Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активация фибринолитической системы в процессе образования фибринового сгустка

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Активация фибринолитической системы в процессе образования фибринового сгустка"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ІМ.О.В.ПАЛЛАДІНА

На правах рукопису

Макогоненко Євген Митрофанович

УДК: 577.152.342

АКТИВАЦІЯ ФІБРИНОЛІТИЧНОЇ СИСТЕМИ В ПРОЦЕСІ УТВОРЕННЯ ФІБРИНОВОГО ЗГУСТКА

03.00.04.- Біохімія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

КИЇВ -1998

Загальна характеристика роботи

Актуальність роботи. Кров як система організму виконує гомеостатичну функцію в цінному стані, який в значній мірі визначається узгодженим функціонуванням згортаючої і бринолітичної систем крові. Фібринолітична система руйнує фібринові утворення в організмі в ріпу чергу в серцево-судинному руслі і виконує дві близькі , але суттєво відмінні по зіологічному значенню функції, а саме: перешкоджає утворенню стабілізованих фібринових /стків і гідролиує сформовані згустки. Перша із згаданих функцій реалізується в процесі ворення згустку і є головною функцією фібринолітичної системи. Й ефективне здійснення зезпечуе підтримку динамічної рівноваги між фібринолізом і згортанням і, як наслідок, крові в цінному стані. Порушення фібринолітичної функції створює умови для тромбоутворення , що и деяких захворюваннях серцево-судинної системи призводить до наслідків різного ступеня лздносгі.

Фібринолітична система крові, її компоненти на сьогодні достатньо вивчені в біохімічному юлекулярно-генетичному аспектах. На основі численних екпериментальних даних сформульована експериментально доведена теорія функціонування фібрінолітачної системи(Mullertz, S., 1976; imán, В. and CollenJD., 1978). Вона базується на даних про наявність високоафінних взаємодій між азміногеном, тканинним активатором плазміногену і полімерним фібрином, котрі призводять до рбції плазміногену і тканинного активатора на поверхні фібрину , що прискорює реакцію гивації плазміногену тканинним активатором (t-PA).

Фібринолітична система крові в нормі функціонує в межах фібринового згустка і тісно в'язана з процесом полімеризації фібрину. Наявність декількох форм фібрину, багатоегапшсть оцесу полімерізації, складність структури полімерного фібрину і зміни її в процесі самоскладання Ірину і наступного руйнування згустка плазміном поставили ряд важливих теоретичних і іктичних проблем, розв’язання яких є необхідним для розуміння механізму дії фібринолітичної теми і для розробки і застосування нових фібринолітичних засобів і знаходиться на різних діях завершення. В роботі досліджено одну з ключових проблем функціонування ринолітичної системи, а саме : активацію фібринолітичної системи в умовах формування ринового згустка.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було з’ясування механізму активації плазміногену іинним активатором плазміногену (t-PA) в процесі утворення полімерного фібрину. В хода іідження вирішувалися такі завдання:

з

Знайдено, що лізин-зв’язуюча ділянка плазміногену К1-3 важлива для активації ліз-пазміногену, а лізин-зв’язуючі ділянки К4 і К5 важливі для активації глу-плазміногену-. Вперше ясовано, що наявність кринглів К4 і К5 у плазміні достатня для забезпечення високої швидкості і іецифічності в руйнуванні структури полімерного фібрину.

Вперше було встановлено, що штучному сополімеру фібриногену і ЇЧ-кінцевого ісульфідного вузла фібрину властива здатність стимулювати активацію плазміногену ЬРА. За >помогою цій' моделі і моделей структур фібринового згустка, створених із фрагментів фібрину, ши визначені кінетичні параметри активації плазміногену ЬРА і показано, що активаторяий >мплекс першої фази реакції активації плазміногену, ймовірно, розташований на ОЕ>Е-тріаді і аС->мені фібрину, а активаторний комплекс другої фази реакції локалізований на ОПЕ-тріадах сусідніх зотофібрил. За даними літератури створена концепція про осьову симетрію центрів полімеризації ділянок зв’язування плазміногену і г-РА на молекулі фібрин(оген)у, на основі якої була створена іивимірна модель молекули фібрин(оген)у, протофібрили і фібрили і модель локалізації на них ггиваторних комплексів плазміногену і г-РА.

Запропоновано новий метод кількісної оцінки фібринолітичної активності ферментів, що ізується на визначенні швидкості руйнування структури фібринового згустка. Модифікація цього гтода знайшла застосування в медичній практиці і дозволяє одночасно вимірювати шість іраметрів стану систем згортання і фібринолізу в плазмі крові хворих.

Особистий внесок здобувача Результати досліджень, викладених автором в підрозділах 8.1

2, 8.3, 8.4.1, 8.4.3, 8.4.4, 8,6 виконані автором особисто ; підрозділи 8.4.2. і 8.4.5 виконані піранткою Дружиною Н.М. під керівництвом і за безпосередньою участю автора; підрозділ 8.4.4 лектронно-мікроскопічні дослідження ) виконано у співробітництві зі с.н.с. Інституту біохімії МПоздняковою і В.І.Чернишовим, а підрозділ 8.5 виконано за безпосередньою участю автора у івробітництві з с.н.с. Л.Д.Таран і н.с. С.І.Андріановим.

Апробація роботи. Матеріали дисертації були представлені на IV, V і VI Українському іхімічному з’їзді ( Дніпропетровськ, 1982, Івано-Франківськ, 1987; Київ, 1992); Всесоюзному ипозіумі по інженерній ензимології (Київ, 1983); VIII Всесоюзному симпозіумі “ Хімія білків і ггидів”(Таллінг1987); Республіканській науковій конференції “Застосування ферментів у медицині” Сімферополь, 1987); Всесоюзній конференції “Методи отримання, аналізу та застосування >ментів” (Юрмала,1990); 7-й Міжнародній конференції по маркерам пухлин людини (Київ,1990);

XII і ХШ Міжнародному конгресі по фібринолізу (Індіанаполіс,1990; Лювен,1994;

іазміноген вилучали із еластазного гідролізата ліз-плазміногену ( Powel J., Castellino F., 1980). лазмін отримували , активуючи глу- або ліз-Пг стрептокіназою або ¡мобілізованою на сефарозі >окіназою (Wiman В. and Wallen P.,1980). Тканинний активатор плазміногену (t-PA) отримували за »робленим нами афіннохроматографічним методом на фібриноген- і аргінін-сефарозі із іетонового порошку м’язової тканини серця свині ( Кудінов С.О., Макогоненко Є.М., Назаренко .А., 1987). Фібриноген виділяли із плазми крові людини або великої рогатої худоби шляхом ісолювання сульфатом натрію ( Варецька Т.В.,1960). Мономери дезАА- і дезААВВфібрину гримували із відповідних фібринових сгустив, розчинюючи їх в 0.02 М оцтовій кислоті (Луговской ,, Гоголинская Г., Дерзская C., Белицер В.А, 1978). Х2 фрагмент фібриногену виділили із іазмінового гідролізата фібриногену шляхом гель-фільтрації на колонці з сефакрілом S-300 при ісокій іонній crai(Lukas М, et al. 1983). Д-Д фрагмент отримали із плазмінового гідролізату )вністю прошитого фактором ХШа фібрину шляхом гель-фільтрації на колонці з сефакрілом S-300 послідуючою доочисткою на КМ сефадексі G-50 (Бєліцер В.А. та ін.,198б). N-кінцевий сульфідний вузол дезААВВфібрину (tN-ДСВ) і FCB-2 фрагмент фібрин(оген)у отримували fa )Зщегшеного за допомогою BrCN фібринового згустку або фібриногену в 70% мурашиній кислоті ляхом гель-фільтрації на сафадексі G-100 (Blomback В. et al.,1968; Позднякова і ін., 1983). Фактор (Ш видалили із плазми крові великої рогатої худоби (Curtís С. and Lorand L.,1976). Фібронектин фимували з донорської плазми за допомогою афінної хроматографії послідовно на желатин- і >гінин-сефарозі( Vuento M. and Vahen A., 1979).

Протеолітичну активність плазміну і потенційну протеолітичну активність плазміногену ізначали казеїнолітичним методом ( Robbins K. and Summaria Z., 1979) та за кількістю аміногруп, D вивільняються в процесі гідролізу казану або фібриногену( Кастрикіна Т.Ф. і ін., 1981). Амідазну тивність плазмін(оген)у визначали з використанням хромогенного субстрату S22S1 (H-D-Val-u-Lys-pNa) за методом виробника (Kabi Diagnostica). Активність активаторів плазміногену: t-PA, окінази та стрептокінази визначали на фібринових плівках, утворених із фібриногену людини ( verkate F. and Brakman P., 1975). Також активаторну активність t-PA і урокінази визначали за помогою відповідних хромогенних субстратів S2251(Verhejien J.H.,1982) і S2444 (pyro-Glu-Gly-S-pNa, Kabi Diagnostica) Активність ФХІІІа була знайдена по рівню ферментативного включення -пугресцину в a-Ka3«H(Curtís С. and Lorand L.,1976), Активність тромбіну визначали за часом ртання фібриногену ( Варецька Т.В., 1977).

Швидкість реакції активації плазміногену t-PA в присутності різних стимуляторів , ючаючи моделі фібринових згустків, визначали декількома способами: 1 - за швидкістю

.) такі параметри кривої поглинання, як швидкість зростання , максимальний рівень і швидкість меншення поглинання , а також лаг-період , час напівруйнування і повного руйнування згустка іідображають динаміку змін в структурі згустка; б) формування структури полімерного фібрину , ктивація плазміногену і руйнування структури згустка іде з найбільшим приближенням до )ізіологічних умов , оскільки в такому згустку з найбільшою відповідністю процесу in vivo реалізуються взаємодії фібриноген-фібрин, фібрин-плазміноген, фібрин-t-PA, t-PA-плазміноген, :кі лежать в основі механізму активації плазміногену і гідроліза фібринового згустка. Ця вддифікація дозволила визначати активність плазміногену , плазміна, t-PA і швидкість активації лазміногену t-PA. Інша модифікація цього методу дозволила визначати шість параметрів стану истеми згортання і фібринолізу в крові хворих на різні захворювання ( Лежен Т.І. і ін., 1990) і найшла застосування в деяких клініках для діагностики порушень системи гемостазу.

Процес утворення і руйнування фібринового згустка під дією компонентів фібринолітичної истеми, а саме: плазміна або плазміногену (в концентрації від 0,4 до 100 нМ), що активується t-'А, описується кривою зміни поглинання середовища, що має дві ділянки. Ділянка сходження ідповідає полімеризації фібрину , а нисхідна - відповідає лізису фібринового згустка. При більшенні концентрації ліз-плазміногену до

пмоль/с

[- Плазміноген І. [Ліз-Пг-фібрин 1.»м

> 2 [ Гду-Пг-фібрвн ],«м

Рис.1. Зміна в поглинанні середовища в процесі утворення і руйнування фібринового згустка присутності плазміногену і І-РА 1 - ліз-плазміноген і г-РА; 2 - глу-плазміноген і 1:-РА; 3 - дезААВВ-брин або дезААВВфібрин і глу-плазміноген; 4 - дезААВВфібрин і ліз-плазміноген.

Рис.2. Залежність швидкості утворення плазміну від концентрації вільного і зв’язаного з 5рином плазміногену. Загальний глу-(1) і ліз-плазміноген(2); зв’язаний глу-(3) і ліз-азміноген(4).

тичини, більшої за 0.18 мкМ при тій же концентрації фібрина форма кривої суттєво змінювалася, з.ІД. Окрім ділянок полімеризації і руйнування фібринового згустка з’являється ділянка іринного зростання поглинання згустка, що передує швидкому розпаду структури згустка. Така

цінка кінетичних параметрів активації двох форм плазміногену в розрахунку на зв’язаний лазміноген, кількість якого знаходили, припускаючи, що сорбція плазміногену на фібрині іде за :еханізмом момомодекулярної адсорбції Ленгмюра. Знайдені кінетичні параметри активації орбованих на фібрині глу- і ліз-форм плазміногену були відповідно рівні: Км - 0,25 нМ і 8 нМ, к-,08 і 0,26 с'1 . Якщо розглядати зв’язаний з фібрином плазміноген як субстрат для ьРА, то порідненість 1-РА до глу-плазміногену у присутності фібрину більша в порівнянні з такою до ліз-лазміногену. Одержані дані вказують на те, що структура комплексу глу-плазміноген-фібрин має ілянку, - такою може бути преактиваційний пептид,- яка після зв’язування глу-плазміногену з ібрином сприяє значному збільшенню спорідненості ЫРА до глу-плазміногену, що забезпечує його фекгивну активацію.

Таким чином, процес руйнування фібринового згустку, що формується , фібринолітичною истемою визначається компонентами обох систем. Ліз- і глу-плазміноген по-різному взаємодіють фібрином і продуктами його руйнування і впливають на структуру згусгка. Фібринолітична истема незалежно від типу активатора подібним чином , але більш ефективно руйнує езААфібриновий згусток в порівнянні з дезААВВфібриновим згустком. Глу-плазміноген при квімолярних фібрину концентраціях руйнує так само ефективно структуру фібринового згусгка, як і із-плазміноген.

Підсилюючий вплав ліз-плазміногену на полімеризацію фібрину. Важливим питанням в сгивації фібринолітичної системи є з’ясування локалізації ділянок зв’язування плазміногену і 1>РА і фібрині і їх просторового відношення до центрів полімеризації. Перетворення фібриногену в ібрин супроводжується двома важливими з точки зору білок-білкової взаємодії наслідками, а саме: після відщеплення А- і В-пептидів експонуються центри полімеризації фібрину; б) одночасно зрмуються центри зв’язування плазміногену , внаслідок чого спорідненість ліз- і глу-іазміногену до фібрину значно зростає. Проте на утворення фібринового згусгка глу- і ліз-іазміноген впливають по-різному. Як було нами знайдено, ліз-плазміноген значно підсилював ілімеризацію фібрину людини і великої рогатої худоби: скорочував лаг-період, збільшував зидкість зростання поглинання при 350 нм і рівень поглинання при еквімолярній фібрину нцентрації. Для фібриногену в присутності тромбіну також зменшувався час згортання. Плазми із нгібованим р-нітрофениловим ефіром гунідинбензойної кислоти активним центром підсилював лімеризацію фібрину аналогічно ліз-плазміногену. Глу-плазміноген не впливав на полімеризацію їринового мономера.

Відмінності у дії ліз- і глу-плазміногену на полімеризацію фібрину були пов’язані, як ми іаємо, з різними конформаціями молекул, відкритою у ліз-форми і закритою у глу-плазміногену,

го поява вторинного збільшення поглинання вказує на утворення ліз-плазміногену в ході руйнування структури згустка. Реакція утворення ліз-форми починається , коли накопичуються X-}>рагменти, і гальмується після руйнування фібрилярної структури згустка з утворенням кінцевих Е і Ц фрагментів гідролізу фібрину. Зони, що відповідають ліз-плазміногену, з’являються одночасно з

Гду-Пг

Т'

«12 3

я-тшпя

85000

1 зооо

5б?89 -

^7*2

г

1—Глу'Пг ' ™ Ліз-Пг

Глу-Пг Ц

___^Глу-Пг І

^8—-Ліз-Пг Ц ' Ліз-Пг І

Рис.З. Зміна в поглинанні середовища, електрофоретичній картині згустка і радіоактивності в зонах глу- і ліз-плазміногену в процесі утворення і руйнування згустка, що формується із дезААфібрину. а - зміна в поглинанні згустка при 350 нм, стрілки вказують моменти часу, в які зроблені зразки для електрофорезу; б-електрофореграми згустків ( рН 3,2); в - рівень радіоактивності в зонах плазміногену. Ф -фібриноген; Хь Х2,У, Д - фрагменти фібрину.

накопиченням У і Д фрагментів. Найбільша швидкість перетворення глу-форми в ліз-форму тівпадала з початком руйнування X фрагментів. Подібну картину , але з меншою швидкістю гворення ліз-плазміногену спостерігали для системи фібриноген і тромбін. В фібриновому згустку,

о формується із очищених білків в присутності глу-плазміногену і 1>РА, початковий етап тйнування фібрину до появи У і Д фрагментів, а саме відщеплення аС-фрагменгів здійснює глу-іазмін. В подальшому, завдяки збільшенню ділянок зв’язування плазміногену на фібрині і яькосгі зв’язаного глу-плазміногену і накопичення глу-плазміну одночасно з інтенсивним йнуванням “корової'” структури молекули фібрину, починається відщеплення найбільш чутливої ' дії плазміну структури глу-плазмногена - преактиваційного пептиду. Утворення ліз-азмін(оген)у з одного боку прискорює руйнування фібринового згустка з іншого є сигналом для ведення плазміну із зони реакції, оскільки плазмін має високу спорідненість до кінцевих продуктів ролізу фібрину(Лежен Т.ЦКудинов С.А.,1986). Руйнування фібрилярної структури згустка і

гільки Тре 346 відповідно, і міні-плазміноген, у якого була видалена К1-К4 ділянка поліпептидного ланцюга. . :

Таблиця 1. ■

Кінетичні параметри активації глу-форм плазміногену і міні-плазміногену

тканинним активатором у присутності нативного фібрину ;

Форма Км, мкМ к, с'1 к/Км

Порівняння кінетичних параметрів обох форм плазміногену t-PA вказує на більшу в 1,7 рази пвидкість активації 2 форми по відношенню до 1 форми. Очевидно, що вуглеводний компонент в толожеш Асн289 на 3 кринглі знижує спорідненість t-PA до глу-плазміногену. Втрата міш-шазміногеном лізин-зв’язуючих ділянок призводить до суттєвого зниження субстратної ¡пецифічносгі t-PA і падіння на порядок швидкості реакції активації. Одержані результати важливі в декількох аспектах. По-перше, нативний фібрин в першій фазі активації плазміногену t-PA не абезпечує максимальної швидкості реакції активації, що пов’язано з відсутністю С-термінальних взинів, які не тільки збільшують кількість зв’язаного на фібрині плазміногену і t-PA, але і змінюють онформацію сорбованого на фібрині глу-плазміногенуСМагкив G,1994). По-друге, ділянки, що абезпечують високу швидкість активації глу-плазміногену t-PA на нативному фібрині, окалізовані в кринглах К1-4 глу-плазміногену. По-третє, крингл КЗ плазміногену не виконує ажливої функції в процесі активації плазміногену і послідуючош гідроліза полімерного фібрину твореним плазміном, що підтверджено в подальших дослідах. :

Активація глу-плазміногену t-PA на фібрикових згустках з різним ступенем прошивки 'ХІІІа. Ковалентна модифікація фібринового згустка ФХШа додає йому міцності, змінює іастичність, підвищує стійкість до дії плазміну або плазміногену, що активується стрептокіназою ю урокіназою. Встановлено, що підвищення стійкості фібринових згустків у плазмі до дії плазміну »в’язане з ковалентним включенням в нього а2-антиплазміну (Sakata J.,Aoki N.,1982). Однак, гтання про вплив прошивки згустка ФХШа по у- і а-ланцюгам на ефекторні властивості ілімерного фібрина в реакції активації плазміногену t-PA висвітлені недостатньо.

Використовуючи очищені білки, ми створили моделі непрошитого, частково і повністю ошитого ФХШа фібринового сгустка. Кінетику активації глу-плазміногену t-PA на цих моделях

• • * • • 123т

вчали , визначаючи швидкість утворення плазміну по швидкості вивільненню мічених J

Форма 1 Форма 2

0,99 ± 0,05 0,51 ±0,02

0,071 ± 0.003 0,063 ±0,003 0,096 ± 0,00

0,7

0,12

0,01

Міні-плазміноген 9,2 ±0,5

5СВ фібрину. Первинним продуктом (»полімеризації , як виявилось , була нитка із молекул фібриногену розташованих кінець-до-кінця. Молекули ЇЧ-ДСВ , які скріплювали між собою молекули фібриногену , на електронних знімках не були помітні внаслідок, як ми вважаємо , іідсутності у них впорядкованої глобулярної структури і малого розміру. Однонитчаті сополімери 5ули здатні до латеральної асоціації у фібрили різної товщини, які утворювали в осаді тривимірну (іібрилярну сітку. Одержані дані підгримують висунуту раніш гіпотезу про структуру сополімера фібриногену і Ы-ДСВ.

Комплекс фібриноген- К-ДСВ на відміну від полімерного фібрину не утворює суцільної ривимірної сітки в розчині і не переходить до стану геля. Комплекс можна перемішувати без зміни зеличини поглинання середовища і , ймовірно, без зміни структури комплексу. Тому швидкість цстивації плазміногену І-РА можна було вимірювати усіма трьома методами, що використовувалися іля аналізу активації плазміногену Ы?А на фібринових згустках. Слід додати, що ліз-плазміноген іикликав підвищення поглинання середовища в процесі утворення комплексу і вторинне зростання юглинання в процесі гідролізу комплексу, стимульованого 1-РА, тобто властивості комплексу і »бринового згустка по відношенню до фібринолітичної системи були подібні. Це підтведжує іпотезу про спільність механізмів формування полімерного фібрину і утворення комплексу іібриноген-М-ДСВ фібрину.

К-Рис. 4, Однонитчатий сополімер

' 8

І фібриногену і К-ДСВ(стрілка) і ,£к ,

Щ пучок ниток сополімера( подвійна

¡¡Щ стрілка). Збільшення 190 000.

І

І Було знайдено, що комплекс І фібриноген-И-ДСВ прискорює активацію плазміногену І-РА. [Активація плазміногену в ''присутності комплексу

І фібриноген- ІМ-ДСВ фібрину іде за »кінетикою Міхаеліса-Ментен. ''Кінетичні параметри активації ладали: для глу- і ліз-плазміногену відповідно - Км- 0,18 мкМ і 0,015 мкМ, к - 0,27 с'1 і 0,06 с'1. ‘А мав більшу спорідненість до ліз-плазміногену , його каталітична дія на Я561-У562 пептидний 'язок ліз-плазміногену була уповільнена в порівнянні з такою на глу-плазміноген. Однак ,

Таблиця 3.

Кінетичні параметри активації глу-плазміногену t-PA в присутності різних ефекторів

Ефекгор активації Км,мкМ К с'1 k/Км, м

Х2 1,2 0,02 0,017

Х2-N-ДСВ 0,83 0,04 0,048

ДД 0,62 0,04 0,064

ДД-N-ДСВ 0,15 0,06 0,4

фібриноген- N-ДСВ 0,125 0,06 0,48

фібриноген- тромбін 0,017 0,13 7.64

Одержані дані свідчили про те, що швидкість активації плазміногену t-PA зменшується зі меншенням впорядкованості структури стимулятора активації - полімерного фібрину. Так, ібриновий згусток і комплекси фібриноген- N-ДСВ і ДД- N-ДСВ значно більше підвищували івидкість активації плазміногену в порівнянні з комплексом Х2 - N-ДСВ або з Хг і ДД рагментами , взятими окремо. Близькі значення кінетичних констант для комплексів ДД-ІЧ-ДСВ і ібриноген- N-ДСВ дозволяють припустити, що в цих комплексах ключовою стимулюючою руктурою є ДДЕ тріада, на якій утворюється акгиваторний комплекс. аС-домен також залучений > утворення активаторного комплексу в фібриноген-№ДСВ сополімері, але з неявною функцією, ¡кільки Х2 - N-ДСВ був значно слабшим стимулятором активації, а ДД-И-ДСВ комплекс мав таку ж имулюючу активність, як і комплекс фібриноген- N-ДСВ. Це припущення підтримується даними uenson Е. and Petersen L, 1989). Висока стимулююча активність фібринового згустка пов’язана на шу думку з тим, що в структурі полімерного фібрину суперспіралізовані міждоменні ділянки ІД тріад, які зв’язують шіазміногек і t-PA, локалізовані вдвічі ближче одна до одної в порівнянні з мплексами фібриноген- N-ДСВ і ДД- N-ДСВ. Більш близьке розташування ділянок зв’язування азміногена і t-PA в полімерному фібрині і експозиція С-термінального лізину в деградованому азміном а-ланцюзі сприяють утворенню активаторного комплексу і підвищенню спорідненості t-до плазміногену.

Вплнв фрагментів плазміногену К1-3, К4, К5 і міні-плазміногену на гідроліз згустка ліз-лу-плазміногеном, що активується t-PA. Роль крннглів К4 і К5 плазміна в руйнуванні •уктури згустку. Активація фібринолітичної системи і послідуючий гідроліз фібринового згустка існюєгься завдяки високоафінним взаємодіям між фібрином, t-PA і плазміногеном. Роль окремих м-з’вязуючих ділянок високої, проміжної і слабкої спорідненості в активації плазміногену t-PA ишається до кінця не з’ясованою. Тому ми вивчали вплив фрагментів плазміногену , що містять

вдсутшсгю кринглів Kl-З. Відсутність кринглів, що містять лізин з’вязуючу ділянку високої шорідненості, не впливає на швидкість руйнування міді-плазміном струкіури фібринового згустка. Для міні-плазміну, який містить К5 з аргініл-з’вязуючою ділянкою, спостерігається значне зниження пвидкості руйнування структури згустку, що , ймовірно, пояснюється вилученням К4 із складу ферменту. Проте, наявність навіть одного афінного модуля К5 забезпечує міншлазміну істотну іеревагу в руйнуванні структури сіустку в порівнянні з мікроплазміном, який не має специфічної шорідненості до фібрину.

Склад продуктів деградації молекул фібрину, які утворюють досліджувані протеази в момент іапівруйнування струкіури фібринового згустка, подано в таблиці 5. В плазміновому і «гініплазміновому гідролізатах, які мають подібний склад, переважає фракція мономерного фібрину і її фрагменту. Для мікроплазміногену і трипсину більшу частину гідролізату складають фрагменти, іе здатні підтримувати структуру полімерного фібрину. Цілком очевидно, що ферменти , які містять •.рінгли К1-5 з ділянками спорідненості до фібрину руйнують полімерний фібрин на великі >рагменти , гідролізуючи пептидні звязки в визначених ділянках фібрили, що погоджується з ;аними (Glander J. and Nossal Я.,1983). Це забезпечує високу швидкість руйнування структури густка. Низький вміст фракції, до якої входить мономерний фібрин і Хі фрагменти , і значний міст продуктів більш глибокої деградації фібрина в трипсиновому гідролізаті вказують на те, що (ехашзм руйнування фібринового згустку трипсином полягає в послідовному вилученні окремих олекул фібрину з поверхні фібрили. Цей шлях руйнування структури полімерного фібрину менш фективний і значно повільніший.

Таблиця 5.

Радіоактивність електрофоретичних зон гідролізатів фібринових згустків в момент

напівруйнування*

ермент

Фрагменти молекули фібрина Мономерний Х2 Y У Б

фібрин + Хі

Низькомол.

фракція

іазмін

62,7+4,8 16,0+2,1 б,8±0,5 4,7±0,5 5,3+0,4 5,5+0,7

іншлазшн 57,6±6,1 21,7+1,9 4,7±0,6 4,9+0,7 5,8±0,7 5,3±0,6

ікроплазмін 39,7+4,2 29,0±3,3 10,5±1,2 5,3±0,4 7,2±0,6 8,2±1,0

ипсин 30,2±2,9 33,6+3,4 12,6±1,1 7,8±0,9 4,3±0,5 11,5+1,2

в % від загальної радіоактивності зразка, нанесеного на електрофоретичний трек

Jflff fit

P. *£/££. Ц

!

'______S._______

fiC л tC

р. к

r*“7J

*

Еі-Ді центрів полімеризації молекул фібрину і протилежний напрямок ниток фібрину в ротофібрилі, що є важливим для латеральних контактів протофібрил.

5. На одну довжину молекули фібрину в протофібрилі припадає 8 центрів латеральних онгакгів. Протофібрила може взаємодіяти з чотирма сусідніми протофібрилами, при цьому на одну овжину молекули фібрину припадає по 2 контакти, рис. 8.

Рис.6.1 .Розташування центрів полімеризації на поверхні молекули фібрин(оген)у. А- вид зверху, центри полімеризації. Су- С-кінцева ділянка у-ланцюга. аС, ßC і уС -С-кінцеві домени а-, ß- і у-ланцюгів. В -вид збоку, С - вид спереду, аС-домени не показані на В і С. О вісь симетрії. Світлий фон - верхня частина, заштрихована - нижня частина молекули фібриногену.

П. Схема орієнтації центрів полімеризації на фібрин(оген)і.

Ця схема втілює один із можливих принципів просторової організації протофібрил в ібриновій фібрилі, що грунтується на ідеї про симетричну локалізацію центрів полімеризації на олекулі фібрину.

Роботи Nieuwenhuizen W., 1994; Weisel І et al.,1994, Медведя Л.В.,1995 і Makogonenko Б. et 1993 дозволяють запропонувати схему розташування ділянок звязування плазміногена і t-PA і поверхні Д доменів фібрину. Ділянка Аа148-160, з якою зв’язується глу-плазміноген, ікалізована на термостабільному субдомені (TSD) Д домена фібрина( Litvinovich S. et al,1995) і іосторово віддалена від Ді і Дг центрів полімеризації. Ділянка зв’язування в складі протофібрили новірно, орієнтована в міжпротофібрилярний простір. Ділянка зв’язування t-PA, що знаходиться у312-324 фрагменті у-ланцюга фібрина(8сЬіе1еп W. et аі.,1991), як і ділянка зв’язування азміногену, експонується на поверхні фібрину після його полімеризації. Припускається, що уЗ 12+ ділянка локалізована поблизу Ді центра полімеризації, на поверхні, оберненій в міжгріадний остір. Ідея про локалізацію центрів зв’язування плазміногену і t-PA на поверхні молекули >рин(оген)у була використана для створення тривимірної моделі активаторного комплексу вільної і швидкої фаз реакції активації плазміногену t-PA на полімерному фібрині і комплексі іриногену з N-ДСК фібрину.

ктивації глу-плазміногену на дезАА- і дезААВВфібрині однакові, що свідчить про формування іентичних ефекгорних структур в цих згустках. Єдина відмінність дезАА- і дезААВВфібрину одягає в різній швидкості їх полімеризації, що може пояснити різну швидкість руйнування іібринових згустків глу-плазміногеном, що активується t-PA. Ми знайшли, що ковалентна юдифікація полімерного фібрину фактором ХШа шляхом прошивки його по у-у і Аа ланцюгам ризводить до зменшення швидкості активації плазміногена t-PA. Таким чином, стабілізація іібринового згустка , що виявляється при перехода дезААфібрина в дезААВВ форму в повільненні його руйнування , і прошивка полімерного фібрину по у-у , а потім і по Аа анцюгам, послідовно погіршують ефекторні властивості фібрину, що формується, в активації лазміногену t-PA. Цей висновок є важливим для розуміння молекулярного механізму регуляції гмостатичного балансу на рівні фібринового згустка.

Модель гемостатичного балансу між згортаючою і фібринолітичною системою в плазмі рові людини. В основу запропонованого механізму покладені дані , які враховують ефекторну ункцію полімерного фібрину в активації фібринолітичної системи і механізм дії тромбіну і плазміну і фібрин(оген) (Макогоненко Е.М.И соавт.,1992). Процес полімеризації фібриногену під дією юмбіну проходить у декілька стадій, що передбачає різні періоди існування проміжних форм ібрину в залежності від концентрації тромбіну, див.схему. При низьких концентраціях тромбіну іреважно утворюється дезААфібрин, який в плазмі крові виявляється в формі олігомерів(Вап§ ,Chang N.,1974). ДезААфібринові олігомери здатні прискорювати активацію плазміногену t-PA, е не прискорюють відщеплення В пептиду від дезААфібрину тромбіном (Lewis S et.al.,1985) і гивацію фактора XIII (Naski N.et аі.,1991). На стадії утворення олігомерів дезААфібрину ібувається вибір подальшого шляху існування фібрину, що полімеризується, а саме: або

ворюється полімерний фібрин після вилучення тромбіном В фібринопепгида, або після видалення ! 1-42 пептида плазміном відбувається подальше руйнування фібрину(ї\058е1 Н.,1981). Механізм бору є кінетичний (Nesheim M.et.al.,1991) і визначається відношенням активностей тромбіну і t-PA мазмі крові, що відбиває співвідношення активностей згортаючої і фібринолітичної систем в ізмі крові.

Особливістю реакції активації плазміногену t-PA є те, що вона іде з достатньою швидкістю ьки на поверхні ефектора - полімерного дезААфібрину (Hoylaerts М et.al.,1982). Плазмін, що орюегься в результаті активації плазміногену, руйнує дезАА фібрин ( маркером появи якого є А ітид) з відщепленням на ранньому етапі гідролізу Врі-42 пептиду, котрий можна розглядати як жер активації фібринолітичної системи(Кагаша М., 1988). Вр 1-42 пептид не відщеплюється від

характеризований підвищеною концентрацією А і В(3 1-42 пептидів , більшою концентрацією ВР -42 в порівнянні з такою В|3 15-42 пептиду, близьким до 1 відношенням концентрацій А до суми онцеятрацій (Вр 1-42 + ВР 15-42) пеіггидів( з поправкою на час напівжитгя пептидів в плазмі) і езначною концентрацією ДЦ-димера в порівнянні з такою Д фрагмента. При гіперкоагуляції онцентращя фібринопеїггида А вище суми концентрацій (Вр 1-42 + ВР 15-42) пептидів, а онцентраці ДЦ-димера вища за таку Д фрагмента . Гіперфібриноліз характеризується меншим за 1 ідношенням концентрації А фібринопептида до суми концентрацій (ВР 1-42 + Вр 15-42) пептидів, изьким рівнем ДЦ-димера і наявністю Е фрагмента, що містить А фібринопептид.

Підтримка гемостатичного балансу в плазмі крові являє собою значно складніший процес, |сий загалом залучає до взаємодії щонайменше чотири системи крові: окрім згаданих гуморальних 'згортаючої і фібринолітичної -, також клітинні системи - тромбоцигарну і клітин ендотелія стінок /дин . Запропонована схема представляє кінцеві етапи взаємозв’язків і характеризується зстуїшістю для теоретичного і експериментального аналва.

Висновки

1. З застосуванням розробленої нами модифікаїщ методу визначення часу руйнування ібринового згустку, який адекватно моделює процес активації фібринолітичної системи під час ворення згустку, встановлено, що фібринолітична система , яка сформована із глу- або ліз-іазміногену і активаторів: І-РА, або урокінази , більш ефективно руйнує фібринові згустки , що »рмуються із дезААфібрину в порівнянні із згустками з дезААВВфібрину , незалежно від типу тиватора.

2. Знайдено, що ліз-плазміноген на відміну від глу-плазміногену міцно взаємодіє з фібрином, ) полімеризується, і спричиняє зміни в його структурі, а саме: підсилює полімеризацію, викликає >ринне підвищення поглинання світла при 350 нм в процесі руйнування згусгка . Взаємодія йснюється за участю лізин-зв’язуючих ділянок високої спорідненості і аргінін-зв ’язуючих ділянок иміногеиу. Показано, що лізин-зв’язуючі ділянки просторово віддалені від центрів полімеризації

3. Встановлено, що гідроліз полімерного фібрину до X фрагментів здійснює глу-плазмін. Лз-рма плазмін(оген)у починає утворюватися на стадії руйнування X фрагментів і її утворення ьмується після руйнування фібрилярної структури згустка.

4. Показано, що швидкість активації глу-плазміногену в присутності дезАА- і ААВВфібринового згустка , що формується, не відрізняється. Це є свідченням того, що уктури, які відповідають за стимулюючу дію полімерного фібрину, формуються на стадії эрення надмолекулярних об’єднань - протофібрил.

Значення концентрацій і відношення концентрацій пептидів і фрагментів плазмінового гідролізу фібрин(оген)у при різних станах балансу системи згортання і фібринолізу в плазмі крові

Молярні концентрації пептидів Відношення концентрацій пептидів Фрагменти фібрин(оген)у Підсумок взаємодії систем А ВР 1-42 ВР 15-42 А/С А/Д С/Д А/(С+Д)

[А] * [С] * ІД]*

А>Ан С>Сн Д>Дн ОД 1 >1 >1 =1

А>Ан С<А Д<А С>Д >1 >1 - >1

А>Ан ОА Д<А С»Д <1 >1 »1 <1

* - А,С,Д . позначення пептидів; Ан,Сн,Дн - концентрації відповідних пептидів у крові конкретного пацієнта; ПДЮ,Х,ХХ,УДЕ позначення фрагментів фібрин(оген)у

В»ОДЕ,Х,У фібрину Динамічна рівновага

В<ОВ,ХХ,ХУ,Е фібрину Гіперкоагуляція

Х,У,В,Еі фібриногену Гіперфібриноліз

12. Makogonenko E.M.,Druzhina N.N.,Lugovskoy E.V.,Kolesnik L.A.,Kudinov S.A. Fibrinogen-N-5K of fibrin complex stimulates the plasminogen activation by t-P A//Fibrinolysis. -1990.-4, Suppl.3 .-P.86.

13. Chubinskaja S.G., Makogonenko E.M. .Vinnitsky V.B. Plasminogen activator activity in murine sues at pregnancy and tumor growths// J. Tumor. Marker Oncol.- 1990.-5,N 3.-P.263.

14. Lugovskoy E.V., Makogonenko E.M., Chudnovetz V.S., Derzskaja S.G.,.Gogolinskaja G.K, )!esnikova I.N.,.Bukhanevich A.M, Sitak I.N., Ljashko E.D.,.Komissarenko S.V Study of fibrin lymerization with monoclonal antibodies// Biomedical sciencies.-1991.-2,N 3.-P.249-256.

15. Макогоненко E.M.,Дружина H.H., Луговской Э.В.,Колесник Л.А. .Кудинов С.А. Активация :азминогена тканевым активатором и эффекгорные свойства комплекса фибриноген- N-концевой сульфидный узел (N-DSK) фибрина// Укр.биохим.журн.-1991.-63, N З.-С. 17-23.

16. Луговской Э.В., Макогоненко Е.М., Чудновец В.С.Дерзская С.Г.,Гоголинская Г.Л.,

)лесникова И.Н., Буханевич Ф.Ь.,Ситак И.Н., Ляшко Е.Д., Комиссаренко С.В. Исследование оцессов полимеризации с помощью моноклональных антител// Биохимия животных и человека, іев: Наукова думка..- 1991.-15.-С.77-86. ■

17. Андрианов С.И., Макогоненко Е.М., Кудинов С.А. Роль К4 и К5 кринглов тяжелой цепи [азмина в разрушении структуры полимерного фибрина// Укр.биохим.журн.-1992. -64, N 2.-С.31-38.

I 18. Андрианов С.И., Макогоненко Е.М., Кудинов С. А Особенности гидролиза полимерного ібрина плазмином, миниплазмином, микроплазмином итрипсином//Укр.биохим.журн.-1992.-64, N ■С. 14-20.

19. Макогоненко Е.М., Луговской Э.В., Колесник Л.А.ДСудинов С.А. О функциональном и агностическом значении А-, Bp 1 -42 и В($ 15-42 пептидных фрагментов фибрин(оген)а// р.биохим.журн.-1992.-64, N 4.-С. 78-92.

20. Дружина Н.Н., Макогоненко Е.М., Яковлев С.А. Роль отдельных структур полимерного брина в активации глу-плазминогена тканевым активатором плазминогена// Докл.АН УССР, р.Б.- 1993,- N 3.-С.151-154.

21. Makogonenko Е.М., Lugovskoy E.V., Jakovlev S. A.,Petrov A.V. Symmetry of fibrin molecule and il structure// Proc. ХП International Fibrinogen Workshop ,-Wrightsville Beach(USA)-1993.-P,6.

22. Лежен T.I., Сушко O.O., Макогоненко Е.М.,Соколовська Л.І., Сенчук А Я. Оцінка стану юваги між згортаючою та фібринолітичними системами крові у практично здорових людей різного алогічного стану за допомогою оригінального експрес-методу// Фізіолог.журн.-1993.-39, N 1,4-28.

36. А.с. 1338151 СССР,МКИ А61 К 37/47. Метод получения тканевого активатора іазминогена из животного сырья// Кудинов С.А.,Макогоненко Е.М.,Назаренко H.A. (СССР)/ явлено 25.04.85 ; Опубл. 15.08.87.

37. А.с. 1777089 СССР, МКИ G01 N 33/87 . Способ исследования свертывания крови// Лежен И., Колесник Л.А, Крамарев С.А, Мартынкж Т.В., Макогоненко Е.М., Андрианов С.И., Кудинов

A.(СССР)/Заявлено 08.06.90; Опубл.23.11.92. Бюл.№43 .

38. Токар А.В.,Сушко О.О.,Платонова Т.М., Лукінова Н.І.,Єна Я.І., Макогоненко Є.М.,Петров

B.,Лежен Т.І.,Соловйов Д.О. Сучасні метода лабораторної діагностики внуїрішньосудинного крозгортання крові// Методичні рекомендації.-Ктв.-1995 ,-С. 11.

акогоненко Є.М. Активація фібринолітичної системи в процесі утворення фібринового згустка. -

'КОПИС.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 ііохімія. Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України, Київ, 1997.

Дисертацію присвячено питанням механізму активації фібринолітичної системи в процесі іворення фібринового згустка. В дисертації встановлена провідна роль дезААфібрину в функції бринолітичної системи; знайдено, що стабілізація фібринового згустка ФХПІа пригнічує його іекторні властивості; доведена ключова роль ДДЕ тріади протофібрили в активації фібринолітичної стеми. Запропонована тривимірна модель молекули фібрин(оген)у, ДДЕ тріади, фібрили і гаваторних комплексів плазміноген-тканинний активатор плазміногену на фібриновій фібрилі, зроблена теоретична схема гемостатичного балансу на рівні фібринового згустку і проаналізовано ови, що визначають стан гемостатичного балансу в плазмі крові.

Ключові слова: фібринолітична система, плазміноген, t-PA, фібриноген, фібринова фібрила, юстатичний баланс.

когоненко Е.М. Активация фибринолитической системы в процессе образования фибринового ?гка. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 10.04 - биохимия. Институт биохимии им. АВ.Палладина НАН Украины, Киев,1997.

Диссертация посвящена вопросам механизма активации фибринолитической системы в мирующемся фибриновом сгустке. В диссертации доказана ведущая роль дезААфибринового тка в выполнении функции фибринолитической системой; найдено, что стабилизация ринового сгустка ФХШа угнетает его эффекторные свойства; доказана ключевая роль ДДЕ

Підписано до друку 22.01.98р. Формат 60x90/16. Ум. друк, арк.2.0, Обл.-вид. арк. 1,6.

Наклад 100. Зам. 25.

Відділ оперативної поліграфії Центру Міжнародної освіти 227-12-75, 227-37-86