Стимуляция активности опухолевого супрессора p53 протимозином альфа

Захарова, Наталья Ильинична

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Стимуляция активности опухолевого супрессора p53 протимозином альфа
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Стимуляция активности опухолевого супрессора p53 протимозином альфа"

На правах рукописи

48488

(М

В1

ЗАХАРОВА Наталья Ильинична

Стимуляция активности опухолевого супрессора р53 иротимозином альфа

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 тон 2011

Москва 2011

4848881

Работа выполнена на Факультете биоинженерии и биоинформатики и в отделе химии и биохимии нуклеопротекдов НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук

Евстафьева Александра Георгиевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Копылов Алексей Михайлович

Рубцов Петр Михайлович

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт канцерогенеза ГУ РОНЦ имени Н.Н.Блохина

Зашита состоится «17» июня 2011 года в 12-00 на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

Автореферат разослан «17» мая 2011 года.

РАМН

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

И.А.Крашенишппсов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы, пожалуй, ни один белок не изучался так интенсивно, как опухолевый супрессор р53. За треть века с момента его открытия р53 было посвящено более 50 тысяч научных работ, и их число неуклонно продолжает расти. Повышенное внимание к р53 определяется, прежде всего, тем, что он является ключевым регуляторным белком клетки, транскрипционным фактором, который активируется в ответ на различные клеточные стрессы, включая генотоксический стресс, и играет важную роль в защите от рака. Будучи «стражем целостности генома», р53 определяет дальнейшую судьбу клетки - произойдет ли остановка клеточного цикла для преодоления последствий стрессового воздействия или включится механизм программируемой клеточной смерти.

Объектом наших исследований также является жизненно важный белок позвоночных протимозин альфа (ПроТа). ПроТа - это мультнкопийный ядерный белок, относящийся к интереснейшему классу природных неструктурированных белков. Оказалось, что даже такой относительно простой белок является многофункциональным, способным участвовать в самых разнообразных процессах жизни и смерти клеток. Традиционно ПроТа считается онкобелком, он ускоряет клеточную пролиферацию и защищает клетки от апоптоза. Однако, неожиданно было обнаружено, что ПроТа стимулирует транскрипционную активность опухолевого супрессора р53, и таким образом, потенциально способен к проявлению анти-онкогенной активности.

Онкобелки и онкосупрессоры иногда обладают дуалистическими функциями, в разных системах проявляя либо онкогенную, либо анти-онкогенную активность. Настоящая работа посвящена выяснению молекулярного механизма, с помощью которого онкобелок протимозин альфа стимулирует р53-зависимую транскрипцию. Понимание механизмов функционирования таких белков необходимо как для выяснения всех путей регуляции активности опухолевого супрессора р53, так и для создания рациональных способов диагностики онкологических заболеваний и антираковой терапии.

Пели исследования:

Целью настоящей работы бьио изучение механизмов стимуляции активности протимозином альфа опухолевого супрессора р53.

Научная повизиа и практическая значимость.

В ходе данной работы обнаружено, что в клетках человека линий НеТа, НЕК293, но не в НСТ116 эктопическая экспрессия ПроТа стимулирует транскрипцию, регулируемую опухолевым супрессором р53. Когда мы получили эти данные, это был

совершенно новый, неописанный в литературе результат. Однако, вскоре была опубликована статья Кобаяши с соавт., в которой представлены аналогичные данные о стимуляции протимозином а активности опухолевого супрессора р53 в ряде клеточных линий, включая Н1299, Saos-2, HepG2, А549, НЕК293 и U20S. При этом стимуляция р53-регулируемой транскрипции отсутствовала в клетках НСТ116, что совпадает с полученными нами результатами. В клетках HeLa исследования в работе Кобаяши с соавт. не проводились; механизм стимуляции активности р53 при повышении уровня ПроТа остался невыявленным. В работе Кобаяши с соавт. было показано, что этот механизм связан с рекрутированием гистоновых ацетилтрансфераз к р53-зависимым промоторам с последующим ацетилированием р53. Однако, ПроТа активирует транскрипцию не на всех, а на избранных промоторах. В частности, ПроТа стимулирует р53-зависимую транскрипцию, но не влияет на E2F- и Мус-зависимую транскрипцию. Механизм избирательного действия ПроТа на транскрипцию с разных промоторов оставался неясным и требовал дальнейшего изучения. Поэтому мы исследовали этот механизм, используя в качестве клеточной модели линию HeLa, в которой эффект ПроТа был наиболее выраженным.

В настоящей работе впервые картирован участок ПроТа, ответственный за усиление р53-зависимой транскрипции. Им оказался центральный «кислый» район ПроТа наряду с NLS, расположенным в С-концевой области.

Центральный район протимозина альфа ответственен за его взаимодействие с гистоном HI. В 2008 году появились интересные данные о том, что гистон HI является специфическим ингибитором р53-зависимой транскрипции за счет прямого взаимодействия с р53 на промоторах его генов-мишеней. На основании этого мы предложили гипотезу', в соответствии с которой ПроТа может стимулировать р53-регулируемую транскрипцию путем вытеснения гистона HI из репрессорного комплекса с р53. В рамках тестирования этой гипотезы в диссертации впервые показано, что: (1) рекомбинантный ПроТа вытесняет р53 из его комплекса с пистоном HI in vitro; (2) эндогенный ПроТа интерферирует с взаимодействием гистона HI с р53 в лизатах клеток HeLa; (3) стимуляция р53-зависимой транскрипции протимозином альфа в клетках HeLa коррелирует со способностью этого белка взаимодействовать с гистоном HI; (4) эктопическая экспрессия гистона HI специфически подавляет стимулирующий эффект ПроТа на р53-зависимую транскрипцию; (5) увеличение уровня ПроТа в клетке приводит к уменьшению количества гистона HI, связанного с р53-зависимым промотором. Перечисленные результаты подтвердили предложенный нами новый механизм

стимуляции транскрипционной активности р53 путем вытеснения протимозином альфа гистона Н1 из репрессорного комплекса с р53.

В данной работе также впервые показано, что при снижении уровня ПроТа происходит заметное снижение экспрессии тирозиновой протеинкиназы JAK1. Активация JAK1 протимозином альфа представляет большой интерес для выявления механизма иммуностимулирующего действия ПроТа, а также для теоретического обоснования его противоопухолевой активности при использовании в генной терапии.

Пуйликапии и аппобапия работы. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи. Материалы работы были представлены на международных конференциях «Ломоносов-2006» (Москва, 2006), «Ломоносов-2009» (Москва, 2009), «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), «Геномика и биология клетки» (Москва, Звенигород, 2010).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 57 рисунками и 2 таблицами. Библиографический указатель включает 175 цитированных работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Влияние уровня протимозина альфа на трааекриацаоааую активность опухолевого супрессора р53

В нашей лаборатории было показано, что протимозин альфа (ПроТа) участвует в регуляции ответа клетки на окислительный стресс. Он вытесняет транскрипционный фактор Nr£2 из комплекса с репрессором Keapl, тем самым активируя Nrf2 и позволяя ему накапливаться в ядре и индуцировать экспрессию генов антиоксидантных белков.

В клетке существует другая транскрипционная система, p53-Mdm2, схожая с системой Nrf2-Keapl. Мы предположили, что активность онкосупрессора р53 может регулироваться протимозином а подобно тому, как ПроТа действует в системе Nrf2-Keapl. Чтобы проверить эту гипотезу, мы изучили, как влияет изменение уровня ПроТа в клетках человека на р53-регулируемую транскрипцию. Повышение концентрации ПроТа в клетке было достигнуто с помощью эктопической экспрессии. Для снижения внутриклеточного уровня ПроТа использовали метод интерференции РНК.

Для тестирования р53-зависимой транскрипции сконструировали репортерную плазмиду p53RE-luc, в которой ген люциферазы светлячков (lue) встроен под контроль р53-регулируемого промотора (рис. 1).

Рис.1. Схема иепортёрной плазмиды.

p53-RE - участки ДНК, с которыми взаимодействует белок р53: элемент из области промотора гена ингибитора циклин-зависимьхх протеинкиназ (р21), консенсусная последовательность (СопА), элемент из кластера рибосомапьных генов (RGC). Pcmv - цитомегаловирусный промотор; lue - ген топиферазы светлячков.

1.1. Влнянне суиерпродукции протимозина а на уровень и активность р53

С целью изучения влияния сверхпродукции ПроТа на трансактавирующие свойства р53 протимозии а человека продуцировали в клетках НСТ116, НеЬа и НЕК293 с использованием полученной ранее в нашей лаборатории плазмиды рНМ-РгоТа. Внутриклеточную концентрацию ПроТа оценивали, воспользовавшись способностью этого белка оставаться в водной фазе при фенольной экстракции. Выделенные из трансфицированных клеток частично очищенные препараты ПроТа анализировали методом электрофореза (рис. 2Б). Количество клеточной тРНК служило внутренним контролем равного нанесения образцов. Было подтверждено, что в трансфицированных клетках уровень ПроТа существенно превышает уровень эндогенного белка (рис. 2Б). А

^ Г

3 ,

Пк

я й ° 4

|1е3 и?2

О. О ш

S § i 1

ПроТа-

| Рис.2.

Активация

р53-зависимого

......................

репортерного гена протимозином а.

А. Изменение шоциферазной активности, нормированной на |3-галактозидазную активность, при эктопической экспрессии ПроТа (2) по сравнению с контрольными клетками (1). Нормированная людиферазная активность контрольных клеток принята за единицу. Б. Суперпродукция протимозина а в клетках НеЬа. Частично очищенный ПроТа, выделенный из лизатов клеток, трансфицированньк рНМ-ПроТа (2) или пустым вектором рНМ-В (1). К - рекомбинантный ПроТа (3 мкг). Приведён фрагмент 8% ПААГ, содержащего 7М мочевину, окрашенного метиленовым синим.

Оказалось, что сверхпродукция ПроТа в клетках НеЬа стимулирует экспрессию р53-зависимого репортерного гена (рис. 2А). При этом экспрессия используемого для нормировки репортерного гена 1асТ, находящегося под контролем конститутивного промотора во второй репортерной плазмиде уШЛ-1асТ, существенно не менялась. Было показано, что увеличение активности р53 в клетках, суперэкспрессирующих ПроТа,

зависит от уровня продукции ПроТа и достигает максимального значения, превышающего в 4.2+/-0.8 раза активность р53 в контрольных клетках (рис. 2А).

В клеточной линии НЕК293 лротимозин а также стимулировал экспрессию р53-зависимого репортерного гена, но эффект был менее сильным, в то время как в клетках линии НСТ116 этот эффект вообще не наблюдался (не показано).

Оценку влияния внутриклеточного уровня ПроТа на количество р53 в клетке проводили методом иммуноблотинга.

Рнс.З. Эктопическая экспрессия протнмозина ц приводит к- увеличению уровня р53 в клетках Не1.а.

Иммуноблоты лизатов клеток НеЬа, супернродуцирующих ПроТа (2) или контрольных (1), с антителами анти-р53 (верхняя панель}, анги-р21 (центральная панель), анти-актин (нижняя панель). Слева указаны положения маркёров молекулярной массы (кДа).

В клетках НеЬа с суперпродуцированым ПроТа количество р53 возрастало по сравнению с его количеством в контрольных клетках, при этом параллельно увеличивался уровень одной из транскрипционных мишеней р53. ингибитора циклин-зависимых киназ р21, тогда как количество актина, используемого как контроль равного нанесения образцов, было неизменным (рис. 3). Следовательно, при повышении внутриклеточной концентрации ПроТа в клетках НеЬа происходит возрастание уровня р53, коррелирующее с возрастанием его транскрипционной активности.

1.2. Влияние подавления экспрессии ПроТа с помощью интерференции РНК на транскрипционную активность опухолевого супрессора р53

С целью изучения влияния уровня эндогенного ПроТа на трансактивирующие свойства р53 уровень протимозина а человека в клетках НеЬа был снижен методом интерференции РНК. Мы создали конструкцию рЬ8-5ЙШАзз-5з> кодирующую интерферирующую РНК, гомологичную участку 33-53 мРНК ПроТа, на основе лентивирусното вектора. С помощью этой конструкции получили лентивирусные частицы, ими инфицировали клетки НеЬа, после чего проводили селекцию клеток с интегрированной в хромосому экспрессионной кассетой с помощью пуромицина.

Внутриклеточный уровень ПроТа в отселектированных клетках детектировали с помощью электрофоретического анализа (рис. 4Б), также было оценено количество мРНК ПроТа с помощью полуколичественной ОТ-ПЦР (рис. 4В). Оказалось, что внутриклеточная концентрация ПроТа в этих клетках снижена по сравнению с

контрольными клетками, инфицированными пустым лентивирусным вектором (рис. 4Б). Аналогичная картина наблюдается и с мРНК ПроТа (рис. 4В).

Таким образом, клеточная линия с пониженным уровнем ПроТа была получена. Эти клетки трансфицировали репортерными плазмидами и измеряли базальную транскрипцию р53-зависимого репортерного гена. Оказалось, что при снижении концентрации ПроТа в клетке уменьшается транскрипционная активность эндогенного р53 (рис. 4А). Этот эффект оказался не очень сильным, но статистически значимым.

Следовательно, эксперименты по интерференции РНК подтверждают результаты, полученные с помощью эктопической экспрессии ПроТа. Внутриклеточный уровень ПроТа оказывает влияние на активность р53 в клетках НеЬа.

-е- «

2 В С л 5 Ь í £

тРНК

ПроТа

—

ПроТа ГАФД

Рис.4. Специфичная к- ипотимознну а интерференция РНК приводит к снижению экспрессии р53-зависимого 1>епортёрното гена.

A. Люциферазная активность, нормированная на Р-галактозидазную активность, в клетках НеЬа, инфицированных пустым лентивиручным векторм (1) или вектором, кодирующим 50ША к ПроТа (2), и трансфицироваиныхрепортерныыи плазмидами р53-КЕ-1пс и рНМ-1ас/.

Б. Частично очищенный ПроТа, выделенный из лнзатов клеток Не!.а, инфицированных пустым лентивирусным векторм (1) или вектором, кодирующим зПША к ПроТа (2). К - рекомбинантный ПроТа (0,5 мкг). Приведен фрагмент 8% ПААГ, содержащего 7М мочевину, окрашенного метилевовым синим.

B. Электрофорез в агарозном геле продуктов ОТ-ПЦР с праймерами, специфичными к кДНК протнмозина а (верхняя панель), и с праймерами, специфичными к кДНК глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (ГАФД), в качестве контроля (нижняя панель). В качестве матрицы использовали кДНК, полученную после обратной транскрипции суммарной РНК, выделенной из клеток НеЬа, инфицированных пустым лентивирусным векторм (1) или вектором, кодирующим я ¡ЯКА к ПроТа (2).

2. Исследование механизма стабилизации и активации опухолевого суцрессора р53 протимозином альфа

Итак, ПроТа стимулирует р53-зависимую генную экспрессию и приводит к повышению внутриклеточной концентрации р53 в клетках карциномы шейки матки человека НеХ-а. Так как в клетках HeLa регуляция р53 не зависит от Mdm2, наше исходное предположение, что ПроТа может разрушать комплекс p53-Mdm2 и, таким образом, стимулировать р53-зависимую транскрипцию, было маловероятным. Для изучения механизма активации опухолевого супрессора р53 протимозином альфа был проанализирован ряд возможных путей активации р53 в клетках. 2.1. Роль пост-трансляциониого фосфорилпрования р53

Стабилизация и активация р53 часто являются следствием его посттрансляционных модификаций. Так, при генотоксическом стрессе происходит каскад фосфорилирований р53 по остаткам серина и треонина, причем ключевой модификацией является фосфорилнрование по Serl5. С целью проверки роли фосфорилирования в стабилизации р53 при повышении уровня ПроТа в клетках HeLa с суперпродукцией ПроТа оценивали уровень фосфорилированного по Serl5 р53 с помощью специфических к этой модификации антител (рис. 5).

Рис.5. Э|стопнческая_экспрессия

протимошна а не приволит к увеличению ££ £ ООХ уровня фосфорилированного по Serl5 р53 ......... _ в клстках i it l íl.

JHH|ppS3 (Ser 15} Йммуноблоты лизатов клеток HeLa, " суперпродупирующих ПроТа (Р) или

^ ^ м-и ¿шШЖь р53 грансфицированных пустым вектором (В), с

w ^ЩЩщ антителами. анти-рр53 (Serl5) (верхняя

панель), анти-р53 (центральная панель), антиактин (нижняя панель). В качетстве контролей использовали лизаты клеток HeLa, обработанных доксорубицином (Dox) и без обработки (С).

«ш* mmm Шш ***** актии

В то время как в клетках НеЬа, обработанных индуктором генотоксического стресса доксорубицином, удалось детектировать достаточно интенсивную полосу фосфорилированного по 8ег15 белка р53 (рис. 5), в клетках с эктопической экспрессией ПроТа этой модификации обнаружено не было. С помощью антител, узнающих концевой эпитоп р53, показано, что уровень р53 в том же самом образце превышает его уровень в контрольных клетках, трансфицированных пустым вектором. Следовательно, механизм активации р53 при повышении внутриклеточной концентрации ПроТа отличается от механизма его активации при ответе на генотоксический стресс.

При помощи аналогичных опытов мы исследовали фосфорилирование р53 по остатку 8ег392. Известно, что эта модификация усиливает способность р53 к образованию

тетрамера, а также его ДНК-связывающие свойства. Однако, возрастания количества фосфорилированного р53 при повышении уровня ПроТа в клетках HeLa обнаружено не было. Следовательно, ПроТа способствует активации р53 по какому-то иному механизму.

2.2. Роль р14 ARF в активации р53

При экспрессии онкобелков нарушение взаимодействия р53 с Mdm2 обуславливается повышением экспрессии белка р14 ARF, который связывает и тем самым ограничивает количество свободного Mdm2, что приводит к стабилизации и накоплению р53. Несмотря на то, что в клетках HeLa регуляция р53 посредством Mdm2 сведена к минимуму, интересно было посмотреть, не меняется ли уровень экспрессии р14 ARF при увеличении уровня ПроТа в клетке.

Иммуноблотингом со специфичными к р 14 ARF антителами показано, что количество р14 ARF в клетках с суперпродукцией ПроТа не возрастает (рис. 6).

Рис.6. Эктопическая экспрессия протимозина а не приводит к увеличению уровня р!4 ART в клетках HeLa.

Иммуноблоты лизатов клеток HeLa. суперпродуцирующих ПроТа (Р) или трансфицированных пустым вектором (В), с антителами анги-ARP (верхняя панель), анти-актин (нижняя панель).

Следовательно, влияние ПроТа на транскрипционную активность р53 не связано с участием р14 ARF в этом процессе.

2.3. Гипотеза о стабилизации р53 протимозипом альфа иутем зашиты от деградации в 20S прогеосомах

Защита р53 от убиквитин-независимой деградации в системе 20S протеасом осуществляется с помощью ферментов NQ01 и NQ02, которые непосредственно взаимодействуют с белком р53 и стабилизируют его. Ингибитор NQ01 дикумарол и ингибитор NQ02 резвератрол нарушают связывание соответствующих ферментов с р53, что приводит к деградации р53.

Экспрессия NQ01 находится под контролем регуляторного элемента АКБ, с которым связывается транскрипционный фактор Nrf2. Так как ПроТа взаимодействует с белком Keapl, ингибитором Nrf2, он может регулировать внутриклеточный уровень NQ01. Чтобы выяснить, не участвует ли эта система в регуляции р53 при изменении внутриклеточного уровня ПроТа, тестировали влияние дикумарола на транскрипцию р53-регулируемого репортерного гена при эктопической экспрессии ПроТа. Оказалось, что дикумарол примерно в одинаковой степени понижает как базальный, так и

В Р .

............... .............. да

стимулированный протимозином а уровень р53-зависимой транскрипции. При этом степень активации р53 протимозином а существенным образом не меняется (рис. 7).

« S ¥ 1000--в"

£ г Е

I т I

5 í Е 800---

1200

Рис.7. Влияние цикумарола на

транскрипцию_|]53-пегулнруемо1 о

пепортерного гена ппи эктопической экспрессии ПпоТа.

Изменение люцнферазной активности, нормированной на [З-галактозидазную активность, при эктопической экспрессии ПроТа в клетках НеЬа, обработанных дикумаролом.

200

дикумарол (мкМ)

350

Цветом обозначены: светло-серым клетки, трансфицированные пустым вектором; темно-серым - клетки с суперпродукдией ПроТа.

Аналогичными экспериментами было показано, что ингибитор NQ02 резвератрол не оказывает существенного влияния на базальный и активированный протимозином а уровень экспрессии р53-регулируемого репортерного гена.

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что активация р53 при повышении внутриклеточной концентрации ПроТа не опосредована предотвращением его деградации в 20S протеасомах посредством NQ01 и NQ02.

3. Локализация структурных детерминант протимозииа альфа, ответственных за активацию р53

Для того, чтобы понять механизм стимуляции активности р53 протимозином альфа, мы картировали участок в ПроТа, ответственный за усиление транскрипции р53-регулируемого репортерного гена. 3.1. Рань сигнала ядериой локализации

В клетках HeLa было исследовано влияние эктопической экспрессии ряда делеционных и точечных мутантов по С-концевой части ПроТа на транскрипцию р53-зависимого репортерного гена (рис. 8).

Оказалось, что делеция десяти С-концевых остатков значительно снижала способность ПроТа(1-99) активировать р53-зависимую транскрипцию (рис. 9). Так как в результате делеции ПроТа теряет С-концевой фрагмент, содержащий блок KJCQK1M, являющийся частью двухчастного сигнала ядерной локализации (NLS), вероятной причиной наблюдаемого эффекта является нарушение активного транспорта ПроТа в ядро.

ПроТа

ПроТа (1-99) С

ПроТа К87Е С

'Гщз-ПроТа Шс::

ТЖ5-Г1роТа(1-99} ©г;

ПроТа Б44.50С Е

акшвада р53 3 +

"87......109

, а в

■ 44

+ + +

Рис.8. Схема точечных и С-концевых аелеционных мбайтов ПроТа.

Серым цветом выделена область ПроТа, обогащенная дикарбоновыми аминокислотными остатками. №5 -сигнал ядерной локализации Т-антигена вируса ЭУ40. Степень активации р53 оценена значками: (+) - более 75%, (-) - менее 25% относительно степени активации полноразмерным ПроТа.

Чтобы убедиться в правильности этого заключения, было проведено два эксперимента. Во-первых, в клетках НеЬа был продуцирован мутант ПроТа К87Е, у которого мутация внесена в другой блок основных аминокислотных остатков К87!?., входящий в двухчастный N18 ПроТа. Активный транспорт в ядро этого мутанта ПроТа нарушен, но С-концевой пептид (100-109) не изменен по сравнению с белком дикого типа. Оказалось, что мутация К87Е также снижает способность ПроТа активировать р53-зависимую транскрипцию (рис. 9). Следовательно, на С-конце ПроТа находится детерминанта, необходимая для его стимулирующего действия на р53-зависимую генную экспрессию, - сигнал ядерной локализации.

а ~

ЕЦ СГ

-е- «

I £

£ 3

700 600 500 400 300 200 100 О

^ вектор ПроТа ПроТа ПроТа ПроТа ТЖБ ТЫЬБ

(1-99) К87Е Е 44,503 ПроТа ПроТа

(1-99)

Рис.9. Влияние точечных мутаций и С-концевых делений в ПроТа на его способность активировать р53'регулируемый репортерный ген.

Клетки НеЬа были трансфицированы смесью репортерных плазмид р53КЕ-1ис (0.15 мкг), рНМ-1ас2 (0.25 мкг) и 1,6 мкг плазмиды для экспрессии указанных производных ПроТа. Для негативного контроля использовали пустой вектор рНМ-В (вектор). Приведены значения нормированной люпиферазной активности клеточных лизатов через 40 часов после трансфекции.

Во втором эксперименте в клетках продуцировали ПроТа(1-99), к И-концу которого был присоединен N1.8 Т-антигена вируса 8У40 (ТЖ^). Оказалось, что такой химерный белок активирует р53-зависимый репортер почти так же эффективно, как контрольный полноразмерный ПроТа с присоединенным к Ы-концу N1.5 Т-антигена вируса 8У40 (рис. 9). Это указывает на то, что на С-конце протимозина альфа расположена только одна детерминанта, важная для активации р53-зависимой транскрипции, - сигнал ядерной локализации.

3.2. Роль взаимодействия протимозина альфа с Кеар1

Недавно при скрининге клонотеки зЖМА было обнаружено, что экспрессия зЦУЧА, специфичной к мРНК белка Кеар1, приводит к активации р53-зависимой транскрипции в клетках НеЬа. Следовательно, можно было предположить, что Кеар1 функционирует как один из ингибиторов р53, например, за счет его способности направлять белки на протеасомную деградацию. Так как Кеар1 взаимодействует с ПроТа, повышение внутриклеточного уровня ПроТа должно приводить к уменьшению концентрации свободного Кеар1 и, как следствие, к активации р53. Чтобы проверить, не является ли это механизмом наблюдаемой нами стимуляции экспрессии р53-зависимого репортера протимозином а, в клетках НеЬа был продуцирован двойной мутант ПроТа Е44,5(Ю, который потерял способность взаимодействовать с белком Кеар1. Однако, оказалось, что мутации Е44,50С не уменьшают способности ПроТа стимулировать экспрессию р53-зависимого репортерного гена (рис. 9). Следовательно, взаимодействие ПроТа с Кеар 1 не играет роли в наблюдаемой нами стимуляции р53-зависимой транскрипции.

3.3. Роль ]\-концевой части протимозина альфа

Чтобы тестировать роль К-концевой части ПроТа в стимуляции р53-зависимой транскрипции, в клетках НеЬа были продуцированы мутанты ПроТа с ^концевыми и внутренними делециями (рис. 10).

активация р53

ПроТа ;......................—...........~1 +

1 тэг__

ЯроТа (32-109) »--------+

ПроТа Д(33-43) р::"^.....-^гг,- ' +

ПроТаД(44-51) _^Ч._ ...... ~....."1 . +

ПроТа -1ЭГ ' . ........I +

! 109

Рис.10. Схема мутантных форм ПпоТа с М-кониевыми и вн\тренннмн делециями.

Серым цветом выделены области ПроТа, обогащенные дикарбоновыми аминокислотными остатками. Черным цветом выделен гексагистидиновый тэг и эпитоп Х-ргезэ, закодированные в векторе. Степень активации р53 оценена значками: (+) - более 75%, (-) - менее 25% относительно степени активашш полноразмерным Про'Га.

В отличие от С-концевой делеции, удаление Ы-концевой части протимозина не препятствовало его способности активировать р53-зависимую транскрипцию. Так, ПроТа (32-109) с делецией 31 1Ч-концевых аминокислоты сохранил способность активировать экспрессию р53-регулируемого репортерного гена (рис. 11).

г /00

500

Р -Ч ■400

«¡1 300

£ * 200

а * 100-

о-

Ш1: Ш1§ —

—

Вектор ПроТос (32-109) ПроТ«-тэг

Рис.11. Влияние делеции Рч'-конца ДроТа на его способность активировать р53-регулируемый репортерный ген.

Клетки НеЬа были трансфицированы смесью репортерных плазмид р53ИЕ-1ис (0.15 мкг), рНМ-1асг (0.25 мкг) и 1,6 мкг плазмиды для экспрессии указанных белков. Для негативного контроля использовали пустой вектор рНМ-В (вектор). Приведены значения нормированной люциферазной активности клеточных лизатов через 40 часов после трансфекции.

Чтобы протестировать роль фрагмента ПроТа (32-51) в активации р53, были сконструированы два мутанта с короткими внутренними делениями в этой области, ПроТа Д(33-43) и ПроТа А(44-51). Оказалось, что оба мутанта сохранили способность активировать экспрессию р53-регулируемого репортерного гена (рис. 12).

га ш ш 5

И 2

700 600 500 400 300 200 100

вектор ПроТос ПроТа ПроТос Д(33-43) Д (44-51)

Рис.12. Влияние делении в !Ч-конневой области ПроТа на его способность

активировать_р53-регулируемый

репортерный ген.

Клетки НеЬа были трансфицированы смесью репортерных плазмид р53КЕ-1ис (0.15 мкг), рНМ-1асг (0.25 мкг) и 1,6 мкг плазмиды для экспрессии указанных белков. Для негативного контроля использовали пустой вектор рНМ-В (вектор). Приведены значения нормированной люциферазной активности клеточных лизатов через 40 часов после трансфекции.

Таким образом, делеции в №-концевой половине ПроТа не влияют на его способность активировать р53-зависимую транскрипцию. 3.4. Роль центральной области протимозина альфа

Центральная часть ПроТа представляет собой «кислый» блок, состоящий в основном из остатков дикарбоновых аминокислот. Её роль в стимуляции р53-зависимой транскрипции изучали с помощью мутантов, содержащих внутренние делеции (рис. 13).

НроТа Д(Й-81) fi»c ESpoTos А($3-б7) ПроТа-ТЗГ паратимозин

активация р53 : -/+

, + <>" +

Рнс.13. Схема мутантиых Форм НроТа с лелециями в иентарльной «кислой» облает».

Серым цветом выделены области ПроТа (и паратпмозина), обогащенные дикарбоновыми аминокислотными остатками. Черным цветом выделен гексаптстидиновый таг и эпигон Х-ргей$, закодированные в векторе. Степень активации р53 оценена значками: (+) - более 75%, (-) - менее 25%, (-/+) - 25-75% относительно степени активации полноразмерным ПроТа.

Удаление пятнадцати аминокислотных остатков, расположенных в центральной области протимозина а, А(53-67), привело к частичному снижению, а удаление всей центральной «кислой» области А(32-81) - к практически полному исчезновению способности ПроТа активировать экспрессию р53-регулируемого репортерного гена (рис. 14).

1000

"5 800

I «m

? 400

т 200

(Й

вектор

ПроТа Д(32-81)

ПроТо; ПроТос-тэг Д(53-67)

Рнс.14. Влияние делецин в центральной области Чип] п на его способность активировать п53-пегулипуемый пепортепный ген.

Клетки HeLa были трансфицированы смесью репортерных цлазмид p53RE-luc (0.15 мкг), pHM-lacZ (0.25 мкг) и 1,6 мкг плазмиды для экспрессии указанных белков. Для негативного контроля использовали пустой вектор рНМ-В (вектор). Приведены значения нормированной люциферазной

активности клеточных лизатов через 40 часов после трансфекции.

На основании полученных данных можно предположить, что центральный район ПроТа, состоящий из отрицательно заряженных аминокислотных остатков Glu и Asp, наряду с интактным двухчастным NLS, расположенным в С-концевой области, отвечает за способность этого белка стимулировать р53-зависимую транскрипцию. Чтобы проверить возможность активации р53-завясимой транскрипции посредством блоков дикарбоновых аминокислотных остатков, мы продуцировали в клетках HeLa другой белок, содержащий подобные «кислые» последовательности и двухчастный NLS, паратимозин. Оказалось, что паратимозин также способен активировать экспрессию р53-зависимого репортерного гена (рис. 15), причем примерно в той же степени, что и ПроТа.

Рис.15. Влияние паратимозина на активность р53-регулируемого репортерного гена.

Клетки HeLa были трансфицированы смесью репортерных плазмид p53RE-luc (0.15 мкг), рНМ-1ас2 (0.25 мкг) и 1,6 шгллазмвды для экспрессии указанных белков. Для негативного контроля использовали пустой вектор рНМ-В (вектор). Приведены значения нормированной люциферазной активности клеточных лизатов через 40 часов после трансфекции.

Итак, результаты проведенных экспериментов свидетельствуют, что центральный «кислый» район ГТроТа наряду с MLS, расположенным в С-концевой области, отвечает за способность этого белка стимулировать р53-зависимую транскрипцию.

4. Роль гистоиа HI в регуляции активности р53 протимозипом а

Известно, что центральная «кислая» область ПроТа, ответственная за стимуляцию р53-зависимой транскрипции, вовлечена также во взаимодействие с гистоновыми ацетилтрансферазами и гистонами, в частности, с линкерным гистоном HI. Гистон HI долгое время считался глобальным репрессором транскрипции. Однако, более новые данные свидетельствуют о том, что гистон HI регулирует экспрессию далеко не всех, а только некоторых генов, и в частности, генов-мишеней р53. Показано, что один из субтипов гистона HI. гистон Н1.2, вместе с набором клеточных белковых кофакторов образует репрессорный комплекс, который связывается с р53 и ингибирует р53-зависимую транскрипцию. По-видимому, при этом происходит прямое взаимодействие гистона HI с р53, блокирующее опосредованное гистоновыми ацетилтрансферазами СВР/рЗОО ацетилирование хроматина на р53-зависимых промоторах.

ПроТа не взаимодействует напрямую с р53, однако способен связываться с гистоном HI, который, в свою очередь, взаимодействует с р53 и подавляет его транскрипционную активность. К тому же в нашей лаборатории было показано, что ПроТа и р53 взаимодействуют с одним и тем же С-концевым доменом гистона HI, что свидетельствует о возможной конкуренции ПроТа и р53 за связывание с гистоном HI. Следовательно, IlpoTa мог бы стимулировать р53-зависимую транскрипцию путем разрушения репрессорного комплекса р53-гистон HI. Было решено проверить эту гипотезу экспериментально.

4.1. ПроТа диссоциирует комплекс р53-гистоп HI

С целью проверить, может ли ПроТа вытеснять гистон HI из комплекса с р53, был применен метод GST pull-down assay. Рекомбинантный гистон HI слитый с глутатион-S-

I 700

rt 600

■а- щ X 300

9 4W

ц Я? ¡5 300

i О X 200

о CL S 100

х вектор паратимозин ПроТа-ч

трансферазой (GST) продуцировали в бактериальных клетках и выделяли аффинной хроматографией на глутатион-сефарозе (рис. 16).

^ ¿^Л Рис.16. Элестррфопетический анализ оекомбинантного гистона HI

слитого с глутатнон-8-трансФеразой (GST), выделенного из бактериальных клеток. " Злектрофорстический анализ в ДСН-ПААГ иммобилизованных на

тш. 55 глутатион-сефарозе GST и GST-H1. гель окрашивали красителем Кумасси.

Dm §Ц 28

Связанный с глутатион-сефарозой белок инкубировали с содержащим р53 клеточным лизатом. Внутриклеточный уровень р53 в клетках HeLa бьш повышен посредством обработки доксорубицином.

Количество связавшегося р53 анализировали иммуноблотингом с использованием соответствующих антител. Оказалось, что р53 связывается только с GST-H1, но не с GST (рис. 17). При этом количество р53, связанного с иммобилизованным гистоном HI, возрастало при деплетировании ПроТа с помощью специфичных антител из лизата клеток, используемого в качестве источника р53 (рис. 17А, сравнить дорожки 4 и 2). И напротив, добавление экзогенного ПроТа приводило к диссоциации комплекса гистон Н1-р53 (рис. 17А, дорожка 5).

лизат

HeLa/Dox лизат (-ПроТа)

¿г <г Б У/ /

фт» р53 SS тРНК

7 '#*» '¿III ПроТа

ПроТа

GST-H1

GST

Рис.17. Взаимодействие р53-гистон HI зависит от уровня ПроТа в клеточном лнзате.

А. Иммобилизованные на глутатион-сефарозе GST-H1 (2, 4, 5) или GST (1, 3) инкубировали с лизатом клеток HeLa, обработанных доксорубицином (лизат HeLa/Dox), или аналогичным лизатом с деплетированным ПроТа (лизат (- ПроТа)). После интенсивных промывок связавшиеся со смолой белки анализировали иммуноблотипгом с антителами к р53. В опыте по конкуренции рекомбинантный ПроТа (10 мкг) был добавлен к лизату с деплетированным ПроТа (5). 6, 7 - 15% аликвоты соответствующих лизатов. Б. Электрофоретический анализ частично очищенных препаратов ПроТа, выделенных из лизатов клеток HeLa или лизатов после деплетирования ПроТа. Приведен фрагмент 8% денатурирующего ПААГ, окрашенного метиленовым синим. На рисунке обозначены положения клеточной тРНК и ПроТа. тРНК, присутствующая в препарате, служит контролем равного нанесения образцов на гель.

Чтобы проверить, действительно ли ПроТа может вытеснять р53 из сформированного комплекса гистон Н1-р53, связанный с матриксом комплекс был обработан рекомбинантным ПроТа. Количество перешедшего в раствор и оставшегося связанным со

смолой р53 анализировали иммуноблогингом. ПроТа дозозависимо диссоциировал р53 из комплекса с пистоном Н1 в полном соответствии с нашими предположениями (рис. 18). При обработке комплекса буфером связывания в элюатах были обнаружены только следовые количества р53.

Диссоциированный Связанный с Н1 О 5 15 30 0 5 15 30 (мкгПроТа)

»Ж ' - - р53

Рис.18. ДроТа вытесняет р53 из комплекса р53-гистон Н1 ■

Иммобилизованный комплекс р53-гистон Н1 инкубировали с указанными количествами ПроТа в 30 мкл буфера связывания в течение 1 часа при 6°С. Количество р53, элгоированного в раствор (Диссоциированный) и оставшегося связанным со смолой (Связанный с Н1), анализировали яммуноблотингом с антителами к р53.

Эти данные указывают на то, что ПроТа конкурирует с р53 за связывание с гистоном

Н1 и что эндогенный ПроТа может ингибировать образование комплекса р53-гистон Н1 в

суммарном клеточном лизате. В подтверждение этой гипотезы в нашей лаборатории с

помощью делеционного мутагенеза ПроТа было показано, что укороченные белки

ПроТк(52-109) и ПроТа(1-82), способные эффективно взаимодействовать с гистоном Н1,

как и полноразмерный ПроТа, эффективно вытесняли р53 из комплекса с гистоном Ш,

тогда как укороченный ПроТа(1-52), неспособный взаимодействовать с гистоном Н1,

этим свойством не обладал. Таким образом, центральная «кислая» область ПроТа,

содержащая аминокислотные остатки 52-82, действительно отвечает за взаимодействие с

гистоном Н1. Следовательно, только способный взаимодействовать с гистоном Ш

протимозин альфа вытесняет р53 из комплекса с гистоном Н1 (рис. 19).

Взаимодействие Диссоциация с гистоном Н1 р53 Про Га !_____гдп + +

„ 1 52 82 109

ПроТа(1-52) г \2

ПроТа (1-82) )-шшш+ +

ПроТа(52-109) + +

Рис. 19. ПроТа и его мутанты, способные взаимодействовать с гнстономШ, вытесняют р53 из комплекса р53-гистон Н1.

Схематическое изображение мутантных форм ПроТа. Серым выделена область ПроТа. обогащенная остатками дикарбоновых аминокислот. Сигнал ядерной локализации (М1.й) выделен черным.

4.2. Стимуляция р53-зависимой транскрипции коррелирует со способностью ПроТа взаимодействовать с гистоном Н1

Как было показано ранее, суперпродукция ПроТа человека в клетках НеЬа стимулирует экспрессию р53-зависимого репоргерного гена. Чтобы выяснить, какую роль

в этом играет взаимодействие ПроТа-гистон Н1, были сконструированы два новых делеционных мутанта ПроТа, отличающиеся по способности взаимодействовать с гистоном Н1, и было исследовано влияние этих мутантов на р53-зависимую

транскрипцию.

ПроТа ПроТа Д(7-51) ПроТаД(53-81)

1 ■

■ ■

N13

Рис.20. Схема делеционных мутантов ПроТа. использованных в экспериментах.

Серым цветом выделена область ПроТа, обогащенная дикарбоновыми аминокислотными остатками. Сигнал ядерной локализации (№5) выделен черным.

Так как за взаимодействие с гистоном Н1 отвечает центральная часть ПроТа (ак 5282), исследовали необходимость этого фрагмента для стимуляции р53-зависимой транскрипции и его достаточность (в сочетании с двухчастным ЖД ак 87-104).

Делеционный мутант ПроТа Л(7-51), почта полностью лишенный Ы-концевой половины белка, но содержащий центральную «кислую» область и N15 (рис. 20), стимулировал р53-зависимую транскрипцию так же, как и полноразмерный ПроТа (рис. 21).

Рис.21. Влияние половины на

удаления 1Ч-концевой способность ПроТа

активировать

р53-регулируемын

репортерный ген.

Люциферазная активность лизатов клеток НеЬа после трансфехдяи репортерными плазмидами и либо пустым вектором (вектор), либо плазмидами, экспрессирующими ПроТа А(7-51) или ПроТа с Ню-тэгом.

ПроТа Д(7-51) ПроТа-тэг

Напротив, ПроТа Д(53-81) с делегированным центральным «кислым» участком (рис. 20) терял способность активировать р53 (рис. 22).

5 Г 700 -р

а ~ 600 —

500 —

и а 400 300 --

5 1 200 —

п 100 —

0-1-

о X

Рис.22. Влияние удаления нейтральной области на способность ДроТа активировать р53-регулируемый репортерный ген.

Люциферазная активность лизатов клеток НеЬа после трансфекции репортерными плазмидами и либо пустым вектором (вектор), либо плазмидами, экспрессирующими ПроТа или ПроТа Д(53-81).

ПроТа ПроТа Д(53-81)

Таким образом мы можем сделать вывод о том, что стимуляция р53-зависимой транскрипции коррелирует со способностью ПроТа взаимодействовать с гистоном Н1.

4.3. Эктопическая экспрессия гистона Н1 предотвращает стимуляцию р53-зависимой транскрипции протимозииом альфа

Если стимулирующий эффект ПроТа на р53-регулируемую транскрипцию зависит от его взаимодействия с гистоном Н1, ведущего к диссоциации репрессорного комплекса р53-Н1, то эктопическая экспрессия гистона Н1 должна препятствовать этому эффекту. Это предсказание проверяли с помощью р53-зависимого репортера. Гистон Н1 с тэгом Хргезэ экспрессировали в клетках НеЬа. Как и ожидалось, суперпродукция ПроТа стимулировала экспрессию р53-регулируемого репортерного гена. В то же время коэкспрессия гистона Н1 с ПроТа, как оказалось, дозозависимо подавляла этот эффект

Рис.23. Влияние эктопической экспрессии гистона Н1 на стимулированную протимозииом а. р53-зависнмую транскрипцию.

Люциферазная активность лизатов клеток НеЬа после трансфекции смесью репортерных плазмид, 1.1 мкг либо рНМ-ПроТа (столбики темно-серого цвета), либо пустого вектора (столбики светло-серого цвета), и указанными количествами рНМ-Н1.0. Эктопическую экспрессию гистона Н1.0 с Хргезз-эпитопом анализировали имммупоблотом с антителами, специфичными к Хргеяз.

На активированную доксорубицином транскрипцию р53-регулируемого репортерного гена влияние эктопической экспрессии гистона Н1 оказалось незначительным. Это свидетельствует о том, что су премирующий эффект гистона Н1, по-видимому, специфичен для стимулирующего активность р53 действия ПроТа.

Следует отметить, что эктопическая экспрессия гистона Н1 снижала также базальный уровень транскрипции р53-регулируемого репортера, причем примерно в той же степени, что и понижение уровня ПроТа методом интерференции РНК (рис. 24).

Рис.24. Эктопическая экспрессия гистона Н1 снижает базальный уровень транскрипции р53-регулнруемого репортера в той же степени, что и понижение уровня ПроТа методом интерференции РНК.

Люциферазная активность лизатов клеток НеЬа после трансфекции смесью репортерных плазмид и либо пустым вектором (вектор), либо плазмидой. экспрессирующей гистон Н1.2 (гистон Н1) и лизата клеток НеЛа с пониженным методом интерференции РНК уровнем ПроТа, трансфицированных смесью репортерных плазмид (ПроТа м1ША).

ПроТа (рис. 23).

рНМ4Н1.0(мкг)

а а

0 £

1 -8-

вектор гистон Н1 ПроТа 5НМА

Это косвенно свидетельствует в пользу предположения, что эндогенный ПроТа вовлечен б повышение базального уровня р53-зависимой транскрипции за счет диссоциации репрессорного комплекса с гистоном HI.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что уровень стимуляции р53-регулируемой транскрипции протимозином альфа зависит от внутриклеточной концентрации гистона HI и подтверждают модель, в соответствии с которой ПроТа усиливает транскрипционную активность р53 путем вытеснения гистона HI из репрессорного комплекса р53-гистон HI.

4.4. Влияние увеличения уровня ПроТа в клетке па количество гистона HI ва р53-зависимом промоторе

Следующим шагом стала проверка того, что предполагаемое вытеснение протимозином а гистона HI из супрессорного комплекса с р53 действительно происходит в живой клетке на промоторах р53-зависимых генов. Для этого нужно было детектировать гистон HI, связанный с хроматином, и сравнить его количества на р53-зависимом промоторе при суперпродукции ПроТа и без нее. Для решения этой задачи мы воспользовались методом иммунопреципитации хроматина (ChIP - Chromatin Immuno Precipitation).

Количество р53-узнающих участков ДНК в преципитатах с антителами к гистону HI.2 сравнивали при помощи ПЦР «в реальном времени» с использованием специфичных праймеров к участку связывания р53 из промотора его гена-мишени p21 (p21-p53REl).

Оказалось, что увеличение уровня ПроТа в клетке приводит к статистически достоверном)' уменьшению количества гистона HI.2 связанного с фрагментами ДНК, содержащими р53-зависимый промотор (рис. 25).

p21-p53REl*

ШрДНК

Рис.25. Увеличение уровня ПроТо. приводит к- снижению количества гистона Ht.2 на п53-зависимом промоторе.

Количественную оценку связывания гистона HI.2 с р53-узнающим элементом промотора гена CDKN1A (p21-p53REl) или с участком ДНК, кодирующим рвбосомную 18S РНК (18S рДНК) в клетках HeLa, суперпродуцирующих ПроТа или контрольных, проводили методом Chip с последующей ПЦР «в реальном времени». * - разница статистически достоверна по критерию Стьюдента (Р value 0.0003).

Количество гистона HI.2, связанного с контрольным, кодирующим 18S рРНК, участком хроматина, также было снижено при суперпродукции ПроТа, но эффект был менее выраженным и недостоверным (рис. 25).

ПроТа

Эти опыты указывают на то, что повышение уровня ПроТа в клетке может приводить к вытеснению некоторой фракции гистона Н1 с самых разных участков хроматина. Важно, что вытеснение протимозином а гистона Н1, связанного с р53-зависимым промотором, показано достоверно. Специфичность действия ПроТа в данном случае не определяется тем, что ПроТа диссоциирует гистон Н1 только с р53-узнающих участков ДНК (это, видимо, не соответствует действительности). Она определяется тем, что вытеснение протимозином а гистона Н1 с р53-зависимых промоторов должно приводить к разрушению репрессорного комплекса, и, как следствие, активации транскрипции генов-мишеней р53, но не влияет на транскрипцию большинства других генов.

Таким образом, результаты метода СЫР подтверждают гипотезу о том, что ПроТа усиливает транскрипционную активность р53 путем вытеснения гистона Н1 из репрессорного комплекса р53-гистон Н1 на промоторах р53-зависимых генов. 4.5. Модель стимуляции протпмозипом а транскрипционной активности р53

На основании полученных результатов мы предлагаем модель, в соответствии с которой ПроТа усиливает транскрипционную активность р53 путем вытеснения гистона Н1 из репрессорного комплекса р53-гистон Н1 (рис. 26).

Рис.26. Предполагаемая модель усиления транскрипционной ак-гивноси 1)53 протимозином а путем вытеснения гистона Щ из репрессорного комплекса 1)53-1 цел он Ш.

Эта модель хорошо согласуется с данными Кобаяши с соавт., что механизм стимулиующего эффекта ПроТа включает рекрутирование гистоновых ацетиятрансфераз СВР/рЗОО к промоторам генов-мишеней р53. Ранее было показано, что репрессорный комплекс гистона Н1 ингибирует опосредованное рЗОО ацетилирование хроматина;

предполагается, что роль гистона Н1 состоит в связывании регуляторных факторов, которые предотвращают р53-зависимое рекрутирование СВР/рЗОО к промоторам. Следовательно, частичное удаление гистона Н1 с р53-регулируемых промоторов протимозином альфа может восстанавливать связывание СВР/рЗОО с промоторами, ведущее к ацетилированию р53 и стимуляции р53-зависимой транскрипции.

Можно предположить возможную биологическую роль такого регуляторного механизма. Известно, что экспрессия р53-зависимых генов регулируется на многих уровнях, одним из многочисленных способов такой регуляции служит подавление транскрипции репрессорным комплексом гистона Н1. Так как риск раковой трансформации особенно велик для активно пролиферирующих клеток, в таких клетках предпочтительно держать р53 в дерепрессированном состоянии для возможности быстрой активации р53 при поступлении тревожного сигнала. Возможно, высокий уровень ПроТа в активно пролиферирующих клетках обеспечивает частичное освобождение р53 от репрессии гистон Ш-содержащим комплексом.

5. Экспрессия тирозииовой прпгеинкиназы ЛАК1 зависит от уровня иротимозина а в клетках НеЬа

Был проведен дифференциальный анализ транскрипции генов человека на микроматрицах при суперпродукции ПроТа в клетках линии НеЬа и при снижении его уровня посредством РНК интерференции. Для этого использовались кчеточная линия с пониженной методом интерференции РНК экспрессией ПроТа и клеточная линия с суперпродукцией ПроТа, полученная в нашей лаборатории с помощью лентивирусного вектора рЬСМУ-ПроТа-пео. Контрольные клеточные линии для обоих случаев были инфицирована «пустым» лентивирусным вектором. Уровень ПроТа в этих клеточных линиях оценивали с помощью электрофоретического анализа частично очищенных препаратов ПроТа (рис. 27).

Рис.27. Сверхпродукиия ПроТа и специфичная к ПроТа шмспференчия РНК в клеточных В ПроТа М А В линиях, используемых лли .тДнЬепенииальжио

анализа транскрипиин генов человека на ^ЩШ ЩШйШ ррШ микрома гринах.

^ццц! хРНК Элекгрофореггический анализ частично очищенных ЦЩж ЯШРР ^^^т препаратов ПроТа. выделенных из лизатов клеток.

инфицированные пустим лентивирусным вектором ПроТа рЬСМУ-пео (1), вектором р!ХМ\Ч1роТа-пео для ■экспрессии ПроТа (2), вектором pI.S-siRNA33.s3 экспрессии эй^А (4), пустым лентивирусным вектором pf.S-F.pw (5). На дорожке 3 нанесен рекомбинантный ПроТа (0,5 мкг) в качестве маркера. Приведен фрагмент 8% ПААГ, содержащего 7М мочевину, окрашенного метиленовым синим. Положения клеточной тРНК и ПроТа указаны.

Выделенная из каждой клеточной линии суммарная РНК была далее использована для получения соответствующих зондов, которые пибридизовали с микрочипами Affymetrix в специализированной лаборатории. Каждая микроматрица содержала 54 тысячи последовательностей, соответствующих почти полному набору генов человека, причем некоторые гены были представлены двз'мя или более последовательностями. Для каждого гена сравнивали сигналы от опытного и контрольного зондов после соответствующей нормировки. Учитывая величины этих эффектов и степень их достоверности, был отобран ряд генов-кандидатов для дальнейшего исследования.

Самым достоверным и интересным из выявленных кандидатов нам представляется Janus kinase 1 (JAK1). JAKi - это гирозиновая протеинкиназа, компонент клеточного сигнального пути JAK-STAT. Этот путь передачи сигналов определяет клеточный ответ на действие цитокинов и факторов роста и играет ключевую роль в выборе дальнейшего пути клетки, регулируя процессы пролиферации, дифференцировки или апоптоза.

Выявленные с помощью микрочиповой технологии эффекты влияния уровня ПроТа на экспрессию JAK1 были проверены с помощью метода ПЦР «в реальном времени». Было показано, что при снижении уровня ПроТа происходит заметное снижение экспрессии JAK1 (рис. 28), тогда как при суперпродукции ПроТа достоверных изменений обнаружено не было. Эти результаты подтверждают данные, полученные с помощью микрочипов.

Рис.28. Снижение уровня ПпоТц приводит к- снижению уровня мРНК ■1АК1 в клепках ПсЬа.

На клеток НеЬа, с пониженным методом интерференции РНК уровнем ПроТа (столбики темно-серого цвета) и контрольных (столбики светло-серого цвета), выделяли суммарную РНК, с помощью обратной транскрипции получали кДНК.

Приведена количественная обработка результатов ПЦР «в реальном времени» с праймерами, специфичными к мРНК ПроТа и к мРНК 1АК1.

Активация .ГАЮ протимозином альфа представляет большой интерес для выявления механизма иммуностимулирующего действия ПроТа, а также для теоретического обоснования его противоопухолевой активности при использовании в генной терапии.

выводы

1. Эктопическая экспрессия ПроТа стимулирует, а снижение уровня ПроТа с помощью интерференции РНК, наоборот, подавляет транскрипцию, регулируемую опухолевым супрессором р53.

2. Центральный «кислый» район ПроТа наряду с сигналом ядерной локализации, расположенным в С-концевой области, отвечает за способность этого белка стимулировать р53-зависимую транскрипцию.

3. ПроТа усиливает транскрипционную активность р53 путем вытеснения пистона П1 из репрессорного комплекса р53-гистон Н1.

4. При снижении уровня ПроТа происходит снижение экспрессии протеинкиназы ДАК1 в клетках НеЬа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Захарова Н.И., Соколов В.В., Рудько В.В., Мельников С.В., Варгапетян А.Б., Евстафьева А.Г. Влияние протимозина альфа и его мутантов на активность опухолевого супрессора р53.// Молекулярная биология. - 2008 - Т. 42, № 4 - С. 673-684.

2. Захарова Н.И., Соколов В.В., Суворова A.A., Шиау А.-Л, Ву Ч.-Л., Евстафьева А.Г. Протимозин альфа взаимодействует с С-концевым доменом гистона Н1 и диссоциирует комплекс гистона Н1 с опухолевым супрессором р53.// Молекулярная биология. - 2011 - Т. 45, № 4 - С. 675-685.

3. Захарова Н.И. Влияние протимозина альфа на экспрессию р53-зависимых генов.// XIII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006». - Сборник тезисов - Секция «Биоинженерия и биоинформатика)> -12-15 апреля 2006 - С. 15.

4. Соколов В.В., Суворова A.A., Захарова Н.И. Получение клеточных линий с суперпродукцией и нокдауном протимозина альфа; исследование влияния протимозина альфа на чувствительность клеток к окислительному стрессу.// XVI Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009». - Сборник тезисов - Секция «Биоинженерия и биоинформатика» - Подсекция «Биоинформатика» - 14-17 апреля 2009 - С. 24.

5. Захарова Н.И., Соколов В.В., Суворова A.A., Евстафьева А.Г. Механизм стимуляции р53-зависимой транскрипции протимозином альфа.// 14 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология -наука XXI века». - Сборник тезисов - Секция «Молекулярная биология» — 19-23 апреля2010-С. 371-372.

6. Захарова Н.И., Суворова A.A., Соколов В.В., Евстафьева А.Г. Роль гистона Н1 в стимуляции р53-зависимой транскрипции протимозином альфа.// IV Международная школа по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки». - Сборник тезисов - 29 ноября - 3 декабря 2010 - С. 89-90.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано в печать 16.05.2011 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 215. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Захарова, Наталья Ильинична

Список условных обозначений Введение

Содержание

1. Протимозин альфа и гистон Н1. Их взаимодействие и роль в регуляции р53-зависимой транскрипции (обзор литературы)

1.1. Протимозин альфа

1.1.1. Структура протимозина альфа

1.1.2. Внутриклеточная локализация протимозина альфа

1.1.3. Протимозин альфа и клеточное деление

1.1.4. Протимозин альфа и апоптоз

1.1.5. Протимозин альфа как переключатель некроза на апоптоз

1.1.6. Протимозин альфа и опухолевая трансформация

1.1.7. Данные о влиянии протимозина альфа на экспрессию генов

1.2. Опухолевый супрессор р

1.2.1. Структура р

1.2.2.' Регуляция уровня и активности р53 в клетке

1.2.3. Субклеточная локализация р53. Роль посттрансляционных модификаций во внутриклеточном транспорте р

1.2.4. Особенности регуляции активности р53 в клетках НеЬа

1.3. Гистон Н

1.3.1. Гистон Н1. Структура и функции

1.3.2. Гистон Н1 специфически регулирует транскрипцию

1.3.3. Гистон Н1 и р

1.3.4. Гистон Н1 и протимозин альфа 41 2. Материалы и методы

2.1. Реактивы и материалы

2.2. Общие методы

2.3. Манипуляции с плазмидной ДНК

2.4. Конструирование плазмид

2.5. Манипуляции с клетками млекопитающих

2.6. Получение стабильной клеточной линии с пониженным уровнем протимозина альфа

2.7. Получение стабильной клеточной линии с повышенным уровнем протимозина альфа

2.8. Исследование взаимодействия гистона Н1, р53 и протимозина альфа

2.9. Иммунопреципитация хроматина (СЫР)

2.10. Определение уровня представленности транскриптов

2.11. ПЦР в реальном времени 68 3. Стимуляция активности опухолевого супрессора р53 протимозином альфа (результаты и их обсуждение)

3.1. Влияние уровня протимозина альфа на транскрипционную активность опухолевого супрессора р

3.2. Исследование механизма стабилизации и активации опухолевого супрессора р53 протимозином альфа

3.3. Локализация структурных детерминант протимозина альфа, ответственных за активацию р

3.4. Роль гистона Н1 в регуляции активности р53 протимозином альфа

3.5. Экспрессия тирозиновой протеинкиназы 1АК1 зависит от уровня протимозина альфа в клетках НеЬа

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Стимуляция активности опухолевого супрессора p53 протимозином альфа"

В последние годы, пожалуй, ни один белок не изучался так интенсивно, как опухолевый супрессор р53. За треть века с момента его открытия р53 было посвящено более 50 тысяч научных работ, и их число неуклонно продолжает расти. Повышенное внимание к р53 определяется, прежде всего, тем, что он является ключевым регуляторным белком клетки, транскрипционным фактором, который активируется в ответ на различные клеточные стрессы, включая генотоксический стресс, и играет важную роль в защите от рака. Будучи «стражем целостности генома», р53 определяет дальнейшую судьбу клетки -произойдет ли остановка клеточного цикла для преодоления последствий стрессового воздействия или включится механизм программируемой клеточной смерти.

Объектом наших исследований также является жизненно важный белок позвоночных протимозин альфа (ПроТа). ПроТа - это мультикопийный ядерный белок, относящийся к интереснейшему классу природных неструктурированных белков. Оказалось, что даже такой относительно простой белок является многофункциональным, способным участвовать в самых разнообразных процессах жизни и смерти клеток. Традиционно ПроТа считается онкобелком, он ускоряет клеточную пролиферацию и защищает клетки от апоптоза. Однако, неожиданно было обнаружено, что ПроТа стимулирует транскрипционную активность опухолевого супрессора р53, и таким образом, потенциально способен к проявлению анти-онкогенной активности.

Онкобелки и онкосупрессоры иногда обладают дуалистическими функциями,, в разных системах проявляя либо онкогенную, либо анти-онкогенную активность. Настоящая работа посвящена выяснению молекулярного механизма, с помощью которого онкобелок протимозин альфа стимулирует р53-зависимую транскрипцию. Понимание механизмов функционирования таких белков необходимо как для выяснения всех путей регуляции активности опухолевого супрессора р53, так и для создания рациональных способов диагностики онкологических заболеваний и антираковой терапии.

В ходе данной работы обнаружено, что в клетках человека линий НеЬа ПроТа регулирует транскрипционную активность опухолевого супрессора р53. Был картирован участок ПроТа, ответственный за усиление р53-зависимой транскрипции. Им оказался центральный «кислый» район ПроТа наряду с МЬБ (сигналом ядерной локализации), расположенным в С-концевой области. Центральный район протимозина альфа ответственен за его взаимодействие с гистоном Н1. На основании этого мы предложили и экспериментально подтвердили гипотезу, в соответствии с которой ПроТа стимулирует р53-регулируемую транскрипцию путем вытеснения гистона Н1 из репрессорного комплекса с р53. В данной работе также впервые показано, что при снижении уровня 6

ПроТа в клетке происходит заметное снижение экспрессии тирозиновой протеинкиназы 1АК1. Активация 1АК1 протимозином альфа представляет большой интерес для выявления механизма иммуностимулирующего действия ПроТа, а также для теоретического обоснования его противоопухолевой активности при использовании в генной терапии.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Захарова, Наталья Ильинична

Выводы

3. ПроТа усиливает транскрипционную активность р53 путем вытеснения гистона Н1 из репрессорного комплекса р53-гистон Н1.

4. При снижении уровня ПроТа происходит снижение экспрессии протеинкиназы 1АК1 в клетках НеЬа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Захарова, Наталья Ильинична, Москва

1. Haritos A.A., Goodall G.J., Horecker B.L. Prothymosin alpha: isolation and properties of the major immunoreactive form of thymosin alpha 1 in rat thymus.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1984-V. 81 -P. 1008-1111.

2. Pineiro A., Cordero O.J., Nogueira M. Fifteen years of prothymosin alpha: contradictory past and new horizons.// Peptides. 2000 - V. 21 - P. 1433.

3. Vartapetian A.B., Uversky V.N. Prothymosin alpha: a simple yet mysterious protein.// Protein structures: kaleidoscope of structural properties and functions. India, Research Signpost.

4. Goodall G.J., Dominguez F., Horecker B.L. Molecular cloning of cDNA for human prothymosin alpha.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986 - V. 83 - P. 8926-8928.

5. Eschenfeldt W.H., Berger S.L. The human prothymosin alpha gene is polymorphic and induced upon growth stimulation: evidence using a cloned cDNA.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986 - V. 83 - P. 9403-9407.

6. Eschenfeldt W.H., Manrow R.E., Krug M.S., Berger S.L. Isolation and partial sequencing of the human prothymosin alpha gene family. Evidence against export of the gene products.// J. Biol. Chem. 1989 - V. 264 - P. 7546-7555.

7. Aniello F., Branno M., De Rienzo G., Ferrara D., Palmiero C., Minucci S. First evidence of prothymosin alpha in a non-mammalian vertebrate and its involvement in the spermatogenesis of the frog Rana esculenta.// Mech. Dev. 2002 - V. 110 - P. 213-217.

8. Gast K., Damaschun H., Eckert K., Schulze-Forster K., Maurer H.R., Muller-Frohne M., Zirwer D., Czarnecki J., Damaschun G. Prothymosin alpha: a biologically active protein with random coil conformation.// Biochemistry. 1995 - V.34 - P. 3211-3218.

9. Uversky V.N., Gillespie J.R., Fink A.L. Why are "natively unfolded" proteins unstructured under physiologic conditions?// Proteins. 2000 - V. 41 - P. 415-427.

10. Abiko T., Sekino H. Synthesis of an immunologically active fragment analog of prothymosin alpha with enhanced enzymatic stability.// Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 1991 - V. 39 - P. 752-756.

11. Bachmair A., Finley D., Varshavsky A. In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue.// Science. 1986 - V. 234 - P. 179-186.

12. Sburlati A.R., De La Rosa A., Batey D.W., Kurys G.L., Manrow R.E., Pannell L.K., Martin B.M., Sheeley D.M., Berger S.L. Phosphorylation of human and bovine prothymosin alpha in vivo.// Biochemistry. 1993 - V. 32 - P. 4587-4596.

13. Tsitsiloni O.E., Yialouris P.P., Sekeri-Pataryas K., Haritos A.A. Prothymosin alpha is not a nuclear polypeptide.// Experientia. 1989 - V. 45 - P. 332-334.

14. Gomez-Marquez J., Segade F. Prothymosin alpha is a nuclear protein.// FEBS Lett. 1988 -V. 226-P. 217-219.

15. Watts J.D., Cary P.D., Crane-Robinson C. Prothymosin alpha is a nuclear protein.// FEBS Lett. 1989 - V. 245 - P. 17-20.

16. Watts J.D., Cary P.D., Sautiere P., Crane-Robinson C. Thymosins: both nuclear and cytoplasmic proteins.// Eur. J. Biochem. 1990 - V. 192 - P. 643-651.

17. Robbins J., Dilworth S.M., Laskey R.A., Dingwall C. Two interdependent basic domains in nucleoplasmin nuclear targeting sequence: identification of a class of bipartite nuclear targeting sequence.// Cell. 1991 - V. 64 - P. 615-623.

18. Palvimo J., Linnala-Kankkunen A. Identification of a low-Mr acidic nuclear protein as prothymosin alpha.// FEBS Lett. 1990 - V. 277 - P. 257-260.

19. Enkemann S.A., Ward R.D., Berger S.L. Mobility within the nucleus and neighboring cytosol is a key feature of prothymosin-alpha.// J Histochem. Cytochem. 2000 - V. 48 - P. 13411355.

20. Wang J., Shiels C., Sasieni P., Wu P.J., Islam S.A., Freemont P.S., Sheer D. Promyelocyte leukemia nuclear bodies associate with transcriptionally active genomic regions.// J. Cell. Biol. 2004 - V. 164 - P. 515-526.

21. Clinton M., Frangou-Lazaridis M., Panneerselvam C., Horecker B.L. Prothymosin alpha and parathymosin: rhRNA and polypeptide levels in rodent tissues.// Arch. Biochem. Biophys. -1989-V. 269-P. 256-263.

22. Frillingos S., Tsolas O. Age- and sex-related differences in the content of prothymosin alpha in rat tissues.// Experientia. 1992 - V. 48 - P. 236-239.

23. Roson E., Garcia-Caballero G., Heimer E.P., Felix A.M., Dominguez F. Cellular distribution of prothymosin alpha and parathymosin in rat thymus and spleen.// J. Histochem. Cytochem. -1990-V. 38-P. 1889-1894.

24. Roson E., Gallego R., Garcia-Caballero T., Heimer E.P., Felix A.M., Dominguez F. Prothymosin alpha expression is associated to cell division in rat testis.// Histochemistry. -1990-V. 94-P. 597-599.

25. Garcia-Caballero T., Dominguez F., Roson E., Gallego R., Zalvide J., Forteza J., Beiras A. Distribution of prothymosin alpha in rat and human adrenal cortex.// Anat. Rec. 1994 - V. 239 - P. 88-94.

26. Gomez-Marquez J., Segade F., Dosil M., Pichel J.G., Bustelo X.R., Freire M. The expression of prothymosin alpha gene in T lymphocytes and leukemic lymphoid cells is tied to lymphocyte proliferation.// J. Biol. Chem. 1989 - V. 264 - P. 8451-8454.

27. Dosil M., Freire M., Gomez-Marquez J. Tissue-specific and differential expression of prothymosin alpha gene during rat development.// FEBS Lett. 1990 - V. 269 - P. 373-376.

28. Bustelo X.R., Otero A., Gomez-Marquez J., Freire M. Expression of the rat prothymosin alpha during T-Lymphocyte proliferation and liver regeneration.// J. Biol. Chem. 1991 - V. 266 - P. 1443-1447.

29. Mori M., Barnard G.F., Staniunas R.J., Jessup J.M., Steele G.D.Jr., Chen L.B. Prothymosin alpha mRNA expression correlates with that of c-myc in human colon cancer.// Oncogene. -1993 -V. 8-P. 2821-2826.

30. Magdalena C., Dominguez F., Loidi L., Puente J.L. Tumour prothymosin alpha content, a potential prognostic marker for primary breast cancer.// Br. J. Cancer. — 2000 V. 82 - P. 584590.

31. Mitani M., Kuwabara Y., Kawamura H., Sato A., Hattori K., Fujii Y. Significance of plasma thymosin alphal measurements in gastric cancer patients.// World J. Surg. 2000 - V. 24 - P. 455-458.

32. Wu C.G., Habib N.A., Mitry R.R., Reitsma P.H., van Deventer S.J., Chamuleau R.A. Overexpression of hepatic prothymosin alpha, a novel marker for human hepatocellular carcinoma.// Br. J. Cancer. 1997 - V. 76 - P. 1199-1204.

33. Sasaki H., Nonaka M., Fujii Y., Yamakawa Y., Fukai I., Kiriyama M., Sasaki M. Expression of the Prothymosin a as a Prognostic Factor in Lung Cancer.// Surg. Today. 2001 - V. 31 -P. 936-938. •

34. Sburlati A.R., Manrow R.E., Berger S.L. Prothymosin alpha antisense oligomers inhibit myeloma cell division.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991 - V. 88 - P. 253-257.

35. Rodriguez P., Vinuela J.E., Alvarez-Fernandez L., Gomez-Marquez J. Prothymosin alpha antisense oligonucleotides induce apoptosis in HL-60 cells.// Cell. Death. Differ. 1999 - V. 6 -P. 3-5.

36. Rodriguez P., Vinuela J.E., Alvarez-Fernandez L., Buceta M., Vidal A., Dominguez F., Gomez-Marquez J. Overexpression of prothymosin alpha accelerates proliferation and retards differentiation in HL-60 cells.// Biochem. J. 1998 - V. 331 - P. 753-761.

37. Evstafieva A.G., Belov G.A., Kalkum M., Chichkova N.V., Bogdanov A.A., Agol V.I., Vartapetian A.B. Prothymosin alpha fragmentation in apoptosis.// FEBS Lett. 2000 - V. 467 -P. 150-154.

38. Evstafieva A.G., Chichkova N.V., Makarova T.N., Vartapetian A.B., Vasilenko A.V., Abramov V.M., Bogdanov A.A. Overproduction in Escherichia coli, purification and properties of human prothymosin alpha.// Eur. J. Biochem. — 1995 V. 231 - P. 639-643.

39. Jiang X., Kim H.E., Shu H., Zhao Y., Zhang H., Kofron J., Donnelly J., Burns D., Ng S.C., Rosenberg S., Wang X. Distinctive roles of PHAP proteins and prothymosin-alpha in a death regulatory pathway.// Science. 2003 - V. 299 - P. 223-226.

40. Qi X., Wang L., Du F. Novel small molecules relieve prothymosin a-mediated inhibition of apoptosome formation by blocking its interaction with Apaf-1.// Biochemistry. 2010 - V. 49 -P. 1923-1930.

41. Kim H.E., Du F., Fang M., Wang X. Formation of apoptosome is initiated by cytochrome c-induced dATP hydrolysis and subsequent nucleotide exchange on Apaf-1.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005 - V. 102 - P. 17545-17550.

42. Lai A., Kawai T., Yang X., Mazan-Mamczarz K., Gorospe M. Antiapoptotic function of RNA-binding protein HuR effected through prothymosin alpha.// EMBO J. 2005 - V. 24 - P. 1852-1862.

43. Ueda H., Fujita R., Yoshida A., Matsunaga H., Ueda M. Identification of prothymosin-alphal, the necrosis-apoptosis switch molecule in cortical neuronal cultures.// J. Cell. Biol. 2007 -V. 176-P. 853-862.

44. Fujita R., Ueda H. Prothymosin-alphal prevents necrosis and apoptosis following stroke.// Cell. Death. Differ. 2007 - V. 14 - P. 1839-1842.

45. Fujita R., Ueda M., Fujiwara K., Ueda H. Prothymosin-a plays a defensive role in retinal ischemia through necrosis and apoptosis inhibition.// Cell. Death. Differ. 2009 - V. 16 - P. 349-358.

46. Fujita R, Ueda H. Protein kinase C-mediated cell death mode switch induced by high glucose.// Cell. Death. Differ. 2003 - V. 10 - P. 1336-1347.

47. Matsunaga H., Ueda H. Stress-induced non-vesicular release of prothymosin-a initiated by an interaction with S100A13, and its blockade by caspase-3 cleavage.// Cell. Death. Differ. -2010-V. 17-P. 1760-1772.

48. Orre R.S., Cotter M.A., Subramanian C., Robertson E.S. Prothymosin alpha functions as a cellular oncoprotein by inducing transformation of rodent fibroblasts in vitro.// J. Biol. Chem. -2000-V. 17-P. 1794-1799.

49. Letsas K.P., Frangou-Lazaridis M., Skyrlas A.s Tsatsoulis A., Malamou-Mitsi V. Transcription factor-mediated proliferation and apoptosis in benign and malignant thyroid lesions.// Pathol. Int. 2005 - V. 55 - P. 694-702.

50. Sasaki H., Sato Y., Kondo S., Fukai I., Kiriyama M., Yamakawa Y., Fujii Y. Expression of the prothymosin alpha mRNA correlated with that of N-myc in neuroblastoma.// Cancer Lett. -2001 -V. 168-P. 191-195.

51. Li K.J, Shiau A.L., Chiou Y.Y., Yo Y.T., Wu C.L. Prothymosin a overexpression induces polycystic kidney disease.// Kidney Int. 2005 - V. 67 - P. 1710-1722.

52. Копнин Б.П. Молекулярные механизмы канцерогенеза.// Энциклопедия клинической онкологии» М.: РЛС, 2004. - С. 34-53.

53. Cotter М.А, Robertson E.S. Modulation of histone acetyltransferase activity through interaction of epstein-barr nuclear antigen 3C with prothymosin alpha.// Mol. Cell. Biol. — 2000-V. 20-P. 5722-5735.

54. Allday M.J., Farrell P.J. Epstein-Barr virus nuclear antigen EBNA3C/6 expression maintains the level of latent membrane protein 1 inGl-arrested cells.// J. Virol. 1994 - V. 68 - P. 34913498.

55. Karetsou Z., Kretsovali A., Murphy C., Tsolas O., Papamarcaki T. Prothymosin alpha interacts with the CREB-binding protein and potentiates transcription.// EMBO Rep. 2002 -V. 3 - P. 361-366.

56. Goodman R.H., Smolik S. CBP/p300 in cell growth, transformation, and development.// Genes. Dev. 2000 - V. 14 - P. 1553-1577.

57. Hartzog G.A., Winston F. Nucleosomes and transcription: recent lessons from genetics.// Curr. Opin. Genet. Dev. 1997 - V. 7 - P. 192-198.

58. Freedman S.J., Sun Z.Y., Poy F., Kung A.L., Livingston D.M., Wagner G., Eck M.J. Structural basis for recruitment of CBP/p300 by hypoxia-inducible factor-1 alpha.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002 - V. 99 - P. 5367-5372.

59. Knight J.S., Lan K., Subramanian C., Robertson E.S. Epstein-Barr virus nuclear antigen 3C recruits histone deacetylase activity and associates with the corepressors mSin3A and NCoR in human B-cell lines.// J. Virol. 2003 - V. 77 - P. 4261-4272.

60. Xue F., Cooley L. Kelch encodes a component of intercellular bridges in Drosophila egg chambers.// Cell. 1993 - V. 72 - P. 681-693.

61. Kang M.L., Kobayashi A., Wakabayashi N., Kim S.G., Yamamoto M. Scaffolding of Keapl to the actin cytoskeleton controls the function of Nrf2 as key regulator of cytoprotective phase 2 genes.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004 - V. 101 - P. 2046-2051.

62. Zhang D.D., Hannink M. Distinct cysteine residues in Keapl are required for Keapl-dependent ubiquitination of Nr£2 and for stabilization of Nrf2 by chemopreventive agents and oxidative stress.// Mol. Cell. Biol. 2003 - V. 23 - P. 8137-8151.

63. Itoh К., Wakabayashi N., Katoh Y., Ishii Т., Igarashi K„ Engel J.D., Yamamoto M. Keapl. repress nuclear activation of antioxidant responsive elements by Nrf2 through binding to the amino-terminal Neh2 domain.// Genes Develop. 1999 - V. 13 - P. 76-86.

64. Мельников C.B. Взаимодействие протимозина а с адаптером убиквитин-лигазы белком Keapl: Автореф. дис. канд. хим. Наук. М., 2008. -19с.

65. Niture S.K., Jaiswal А.К. Prothymosin-alpha mediates nuclear import of the INrf2/CuI3 Rbxl complex to degrade nuclear Nrf2.// J. Biol. Chem. 2009 -V. 284(20) - P. 13856-13868.

66. Johnson R.A., Ince T.A., Scotto K.W. Transcriptional repression by p53 through direct binding to a novel DNA element.// J. Biol. Chem. 2001 - V. 276 - P. 27716-27720.

67. Attardi L.D., DePinho R.A. Conquering the complexity of p53.// Nature Genetics 2004 - V. 36-P. 7-8.

68. Romer L., Klein C., Dehner A., Kessler H., Buchner J. p53 a natural cancer killer: structural insights and therapeutic concepts.// Angew Chem. Int. Ed. Engl. - 2006 - V. 45(39) - P. 6440-6460.

69. Scoumanne A., Harms K.L., Chen X. Structural basis for gene activation by p53 family members.// Cancer Biol. Ther. 2005 - V. 4(11) - P. 1178-1185.

70. Harms K.L., Chen X. The functional domains in p53 family proteins exhibit both common and distinct properties.// Cell. Death. Differ. 2006 - V. 13(6) - P. 890-897.

71. Kubbutat M.H., Ludwig R.L., Ashcroft M., Vousden K.H. Regulation of Mdm2-directed degradation by the С terminus of p53.// Mol. Cell Biol. 1998 - V. 18 - P. 5690-5698.

72. Haupt Y., Maya R., Kazaz A., Oren M. Mdm2 promotes the rapid degradation of p53.// Nature. 1997 - V. 387 - P. 296-299.

73. Kubbutat M.H., Jones S.N., Vousden K.H. Regulation of p53 stability by Mdm2.// Nature. -1997-V. 387-P. 299-303.

74. Fang S., Jensen J.P., Ludwig R.L., Vousden K.H., Weissman A.M. Mdm2 is a RING finger-dependent ubiquitin protein ligase for itself and p53.// J. Biol. Chem. 2000 - V. 275 - P. 8945-8951.

75. Honda R., Yasuda H. Activity of MDM2, a ubiquitin ligase, toward p53 or itself is dependent on the RING finger domain of the ligase.// Oncogene. 2000 - V. 19 - P. 1473-1476.

76. Siepe D., Jentsch S. Prolyl isomerase Pinl acts as a switch to control the degree of substrate ubiquitylation.// Nat. Cell. Biol. 2009 - V. 11 - P. 967-972.

77. Barak Y., Juven Т., Haffher R., Oren M. Mdm2 expression is induced by wild type p53 activity.// EMBO J. 1993 - V. 12 - P. 461-468.

78. Wu X., Bayle J.H., Olson D., Levine A.J. The p53-mdm-2 autoregulatory feedback loop.// Genes Dev. 1993 - V. 7 - P. 1126-1132.

79. Shieh S.Y., Ikeda M., Taya Y., Prives C. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2.// Cell. 1997 - V. 91 - P. 325-334.

80. Shieh S.Y., Taya Y., Prives C. DNA damage-inducible phosphorylation of p53 at N-terminal sites including a novel site, Ser20, requires tetramerization.// EMBO J. 1999 - V. 18 - P. 1815-1823.

81. Sakaguchi K., Herrera J.E., Saito S., Miki T., Bustin M., Vassilev A., Anderson C.W., Appella E. DNA damage activates p53 through a phosphorylation-acetylation cascade.// Genes. Dev. 1998-V. 12-P. 2831-2841.

82. Liu L., Scolnick D.M., Trievel R.C., Zhang H.B., Marmorstein R., Halazonetis T.D., Berger S.L. p53 sites acetylated in vitro by PCAF and p300 are acetylated in vivo in response to DNA damage.// Mol. Cell. Biol. 1999 - V. 19 - P. 1202-1209.

83. Xu Y. Regulation of p53 responses by post-translational modifications.// Cell. Death. Differ. -2003-V. 10-P. 400-403.

84. Vousden K.H. Outcomes of p53 activation-spoilt for choice.// J. Cell. Sci. — 2006 V. 119(24)-P. 5015-5020.107. zur Hausen H. Viruses in human cancers.// Science. 1991 - V. 254(5035) - P. 1167-1173.

85. Werness B.A., Levine A. J., Howley P.M. Association of human papillomavirus types 16 and 18 E6 proteins with p53.// Science. 1990 - V. 248(4951) - P. 76-79.

86. Hawley-Nelson P., Vousden K.H., Hubbert N.L., Lowy D.R., Schiller J.T. HPV 16 E6 and E7 proteins cooperate to immortalize human foreskin keratinocytes.// EMBO J. 1989 V. 8 - P. 3905-3910.

87. Munger K., Phelps W.C., Bubb V., Howley P.M., Schlegel R. The E6 and E7 genes of the human papillomavirus type 16 together are necessary and sufficient for transformation of primary human ceratinocytes.// J. Virol. 1989 - V. 63 - P. 4417-4421.

88. Schneider-Gadicke A., Schwarz E. Different human cervical carcinoma cell lines show similar transcription patterns of human papillomavirus type 18 early genes.// EMBO J. 1986 - V. 5 -P. 2285-2292.

89. Vogelstein B., Kinzler K.W. p53 function and dysfunction.// Cell. 1992 - V. 70(4) - P. 523526.

90. Scheffner M., Whitaker N.J. Human papillomavirus-induced carcinogenesis and the ubiquitin-proteasome system.// Semin. Cancer Biol. 2003 - V. 13 - P. 59-67.

91. Huibregtse J.M., Scheffner M., Beaudenon S., Howley P.M. A family of proteins structurally and functionally related to the E6-AP ubiquitin-protein ligase.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA -1995) V. 92 - P. 2563-2567.

92. Huibregtse J.M., Scheffner M., Howley P.M. Localization of the E6-AP regions that direct human papillomavirus E6 binding, association with p53, and ubiquitination of associated proteins.// Mol. Cell. Biol. 1993 - V. 13 - P. 4918-4927.

93. Hengstermann A., Linares L.K., Ciechanover A., Whitaker N.J., Scheffner M. Complete switch from Mdm2 to human papillomavirus E6-mediated degradation of p53 in cervical cancer cells.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001 - V. 98 - P. 1218-1223.

94. Munger K., Basile J.R., Duensing S., Eichten A., Gonzales S.L., Grace M., Zacny V.L. Biological activities and molecular targets of the human papillomavirus E7 oncoprotein.// Oncogene. 2001 - V. 20 - P. 7888-7898.

95. Boyer S.N., Wazer D.E., Band V. E7 protein of human papillomavirus-16 induces degradation of retinoblastoma protein through through ubiquitin-proteasome pathway.// Cancer. Res. -1996 V. 56 - P. 4620-4624.

96. Wang J., Sampath A., Raychaudhuri P., Bagchi S. Both Rb and E7 are regulated by the ubiquitin proteasome pathway in HPV-containing cervical tumor cells.// Oncogene. 2001 -V. 20-P. 4740-4749.

97. Stevaux O., Dyson NJ. A revised picture of the E2F transcriptional network and RB function.// Curr. Opin. Cell. Biol. 2002 - V. 14 - P. 684-691.

98. Longworth M.S., Laimins L.A. The binding of histone deacetylases and the integrity of zinc finger-like motifs of the E7 protien are essential for the life cycle of human papillomavirus type 31.// J. Virol. 2004 - V. 78 - P. 3533-3541.

99. Kornberg R.D., Lorch Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome.// Cell. 1999 - V. 98(3) - P. 285-294.

100. Luger K., Richmond T.J. The histone tails of the nucleosome.// Curr. Opin. Genet. Dev. -1998-V. 8(2)-P. 140-146.

101. Workman J.L., Kingston R.E. Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation.// Annu. Rev. Biochem. 1998 - V. 67 - P. 545-79.

102. Bustin M., Catez F., Lim J. The dynamics of histone HI function in chromatin.// Molecular Cell. 2005 - V. 17 - P. 617-620.

103. Parseghian M.H., Hamkalo B.A. A compendium of the histone HI family ofsomatic subtypes: An elusive cast of characters and their characteristics.// Biochem. Cell. Biol. 2001 - V. 79 -P.289-304.

104. Ponte I., Vila R., Suau P. Sequence complexity of histone HI subtypes.// Mol. Biol. Evol. -2003 V. 20(3) - P. 371-380.

105. Khochbin S. Histone HI diversity: bridging regulatory signals to linker histone function.// Gene. 2001. V. 271(1)-P. 1-12.

106. Vignali M., Workman J.L. Location and function of linker histones.// Nat. Struct. Biol. 1998 -V. 5(12)-P. 1025-1028.

107. Thomas J.O. Histone HI: location and role.// Curr. Opin. Cell. Biol. 1999 - V. 11(3) - P. 312-317.

108. Lusser A., Kadonaga J.T. Strategies for the reconstitution of chromatin.// Nat. Methods. -2004-V. 1(1)-P. 19-26.

109. Thoma F., Koller T., Klug A. Involvement of histone HI in the organization of the nucleosome and of the salt-dependent superstructures of chromatin.// J. Cell. Biol. 1979 - V. 83-P. 403-427.

110. Pennings S., Meersseman G., Bradbury E.M. Linker histones HI and H5 prevent the mobility of positioned nucleosomes.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994 - V. 91(22) - P. 1027510279.

111. Shimamura A., Sapp M., Rodriguez-Campos A., Worcel A. Histone HI represses transcription from minichromosomes assembled in vitro.// Mol. Cell. Biol. 1989 -V. 9(12) -P. 5573-5584.

112. Laybourn P.J., Kadonaga J.T. Role of nucleosomal cores and histone HI in regulation of transcription by RNA polymerase II.// Science. 1991 - V. 254(5029) - P. 238-245.

113. Brown, D.T., Alexander, B.T., Sittman, D.B. Differential effect of HI variant overexpression on cell cycle progression and gene expression.// Nucleic Acid Res. 1996 V. 24 - P. 486-493.

114. Shen X., Gorovsky M.A. Linker histone HI regulates specific gene expression but not global transcription in vivo.// Cell. 1996 - V. 86 - P. 475-483.

115. Ni J.Q., Liu L.P., Hess D., Rietdorf J., Sun F.L. Drosophila ribosomal proteins are associated with linker histone HI and suppress gene transcription.// Genes. Dev. 2006 - V. 20(14) - P. 1959-1973.

116. Shen X., Yu L., Weir J.W., Gorovsky M.A. Linker histones are not essential and affect chromatin condensation in vivo.// Cell. 1995 - V. 82(1) - P. 47-56.

117. Ushinsky S.C., Bussey H., Ahmed A.A., Wang Y., Friesen J., Williams B.A., Storms R.K. Histone HI in Saccharomyces cerevisiae.// Yeast. 1997 - V. 13(2) - P. 151-161.

118. Patterton H.G., Landel C.C., Landsman D., Peterson C.L., Simpson R.T. The biochemical and phenotypic characterization of Hholp, the putative linker histone HI of Saccharomyces cerevisiae.// J. Biol. Chem. 1998 - V. 273(13) - P. 7268-7276.

119. Ramón A., Muro-Pastor M.I., Scazzocchio C., Gonzalez R. Deletion of the unique gene encoding a typical histone HI has no apparent phenotype in Aspergillus nidulans.// Mol. Microbiol. 2000 - V. 35(1) - P. 223-233.

120. Rupp R.A., Becker P.B. Gene regulation by histone HI: new links to DNA methylation.// Cell. 2005 - V. 123(7) - P. 1178-1179.

121. Kim K., Choi J., Heo K., Kim H., Levens D., Kohno K., Johnson E.M., Brock H.W., An W. Isolation and characterization of a novel HI.2 complex that acts as a repressor of p53-mediated transcription.// J. Biol. Chem. 2008 - V. 283(14) - P. 9113-9126.

122. Nishiyama M., Nakayama K., Tsunematsu R., Tsukiyama T., Kikuchi A., Nakayama K.I. Early embryonic death in mice lacking the beta-catenin-binding protein Duplin.// Mol. Cell. Biol. 2004 - V. 24(19) - P. 8386-8394.

123. An W., Palhan V.B., Karymov M.A., Leuba S.H., Roeder R.G. Selective requirements for histone H3 and H4 N termini in p300-dependent transcriptional activation from chromatin.// Mol. Cell. 2002 - V. 9(4) - P. 811-821.

124. Papamarcaki T., Tsolas O. Prothymosin alpha binds to histone HI in vitro.// FEBS Lett. — 1994-V. 345 -P. 71-75.

125. Diaz-Jullien C., Perez-Estevez A., Covelo G., Freire M. Prothymosin alpha binds histones in vitro and shows activity in nucleosome assembly assay.// Biochim. Biophys. Acta. 1996 - V. 1296 - P. 219-227.

126. Karetsou Z., Sandaltzopoulos R., Frangou-Lazaridis M., Lai C.Y., Tsolas O., Becker P.B., Papamarcaki T. Prothymosin alpha modulates the interaction of histone HI with chromatin.// Nucleic Acids Res. 1998 - V. 26 - P. 3111-3118.

127. Gomez-Marquez J., Rodriguez P. Prothymosin alpha is a chromatin-remodelling protein in mammalian cells.// Biochem. J. 1998 - V. 333 - V. 1-3.

128. Karetsou Z., Martic G., Tavoulari S., Christoforidis S., Wilm M., Gruss C., Papamarcaki T. Prothymosin alpha associates with the oncoprotein SET and is involved in chromatin decondensation.// FEBS Lett. 2004 - V. 577 - P. 496-500.

129. Martic G., Karetsou Z., Kefala K., Politou A.S., Ciapier C.R., Straub Т., Papamarcaki Т. Parathymosin affects the binding of linker histone HI to nucleosomes and remodels chromatin structure.// J. Biol. Chem. 2005 - V. 280 - P. 16143-16150.

130. Mamoon N.M., Song Y. Wellman S.E. Binding of histone HI to DNA is described by an allosteric model.// Biopolymers. 2005 - V. 77 - P. 9-17.

131. Catez F., Ueda T. Bustin M. Determinants of histone HI mobility and chromatin binding in living cells.// Nat. Struct. Mol. Biol. -2006 V. 13 - P. 305-310.

132. Park YJ. Luger K. Histone chaperones in nucleosome eviction and histone exchange.// Curr. Opin. Struct. Biol. 2008 - V. 18 - P. 282-289.

133. George E.M., Brown D.T. Prothymosin a is a component of a linker histone chaperone.// FEBS Letters. 2010 - V. 584 - P. 2833-2836.

134. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.// Nature. 1970 - V. 227 - P. 680-685.

135. Гурьянова O.A., Маханов M., Ченчнк A.A., Чумаков П.М., Фролова Е.И. Оптимизация полногеномной неупорядоченной клонотеки коротких шпилечных РНК на основе лентивектора.// Молекулярная биология. 2006 - V. 40 - Р. 448-459.

136. Chichkova N.V., Evstafieva A.G., Lyakhov I.G., Tsvetkov A.S., Smirnova T.A., Karapetian R.N., Karger E.M., Vartapetian A.B. Divalent metal cation binding properties of human prothymosin cc.// Eur. J. Biochem. 2000 - V. 267 - P. 4745-4752.

137. Cai J.H., Deng S., Kumpf S.W., Lee P.A., Zagouras P., Ryan A., Gallagher D.S. Validation of rat reference genes for improved quantitative gene expression analysis' using low density arrays.// Biotechniques. 2007 - V. 42(4) - P. 503-512.

138. Kobayashi Т., Wang Т., Maezawa M., Kobayashi M., Ohnishi S., Hatanaka K., Hige S., Shimizu Y., Kato M., Asaka M., Tanaka J., Imamura M., Hasegawa K., Tanaka Y.,

139. Brachmann R.K. Overexpression of the oncoprotein prothymosin alpha triggers a p53 response that involves p53 acetylation.// Cancer Res. 2006 - V. 66 - P. 3137-3144.

140. Shiau A.L., Lin P.R., Chang M.Y., Wu C.L. Retrovirus-mediated transfer of prothymosin gene inhibits tumor growth and prolongs survival in murine bladder cancer.// Gene Ther. — 2001 V. 8(21) - P. 1609-1617.1. Благодарности

141. Выражаю искреннюю благодарность своему научному руководителю Александре Георгиевне Евстафьевой за организацию работы, грамотное руководство и всестороннюю поддержку.

142. Хочется выразить глубокую благодарность моим коллегам, которые принимали участие в данной работе: Суворовой А., Соколову В., Рудько В.

143. Искренне признательна своим учителям Фатеевой Т., Мельникову С., Филонову Г. за обучение методам, обсуждение результатов и всевозможную помощь в выполнении и написании работы.

144. Выражаю отдельную благодарность Хуторненко А., Тужикову А., Трусовой С. -сотрудникам нашей лаборатории — за обсуждение результатов, ценные советы и поддержку.

145. Отдельная благодарность И.М.Теренину за помощь в написании диссертации, а также Андрееву Д.Е. и Дмитриеву С.Е. за теоретическую поддержку и стимуляцию научной деятельности.

146. И эта работа не была бы возможна без неоценимого содействия П.М.Чумакова.

Информация о работе

Захарова, Наталья Ильинична
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.03

Диссертация

Стимуляция активности опухолевого супрессора p53 протимозином альфа - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Стимуляция активности опухолевого супрессора p53 протимозином альфа ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Стимуляция активности опухолевого супрессора p53 протимозином альфа"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Захарова, Наталья Ильинична

Введение Диссертация по биологии, на тему "Стимуляция активности опухолевого супрессора p53 протимозином альфа"

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Захарова, Наталья Ильинична

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Захарова, Наталья Ильинична, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Стимуляция активности опухолевого супрессора p53 протимозином альфа
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология