Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протимозин альфа: ядерный белок, присоединяющий тРНК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Протимозин альфа: ядерный белок, присоединяющий тРНК"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРС ГВЕ1111ЫЙ У1НШНРСПТНТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Л У КАШ ЕВ Дмитрий Евгеньевич

ИРОТИМОЗИН АЛЬФА: ЯДЕРНЫЙ БЕЛОК, ПРИСОЕДИНЯЮЩИЙ тРНК

03.00.03- Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в отделе химии и биохимии нуклеопротеидов НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор химических наук Варгапетян А.Б.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук Добров E.H.

кандидат биологических наук Гмыль А.П.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт бнооргапической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

I 1 ^ \ /

Защита состоится в\^/часов X, 1998 года на заседании Диссертационного совета

053.05.70 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факулыста МГУ им. М.В. Ломоносова.

1

Автореферат разослан (сентября 1998 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук

Каграманов В.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Центральную роль в процессах жизнедеятельности клетки играют различные РЖ-белковые комплексы. В большинстве своем, эти комплексы могут быть разделены на белковую и РНК составляющие при денатурирующих обработках, поскольку основаны на нековалентных взаимодействиях. Однако, в клетке существуют и ковалентные комплексы белка и РНК. Примерно четвертая часть РНК-содержащих вирусов эукариот имеет необычную структуру на 5-конце РНК, выделенной из вирионов, - ковалентно присоединенный низкомолекулярным вирусный белок, называемый VPg (viral protein genome-linked), который играет важную роль в процессе вирусной репликации. По сравнению с вирусными ковалентными РНК-белковыми комплексами, их клеточные аналоги пока мало изучены. На сегодняшний день наиболее охарактеризован лишь комплекс, образованный 5.8S рРНК и продуктом клеточного антнонкогена белком р53. Также, ковалентный комплекс с РНК способен образовывать протимознн альфа (ПроТ а) - небольшой (13 кДа) эволюционно консервативный ядерный белок, в больших количествах обнаруживаемый в быстро делящихся клетках эукариот. В клетках асцитной карциномы Кребс 2 мыши ПроТ а ковалентно связан с неизвестной РНК длиной около 20 нукпеотидов. Подобные РНК-ПроТ а комплексы были найдены п в других эукариотических организмах. ПроТ а является жизненно важным белком, принимающим участие в клеточной пролиферации, однако конкретная функция и механизм действия ПроТ а до сих пор неизвестны. Установление нуклеотндной последовательности связанной с ПроТ а РНК могло бы пролить свет на его функции.

Если способность ПроТ а млекопитающих присоединять РНК является свойством самого белка, то возникает вопрос, не может ли рекомбинантный ПроТ а высших эукариот сохранять эту способность при продукции в клетках E.coli. В этом случае, введя в последовательность рекомбинантного ПроТ а небольшую модификацию, облегчающую выделение ПроТ а и его комплекса с РНК, такой комплекс можно будет получить в индивидуальном виде и исследовать.

Цель работы. Целью настоящей работы было установить, сохраняет ли ПроТ а высших )укариот способность присоединять РНК в клетках E.coli, с какой РНК он может шимодействовать, что представляет собой данный РНК-белковый комплекс и какие участки 1 молекуле ПроТ а обеспечивают ему возможность присоединять к себе РНК. Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе установлено,

!то рекомбинантный ПроТ а крысы и человека, синтезируемый в клетках E.coli, обладает :пособностью присоединять РНК. Таким образом, способность ПроТ а образовывать юмплекс с РНК является свойством самого белка, а не клеточного аппарата высших эукариот. Наличие гексагистндинового «тэга» у рекомбинантного ПроТ а по молило очистить и

охарактеризовать его комплекс с РНК. Был идентифицирован РНК-комггонент образуемог комплекса: им оказался набор тРНК, которые присоединены к ПроТ <х споим S'-концом i имеют свободный 3'-конец. Присоединение тРНК к ПроТ а носит ковалентный характер.

Выявлено несколько независимых мест присоединения тРНК к ПроТ а локализованных вблизи N- и С-концевых кластеров остатков основных аминокислот г молекуле ПроТ а. Отдельные фрагменты ПроТ а сохраняют способное'! ь присоединять тРНК но необходимым условием образования комплекса, по-видимому, является наличие в белк! остатков основных аминокислот. Поскольку С-концевой кластер представляет собой сигнш ядерной локализации ПроТ ос, то можно ожидать, что присоединение к нему болыио! отрицательно заряженной молекулы тРНК должно маскировать его и, таким образом, влият! на внутриклеточную локализацию ПроТ а в клетках эукариот.

Публикации н апробация работы. По материалам диссертации опубликовано < научные работы. Результаты исследований докладывались на VI Международно! конференции по биохимии и молекулярной биологии памяти Л.Л.Белозерского, Москва, 1995 на Международной конференции «The First Annual Meeting of The RNA Society», Мэдисон США, 1996 г., на II съезде Биохимического Общества РАН, Москва, 1997 г. и на 13-n Французско-Российском симпозиуме «Структура и регуляция эукарнотпческмх генов» Монпелье, Франция, 1997.

Структура н объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы результатов и обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемо! литературы. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста и содержит 3! рисунков и 5 таблиц. Список литературы включает более 100 источников публикаций.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Для того, чтобы понять, способен ли ПроТ а млекопитающих присоединять РНК, ] клетках E.coli был продуцирован рекомбинантный ПроТ а крысы и человека, несущий на С конце последовательность из 6 гнстидиновых остатков, что позволило очищать белок i помощью аффинной хроматографии на смоле Ni-NTA. С помощью этого подхода удалое] идентифицировать ковалентный комплекс, образуемый ПроТ а и бактериальной РНК выделить и охарактеризовать его, а также определить последовательность связанной с ПроТ с РНК.

1. Продукция ПроТ а млекопитающих в клетках E.coli.

На основе вектора pQE70 были сконструированы плазмиды pQN и pQH содержащие под контролем сильного промотора фага Т5 белок-кодирующую часть кДШ

ПроТ а крысы и человека, соответственно, где на С-конце рекомбинантный ПроТ а дополнительно нес шесть гистидиновых остатков (рис.1 А). Помимо шестигистидинового блока был добавлен остаток тирозина, что позволило включать в белок радиоактивную метку с помощью Следует ел метить необычное строение молекулы ПроТ «. Ого

чрезвычайно кислый гидрофильный белок: половина аминокислотных остатков, входящих в состав молекулы ПроТ а, представляют собой остатки дикарбомовых аминокислот. Наиболее продолжительный участок этих остатков расположен в центральной части молекулы, разделяя два блока остатков основных аминокислот, расположенных в Ы- и С-концевых областях ПроТ а. С-конневой кластер КЯ...КК(ЖК входит в состав двучастичного сигнала ядерной локализации ПроТ а, обеспечивающего направленный транспорт Про'Г а в ядро, роль Ы-концевого блока пока неясна.

Рис.1 (А) Последовательность рекомбинантнаго ПроТ а крысы. Подстрочно в скобках указаны отличающиеся аминокислотные остатки в молекуле ПроТ а человека. Подчеркнуты остатки основных аминокислот.

(Б) Очистка рекомбинантиого ПроТ а крысы с помощью хроматографии на Л7-

!УТА агарозе. Анализ отдельных фракций (1-4) при помощи электрофореза в 8% ПЛАГ с 7М мочевиной: 1- несвязавшиеся со смолой РНК; 2, 3- промывочные стадии; 4- элтция связавшегося со смолой ПроТ а раствором имидазола; 5- ПроТ а крысы без гексагистидинового «тэга» (маркер). Окрашивание геля метиленовым синим.

(А)

.10 .20 30 4(1

5ОААУПТ88Е1ТТКОЬКЕККЕУУЕЕАЕМОВОАРЛЫОЫА0Ш7НЫО

! - )

.50 60 70 80

ЕОЕАО^УОЕЕЕЕЕООЕЕЕЕЕЕЕЕСООЕЕЕПСОЕОЕЕЛЕЛРТОК

( Я * Л I

.90 .100 .110

АЕОБЕОООУЕТККС)ККТОЕОО УННП ИНН

(А) (О) П

г .-г—|

(Б)

Наличие гексагистидинового «тэга» позволило эффективно очищать рекомбинантный белок с помощью хроматографии 11а Ni-NTA агарозе (рис.1 Б). Количество ПроТ а, синтезируемого в клетках E.coli, содержащих плазмиды pQN и pQH, составляло около 10% от суммарного клеточного белка.

2. Обнаружение РНК-белкового комплекса в клетках E.coli, продуцирующих ПроТ а.

Для поиска возможного комплекса ПроТ а-РНК клетки E.coli, продуцирующие ПроТ а крысы, выращенные на среде, содержащей [32Р]-ортофосфат, разрушали кипячением в присутствии додецилсульфата натрия и полученные лизаты подвергали фенольной депротеинизации - процедуре, при которой клеточные белки переходят в фенольную фазу, а ПроТ а и его комплекс с РНК остаются в водной фазе благодаря уникальным свойствам ПроТ а. Препарат, содержащий клеточные РНК и рекомбинантный ПроТ а, очищали хроматографией на Ni-NTA агарозе в денатурирующих условиях, тем самым удаляя свободные РНК. В элюате связавшейся со смолой материн была обнаружена [32Р]-радноактивность. В результате последующего анализа этой фракции методом электрофореза в ПААГ, содержащем 7М мочевину, было обнаружено высокомолекулярное [32Р]-содержащее соединение, чувствительное к обработке протеиназой К (рнс.2 А). Данное соединение отсутствовало в препарате клеток, трансформированных вектором pQE70, несодержащии: кДНК ПроТ а. Продукт протеолиза обнаруженного комплекса обладал элсктрофоретическо! подвижностью РНК длиной около 70 нуклеотидов и был устойчив к действию фосфатазы i ДНКазы I, но полностью гидролизовался РНКазой А (рис.2 Б). Таким образом, комплекс образующийся в клетках E.coli, продуцирующих ПроТ а крысы, является комплексом белка i РНК.

Рис. 2 (А) Обнаружение протеазо-чувствительного [ Р]-содержащего соединения , клетках, продуцирующих ПроТ а крысы: 1- необработанный препарат; 2- препарат обработанный протеиназой К; 3- препарат из клеток, ne синтезирующих IIpoT а. ХС положение красителя ксиленцианола. Радиоавтограф 8% ПААГ с 7М мочевиной. (Б) Установление природы вещества, связанного с белком: 1- обработк бактериальной щелочной фосфатазой; 2- обработка РНКазой А; 3- обработка ДНКазо,

I; 4- без обработки. Радиоавтограф 8% ПААГ с 7Ммочевиной.

Судя по способности обнаруженного комплекса связываться с аффинным сорбентом, его белковым компонентом является рекомбинантный ПроТ га, несущий гексагиспщнновый «тэг». Более того, отсутстзие данного PIfK-белкового комплекса в клетках E.coli, не синтезирующих ПроТ а, говорит о том, что по крайней мере, Про'Г а необходим для образования такого комплекса. Для дополнительного подтверждения тою. что ПроТ а нхпднг в состав комплекса, в [12Р]-меченып по РНК комплекс была введена [12511- метка в белок с помощью Nal3!I. Далее, меченый но РНК и по белку комплекс гндролизовали РНКазой А. Полученный в результате гидролиза РНКазой белок демонстрировал в геле подвижность ПроТ а. Таким образом, белковым компонентом РНК-белкового комплекса, выделяемою из клеток E.coli, продуцирующих ПроТ а крысы, является рекомбинантный ПроТ о. Следует отметить, что несмотря на большое количество ПроТ << синтезируемого в клетках продуцента, количество комплекса ПроТ ot-1'HK, выдел;!- .. :п этих клеток по имеющейся методике, составляет небольшую часть ио отношению к свободному белку и не може! быть визуально определено при окрашивании геля.

Поскольку было известно, что в составе комплекса ПроТ о-РНК, выделенною из клеток мыши, белок присоединен к ."¡'-концу РНК. была предпринята попытка чокатизовагь ПроТ а относительно РНК в составе его комплекса, образуемого в клетках Е coli. Немеченый препарат комплекса из клеток E.coli был очищен на смоле Ni-NTA и разделен на две части. Одну часть мегшш по 5'-концу с помощью [у- 1;Р]-АТР и 4M тюлннуклеотнлкннпн.т. Вторую половину препарата метили при помощи Т4 РНК-лигазы 5'[з:Р]-цитндин-3'диф0сфа10м (рСр). Выяснилось, что РНК, входящая в состав комплекса, способна присоединять рСр к З'-концу и неспособна метиться по 5'-концу, то есть имеет свободный 3'-конец и блокированный, очевидно белком, 5'-конец (рис. 3), точно так же, как и РНК-компонент комплекса, выделенного из клеток мыши.

Рис. 3 Анализ препаратов РНК-белкового комплекса, меченых: 1- 1у-"Р/Л TP и 2-4- /"/'/-пСр: 2- без обработки; 3- обработка РНКазой А; 4- обработка протеинами К.

Радиоавтограф 8% ПААГс 7Ммочевиной._

1 2 3 4

Представлялось существенным доказать, что добавленные на С-конец ПроТ а б гистидиновых остатков не являются причиной образования обнаруженною комплекса РНК-ПроТ а. Для выделения комплекса РНК с ПроТ а, не содержащим 6-гистндинового довеска, были решено воспользоваться клетками Е.соИ, продуцирующими немодифицированнын ПроТ а человека с плазмиды рНР12. Препараты из клеток, продуцирующих ПроТ а без гексагистндинового «тэга», фракционировали хроматографией на ОН-52 целлюлозе, а затем на смоле СЬе1ех-100, заряженной ионами цинка, используя недавно обнаруженное свойство ПроТ а связывать ноны 7.п2*. Связавшиеся с носителем соединения элюировали раствором ЭДТА и метили [3"Р]- рСр с помощью Т4 РНК-лигазы. При анализе продуктов мечения электрофорезом в ПААГ был обнаружен РНК-белковый комплекс, движущийся в геле немного быстрее, чем вышеописанный комплекс РНК с ПроТ а, содержащим гексагпстидиновый «тэг» (рис. 4). Таким образом, добавление гистидинового «тэга» к молекуле ПроТ а не является причиной образования комплекса ПроТ а с РНК.

Рис. 4 Комплекс РНК и ПроТ си А - с гексагистидиповым «тэгом»; Е- без гексагистидинового «тэга»; 1, 4- без обработки; 2, 5- обработка протеиназой К; 3, 6-обработка РНКазой А. Радиоавтограф 8% ПААГ с 7Ммочевиной.

(А) 1 2 (Б) 3 4 5 6

т т <т

3. Идентификация РНК, связанной с ПроТ а.

Одной из задач данной работы была идентификация РНК, которую може присоединять к себе ПроТ а. Подвижность РНК-компонента комплекса, образуемого рекомбинантным ПроТ а крысы в клетках Е.соИ, совпадала с подвижностью тРНК, однак предстояло однозначно установить ее первичную структуру. Для определения нуклеотидно последовательности связанной с ПроТ а РНК были созданы необходимые условия: имелс препарат комплекса, очищенный от свободных РНК, а терминальная метка на 3'-конце РНК компонента комплекса позволяла секвенировать эту РНК методом химических модификацш Снквенс выявил гетерогенность РНК, связанной с ПроТ а, однако удалось определит последовательность небольшого консервативного участка, начинавшуюся примерно с 1

нуклеотида от 3' конца РНК, которая, как оказалось, соответствовала консервативному участку Т'РС петли тРНК.

Для определения последовательности исследуемой РНК была предложена схема, изображенная на рис. 5 А. Очищенный комплекс ПроТ а-РНК обрабатывали протеиназой К. На полученной РНК-матрице осуществлялась обратная транскрипция со статистической затравки в присутствии меченого fa- "PJdATP. Проду кты обратной транскрипции фракционировали электрофорезом в ПААГ и элюировали продукт, имевший максимальную длину. Затем к З'-концу полученной кДНК присоединяли олигодезоксирпбонуклеошдный адаптор Л с помощью Т4 РНК-лигазы и проводили ПЦР с А'-праймером, комплементарным данному адаптору, и с Т-праймером, синтезированным на основе определенной епквепсом последовательности. Полученный продукт ПЦР длиной около 80 нуклеотидов клонировали в вектор pUCI9 и определяли последовательность фрагмента в одном из полученных клопов. Оказалось, что последовательное!ь полученной кДНК соответствует участку от 10 до 64 нуклеотида лизиновоп тРНК E.coli. Тот факт, что обратная транскриптаза сумела достроить цепь кДНК почти до S'-конца РНК, дополнительно подтвердил, что ПроТ а присоединен в непосредственной близости от 5' конца этой тРНК. Для того, чтобы проверить, действительно ли tPHKIvs является компонентом комплекса ПроТ а-РНК, кД11К1л" была подверг ну ia блот-гибридизации с [''['¡-меченым РНК-компонентом исследуемого комплекса. В качестве контроля использовали мутаптную кДНК,у!!, которая отличалась от кДНК1" дикого шил 6 нуклеотидными заменами. Выяснилось, что кДНК1'5 дикого типа, но не мутаптная кДНК1", гибриднзуется с РНК-компонентом комплекса ПроТ а-РНК, а значит, tPHKl>s действительно входит в состав этого комплекса (рис. 5 Б).

Рис. 5 (А) Схема определения иуклеотидпой последовательности РНК, связанной с ПроТ а.

(Б) Блот-гибридтация [,2Р]-меченого РНК-компонента комплекса ПроТ а-РНК с: 1-кДНКдикого типа; 2- мутантной кЛНК1".

(А ) (Б)

. -рнк , п*

О обрати; я транскрипция тт

3- А 3- Я- к Д Н К г. •

sy л игир о j а и и е ада тора

А * х

X ГС J'

О ПЦР

о тР II КИ!

Неоднородность РНК-компонента комплекса, выявленная химическ! секвенированием, наводила на мысль, что в состав комплекса входит набор клеточных тРН1 Для подтверждения эюй гипотезы популяция РНК, связанных с ПроТ а, полученная результате обработки [32Р]-меченпого комплекса ПроТ а-РНК протеиназой К, бьи фракционирована при помощи двумерного гель-электрофореза, используемого для разделен! тРНК. Радиограмма 1сля, представленная на рис. 6, демонстрирует широкий спектр PHJ исходно входящих в состав комплекса ПроТ а-РНК.

Рис. 6 Разделение ¡'ПК, входящих в состав комплекса ПроТ а-РНК, с помощь, двумерного гель-злектрофореза. Стрелками показаны индивидуальна охарактеризованные РНК. Радиоавтограф ПААГ.

Несколько индивидуальных РНК были элюированы из геля и подвергнут химическому ссквенпрованню. Они были идентифицированы как тРНК, у\ тРНКз5ег, тРНКг"' тРНК „Мс|. При этом IР11К'л4 была тем самым определена двумя независимыми способам вероятно, вследствие ее большею количества по отношению к другим тРНК, связанным ПроТ и. Несколько других РНК не были полностью идентифицированы вследствие I негомогенностн, по все они содержали характерные нуклеотидные последователыюст общие для тРНК, в частности ТЧ'С участок. Таким образом, в состав комплекса с ПроТ входит широкий спектр бактериальных тРНК.

4. Определение харакгтера присоединения тРНК к ПроТ «.

Устойчивость комплекса ПроТ а-тРНК в процессе выделения, включающего стад! кипячения в 10% ДСП, фенольной депротешшзации, денатурирующего гель-электрофорез хромаю!рафии на Ы1-Ы'1'А а1арозе в 8М мочевине, инкубации в высокой соли и т.; практически исключает возможность того, что компоненты комплекса ассоциированы лив за счет существования водородных, ионных или гидрофобных взаимодействий между тРНК ПроТ а. Кроме того, тРНК не отщепляется при вышеперечисленных обработках не только полноразмерного ПроТ а, по и от имеющих небольшую длину пептидов, образующихся резулыате обработки комплекса ПроТ а-тРНК трипсином (см. ниже), то есть, да)

г

небольшие пептиды прочно присоединены к тРНК. Таким образом, связь между тРНК и ПроТ а, по-видимому, носит ковалентный характер. Основываясь на информации об известных ковалентных соединениях между аминокислотами и нуклеотидами, было предположено, что присоединение ПроТ а к тРНК может осуществляться либо за счет фосфоамидной связи между нуклеотндом тРНК и остатком основной аминокислоты ПроТ а, либо за счет фосфодиэфирной связи между нуклеотндом тРНК и остатком оксиаминокислоты ПроТ а.

Устойчивость комплекса ПроТ а-тРНК при обработке 4М гидроксиламином рН 5, 15% уксусной кислотой и 0.1М соляной кислотой, а также устойчивость к этим обработкам связанных с тРНК триптических пептидов комплекса делают маловероятным существование фосфоамидной связи между ПроТ а и тРНК. Связь тРНК с ПроТ а также устойчива в растворе щелочи, до тех пор, пока не начинается гидролиз самой РНК, что делает маловероятным существование фосфодиэфирной связи между РНК и белком. Таким образом, на основании устойчивости комплекса ПроТ а-РНК к различным обработкам можно утверждать, что присоединение тРНК к ПроТ а носит ковалентный характер, и эта связь, скорее всею, не является ни фосфоамидной, ни фосфодиэфирной.

5. Локализация места присоединения тРНК к молекуле ПроТ а.

Для определения в молекуле ПроТ а места, к которому присоединена тРНК, использовали гидролиз [32Р]-мечсмого по РНК комплекса ПроТ <<-тРНК трпненном, гидролизующим пептидную связь после остатков основных аминокислот, и анализировали полученные трнптические пептиды ПроТ а, связанные с тРНК, по их способности :вязываться с ЬП-ЫТА, то есть наличию у этих пептидов гнетидинового «тэга», и по их массе. Фракционирование [32Р]-меченых РНК-пептидов хроматографией на №-ЫТЛ агарозе, а затем )лектрофорезом в денатурирующем геле с мочевиной показало, что с РНК связаны два <оротких пептида «А» и «В», не содержащих гистидиновый «тэг» (они не задерживались на ^¡-ЫТА агарозе) и два пептида «Е» и «В», содержащих гистидиновые остатки, которые ¡адерживались на смоле №-Ш"А (рнс.7 А). Самый меньший из РНК-пептидов имел тодвижность свободной тРНК. Подвижность этих триптических РНК-пептидов относительно хруг друга сохранялась и когда они были элюированы из ПААГ с мочевиной и троанализированы с помощью гель-электрофореза по ЬаеттН (рис.7 Б). Таким образом, ¡азница зарядов триптических РНК-пептидов соответствует разнице их массы. При помощи ¡елковых маркеров были определены приблизительные молекулярные веса этих РНК-1ептидов: «А»- 21 кДа ; «В»- 23 кДа; «С»- 31 кДа; «О»- 24 кДа; «Е»- 26 кДа; полноразмернын :омплекс ПроТ а-тРНК- 40 кДа. Масса свободной тРНК, а также РНК-компонента этих Р11К-■ептидов после обработки протеиназои К, приблизительно равнялись 20 кДа. Чпая

молекулярный вес ПроТ а (13 кДа), можнб полагать, что в состав комплекса ПроТ а-тРНК входит одна молекула тРНК и одна молекула ПроТ а.

Рис. 7 (А) Гидролиз комплекса ПроТ а-РНК трипсином с последующим фракционированием па №-№ТА агарозе и электрофорезом в ПААГ с мочевиной. 1-комплекс ПроТ а-тРПК, не обработанный трипсином; 2- несвязавшиеся с №-ЫТА агарозой триптические РНК-пептиды; 3- связавшиеся с №-1ЧТА агароюй триптические РНК-пептиды; 4- обработка протеиназой К. Радиоавтограф 8% ПААГ с 7М мочевиной. (Б) Анализ триптических РНК-пептидов комплекса ПроТ а-тРПК в ДСН-денатурирующем геле по ЬаеттЧ. Б/0=без обработки; А, В, С, I), Е =РНК-пептиды, элюированные из ПААГ с мочевиной. Радиоавтограф 18% ПААГ.

(А)

12 3 4

В

D ф

(Б)

Б/0 А В С D К

Е

Выяснилось, что РНК-пептиды «С»и «Е» являются продуктами неполного трипсинолиза. При их повторной обработке трипсином РНК-пептид «Е» дал набор из трех РНК-пептидов «А», «В» и «D», а РНК-пептид «С»- РНК-пептиды «А» и «В». Таким образом, при исчерпывающем гидролизе трипсином комплекса ПроТ а-тРНК должны образовываться три коротких пептида, связанных с тРНК: «А», «В» и «D». Более того, эти пептиды входят в состав С-концевого гистидинсодержащего фрагмента ПроТ а «Е».

Следовательно, место, или места присоединения тРНК расположены вблизи С-конца ПроТ а. Установив, что тРНК присоединяется к С-концу ПроТ а, решено было проверить, является ли С-концевой фрагмент ПроТ а достаточным для взаимодействия с тРНК. Для этого была создана плазмида pQC, содержащая кДНК С-концевой части ПроТ а крысы начиная с остатка треонина-86, с 6 гистидиновымн остатками на С-конце (рис.9 А IV). Выяснилось, что этот С-концевой пептид ПроТ а, продуцируемый в клетках E.coli, способен присоединять тРНК так же, как и полноразмерный ПроТ а (рнс.8 А). Набор триптических РНК-пептидов целого ПроТ а, связанного с тРНК, подобен триптическим РНК-пептидам комплекса, образованного С-концевым фрагментом ПроТ а (рнс.8 Б). Таким образом, С-концевой фрагмент ПроТ а, включающий в себя двучастичный сигнал ядерной локализации, достаточен для присоединения тРНК.

Рис. 8 (А) Обнаружение комплекса, образованного С-концевым фрагментом (86-111) ПроТ а с тРНК: 1- комплекс тРНК- ПроТ а дикого типа; 2, 3, 4- комплекс тРНК с С-концевым фрагментом ПроТ а: 2- необработанный комплекс; 3- обработка РНКазой А; 4- обработка протеиназой К. Радиоавтограф 8% ПААГ с 7Ммочевиной. (Б) Триптический гидролиз комплекса С-копцевого фрагмента ПроТ а с тРНК: 1-необработанный трипсином комплекс; 2- фракция гидролизата, несвязавшаяся с №-1УТА агарозой; 3- фракция гидролизата, связавшаяся с №-1ЧТА агарозой. Радиоавтограф 8% ПААГ с 7М мочевиной.

(Л) (Б)

12 3 4

Опираясь на знания о вирусных и некоторых клеточных ковалснтных РНК-белковых :омнлексах, было предположено, что тРНК присоединяется к одному из греониновых (статков, расположенных в С-концевой части молекулы ПроТ а, хотя вследствие стойчивости комплекса ПроТ а-тРНК в щелочи вероятность существования юсфодиэфирной связи была мала. Был получен точечный мутант Про'Г а. в котором остатки реошша в положениях 86, 101 и 107 были заменены на аланиновые остатки. Однако этот утант ПроТ а по-прежнему сохранял способность присоединять тРНК и имел идентичный с эмплексом ПроТ а дикого типа набор триптических РНК-пептидов. Таким образом, рисоединение тРНК к С-концу ПроТ а не является аналогичным существующему у фусных ковалентных комплексов типом фосфодиэфирной связи между остатком ссиамннокислоты белка и концевым нуклеотидом РНК.

Существование участка присоединения тРНК в С-концевой части ПроТ а не •ключало возможность того, что тРНК может присоединяться и к другим местам внутри )лекулы ПроТ а. Для проверки этого предположения была создана конструкция рО'А'С, дирующая участок ПроТ а крысы от >1-конца до остатка глутаминовой кислоты в ложении 83 с гистидиновым «тэгом» на С-конце (рис.9 А V), то есть экспрессирующая >оТ а без С-концевого фрагмента, компетентного в присоединении тРНК. Неожиданно азалось, что подобный делеционный мутант ПроТ а также способен ковалеитно

связываться с тРНК. Обработка полученного комплекса трипсином привела к образованию двух коротких пептидов, несодержащих гистидинового «тэга» (рис.9 Б).

Таким образом, тРНК может присоединяться и к С-концу ПроТ а, и к его М-концевой части. При этом короткие безгистидиновые триптические пептиды С- и Ы-концевых участков, связанные с тРНК, обладают сходной электрофоретической подвижностью и не могут быть разделены в геле.

Рис. 9 (А) Схема производных ПроТ а, полученных в настоящей работе. Надстрочно указано положение аминокислотных остатков от Ы-конца полноразмерного ПроТ а. Вертикальные полосы обозначают остатки основных аминокислот. Закрашенный прямоугольник тооралсает б-гистидиновый «тэг».

(А)

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

сп п: i ; 11 о i ел m i

: 110 I

1 II 1 II D 1111

1 1 ID

ОПТСРОКИНАЗЛ

í

! ПО I

Ж

[lEiii::: ГНИ I

ГГЛ I

и:

[ггп:

п п

Х~Л1

: пв ш

(I)pQN: ПроТ а крысы (1-111)

(II)pQH: ПроТ а человека (1-109)

(III)pQYD: ПроТ а крысы без дополнительного остатка тирозина (1111)

(IV)pQC: С-концевой участок ПроТ а (86-111)

(V)pQWC: N-концевой участок ПроТ а (1-83)

(VI)pQD4K: ПроТ а с внутренним сайтом разрезания энтерокиназы (1-111)

(VH)pQT: ПроТ а крысы с заменой в 3 С-концевых Thr на Ala (1-111). Звездочками отмечены замененные остатки треонина.

(VIII)pQARS: ПроТ а без сигнала ядерной локализации (1-98)

(IX)pQRS: ПроТ а без сигнала ядерной локализации с дополнительным остатком аргинина (1-101)

(X)pQWN: ПроТ а без N-концевой части(15-111)

(XI)pQAT: ПроТ а без а-тимозиновой части (29-111)

(XII)pQM: ПроТ а без N-конца и без сигнала ядерной локализации (15-101)

(XIII)pQAE: ПроТ а без а-тимозиновой части и без сигнала ядерной локализации (29-101)

(XIV)pQAc: Кислая область ПроТ а без остатков основных аминокислот (32-83)

(XV)pQGR: Кислая область ПроТ а с остатком аргинина-30 (29-83)

(XVI)pQKRR: Кислая область ПроТ а до сигнала ядерной локализации 32-101)

(XVII)pQaT: тимозин а, (1-28)

>) Фракционирование продуктов триптического гидролиза комплексов, образованных юизводными ПроТ а с тРНК: 1- без обработки; 2- несвязавшиеся с Ш-ЫТА агарозой НК-пептиды; 3- задержавшиеся на 1\Ч-№ТА агарозе РНК-пептиды. Радиоавтограф 8% ААГс 7Ммочевиной.

1 V 2 3 1 VIII 2 3 XV 1 2 3

ф> * 1* •

Для того, чтобы понять, являются ли N и С-концевые части белка равноценными для рисоединения тРНК , и часть тРНК в популяции комплекса ПроТ а-РНК присоединена к С-энцевой области, а часть- к Ы-концевой области ПроТ а, или же они взаимозаменяют друг руга в случае делеционных мутантов ПроТ а р(?С и р(3\УС, последовательность ПроТ а была зменена таким образом, что в положение 84 белка был введен сайт энтерокиназы, зецифической протеазы, узнающей последовательность АБр-Азр-Авр-Азр-Ьуз (рис.9 Л VI). аким образом, гидролиз ПроТ а энтерокиназой должен приводить к образованию пептида роТ а от Ы-конца до 84 аминокислотного остатка, то есть аналогичного синтезируемому с лазмиды р(}\УС, и С-концевого (идентичному продукту экспрессии рС?С) пептида с гстидиновым «тэгом». После фракционирования продуктов гидролиза энтерокиназой еченого по РНК комплекса ПроТ а-РНК на смоле М-ЫТА и последующего разделения ракций в геле выяснилось, что тРНК присоединена как к Ы-концевон части ПроТ а, езадерживающейся на ЬП-ЫТА агарозе, так и к С-концевой части, содержащей жсагистидиновый «тэг» (рис.10 А). Поскольку, как говорилось выше, вероятнее всею, с цной молекулой ПроТ а связана одна молекула тРНК, то комплекс ПроТ а-РНК редставляет собой набор тРНК, присоединенных к разным местам в молекуле ПроТ а. ледует отметить, что энтерокиназа гидролизует ПроТ а лишь частично, что и обуславливает аличие существенного количества исходного комплекса в треке 3 рис. 10 А. Оба бразовавшихся в результате гидролиза энтерокиназой РНК-пептида, отмеченных на рис. 10 . «Ы-К» и «С-К», были элюированы из геля и подвергнуты обработке трипсином. Как и жидалось, из обоих продуктов «И-К» и «С-К» образуются два коротких иезадерживаюшихся

13

на №-ЫТА агарозе триптических РНК-пептида (А' и В', А и В, соответственно), а из С-концевого РНК-пептида, кроме них еще и связывающийся с никелевой смолой триптический РНК-пептид «О» (рис.10 Б).

Рис.10 (А) Гидролиз комплекса ПроТ а-тРНК энтерокиназой, с последующей хроматографией на №№ТА агарозе: 1- без обработки; 2- фракция гидролизата, несвязавшаяся с Л7-ЛТ/1 агарозой; 3- фракция гидролизата, задержавшаяся на Л7-ЛТ/1 агарозе. Радиоавтограф 8% ПААГс 7М мочевиной.

(Б) Триптический гидролиз РНК-пептидов комплекса ПроТ а-тРНК, полученных в результате гидролиза энтерокиназой: 1- №копцевой РНК-пептид без обработки; 2-обработка трипсином Ы-концевого РНК-пептида; 3- С-концевой РНК-пептид без обработки; 4- триптический гидролизат С-концевого РНК-пептида, несвязавшийся со смолой АЧ-НТА; 5- триптический гидролизат С-концевого РНК-пептида, задержавшийся на смоле Л'|-ЛТ/1. Радиоавтограф 8% ПААГ с 7М мочевиной.

(В) Схема присоединения тРНК к молекуле ПроТ а. Вертикальные полосы обозначают остатки основных аминокислот. Заштрихованный прямоугольник изображает 6-гистидиновый «тэг». Скобками обозначены предполагаемые триптические пептиды ПроТ а, к которым присоединена тРНК. Черными прямоугольниками показаны /V- и С-концевые кластеры остатков лизина, присоединение тРНК к которым способно объяснить образование наблюдаемых тРНК-пептидов.

(А)

ш

1 2

3 4

\ В' * А'

В

А-

О

(В)

10 20 30 40 50 60 70 80

90

100

110

I—

пи г

гв

I)

1111 I II _ц

I

Е

Таким образом, исходя из полученных данных, можно заключить, что детектируются [два соединенных с тРНК триптическтгх пептида ПроТ а, происходящие из N-концевой части белка, и три - из С-концевой части. Этот результат также подтверждает предыдущее заключение, сделанное при анализе укороченного с С-конца мутанта ПроТ а, о том, что каждый из РНК-пептидов «А» и «В» является смесью тРНК-связанных пептидов (А' и Л, В' и В) со сходной электрофоретической подвижностью. Можно интерпретировать наблюдаемую картину следующим образом. На рис. 10 Б представлена картина тринтпческого гидролиза С-концевого РНК-пептида «С-К», практически идентичного продукту экспрессии плазмидм pQC (рис.8 Б). РНК-пептнд «D» с гистиднновым «тэгом» должен соответствовать тРНК , связанной с пептидом от положения 103-106 до С-конца, более крупный безгнстпдиновый РНК-пептид «В», видимо, представляет собой тРНК с пептидом с 89-90 по 102-106, и меньший «А» - т РНК с пептидом 103-104 по 105-106 аминокислотный остаток (рис.10 В). При гидролизе трипсином РНК-связанного N-концевого пептида с 1 по 83 остаток («N-K»), образующеюся после обработки комплекса ПроТ rx-тРНК энтерокиназой, получаются два коротких тРПК-связанных пептида, из которых меньший «А'» может представлять собой тРНК-связанный пептид из нескольких аминокислот участка с 15 по 20. Более крупный РНК-пептид «В'» может являться смесыо двух РНК-пептидов, соответствующих связанных с тРНК участкам ПроТ а с 1 по 17-20 не 15-18 по 30 аминокислотный остаток. Таким образом, в обоих случаях присоединение тРНК к одному из двух кластеров остатков лизина с 14 по 20 и с 102 по 106 в молекуле ПроТ а способно объяснить наблюдаемую картину тринтпческого шдролиза комплекса.

Для подтверждения локализации присоединения тРИК внутри молекулы ПроГ а был применен делеционный анализ белка. Были получены и экспрессированы в клетках E.coli конструкции, кодирующие различные мутантные формы ПроТ а крысы, представленные на рис. 9 А. За исключением производного ПроТ а, состоящего из 28 N-концевых аминокислотных остатков (область тнмозина а,) (рис.9 А XVII), все делеционные мутанты были стабильны в клетках продуцента. Свойство ПроТ а присоединять тРНК сохранялось и у его фрагментов за исключением мутанта XTV (рис.9 А). Анализ триптических РНК-пептидов этих комплексов позволил не только подтвердить справедливость сделанного ранее заключения о присоединении тРНК к двум кластерам остатков основных аминокислот (14-20 и 102-106 остатки ПроТ а), но выявил и новые места присоединения тРНК к молекуле ПроТ а.

Так, у мутанта VIII (с 1 по 98 а.к. остаток ПроТ а) удаление блока лизиновых остатков 102-106 не вызывает исчезновения С-концевого места присоединения тРНК (рнс.9 Б). Наличие небольшого РНК-пептида с гексагистидиновым «тэгом», который задерживается на

К1-МТА агарозе, говорит о том, что в дополнение к области 102-106 существует мест присоединения тРНК на участке от остатка лизина-88 до остатка аспарагнновой кислоты I положении 98. Два коротких безгистидиновых связанных с тРНК нетида, видимо соответсвуютЫ-концевым участкам присоединения тРНК.

Как отмечалось выше, белок, соответствующий центральной части ПроТ а с 32 по 8; остаток (рис.9 А XIV), не содержащий ни одного остатка основных аминокислот детектировался в лнзате клеток продуцента, однако был неспособен образовывать комплекс ( тРНК. Удивительно, но удлинение этого белка на 3 аминокислотных остатка (СГШ) в сторон; Ы-конца (рнс.9 А XV) приводило к способности этого белка присоединять тРНК Образованный комплекс, как и следовало ожидать, не изменял электрофоретическук подвижность после обработки трипсином (рнс.9 Б). Таким образом, центральная часп молекулы ПроТ а также способна присоединять тРНК, причем для этого взаимодействия, но видимому, необходим остаток основной аминокислоты. Удлинение центральной области 32 83, неспособной образовывать комплекс с тРНК, в сторону С-конца до положения 101 (рис.? А XVI), включающей в себя несколько остатков основных аминокислот, также прндавалс этому участку способность присоединять тРНК. Это последнее обстоятельство не вызывав! особого удивления, поскольку добавленный фрагмент содержит область 89-98, которая, каь было показано выше, способна служить местом присоединения тРНК.

Таким образом, делеционный анализ ПроТ а подтвердил, что существует несколько мест присоединения тРНК внутри молекулы ПроТ а. Такими местами являются два кластера остатков основных аминокислот в районе Ы- и С-концов белка (рис.10 В), а также область 8998 и центральная область белка. Кроме того, выяснилось, что способность присоединять тРНК сохраняют даже фрагменты ПроТ а, синтезируемые в клетках продуцента, однако необходимым условием формирования ПроТ <х-РНК комплекса, по-видимому, является

наличие в молекуле белка остатков основных аминокислот.

* * *

Обнаружение ковалентного комплекса ПроТ а-Р1Ж в цитоплазме мышиных клеток повлекло за собой много вопросов: какова природа связанной с ПроТ а РНК, каков механизм образования подобного комплекса и какие функции можно от него ожидать. Поиск ответов на эти вопросы был невозможен из-за отсутствия данных об оптимальных условиях образования комплекса ПроТ а-РНК в клетках млекопитающих и из-за отсутствия надежных методов очистки такого комплекса от свободных клеточных РНК для анализа ПроТ «-связанной РНК. В данной работе демонстрируется, что образования комплекса ПроТ а-РНК можно моделировать в клетках Е.соИ при продукции в них Про! а млекоишающих, то есть присоединение РНК, по-видимому, является свойством самого ПроТ а. Используя свойство

лков с гексагистидиновым «тэгом» связываться со смолой Ni-NTA, удалось продуцировать екомбинанпшй. модифицированный ПроТ а и очистить РНК, связанную с ПроТ а от вободных РНК Е.соН. Выяснилось, что РНК-компонент комплекса представляет собой тирокий спектр бактериальных тРНК

Неожиданным оказался факт присоединения тРНК к нескольким участкам молекулы IpoT а. Более того, отдельные фрагменты ПроТ а сохраняют способность присоединять к ебе тРНК. Есть все основания считать, что остатки основных аминокислот играют ключевую юль в образовании этого комплекса. Это в особенности относится к двум кластерам 1ИЗШЮВЫХ остатков, расположенных вблизи N- и С-концов молекулы I IpoT а.

Связанная с ПроТ а тРНК имеет свободный 3'-конец и блокированный для >адиоактивного мечення 5'-конец, наиболее вероятно вследствие ковалентного трисоединения ПроТ а. РНК-компонент комплекса ПроТ а в клетках мыши также имеет шокированный 5'-конец и свободный З'-консц.

Важное отличие между ПроТ а-РНК комплексами, выделенных из мышиных и ¡актериальных клеток, заключается в длине РНК, связанной с ПроТ а. В клетках мыши длина 'НК оценивается примерно в 20 нуклеотидных остатков, хотя не исключена возможность «градации ПроТ а-связанной РНК. Но, если в клетках мыши тРНК, связанная с ПроТ ot, 'корачивается до фрагмента длиной 20 нуклеотидных остатков, то почему, экспресснруя Тро'Г а в клетках Е.соН, в составе комплекса с ПроТ а удается обнаружить лишь РНК длиной '0 нуклеотидных остатков, но не 20? Возможно, причина кроется в использовавшейся в (анной работе гетерологичной системе. Вероятно, в клетках Е.соН отсутствуют некие сомпоненты, необходимые для дальнейшего процессинга ПроТ а-связанной тРНК. Малые соличества образуемого ПроТ а-тРНК комплекса по отношению к свободному ПроТ а, :интезируемому в клетках продуцента, также свидетельствуют не в пользу того, что в ¡актериальных клетках существуют оптимальные условия для образования комплекса. На :амом деле, удивительным является сам факт того, что присоединение РНК к ПроТ о. удается моделировать в бактериальной системе.

Известно, что образовывать промежуточный ковалентный комплекс с тРНК могут такие ферменты, как аминоацил тРНК синтетаза Е.соН и тРНК-(ш5и54)-метилтрансфераза ?.со/(. Однако участия ПроТ а в метаболизме тРНК ранее не предполагалось, и его 1рисоединение к тРНК явилось неожиданностью. С другой стороны, известно, что продукт снеточного антионкогена белок р53, выделенный из клеток мыши, ковалентно присоединен к 5.8S рРНК, причем место присоединения РНК находится на С-конце белка, вблизи сиг нала щерной локализации р53. Хотя функциональное значение такого комплекса до конца не ясно, ¡равнение ковалентных комплексов p53-5.8S рРНК и ПроТ а-тРНК обнаруживает несколько

важных общих черт: -оба белка являются ядерными белками, участвующими в проц клеточного деления; -РНК-компонент обоих комплексов представляет собой Р трансляционного аппарата; -оба комплекса локализуются в цитоплазме. Эти два прим показывают, что в клетке может существовать неизвестная в настоящее время связь ме> пролиферативным и трансляционным аппаратами. Более того, образование ковалентн РНК-белкового комплекса показано и для ряда других ядерных белков (Т-антиген вир SV40, р125), однако РНК-компонент этих комплексов, к сожалению, не был охарактеризова

Что может означать такая модификация как присоединение тРНК ; функционирования ПроТ а? В данной работе показано, что одним из мест присоедине! тРНК к молекуле ПроТ а является район с 88 по 106 остаток. Этот участок являе двучастичным сигналом ядерной локализации ПроТ а, обеспечивающим направленн транспорт белка в ядро, и присоединение к аминокислотным остаткам, входящим в его сост негативно заряженной молекулы РНК должно нарушать или полностью маскиров; положительно заряженный сигнал ядерной локализации, а следовательно, влиять внутриклеточную локализацию ПроТ а. Тот факт, что комплекс ПроТ а-РНК был найде] цитоплазме мышиных клеток, но не в ядре, подтверждает предположение о возможн влиянии присоединенной РНК на внутриклеточную локализацию Про'Г а. Для регуляи ядерного транспорта столь многокопийного белка как ПроТ а наилучшим партнер выглядит также мультикопийная тРНК.

Фосфорилирование и дефосфорилирование аминокислотных остатков белков вблт сигнала ядерной локализации известно как механизм регуляции транспорта белков в яд| Почему же в данном случае можно ожидать столь необычного решения проблемы: пут присоединения тРНК, а не простого фосфорилировання? Возможно, образован ковалентного ПроТ а-тРНК комплекса играет роль не только во внутриклеточн локализации ПроТ а, но и в метаболизме тРНК.

ВЫВОДЫ.

1. Продуцируемый в клетках E.coli рекомбинантный ПроТ а млекопитающих (крысь человека) образует ковалентный комплекс с РНК. Используя гексагистидиновый «тэг» на конце рекомбннантного ПроТ а, комплекс может быть выделен из клеток в индивидуалы! виде с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии.

2. РНК-компонент комплекса представляет собой набор тРНК, присоединенных к ПроТ 5'-концом и имеющих свободный З'-конец. Согласно электрофоретической подвижное комплекса, одна молекула IIpoT а соединена с одной молекулой тРНК.

3. В молекуле ПроТ а существует несколько мест присоединения тРНК, локализованных вблизи N- и С-концовых кластеров остатков основных аминокислот.

4. Отдельные фрагменты ПроТ а сохраняют способность присоединять тРНК. Остатки основных аминокислот в молекуле ПроТ а играют существенную роль в образовании комплекса ПроТ а-тРНК.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОНАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Богданов А.А., Вартапетян А.Б., Лукашев Д.Е., Ляхов И.Г., Чнчкова П.В. Клонирование и экспрессия гена эволюционно консервативного иммуностимулирующего белка протимозина а. Молек. генетика, микробиол. и вирусол. 4, 31 (1994).

2. Vartapetian A., Lukashev D., Belyaeva A. and Chichkova N. Rat prothymosin a covalently binds to a small RNA in E.coli cells. Abstracts of The First Annual Meeting of The RNA Society, Madison, 733 (1996).

3. Лукашев Д.Е., Ляхов И.Г., Беляева H.A., Карапетян Р.Н., Чнчкова П.В., Вартапетян А.Б. Протимозин а ковалентно присоединяется к тРНК. Тезисы докладов второго съезда биохимического общества РАН, Москва, I: 122 (1997).

4. Vartapetian A., Lukashev D., Lyakhov I., Belyaeva A., Chichkova N., and Bogdanov A. Mammalian prothymosin a links to tRNA in Escherichia coli cells. RNA 3, 1173-1181 (1997).