Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ данных атомно-силовой микроскопии с помощью компьютерного моделирования

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Анализ данных атомно-силовой микроскопии с помощью компьютерного моделирования"

На правах рукописи

Толстова Анна Павловна

АНАЛИЗ ДАННЫХ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ С ПОМОЩЬЮ КОМПЬЮТЕРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ

Специальность 03.01.02 — «Биофизика»,

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

11 НОЯ 2015

Москва - 2015

005564384

Работа выполнена в МГУ им М.В. Ломоносова, Физический факультет, Кафедра биофизики

Твердислов Всеволод Александрович, доктор физико-математических наук, профессор. Дубровин Евгений Владимирович, кандидат физико-математических наук. Мазо Михаил Абрамович, кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник, руководитель группы Института химической физики им. Н.Н.Семенова РАН, Быстрое Владимир Сергеевич, доктор физико-математических наук, ведущий научный сотрудник, руководитель Группы компьютерного моделирования молекулярных наноструктур и биосистем ОПИТ Института математических проблем биологии РАН

Ведущая организация : Институт Биохимической физики им. Н.М.

Эмануэля Российской академии наук

Защита состоится 17 декабря 2015 года в 17-00 на заседании диссертационного совета Д 501.002.11 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 2, физический факультет МГУ, ЦФА

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова и на сайте диссертационного совета http://www.phys.msu.ru/rus/research/disser/sovet-0501-002-11/

Автореферат разослан_

(дата)

Ученый секретарь

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время трехмерная структура белков и белковых комплексов является объектом изучения сразу нескольких областей науки, от структурной биологии до биоинженерии и биоинформатики. В связи с ростом производительности компьютеров стало возможным производить весьма сложные и ресурсоемкие компьютерные эксперименты по изучению трехмерной структуры белков с атомистическим разрешением. Компьютерное моделирование, а именно молекулярная динамика, метод Монте-Карло и докинг, сдвинули фокус в изучении белковых структур и их конформационных изменений от экспериментов к теории.

Однако, далеко не все известные науке белки могут участвовать в моделях. Исходными данными для компьютерных экспериментов служат данные высокого разрешения реальных экспериментов, а именно рентгеноструктурного анализа (РСА) и ядерно-магнитного резонанса (ЯМР). Появление каждой структуры в компьютерных банках данных структур белков - трудоемкий и долгий процесс. При этом, большие белки не исследуются методом ЯМР, а РСА позволяет получить структуру только малоподвижных частей белков, оставляя на месте подвижных частей пробелы. Следует также отметить, что методы секвенирования последних лет позволяют накапливать данные об аминокислотной последовательности белков с экспоненциально растущей скоростью. Наблюдается все возрастающий разрыв между количеством известных последовательностей и количеством известных структур. Для устранения этой проблемы возникла целая наука по предсказанию структур белков по их аминокислотной последовательности. На данный момент стало возможным предсказать структуру отдельных небольших пропусков в аминокислотной последовательности трехмерных структур белков, полученных методом РСА. Тем не менее, существуют работы, доказывающие, что предсказанные

структуры близки скорее к своим прототипам, т.е. как правило к гомологичным белкам, чем к белку-цели, а поэтому требуют экспериментальной верификации. Все вместе это характеризует некоторую проблему в области структурной биологии: появились новые многообещающие и быстрые методы компьютерного моделирования, которые, тем не менее, оказываются напрямую зависимы от экспериментальных данных.

Наиболее адекватным экспериментальным методом, позволяющим изучать конформационные особенности отдельных крупных белков и белковых комплексов in vitro и в режиме реального времени является атомно-силовая микроскопия (АСМ). В качестве достоинств следует упомянуть относительную простоту и дешевизну метода, а в качестве недостатка -низкое разрешение и необходимость адсорбции на поверхность объектов изучения. В последние годы ряд работ по модификации поверхностей для АСМ позволил существенно увеличить возможности метода. Становится возможным различать отдельные домены в структуре единичной белковой молекулы, узнавать их характерные размеры. Исследовать структуру, свойства особенности и процесс формирования белковых комплексов.

Цель данной работы - выяснить физические особенности взаимодействия класса белков, имеющих неструктурированные участки, in vitro и в условиях пространственных ограничений (на подложке) с помощью атомно-силовой микроскопии и полноатомной молекулярной динамики для развития методологии анализа данных (преодоление молекулярного разрешения, учёта роли подложки) атомно-силовой микроскопии.

Для этого были выбраны два белка, о70-субъединица РНК-полимеразы Escherichia coli и фибриноген человека. Оба белка обнаруживают склонность к амилоидному фибриллообразованию в нативных условиях, которое было хорошо изучено в АСМ-исследованиях. Оба белка имеют пропуски в

трехмерной структуре: у фибриногена отсутствует информация об аС-цепях, предполагаемых участках связывания между белками внутри фибриллы. В связи с этим, в данной диссертации исследовался процесс адсорбции одной молекулы фибриногена на различные по своим физическим свойствам поверхности методами АСМ и молекулярной динамики с последующим сравнением полученных результатов.

У о70-субъединицы РНК-полимеразы E.coli не расшифрованы два небольших участка внутри белковой глобулы. В данной работе исследовалось фибриллообразование а70-субъединицы методами АСМ и компьютерного моделирования с последующим сравнением результатов. Для выяснения возможной применимости результатов компьютерного моделирования к трактовке и повышения информативности данных АСМ было проведено моделирование адсорбции молекулы белка лизоцима из куриного белка, и сравнение полученных результатов с данными АСМ. Лизоцим хорошо изучен и не имеет пропусков в структуре. В соответствии с вышеизложенной целью были сформулированы следующие задачи:

Были поставлены следующие научные задачи:

1) Анализ состояния методов молекулярной динамики и атомно-силовой микроскопии в приложении к исследованию класса белков с неструктурированными участками.

2) Разработка метода молекулярной динамики в приложении к сравнению данных с данными атомно-силовой микроскопии

3) Исследование биологически важных конформаций класса белков, имеющих неструктурированные участки, методами молекулярной динамики и атомно-силовой микроскопии

Научная новизна

1. Впервые построена молекулярная модель фибриллы о70-

субъединицы РНК полимеразы E.coli.

2. Впервые построены модели о70-субъединицы РНК полимеразы E.coli с восстановленными участками структуры при разной ионной силе.

3. Построена модель синтетической молекулы Graphite Modifier(GM).

4. Впервые промоделирована адсорбция GM на поверхность графита.

5. Впервые построена модель слюды, покрытой гексаметилдисилозаном.

6. Получена модель адсорбции лизоцима на поверхность слюды.

7. Предложен метод получения топологии поверхности адсорбированного белка.

Научная и практическая значимость работы

Результаты работы имеют как практическую, так и научную значимость.

Результаты экспериментов, а именно выяснение характерных мест связывания молекул о70-субъединицы РНК полимеразы E.coli ,

формирующих структуры типа «бусина на нити», которые затем предположительно сворачиваются в спираль, формирующую фибриллу, представляют ценность как для ученых, занимающихся исследованием комплекса бактериальной РНК полимеразы и выяснением свойств и функций отдельных белков в этом комплексе, так и для ученых, решающих общую для многих белков проблему возникновения амилоидных фибрилл.

Данные об адсорбции фибриногена на различные поверхности хорошо коррелируют с данными АСМ-исследований и дополняют их, позволяя сделать вывод о характере взаимодействия с подложками аС-цепей, подтверждая таким образом одну из двух теорий, разрабатываемых на данный момент ведущими учеными в этой области. Поскольку сами аС-цепи не фигурировали в компьютерном исследовании, выполненная работа

открывает перспективы для повышения точности и адекватности метода молекулярной динамики.

Данные об адсорбции лизоцима на поверхность слюды позволяют в перспективе перейти к автоматическому объединению данных АСМ и молекулярной динамики и повышению информативности АСМ.

Все вместе проведенные компьютерные и АСМ эксперименты представляют научную и методологическую ценность, внося вклад в развитие обоих методов и показывая перспективность объединения их результатов.

Положения, выносимые на защиту

1) Молекулярные модели фибрилл а70-субъединицы РНК

полимеразы E.coli, позволяющие исследовать ранние стадии амилоидоза.

2) Уточненные молекулярные модели а70-субъединицы РНК полимеразы E.coli с восстановленными участками в водной среде при разных уровнях ионной силы, позволяющие исследовать процесс самоингибирования белка при высоких концентрациях солей.

3) Молекулярные модели адсорбированных белков фибриногена и лизоцима на поверхности слюды и других исследуемых в АСМ подложек.

4) Молекулярные модели подложек свежесколотого графита, графита, покрытого слоем молекул GM, свежесколотой слюды и слюды, покрытой гексаметилдисилозаном, позволяющие проводить моделирование адсорбции белков.

5) Метод получения топологии поверхности молекулярных моделей адсорбированных белков.

Личный вклад диссертанта

АСМ-изображения лизоцима получены и обработаны автором лично. Все модели в среде Gromacs построены автором лично.

Параметризация подложек и подбор парциальных зарядов, а также конструирование новых молекул и подложек проведены автором лично.

Построение топологий поверхности адсорбированных белков и сравнение с данными АСМ проведено автором лично.

Данные АСМ по адсорбции фибриногена на исследуемые поверхности получены совместно с Протопоповой Анной Дмитриевной.

Данные АСМ по фибриллообразованию сигма-фактора получены совместно с Кузьминой Натальей Викторовной.

Модели в среде NAMD построены совместно с Оферкиньтм Игорем Владимировичем.

Все результаты, составляющие основное содержание диссертации, получены автором самостоятельно.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались на следующих научных конференциях и школах:

1. VIII Международная конференция "Проблемы биологической физики" 27-28 ноября 2009 Москва, Россия

2. Международная конференция Ломоносов 2010, Выставка инновационных проектов и достижений молодых ученых СНГ, 12 апреля 2010, Москва, Россия

3. Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии 26-30 апреля 2010 , Севастополь, Украина

4. Четвертая международная конференция "Современные достижения бионаноскопии", 15-18 июня 2010, Москва, Россия

5. Международная конференция Ломоносов 2011, 11 — 15 апреля 2011, Москва, Россия

6. Пятая международная конференция «Современные достижения бионаноскопии», 15-17 июня 2011 Москва, Россия

7. 17th International Biophysics Congress, 31 октября - 3 ноября 2011 Пекин, Китай

8. 2-я Международная школа по физике поверхности «Технологии и измерения атомного масштаба», 1-7 октября 2012 Сочи, Россия

9. Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова", 14-17 ноября 2011, Москва, Россия

10. Международная конференция Ломоносов 2015, 13-17 апреля 2015, Москва, Россия

11. Международная конференция Super resolution in different dimensions, 2-3 июня 2015, Москва, Россия

12. Международная конференция 18th International Conference of поп contact Atomic Force Microscopy, 7-11 сентября 2015, Кассис, Франция Публикации. По теме диссертационой работы опубликовано 15 работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень ВАК, 1 статья в нерецензируемом журнале, 1 публикация в сборнике трудов и 11 публикаций в сборниках тезисов докладов конференций.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения и списка цитируемой литературы из 151 наименования. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста и включает 32 рисунка и 10 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении излагается актуальность выбранной темы диссертации, ее научная новизна и практическая значимость, определяются ее цели и задачи.

Первая глава диссертации представляет собой обзор литературы и состоит из пяти разделов, содержащих описание методов молекулярной динамики и атомно-силовой микроскопии, их областей применения и возможностей. Также в конце главы имеется заключение, содержащее постановку задачи диссертационной работы, вытекающую из проведенного анализа современных работ на тему исследования.

Вторая глава посвящена вопросам применимости метода компьютерного моделирования белков с неструктурированными участками, полученных методом РСА, к совместной трактовке данных, полученных экспериментальными методами. Рассматриваются проблемы, вытекающие из несовершенств исходных структур белков для моделирования, а также некоторые ограничения молекулярной динамики в связи с несовершенством баз данных структур твердых тел.

Раздел 2.1 отвечает на вопрос, возможно ли вообще, имея кристаллическую структуру с невысоким разрешением (больше 2 А), полученную методом РСА, уточнить ее только с помощью компьютерного моделирования. Для ответа на этот вопрос была сделана выборка белков, у которых нет неструктурированных участков, а также есть несколько структур в банках данных, полученных методом РСА с разным разрешением. Для таких белков проводилась процедура минимизации энергии. Эта процедура смещает белок по энергетической плоскости, отражающей все возможные конформации и промежуточные состояния белка, в энергетический минимум. Справедливо предположить, что это может быть глобальный энергетический минимум, соответствующий точной укладке белка в кристалле, когда координаты каждого атома в модели и в реальном кристалле совпадают. Однако, путем сравнения минимизированных, не минимизированных и сгенерированных, а затем случайно возмущенных, структур было выяснено, что минимизация энергии сама по себе не приводит белок в глобальный энергетический минимум в энергетическом пространстве, а значит, идеально разрешенная структура не может быть достигнута. Следовательно, любое моделирование с использованием данных РСА использует не тот белок, который участвует в реальных экспериментах, а несколько отличающуюся структуру, а значит, требует верификации экспериментом.

В разделе 2.2. рассмотрена вторая проблема структур белков, полученных методом РСА, — наличие пропусков в структуре, соответствующих

подвижным областям белка. Существующие на данный момент методы предсказания структуры белка по его аминокислотной последовательности приводят к большим различиям между предсказанными и существующими в реальности участками. Тем не менее, при наличии небольших пропусков, выбранный для анализа белок о"70-субъединицы РНК-полимеразы Е. coli демонстрировал тот же характер изменений структуры при изменении ионной силы раствора, что и в многочисленных ЯМР-экспериментах, биохимических и генных экспериментах, подтверждая наличие активной и неактивной форм домена, отвечающего за связывание с ДНК .

Рисунок 1. Результаты моделирования полной с7и-субъединицы после 150 не при разных концентрациях солей: А - начальная структура после добавления недостающих участков пептидной цепн, Б - с7"-субъединица после 150 не моделирования с нулевой концентрацией ионов, В - в 20мМ NaCl и 5 мМ MgCI2, Г - в 40 мМ NaCl, Д - в 40 мМ NaCl и 5 мМ MgCI2. Цветом выделены

домены: 1.1(7-100АК) - зеленый, NCR (127-370) - красный, 2.3(416-434АК) - оранжевый, 2.4(435-453АК) - желтый, 4.1(536-565 А К) - розовый, 4.2(566-613 АК) - голубой.

Для получения полной структуры белка был проведен анализ имеющихся 20

структур в банке данных, после чего были выбраны наиболее близкие по

результатам выравнивания структуры с перекрывающимися областями в

районе пропусков, и отдельные области белка были перенесены из одной

11

структуры в другую. Это позволило уменьшить области для предсказания, увеличив, однако, их число. Далее, неполные и полные структуры участвовали в моделировании при разной концентрации ионов в растворе в течение 100-150 не (Рис.1).

Рисунки 1 А, Г, Д демонстрируют активную форму о70-субъединицы, когда концевой домен 4 белка свободен и не взаимодействует с доменом NCR при высоких концентрациях солей, а рисунки 1 Б и В - неактивную, когда концевой домен 4 ингибирован областью сильного отрицательного заряда из домена NCR при низких концентрациях солей. Похожий результат был получен и для неполной структуры о70 субъединицы. Однако там, из-за отсутствия связи с остальной частью белка, домен 1.1 в случае низкой концентрации соли также приближался к домену 4. То, что полная и неполная структуры продемонстрировали одинаковый характер измерений в зависимости от ионной силы, говорит о большем влиянии электростатики на процесс фибриллообразования, чем специфических водородных связей, возникающих, по данным литературы, между 1 и 4 доменами.

Полученный результат показывает успешность применения молекулярной динамики для трактовки экспериментальных данных. Тем не менее, таким сравнением невозможно добиться окончательного ответа на вопрос, какова структура неизвестных областей белка. Для этого нужен экспериментальный метод, позволяющий распознать трехмерную структуру отдельных областей белков. Современная атомно-силовая микроскопия далеко шагнула в этой области, с применением специальных покрытий, увеличивающих контрастность изображения. Однако, не следует забывать, что на рельеф поверхности белка, полученного в АСМ, влияет не только реальная топология объекта, но и электростатика, и его упругость, поэтому учет этих взаимодействий белка с подложкой и белка с кантилевером очень важен для интерпретации данных АСМ.

Раздел 2.3 посвящен вопросу разработки методов моделирования адсорбции белков на различные использующиеся в АСМ поверхности. Решение проблемы сводится, в основном, к получению топологий поверхностей, для чего необходимо дополнять существующие силовые поля, наилучшим образом подходящие для моделирования белков, параметрами для моделирования твердых тел. Для простых подложек, использующихся в АСМ, как графит или слюда, можно просто взять данные из статей и справочников, и преобразовать коэффициенты в требуемые единицы измерения. В случае композитных подложек, полученных методом химической обработки поверхности, требуется создание новой параметризации для силового поля. В случае композитных подложек, созданных методом адсорбции полимерного слоя на поверхность, требуется моделирование до факта получения искомой композитной поверхности. Все три варианта получения подложек для АСМ были использованы в компьютерном эксперименте. Моделирование подложек из графита и слюды демонстрировало первый вариант простых подложек, моделирование слюды, модифицированной гексаметилдисилозаном, демонстрировало вариант химической обработки поверхности, а моделирование графита, покрытого

Рисунок 2. Сконструированные в силовом поле AMBER подложки: А - оксид кремния, моделирующий слюду, Б - оксид кремния, покрытый гексаметилдисилозаном, В - графит с адсорбированными на него молекулами GM

слоем композитных молекул Graphite modifier, демонстрировало вариант получения подложек методом адсорбции (Рис.2). Все сконструированные подложки показали высокую степень соответствия экспериментам. Они были стабильны, имели тот же поверхностный заряд, что и в экспериментах и такой же характер взаимодействия с белками.

Для исследования адсорбции фибриногена на поверхность GM была сконструирована молекула GM и проведено моделирование сорбции ее на графит. Молекула GM имеет следующую структуру: (CH2)n(NCH2CO)m-NH2 (Рис.3 А)

Рисунок 3. Молекула GM (А) и адсорбированные молекулы после 10 не моделирования в воде (Б)

Для получения слоя молекул на графите было проведено моделирование системы из 100 молекул, воды и однослойного графита в течение 20 не, а также системы из 200 молекул ОМ, воды и однослойного графита, полученной путем добавления к первой системе еще 100 молекул через 5 не после начала моделирования. Эта система моделировалась в общей сложности 15 не. В итоге 93% молекул адсорбировались на графит. На рис. 3 Б видно, что СМ образует на поверхности графита структуры, напоминающие шпильки. Обнаружение шпилек, возможно, объясняет ламели, из которых сострит плотный слой СМ на графите. Следует отметить, что большая величина стандартного отклонения от среднего

значения для длины шпильки обусловлена тем, что система находится на начальных стадиях адсорбции. Для более точных измерений требуется привести систему в состояние равновесия, что подразумевает продолжение моделирования. Можно заметить, что молекулы GM в целом имеют тенденцию выстраиваться по осям симметрии графита, что также подтверждается АСМ-экспериментами.

В Главе 3 приведены данные сравнения экспериментов молекулярной динамики с данными АСМ-экспериментов. Глава имеет три раздела, по числу объектов исследования.

Раздел 3.1 представляет собой описание и анализ результатов исследования фибриллообразования о'"-субъединицы РНК-полимеразы E.coli. Представлены сведения о свойствах, структуре и роли в бактериальной РНК-полимеразе о70-субъединицы. На рисунке 4 приводятся данные АСМ-экспериментов по адсорбции фибрилл а'°-субъединицы на графит, полученные совместно с Кузьминой Н.В. (кафедра биофизики физического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова).

Рисунок 4. АСМ-изображение червеобразпых фибрилл сигма-субъедииицы на графите в7"-субъединицы РНКП Е.соП в буфере с концентрацией солей 20 мМ и 5 мМ полученные (а)

в том же буфере (б) на воздухе после высушивания образна. В средней колонке представлены увеличенные изображения червеобразных структур из областей, отмеченных на АСМ-изображениях

слева с соответствующими римскими цифрами (размер увеличенных областей 150x150 нм). Правая колонка демонстрирует распределение высот вдоль белых линий с центральных изображений.

Задачей данной работы было получить адекватную модель фибриллообразования а70-субъединицы, объясняющую данные эксперимента.

Компьютерное моделирование проводилось методом молекулярной динамики в среде Оготасз с силовым полем АтЬег995Ы1с1п. Использовалась структура белка 4ЮС из банка данных белковых структур. Продуктивное моделирование проводилось в течение 40 не для димеров и 70 не для дальнейшей полимеризации.

Для получения димеров а70-субъединицы было составлено 6 вариантов взаимного расположения молекул, проводилось моделирование каждого из них в течение 40 не.

Рисунок 5. Димер снгма-субъединнцы, полученный после 40 не моделирования в воде с концентрацией ионов NaCI 20мМ и MgCI2 5мМ. Красным обозначены домены NCR, голубым н зеленым — концевые домены разных молекул.

Димеризация возникла только в двух случаях, в первом за счет взаимодействия концевых доменов 1.1 и 4, во втором за счет взаимодействия доменов NCR, жестко структурированных областей 130-370 аминокислот (АК) белка. Для дальнейшего исследования был выбран вариант с наибольшим количеством контактов (Рис. 5), а именно взаимодействие доменов NCR. Необходимо отметить, что все варианты взаимодействия

димеров друг с другом или димеров с мономерами происходили за счет взаимодействия концевых доменов, реализуя первый вариант димеризации.

Было построено четыре варианта расположения двух димеров друг относительно друга и три варианта взаимного расположения мономера и димера. В среднем, минимальное расстояние между молекулами составляло 4 нм. Перед началом моделирования мономер моделировался в течение 100 не, а димер в течение 40 не. Моделирование димеров с димерами и димеров с мономерами длилось 70 не.

Во всех трех вариантах систем димер-мономер наблюдалось взаимодействие концевых доменов, в случае систем димер-димер два варианта показали взаимодействие концевых доменов (Рис. 6), в двух других случаях никакого взаимодействия не наблюдалось. Следует отметить, что в случае систем димер-димер наблюдалась закрученность получаемого полимера,

Рисунок 6. Фибрилла а70-субъеднницы, образованная из двух димеров после 70 не моделирования в воде с концентрацией ионов NaCl 20мМ и MgCI, 5мМ

причем угол между димерами медленно увеличивался со временем, а глобулы, образованные хвостами белков, были повернуты друг относительно друга на угол примерно в 90°, т.е. имела место спирализация полибелковой цепи. Такая структура очень напоминает полученные в эксперименте in vitro бусины на нити в червеобразных структурах (Рис. 4). Было выдвинуто

предположение, что в дальнейшем полученная нить суперспирализуется с образованием жестких амилоидных палочек, наблюдаемых в эксперименте. Характерные размеры червеобразных структур на АСМ-изображениях были следующие: длина 150-200 нм, размер глобул, формирующих бусины, 4,2±0,6 нм, а расстояние между ними от 15 до 20 нм. Также для червеобразных структур измерялась персистентная длина, характеризующая гибкость фибриллы. Для данной концентрации ионов она составляла 22,6±1,1 нм. Один из вариантов двух взаимодействующих димеров был практически полностью расположен в одной плоскости, поэтому оказалось возможным оценить его персистентную длину, получившуюся равной примерно 20 нм.

Расстояние между глобулами, состоящими из хвостов взаимодействующих мономеров, для обоих вариантов взаимодействия димер-димер составило около 13 нм и 21 нм, что хорошо согласуется с расстоянием между бусинами на нити в червеобразных структурах.

Таким образом, с помощью молекулярной динамики были выяснены предполагаемые места связывания молекул при димеризации и предложена модель образования фибрилл о70-субъединицы РНК-полимеразы Е. coli.

Раздел 3.2 содержит описание исследования адсорбции фибриногена на

Рисунок 7. Фибриноген на слюде (А), модифицировано!"! HMDS слюде (Б), модифицированном GM графите (В) и графите (Д) по данным АСМ

модифицированные и немодифицированные поверхности слюды и графита. Приводятся данные АСМ-экспериментов по адсорбции фибриногена на поверхности слюды, слюды, модифицированной гексаметилдисилозаном (ГМДС), графита, и графита, модифицированного молекулами Graphite Modifier (GM). Различия в структуре белка очень велики (Рис. 7), однако, несмотря на общую тенденцию, в литературе нет единого мнения о характере взаимодействия белка с подложками, о том, какие именно части белка участвуют во взаимодействии в зависимости от гидрофобности подложки. Например, существуют две гипотезы о расположении аС-цепей фибриногена на слюде: между белком и поверхностью и над белком.

Компьютерное моделирование методом молекулярной динамики проводилось в среде Gromacs с силовым полем Amber99sb-ildn, а также в среде NAMD с силовым полем CHARMM. Использовалась структура белка 3GHG из банка данных белковых структур.

В разделе описаны результаты 5 не моделирования адсорбции фибриногена на поверхности слюды и ГМДС в среде NAMD, силовое поле CHARMM (Рис. 8). Предварительные данные по сравнению топологий поверхности

А В

Рисунок 8. Фибриноген после I не симуляции на оксиде кремния (А) и ГМДС (С), после 5 не на оксиде кремния (В) и ГМДС (О)

молекул фибриногена, полученных методами АСМ и МД, показали очень хорошее соответствие данных АСМ и моделирования (Таблица 1).

Таблица I.

Сравнение данных АСМ и МД по высоте и длине фибриногена

Слюда ГМДС-слюда

Высота (D-домен), нм Длина, нм Высота (D-домен), нм Длина, нм

АСМ 2,2 ± 0,4 42 ±7 1,2 ±0,4 60 ±9

МД 7,5 34 5,5 41

Можно заметить, что результаты моделирования и эксперимента изменяются в том же самом направлении при смене подложки. Модель воспроизводит известный эффект, что высота молекулы уменьшается, а длина увеличивается на более гидрофобной поверхности. На рисунке 8 можно легко заметить, что на поверхности гидрофобной ГМДС-слюды концевые глобулярные D-домены плотно контактируют с поверхностью, тогда как области альфа-спиралей приподняты над поверхностью и образуют меньше контактов. На чистой гидрофильной слюде ситуация обратная, участки альфа-спиралей плотно примыкают к подложке, а D-домены приподняты.

Можно предположить, что несоответствие между экспериментом и моделированием связано с отсутствием аС-областей в модели. Хотя последовательность аминокислот аС-домена в среднем гидрофильна (средняя гидрофобность GRAVY = -0.994), более важно, как этот домен структурирован. На сегодняшний день такой информации нет, и не исключено, что присутствие аС-доменов делает молекулу на гидрофобной подложке немного длиннее, чем в моделировании. Также важно отметить,

что, хотя конечные конформации расценены как устойчивые, могут иметь место очень медленные процессы разворачивания белка на гидрофобных поверхностях.

Раздел 3.3 содержит описание эксперимента по адсорбции лизоцима, полученного из белка куриного яйца, на поверхность слюды, а также предложенной методики сравнения данных АСМ и молекулярной динамики. Подробно описывается методика обработки полученной в модели молекулы, адсорбированной на кремниевую подложку. Для этого строится двумерная сеточная функция, напоминающая изображение топологии поверхности в АСМ: в каждой точке этой функции регистрируется максимальная высота по оси Z, на которой происходит перекрытие Ван-дер-Ваальсовых радиусов пробного зонда из 8 атомов кремния с атомами белка. Методика аналогична использованной при сравнении данных по адсорбции фибриногена.

На рисунке 9 показано АСМ-изображение молекул лизоцима на поверхности слюды. При увеличении концентрации раствора лизоцима вдвое количество единичных молекул увеличивается также вдвое, что позволяет считать, что

Рисунок 9. Данные атомно-силовой микроскопии лизоцима, концентрация лизоцима в воде 0,05мкг/мл и 0,02 мкг/мл

данные молекулы - единичные белки.

По описанной ранее процедуре были получены изображения единичного белка на слюде в АСМ-эксперименте и в модели (Рисунок 10), после чего

21

было проведено сравнение их характерных величин. Результаты представлены в Таблице 2.

Рисунок 10 Визуализация данных АСМ-эксперимента и моделирования зондового сканирования

Шаг измерений высоты по осям х и у составлял 0,3 А для компьютерного эксперимента и 4 А для АСМ-эксперимента.

Таблица 2.

Сравнение экспериментальных и модельных размеров лизоцима

Наименование характеристики Модель Образец №1 Образец №2 Образец №3 Образец №4 Образец №5

Характерный латеральный размер, нм 4,5 5,1 7,3 4,1 4,9 7,2

Максимальная высота , нм 3,4 1,5 1,9 1,6 1,8 2,1

Данные таблицы показывают характерное уширение латеральных и занижение вертикальных размеров молекулы в АСМ-эксперименте, что приводит к некоторому различию данных компьютерного и реального экспериментов. Однако из данной таблицы можно сделать важные выводы о порядке этих искажений. На данный момент характерные величины белков, полученных в АСМ-экспериментах, сравнивают в основном с данными светорассеяния или ЯМР, то есть размеры адсорбированных молекул

сравнивают с размерами молекул в растворе, что в общем случае может привести к ошибке.

Рисунок 11 Начальная н промежуточная конформацнп адсорбированного лнзоцпма после 5 пс

По данным экспериментов лизоцим на отрицательно заряженной поверхности не сохраняет свою изначальную форму, а расползается по поверхности, что существенно влияет на его высоту и латеральные размеры. Тот же самый эффект характерен и для фибриногена, хотя и в меньшей степени из-за большего размера белка. На Рисунке 11 видно, что промежуточная форма лизоцима имеет большие размеры, чем первоначальная, взятая из кристалла. Причем различие получается примерно в 2 раза. Модельная топология адсорбированной молекулы должна дать более хорошее соответствие с данными АСМ.

В целом, сравнение размеров дало хорошее соответствие между моделью и экспериментом. Следует отметить, что предложенный подход для представления модельных данных в виде топологии поверхности имеет большие перспективы для развития метода АСМ, т.к. позволяет учесть в полученной топологии особенности взаимодействия зонда с белком, добавив или убрав итоговую высоту в соответствии со знаком и величиной сил, действующих на зонд.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ ДИССЕРТАЦИИ

1. Построены молекулярные модели агрегатов ранних стадий (протофибрилл) а™-субъединицы РНК полимеразы E.coli, показано соответствие их размеров с данными АСМ.

2. Проведено моделирование адсорбции фибриногена на значимые для АСМ поверхности свежесколотой слюды и слюды, покрытой ГМДС. Показано существенное влияние гидрофобных свойств белка на характер адсорбции. Построена модель адсорбции лизоцима на поверхность слюды. Характерные размеры моделей хорошо согласовываются с данными АСМ.

3. Построены модели часто используемых в АСМ подложек: графита, слюды, ГМДС-слюды и графита, покрытого GM. Обнаружена характерная конформация молекулы GM в виде шпильки на поверхности графита с характерными размерами 1,8 нм и 0,4 нм.

4. Доказано, что энергетическая минимизация не сдвигает структуру белка ближе к нативному состоянию, однако изменяет все белки единообразно, что показывает принципиальную возможность использовать эту процедуру для уточнения структур белков с низким разрешением.

5. Проведен сравнительный анализ данных АСМ и МД достроенных белков с использованием методов предсказания структуры отсутствующих фрагментов белков . На основе данного метода построена близкая к нативной структура белка

о70-субъединицы РНК-полимеразы E.coli при разных уровнях ионной силы раствора.

Поставленные задачи выполнены и цель работы достигнута.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Список работ, опубликованных в перечне издании, рекомендуемых ВАК

1. М.Г. Годзи, А.П. Громова (Толстова), И.В. Оферкин, П.В. Миронов. Можно ли использовать локальную энергетическую минимизацию для уточнения PDB-структур разного разрешения? // Биофизика , 2009, том 54, вып. 4, с. 622-629.

2. М.Г. Годзи, А.П. Толстова, И.В. Оферкин. Применение молекулярной динамики для интерпретации данных атомно-силовой микроскопии. // Биофизика, 2010, том 55, вып. 3, с. 415-423.

Список работ, опубликованных в виде статей в журналах, не входящих в

перечень рекомендуемых ВАК

3. А.Толстова, А.Протопопова, И.Оферкин, М.Годзи. Компьютерное моделирование и данные атомно-силовой микроскопии. // Наноиндустрия, 2011, вып. 3, с. 42-44

Список работ, опубликованных в виде тезисов конференций

4. Толстова А.П. Компьютерное моделирование, как основа для интерпретации данных атомно-силовой микроскопии наносистем // Сборник тезисов VIII Международной конференции "Проблемы биологической физики", 27-28 ноября 2009 стр. 229

5. Толстова А.П. Годзи М.Г. Модуль компьютерного моделирования для полуавтоматической интерпретации данных атомно-силовой микроскопии // Сборник тезисов Международной конференции Ломоносов 2010, Выставка инновационных проектов и достижений молодых ученых СНГ, 12 апреля 2010, стр. 51

6. А.П. Толстова, М.Г. Годзи, Новый метод получения трехмерных структур адсорбированных биополимеров в нативных условиях // Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии, том 2 - биофизика и биофизическая медицина, стр. 79-82

7. Толстова А.П Компьютерное моделирование как способ повышения информативности атомно-силовой микроскопии биополимеров // Сборник тезисов Четвертой международной конференции "Современные достижения бионаноскопии", 15-18 июня 2010, стр. 72

8. Толстова А.П. Годзи М.Г. Применение компьютерного моделирования для уточнения данных атомно-силовой микроскопии // Сборник тезисов Международной конференции Ломоносов 2011, 11 — 15 апреля 2011, стр. 53

9. Толстова А. П., Протопопова А. Д., Оферкин И. В., Завьялова Е. Г., Годзи М. Г. Трактовка данных атомно-силовой микроскопии методом молекулярной динамики // Сборник тезисов Пятой международной конференции «Современные достижения бионаноскопии», Москва 15-17 июня 2011, стр. 52-53.

10.Protopopova A. D., Tolstova А. P., Oferkin I. V., Zavyalova Е. G., Godsie M. G., Structure of adsorbed fibrinogen studied by atomic force microscopy and molecular dynamics simulation // Absracts book of 17th International Biophysics Congress, 31 October - 3 November 2011, p. 244.

1 l.Protopopova A.D., Tolstova A.P., Zavyalova E.G., Kopylov A.M., Tverdislov V.A., Yaminsky I.V. Structure of adsorbed fibrinogen studied by single-molecule atomic force microscopy and molecular dynamics simulation // Сборник тезисов 2-й Международной школы по физике поверхности «Технологии и измерения атомного масштаба», 1-7 октября 2012 г., Сочи, стр 37

12.Протопопова А.Д., Завьялова Е.Г., Толстова А.П., Оферкин И.В., Годзи М.Г., Ахмерова Д.Р., Копылов A.M., Яминский И.В. Исследование структуры и свойств фибриногена и фибрина // Сборник тезисов научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова", 14-17 ноября 2011, стр. 54

13.Толстова А.П. Кузьмина Н.В. Исследование механизмов образования амилоидных нанофибрилл с использованием бактериальных наносистем // Сборник тезисов XXII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2015", 13-17 апреля 2015 , стр. 55.

14.А.Р. Tolstova, N.V. Kuzmina, E.V. Dubrovin, O.N. Koroleva, I.V. Yamisky, V.L. Drutsa. Comparison of atomic force microscopy and molecular dynamics data of protein amyloid fibrils in bacterial systems. // Сборник тезисов Международной конференции Super resolution in different dimensions, 2-3 июня 2015, стр. 69 15.E.V. Dubrovin, O.N. Koroleva, N.V. Kuzmina, A.P. Tolstova, I.V. Yamisky , V.L. Drutsa. AFM study of wormlike aggregates of Esherichia coli RNA polymerase a70 subunit. // Сборник тезисов международной конференции 18th International Conference of non contact Atomic Force Microscopy, 7-11 сентября 2015, стр. 108.

Толстова Анна Павловна Анализ данных атомно-силовой микроскопии с помощью компьютерного моделирования

Формат 60x90/16 Тираж 100 экз. Подписано в печать 13.10.2015 Заказ № 330 Типография ООО «Генезис» 8 (495) 246-12-21 119571, г. Москва, пр-т Вернадского, 86