Взаимодействие поверхностных рецепторов клетки с различными иммобилизованными и свободными лигандами определяет структуру актинового цитоскелета

Арэ, Александра Феликсовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Взаимодействие поверхностных рецепторов клетки с различными иммобилизованными и свободными лигандами определяет структуру актинового цитоскелета
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие поверхностных рецепторов клетки с различными иммобилизованными и свободными лигандами определяет структуру актинового цитоскелета"

На правах рукописи

АРЭ

Александра Феликсовна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПОВЕРХНОСТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ КЛЕТКИ С РАЗЛИЧНЫМИ ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ И СВОБОДНЫМИ ЛИГАНДАМИ ОПРЕДЕЛЯЕТ СТРУКТУРУ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА

03.00.25. - Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Сашсг-Петербург 2000

РГ5 0 а

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, С.-Петербург.

Научный руководитель: академик H.H. Никольский

Институт цитологии РАН, С.-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор В.И. Воробьев Институт цитологии РАН, С.-Петербург

доктор биологических наук А.Д. Харазова Санкт-Петербургский Государственный Университет, С.-Петербург

Ведущее учреждение: Онкологический научный

ттритп ---- г

им. H.H. Блохина РАМН, Москва

Защита состоится иса-^шл, 2000 года

в "/3 ч. на заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института цитологии РАН

Реферат разослан "

2000 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета д.б.н. ^ '/Л-Н- Писарева

Еот,о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Одной из центральных проблем клеточной биологии является изучение механизмов передачи сигнала с поверхности клетки в ядро. Источники таких сигналов - ростовые факторы, гормоны и элементы внеклеточного матрикса (ВКМ) - взаимодействуют с поверхностными рецепторами (на основании чего их объединяют под общим названием "лиганды") и регулируют клеточные процессы, включая пролиферацию, дифференцировку, подвижность, эндо- и экзоцитоз и другие. Образование лиганд/рецепторных комплексов активирует каскады сигнальных молекул и вызывает реорганизацию цитоскелета. Взаимоотношение между этими двумя процессами до настоящего момента остается неясным. В то же время, имеется ряд данных, указывающих на существование связи между реорганизацией цитоскелета и проведением сигнала. В частности, показано, что разрушение цитоскелета прекращает или нарушает клеточный ответ (Puck, Krystosek, 1992). Ряд активированных сигнальных молекул непосредственно связывается с ци-тоскелетом (Yamada, Geiger, 1997). Белки цитоскелета и сигнальные молекулы имеют общие домены, предназначенные для белок-белковых взаимодействий (Mayer, Baltimore, 1993). Эти взаимодействия могут изменять кон-формацию белков цитоскелета и приводить к его пространственной реорганизации. Можно предполагать, что реорганизация является специфической реакцией цитоскелета на сигналы, поступающие в клетку от разных лиганд/ рецепторных комплексов. К настоящему времени в литературе накоплено много данных, свидетельствующих о том, что действие разных лигандов на клетку вызывает перестройку актиновош цитоскелета. Однако, все эти данные были получены на разных клеточных линиях и в разных условиях, что не позволяет выявить какие-либо закономерности в реакции актинового цитоскелета. В частности, до настоящего времени остается неясным, сопровождается ли образование конкретного лиганд/рецепторного комплекса специфическим изменением структуры актинового цитоскелета.

цесс адгезии клетки на субстрате, но в условиях, когда клетка прикрепляется и распластывается только на определенном иммобилизованном лиганде. Этот подход дает возможность изучать реакцию системы микрофиламен-тов на активацию конкретных поверхностных рецепторов клетки, в том числе рецепторов, в норме не участвующих в адгезии. Одним из таких рецепторов является рецептор эпидермалыюго фактора роста (ЭФР), для которого показано взаимодействие с системой микрофиламентов in vivo и фибриллярным актином in vitro (Khrebtukova et al, 1991; den Hartigh et al., 1992).

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлось изучение зависимости организации ак-тинового цитоскелета от действия на клетку различных иммобилизованных и свободных лигандов и выяснения, в какой степени распределение в клетке некоторых сигнальных молекул может быть связано с преобразованием актиновых структур.

Для достижения указанной цели было необходимо решить ряд конкретных задач:

1. Разработать методические подходы для адекватной оценки влияния лигандов на цитоскелет клетки;

2. Изучить характер организации актинового цитоскелета при распластывании одних и те же клеток на различных иммобилизованных лигандах;

3. Установить, в какой степени различия в организации актинового цитоскелета под действием иммобилизованных лигандов воспроизводятся на клетках разного происхождения, а также на клетках, трансформированных введением онкогенов ElA+cHa-ras;

4. Изучить действие свободных лигандов, активирующих малые ГТФа-зы Rho, Rae и Cdc42, на организацию цитоскелета, сформированного при распластывании на разных иммобилизованных лигандах;

5. Установить, в какой мере перестройки актиновых структур сопровождаются перераспределением некоторых подмембранных актин-связы-вающих белков;

6. Выяснить возможность взаимодействия с актиновыми структурами транскрипционных факторов на примере широко распространенного в различных клеточных линиях фактора NF-kB.

Основные положения, выносимые на защиту

1 .При распластывании клетки на субстрате характер организации формирующегося актинового цитоскелета определяется типом иммобилизованного лиганда, взаимодействующего с поверхностными рецепторами.

2.Реорганизация актинового цитоскелета при действии на клетку свободных лигандов состоит в переходе его из одного структурного состояния в другое через стадию разборки ранее сформированных структур.

3.Субъединица p65/RelA транскрипционного фактора NF-kB взаимодействует с филаментным актином и ее распределение в цитоплазме зависит от характера организации актиновых структур.

Научная новизна. Установлено, что образование различных лиганд/ рецепторных комплексов сопровождается специфической перестройкой актинового цитоскелета. Свободные лиганды, активирующие малые ГТФа-

зы Rho, Rae и Cdc42, при взаимодействии с клетками, распластанными на различных иммобилизованных лигандах, вызывают реорганизацию акти-нового цитоскелета, которая, независимо от типа свободного лиганда, начинается с разборки существующих актиновых структур и заканчивается восстановлением системы микрофиламентов. Характер организации восстановленного актинового цитоскелета является результатом совместного действия иммобилизованного и свободного лиганда. Впервые показано, что субъединица p65/RelA транскрипционного фактора NF-кВ взаимодействует с фибриллярным актином и солокализуется с актин-содержащими структурами в цитоплазме нормальных фибробластов.

Теоретическое и практическое значение работы. Разработана экспериментальная клеточная модель, позволяющая изучать реорганизацию актинового цитоскелета под действием отдельных внешних лигандов и проводить биохимические эксперименты, не нарушая его структурной целостности. В результате систематических исследований, проведенных с использованием этой модели, достоверно установлено, что характер пространственной организации системы микрофиламентов определяется типом образующихся лиганд/рецепторных комплексов. Разработанные методические подходы открывают широкие перспективы для дальнейшего изучения молекулярных механизмов взаимодействия отдельных актиновых структур со сложными белковыми сигнальными комплексами в процессе передачи сигнала с поверхности клетки в ядро. Наряду с теоретическим значением полученные данные могут быть использованы для практических целей направленного воздействия на клеточные функции путем формирования заданной структуры цитоскелета.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ. Материалы диссертации были доложены на 40 и 41 международных Конгрессах Европейского общества тканевых культур (Ренн, Франция, 1993 и Верона, Италия, 1994), на 10 Европейском цитоскелетном форуме (Стокгольм, Швеция, 1994), на Всероссийских симпозиумах "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 1995 и 1998), на 2 съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997) на 2 съезде биофизиков России (Москва, 1999), на межинститутском семинаре "Цитоскелет" (Санкт-Петербург, 1998).

Диссертационная работа апробирована на совместном научном семинаре Отдела клеточных культур и Лаборатории физиологии клеточного цикла Института цитологии РАН 17 ноября 1999 г.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на ^страницах машинописного текста и состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", выводов и списка цитируемой литературы, содержащего %ЪЬпубликаций, иллюстрирована 32 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клетки и клеточные культуры. В работе использованы:

1) клетки эпидермоидной карциномы человека линии А-431, полученные из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН);

2) нормальные эмбриональные фибробласты крысы (ЭФК) и клеточ-

ные линии, полученные из них путем иммортализации ранним районом El А аденовируса 5 типа человека и трансформации El А в комплементации с онкогеном cHa-ras ( Поспелова и др., 1990 ), любезно предоставленные Т.В. Поспеловой (Институт цитологии РАН);

3) целомоциты полихеты Arenicola marina.

Клетки культивировали на среде Дальбекко (DMEM, Sigma) с добавлением 10% сыворотки крови эмбрионов коров (Gibco). Для экспериментов по адгезии клетки наращивали до плотности не более 70 %.

Целомоциты получали из целомической жидкости, которую забирали шприцом, заполненным наполовину буфером, предотвращающим агрегацию клеток, перемешивали и раскапывали на покровные стекла.

Материалы. Моноклональные антитела к рецептору ЭФР Ma 5А9 были любезно предоставлены Е.В. Буровой (Институт цитологии РАН), ламинин 2/4 (полученный из плаценты человека) - И.В. Воронкиной (Институт цитологии РАН), коллаген Ш типа - JI. А. Садофьевым (Институт цитологии РАН), поликлональные антитела к p65/RelA субъединице транскрипционного фактора NF-kB (1226) и полипептид, против которого антитела были получены, - д-ром Н. Райе (Frederick Cancer Research Center, США). В качестве первых антител использовали моноклональные антитела против винкули-на, талина, спектрина, тубулина и ß-актина и поликлональные против а-актинина, а в качестве вторых антител - меченные козьи антитела, полученные против иммуноглобулинов мыши (GAM-FITC) и кролика (GAR-FITC) соответственно (Sigma, USA). Тетрародамин-фаллоидин (Molecular Probes, USA). Цитохалазикы В и D (Sigma, USA) использовали для подавления полимеризации актина. Использовали фибронектин из плазмы крови человека, конканавалин A (Con А), активаторы малых ГТФаз (ЭФР, лизофосфати-диловую кислоту (LPA) и брадикинин (ВК)) фирмы Sigma, (USA).

Подготовка субстратов. Покровные стекла, обработанные Repell-Silane (Pharmacia Biotech., Sweden) для придания поверхности гидрофобных свойств, 96-луночные иммуноплаты (гидрофобная поверхность, Costar, Life Technologies AB, Sweden) покрывали различными лигандами (фибро-нектином, коллагеном III, ламинином 2/4, антителами 5А9, Con А в концентрации 20 мкг/мл) в течение 1 ч при 37°С, а затем обрабатывали 2% бычьим сывороточным альбумином (БСА) 1 ч при 37°С для предотвращения неспецифического взаимодействия клеток с субстратом.

Изучение адгезии клеток на различных субстратах. Суспендированные клетки после инкубации в полной среде отмывали три раза средой без сыворотки и раскапывали в покрытые лигандами иммуноплаты (1-3x105 клеток/мл). После инкубации в течение 1 ч при 37°С в атмосфере 5% С02 среду осторожно отсасывали и промывали пластины PBS-буфером (137 мМ NaCl, 7 мМ Na2HP04 pH 7.4,1.5 мМ КН2РО 2.7 мМ KCl). Прикрепившиеся клетки фиксировали 70%-ным этанолом (10 мин при комнатной температуре), окрашивали кристаллическим фиолетовым (20 мин при комнатной температуре), промывали дистиллированной водой и пермеабилизовали 0,2%-ным Triton Х-100 в PBS (30 мин). Поглощение при 620 нм измеряли наМуль-тискане (LKB).

Изучение влияния различных иммобилизованных лигандов на структуру актинового цитоскелета. Клетки после инкубации в полной среде отмывали три раза средой без сыворотки и наносили по 100 мкл суспензии (1 х 105 кл/мл) в среде без сыворотки на покрытые лигандами покровные стекла. Стекла выдерживали 1 ч при 37°С в атмосфере 5% С02. Неприкре-пившиеся клетки смывали PBS.

Для изучения влияния свободных лигандов на структуру актинового цитоскелета активаторы малых ГТФаз, ЭФР и ВК, добавляли в среду к распластанным в течение 1ч клеткам до конечной концентрации 100 нг/мл, а LPA - 20 нг/мл.

Иммунофлуоресценция. Стекла с распластанными клетками фиксировали 3%-ным парафармальдегидом 10 мин при комнатной температуре, пер-меабилизовали 0,1%-ным раствором тритона Х-100 15 мин при комнатной температуре и окрашивали родамин-фаллоидином 10 мин при 37°С для выявления актиновых структур. Актин-связывающие белки, тубулин и р65 выявляли методом непрямой иммунофлуоресценции. Клетки инкубировали с первыми, а затем вторыми антителами по 1 ч при 37°С. Для выявления ß-актина использовали смешанную фиксацию (3%-ным парафармальдегидом 5 мин при комнатной температуре, затем метанолом 1 мин при -20° С). Препараты анализировали на флюоресцентном микроскопе Zeiss и конфокальном микроскопе Leica и фотографировали на пленку Tmax-400 (Kodak).

Определение взаимодействия транскрипционного фактора NF-kB с фибриллярным актином проводили методом аффинной хроматографии (Miller, Alberts, 1989). Актин, стабилизированный фаллоидином, смешивали с носителем (Affi-Gel-10 (BioRad) и Sepharose CL-6B (Pharmacia) в экви-молярном количестве). В контрольных колонках вместо актина носитель был связан с БСА (Sigma). Клетки снимали с подложки скребком в лизиру-ющем Е-буфере (5 мМ HEPES-KOH pH 7.5,0.05% Nonidet-P40,0.5 мМ EDTA, 0.5 мМ EGTA, 1 мМ DTT, 1мМ PMSF) при 4°С. Суспензию лизированных клеток гомогенизировали в ручном гомогенизаторе 10 мин на льду и центрифугировали при 12000 об/мин при 4°С для удаления ядер и осколков мембран. Супернатант фильтровали, используя фильтр с диаметром пор 0.22 мкм (Millipore). Полученный цитозоль наносили на колонку и промывали А-буфером (Е-буфер с 50 мМ HEPES-KOH pH 7.5) до исчезновения белка в элюате. Элюцию проводили в две ступени: А-буфером, содержащим 1 мМ АТФ и 10% глицерина, а затем А-буфером с 0.5 М KCl. Белковый состав элюатов исследовали методом электрофореза по Лэммли в 12.5% ПААГ. Для идентификации p65/RelA использовали иммуноблотинг с поликлональ-ными антителами к р65 (1226).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Различия в морфологии и организации актинового цитоскелета в клетках А-431, распластанных на разных иммобилизованных лигандах.

С целью изучения влияния различных лигандов на адгезию и распластывание клеток, а также для выяснения возможности использования в качестве одного из лигандов антител к рецептору ЭФР, клетки А-431 наносили на

субстраты, покрытые фибронектином. ламинином 2/4, коллагеном ill, Con А или антителами к рецептору ЭФР. На субстратах, покрытых белками ВКМ, а также на субстратах, покрытых Con Л или антителами к рецептору ЭФР, клетки хорошо прикрепляются и быстро (20-30 мин) распластываются. В то же время клетки плохо прикрепляются к субстрату, покрытому БСА, или к непокрытому лигандами пластику и совсем не распластываются в течение 1 часа инкубации. Обработка клеток иитохалазином В приводит к потере способности распластываться на субстрате, покрытом антителами к рецептору ЭФР, что указывает на зависимость этого процесса от нормального функционирования системы микрофиламенгов.

в 5 10 15

лиганд (мкг/мл)

Рис 1. Адгезия клеток Л-43 1 нп различных иммобилизованных лиганд ах в отсутствии дива-лентных катионов Суспензию клеток (100 мкл. /SxKf клеток/мл) и PBS без Civ" и Мц2' наносили в п шты. покрытие различными лигандами. Через ! ч прикрепленные клеп<и фиксировали и окрашивали, как описано в "Материалы и методы ", измеряли поглощение при 620 им. Символы: USA - заполненные кружки, антитела к рецептор) ЭФ1' - открытые квадраты, коллаген - открытые треугольники, фибронектин - ромбы.

Клетки А-431, посеянные в бессывороточной среде или в PBS, прикрепляются к субстрату, покрытому антителами к рецептору ЭФР или коллагеном, с одинаковой эффективностью. Известно, что присутствие дивалент-ных катионов является необходимым условием для связывания лигандон интегрииами (Tozcr et aL 1996). Поэтому тот факт, что удаление из среды дивалентных катионов приводит к существенному снижению прикрепления клеток к коллагену и фибронекгину, но не влияет на их прикрепление к антителам к рецептору ЭФР (рис. 1), является свидетельством специфичности взаимодействия клеток с антителами к рецептору.

Различия в организации актинового цитоскелета в клетках А-431. распластанных на разных иммобилизованных лигандах, представлены на рисунке 2 (см. стр. 10). Ма стекле или пластике клетки этой линии растут небольшими группами, плотно прилегая друг к другу. Актиновын цитоскелет представлен в них тремя основными типами структур: пучками актиновых филаментов. ориентированными в разных направлениях, циркулярными пучками вдоль края клетки и

актин-содержащими агрегатами, разбросанными в центральной части клетки (рис.2, А).

На субстрате, покрытом фибронектином, клетки А-431 растут в виде отдельных клеток и приобретают характерную полигональную форму. Превалирующими актиновыми структурами являются стресс фибриллы с фокальными контактами, часто ориентированные параллельно друг другу (рис.2, С). Клетки А-431, распластанные на антителах к рецептору ЭФР, приобретают уникальную морфологию. Большинство клеток покрыто многочисленными микроворсинками, образованными радиальными пучками актиновых филаментов. Эти пучки могут сливаться между собой, образуя одну или несколько крупных ламелл. В некоторых клетках просматриваются широкие циркулярные пучки и мелкие агрегаты в центральной части клетки. Стресс фибриллы или подобные им структуры отсутствуют (рис.2, В). Те же клетки, распластанные на субстрате, покрытом ламинином 2/4, имеют вытянутую форму с широкой ламеллой на ведущем крае. Высокая степень поляризации и значительное количество пересекающих друг друга клеток свидетельствуют о том, что клетки активно перемещаются по субстрату. Актиновый цитоскелет представлен сложноорганизованной сетью микрофиламентов в ламелле (рис.2, D). Кроме того, во многих клетках выявляется центральный тяж актиновых филаментов, проходящий через все тело клетки.

Для того чтобы выяснить, на какой стадии возникают различия в организации актинового цитоскелета, исследовали кинетику процесса распластывания клеток на разных иммобилизованньгх лигандах. Клетки фиксировали через 5, 10, 15 и 20 минут от момента посадки на субстрат. Эксперименты показали, что различия в организации системы микрофиламентов выявляются уже на ранних (15-20 мин) стадиях распластывания клеток.

Таким образом, взаимодействие одних и тех же клеток с различными иммобилизованными лигандами приводит к формированию разных типов пространственной организации актинового цитоскелета, специфичных для каждого из изученных лигандов.

Влияние иммобилизованных лигандов на организацию актинового цитоскелета в клетках различного происхождения. Для того, чтобы выяснить, являются ли обнаруженные различия в организации актинового цитоскелета в клетках А-431, распластанных на разных субстратах, особенностью данного типа клеток или же они являются следствием специфичного действия каждого лиганда на систему микрофиламентов, аналогичные эксперимента были проведены на клетках другого происхождения, а именно: на нормальных, £7у4-иммортализованных и El А +с//а-гш,-трансформи-рованных фибробластах крысы и целомоцитах полихеты Arenicola marina.

Нормальные фибробласты хорошо распластываются на стекле и обладают развитой системой актиновых микрофиламентов, представленной главным образом классическими стресс фибриллами, сконцентрированными в нескольких параллельных субстрату плоскостях. Иммортализованные фибробласты по форме напоминают нормальные, однако степень распластан-

Рис.2. Организация структуры актинового цитоскелета в клетках А-431, распластанных на разных иммобилизованных лигандах. Клетки распластывали на покровных стеклах в присутствии 10 % сыворотки в течение 24 ч (А) или в отсутствии сыворотки на субстратах, покрытых антителами к рецептору ЭФР (В), фибронектином (С) или ламинином 2/4 (О) в течение 1 ч. Окраска родамин-фаллоидином. Масштабная линейка, 10 шМ.

ности их понижена. Число стресс фибрилл в этих клетках также снижено и нарушена правильность их ориентации по сравнению с нормальными фиб-робластами. На поверхности клеток появляются многочисленные микроворсинки. ЕЫ+сНа-гаэ-трансформированные фибробласты мало адгезивны. Клетки плохо прикрепляются к стеклу, почти не распластываются у. имеют многочисленные выросты неправильной формы. Актиновый цитос-келет дезорганизован: при общем интенсивном окрашивании фибриллярного актина в цитоплазме невозможно выделить какие-либо упорядоченные структуры.

Независимо от степени трансформации распластывание фибробластоЕ на субстратах, покрытых фибронектином или ламинином, приводит к фор мированию системы микрофиламентов различной организации, причем е( особенности и форма клетки для каждого из двух субстратов совпадают < таковыми в клетках А-431, распластанных на тех же иммобилизованные лигандах. Так, в фибробластах на фибронектине формируются мощньи фокальные контакты и стресс фибриллы, клетки приобретают полигональ

IVю форму. Фибробласты на ламиннне активно перемещаются по субстра-гу, вытягиваются, формируя ламеллу на ведущем крае, заполненную сетью жтиновых филаментов (рис.3). В связи с недостаточным количеством ре-(ептора ЭФР на поверхности клеток фибробласты не способны распласты-шться на иммобилизованных антителах к рецептору ЭФР.

ис.З. Организация структуры актинового цитоскелета в нормальных (Л), £7Л-иммортали-гтаннмх (В) и Е/Л+сНа-гая-траисформированных (С) фибробластах крысы, раснластан-ых на субстрате, покрытом ламинином 2/4 в течение 1 часа. Окраска родамин-фаллоиди-ом. Об. ЮОх, ок. 10.x.

В качестве следующего объекта были выбраны целомоциты полихеты ircnicola marina. Целомоциты морских беспозвоночных выполняют мно-сественные защитные функции, что обеспечивается их высокой динамич-остыо и способностью к быстрым перестройкам актинового цитоскелета Исаева, Коренбаум, 1989). Целомоциты быстро (в течение 10-15 минут) аспластываются на стекле, образуя многочисленные ламеллоподии. След-гвисм этого является чрезвычайная гетерогенность формы распластанных леток. Эксперименты показали, что целомоциты Arenicola marina способы распластываться на всех исследованных лигандах - иммобилизованных ибронектине, ламинине 2/4 и антителах к рецептору ЭФР - и демонстри-уют особенности морфологии и структуры актинового цитоскелета, спе-ифичные для каждого иммобилизованного лиганда, и сходные с выявлен-ыми в клетках А-431 и фибробластах разной степени трансформации.

На основании сравнения разных типов клеток можно заключить, что зракгерные особенности организации системы микрофиламентов, обна-уженные в клетках, распластанных на разных иммобилизованных лиган-ах, не зависят от клеточного типа и являются следствием специфичности энкретного лиганд-рецепторного взаимодействия.

Распределение некоторых актин-связывающих белков в клетках А-31, распластанных на разных иммобилизованных лигандах. Снецифич-эсть перестроек актинового цитоскелета в ответ на действие различных «мобилизованных лигандов может обеспечиваться вовлечением разных

актин-связывающих белков. Fi связи с этим был проведен сравнительный анализ распределения винкулина, талина, спектрина и а-актинина, принимающих участие в осуществлении связи микрофиламентов с поверхностными рецепторами, в клетках А-431, распластанных на фибронектине. ла-минине 2/4, Сон А или антителах к рецептору ЭФР.

Из четырех изученных белков только а-актинин имеет сходное распределение независимо от типа иммобилизованного л и ганда. Распределение остальных актин-связывающих белков меняется в зависимости от характера организации системы микрофиламентов. Винкулин и талин - постоянные участники фокальной адгезии - в клетках, распластанных на ламинине или Con А (в которых фокальные контакты не образуются), выявляются в виде тонких штрихов на концах пучков микрофиламентов. В клетках на антителах к рецептору ЭФР винкулин и талин не выявляются. По-видимому, в данном случае в клетках формируется принципиально иной тип контакта с субстратом, в котором эги актин-связывающие белки не участвуют.

Интересным является тот факт, что спектрин, который ранее был обнаружен в местах образования связи системы микрофиламентов с мембраной (Bennet and Gilligan, 1993), в клетках А-431 преимущественно локализу ется вдоль пучков микрофиламентов, а в клетках, распластанных на антителах, не выявляется. В то же время а-актинин. обычно присутствующий в стресс фибриллах и фокальных контактах (Matsudaira. 1994), в клетках А-431. распластанных на всех изученных субстратах, локализуется в многочисленных петчах под мембраной, распределенных по всей дорзальной поверхности клетки, а также в микроворсинках.

Клетки А-431. распластанные на субстрате, покрытом Con А. по морфологии и структуре актинового цитоскелета сходны с клетками, распластанными на иммобилизованных антителах к рецептору ЭФР. Однако, принципиальным отличием является присутствие в клетках на Con А параллельно ориентированных пучков микрофиламентов. напоминающих стресс фибриллы. Кроме того, распределение винкулина, талина и спектрина в этих клетках различно.

Таким образом, характер распределения акгин-связывающих белков в клетках А-431, распластанных на разных субстратах, зависит от типа иммобилизованного лиганда. Однако, очевидно, что избирательное участие четырех изученных актин-связывающих белков в формировании актиновых структур является не единственным фактором, обеспечивающим специфичность реорганизации системы микрофиламентов под действием иммобилизованных лигандов.

Влияние свободных лигандов - активаторов мал ых ГТФаз - на структуру актинового цитоскелета. Различия, выявленные в клетках А-431, распластанных на антителах к рецептору ЭФР. фибронектине или ламинине 2/4 могут возникать в результате активации различных сигнальных путей. Серия работ, начататая в 1992 году Холлом и Ридли и продолженная исследователями других ведущих научных центров, демонстрирует, что члены Rho семейства малых ГТФаз Rho, Rae и C'dc42 контролируют орга-

низанию актпновых структур в клетке, вызывая преимущественное формирование стресс фибрилл, сети микрофиламентоп в ламелле и микрофила-ментов филоподий. соответственно. Можно было предполагать, что разные иммобилизованные внеклеточные лиганды определяют различное состоя-чие организации актиновых структур в клетках А-431, специфически акти-зируя разные ГТФазы. Для того чтобы выяснить правильность этого пред-голоження. на клетки А-431, распластанные на обычном стекле или на иммобилизованных фибронектине, ламинине 2/4 или антителах к рецептору )ФР в течение 1 часа, действовали активаторами малых ГТФаз - ЭФР, LPA I ВК. Клетки фиксировали через 1. 5, !0. 30, 60 и 120 мин инкубации в присутствии свободного лиганда. Ранее установлено, что ЭФР вызывает эбразование мембранных раффлов и ламеллы. LPA - стресс фибрилл и фокальных контактов, а ВК - микроворсинок и филоподий (Machcsky and Mall, 1996).

Эксперименты показали, что ЭФР в первые минуты после добавления тействптельно вызывает образование ламеллы и раффлов по краю клеток. 5 го же время, в обработанных LPA и ВК клетках не наблюдается образована ранее описанных структур. Через 10 мин вместо преимущественного образования стресс фибрилл в случае LPA или микроворсинок в случае ВК кюлюдается полная дезорганизация актиновых структур. Микроворсинки 1ли структуры, похожие на микроворсинки, появляются в клетках в опреде-юнный промежуток времени под действием ВК так же. как и LPA. Однако, I отличие от микроворсинок, описанных ранее как результат активации Ч1с42 брадикинином. образование данных актнн-содержащих выростов не опровождается образованием комплексов адгезии. Для выяснения проис-юждения этих структур был проведен анализ распределения ß-актина. 06-шружено. что в выростах, образующихся в клетках под действием LPA и Ж. наблюдается резкое повышение уровня ß-актина, в то время как до па-(есепия этих агентов в распластанных клетках скопление ß-актина имеет iecTo только в небольших участках активного края ламеллы. Ранее было юказано, что ß-актин присутствует в тех районах клетки, где происходит ¡ыстрая реорганизация актиновых структур: под мембраной у края веду-цей ламеллы, в мембранных раффлах и быстро растущих филоподиях Gimona et al.. 1994). Результаты настоящего исследования продемонстрировали активное участие ß-актина в процессе распластывания клеток <-431 на иммобилизованных Соп А и ламинине, а также значительное сни-<енне его присутствия в малоподвижных клетках на Con А после заверше-[ия процесса распластывания и постоянное присутствие в активном крае амедлы в высокоподвижных клетках на ламинине. что согласуются с литературными данными. Таким образом, присутствие ß-актина в выростах, образующихся под действием активаторов малых ГТФаз. свидетельствует о ом. что эти структуры представляют собой активно растущие филоподии.

Детальный анализ изменении структуры актинового цитоскелета, вы-ываемых действием ЭФР, LPA и ВК, показывает, что реорганизация систе-1Ы микрофиламентов во всех случаях проходит через три последователь-ые стадии. Независимо от типа свободного агента и лиганда, иммобилизо-

ванного на субстрате, реорганизация начинается с образования мини раф-флов у края ламеллоподии. На следующей стадии появляются многочисленные микроворсинки, идет разборка всех типов актиновых пучков и замещение их на актин-содержащие агрегаты. В итоге после полной дезорганизации система микрофиламентов восстанавливается до состояния, близкого к исходному, причем характер организации ее определяется главным образом типом иммобилизованного лиганда. На рисунке 4 в качестве примера представлены последовательные этапы реорганизации актинового цитоскелета под действием свободных лигандов в клетках, распластанных на фибронектине. Таким образом, переход от одного состояния системы микрофиламентов к другому под действием активирующих агентов осуществляется через разборку актиновых структур, исходно сформированных в процессе распластывания клетки. Переходная фаза между двумя упорядоченными состояниями занимает около 30 мин.

Главное отличие экспериментов, представленных в настоящей работе, от экспериментов других авторов состоит в том, что клетки не выдерживались в бессывороточной среде перед активацией ГТФаз. Предварительные эксперименты показали, что инкубация клеток А-431 в бессывороточной среде в течение 48 ч и более длительного времени не приводит к существенной разборке актиновых структур, как это было показано для фибробластов Swiss ЗТЗ (Paterson et al., 1990). Мы не наблюдали полной разборки цитоскелета также и в эмбриональных фибробластах крысы. Можно предположить, что первые стадии реорганизации системы микрофиламентов под действием свободных лигандов "пропускаются" клеткой, актиновые структуры которой уже находятся в разобранном состоянии. В таком случае, следовало ожидать, что появление специфических актиновых структур в клетках А-431 после начальной разборки цитоскелета будет отставлено во времени. Однако, эксперименты показали, что через 30 мин действия свободного лиганда вместо формирования типичных структур происходит восстановление исходного состояния системы микрофиламентов. Это ситуация наблюдается в клетках, распластанных на стекле, фибронектине или лами-нине, под действием всех изученных агентов и в клетках, распластанных на иммобилизованных антителах и обработанных LPA и BÍC. Наблюдение за клетками в течение последующих 30 и 90 мин не выявило существенных изменений в структуре актинового цитоскелета. Таким образом, даже по истечении большего промежутка времени активация Rho, Rae и Cdc42 в клетках А-431 не приводила к преимущественному образованию описанных в литературе типичных структур. Вместе с тем, в некоторых случаях действие активатора несомненно сказывалось на характере организации восстановленной системы микрофиламентов. Очевидно, что конечный характер организации актинового цитоскелета представляет собой результат совместного действия двух разных лиганд/рецепторных комплексов. Этот вывод согласуется с данными о необходимости совместного участия белков ВКМ и rho/rac ГТФаз в процессе образования интегриновых адгезионных комплексов (Hotchin and Hall, 1995). Наиболее ярко эффект совместного действия двух разных лиганд/рецепторных комплексов проявляется в клетках,

Рис.4. Реорганизация актинового цитоскелета в клетках А-431, распластанных на субстрате, покрытом фибронектином, под действием ЭФР, ЬРА или ВК. Клетки распластывали в среде без сыворотки в течение 1 ч. Затем в среду добавляли ЭФР (А, Э, в), ЬРА (В, Е, Н) или ВК (С, Р, I). Клетки фиксировали через 5 (А, В, С), 10 (Б, Е, Р), 30 (в, Н, I) мин. Окраска рода-мин-фаллоидином. Масштабная линейка, 10 шМ.

распластанных на антителах и обработанных ЬРА: клетки восстанавливают исходную структуру актинового цитоскелета, но вместо циркулярных пучков у основания ламеллы в них появляются параллельно ориентированные пучки микрофиламентов, напоминающие стресс фибриллы.

Совершенно другая ситуация наблюдается в клетках, в которых два разных лиганда взаимодействуют с одним и тем же рецептором. Клетки А-431, распластанные на иммобилизованных антителах к рецептору ЭФР, округляются и остаются в таком состоянии в течение 2 часов в присутствии ЭФР.

Полученные результаты позволяют заключить, что исходное состояние системы микрофиламентов, приобретенное в процессе распластывания клетки на иммобилизованном лиганде, оказывает определяющее влияние на

процесс реорганизации актиновых структур под действием свободных ли гандов. Этим может объясняться отсутствие специфических эффектов ак тивации разных ГТФаз. Наши результаты согласуются с недавними данны ми о том, что первичный контакт интегринов с фибронектином в ходе рас пластывания клетки активирует Rae и Cdc42 в отсутствии экзогенных рос товых факторов (Price et al., 1998). Поэтому, представляется возможным что и в нашем случае образование комплексов поверхностных рецепторов > различными иммобилизованными лигандами в процессе распластывани: клетки приводит к селективной активации Rho, Rae или Cdc42 с последую щим формированием соответствующих типов актиновых структур.

Таким образом, действие на клетки иммобилизованных и свободны: лигандов сопровождается специфическими изменениями пространственно! организации системы микрофиламентов, что является еще одним аргумен том в пользу участия последней в процессе передачи сигнала. Остается не ясным, однако, существует ли связь между преобразованиями актиновоп цитоскелета и его взаимоотношениями с сигнальными молекулами. В связ! с этим было предпринято исследование зависимости распределения транс крипционного фактора NF-кВ от состояния актинового цитоскелета на мо дели нормальных и трансформированных фибробластов крысы. Основани ем для выбора именно этого фактора послужил тот факт, что в нормальны) нестимулированных клетках NF-кВ находится в цитоплазме в комплексе < ингибиторным белком 1кВ и транспонируется в ядро после активации, ; также то, что в ElA+cHa-ras-трансформированных фибробластах с дезор ганизованным актиновым цитоскелетом NF-кВ конститутивно активировав и находится в ядре (Дариева с соавт., 1999). Имеются также косвенные дан ные о связи NF-кВ со структурами цитоскелета (Rosette, Karin, 1995).

Зависимость распределения транскрипционного фактора NF-кВ on состояния актинового цитоскелета в цитоплазме нормальных и трансформированных фибробластов крысы. Для выявления транскрипционно го фактора NF-кВ в цитоплазме эмбриональных фибробластов крысы клетки окрашивали поликлональными антителами к его p65/RelA субъединице Установлено, что характер распределения р65 в цитоплазме ЭФК зависит от степени распластанности клетки. Прежде всего, р65 локализуется в местах фокальных контактов, хорошо различимых на фоне легкого диффузного свечения в цитоплазме (рис.5, Ь). В наиболее распластанных клетках, где толстые стресс фибриллы отстоят друг то друга (рис.5, d), выявляется распределение р65 вдоль этих структур (рис.5,е). Распределение рб5 в цитоплазме ЭФК полностью совпадает с распределением винкулина, одного и: основных компонентов фокальных контактов (рис.5, f, g). Имеются данные, указывающие на взаимодействие NF-кВ с микротрубочками (Crepieux el al., 1997). Наши эксперименты показали, что характер распределения р65 б цитоплазме ЭФК ничем не напоминает систему микротрубочек в тех же клетках, выявленную при помощи моноклональных антител к тубулину (рис.5, с).

По данным иммунофлуоресценции в El A -трансформирован-

1с 5 Оргатплция цитоскелета и распределение р65/Ке1Л в интоплаше нормальных фиб->оласюв крыси. Клетки культивировали в среде ОМ1Л1 с 10% сыворотки. Окраска на ак-|н родамин-фалдоидином (а. <-!): знтшслами к р65 (Ь. е, g): к губулипу (с): к випкутипу (О-асшгаГшая линейка. Ютт

ых фибробластах основная часть р65 локализована в ядре и лишь незначи-:льное его количество диффузно распределено в цитоплазме. При распла-гывании на субстрате, покрытом фибронектином, трансформанты восста-звливают морфологию и структуру актинового цитоскелета. характерные 1я нормальных фибробластов. что приводит к перераспределению р65 в ,1топлазме и солокализации его с вновь сформированными фокальными знтактами и стресс фибриллами.

При культивировании на субстрате, покрытом ламинином 2/4, /.Л-с//</-гал-трансформированные фибробласты формируют структуру актового цитоскелета, характерную для клеток, распластанных на этом им-

мобилизованном лиганде, с широкой ламеллой на ведущем крае, заполнен ной сетью микрофиламентов. При этом р65 в ламелле имеет диффузное рас пределение, несовпадающее с распределением винкулина. Однако, в неко торых клетках р65 аккумулируется под мембраной у края ламеллы. Следуе' отметить, что в случае, когда плотность культуры позволяет клеткам обра зовывать межклеточные контакты, р65 так же, как и винкулин, выявляется i местах контактов.

Для того чтобы выяснить, способен ли р65 взаимодействовать с акти новыми структурами, была проведена афинная хроматография клеточны; экстрактов на актиновой колонке. Исходные экстракты и элюаты связав шихся белков анализировали методом электрофореза в полиакриламиднод геле с последующим иммуноблотгингом с поликлональными антителами i р65. Результаты Вестерн-блоттинга показали, что р65 из клеточных экст рактов нормальных и трансформированных фибробластов, а также транс формантов, распластанных на фибронектине, присутствует среди белков связавшихся с иммобилизованным F-актином (рис.6, А, В, С). Аналогич ные результаты о солокализации р65 с актиновыми структурами, а такж! его способности связываться с фибриллярным актином, были получены н; клетках А-431 (рис. 6, D).

ABC D i....... ir....................н...................................i i ........i

12 12 12 12

Рис.6. Взаимодействие р65/К.е1А с иммобилизованным фибриллярным актином. Клеточны экстракты нормальных фибробластов (А), £/Л+с//а-/тщ-трансформированных фиброблас тов (В), £/Л+с//я-г<х5-трансформированных фибробластов, распластанных на фибронекти не (С) и клеток А-431 (Ь) были проанализированы метолом афинной хроматографии на кс лонке с иммобилизованным фибриллярным актином с последующим электрофорезом и им муноблоттингом с антителами к р65, как описано в "Материалы и методы". 1 - клеточны экстракты; 2 - элюаты с актиновой колонки.

Связавшийся с актином р65 в Вестерн-блоттинге выявляется в вид дублета. Ранее было показано, что р65 является фосфобелком. В некоторы. клеточных линиях он постоянно фосфорилирован (У е1 а1., 1994). Такиг образом, верхняя полоса в иммуноблоттинге может представлять фосфори лированную форму р65. В нормальных фибробластах и в клетках А-431 рб. представлен преимущественно верхней полосой. Амплификация нижне: полосы в трансформированных фибробластах может являться результатог дефосфорилирования р65, вызываемого ЯаБ-трансформацией.

Специфичность взаимодействия р65 с актин-содержащими структура ми подтверждается тем, что преинкубация антител с синтетическим пепти дом, против которого антитела были получены, полностью подавляет окра шивание в местах фокальных контактов и вдоль стресс фибрилл, а такж приводит к исчезновению соответствующих полос на иммуноблоттах. Раз

орка актиновых филаментов под действием цитохалазина D как в нормаль-ых фибробластах, так и в трансформированных с восстановленным под ействием фибронектина актиновым цитоскелетом, сопровождается пере-аспределением р65 в агрегаты актина, что также указывает на взаимодей-твие р65 с актин-содержащими структурами. В то же время, характер рас-ределения р65 в цитоплазме трансформантов, распластанных на разных игандах, принципиально различен. Таким образом, тип иммобилизован-ого лиганда определяет не только специфику организации системы мик-офиламентов в клетке, но и распределение связанных с ним сигнальных юлекул.

Подводя итог проведенным исследованиям, следует отметить, что поученные результаты свидетельствуют в пользу высказанной гипотезы о том, то специфическая реорганизация системы микрофиламентов в ответ на азличные лиганд/рецепторные взаимодействия может являться способом частая актинового цитоскелета в процессе проведения сигнала.

Выводы

1. Установлено, что пространственная организация актинового цитос-елета, формирующегося в процессе распластывания клеток А-431 на им-юбилизованных фибронектине, ламинине или антителах к эпидермально-[у фактору роста, специфична для каждого иммобилизованного лиганда.

2. Характерные особенности пространственной организации актино-ого цитоскелета, формирующейся под влиянием различных имобилизован-ых лигандов, в клетках линии А-431, в нормальных, иммобилизованных и расформированных фибробластах крысы, а также в целомоцитах поли-еты Arenicola marina определяются типом лиганда, а не происхождением леток.

3. Свободные лиганды, активирующие малые ГТФазы Rho, Rae и Cdc42, ри взаимодействии с клетками, распластанными на различных иммобили-ованных лигандах, вызывают реорганизацию актинового цитоскелета, ко-орая, независимо от типа свободного лиганда, начинается с разборки су-хествующих актиновых структур и заканчивается восстановлением систе-[ы микрофиламентов. Характер организации восстановленного актиново-d цитоскелета является результатом совместного действия иммобилизован-ого и свободного лиганда.

4. Впервые показано, что субъединица p65/RelA транскрипционного »актора NF-кВ взаимодействует с фибриллярным актином и солокализует-я с актин-содержащими структурами в цитоплазме нормальных фибробла-тов. Восстановление структуры актинового цитоскелета в трансформиро-анных фибробластах под действием иммобилизованных лигандов сопро-ождается восстановлением распределения p65/RelA в цитоплазме, харак-ерного для нормальных клеток.

5. Характер распределения NF-кВ в цитоплазме трансформированных шбробластов, распластанных на субстратах, покрытых разными лиганда-ш, зависит от типа иммобилизованного лиганда.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. G. Pinaev, A. Are, Е. Burova, U. Lindberg. Specific attachment anc spreading of A431 cells on substrate via EGF-receptors. Abst. of 40-th Int Congress of the European Tissue Culture Soc., Rennes, France, 1993, W 2.16.

2. G. Pinaev, M.Blinova, N.Odintzova, E. Korenbaum, A. Are, Yu. Yudin N. Sheludko. Cell cultures of marine invertebrates: problems and perspectives Abst. of 40-th Int. Congress of the European Tissue Culture Soc., Rennes, France

1993, W 1.4.1.

3. A. Are, G. Pinaev, U. Lindberg. The EGF effect on actin microfilament; organization in A431 cells attached to substrates coated with various ligands Abst. of 41-th Int. Congress of the European Tissue Culture Soc., Verona, Italy

1994, p.82.

4. A. Arc, G. Pinaev, U. Lindberg. The rapid actin cytoskeleton reorganizatior induced by EGF is different for A431 cells spread on various substrates. Abstr. o: 10th European Cytoskeletal Forum, Stockholm, Sweden, 1995, p. 15.

5. А.Ф. Арэ, Г.П. Пинаев. Особенности пространственной организации актиновош цитоскелета и распределения актин-связывающих белков в клетках А-431, распластанных на разных субстратах. Тезисы Всероссийскогс симпозиума "Биология клетки в культуре". Цитология, 1996, т.38, № 2, с 178.

6. А.Ф. Арэ, И.В. Воронкина, Г.П. Пинаев. Зависимость пространствен ной организации цитоскелета от типа лиганд/рецепторных комплексов, об разующихся при адгезии культивируемых клеток к разным субстратам. Те зисы 11-го съезда биохимического общества РАН, 1997, с. 253-254.

7. А.Ф. Арэ, Т.В.Поспелова, Г.П.Пинаев. Распределение транскрипци онного фактора NF-kB в нормальных и трансформированных фиброблас-тах крысы, распластанных на разных субстратах. Тезисы Всероссийской: симпозиума "Биология клетки в культуре". Цитология, 1999, т.41, №3/4, с.258

8. А.Ф. Арэ, Т.В.Поспелова, ГЛ.Пинаев. Особенности структурной орга низации актинового цитоскелета нормальных, иммортализованных и транс формированных фибробластов крысы и ее изменения под влиянием белко! внеклеточного матрикса. Цитология, 1999, т.41, № 8, с. 707-715.

9. I.V. Voronkina, Yu.V. Gorelik, A.F. Are, N.V. Kalmykova, G.P. Pinaev The peculiarities of attachment and spreading of normal and transformec ephithelial human cells on different extracellular matrix proteins. In NATO Sciena Series, Series A: Life Sciences, ed. G.G.Skouteris, 1999, 311, 171-181.

10. A.F. Are, V.E. Galkin, T.V. Pospelova, G.P. Pinaev. The p65/RelA subuni of NF-kB interacts with actin-containing structures. Exp. Cell Res. 2000, in press

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Дариева З.А., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. Транскрипционый фак тор NF-kB/RelA конститутивно активирован и локализован в ядре клето1 трансформантов ElA+cHa-ras. Цитология. 1999. 41(7): 622-627.

Исаева В.В., Коренбаум Е.С. Защитные функции целомоцитов и имму нитет иглокожих. Биология моря. 1989.6: 3-14.

Поспелова Т.В., Кислякова Т.В., Медведев A.B., Светликова С.Б., По-пелов В.А. Особенности трансформированного фенотипа и экспрессия ндикаторных САТ-плазмид в эмбриональных фибробластах крысы, иммор-ализованных El Аас15-онкогеном и трансформированных El A+cHa-ras-он-эгенами. Цитология. 1990.32(1): 148-155.

Bennett, V. & Gilligan, D.M. (1993). The spectrin-based membrane skeleton nd micron-scale organization of the plasma membrane. Annu Rev Cell Biol. 9, 7-66.

Bershadsky, A.D. & Vasiliev, J.M. (1988). Cytoskeleton. New York: Plenun ress.

Crepieux, P., Kwon, H., Leclerc, N., Spencer, W., Richard, S., & Hiscott, J. 997). I kappa В alpha physically interacts with a cytoskeleton-associated protein irough its signal response domain. Mol Cell Biol, 17, 7375-7385.

den Hartigh, J.C., Van Bergen en Henegouwen, P.M.P., Verkleij, A.J., & oonstra, J. (1992). The EGF receptor is an actin-binding protein. J Cell Biol. 19, 349-355.

Gimona, M., Vandekerckhove, J., Goethals, M., Herzog, M., Lando, Z., & mall, J. V. (1994). Beta-actin specific monoclonal antibody. CellMotil Cytoskel,

I, 108-116.

Haigier, H., Ash, J.F., Singer, S.J., & Cohen, S. (1978). Visualisation by uorescence of the binding and internalization of epidermal growth factor in jman carcinoma cells A-431. Proc Natl Acad Sei USA, 75, 3317-3321.

Hall, A. (1994). Small GTP-binding proteins and the regulation of the actin -toskeleton. Annu Rev Cell Biol, 10,31-54.

Hartwig, J.H. & Kwiatkowski, D.J. (1991). Actin-binding proteins. Curr pin Cell Biol, 3, 87-97.

Hill, M.A., Schedlich, L., & Gunning, P. (1994). Serum-induced signal msduction determines the peripheral location of beta-actin mRNA within the

II. J Cell Biol. 126, 1221-1230.

Hoock, T.C., Newcomb, P.M., & Herman, I.M. (1991). Beta-actin and its RNA are localized at the plasma membrane and the regions of moving cytoplasm iring the cellular response to injury. J Cell Biol. 112, 653-664.

Hotchin, N.A. & Hall, A. (1995). The assembly of integrin adhesion mplexes requires both extracellular matrix and intracellular rho/rac GTPases. :ellBiol, 131. 1857-1865.

Khrebtukova, I.A., Kwiatkowska, K., Gudkova, D.A., Sorokin, A.B., & naev, G.P. (1991). The role of microfilaments in the capping of epidermal growth :tor receptor in A431 cells. Exp Cell Res, 194, 48-55.

Li, C.-C.H., Korner, M., Ferris, D.K., Chen, E., Dai, R.-M., & Longo, D.L.

(1994). NF-kappa B/Rel family members are physically associate* phosphoproteins. Biochem J. 303, 499-506.

Machesky, L.M. & Hall, A. (1996). Rho: a connection between membran receptor signalling and the cytoskeleton. Trends Cell Biol. 6,304-310.

Matsudaira, P. (1994). Actin crosslinking proteins at the leading edge Seminars Cell Biol. 5, 165-174.

Mayer, B.J. & Baltimore, D. (1993). Signalling through SH2 and SH domains. Trends Cell Biol, 3,8-13.

Miller, K.G. & Alberts, B.M. (1989). F-actin affinity chromatograph) Technique for isolating previously unidentified actin-binding proteins. Proc Nal Acad SciUSA. 86,4808-4812.

Paterson, H.F., Self, A.J., Garrett, M.D., Just, I., Actories, K., & Hall, A (1990). Microinjection of recombinant p21rho induces rapid changes in eel morphology. J Cell Biol. 111. 1001-1007.

Price, L.S., Leng, J., Schwartz, M.A., & Bokoch, G.M. (1998). Activation c Rac and Cdc42 by integrins mediates cell spreading. Mol Biol Cell. 9, 1863 1871.

Puck, T.T. & Krystosek, A. (1992). Role of the cytoskeleton in genom regulation and cancer. Int Rev Cyt. 132, 75-108.

Rosette, C. & Karin, M. (1995). Cytoskeletal control of gene expressior depolymerization of microtubules activates NF-kappa B. J Cell Biochem. 12i 1111-1119.

Tozer, E.C., Hughes, P.E. & Lofitus, J.C. (1996). Ligand binding and affinit modulation of integrins. Biochem Cell Biol. 74, 785-798.

Yamada, K.M. & Geiger, B. (1997). Molecular interactions in cell adhesio complexes. Curr Opin Cell Biol. 9, 76-85.

Zohn, I.M., Campbell, S.I., Khosravi-Far, R., Rossman, K.I., & Der, C.. (1998). Rho family proteins and Ras transformation: the RHOad less travele gets congested. Oncogene. 17, 1415-1438.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Арэ, Александра Феликсовна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Организация актинового цитоскелета в культивируемых клетках.

2.1.1. Основные типы актиновых структур.

2.1.2. Роль актин-связывающих белков в формировании актиновых структур.

2.1.3. Формирование актиновых структур in vivo в процессе распластывания клетки на субстрате.

2.2. Реорганизация актинового цитоскелета под действием внешних факторов.

2.3. Малые ГТФазы Rho, Rac и Cdc42 и их роль в регуляции структуры актинового цитоскелета.

2.4. Комплексы адгезии. Связь актиновых структур с сигнальными молекулами.

2.5. Неопластическая трансформация как фактор, вызывающий реорганизацию актинового цитоскелета.

2.6. Транскрипционный фактор NF-кВ. Участие в процессах адгезии.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Клетки и клеточные культуры.

3.2. Материалы.

3.3. Подготовка субстратов.

3.4. Изучение адгезии клеток на различных субстратах.

3.5. Изучение влияния различных иммобилизованных лигандов на структуру актинового цитоскелета.

3.6. Конъюгация моноклональных антител с флуорохромом.

3.7. Иммунофлуоресценция.

3.8. Приготовление цитозоля фибробластов и клеток линии А431.

3.9. Аффинная хроматография на колонках с иммобилизованным F-актином.

3.10. Электрофорез и идентификация белков.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Различия в морфологии и организации актинового цитоскелета в клетках А-431, распластанных на разных лигандах.

4.1.1. Адгезия клеток А-431 на субстратах, покрытых разными лигандами.

4.1.2. Специфичность адгезии клеток А-431 на субстрате, покрытом антителами к рецептору ЭФР.

4.1.3. Различия в морфологии и организации актинового цитоскелета в клетках А-431, распластанных на разных лигандах.

4.2. Различия в морфологии и организации актинового цитоскелета в нормальных, иммортализованных и трансформированных фибробластах, распластанных на разных лигандах.

4.3. Различия в морфологии и организации актинового цитоскелета в целомоцитах полихеты Arenicola marina, распластанных на разных лигандах.

4.4. Распределение F-актина в клетках А-431, находящихся на ранних стадиях распластывания на разных субстратах.

4.5. Распределение актин-связывающих белков в клетках А-431, распластанных на разных иммобилизованных лигандах.

4.5.1. Структура актинового цитоскелета в клетках А-431, распластанных на иммобилизованном конканавалине А.

4.5.2. Распределение винкулина, талина, а-актинина и спектрина в клетках А-431, распластанных на разных субстратах.

4.6. Влияние активаторов малых ГТФаз на структуру актинового цитоскелета.

4.6.1. Влияние культивирования в бессывороточной среде на структуру актинового цитоскелета в клетках А-431 и фибробластах крысы.

4.6.2. Ранний ответ клеток на действие ЭФР, LPA и ВК.

4.6.3. Последовательные стадии реорганизации системы микрофиламентов под действием ЭФР, LPA и ВК в клетках, распластанных на разных субстратах.

4.6.4. Зависимость распределение винкулина от действия LPA и ВК.

4.6.5. Распределение Р-актина в клетках А-431 на разных стадиях распластывания и его перераспределение под действием ЭФР, LP А и ВК.

4.7. Зависимость распределения транскрипционного фактора NF-кВ в цитоплазме нормальных и трансформированных фибробластов крысы от состояния актинового цитоскелета.

4.7.1. Распределение p65/RelA в цитоплазме нормальных фибробластов.

4.7.2. Перераспределение p65/RelA в ElA+cHa-Ras-трансформированных фибробластах при распластывании их на фибронектине.

4.7.3. Разборка актинового цитоскелета под действием цитохалазина D сопровождается перераспределением p65/RelA в цитоплазме.

4.7.4. p65/RelA концентрируется у ведущего края ламеллы в ElA+cHa-Ras-трансформированных фибробластах, распластанных на ламинине 2/4.

4.7.5. Распределение p65/RelA в клетках А-431.

4.7.6. Взаимодействие p65/RelA с фибриллярным актином in vitro.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие поверхностных рецепторов клетки с различными иммобилизованными и свободными лигандами определяет структуру актинового цитоскелета"

Одной из центральных проблем клеточной биологии является изучение механизмов передачи сигнала с поверхности клетки в ядро. Источники таких сигналов - ростовые факторы, гормоны и элементы внеклеточного матрикса (ВКМ) - взаимодействуют с поверхностными рецепторами (на основании чего их объединяют под общим названием «лиганды») и регулируют клеточные процессы, включая пролиферацию, дифференцировку, подвижность, эндо- и экзоцитоз и другие. Образование лиганд/рецепторных комплексов активирует каскады сигнальных молекул и вызывает реорганизацию цитоскелета (Sastry and Horwitz, 1993; Keely et al., 1998). Взаимоотношение между этими двумя процессами до настоящего момента остается неясным. В то же время, имеется ряд данных, указывающих на существование связи между реорганизацией цитоскелета и проведением сигнала. В частности, показано, что разрушение цитоскелета прекращает или нарушает клеточный ответ (Puck, Krystosek, 1992). Ряд активированных сигнальных молекул непосредственно связывается с цитоскелетом (Yamada, Geiger, 1997). Белки цитоскелета и сигнальные молекулы имеют общие домены, предназначенные для белок-белковых взаимодействий (Mayer, Baltimore, 1993). Эти взаимодействия могут изменять конформацию белков цитоскелета и приводить к его пространственной реорганизации. Можно предполагать, что реорганизация является специфической реакцией цитоскелета на сигналы, поступающие в клетку от разных лиганд/рецепторных комплексов. К настоящему времени в литературе накоплено много данных, свидетельствующих о том, что действие разных лигандов на клетку вызывает перестройку актинового цитоскелета. Однако, все эти данные были получены на разных клеточных линиях , и в разных условиях, что не позволяет выявить какие-либо закономерности в реакции актинового цитоскелета. В частности, до настоящего времени остается неясным, сопровождается ли образование конкретного лиганд-рецепторного комплекса специфическим изменением структуры актинового цитоскелета.

Трудности изучения данной проблемы обусловлены высокой естественной динамичностью актинового цитоскелета, присущей ему способностью перестраиваться в ответ на разнообразные воздействия. В частности, неопластическая трансформация приводит к значительным изменениям в состоянии актиновых филаментов (Bershadsky, Vasiliev, 1988). В последние годы важную роль в регуляции структуры актинового цитоскелета отводят членам Rho-семейства малых ГТФаз (Hall, 1994; Machesky and Hall, 1996), которые сами являются онкогенами или критическими участниками Ras-зависимых сигнальных путей, ведущих к трансформации (Zohn, 1998). Кроме того, поскольку на клетки как в составе ткани, так и в условиях культуры, одновременно действует множество разнообразных лигандов, трудно вычленить результат действия только одного из них. В связи с этим возникает необходимость использования упрощенной и, в то же время, приближенной к естественным условиям животного организма модели, позволяющей вести наблюдение за результатом конкретного лиганд/рецепторного взаимодействия. В качестве такой модели может быть предложен естественный процесс адгезии клетки на субстрате, но в условиях, когда клетка прикрепляется и распластывается только на определенном иммобилизованном лиганде. Этот подход дает возможность изучать реакцию системы микрофиламентов на активацию конкретных поверхностных рецепторов клетки, в том числе рецепторов, в норме не участвующих в адгезии. К таковым следует отнести рецепторы инсулина ,тромбина, эпидермального, тромбоцитарного, фибробластного и других факторов роста, для которых показано взаимодействие с системой микрофиламентов (Carlsson et al., 1979, Mellstrom et al., 1983, Bochus and Stiles, 1984, Paves et al, 1990, Vouret-Craviari et al., 1998). С помощью такого подхода представлялось возможным установить степень зависимости организации актинового цитоскелета от действия на клетку различных иммобилизованных и свободных лигандов и выяснить, в какой степени распределение в клетке некоторых сигнальных молекул может быть связано с преобразованием актиновых структур.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Организация актинового цитоскелета в культивируемых клетках

Цитоскелет представляет собой сеть микрофиламентов, микротрубочек и промежуточных филаментов, образованных полимерами трех основных белков: актина, тубулина и одного из нескольких видов белков промежуточных филаментов, соответственно. В настоящей работе рассматриваются только преобразования системы актиновых филаментов.

Состояние цитоскелета клеток, находящихся в составе ткани многоклеточного организма, зависит от сложной комбинации биологически активных молекул, взаимодействующих с поверхностными рецепторами. В культивируемых клетках цитоскелет формируется в процессе распластывания на субстрате и может зависеть от природы субстрата, от состава питательной среды, плотности культуры и факторов сыворотки крови. Таким образом, хотя клетки в культуре представляют собой упрощенную модель их естественного состояния в животном организме, цитоскелет этих клеток также находится под воздействием сложного комплекса факторов и постоянно изменяется. Эту динамичность необходимо иметь в виду при оценке влияния биологически активных молекул на структуру цитоскелета и при сравнительном анализе изменений в его структуре в различных типах клеток.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Арэ, Александра Феликсовна

6. ВЫВОДЫ

1. Установлено, что пространственная организация актинового цитоскелета, формирующегося в процессе распластывания клеток А-431 на иммобилизованных фибронектине, ламинине или антителах к эпидермальному фактору роста, специфична для каждого иммобилизованного лиганда.

2. Характерные особенности пространственной организации актинового цитоскелета, формирующейся под влиянием различных имобилизованных лигандов, в клетках линии А-431, в нормальных, иммсртлизованных и трансформированных фибробластах крысы, а также в целомоцитах полихеты Arenicola marina определяются типом лиганда, а не происхождением клеток.

3. Свободные лиганды, активирующие малые ГТФазы Rho, Rac и Cdc42, при взаимодействии с клетками, распластанными на различных иммобилизованных лигандах, вызывают реорганизацию актинового цитоскелета, которая, независимо от типа свободного лиганда, начинается с разборки существующих актиновых структур и заканчивается восстановлением системы микрофиламентов. Характер организации восстановленного актинового цитоскелета является результатом совместного действия иммобилизованного и свободного лиганда.

4. Впервые показано, что субъединица p65/RelA транскрипционного фактора NF-кВ взаимодействует с фибриллярным актином и солокализуется с актин-содержащими структурами в цитоплазме нормальных фибробластов. Восстановление структуры актинового цитоскелета в трансформированных фибробластах под действием иммобилизованных лигандов сопровождается восстановлением распределения p65/RelA в цитоплазме, характерного для нормальных клеток.

5. Характер распределения NF-кВ в цитоплазме трансформированных фибробластов, распластанных на субстратах, покрытых разными лигандами, зависит от типа иммобилизованного лиганда.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Арэ, Александра Феликсовна, Санкт-Петербург

1. Арэ А.Ф., Пинаев Т.П. (1996). Особенности пространственной организации актинового цитоскелета и распределения актин-связывающих белков в клетках А-431, распластанных на разных субстратах. Цитология. 38(2): 178.

2. Арэ А.Ф., Поспелова Т.В., Пинаев, Т.П. (1999). Распределение транскрипционного фактора NF-кВ в нормальных и трансформированных фибробластах крысы, распластанных на разных субстратах. Цитология. 41(3/4): 258.

3. Галкин В.Э., Туроверова Л.В., Константинова И.М., Пинаев Г.П. (1998). Взаимодействие просом с фибриллярным актином. Цитология. 40(2/3): 618-626.

4. Дариева З.А., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. (1999). Транскрипционый фактор NF-KB/RelA конститутивно активирован и локализован в ядре клеток трансформантов ElA+cHa-ras. Цитология. 41(7): 622-627.

5. Исаева В.В., Коренбаум Е.С. (1989). Защитные функции целомоцитов и иммунитет иглокожих. Биология моря. 6: 3-14.

6. Никольский Н.Н., Соркин А.Д., Сорокин А.Б. (1987). Эпидермальный фактор роста. Наука, Ленинград, 200с.

7. Одинцова Н.А., Нестеров A.M., Корчагина Д.А. (1992). Ростовой фактор из тканей морского моллюска Mytilus edulis. Цитология. 34(2): 94-100.

8. Ровенский Ю.А. (1998). Клеточные и молекулярные механизмы опухолевой инвазии. Биохимия. 63(9): 1204-1221.

9. Сорокин А.Б., Нестеров A.M., Соркин А.Д., Игнатова Т.Н., Галактионов К.И., Кудрявцева Н.В. (1989). Получение и характеристика моноклональных антител к наружному домену рецептора ЭФР эпидермоидной карциномы человека А431. Цитология. 31(5): 549-555.

10. Хребтукова И.А., Никольская А.Н., Соркин А.Д., Сорокин А.Б., Пинаев Т.П. (1989). Кэпинг рецепторов к эпидермальному фактору роста и участие цитоскелета в этом процессе у клеток А431. Цитология. 31(10): 1211-1220.

11. Aepfelbacher, М. (1995). ADP-ribosylation of Rho enchances adhesion of U937 cells to fibronectin via the alpha 5 beta 1 integrin receptor. FEBS Lett. 363: 78-80.

12. Allen, E.W., Jones, G.E., Pollard, J.W, Ridley, A.J. (1997). Rho, Rac and Cdc42 regulate actin organization and cell adhesion in macrophages. J. Cell Sci. 110:707-720.

13. Amano, M., Mukai, H., Ono, Y., Chihara, K., Matsui, T. (1996). Identification of a putative target for Rho as the serine-threonine kinase protein kinase N. Science. 271: 648-650.

14. Are, A., Pinaev, G., Lindberg, U. (1994). The EGF effect on actin microfilaments organization in A431 cells attached to substrates coated with various ligands. Abst. of 41-th Int. Congress of the European Tissue Culture Soc., Verona, Italy, p.82.

15. Are, A., Pinaev, G., Lindberg, U. (1995). The rapid actin cytoskeletonreorganization induced by EGF is different for A431 cells spread onthvarious substrates. Abstr. of 10 European Cytoskeletal Forum, Stockholm, Sweden, p. 15.

16. Are, A.F.,Galkin, V.E., Pospelova, T.V., Pinaev, G.P. (2000). The p65/RelA subunit of NF-кВ interacts with actin-containing structures. Exp. Cell Res. In press.

17. Ash, J.F., Louvard, D., Singer, S.J. (1977). Antibody-induced linkages of plasma membrane proteins to intracellular actomyosin-containing filaments in cultured fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74: 5584-5588.

18. Aspenstrom, P., Lindberg, U., Hall, A. (1996). Two GTPases, Cdc42 and Rac, bind directly to a protein implicated in the immunodeficiency disorder Wiskott-Aldrich syndrome. Curr. Biol. 6: 70-75.

19. Ayalon, O., Geiger, B. (1997). Cyclic changes in the organization of cell adhesions and the associated cytoskeleton, induced by stimulation of tyrosine phosphorilation in bovine aortic endothelial cells. J. Cell Sci. 110: 547-556.

20. Azuma, Т., Witke, W., Stossel, T.P., Hartwig, J.H., Kwiatkowski, DJ. (1998). Gelsolin is downstream effector of rac for fibroblast motility. EMBO J.17: 1362-1370.

21. Baeuerle, P.A., Baltimore, D. (1988). Activation of DNA-binding activity in an apparently cytoplasmic precursor of the NF-kappa В transcription factor. Cell. 53:211-217.

22. Baldwin, A.S. (1996). The NF-kappa В and I kappa В proteins: new discoveries and insights. Annu. Rev. Immunol. 14: 649-683.

23. Bartles, J.R., Wierda, A., Zheng, L. (1996). Identification and characterization of espin, an actin-binding protein localized to the F-actin-rich junctional plaques of Sertoli cell ectoplasmic specializations. J. Cell Sci. 109: 1229-1239.

24. Bashour, A.-M., Fullerton, A.T., Hart, M.J., Bloom, G.S. (1997). IQGAP1, a Rac- and Cdc42-binding protein, directly binds and cross-links microfilaments. J. Cell Biol. 137: 1555-1566.

25. Bayley, S.T., Mymryk, J.S. (1994). Adenovirus E1A protein and transformation. Int. J. Oncol. 5: 425-444.

26. Bearer, E.L. (1991). Direct observation of actin filament severing by gelsolin and binding by gCap39 and CapZ. J. Cell Biol. 115: 1629-1638.

27. Behrens, J., Von, K.J., Kuhl, M., Bruhn,L., Wedlich, R., Grosschedl, R., Birchmeier, W. (1996). Functional interaction of beta-catenin with the transcription factor LEF-1. Nature. 382: 638-642.

28. Bennett, V., Gilligan, D.M. (1993). The spectrin-based membrane skeleton and micron-scale organization of the plasma membrane. Annu. Rev. Cell Biol. 9: 27-66.

29. Benoliel, A.-M., Kahn-Perles, В., Imbert, J., Verrando, P. (1997). Insulin stimulates haptotactic migration of human epidermal keratinocytes through activation of NF-kappa В transcription factor. I. Cell Sci. 110: 2089-2097.

30. Bershadsky, A.D., Tint, I.S., Neyfakh, A.A., Vasiliev, J.M. (1985). Focal contacts of normal and RSV-transformed quail cells. Exp. Cell Res. 158: 433-444.

31. Bershadsky, A.D., Vasiliev, I.M. (1988). Cytoskeleton. New York: Plenum Press. 298.

32. Bockus, В J., Stiles, C.D. (1984). Regulation of cytoskeletal architecture by platelet-derived growth factor, insulin and epidermal growth factor. Exp. Cell Res. 153: 186-197.

33. Boonstra J, Rijken P, Humbel B, Cremers F, Verkleij A, van Bergen en Henegouwen P. (1995). The epidermal growth factor. Cell Biol. Internat. 19: 413-430.

34. Bourguignon, L.Y.W., Bourguignon, G.J. (1984). Capping and the cytoskeleton. Int. Rev. Cyt. 87: 195-224.

35. Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.

36. Bretscher, A. (1989). Rapid phosphorylation and reorganization of ezrin and spectrin accompany morphological changes induced in А-431 cells by epidermal growth factor. J. Cell Biol. 108: 921-930.

37. Bretcher, M.S. (1992). Cells can use their transferrin receptors for locomotion. EMBO J. 11:383-389.

38. Bretscher, M.S., Aguado-Velasco, C. (1998). EGF induces recycling membrane to form ruffles. Curr. Biol. 8: 721-724.

39. Brown, E.J. (1997). Adhesive interactions in the immune system. Trends Cell Biol. 7:285-295.

40. Burbelo, P.D., Drechsel, D., Hall, A. (1995). A conserved binding motif defines numerous candidate target proteins for both Cdc42 and Rac GTPases. J. Biol. Chem. 270: 29071-29074.

41. Burridge, K., Turner, C.E., Romer, L.H. (1992). Tyrosine phosphorylation of paxillin and ppl25FAK accompanies cell adhesion to extracellular matrix: a role in cytoskeletal assembly. J. Cell Biol. 119: 893-903.

42. Cantarero, L.A., Butler J.E., Osborne J.W. (1980). The adsorptive characteristics of proteins for polystyrene and their significance in solid-phase immunoassays. Anal. Biochem. 105: 375-382.

43. Carlsson, L., Markey, F., Blikstad, I., Persson, Т., Lindberg, U. (1979). Reorganization of actin in platelets stimulated by trombin as measured de the Dnase I inhibition assay. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76: 6376-6380.

44. Carlsson, L., Nystrom, L.E., Lindberg, U., Kannan, K.K., Cid-Dresdner, H., Lovgren, S. (1976). Crystallization of a non-muscle actin. J. Mol. Biol. 105: 353-366.

45. Chan, A.Y., Raft, S., Bailly, M., Wyckoff, J.B., Segall, J.E., Condeelis, J.S. (1998). EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells. J. Cell Sci. Ill: 199-211.

46. Chen, Q., Kinch, M.S., Lin, Т.Н., Burridge, K., Juliano, R.L. (1994) Integrin-mediated cell adhesion activates mitogen-activated protein kinases. J. Biol. Chem. 269: 26602-26605.

47. Chinkers, M., McKanna, J.A., Cohen, S. (1979). Rapid induction of morphological changes in human carcinoma cells A-431 by epidermal growth factor. J. Cell Biol. 83:260-265.

48. Chinkers, M., McKanna, J.A., Cohen, S. (1981). Rapid rounding of human epidermoid carcinoma cells А-431 induced by epidermal growth factor. J. Cell Biol. 88:422-429.

49. Chrzanowska-Wodnicka, M., Burridge, K. (1996). Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesion. J. Cell Biol. 133: 1403-1415.

50. Coso, O.A., Chiariello, M., Yu, J.C., Teramoto, H., Crespo, P., Xu, N., Miki, Т., Gutkind, J.S. (1995). The small GTP-binding proteins Racl and Cdc42Hs regulate the activity of the JNK/SAPK signaling pathway. Cell. 81:1137-1146.

51. Craig, S.W., Johnson, R.P. (1996) Assembly of focal adhesion: progress, paradigms, and portents. Curr. Opin. Cell Biol. 8, 74-85.

52. Cramer, L.P., Siebert, M., Mitchison, T.J. (1997). J. Cell Biol. 136: 12871305.

53. Crepieux, P., Kwon, H., Leclerc, N., Spencer, W., Richard, S., Hiscott, J. (1997). I kappa В alpha physically interacts with a sytoskeleton-associated protein through its signal response domain. Mol. Cell Biol. 17: 7375-7385.

54. Dartsch, P.C., Ritter, M., Haussinger, D., Lang, F. (1994). Cytoskeletal reorganization in NIH 3T3 fibroblasts expressing the ras oncogen. Eur. J. Cell Biol. 63: 316-325.

55. Dillner L, Dickerson K, Manthorpe M, Ruoslahti E, Engvall E. (1988). The neurite-promoting domain of human laminin promotes attachment and induces characteristic morphology in non-neuronal cells. Exp. Cell Res. 177: 186-198.

56. Dogic, D., Rousselle, P., Aumailley, M. (1998). Cell adhesion to laminin 1 or 5 induces isoform-specific clustering of integrins and other focal adhesion components. J. Cell Sci. Ill: 793-802.

57. Dubreuil, R.R. (1991). Structure and evolution of the actin crosslinking proteins. BioEssays. 13: 219-226.

58. Eck, S.L., Perkins, N.D., Carr, D.P., Nabel, G.J. (1993). Inhibition of phorbol ester-induced cellular adhesion by copetitive binding of NF-kappa В in vivo. Mol. Cell Biol. 13: 6530-6536.

59. Engel, J. (1989). EGF-like domeins in extracellular proteins lokalized signals for growth and differentiation. FEBS Lett. 251: 1-7.

60. Evans, M.D., Steele, J.G. (1997). Multiple attachment mechanisms of corneal epithelial cells to a polymer cells can attach in the absence of exogenous adhesion proteins through a mechanism that requires microtubules. Exp.CellRes. 233: 88-98.

61. Ferletta, M., Ekblom, P. (1999). Identification of laminin-10/11 as a strong cell adhesive complex for a normal and malignant human epithelial cell line. J. Cell Sci. 112: 1-10.

62. Fischer, D., Brown-Ludi, M., Schulthess, Т., Chiquet-Ehrismann, R. (1997). Concerted action of tenascin-C domains in cell adhesion, anti-adhesion and promotion of neurite outgrowth. J. Cell Sci. 110: 1513-1522.

63. Fukami, K., Furuhashi, K., Inagaki, M., Endo, Т., Hatano, S., Takenawa, T. (1992). Requirement of phosphatidylinositol 4,5-biphosphate for alpha-actinin function. Nature. 359: 150-152.

64. Geiger, В., Ginsberg, D., Solomon, D., Volberg, T. (1990). The molecular basis for the assembly and modulation of adherens-type junction. Cell Differ. Dev. 32: 343-353.

65. Geiger, В., Yehuda-Levenberg, S., Bershadsky, A.D. (1995) Molecular interactions in the submembrane plaque of cell-cell and cell-matrix adhesions. ActaAnat. 154:46-62.

66. Gimona, M., Vandekerckhove, J., Goethals, M., Herzog, M., Lando, Z., Small, J.V. (1994). Beta-actin specific monoclonal antibody. Cell Motil. Cytoskelet. 27: 108-116.

67. Gimond, C., Mercier, I., Weber, I., Aumailley, M. (1996). Adhesion complexes formed by OVCAR-4 cells on laminin 1 differ from those observed on fibronectin. Cell Adhes. Comm. 3: 527-539.

68. Graf, J., Iwamoto, Y., Sasaki, M., Martin, G.R., Kleinman, H.K., Robey, F.A., Yamada, Y. (1987a). Identification of an amino acid sequence inlaminin mediating cell attachment, chemotaxis, and receptor binding. Cell 48: 989-996.

69. Graf, J., Ogle, R.C., Robey, F.A., Sasak, M., Martin, G.R., Yamada, Y., Kleinman, H.K. (1987b). A pentapeptide from the laminin B1 chain mediates cell adhesion and binds the 67 000 laminin receptor. Biochemistry 26: 6896-6900.

70. Grinnell, F. (1978). Cellular adhesiveness and extracellular substrata. Int. Rev. Cyt. 53: 65-144.

71. Haigler, H., Ash, J.F., Singer, S.J., Cohen, S. (1978). Visualization by fluorescence of the binding and internalization of epidermal growth factor in human carcinoma cells A-431. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75: 33173321.

72. Hall, A. (1992). Ras-related GTPases and the cytoskeleton. Mol. Biol. Cell. 3: 475-479.

73. Hall, A. (1994). Small GTP-binding proteins and the regulation of the actin cytoskeleton. Annu. Rev. Cell Biol. 10: 31-54.

74. Hart, M.J., Callow, M.G., Souza, В., Polakis, P. (1996). IQGAP1, a calmodulin-binding protein with a rasGAP-related domain, is a potential effector for cdc42Hs. EMBO J. 15: 2997-3005.

75. Hartwig, J.H., Kwiatkowski, D.J. (1991). Actin-binding proteins. Curr. Opin. Cell Biol. 3: 87-97.

76. Hedberg, K.M., Bengtsson, Т., Safiejko-Mroczka, В., Bell, P.B., Lindroth, M. (1993). PDGF and neomycin induce similar changes in the actin cytoskeleton in human fibroblasts. Cell Motil. Cytoskelet. 24: 139-149.

77. Herman, I.M. (1993). Actin isoforms. Curr. Opin. Cell Biol. 5: 48-55.

78. Hill, M.A., Schedlich, L., Gunning, P. (1994). Serum-induced signal transduction determines the peripheral location of beta-actin mRNA within the cell. J. Cell Biol. 126: 1221-1230.

79. Hoock, T.C., Newcomb, P.M., Herman, I.M. (1991). Beta-actin and its mRNA are localized at the plasma membrane and the regions of movingcytoplasm during the cellular response to injury. J. Cell Biol. 112: 653664.

80. Hotchin, N.A., Hall, A. (1995). The assembly of integrin adhesion complexes requires both extracellular matrix and intracellular rho/rac GTPases. J. Cell Biol. 131: 1857-1865.

81. Hunter, T. (1997). Oncoprotein networks. Cell. 88: 333-346.

82. Hynes, R.O. (1992). Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. Cell. 69: 11-25.

83. Ishizaki, Т., Maekawa, M., Fujisawa, K., Okawa, K., Iwamatsu, A. (1996). The small GTP-binding protein Rho binds to and activates a 160 kDa Ser/Thr protein kinase homologous to myotonic dystrophy kinase. EMBO J. 15: 1885-1893.

84. Ishizaki, Т., Naito, M., Fujisawa, K., Maekawa, M., Watanabe, N., Saito, Y., Narumiya, S. (1997). pl60 ROCK, a Rho-associated coiled-coil forming protein kinase, works downstream of Rho and induces focal adhesion. FEBS Lett. 404: 118-124.

85. Iwamoto, Y., Robey, F.A., Graf, J., Sasaki, M., Kleinman, H.K., Yamada, Y., Martin, G.R. (19870. YIGSR, a synthetic laminin pentapeptide, inhibits experimental metastasis formation. Science. 238:1132-1134.

86. Izzard, C.S., Lochner, L.R. (1980). Formation of cell-to-substrate contacts during fibroblast motility: an interference-reflexion study. J. Cell Sci. 42: 81-116.

87. Izzard, C.S., Radinsky, R., Culp, L.A. (1986). Substratum contacts and cytoskeletal reorganization of BALB/c 3T3 cells on a cell-binding fragment and heparin-binding fragments of plasma fibronectin. Exp. Cell Res. 165: 320-336.

88. Janmey, P.A. (1994). Phosphoinositides and calcium as regulators of cellular actin assembly and disassembly. Annu. Rev. Physiol. 56: 169-191.

89. Janmey, P.A. (1998). The cytoskeleton and cell signalling:component localization and mechanical coupling. Physiological Reviews. 78: 763-781.

90. Jockusch, B.M., Hinssen, H. (1996). Nonmuscle motility and the actin-based cytoskeleton. Comprehensive Human Physiology. 1:225-243.

91. Joneson, Т., McDonough, M., Bar-Sagi, D., Van Aelst, L. (1996) RAC regulation of actin polymerization and proliferation by a pathway distinct from Jun kinase. Science. 274: 1374-1376.

92. Juliano, R.L., Haskill, S. (1993). Signal transduction from extracellular matrix. J. Cell Biol. 120: 577-585.

93. Juliano, R.L., Varner, J.A. (1993). Adhesion molecules in cancer: the role of integrins. Curr. Opin. Cell Biol. 5: 812-818.

94. Kadowaki, Т., Koyasu, S., Nishida, E., Sakai, H., Takaku, F., Yahara, I., Kasuga, M. (1986). Insulin-like growth factors, insulin, and epidermal growth factor cause rapid cytoskeletal reorganization in KB cells. J. Biol. Chem. 261: 16141-16147.

95. Karin, M. (1994). Signal transduction from the cell surface to the nucleus through the phosphorilation of transcription factors. Curr. Opin. Cell Biol. 6:415-424.

96. Katsumoto, Т., Kurimura, T. (1988). Ultrastructural localization of concanavalin A receptors in the plasma membrane: association with underlying actin filaments. Biol Cell. 62: 1-10.

97. Keely, P., Parise, L., Juliano, R. (1998). Integrins and GTPases in tumour cell growth, motility and invasion. Trends Cell Biol. 8: 101-106.

98. Khosravi-Far, R., Solski, P.A., Clark, G.F., Kinch, M.S., Der, C.J. (1995). Activation of Rac 1, RhoA and mitogen-activated protein kinases is required for Ras transformation. Mol. Cell Biol. 15:6443-6453.

99. Khrebtukova, I.A., Kwiatkowska, K., Gudkova, DA., Sorokin, A.B., Pinaev, G.P. (19910. The role of microfilaments in the capping of epidermal growth factor receptor in A-431 cells. Exp. Cell Res. 194: 4855.

100. Kimura, K., Ito, M., Amano, M., Chihara, K., Fukata, Y. (1996). Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rho-kinase). Science. 273: 245-248.

101. Kozma, R., Ahmed, S., Best, A., Lim, L. (1995). The Ras-related protein Cdc42Hs and bradykinin promote formation of peripheral actin microspikes and filopodia in Swiss 3T3 fibroblasts. Mol. Cell Biol. 15: 1942-1952.

102. Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685.

103. Lamarche, N., Tapon, N., Stowers, L., Burbelo, P.D., Aspenstrom, P. (1996). Rac and Cdc42 induce actin polymerization and G1 cell cycle progression independently of p65PAK and the JNK/SAPK MAP kinase cascade. Cell. 87: 519-529.

104. Lamb, J.A., Allen, P.G., Tuan, B.Y., Janmey, P.A. (1993). Modulation of gelsolin function. Activation at low pH overrides Ca2+ requirement. J. Biol. Chem. 268: 8999-9004.

105. Lassing, I., Lindberg, U. (1985). Specific interaction between phosphatidylinositol 4,5-biphosphate and profilactin. Nature. 314: 472474.

106. Leung, Т., Manser, E., Tan, L., Lim, L. (1995). A novel serine/threonine kinase binding the Ras-related RhoA GTPase which translocates die kinase to peripheral membranes. J. Biol. Chem. 270: 29051-29054.

107. Leung, Т., Chen, X.Q., Manser, E., Lim, L. (1996). The pl60 RhoA-binding kinase ROK alpha is a member of a kinase family and is involved in the reorganization of the cytoskeleton. Mol. Cell Biol. 16: 5313-5327.

108. Li, C.-C.H., Korner, M., Ferris, D.K., Chen, E., Dai, R.-M., Longo, D.L.1994). NF-kappa B/Rel family members are physically associated phosphoproteins. Biochem. J. 303: 499-506.

109. Li, J., Lin, M.-L., Wiepz, G.J., Guadarrama, A.G., Bertics, P.J. (1999). Integrin-mediated migration of murine B82L fibroblasts is dependent on the expression of an intact epidermal growth factor receptor. J. Biol. Chem. 274:11209-11219.

110. Li, Y., Ndubuca, C., Rubin, C.S. (1996). A kinase anchor protein 75 targets regulatory (RII) subunits of cAMP-dependent protein kinase II to the cortical actin cytoskeleton in non-neuronal cells. J. Biol. Chem. 271: 16862-16869.

111. Lim, L., Manser, E., Leung, Т., Hall, C. (1996). Regulation of phosphorylation pathways by p21 GTPases. The p21 Ras-related Rho subfamily and its role in phosphorylation signalling pathways. Eur. J. Biochem. 242: 171-185.

112. Liou, H.-C., Baltimore, D. (1993). Regulation of the NF-kappa B/rel transcription factor and I kappa В inhibitor system. Curr. Opin. Cell Biol. 5: 477-487.

113. Lux, S.E., John, K.M., Bennet, V. (1990). Analysis of cDNA for human erythrocyte ankyrin indicates a repeated structure with homology to tissue-differentiation and cell-cycle control proteins. Nature. 344: 36-42.

114. Machesky, L.M., Hall, A. (1996). Rho: a connection between membrane receptor signalling and the cytoskeleton. Trends Cell. Biol. 6: 304-310.

115. Machesky, L.M., Hall, A. (1997). Role of actin polymerization and adhesion to extracellular matrix in Rac- and Rho-induced cytoskeletal reorganization. J. Cell Biol. 138: 913-926.

116. Mackay, D.J.G., Hall, A. (1998). Mo GTPases. J. Biol. Chem. 273: 20685-20688.

117. Madaule, P., Furuyashiki, Т., Reid, Т., Ishizaki, Т., Watanabe, G. (1995). A novel partner for the GTP-bound forms of rho and rac. FEBS Lett. 377: 243-48.

118. Marinovich, M., Viviani, В., Corsini, E., Ghilardi, F., Galli, C.L. (1996). NF-kappa В activation by triphenyltin triggers apoptosis in HL-60 cells. Exp. Cell Res. 226: 98-104.

119. Matsudaira, P. (1991). Modular organization of actin crosslinking proteins. Trends Biochem. Sci. 16: 87-92.

120. Matsudaira, P. (1994). Actin crosslinking proteins at the leading edge. Semin. Cell Biol. 5: 165-174.

121. Matsudaira, P., Janmey, P. (1988). Pieces in the actin-severing protein puzzle. Cell. 54: 139-140.

122. Matsui, Т., Amano, M., Yamamoto, Т., Chihara, K., Nakafuku, M. (1996). Rho-associated kinase, a novel serine/threonine kinase, as a putative target for small GTP binding protein Rho. EMBO J. 15: 2208-2216.

123. Mayer, B.J., Baltimore, D. (1993). Signalling through SH2 and SH3 domains. Trends Cell Biol. 3: 8-13.

124. McGarvey, M.L., Baron-Van Evercooren, A., Kleinman, H.K., Dubois-Dalcq, M. (1984). Synthesis and effects of basement membrane components in cultured rat Schwann cells. Dev. Biol. 105: 18-28.

125. McNamee, C.J., Pennington, S.R., Sheterline, P. (1995). Cell cycle-dependent morphological changes in the actin cytoskeleton induced by agents which elevate cyclic AMP. Cell Biol. Int. 19: 769-775.

126. McWhirter, J.R., Wang, J.Y. (1993). An actin-binding function contributes to transformation by the Bcr-Abl oncoprotein of Philadelphia chromosome-positive human leukemias. EMBO J. 12: 1533-1546.

127. Mellstrom, K., Hoglund, A.-S., Nister, M., Heldin, C.-H., Westermark, В., Lindberg, U. (1983). The effect of platelet-derived growth factor on morphology and motility of human glial cells. J. Muse. Res. Cell Motil. 4: 589-609.

128. Miller, K.G., Alberts, B.M. (1989). F-actin affinity chromatography: Technique for isolating previously unidentified actin-binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 4808-4812.

129. Minden, A., Lin, A., Claret, F.X., Abo, A., Karin, M. (1995). Selective activation of the JNK signaling cascade and c-Jun transcriptional activity by the small GTPases Rac and Cdc42Hs. Cell. 81: 1147-1157.

130. Miyamoto, S., Teramoto, H., Coso, O.A., Gutkind, J.S., Burbelo, P.D., Akiyama, S.K., Yamada, K.M. (1995) Inegrin function: molecular hierarchies of cytoskeletal and signaling molecules. J. Cell Biol. 131: 791805.

131. Moran, E., Zerler, В., Harrison, T.M., Mathews, M.B. (1986). Identification of separate domains in the adenovirus El A gene for immortalization activity and the activation of virus early genes. Mol. Cell Biol. 6: 3470-3480.

132. Moro, L., Venturino, M., Bozzo, C., Silengo, L., Atruda, F., Beguinot, L., Tarone, G., Defilippi, P. (1998). Integrins induce activation of EGFreceptor: role in MAP kinase induction and adhesion-dependent cell survival. EMBO J. 17: 6622-6632.

133. Mucai,H., Toshimori, M., Shibata, H., Takanaga, H., Kitagawa, M., Miyahara, M., Shimakawa, M., Ono, Y. (1997). Interaction of PKN with alpha-actinin. J. Biol. Chem. 272: 4740-4746.

134. Mullins, R.D., Heuser, J.A., Pollard, T.D. 1998. The interaction of Arp2/3 complex with actin: nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 6181-6186.

135. Nachmias, V.T. (1993). Small actin-binding proteins: the beta-thymosin family. Curr. Opin. Cell Biol. 5: 56-62.

136. Narayanan, R., Higgins, K.A., Perez, J.R., Coleman, T.A., Rozen, C.A. (1993). Evidence for differential function of the p50 and p65 subunits of NF-kappa В with a cell adhesion model. Mol. Cell Biol. 13: 3802-3810.

137. Naumann, M., Scheidereit, C. (1994). Activation of NF-kappa В in vivo is regulated by multiple phosphorylations. EMBO J., 13, 4597-4607.

138. Nobes, C.D., Hall, A. (1995). Rho, rac, and cdc42 GTPases regulate the assembly of multimolecular focal complexes associated with actin stress fibers, lamellipodia, and filopodia. Cell. 81: 53-62.

139. Noda, M. (1993). Mechanisms of reversion. FASEB J. 7: 834-840.

140. Palladini, G., Finardi, G., Bellomo, G. (1996). Disruption of actin microfilament organization by cholesterol oxides in 73/73 endothelial cells. Exp. Cell Res. 223: 72-82.

141. Palombella, V.J., Rando, O.J., Goldberg, A.L., Maniatis, T. (1994). The ubiquitin-proteasome pathway is required for processing the NF-kappa B1 precursor protein and the activation of NF-kappa B. Cell. 78: 773-785.

142. Panayotou, G., End, P., Aumailley, M., Timpl, R., Engel, J. (1989). Domains of laminin with growth-factor activity. Cell. 56: 93-101.

143. Parsons, J.T. (1996) Integrin-mediated signaling regulation by protein-tyrosine kinases and small GTP-binding proteins. Curr. Opin. Cell Biol. 8: 146-152.

144. Paterson, H.F., Self, A.J., Garrett, M.D., Just, I., Actories, K., Hall, A. (1990). Microinj action of recombinant p21rho induces rapid changes in cell morphology. J. Cell Biol. Ill: 1001-1007.

145. Paves, H., Neuman, Т., Metsis, M., Saarma, M. (1990). Nerve growth factor-induced rapid reorganization of microfilaments in PC 12 cells: Possible roles of different second messenger systems. Exp. Cell Res. 186. 218-226.

146. Pawson, T. (1995). Protein modules and signalling networks. Nature. 373: 573-580.

147. Pinaev, G., Are, A., Burova, E., Lindberg, U. (1993). Specific attachment and spreading of A431 cells on substrate via EGF-receptors. Abst. of 40-th Int. Congress of the European Tissue Culture Soc., Rennes, France, W 2.16.

148. Prendergast, G.C., Gibbs, J.B. (1993). Pathways of ras function: connections to the cytoskeleton. Adv. Cancer Res. 62: 19-64.

149. Prendergast, G.C., Khosravi-Far, R., Solski, P.A., Kurzawa, H., Lebowitz, P.F., Der, C.J. (1995). Critical role of Rho in cell transformation by oncogenic Ras. Oncogene. 10:2289-2296.

150. Price, L.S., Leng, J., Schwartz, M.A., Bokoch, G.M. (1998). Activation of Rac and Cdc42 by integrins mediates cell spreading. Mol. Biol. Cell. 9: 1863-1871.

151. Puck, T.T., Krystosek, A. (1992). Role of the cytoskeleton in genome regulation and cancer. Int. Rev. Cyt. 132: 75-108.

152. Puius, Y.A., Mahoney, N.M., Almo, S.C. (1998). The modular structure of actin-regulatory proteins. Curr. Opin. Cell Biol. 10: 23-34.

153. Qiu, R., Chen, J., Kirin, D., McCormick, F., Symons, M. (1995). An essential role for Rac in Ras transformation. Nature. 374: 457-459.

154. Quilliam, L.A., Lambert, Q.T., Mickelson-Young, L.A., Westwick, J.K., Sparks, A.B., et al. (1996). Isolation of a NCK-associated kinase, PRK2, an SH3-binding protein and potential effector of Rho protein signalling. J. Biol. Chem. 271: 28772-28776.

155. Qwarnstrom, E.E., Ostberg, C.O., Turk, G.L., Richardson, C.A., Bomsztyk, K. (1994). Fibronectin attachment activates the NF-kappa В p50/p65 heterodimer in fibroblasts and smooth muscle cells. J. Biol. Chem. 269: 30765-30768.

156. Rao, C.N., Margulies, I.M., Tralka, T.S., Terranova V.P., Madri, J.A., Liotta, L.A. (1982). Isolation of a subunit of laminin and its role in molecular structure and tumor cell attachment. J. Biol. Chem. 257: 97409744.

157. Reid, Т., Furuyashiki, Т., Ishizaki, Т., Watanabe, G., Watanabe, N. (1996) Rhotekin, a new putative target for Rho bearing homology to a serine/threonine kinase, PKN, and rhophilin in the rho-binding domain. J. Biol. Chem. 271: 13556-13560.

158. Ren, X.-D., Kiosses, W.B., Schwartz, M.A. (1999). Regulation of the small GTP-binding protein Rho by cell adhesion and the cytoskeleton. EMBO J. 18: 578-585.

159. Rice, N.R., MacKichan, M.L., Israel, A. (1992). The precursor of NF-kappa В p50 has I kappa B-like functions. Cell. 71: 243-253.

160. Ridley, A.J., Hall, A. (1992). The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in responce to growth factors. Cell. 70: 389-399.

161. Ridley, A.J., Paterson, H.F., Johnston, C.L., Diekmann, D., Hall, A. (1992). The small GTP-binding protein rac regulates growth factor-induced membrane ruffling. Cell. 70: 401-410.

162. Roberts, B.E., Miller, J.S., Kimelman, D., Cepko, C.L., Lemischka, I.R., Mulligan, R.C. (1985). Individual adenovirus type 5 early region 1A gene products elisit distinct alterations of cellular morphology and gene expression. J. Virol. 56: 404-413.

163. Rosette, C., Karin, M. (1995). Cytoskeletal control of gene expression: depolymerization of microtubules activates NF-kappa B. J. Cell Biochem. 128: 1111-1119.

164. Ruley, H.E. (1990). Transforming collaborations between Ras and nuclear oncogene. Cancer Cells. 2: 258-268.

165. Sasaki, M., Kato, S., Kohno, K., Martin, G.R., Yamada, Y. (1987). Sequence of the cDNA encoding the laminin B1 chain reveals a multidomain protein containing cysteine-rich repeats. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 935-939.

166. Sastry, S.K., Horwitz, A.F. (1993). Integrin cytoplasmic domains: mediators of cytoskeletal linkages and extra- and intracellular initiated transmembrane signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 5: 819-831.

167. Schlessinger, J., Geiger, B. (1981). Epidermal growth factor induces redistribution of actin and alpha-actinin in human epidermal carcinoma cells. Exp. Cell Res. 134: 273-279.

168. Schmidt, A., Hall, M.N. (1998). Signaling to the actin cytoskeleton. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14: 305-338.

169. Schwartz, M.A. (1993). Signaling by integrins: implications for tumorigenesis. Cancer Res. 53: 1503-1506.

170. Sells, M.A., Knaus, U.G., Bagrodia, S., Ambrose, D.M., Bokoch, G.M., Chernoff, J. (1997). Human p21-activated kinase (Pakl) regulates actin organization in mammalian cells. Curr. Biol. 7: 202-210.

171. Seth, A., Gonzales, F.A., Gupta, S., Raden, D.L., Davis, RJ. (1992). Signal transduction within the nucleus by mitogen-activated protein kinase. J. Biol. Chem. 267: 24796-24804.

172. Sharma, C.P., Ezzell, R.M., Arnaout, M.A. (1995) Direct interaction of filamin (ABP-280) with the beta 2-integrin subunit CD 18. J. Immunol. 154: 3461-3470.

173. Shelden, E. (1999). Major role for active extension in the formation of processes by ras-transformed fibroblasts. Cell Motil. Cytoskeleton. 42: 1226.

174. Singer, I.I., Kawka, D.W., Scott, S., Mumford, R.A., Lark, M.W. (1987). The fibronectin cell attachment sequence Arg-Gly-Asp-Ser promotes focal contact formation during early fibroblast attachment and spreading. J. Cell Biol. 104: 573-584.

175. Small, J.V., Rottner, K., Kaverina, I., Anderson, K.I. (1998). Assembling an actin cytoskeleton for cell attachment and movement. Biochim. Biophys. Acta, 1404: 271-281.

176. Sobue, K., Fugio, Y., Kanda, K. (1988). Tumor promoter induces reorganization of actin filaments and calspectin (fodrin or nonerythroid spectrin) in 3T3 cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 482-486.

177. Symons, M., Derry, J.M., Karlak, В., Jiang, S., Lemahieu, V. (1996b) Wiskott-Aldrich syndrome protein, a novel effector for the GTPase CDC42Hs, is implicated in actin polymerization. Cell. 84: 723-34.

178. Takai, Y., Sasaki, Т., Tanaka, K., Nakanishi, H. (1995). Rho as a regulator of the cytoskeleton. Trends Biochem. 20: 227-231.

179. Tapon, N., Nagata, K., Lamarche, N., Hall, A. (1998). A new Rac target POSH is an SH3-containing scaffold protein involved in the JNK and NF-kappa В signaling pathways. EMBOJ. 17: 1395-1404.

180. Theriot, J.A. (1994). Regulation of the actin cytoskeleton in living cells. Sem. Cell Biol. 5: 193-199.

181. Towbin, H., Staehelin, Т., Gordon, J. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76: 4350-4354.

182. Tozer, E.C., Hughes, P.E., Loftus, J.C. (1996). Ligand binding and affinity modulation of integrins. Biochem. Cell Biol. 74:785-798.

183. Verma, I.M., Stevenson, J.K., Schwarz, E.M., Van Antwerp, D., Miyamoto, S. (1995). Rel/NF-kappa ВЯ kappa В family: intimate tales of association and dissociation. Genes Dev. 9: 2723-2735.

184. Vincent, S., Settleman, J. (1997). The PRK2 kinase is a potential effector target of both Rho and Rac GTPases and regulates actin cytoskeletal organization. Mol. Cell Biol. 17: 2247-2256.

185. Vouret-Craviari, V., Boquet, P., Pouyssegur, J., Van Obberghen-Schilling, E. (1998). Regulation of the actin cytoskeleton by thrombin in human endothelial cells: role of Rho proteins in endothelial barrier function. Mol. Biol. Cell. 9: 2639-2653.

186. Walmod, P.S., Skladchikova, G., Kawa, A., Berezin, V., Bock, E. (1999). Antiepileptic Teratogen Valproic Acid (VPA) modulates organization and dynamics of the actin cytoskeleton. Cell Motil Cytoskeleton. 42: 241-255.

187. Wang, Y.-L. (1984). Reorganization of actin filament bundles in living fibroblasts. J. Cell Biol. 99: 1478-1485.

188. Watanabe, G., Saito, Y., Madaule, P., Ishizaki, Т., Fujisawa, K. (1996). Protein kinase N (PKN) and PKN-related protein rhophilin as targets of small GTPase Rho. Science. 271: 645-648.

189. Watanabe, N., Madaule, P., Reid, Т., Ishizaki, Т., Watanabe, G. (1997). pl40mDia, a mammalian homolog of Drosophila diaphanous, is a target protein for Rho small GTPase and is a ligand for profilin. EMBO J. 16: 3044-3056.

190. Westermark, В., Magnusson, A., Heldin, C.-H. (1982). Effect of epidermal growth factor on membrane motility and cell locomotion in cultures of human clonal glioma cells. J. Neurosci. Res. 8: 491-507.

191. Wewer, U.M., Engvall, E. (1994). Laminins. Methods in Enzymology 245: 85-104.

192. Wiegant, F.A., Block, F.J., Defize, L.H., Linnemans, W.A., Verkley, A.J., Boonstra, J. (1986). Epidermal growth factor receptors associated to cytoskeletal elements of epidermoid carcinoma (A-431) cells. J. Cell Biol. 103: 87-94.

193. Witke, W., Hofinann, A., Koppel, В., Schleicher, M., Noegel, A.A. (1993). The Ca(2+)-binding domains in non-muscle type alpha-actinin: biochemical and genetic analysis. J. Cell Biol. 121: 599-606.

194. Woods, A., Couchman, J.R., Johansson, S., Hook, M. (1986). Adhesion and cytoskeletal organisation of fibroblasts in response to fibronectin fragments. EMBO J. 5: 665-670.

195. Xu, J., Zutter, M.M., Santoro, S.A., Clark, R.A.F. (1998). A three-dimensional collagen lattice activates NF-kappa В in human fibroblasts: role in integrin alpha2 gene expression and tissue remodeling. J. Cell Biol. 140: 709-719.

196. Yamada, K.M., Geiger, B. (1997). Molecular interactions in cell adhesion complexes. Curr. Opin. Cell Biol. 9: 76-85.

197. Yamada, K.M., Kennedy, D.W. (1984). Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function. J. Cell Biol. 99: 29-36.

198. Yamada, K.M., Miyamoto, S. (1995). Integrin transmembrane signaling and cytoskeletal control. Curr. Opin. Cell Biol. 7: 681-689.

199. Yamada, K.M., Olden, K. (1978). Fibronectins adhesive glycoproteins of cell surface and blood. Nature. 275: 179-184.

200. Zhu, P., Xiong, W., Rodgers, G., Qwarnstrom, E. (1998). Regulation of interleukin 1 signalling through integrin binding and actin reorganization: disparate effect on NF-kappa В and stress kinase pathways. Biochem. J. 330: 975-981.

201. Zohn, I.M., Campbell, S.I., Khosravi-Far, R., Rossman, K.I., Der, C.J. (1998). Rho family proteins and Ras transformation: the RHOad less traveled gets congested. Oncogene. 17: 1415-1438.

Информация о работе

Арэ, Александра Феликсовна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2000
ВАК 03.00.25

Диссертация

Взаимодействие поверхностных рецепторов клетки с различными иммобилизованными и свободными лигандами определяет структуру актинового цитоскелета - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы