Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активация опухолевого супрессора p53 при ингибировании III комплекса дыхательной цепи митохондрий

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Активация опухолевого супрессора p53 при ингибировании III комплекса дыхательной цепи митохондрий"

На правах рукописи

ХУТОРНЕНКО Анастасия Александровна

Активация опухолевого супрессора р53 при ингибировании III комплекса дыхательной цепи митохондрий

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 1 ОКТ 2012

Москва-2012

005053203

005053203

Работа выполнена на Факультете биоинженерии и биоинформатики и в отделе химии и биохимии нуклеопротеидов НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова"

Научный руководитель:

доктор химических наук Евстафьева Александра Георгиевна

Официальные оппоненты:

Копылов Алексей Михайлович, доктор химических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова", химический факультет, профессор.

Кравченко Юлия Евгеньевна, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, научный сотрудник.

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт канцерогенеза ФГБУ «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» РАМН

Защита состоится 11 октября 2012 года в на заседании Совета Д 501.001.76 по

защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991 Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В .Ломоносова.

Автореферат разослан 11 сентября 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Опухолевый супрессор р53 - это ключевой регуляторный белок клетки, который является транскрипционным фактором. Активация р53 происходит в ответ на различные стрессы (например, окислительный стресс, повреждения ядерной и митохондриальной ДНК, ингибирование репликации и транскрипции ДНК, гипоксию) и определяет дальнейшую судьбу клетки: произойдет ли остановка клеточного цикла для преодоления последствий стресса или включится механизм программируемой клеточной смерти. Белок р53 находится на пересечении множества сигнальных путей, участвуя в таких процессах, как поддержание стабильности клеточного генома, регуляция апоптоза, клеточного цикла, аэробного и анаэробного дыхания и многих других. Повышенное внимание к р53 определяется, прежде всего, ключевой ролью этого белка в защите от рака. Нарушения функционирования р53 наблюдаются в большинстве опухолей человека.

Митохондрии играют двоякую роль - как «энергетические станции» клетки и как медиаторы ряда регуляторных путей, включая индукцию апоптоза. Дыхательная цепь (ДЦ) или цепь переноса электронов (ЦПЭ) митохондрий состоит из интегрированных во внутреннюю митохондриальную мембрану мультикомпонентных белковых комплексов I -IV, которые катализируют перенос электронов от КАОН на молекулярный кислород.

Описано множество случаев "митохондриальных заболеваний", обусловленных, как правило, дефектами дыхательной цепи митохондрий. Клетки с дефектами в дыхательной цепи склонны к апоптозу, и усиленная потеря клеток, таким образом, является важным следствием митохондриальных дисфункций, связанных с возрастом. Есть связь между нарушением работы митохондрий и увеличением генерации активных форм кислорода, весьма опасных для клетки.

Таким образом, дыхательная цепь митохондрий и р 53 являются системами, определяющими судьбу клеток в организме на протяжении его жизни, а также участвующими в его патофизиологии.

На сегодняшний день в литературе существует мало данных относительно сигналов от митохондрий, приводящих к активации р 53. Кроме того, эти данные зачастую противоречивы. Систематического исследования влияния ингибирования каждого из комплексов ДЦ митохондрий на уровень и активность белка р 53 не проводилось. В настоящей работе такое исследование проведено впервые.

Выявление новых путей и механизмов активации опухолевого супрессорар 53 и индукции р53 -зависимого апоптоза несет в себе потенциал для разработки новых стратегий антираковой терапии и создания лекарств нового поколения.

Цели исследования.

Целью настоящей работы было изучение механизма активации опухолевого супрессора р53 в ответ на ингибирование III комплекса дыхательной цепи митохондрий.

Научная новнзна и практическая значимость. Ни один белок не изучается так интенсивно, как опухолевый супрессор р53. Однако данные о влиянии ингибирования дыхательной цепи митохондрий на уровень и активность р 53 в научно-информационных источниках малочисленны и противоречивы. С одной стороны, показано, что для активации р53 под действием некоторых стрессов необходима ненарушенная работа митохондриальной дыхательной цепи. При действии ингибиторов ДЦ митохондрий в отсутствие активирующего р 53 агента наблюдали как снижение базального уровня р5 3 под действием ротенона и олигомицина, так и накопление р 53 под действием ротенона и антимицина A. Behrend и др. (2005) связали активацию р 53 под действием ротенона и антимицина А со снижением митохондриального мембранного потенциала (ММП) и предположили существование общего механизма активации р 53 в результате разобщения окислительного фосфорилирования.

В нашей работе впервые показано, что ингибирование именно III комплекса ДЦ приводит к активации р 53, сопровождающейся р53-зависимым апоптозом, в то время как ингибирование I, II или IV комплексов существенного влияния нар53 не оказывает. При этом разобщители окислительного фосфорилирования не приводили к заметному увеличению уровня и активности р53, что свидетельствует против гипотезы Behrend и др. о ключевой роли деполяризации митохондриальной мембраны в активации р53.

Исследуя механизм этого явления, мы обнаружили, что причиной активации р53 является нарушение работы дигидрооротат дегидрогеназы (ДГОДГ), одного из ферментов пути биосинтеза пиримидинов в клетке. ДГОДГ - это белок, встроенный во внутреннюю митохондриальную мембрану, его функционирование сопряжено с III комплексом ДЦ митохондрий через убихинон, акцептирующий электроны при окислении дигидрооротата. То, что ингибирование ДГОДГ должно приводить к активации р 53, было предсказано ранее, но не было подтверждено экспериментально. Таким образом, наша работа впервые экспериментально продемонстрировала, что биосинтез пиримидинов de novo является связующим звеном между дыхательной цепью митохондрий и о пухолевым супрессором р53.

В настоящее время, как ни странно, нет общепринятого молекулярного механизма активации р 53 при дефиците пиримидиновых нуклеотидов. Ингибирование биосинтеза пиримидинов должно приводить к нарушениям синтеза РНК и ДНК. Нарушение репликации ДНК обычно сопровождается генотоксическим стрессом и, вследствие этого,

стабилизацией и активацией р 53. Такой механизм недавно был предложен для активации р53 в фибробластах человека при действии ингибитора биосинтеза пиримидинов PALA. Однако в раковых клетках, с которыми мы работаем, возрастание уровня р 53 при ингибировании III комплекса ДЦ митохондрий не коррелировало с ключевой для генотоксического стресса модификацией, фосфорилированием р 53 по SerlS. Следовательно, в нашем случае работает к акой-то другой механизм активации р 53. И действительно, мы показали, что хиноноксидоредуктазы NQOl и NQ02,

осуществляющие защиту р 53 от убиквитин-независимой деградации в 20S протеосомах, вносят вклад в стабилизацию р53 при ингибировании III комплекса ДЦ митохондрий.

Публикации и апробация работы. Материалы работы были представлены на международных конференциях "Ломоносов-2008" (Москва, 2008), "Ломоносов-2009" (Москва, 2009), "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2010), "Геномика и биология клетки" (Москва, Звенигород, 2010), 36th FEBS Congress 'Biochemistry for tomorrow's medicine' (Torino, Italy, 2011). По материалам диссертации опубликована 1 статья в международном журнале.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на //0 странице машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован S? рисунками и Q_ таблицами. Библиографический указатель включает ^^ цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Ингибирование III комплекса ДЦ митохондрий приводит к увеличению уровня и транскрипционной активности р53

Опухолевый супрессор р53 - транскрипционный фактор, который активируется в клетке в ответ на различные стрессы. Нарушение работы митохондрий является серьезным стрессом для клеток, приводящим к возникновению различных патологических состояний в организме человека. В функционировании митохондрий важную роль играет дыхательная цепь (ДЦ), состоящая из нескольких многосубъединичных комплексов (1-1У). Мы систематически исследовали, как нарушение работы разных участков дыхательной цепи влияет на активность р53 в эпителиальных раковых клетках человека.

Значительное увеличение уровня р 53 в клетках рака толстой кишки RKO наблюдалось после их обработки ингибиторами III комплекса дыхательной цепи митохондрий миксотиазолом (МХТ), стигмателлином (STG) и антимицином A (ANT) (Рис. 1, А). Под действием ингибитора I комплекса ДЦ, пирицидина (PRC), было заметно небольшое снижение уровня р 53 (Рис. 1, А). Обработка клеток TTFA, ингибитором II комплекса ДЦ, и KCN, ингибитором цитохром с оксидазы (IV комплекса ДЦ), не приводила к изменению уровня р53 в клетках. С помощью иммуноблота лизатов клеток рака шейки матки HeLa мы также наблюдали значительное увеличение уровня р53 под действием миксотиазола (МХТ) и стигмателлина (STG), однако практически никакого эффекта не было видно в результате действия пирицидина (PRC) (Рис. 1, Б). Похожие результаты были получены на клетках рака легкого А549 и клетках рака толстой кишки НСТ116 (не показано).

Далее изучали влияние ингибиторов ДЦ митохондрий на транскрипционную активность р 53. Для измерения транскрипционной активности р 53 клетки HeLa трансфицировали плазмидой, несущей ген люциферазы (lue) под контролем р53 -зависимого промотора, а также плазмидой, несущей ген lacZ под контролем конститутивного промотора, для нормировки. Транскрипция lue значительно усиливалась при обработке клеток HeLa ингибиторами III комплекса дыхательной цепи миксотиазолом (МХТ) и стигмателлином (STG) и в меньшей степени усиливалась под действием антимицина A (ANT) (Рис. 1, В). Ингибиторы I комплекса пирицидин (PRC), II комплекса TTFA и IV комплекса KCN не влияли на уровень транскрипции р53 -зависимого репортерного гена (Рис. 1, В). При оценке репортерной активности в клетках других линий (RKO, А549) были получены похожие результаты, хотя эффекты были менее выраженными. Поскольку репортерная система работала наилучшим образом в клетках HeLa, то для изучения транскрипционной активности р53 использовали именно эту клеточную линию.

RKO

о / /о , iW

mm — —■ актин

Б HeLa о

р53 aicniH

с мхт stg ant prc kcn ttfa

Рис. 1. Влияние ингибиторов ДЦ митохондрий на уровень и транскрипционную активность р53 в клетках. Клетки RKO (А) или клетки HeLa (Б, В) инкубировали с 2 мкМ миксотиазола (МХТ), 1 мкМ стигмателлина (STG), 2 мМ антимицина A (ANT), 2 мкМ пирицидина (PRC), 100 мкМ TTFA или 5 мМ KCN в течение 18 часов, затем уровень р53 (А, Б) анализировали методом иммуноблотинга с антителами к р 53 и к актину в качестве контроля нанесения. Для измерения транскрипционной активонстир 53 клетки HeLa трансфицировали плазмидой, несущей ген люциферазы под контролем р53 -зависимого промотора, а также плазмидой, несущей ген lacZ под контролем конститутивного промотора, для нормировки; затем клетки инкубировали с ингибиторами, как указано выше, и измеряли люциферазную активность, которую нормировали на Р-галактозидазную активность в лизатах этих клеток (В). Справа на рисунке показана схема ДЦ митохондрий, указаны ингибиторы для каждого из комплексов дыхательной цепи.

На основании полученных данных мы сделали вывод о том, что увеличение уровня и активности р 53 в клетках связано с ингибированием ДЦ митохондрий в определенном участке, а именно, в области III комплекса (цитохром bel комплекса) ДЦ митохондрий, но не с ингибированием работы других комплексов (I, II или IV) дыхательной цепи.

Известно, что р 53 накапливается в ядрах в ответ на повреждение ДНК и другие в иды клеточного стресса, но он также может перемещаться в митохондрии в ответ на определенные стимулы. Мы показали с помощью иммунофлюоресцентной микроскопии, что в необработанных клетках линии RKO виден только фоновый сигнал от р53 в ядрах и цитоплазме. После инкубации клеток с миксотиазолом в течение 18 часов наблюдалось значительное усиление сигнала отр53 в ядрах (Рис. 2).

Ротенон (RTN) Пирицидип (PRC)

TTFA

Миксотиазол (МХТ) Сгигмкгеллин Антимицин A (ANT)

RKO

Контроль Миксотиазол

© 11

Рис. 2. Внутриклеточная локализация активированного под действием миксотиазола р53. Иммунофлюоресцентное окрашивание р 53 в клетках RKO без обработки ингибиторами (Контроль) и обработанных миксотиазолом в течение 18 часов. Для детекции р53 в клетках использовали антитела, меченные Alexa Fluor 555 (красный). Ядра окрашивали специфическим красителем Hoechst 33342 (синий).

Таким образом, индуцированный при ингибировании III комплекса ДЦМ р53 накапливается в ядрах клеток.

2. Причина индукции р53 при ингибировании III комплекса ДЦМ

Далее встал вопрос относительно того, что служит причиной индукции р53 при ингибировании III комплекса ДЦ митохондрий.

2.1 Образование активных форм кислорода

р53 - это транскрипционный фактор, весьма чувствительный к изменениям редокс-состояния внутри клетки. Он может активироваться в ответ на окислительный стресс, вызванный активными формами кислорода (АФК). Митохондрии являются основным внутриклеточным источником АФК, которые образуются в качестве побочных продуктов при аэробном дыхании.

Методом цитофлуориметрии нами было показано, что при ингибировании III комплекса ДЦМ миксотиазолом происходит небольшое увеличение АФК в клетках.

Добавление к клеткам пероксида водорода, который сам является активной формой кислорода, также приводит к увеличению уровня АФК в клетках (Рис. 3, А-Б, пунктирная линия). Общеизвестный антиоксидант N-ацетил цистеин (NAC) препятствует образованию АФК под действием миксотиазола и пероксида водорода (Рис. 3, А-Б, зеленый или серый пик).

HeLa

о а

В

и о Г

S

§

270-

1 10 100 FL1 - DCF-DA

Control(4,6) Myrotluazol(6,2) Myxothiazol + NAC(4,6)

1000

1 10 100 FL1 - DCF-DA

2200

О 1760 H

320

4 О

m 440

£ 880

4 о

s<s

RKO

Меал-х

. — Control 1,54

— Н202 2,75

1 ■■ H202+NAC 1,39

Ii [Ті И 1

JW1 1\\

ш Ш 1

11 Н \

j / KI

0.1

1 10 100 FL1 - DCF-DA

. Меап-х

1 - Control 1,54

1--Myxothiazol 1.96

1 ■■ Myxo+NAC 1,63

Kl

1 10 100 FL1 - DCF-DA

Рис. 3. N-ацетил цистеин предотвращает образование АФК под действием ингибитора III комплекса ДЦМ миксотиазола. а также под действием пероксида водорода. Клетки HeLa (А) или RKO (Б) инкубировали с 2 мкМ миксотиазола или 200 мкМ пероксида водорода отдельно (Myxothiazol или Н202, пунктирная линия) или совместно с 10 мМ NAC (Myxothiazol+NAC или H2O2+NAC, зеленый или серый пик) в течение 18 часов, затем к клеткам добавляли чувствительный к АФК краситель DCF-DA, и уровень АФК измеряли с помощью проточного цитофлуориметра. FL1 - флуоресценция DCF-DA; в скобках на графиках указано среднее положение пика по горизонтальной оси (то есть, среднее значениие интенсивности флуоресценции DCF-DA в клетках).

Однако NAC не влияет существенно на накопление (Рис. 4, А) или активации (Рис. 4, В) р 53 под действием ингибиторов III комплекса ДЦ митохондрий, в то время как он полностью предотвращает индукцию р53 под действием пероксида водорода (Рис. 4, Б).

RKO

ANT + + — — —

MXT — — + + —

STG — — — — +

NAC — + — + ~

■a? rr » rr

+ +

RKO

H2O2 - + + NAC - - +

p53

p53

Рис. 4. NAC не препятствует накоплению и активации р 53 при ингибировании III комплекса ДП. но предотвращает накопление р53 под действием пероксида водорода. А, Б. Оценка уровня р 53 с помощью иммуноблота в лизатах клеток RKO, инкубированных с 2 мкМ антимицина A (ANT), 2 мкМ миксотиазола (MXT), 1 мкМ стигмателлина (STG) или 300 мкМ Н2О2 отдельно или совместно с 10 мМ NAC в течение 18 часов. В. Измерение люциферазной активности для оценки уровня р53-зависимой транскрипции в клетках HeLa, обработанных 2 мкМ антимицина A (ANT), 2 мкМ миксотиазола (МХТ) или 1 мкМ стигмателлина (STG) отдельно или совместно с 10 мМ NAC.

Таким образом, активация р 53 под действием ингибиторов III комплекса ДЦ митохондрий в существенной степени является независимой от АФК.

2.2 Падение мембранного потенциала

Для проверки того, не является ли индукция р 53 под действием ингибиторов III комплекса ДЦ митохондрий следствием снижения митохондриального мембранного потенциала (ММП), клетки (наряду с миксотиазолом) были обработаны различными разобщителями окислительного фосфорилирования, такими как SF (3,5-ди-терт-бутил-4-гидроксибензилиденмалононитрил), TTFB (4,5,6,7-тетрахлоро-2-трифторметил-

бензимидазол), FCCP (трифторкарбонилцианид фенилгидразон) и DNP (динитрофенол). Для оценки уровня ММП клетки окрашивали потенциал-зависимым митохондриальным красителем TMRM, и качественное изменение ММП изучали с помощью конфокальной микроскопии. Спустя 4 часа инкубации с миксотиазолом мы наблюдали дробление

митохондрий, однако мембранный потенциал в них сохранялся, в то время как после 4 часов инкубации с разобщителем (РССР) происходило дробление митохондрий и значительное падение электрохимического потенциала на их мембранах (Рис. 5). Тем не менее, обработка клеток разобщителями, в отличие от миксотиазола, не приводила к заметному увеличению уровня опухолевого супрессора р53 (Рис. 6, А) или к усилению его транскрипционной активности (Рис. 6, Б). В свою очередь, разобщители не предотвращали активацию р53 под действием миксотиазола (не показано).

ЯКО

Контроль

Миксотиазол

БССР

Рис. 5. Влияние ингибитора III комплекса ДП (миксотиазола) и разобщителя (ТС'СР) на ММП. Клетки ККО инкубировали в течение 4 часов с 2 мкМ миксотиазола или с 1 мкМ РССР, затем окрашивали потенциал-зависимым митохондриальным красителем ТМ1Ш и изменение уровня ММП изучали с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии.

РЖО

Л ГС? ^ <<° С

4

р53 актин

С НТВ РССР ЭР РМР мхт

Рис. 6. Влияние разобщителей окислительного фосфорилирования на индукцию р53. А. Оценка уровня р53 с помощью иммуноблота лизатов клеток ККО, обработанных 2 мкМ миксотиазола (МХТ), разобщтелями: 0,4 мМ динитрофенола (ЭЩ 5 мкМ ТТРВ (ТТТВ), 1 мкМ РССР (РССР), 1 мкМ вР (8Р), или клеток без обработки (С). Б. Измерение люциферазной репортерной активности для оценки р53-зависимой транскрипции в лизатах клеток НеЬа, обработанных аналогично клеткам ЯКО (А).

Эти результаты свидетельствуют о том, что снижение митохондриапьного мембранного потенциала не является причиной увеличения уровня и активности р 53 под действием ингибиторов III комплекса ДЦ митохондрий.

2.3 Падение уровня пиримидинов

С цепью переноса электронов сопряжен один из метаболических путей в клетке - путь биосинтеза пиримидинов de novo. Единственный митохондриальный фермент этого пути -дигидрооротат дегидрогеназа (DHODH), флавопротеин, интегрированный во внутреннюю мембрану митохондрии и осуществляющий окисление дигидрооротата до оротата (Рис. 7).

итр......г СТР

дигидрооротат

уридин ■•'

.Л

Межмембранное пространство

DHODH......^оротат —' Cytc

[Комплекс, - . ---,

uq/uqh2 -^ 1П 1 /Комплекс»

t1 ( IV

Ч^ЛСомплекс J V J

II f\

02 H20

Внутренняя мембрана митохондрии

сукцинат фумарат

Рис. 7. С дыхательной цепью митохондрий функционально связан фермент пути биосинтеза пиримидинов, дигидрооротат дегидрогеназа (ОНСЮН). Окисленный убихинон (иО) принимает электроны от комплекса I, комплекса II и БНООН, восстанавливается до убихинола (иОН2), который затем отдает электроны на комплекс III.

Методом жидкостной хроматографии мы измерили уровень пуринов и пиримидинов в клетках ККО после их обработки ингибиторами ДЦ митохондрий. Под действием миксотиазола, как и под действием специфического ингибитора ОНООН лефлюномида, происходило снижение уровня пиримидинов (уридина и цитидина - и и гС, соответственно) в клетках, в то время как уровень пуринов (аденозина и гуанозина - гА и Ю, соответственно) не изменялся (Рис. 8, лефлюномид - зеленые столбцы, миксотиазол -фиолетовые, контроль без обработок - синие). Обработка клеток ингибитором IV комплекса ДЦ i4.CN не приводила к изменению уровней ни пуринов, ни пиримидинов (Рис. 8, КС1Ч - красные столбцы).

Рис. 8. При ингибировании III комплекса ДЦ митохондрий происходит падение уровня пиримидинов. Клекти КХО инкубировали с 2 мкМ миксотиазола, 50 мкМ лефлюномида или 5 мМ КСМ в течение 18 часов, затем лизировали и из лизатов выделяли нуклеотиды, уровень которых, после дефосфорилирования, анализировали методом ультра-эффективной жидкостной хроматографии. Приведены значения, нормированные на количество каждого из нуклеозидов в контрольном образце.

Аналогично миксотиазолу, под действием ингибитора БНСЮН лефлюномида происходило увеличение уровня р 53 в клетках ККО (Рис. 9, А). Добавление к клеткам продуктов ЦНООН, оротата и далее образуемого в пути биосинтеза пиримидинов уридина, предотвращали накопление (Рис. 9, Г и Б, соответственно) и активацию р53 (Рис. 9, Д и В, соответственно) под действием миксотиазола, в то время как добавление субстрата БНСЖН, дигидрооротата, не препятствовало индукции р 53 при ингибировании III комплекса ДЦ (Рис. 9, Г и Д).

LFL

RKO 5 100 (цМ)

В

Б RKO

мхт - + + +

URD 75 - 75 50 (цд/ml) __ .

+ -

25 -

p53

МХТ DHO ORT URD

RKO + +

- +

ОС 4

•е- §

II» 2 I '

МХТ URD

Д s

+ + -

+ - +

- + -

. _ т р53

мхт

ORT DHO

HeLa

Г—1 Г=1

п

+ +

+ + + - + -

Рис.9. При ингибировании III комплекса ДЦ митохондрий нарушается работа DHODH. фермента пути биосинтеза пиримидинов. А. Инкубация клеток RKO с ингибитором DHODH лефлюномидом (LFL) приводит к увеличению уровня р 53 в этих клетках. Б, В. Восполнение пула пиримидинов при добавлении к клеткам RKO или HeLa уридина (URD) предотвращает накопление (Б) или активацию (В) р53 под действием миксотиазола (МХТ). Г, Д. Добавление к клеткам RKO или HeLa продукта DHODH оротата (ORT) предотвращает накопление (Г) или активацию р53 (Д) под действием миксотиазола (МХТ), а добавление субстрата DHODH дигидрооротата (DHO) не препятствует такой индукции р53 в клетках RKO (Г) и HeLa (Д).

Таким образом, мы показали, что основной механизм стабилизации и активации р53 при нарушении работы III комплекса ДЦ митохондрий - ингибирование дигидрооротат-дегидрогеназы (DHODH) и, как следствие, падение уровня пиримидинов.

3. Механизм стабилизации р53 при ингибировании III комплекса ДЦ митохондрий

Пути деградации р53 в клетках

В клетках в норме уровень р53 довольно низкий за счет его деградации в 26S и в 20S протеасомах. Mdm2 и другие ЕЗ-убиквитинлигазы полиубиквитинилируют р53, направляя его в 26S протеасомы. Этот процесс нарушается при стрессах, под действием которых происходит фосфорилирование р53 по ряду остатков серина и треонина или усиливается экспрессия белка pl4Arf. Опухолевый супрессорр53 может стабилизироваться также в результате взаимодействия с NAD(P)H:xhhoh оксидоредуктазой 1 (NQ01) и NRH:xhhoh

оксидоредуктазой 2 (NQ02). Такое взаимодействие препятствует убиквитин-независимой деградации р53 в 20S протеасомах (Рис. 10).

NADH

NRH

ser15

(ATM )

QMdm2j |

I

повреждение ДНК

t

активированные онкогены

Рис. 10. Два пути деградации р53: 1) убиквитин-зависимый путь деградации р53 в 26S протеасомах (ЕЗ-убиквитинлигаза Mdm2 полиубиквитинилирует р53, направляя его, таким образом, на деградацию в 26S протеасомы); 2) убиквитин-независимый путь деградации в 20S протеасомах (взаимодействие р53 с NQOl и NQ02 препятствует такой деградации).

А) Путь убиквитин-зависимой деградации р53

3.1 Стабилизация р53 в результате его модификации

В клетке в нормальных условиях белок р 53 нестабилен в связи с процессами деградации, инициаторами которой является ряд ЕЗ убиквитинлигаз, среди которых Mdm2 является наиболее изученной. В результате клеточного стресса (например, повреждения ДНК или нарушения процесса транскрипции) Мскп2-опосредованная негативная регуляция р53 ослабляется, и уровень белка р 53 в клетке растет. Такое накопление р53 может осуществляться е помощью фосфорилирования р 53 и Mdm2, что ведет к разрушению взаимодействия между ними. Фосфорилирование Serl 5 в р53 считается ключевым и одним из первых в ряду событий фосфорилирования под действием генотоксического стресса. Это способствует дальнейшим модификациям и стабилизации р53.

«О # о о <3

-

Для проверки того, происходит ли фосфорилирование р53 по 8ег15 при ингибировании III комплекса дыхательной цепи митохондрий, мы обрабатывали клетки ЮСО и А549 миксотиазолом и анализировали лизаты этих клеток с помощью иммуноблота с антителами к фосфорилированному по 8ег15 белку р53. В то время как обработка клеток известными активаторами р53, индукторами генотоксического стресса 5-фтороурацилом и этопозидом, как и ожидалось, приводила к значительному фосфорилированию р53 по 8ег15, никакого фосфорилирования по этому сайту не было детектировано после инкубации клеток с миксотиазолом (Рис. 11).

А549 РКО

рр53 (Ser15) р53

Рис.11. Детекция фосфорилированного р 53 по Serl5 с помощью иммуноблота в лизатах клеток RK.O и А549, инкубированных с 2 мкМ миксотиазола (МХТ), 10 мкг/мл 5-фтороурацила (5-FU), 50 мкМ этопозида (ЕТР) в течение 18 часов или в лизатах необработанных клеток (С). На приведенном иммуноблоте верхняя панель с антителами к фосфорилированному по Serl5 р53, средняя - с антителами к р53, а нижняя - с антителами к актину.

Таким образом, фосфорилирование р53 по Serl5 не вносит вклад в активацию р53 при ингибировании III комплекса ДЦ митохондрий.

3.2 Рольр14arf

Важным регулятором Мс1т2-зависимой деградации р53 является опухолевый супрессор p!4ARF (ARF). Под действием онкогенов экспрессия ARF усиливается на транскрипционном уровне. Связываясь с Mdm2, ARF ингибирует его убиквитинлигазную активность, что приводит к стабилизации р53 (Рис. 10).

Для установления роли ARF в регуляции опухолевого супрессорар 53 при ингибировании III комплекса ДЦ митохондрий, мы обрабатывали клетки RKO и А549 миксотиазолом и анализировали уровень белка ARF с помощью иммуноблота. В обеих клеточных линиях уровень белка ARF был недетектируем как при отсутствии, так и при добавлении миксотиазола к клеткам (Рис. 13). Однако в клетках HeLa, суперпродуцирующих ARF вследствие экспрессии онкогенов HPV Е6 и Е7, добавление миксотиазола приводило даже к небольшому снижению уровня ARF, а не к его увеличению (Рис. 12).

А549 HeLa RKO

о # ^ о ^ о #

ARF

p14 ► актин

Рис.12. Оценка уровня ARF с помощью иммуноблота в лизатах клеток RK.O, HeLa и А549, инкубированных с 2 мкМ миксотиазола в течение 18 часов (МХТ) или в течение 24 часов (МХТ+), и в лизатах необработанных клеток (С). На приведенном иммуноблоте верхняя панель с антителами к ARF, а нижняя - с антителами к актину.

Таким образом, функция белка ARF, по-видимому, не вносит вклад в индукцию р53 при ингибировании III комплекса ДЦ митохондрий.

Б) Путь убиквитин-независимой деградации р53

3.3 NOQ1 и NOO 2 участвуют в стабилизаиии р53

Помимо убиквитин-зависимой деградации р 53 в 26S протеосомах, опосредуемой Mdm2, в клетке существует также система убиквитин-независимой деградации р 53 в 20S протеосомах, включающая в себя два белка, хинон-оксидоредуктазы NQOl и NQ02 (Рис. 10).

NQ01 и NQ02 - это цитоплазматические белки, катализирующие метаболизм хинонов. Они присутствуют во всех типах тканей; гены NQOl и NQ02 индуцируются наряду с целым набором защитных генов в ответ на такие стрессы, как действие ксенобиотиков, антиоксидантов, оксидантов, тяжелых металлов, УФ света и ионизирующей радиации. Координированная индукция этих генов обеспечивает защиту клеток от повреждений свободными радикалами, окислительного стресса и неоплазии.

Известно, что NQOl и NQ02 напрямую взаимодействуют ср53, защищая его от убиквитин-независимой деградации в 20S протеосомах.

Дикумарол [3,3'-метиленбис(4-гидроксикумарин)] является конкурентным ингибитором NQOl. Дикумарол конкурирует с NAD(P)H за связывание с NQOl и препятствует переносу электронов на FAD. Кроме того, дикумарол разрушает связь NQOl с р53, что приводит к убиквитин-независимой деградации р53.

Резвератрол (транс-3,4',5-тригидроксистильбен) - это полифенол, являющийся ингибитором NQ02 с К^ 35 нМ.

Специфические ингибиторы NQOl и NQ02, дикумарол и резвератрол, соответственно, связываясь в активных центрах этих белков, ингибируют взаимодействие NQO1 и NQ02 с

р53. Чтобы проверить, влияют ли дикумарол и резвератрол на аккумуляцию и активацию р53, вызванные миксотиазолом, клетки линии МСО обрабатывали 2 мкМ миксотиазола в течение 12 часов, причем на последние 4 часа к клеткам также добавлялся 300 мкМ дикумарол, а на последние 10 часов - 50 мкМ резвератрол (Рис. 13, А). Время обработки и концентрации дикумарола и резвератрола были подобраны так, чтобы избежать неспецифической активации р 53, так как известно, что в высоких концентрациях и при длительных инкубациях дикумарол и резвератрол вызывают активацию р 53 из-за ингибирования дыхательной цепи митохондрий, вызывая накопление активных форм кислорода.

Как видно из результатов, представленных на рисунке 13А, как резвератрол, так и дикумарол существенно снижают аккумуляцию р53 в клетках линии ЯКО под действием миксотиазола. Кроме того, обработка клеток линии НеЬа, данными ингибиторами приводит к значительному снижению транскрипционной активности р 53 под действием миксотиазола (Рис. 13, Б). Данные результаты позволяют предполагать, что N001 и N002 участвуют в аккумуляции р53 при ингибировании III комплекса цепи переноса электронов.

МХТ DCM RSV

RKO + +

о

о о

а: л

а Я 4

к s

Н X

* 5

я 5 3

К 41

ее

U

р53

I § 2

с. ш

QJ О

■в- Ч 1 Я" ¿>

S 0

^ МХТ -DCM -RSV -

HeLa

+ + +

Рис. 13. Обработка ингибитором NOQ1 дикумаролом и ингибитором NOQ2 резвератролом снижает аккумуляцию и активацию р 53 при действии миксотиазола. А) Совместная обработка клеток линии RKO 2 мкМ миксотиазола (МХТ) в течение 12 часов с ингибиторами NQOl и NQ02 (инкубация с 300 мкМ дикумарола (DCM) в течение 4 часов, и инкубация с 50 мкМ резвератрола (RSV) в течение 10 часов) приводит к значительному снижению аккумуляции р 53 по сравнению с аккумуляцией под действием миксотиазола. Б) Транскрипционная активность р 53 в клетках линии HeLa, обработанных 2 мкМ миксотиазола (МХТ), 300 мкМ дикумарола (DCM) и 50 мкМ резвератрола (RSV). Дикумарол и резвератрол значительно подавляют активацию р 53 под действием миксотиазола.

Однако, так как дикумарол и резвератрол могут иметь какие-то другие активно^ помимо ингибирования N001 и N002, необходимо было проверить это предположение альтернативными методами.

Для того, чтобы тестировать влияние подавления экспрессии NQ01 и NQ02 на аккумуляцию р 53 при ингибировании III комплекса ДЦ митохондрий, были получены линии клеток RKO со специфичной к NQ01 и NQ02 РНК-интерференцией.

Для получения клеточных линий, экспрессирующих интерферирующие РНК (shRNA) к NQOl и NQ02, клетки-упаковщики НЕК293Т были трансфицированы лентивирусными конструкциями, кодирующими соответствующие shRNA, и упаковочными плазмидами, необходимыми для сборки лентивирусных частиц. Собранными из среды псевдовирусными частицами инфицировали клетки RKO. После короткой селекции на среде с пуромицином качество интерференции анализировали иммуноблотами со специфическими антителами к NQOl и NQ02. Кроме того, анализировали изменение уровня р 53 при обработке этих и контрольных клеток миксотиазолом.

Оказалось, что нокдаун как NQOl (Рис. 14, А), так и NQ02 (Рис. 14, Б) приводит к частичному снижению аккумуляции р 53 под действием миксотиазола по сравнению с аккумуляцией р53 в контрольных клетках.

RKO + +

+ +

— р53

v актин

NQ02

Рис. 14. А. Интерференция РНК NQOl приводит к частичному снижению аккумуляции р53 при ингибировании III комплекса ДЦ. Б. Интерференция РНК NQ02 приводит также к частичному снижению аккумуляции р 53 под действием миксотиазола (МХТ). В обоих случаях, в качестве контроля использовали клетки, инфицированные пустым интерференционным вектором, обработанные миксотиазолом в концентрации 2 мкМ.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что NQOl и NQ02 вносят вклад в стабилизацию р53 при ингибировании III комплекса ДЦ митохондрий.

4. Ингибирование III комплекса ДЦМ приводит к р53-зависимому апоптозу

Далее мы исследовали биологический эффект индукции р53 при ингибировании III комплекса ДЦ митохондрий. Активация опухолевого супрессора р 53 может приводить к остановке клеточного цикла, апоптозу или клеточному старению (сенесенсу). Мы проследили за судьбой клеток НСТ116 дикого типа (НСТ116 wt), обработанных миксотиазолом. Цитометрический анализ клеток, окрашенных пропидий иодидом (PrI) и Аннексином-V спустя 20 часов после добавления миксотиазола, выявил значительную

А RKO Б

siNQOI + + siNQ02 -

МХТ - + + - мхт

NQ01 актин

популяцию аннексин-положительиых клеток (Рис. 15 а, б). В целом, мы наблюдали три популяции клеток: популяцию нормальных клеток (аннексинУ-отрицательные, Рг1-отрицательные), популяцию апоптотических клеток (аннексинУ-положительные, Рг1-отрицательные, которые составляли примерно 25-30% от всех клеток) и третью, небольшую популяцию мертвых клеток (аннексинУ-положительные, РгЬположительные, которые составляли 3-25% от всех клеток) (Рис.15 е, ж).

Некоторые дополнительные данные говорят в пользу апоптотической природы клеточной смерти после обработки клеток миксотиазолом. Во -первых, в этих клетках происходит активация каспаз. В частности, с помощью иммуноблота в клеточных экстрактах был детектирован процессинг прокаспазы-3 и -7 (Рис. 15 л, м). Ингибитор каспаз с широким спектром действия, гУАО-йпк, в значительной степени снизил уровень гибели клеток под действием миксотиазола (в частности, значительно снизил число открепившихся от подложки клеток) и полностью предотвратил процессинг прокаспазы-3 и -7 (Рис. 15 л, м). Процент аннексин-положительиых клеток снижался до уровня контроля, когда клетки обрабатывали миксотиазолом вместе с гУЛО-Апк по сравнению с клетками, инкубированными только с миксотиазолом (Рис. 15 а-в, е-з).

Далее мы проверили р53 -зависимость апоптоза, вызванного миксотиазолом. Сравнивали уровни апоптоза в клетках линий НСТ116 дикого типа (НСТ116 и нокаутных по р53 (НСТ116 р53-/-) после обработки этих клеток миксотиазолом. Интересно отметить, что миксотиазол-индуцированный апоптоз значительно подавлялся в клетках НСТ116 р53-/- (Рис.15 г, д). С другой стороны, процент аннексинУ-положительных, Рг1-положительных (некротических) клеток был практически одинаков среди НСТ116 иЛ и НСТ116 р53-/- клеток, обработанных миксотиазолом (3,34% и 3,24%, соответственно, Рис. 15 ж, к). И наконец, процессинг прокаспазы-7 в клетках НСТ116 обработанных миксотиазолом, был значительно более выраженным, чем в клетках НСТ116 р53-/-, как видно из результатов иммуноблота (Рис.15 м).

Полученые данные свидетельствуют о том, что в ответ на ингибирование III комплекса ДЦ митохондрий происходит индукция р53-зависимого апоптоза.

НСТ116

миксотиазол миксо + хУАП-Гшк контроль

НСТ116р53-/-

миксотиазол

96% ЯЫ2 4%

90% 10%

2"

(}4

2.73%

25.89%

2.93%

3.86%

7.12%

миксотиазол + + гУАО-йпк - - + 34

НСТПбМ р53 -/-

миксотиазол гУАО-Гшк

— каспаза-7 ч» актин

1 2 3 4 5

Рис. 15. Миксотиазол стимулирует р53 -зависимый апоптоз. (а-к) Оценка апоптоза с помощью проточной цитометрии в клетках НСТ116 \у1: и р53-/-, необработанных (контроль) или инкубированных с 2 мкМ миксотиазола или с 2 мкМ миксотиазола + 100 мкМ гУАО-йпк в течение 20 часов. Клетки были окрашены аннексиномУ (ИЫ) и пропидий иодидом (БЬЗ). Указан процент аннексинУ-отрицательных (1Ш1), аннексинУ-положительных (КЫ2) и аннексии У-положительных, Рг!-отрицательных (04) клеток, (л) Анализ процессинга прокаспазы-3 с помощью иммуноблота в клетках НСТ116 обработанных 2 мкМ миксотиазола или/и 100 мкМ гУАО-йпк, как указано на рисунке. Приведен иммуноблот с антителами к каспазе-3. (м) Анализ процессинга прокаспазы-7 с помощью иммуноблота в клетках НСТ116 и р53-/-, обработанных 2 мкМ миксотиазола или/и 100 мкМ гУАО-йпк, как указано на рисунке. На приведенном иммуноблоте верхняя панель с антителами к каспазе-7, а нижняя - с антителами к актину.

Таким образом, в ходе данного и сследования мы блокировали работу каждого из комплексов ДЦ и следили за уровнем и активностью р 53. Нам удалось показать, что ни снижение митохондриального мембранного потенциала, ни нарушение в целом работы дыхательной цепи не приводит к индукции р 53. Однако активация р 53 и запуск р53 -зависимого апоптоза происходят специфически в ответ на ингибирование 111 комплекса ДЦ митохондрий, что вызвано нарушением работы функционально сопряженного с ним фермента пути биосинтеза пиримидинов, дигидрооротат дегидрогеназы (ДГОДГ). Мы показали, что возникающий таким образом недостаток пиримидинов является причиной индукции р 53 в ответ на ингибирование III комплекса ДЦ. В итоге, нам удалось обнаружить ранее неизвестную функциональную связь между митохондриальным

дыханием и опухолевым супрессором р53, а также обнаружить участие N001 и N002 в стабилизации и накоплении р53 в ядрах эпителиальных клеток с нарушенным биосинтезом пиримидинов.

ВЫВОДЫ

1. Ингибирование III комплекса дыхательной цепи митохондрий, но не I, II или IV комплексов, приводит к увеличению уровня и активности опухолевого супрессора р53 в различных линиях эпителиальных раковых клеток человека.

2. Причиной индукции р 53 в ответ на ингибирование III комплекса ДЦ митохондрий является нарушение работы БНООН и пути биосинтеза пиримидинов.

3. В стабилизацию р 53 при ингибировании III комплекса ДЦ вносят вклад хинон оксидоредуктазь^001 и N002.

4. В ответ на ингибирование III комплекса ДЦ митохондрий происходит индукция р53-зависимого апоптоза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Khutornenko A.A., Roudko V.V., Chernyak B.V., Vartapetian А.В., Chumakov P.M., Evstafieva A.G. Pyrimidine biosynthesis links mitochondrial respiration to the p53 pathway. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2010. V. 107(29). P. 12828-33.

2. Khutornenko A.A., Dalina A.A. and Evstafieva A.G. Pyrimidine nucleotide biosynthesis impairment after mitochondrial cytochrome be 1-complex inhibition leads to p53 activation and p53-dependent apoptosis. // FEBS Journal. 2011. V. 278 (Suppl 1). P. 348.

3. Хуторненко A.A. Ингибирование bcl комплекса дыхательной цепи митохондрий приводит к активации опухолевого супрессора р53. // XV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008». Сборник тезисов. СЕКЦИЯ "Биоинженерия и биоинформатика". Подсекция "Биоинженерия". 8-11 апреля 2008. С. 56.

4. Рудько В.В ., Хуторненко А.А. Исследования механизма активации опухолевого супрессора р 53 при ингибировании III комплекса дыхательной цепи митохондрий. // XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009». СЕКЦИЯ "Биоинженерия и биоинформатика". Подсекция "Биоинженерия". 14-17 апреля 2009. С. 25.

5. Хуторненко А.А., Рудько В.В., Далина А.А., Евстафьева А.Г. Падение уровня пиримидинов - причина активации онкосупрессора р 53 при ингибировании III комплекса дыхательной цепи митохондрий. // 14 международная пущинская школа-конференция молодых уч еных "Биология -наука XXI века". Сборник тезисов. Секция "Молекулярная биология". 19-23 апреля 2010 . С. 196.

6. Хуторненко А.А. И зучение влияния ингибиторов дыхательной цепи митохондрий и цитоплазматических хиноноксидоредуктаз на биосинтез пиримидинов и опухолевый супрессор р53. // IV Международная школа по молекулярной генетике "Геномика и биология клетки". Сборник тезисов. 29 ноября-3 декабря 2010. С. 209-210.

Заказ № 27-П/09/2012 Подписано в печать 10.09.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л.1

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хуторненко, Анастасия Александровна

I. ВВЕДЕНИЕ

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Структура онкосупрессора р

Механизмы деградации и стабилизации р53 в клетке

Причины индукции р

Последствия индукции р

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Индукция р53 в ответ на ингибирование III комплекса ДЦМ

Последствия ингибирования III комплекса ДЦМ

Причина индукции р53 в ответ на ингибирование III комплекса ДЦМ

Механизм стабилизации р53 при ингибировании III комплекса ДЦМ

V. ВЫВОДЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Хуторненко, Анастасия Александровна

V. Выводы

1. Ингибирование III комплекса дыхательной цепи митохондрий, но не I, II или IV комплексов, приводит к увеличению уровня и активности опухолевого супрессора р53 в различных линиях эпителиальных раковых клеток человека.

2. Причиной индукции р53 в ответ на ингибирование III комплекса ДЦ митохондрий является нарушение работы ЭНСЮН и пути биосинтеза пиримидинов.

3. В стабилизацию р53 при ингибировании III комплекса ДЦ вносят вклад хинон оксидоредуктазы N0)01 и N(^02.

4. В ответ на ингибирование III комплекса ДЦ митохондрий происходит индукция р53-зависимого апоптоза.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хуторненко, Анастасия Александровна, Москва

1. Sonveaux P, et al. (2008) Targeting lactate-fueled respiration selectively kills hypoxic tumor cells in mice. J Clin Invest 118:3930-3942.

2. Jones RG, Thompson CB (2009) Tumor suppressors and cell metabolism: A recipe for cancer growth. Genes Dev 23:537-548.

3. Olovnikov IA, Kravchenko JE, Chumakov PM (2009) Homeostatic functions of the p53 tumor suppressor: Regulation of energy metabolism and antioxidant defense. Semin Cancer Biol 19:3241.

4. Gottlieb E, Vousden KH (2010) p53 regulation of metabolic pathways. Cold Spring Harb Perspect Biol 2(4):a001040.

5. Tsvetkov P, Reuven N, Shaul Y (2010) Ubiquitin-independent p53 proteasomal degradation. Cell Death Differ. 17:103-108.

6. Gong X, Kole L, Iskander K, Jaiswal AK (2007) NRH:quinone oxidoreductase 2 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 protect tumor suppressor p53 against 20S proteasomal degradation leading to stabilization and activation of p53. Cancer Res. 67:5380-5388.

7. Römer L., Klein C., Dehner A., Kessler H., Buchner J. (2006) p53 a natural cancer killer: structural insights and therapeutic concepts. Angew Chem Int Ed Engl. 45(39):6440-60.

8. Scoumanne A., Harms K.L., Chen X. (2005) Structural Basis for Gene Activation by p53 Family Members. Cancer Biol Ther. 4(11): 1178-85.

9. Harms K.L., Chen X. (2006) The functional domains in p53 family proteins exhibit both common and distinct properties. Cell Death Differ. 13(6):890-7.

10. Laptenko O., Prives C. (2006) Transcriptional regulation by p53: one protein, many possibilities. Cell Death Differ. 13(6):951-61.

11. Asher G, Shaul Y. (2005) p53 proteasomal degradation: poly-ubiquitination is not the whole story. Cell Cycle. 4(8): 1015-8.

12. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. (2002) The Molecular Biology of the Cell. Garland Science, pp. 889-892, 379-382.

13. Asher G, Shaul Y. (2006) Ubiquitin-independent degradation: lessons from the p53 model. Isr Med Assoc J. 8(4):229-32.

14. Asher G, Lotem J, Sachs L, Kahana C, Shaul Y. (2002) Mdm-2 and ubiquitin-independent p53 proteasomal degradation regulated by NQOl. PNAS. 99(20):13125-30.

15. Asher G, Tsvetkov P, Kahana C, Shaul Y. (2005) A mechanism of ubiquitin-independent proteasomal degradation of the tumor suppressors p53 and p73. Genes Dev. 19(3):316-21.

16. Leung KK, Litchfield DW, Shilton BH. (2012) Flavin adenine dinucleotide content of quinone reductase 2: analysis and optimization for structure-function studies. Anal Biochem. 420(l):84-9.

17. Karine Reybier, Pierre Perio, Gilles Ferry, Jalloul Bouajila, Philippe Delagrange, Jean A. Boutin, Francoise Nepveu. (2011) Insights into the redox cycle of human quinone reductase 2. Free Radical Research, 45(10): 1184-1195.

18. Long DJ 2nd, Jaiswal AK. (2000) NRH:quinone oxidoreductase2 (NQ02). Chem Biol Interact. 129(l-2):99-l 12.

19. Wang W, Le WD, Pan T, Stringer JL, Jaiswal AK. (2008) Association of NRH:quinone oxidoreductase 2 gene promoter polymorphism with higher gene expression and increased susceptibility to Parkinson's disease. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63(2): 127-34.

20. Hashimoto T, Nakai M. (2011) Increased hippocampal quinone reductase 2 in Alzheimer's disease. Neurosci Lett. 8;502(1):10-2.

21. Shen J, Barrios RJ, Jaiswal AK. (2010) Inactivation of the quinone oxidoreductases NQOl and NQ02 strongly elevates the incidence and multiplicity of chemically induced skin tumors. Cancer Res. 1;70(3):1006-14.

22. Iskander K, Barrios RJ, Jaiswal AK. (2009) NRH:quinone oxidoreductase 2-deficient mice are highly susceptible to radiation-induced B-cell lymphomas. Clin Cancer Res. 1; 15(5): 1534-42.

23. Hsieh TC, Wang Z, Hamby CV, Wu JM. (2005) Inhibition of melanoma cell proliferation by resveratrol is correlated with upregulation of quinone reductase 2 and p53. Biochem Biophys Res Commun. 19;334(l):223-30.

24. Horn H.F., Vousden K.H. (2007) Coping with stress: multiple ways to activate p53. Oncogene. 26(9): 1306-16.

25. Vousden K.H. (2006) Outcomes of p53 activation-spoilt for choice. J Cell Sci. 119(Pt 24):5015-20.

26. Xu Y. (2003) Regulation of p53 responses by post-translational modifications. Cell Death Differ. 10(4):400-3.

27. Toledo F., Wahl G.M. (2006) Regulating the p53 pathway: in vitro hypotheses, in vivo Veritas. Nat Rev Cancer. 6(12):909-23.

28. Efeyan A., Serrano M. (2007) p53: guardian of the genome and policeman of the oncogenes. Cell Cycle. 6(9): 1006-10.

29. Clark P.A., Llanos S., Peters G. (2002) Multiple interacting domains contribute to pl4ARF mediated inhibition of MDM2. Oncogene. 21(29):4498-507.

30. Sherr C.J., Bertwistle D., DEN Besten W., Kuo M.L., Sugimoto M., Tago K., Williams R.T., Zindy F., Roussel M.F. (2005) p53-Dependent and -independent functions of the Arf tumor suppressor. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 70:129-37.

31. Zhang Y, Lu H. (2009) Signaling to p53: Ribosomal Proteins Find Their Way. Cancer Cell. 16(5):369-77.

32. Nicholls DG, Ferguson SJ. Bioenergetics 3. (2002) Elsevier Science Ltd., 2 ed., pp. 90-92.

33. Lenaz G, Genova ML. (2009) Mobility and function of coenzyme Q (ubiquinone) in the mitochondrial respiratory chain. Biochim Biophys Acta. 1787(6):563-73.

34. Karawajew L, Rhein P, Czerwony G, Ludwig WD. (2005) Stress-induced activation of the p53 tumor suppressor in leukemia cells and normal lymphocytes requires mitochondrial activity and reactive oxygen species. Blood. 105(12):4767-75.

35. Wang J, Biju MP, Wang MH, Haase VH, Dong Z. (2006) Cytoprotective effects of hypoxia against cisplatin-induced tubular cell apoptosis: involvement of mitochondrial inhibition and p53 suppression. J Am Soc Nephrol. 17(7): 1875-85.

36. Behrend L., Möhr A., Dick T., Zwacka R.M. (2005) Manganese superoxide dismutase induces p53-dependent senescence in colorectal cancer cells. Mol Cell Biol 25:7758-7769.

37. Achanta G, Sasaki R, Feng L, Carew JS, Lu W, Pelicano H, Keating MJ, Huang P. (2005) Novel role of p53 in maintaining mitochondrial genetic stability through interaction with DNA Pol gamma. EMBO J. 24(19):3482-92.

38. Compton S, Kim C, Griner NB, Potluri P, Scheffler IE, Sen S, Jerry DJ, Schneider S, Yadava N. (2011) Mitochondrial dysfunction impairs tumor suppressor p53 expression/function. J Biol Chem. 286(23):20297-312.

39. González-Aragón D, Ariza J, Villalba JM. (2007) Dicoumarol impairs mitochondrial electron transport and pyrimidine biosynthesis in human myeloid leukemia HL-60 cells. Biochem Pharmacol. 73(3):427-39.

40. Gattermann N, Dadak M, Hofhaus G, Wulfert M, Berneburg M, Loeffler ML, Simmonds HA. (2004) Severe Impairment of Nucleotide Synthesis Through Inhibition of Mitochondrial Respiration. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 23(8-9): 1275-9.

41. Huang M, Graves LM. (2003) De novo synthesis of pyrimidine nucleotides; emerging interfaces with signal transduction pathways. Cell Mol Life Sei. 60(2):321-36.

42. Cui Z, Houweling M, Chen MH, Record M, Chap H, Vance DE, Tercé F. (1996) A genetic defect in phosphatidylcholine biosynthesis triggers apoptosis in Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem. 1996 271 (25): 14668-71.

43. Gibellini F, Smith TK. (2010) The Kennedy pathway-De novo synthesis of phosphatidylethanolamine and phosphatidylcholine. IUBMB Life. 62(6):414-28.

44. Jamil H, Yao ZM, Vance DE. (1990) Feedback regulation of CTPphosphocholine cytidylyltransferase translocation. J Biol Chem. 265(8):4332-9.

45. Zhang XH, Zhao C, Seleznev K, Song K, Manfredi JJ, Ma ZA. (2006) Disruption of Gi-phase phospholipid turnover by inhibition of Ca2+-independent phospholipase A2 induces a p53-dependent cell-cycle arrest in Gi phase. J Cell Sci. 119(Pt 6):1005-15.

46. Choy PC, Paddon HB, Vance DE. (1980) An increase in cytoplasmic CTP accelerates the reaction catalyzed by CTPphosphocholine cytidylyltransferase in poliovirus-infected HeLa cells. J Biol Chem. 255(3): 1070-3.

47. Gehrig K, Morton CC, Ridgway ND. (2009) Nuclear export of the rate-limiting enzyme in phosphatidylcholine biosynthesis is mediated by its membrane binding domain. J Lipid Res. 50(5):966-76.

48. Lagace TA, Ridgway ND. (2005) Induction of apoptosis by lipophilic activators of CTP:phosphocholine cytidylyltransferase alpha (CCTalpha). Biochem J. 392(Pt 3):449-56.

49. Pruschy M, Resch H, Shi YQ, Aalame N, Glanzmann C, Bodis S. (1999) Ceramide triggers p53-dependent apoptosis in genetically defined fibrosarcoma tumour cells. Br J Cancer. 80(5-6):693-8.

50. Yao ZM, Jamil H, Vance DE. (1990) Choline deficiency causes translocation of CTPphosphocholine cytidylyltransferase from cytosol to endoplasmic reticulum in rat liver. J Biol Chem. 265(8):4326-31.

51. Zeisel SH, Albright CD, Shin OH, Mar MH, Salganik RI, da Costa KA. (1997) Choline deficiency selects for resistance to p53-independent apoptosis. Carcinogenesis. 18(4):731-8.

52. Murph MM, Hurst-Kennedy J, Newton V, Brindley DN, Radhakrishna H. (2007) Lysophosphatidic Acid Decreases the Nuclear Localization and Cellular Abundance of the p53 Tumor Suppressor in A549 Lung Carcinoma Cells. Mol Cancer Res. 5(11): 1201-11.

53. Lyo D, Xu L, Foster DA. (2010) Phospholipase D stabilizes HDM2 through an mTORC2SGKl pathway. Biochem Biophys Res Commun. 396(2):562-5.

54. Attardi L.D., DePinho R.A. (2004) Conquering the complexity of p53. Nature Genetics 36: 78.

55. Menendez D., Inga A., Jordan J.J., Resnick M.A. (2007) Changing the p53 master regulatory network: ELEMENTary, my dear Mr Watson. Oncogene. 26(15):2191-201.

56. Clarke PR, Allan LA. (2009) Cell-cycle control in the face of damage a matter of life or death. Trends Cell Biol. 19(3):89-98.

57. Blagosklonny MV. (2001) Cell Cycle Checkpoints and Cancer. Landes Bioscience, pp.52-72.

58. Ko LJ, Prives C. (1996) p53: puzzle and paradigm. Genes Dev. 10(9): 1054-72.

59. De Falco M, De Luca A. (2010) Cell Cycle as a Target of Antineoplastic Drugs. Curr Pharm 16(12): 1417-26.

60. Agarwal M.K., Hastak K., Jackson M.W., Breit S.N., Stark G.R., Agarwal M.L. (2006) Macrophage inhibitory cytokine 1 mediates a p53-dependent protective arrest in S phase in response to starvation for DNA precursors. PNAS. 103(44): 16278-83.

61. Huang M., Wang Y., Collins M., Mitchell B.S., Graves L.M. (2002) A77 1726 induces differentiation of human myeloid leukemia K562 cells by depletion of intracellular CTP pools. Mol Pharmacol. 62(3):463-72.

62. Jackowski S. (1994) Coordination of Membrane Phospholipid Synthesis with the Cell Cycle. J Biol Chem. 269(5):3858-67.

63. Lagace T.A., Miller J.R., Ridgway N.D. (2002) Caspase processing and nuclear export of CTP:phosphocholine cytidylyltransferase alpha during farnesol-induced apoptosis. Mol Cell Biol. 22(13):4851 -62.

64. Leist M, Jaattela M. (2001) Four deaths and a funeral: from caspases to alternative mechanisms. Nat Rev Mol Cell Biol. 2(8):589-98.

65. Igney FH, Krammer PH. (2002) Death and anti-death: tumour resistance to apoptosis. Nat Rev Cancer. 2(4):277-88.

66. Zhou F, Yang Y, Xing D. (2011) Bcl-2 and Bcl-xL play important roles in the crosstalk between autophagy and apoptosis. FEBS J. 278(3):403-13.

67. Schmitz I, Kirchhoff S, Krammer PH. (2000) Regulation of death receptor-mediated apoptosis pathways. Int J Biochem Cell Biol. 32: 1123-36.

68. Pradelli LA, Beneteau M, Ricci JE. (2010) Mitochondrial control of caspase-dependent and -independent cell death. Cell Mol Life Sei. 67: 1589-97.

69. Acehan D., Jiang X., Morgan D.G., Heuser J.E., Wang X., Akey C.W. (2002) Three-dimensional structure of the apoptosome: implications for assembly, procaspase-9 binding, and activation. Mol. Cell. 9: 423-432.

70. Yoshida К, Miki Y. (2010). The cell death machinery governed by the p53 tumor suppressor in response to DNA damage. Cancer Sci. 101: 831-835.

71. Li YZ, Lu DY, Tan WQ, Wang JX, Li PF. (2008) p53 initiates apoptosis by transcriptionally targeting the antiapoptotic protein ARC. Мої Cell Biol. 28: 564-74.

72. Чумаков П.М. (2007) Белок p53 и его универсальные функции в многоклеточном организме. Успехи биологической химии, 47: 3-52.

73. Jose J. Fuster, Silvia M. Sanz-Gonzales, Ute M. Moll and Vicente Andres (2007) Classic and novel roles of p53: prospects for anticancer therapy. Trends Мої Med. 13:192-197.

74. Shieh SY, Ikeda M, Taya Y, Prives C. (1997) DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell 91: 325-334.

75. Marchenko ND, Wolff S, Erster S, Becker K, Moll UM. (2007) Monoubiquitylation promotes mitochondrial p53 translocation. EMBO J. 26: 923-34.

76. Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem., 72, 248-254.

77. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227(5259):680-5.

78. Захарова Н.И., Соколов В.В., Рудько В.В., Мельников С.В., Вартапетян А.Б., Евстафьева А.Г. (2008) Влияние протимозина а м его мутантов на активность опухолевого супрессора р53. Молекулярная Биология, 42(4):673-684.

79. Hunte С., Palsdottir Н., Trumpower B.L. (2003) Protonmotive pathways and mechanisms in the cytochrome bcl complex. FEBS Lett., 545(l):39-46.

80. Sherr C.J., Roberts J.M. (1999) CDK inhibitors: positive and negative regulators of G1-phase progression. Genes Dev., 13(12):1501-12.

81. Nithipongvanitch R, Ittarat W, Cole MP, Tangpong J, Clair DK, Oberley TD. (2007) Mitochondrial and nuclear p53 localization in cardiomyocytes: redox modulation by doxorubicin (Adriamycin)? Antioxid Redox Signal. 9(7): 1001-8.

82. Wang F, Fu X, Chen X, Chen X, Zhao Y. (2010) Mitochondrial uncoupling inhibits p53 mitochondrial translocation in TPA-challenged skin epidermal JB6 cells. PLoS One. 5(10):el 3459.

83. Galluzzi L, Morselli E, Kepp O, Vitale I, Pinti M, Kroemer G. (2011) Mitochondrial liaisons of p53. Antioxid Redox Signal. 15(6):1691-714.

84. Boehme SA, Lenardo MJ. (1993) Propriocidal apoptosis of mature T lymphocytes occurs at S phase of the cell cycle. Eur J Immunol. 23(7): 1552-60.

85. Darzynkiewicz Z, Bruno S, Del Bino G, Gorczyca W, Hotz MA, Lassota P, Traganos F. (1992) Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry. 13(8):795-808.

86. Lo S., Tolner B., Taanman J.W., Cooper J.M., Gu M., Hartley J.A., Schapira A.H., Hochhauser D. (2005) Assessment of the significance of mitochondrial DNA damage by chemotherapeutic agents. Int J Oncol., 27(2):337-44.

87. Park W.H., Han Y.W., Kim S.H., Kim S.Z. (2007) An ROS generator, antimycin A, inhibits the growth of HeLa cells via apoptosis. J Cell Biochem., 102(1):98-109.

88. Moghaddas S., Hoppel C.L., Lesnefsky E.J. (2003) Aging defect at the QO site of complex III augments oxyradical production in rat heart interfibrillar mitochondria. Arch Biochem Biophys., 414(l):59-66.

89. Young T.A., Cunningham C.C., Bailey S.M. (2002) Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol. Arch Biochem Biophys., 405(l):65-72.

90. Pletjushkina O.Y., Lyamzaev K.G., Popova E.N., Nepryakhina O.K., Ivanova O.Y., Domnina L.V., Chernyak B.V., Skulachev V.P. (2006) Effect of oxidative stress on dynamics of mitochondrial reticulum. Biochim Biophys Acta., 1757(5-6):518-24.

91. Muller F.L., Roberts A.G., Bowman M.K., Kramer D.M. (2003) Architecture of the Qo site of the cytochrome bcl complex probed by superoxide production. Biochemistry., 42(21):6493-9.

92. Fox RI, Herrmann ML, Frangou CG, Wahl GM, Morris RE, Strand V, Kirschbaum BJ. (1999) Mechanism of action for leflunomide in rheumatoid arthritis. Clin Immunol 93:198-208.

93. Jang JH, Lee CS, Hwang D, Ryu SH. (2012) Understanding of the roles of phospholipase D and phosphatidic acid through their binding partners. Prog Lipid Res. 51 (2):71 -81.

94. Lee S.J., Yun C.C. (2010) Colorectal cancer cells Proliferation, survival and invasion by lysophosphatidic acid. Int J Biochem Cell Biol. 42(12): 1907-10.

95. Foster D.A. (2009) Phosphatidic acid signaling to mTOR: signals for the survival of human cancer cells. Biochim Biophys Acta. 1791(9):949-55.

96. Lee CH, Inoki K, Karbowniczek M, Petroulakis E, Sonenberg N, Henske EP, Guan KL. (2007) Constitutive mTOR activation in TSC mutants sensitizes cells to energy starvation and genomic damage via p53. EMBO J. 26(23):4812-23.

97. Favale NO, Fernández-Tome MC, Pescio LG, Sterin-Speziale NB. (2010) The rate-limiting enzyme in phosphatidylcholine synthesis is associated with nuclear speckles under stress conditions. Biochim Biophys Acta. 1801 ( 11 ): 1184-94.1. Благодарности

98. Выражаю искреннюю благодарность своему научному руководителю Александре Георгиевне Евстафьевой за организацию работы, грамотное руководство и всестороннюю поддержку.

99. Хочется выразить глубокую благодарность моим коллегам, которые принимали участие в данной работе: Рудько В., Далиной А., Александровой А.

100. Отдельная благодарность И.М.Теренину, Андрееву Д.Е. и Дмитриеву С.Е. за теоретическую поддержку и стимуляцию научной деятельности.

101. Также хочу выразить свою благодарность Б.В. Черняку за теоретическу и практическую поддержку в проведении работы.

102. И эта работа не была бы возможна без неоценимого содействия П.М.Чумакова.