. - P. 956-61.

267. The EPILOG Investigators: Platelet glycoprotein Ilb/IIIa receptor blockade and low-dose heparin during percutaneous coronary revascularization //N. Engl. J. Med. 1997. - Vol.336, N.24 - P. 168996.

268. Thomas D.P., Merton R.E. Effects of low molecular weight--heparins // Thrombos. Res. 1985. - Vol. 44, N 6. - P. 234-238^

269. Tsao P.W., Bozarth J.M., Jackson S.A., Forsythe M.S., Flint S.K., Mousa S.A. Platelet GPIIb/IIIa receptor occupancy studies using a novel fluoresceinated cyclic Arg-Gly-Asp peptide //Thromb. Res. -1995. Vol.77, N.6 - P.543-56.

270. Uszynsky M. Anticoagulant activity peptides from the human placenta//Thromb. Res. 1979. - V. 16. - P. 689-694.

271. Van Ryn Me Kenna J., Ofosu F., Hirsh J., Buchman M. Anti144thrombotic effects of glycosaminoglycans with different degrees of sulphation//Brit. J. Haematol. 1989. - Vol. 71, N 2. - P. 265-269.

272. Van Zyl W.B., Pretorius G.H., Hartmann M., Kotze H.F. Production of a recombinant antithrombotic and fibrinolytic protein, PLATSAK, in Escherichia coli //Thromb. Res. 1997. - Vol.88, N.5. - P.419-26.

273. Vane J.R. Inhibition of prostaglandin synthesis as a mechanism of action for aspirin-like drugs //Nat. New. Biol. 1971. - Vol.231, N.25. - P.2352-6.

274. Verstrate M. Clinical usage of heparin // Triangle. 1984. - Vol. 23, N2.-P. 49-55.

275. Verstrate M., Machin S.J. Clinical Usage of heparin. Present and future frends // Scand. J. Haematol. 1980. - Vol. 25. - P. 188.

276. Vlasuk J. Structural and functional characterization of tick anticoagulant peptide (TAP): a potent and selective inhibitor of blood coagulation factor Xa//Thromb. Haemost. 1993. - V. 70. - N 1. - P. 212-216.

277. Vun C., Evans S., Chong B. Cross-reactivity study of low molecular weight heparins and heparinoid in heparin-induced thrombo-cytopenia//Thromb. Res. 1996. -V. 81. -N 5. - P. 525-532.

278. Walenga J., Fasanella A., Iqbal O., Hoppensteadt D., Ahmad S., Wallis D., Bakhos M. Coagulation laboratory testing in patients treated with argatroban//Semin. Thromb. Haemost. 1999. - V. 25. -Suppl. l.-P. 61-66.

279. Walenga J.M., Fareed J., Hoppensteadt D et al. / Fraxiparine Recent Pharmacological and Clinical Data. Stuttgart, 1990. - P. 103118.

280. Wang J., Hsu M., Tery C. Antihemostatic effect of Hsien-Ho-Tsao (Agrimonia pilosa) // Amer. J. Clin. Med. 1984. - Vol. 12, N 1-4.-P. 116-121.

281. Watt K., Cotrell B., Strong D., Doolittle R. Amino acid sequence studies on the a-chein of human fibrinogen//Biochemistry. -1979.-N24.-P. 5410-5416.

282. Wehmeier A., Schneider W. Platelet volume parameters as a diagnostic tool: the influence of anticoagulation and storage conditions on platelet impedance volume //Klin. Wochenschr. 1989. -Vol.67, N19,-P.980-4.

283. Weinstein M., Deykin D. Quantitative abnormality of an a-Chain molecular weight from in the fibrinogen of cirrhotic pa-tients//Brit. J. Haematol. 1978. -V. 40. - P. 617-630.

284. Weisel J.W., Nagaswami C., Vilaire G., Bennett J.S. Examination of the platelet membrane glycoprotein Ilb-lila complex and its interaction with fibrinogen and other ligands by electron microscopy //J. Biol. Chem. 1992. - Vol.267, N23. - P. 16637-43.

285. Wenkel-Drace J.D. Evidence for a cycking receptor pool // Amer. J. Pathol. 1990. - 136. -1. - P. 61-70.

286. Yeh C.H., Peng H.C., Yih J.B., Huang T.F. A new short chain RGD-containing disintegrin, accutin, inhibits the common pathway of human platelet aggregation //Biochim. Biophys. Acta. 1998. -Vol. 1425, N.3.-P.493-504.

287. AT III антитромбин III BP - время рекальцификации ВС - время самосборки фибрина Г - гепарин1. ЕА единицы активности1. С сапропель1. ТВ тромбиновое время1. ТЦ тромбоциты1. ТП тромбопластин1. ФБ фибрин1. ФГ фибриногенi эффективность торможения

Информация о работе

Бушин, Антон Евгеньевич
кандидата медицинских наук
Тюмень, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Эффекторы свертывания крови из сапропеля: влияние на плазменный, тромбоцитарный гемостаз и некоторые жизненные функции лабораторных животных (экспериментальное исследование) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы