Изменения ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов при реорганизациях актинового цитоскелета клеток А431

Емельянов, Артем Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изменения ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов при реорганизациях актинового цитоскелета клеток А431
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Изменения ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов при реорганизациях актинового цитоскелета клеток А431"

На правах рукописи ООЗОВ71ЭО

ЕМЕЛЬЯНОВ Артём Николаевич

- \

ИЗМЕНЕНИЯ ДНК-СВЯЗЫВАЮЩЕИ АКТИВНОСТИ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ ПРИ РЕОРГАНИЗАЦИЯХ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА КЛЕТОК А431

03.00.25 - гистология, цитология и клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург, 2006г.

003067190

Работа выполнена в Отделе клеточных культур Института цитологии РАН,

Санкт-Петербург

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Ольга Александровна Петухова Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Елена Сергеевна Корнилова • Институт цитологии РАН Санкт-Петербург

доктор биологических наук Надежда Владимировна Кулёва

Биолого-почвенный факультет, Санкт-Петербургского государственного университета

Ведущая организация: ГУ НИИ экспериментальной

медицины

РАМН, Санкт-Петербург

Защита состоится 19 января 2007 года в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН. Автореферат разослан 19 декабря 2006 года.

Учёный секретарь . кандидат биологических наук

Диссертационного совета ^[¡М^3 Е.В.Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Изучение механизмов передачи сигнала с клеточной поверхности в ядро является одной из центральных задач современной клеточной и молекулярной биологии. Сигнал возникает в результате взаимодействия клеточных рецепторов с сигнальными молекулами. При этом запускается ряд внутриклеточных реакций, называемых совокупно внутриклеточной сигнализацией. Внутриклеточная сигнализация, в конечном счёте, приводит к модуляции экспрессии тех или иных генов, которые, в свою очередь, регулируют такие функции клетки, как пролиферация, дифференцировка, деление, апоптоз, биологическая подвижность, а также различные стороны клеточного метаболизма.

Адгезия клеток к белкам внеклеточного матрикса (ВКМ) является одним из пусковых механизмов внутриклеточной сигнализации. Распластывание клеток на иммобилизованных белках ВКМ можно использовать как модельную систему, которая позволяет выявлять процессы, связанные с адгезией на молекулярном и на субклеточном уровнях организации клетки. Взаимодействие клеток с белками ВКМ осуществляется поверхностными рецепторами адгезии, среди которых лучше всего охарактеризованы интегриновые рецепторы (Van Aelst, D'Souza-Schorey, 1997; Hall, 1998; Schoenwaelder, Burridge, 1999). Интегрины ассоциированы с подмембраиными структурами актинового цитоскелета (АЦ) в образующихся при распластывании клеток трансмембранных комплексах, где они активируют сигнальные молекулы, способствуя переносу в ядро белковых факторов, индуцирующих транскрипцию генов (Miyamoto et al., 1998; Clark, Brugge, 1995).

АЦ является обязательным участником адгезии, способствуя стабилизации множественных взаимодействий и определяя форму клетки (Hynes, 1999; Geiger et al., 2001). При этом происходит реорганизация АЦ под влиянием элементов ВКМ. Влияние ВКМ на АЦ в значительной степени реализуется через интегриновые рецепторы (Sastry, Horwitz, 1993; Yamada, Miyamoto, 1995).

В культивируемых клетках структуры АЦ представлены стресс-фибриллами, разнообразными пучками микрофиламентов в цитоплазме и филоподиях, а также сетью микрофиламентов в ламеллах клеток (Small et al., 1999). При распластывании клеток эпидермоидной карциномы А431 на фибронектине в цитоплазме клеток обнаруживаются стресс-фибриллы, на ламинине 2/4 - сеть актиновых филаментов в ламелле, и на антителах к рецептору ЭФР - сеть актиновых филаментов в филоподиях и ламеллах (Are et al., 2001). Соответствующие структуры АЦ обнаруживаются у большинства клеток, распластанных в течение 1 ч на данных лигандах (Петухова и др., 2004).

Участие малых ГТФ-аз в возникновении тех или иных типов пространственной организации АЦ было показано в 1992 году Ридли и Холлом (Ridley, Hall, 1992) и исследуется в последующих работах этой группы исследователей. Также в ряде работ было показано наличие связи между состоянием АЦ и проведением сигнала от поверхностной мембраны к ядру клетки (Puck, Krystosek, 1992; Yamada, Geiger, 1997). Предполагается три варианта участия АЦ в этом процессе: роль скаффолда (Hopkins et al., 2000; Yin, Janmey, 2003), роль «рельсов», по которым перемещаются сигнальные молекулы (Small et al., 1999), и самостоятельная передача сигнала самим цитоскелетом (Maniotis et al., 1997) или его компонентами (Batchelor et al., 2004; Бабаков и др., 2004). Все эти данные приводят к предположению о том, что изменение тех или иных типов пространственной организации АЦ может оказывать влияние на процесс активации соответствующих данным типам цитоскелета транскрипционных факторов (ТФ).

Для проверки данного предположения была использована уже существующая модель распластывания клеток эпидермоидной карциномы человека А431 на белках ВКМ фибронектине, или ламинине 2/4, или на антителах 5А9 к рецептору ЭФР (Are et al., 2001; Петухова и др., 2004). В рамках этой модели реорганизации АЦ можно наблюдать в процессе распластывания клеток (Small et al., 1998), при действии на распластанные клетки ЭФР (Are et al., 2001), а также после воздействия на клетки цитохалазина Д (Nemeth et al., 2004).

Были выбраны ТФ, которые специфически взаимодействуют с регуляторными последовательностями кВ, SRE, и API. Показано, что активность данных ТФ может изменяться в связи с адгезией и реорганизацией АЦ. Так, активность SRF регулируется динамикой актина при участии ГТФ-азы RhoA и через Raf-MEK-ERK сигнальный путь (Sotiropoulos et al., 1999; Gineitis, Treisman, 2001). Семейство Rel/NFxB ТФ индуцируется малыми ГТФ-азами, МЕКК1 и убиквитинирующими ферментами за счёт деградации 1кВ и при разборке АЦ цитохалазином Д (May, Ghosh, 1998; Nemeth et al., 2004). В нашей лаборатории были получены данные о том, что субъединица р65 ТФ NFkB взаимодействует с актином и актин-связывающим белком а-актинином и перераспределяется в цитоплазме клетки в зависимости от характера организации актиновых структур (Are et al., 2001; Бабаков и др., 2004). Для API показано участие в процессах, связанных с подвижностью клеток (Malliri et al., 1998).

Цель и задачи исследования

Целью работы было исследовать влияния различных типов пространственной организации и перестроек актинового цитоскелета на ДНК-связывающую активность транскрипционных факторов SRF, API и NFkB в клетках эпидермоидной карциномы человека А431.

В работе были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

1. Изучить динамику реорганизаций АЦ при распластывании клеток на фибронектине, или ламинине 2/4, или антителах 5А9 к рецептору ЭФР. Провести анализ изменений ДНК-связывающей активности ТФ при распластывании клеток в тех же условиях. Сравнить данные анализа реорганизации АЦ и ДНК-связывающей активности ТФ.

2. Изучить динамику перестроек АЦ при воздействии на распластанные клетки эпидермалыюго фактора роста и/или цитохалазина Д. В тех же условиях провести анализ ДНК-связывающей активности ТФ клеток. Сравнить данные анализа реорганизации АЦ и ДНК-связывающей активности ТФ.

3. Провести анализ распределения субъединицы р65 NFkB при распластывании клеток на различных иммобилизованных лигандах, а также при воздействии на распластанные клетки эпидермальным фактором роста и (или) цитохалазином Д.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Распластывание клеток на иммобилизованных лигандах сопровождается закономерной сменой типов пространственной организации актинового цитоскелета. Особенности формирования и смена типов актинового цитоскелета зависят от лиганда, на котором распластываются клетки.

3. Изменения ДНК-связывающей активности NFkB согласуются с процессами сборки-разборки стресс-фибрилл, пучков актиновых филаментов и фокальных контактов.

Изменения ДНК-связывающей активности SRF согласуются с процессами сборки-разборки сети актиновых филаментов в основании ламелл клеток.

4. Прямой зависимости короткопериодических изменений уровня ДНК-связывающей активности NFkB от ядерно-цитоплазматических перемещений р65 нет. Научная новизна полученных результатов

В работе впервые показано наличие короткопериодических волнообразных изменений ДНК-связывающей активности NFkB, SRF и API в ответ на прикрепление и распластывание клеток на субстрате и в ответ на воздействие на распластанные клетки эпидермального фактора роста. Изменения ДНК-связывающей активности NFkB и SRF согласуются именно с перестройками соответствующих актиновых структур, а не с наличием или отсутствием той или иной структуры актинового цитоскелета. Выявленные короткопериодические изменения активности NFkB прямо не зависят от перемещений р65 между ядром и цитоплазмой клеток. Теоретическое и практическое значение работы

Полученные результаты позволяют обосновать перспективность дальнейшего изучения роли актинового цитоскелета в сигнальных процессах, а также надмолекулярного подхода к исследованию функций актинового цитоскелета в клетке, в котором он рассматривается как единое целое. Обосновываются исследования влияний актинового цитоскелета на экспрессию определённых генов в результате активации или ингибирования активности транскрипционных факторов.

Данная работа закладывает фундамент для дальнейшего изучения актин-связывающих белков и самого актина в роли регуляторов активности транскрипционных факторов. Показана принципиальная возможность управления клеточными процессами в результате тех или иных воздействий на цитоскелет клетки. Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 2 статьи и сделано 7 тезисных сообщений на всероссийских и международных конференциях. Основные положения были доложены и обсуждались на научных семинарах Лаборатории клетки в культуре Отдела клеточных культур Института цитологии РАН. Диссертационная работа апробирована на научном семинаре Отдела клеточных культур Института цитологии РАН 27 января 2006 г. Финансовая поддержка работы

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 03-04-48251), гранта Президента РФ по поддержке ведущих научных школ (НШ-1244.2003.4) и гранта СПб НЦ РАН. Диссертационная работа является фрагментом технического задания Государственного контракта № 02.435.11.3020 от сентября 2005 г по теме: «Метод восстановления эпителиально-мезенхимальных дефектов с помощью стволовых клеток», Лот № 2005-ЖС-13.1/001 (IV очередь). Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из «Введения», глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты» и «Обсуждение результатов», выводов и списка цитируемой литературы, включающего 196 ссылок. Иллюстративный материал содержит 34 рисунка и 9 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Культивирование клеток

Клетки эпидермоидной карциномы линии А431 были получены из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН). Клетки культивировали в среде Дальбекко (ДМЕМ, Sigma), содержащей 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого

скота. Клетки снимали с подложки смесью 0.25% трипсина с 0.02% ЭДТА (3/7), дважды отмывали средой ДМЕМ без сыворотки и ресуспендировали в среде ДМЕМ до концентрации 12.5x105 клеток/мл для биохимических и 2x10s клеток/мл для цитологических исследований. Подготовка иммобилизованных лнгандов

Покровные стёкла, обработанные Repel-Silan (Pharmacia Biotech., Sweden) для придания поверхности гидрофобных свойств, и бактериологические чашки Петри диаметром 90 мм (гидрофобная поверхность, ПО "Ленполимер", СССР) покрывали растворами различных лигандов (фибронектина, ламинина2/4, AT 5А9, полилизина) с концентрацией 10 мкг/мл. Выдерживали в течение ночи при 4°С, затем трижды отмывали фосфатным буфером (ФБ). Обрабатывали 2%-м бычьим сывороточным альбумином (heat shock fractionated), приготовленным на ФБ, в течение 1 ч при температуре 37°С для предотвращения неспецифического взаимодействия клеток с субстратом и снова трижды отмывали ФБ.

Распластывание клеток на субстратах

Суспензию клеток наносили на тёплые покровные стёкла или чашки Петри с иммобилизованными на них лигандами в количестве 2х104кл (100 мкл) на стекло и 5х106кл (4 мл) на чашку и культивировали при 37°С в атмосфере 5% С02. Для исследования динамики распластывания клеток на субстратах из общего числа чашек Петри или покровных стёкол через 10, 20, 30, 40, 50, 60 мин, 1.5 и 2 ч от начала распластывания изымали по одной чашке Петри или одному покровному стеклу для биохимического и цитологического анализа соответственно.

При исследовании динамики влияния ЭФР на клетки, распластанные на иммобилизованных лигандах, клетки инкубировали при 37°С в атмосфере 5% С02 1 ч и затем производили смену среды на среду ДМЕМ с ЭФР (100 нг/мл) и вновь помещали в инкубатор при тех же условиях. Через 5, 30, 60 мин и 2 ч после смены среды производили дальнейшее исследование.

При исследовании влияния на клетки, распластанные на иммобилизованных лигандах, цитохалазина Д клетки инкубировали при 37°С в атмосфере 5% С02 1 ч и затем производили смену среды на среду ДМЕМ с цитохалазином Д (2 мкг/мл) и вновь помещали в инкубатор при тех же условиях. Через 30 мин после смены среды одну чашку Петри или одно покровное стекло брали на анализ. В остальных среду с цитохалазином Д меняли на среду ДМЕМ с ЭФР (100 нг/мл) без цитохалазина Д и вновь помещали в инкубатор при тех же условиях. Через 5, 30, 60 мин и 2 ч после смены среды производили дальнейшее исследование (всего 5 чашек и 5 стёкол).

В качестве контроля действия ЭФР на клетки, обработанные цитохалазином Д, клетки, культивируемые на покровных стёклах, после их обработки цитохалазином Д, снова культивировали, но в среде ДМЕМ без цитохалазина Д и ЭФР. Через 5 и 30 мин после смены среды стёкла брали на морфологический анализ.

Для исследования динамики изменений актинового цитоскелета при распластывании клеток на иммобилизованных лигандах в течение 24 ч клетки культивировали только на покровных стёклах в среде ДМЕМ как описано выше. Анализ актинового цитоскелета проводили через 1, 3, 5, 24 ч после помещения клеток на лиганд. Изучение структуры актинового цитоскелета

Для изучения структуры актинового цитоскелета использовали метод флуоресцентного анализа (метод прямой флуоресценции). Покровные стёкла с культивированными на них, как было описано выше, клетками промывали один раз тёплым ФБ для удаления неприкрепившихся клеток. Прикрепившиеся клетки фиксировали

3.3 %-м формальдегидом (10 мин при комнатной температуре), пермеабилизировали 0.1 %-м Тритоном Х-100 (20 мин) и окрашивали родамин-фаллоидином (Molécula Probes, USA) 10 мин. Препараты анализировали с помощью микроскопа Axioskop (Zeiss), и фотографировали с помощью CD камеры. Изображение записывалось на жёсткий диск с помощью программы КС 100.

В зависимости от структуры и формы актинового цитоскелета выделяли несколько типов клеток. Для определения долевого соотношения выделенных клеточных типов подсчитывали клеточные типы в трёх областях препарата по 100 клеток в каждой (Петухова и др., 2004). Подсчитывали средние значения долей клеток, принадлежащих к разным морфологическим типам, определяли доверительные интервалы с уровнем значимости а = 0.05.

Изучение распределения в клетке субъединицы NFkB р65 и винкулина

При изучении перераспределений субъединицы NFkB р65 или винкулина для окраски клеток использовали метод двойной флуоресценции. Для этого после фиксирования и пермеабилизации клеток, как было описано выше, клетки инкубировали с первыми антителами в течение 30 мин при комнатной температуре и трижды промывали раствором 0.1 % Tween на ФБ. Затем клетки обрабатывали вторыми антителами в течение 30 мин в тех же условиях, промывали раствором 0.1 % Tween на ФБ и окрашивали актиновый цитоскелет раствором родамин-фаллоидина, как было описано выше. Препараты анализировали с помощью конфокального микроскопа Leica (Zeiss).

Для возбуждения флуоресценции использовали аргоновый лазер с длиной волны 488 им для FITC и HeNe лазер с длиной волны 543 нм для родамин-фаллоидина. Применяли раздельное сканирование для сигнала F1TC (флуоресценция в области 500530 нм) и родамин-фаллоидина (флуоресценция в области 580-640 нм). Совмещение двух сигналов проводили с помощью компьютерной программы Leica Confocal Software. Получение ядерных экстрактов

Клетки, распластанные на чашках Петри, промывали однократно тёплым ФБ, лизировали в лизирующем буфере (0.32 M сахароза, 2 мМ ЭДТА, 0.1% Тритон Х-100, 10 мМ Трис-HCl (pH 7.9), 1.0 мМ ДТТ и 0.5 мМ PMSF) и соскребали скребком при 0°С (на льду) в центрифужные пробирки. Ядра осаждали при 2000 g, температуре 4°С в течение 5 мин и очищали центрифугированием через 0.5 M сахарозу при 10000 g, температуре 8°С в течение 10 мин. Фракции, содержащие транскрипционные факторы, экстрагировали при 0°С (на льду) в течение 30 мин в 350 мМ растворе NaCl (350 мМ NaCl, 20 мМ HEPES (рН7.9), 25% глицерин, 1.5 мМ MgCl2 0.4 мМ ЭДТА, 0.4 мМ PMSF, 1 мМ ДТТ, 2 мМ Na3V04, Complete protease inhibitor cocktail (Roche, Germany)) и центрифугировали при 12000 g, температуре 8°C в течение 30 мин. Концентрацию белка в ядерных экстрактах определяли по методу М. Бредфорд (Bradford, 1976; Ферменты и нуклеиновые кислоты, 1997). Белки хранили при -70°С в аликвотах. Выход белка составлял примерно 20-30 мкг с одной чашки Петри.

Выявление ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов

Для выявления связывающей активности транскрипционных факторов использовали метод торможения ДНК-белковых комплексов в геле (electromobility-shiñ assay, Kingston R. Е. 1990). ДНК-белковые комплексы выявляли с помощью меченной по 5'-концу ДНК. Использовали двуцепочечные олигонуклеотиды API (c-jim), 5'-cgcttgatgagtçagccggaa-З'; kB 5'-agttgaggggactttcccaggc-3'; SRE (c-fos) 5'-ggatgtccatattaggacatc-3'. Олигонуклеотиды метили [y32P] АТФ (Amersham,U.K.) с помощью 1 -4 полинуклеотидкиназы (DNA 5'-end Labelling Kit #0812, MBI Fermentas, Lithuania) в прямой реакции согласно протоколу. Меченые одноцепочечные нуклеотиды (2.7 нг/мкл) отжигали

с антисенс-ДНК (5.4 нг/мкл) в ТЕ буфере (10 мМ Трис-HCl (рН8.0), 1 мМ ЭДТА) в присутствии 0.1 М NaCl в течение ночи (Маниатис и соавт., 1984). Двуцепочечные олигонуклеотиды использовали в реакции связывания с транскрипционными факторами. В реакции связывания транскрипционных факторов и олигонуклеотидов использовали ядерные экстракты с равными количествами белка (7 мкг), которые инкубировали в реакционном буфере (50 мМ KCl, 20 мМ ГЭПЭС (рН7.9), 10 мМ MgCl2 0.5 мМ ДТТ, 12% глицерин), содержащем олигонуклеотидную пробу (25000 ерш) и поли dl-dC ДНК (Polydeoxyinosinic-deoxycytidylic acid sodium salt, ICN) в отношении 1/800 соответственно. Реакцию проводили в течение 20 мин при комнатной температуре. В реакции связывания в присутствии специфического конкурента (немеченый двуцепочечный олигонуклеотид) с отношением меченого олигонуклеотида к немеченому 1/100 соответственно экстракты преинкубировали 15 мин при комнатной температуре. Антитела, специфичные к р65 субъединице транскрипционного фактора NFkB (р65 А; Santa Cruz), добавляли к экстракту за 30 мин до добавления меченого олигонуклеотида. По окончании реакции связавшиеся транскрипционные факторы разделяли методом электрофореза в нативном 4%-ном полиакриламидном геле (4% акриламид, 0.1% бисакриламид, ТАЭ (40 мМ Трис-НСН3СОО (рН7.5), 1 мМ ЭДТА)) в блоках геля 10x16 см при постоянном напряжении 100 В в ТАЭ буфере и высушивали на ватмане с помощью сушилки Gel Dryer m.583 (BIO-RAD) в течение одного часа при 80°С. Для получения видимого изображения высушенные гели экспонировали с рентгеновской плёнкой Kodak X-omat при -80°С.

Количественный анализ ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов

Количественный анализ ДНК-связывающей активности осуществляли, определяя интенсивность засвечивания рентгеновской плёнки соответствующими ДНК-белковыми комплексами после разделения в ПААГ. Для установления зависимости ДНК-связывающей активности от времени распластывания клеток каждый ДНК-белковый комплекс сканировали вдоль временной оси на участках, показанных на рис. 1,3,4 скобками. Денситометрию электрофоретических полос (в дальнейшем просто - «полос») проводили с помощью компьютерной программы Scion image 4.2. Результаты сканирования оформляли в виде графиков. Все полученные кривые для данной консенсусной последовательности для каждого лиганда сводили относительно среднего значения неспецифической полосы для клеток в суспензии. Эта полоса была выбрана, так как она стабильно присутствовала во всех опытах. Все значения, оказавшиеся меньше нуля, были приравнены нулю. Количества радиоактивной метки, нанесенной на каждую дорожку, при анализе были стандартизованы.

В связи с небольшим количеством повторов экспериментов (от 2 до 4) и особенностями изменений ДНК-связывающей активности ТФ не удалось провести стандартного статистического анализа данных. Полученные кривые сравнивали по форме, которая отражает все основные закономерности поведения электрофоретических полос.

Анализируя графики, отмечали периоды возникновения максимумов и минимумов ДНК-связывающей активности. В окончательный результат включали только максимумы и минимумы, стабильно повторяющиеся во всех повторах опытов.

Для проверки ошибок единичного измерения в двух опытах проведено по 3 независимых измерения одной и той же полосы с одного и того же рентгеновского снимка. Ошибка составила не более 700 отн. ед., что меньше выбранного доверительного интервала (1000 отн ед), который не влияет на форму кривых, так как максимальное значение интенсивности 100000 отн. ед. (на рисунках для удобства восприятия значения интенсивностей уменьшены в 1000 раз). Поэтому для других значений ошибку не

вычисляли. Все подсчёты, построения графиков и диаграмм проводили с помощью программы Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для того чтобы установить, могут ли влиять определённые типы пространственной организации актинового цитоскелета на уровень ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов, нужно было сначала формализовать эти типы актинового цитоскелета. Ранее в нашей лаборатории было описано несколько типов пространственной организации актинового цитоскелета после распластывания клеток А431 в течение 1 ч на фибронектине, ламинине 2/4 или антителах к рецептору ЭФР (Are et al, 2001). Авторы также попытались проследить процесс формирования этих типов актинового цитоскелета. Однако, оказалось, что в каждый момент времени, в который клетки брали на анализ, присутствовал не один какой-либо тип актинового цитоскелета, а несколько. Это сильно осложнило последующие исследования. Была проведена работа по выделению и подсчёту различных типов актинового цитоскелета после распластывания клеток на данных лигандах в течение 1 ч (Петухова и др., 2004). Основной вывод из неё: в популяции клеток А431, распластанных в течение 1ч на фибронектине, ламинине 2/4 или антителах к рецептору ЭФР, всегда существует доминирующий тип актинового цитоскелета, присутствующий в большинстве клеток популяции. Это дало основание для попытки сравнения уровня ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов с типами актинового цитоскелета. Предполагалось, что в случае какой-либо взаимосвязи активности транскрипционных факторов и актинового цитоскелета уровень ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов до и после организации данного типа пространственной организации актинового цитоскелета будет различаться.

В качестве исследуемой модели перестроек актинового цитоскелета использовали модель распластывания клеток на иммобилизованных лигандах фибронектине, ламинине 2/4 или антителах к рецептору ЭФР. Известно, что клетки в суспензионном состоянии не имеют сети актинового цитоскелета. Через 1 ч распластывания на лигандах сеть актиновых филаментов в клетках уже сформирована (Are et al., 2001). Кроме того, в распластываемых клетках на выбранных лигандах образуются специфичные типы актинового цитоскелета, сравнимые с теми, которые в 1992 году получили Холл и Риддли, исследуя действие малых ГТФ-аз Rho на организацию АЦ (Ridley, Hall, 1992).

Для клеток, распластанных на фибронектине, образование комплексов адгезии зависит от интегринов а5(31 (Genersch et al., 1996), a на ламинине - от интегриновых рецепторов а6(54 и а2[51 и от рецепторов с молекулярной массой 67 кДа (Черепанова и др., 2003). Причём оба интегриновых рецептора (абр4 и а2(31) принимают участие в миграции клеток (Калмыкова и др. 2003). Распластывание клеток на антителах к рецептору ЭФР предполагалось использовать в качестве контроля, когда адгезия приводит к образованию актинового цитоскелета, но не запускает сигнальных процессов, так как рецептор ЭФР не используется клеткой в процессе адгезии, а полученные на него антитела 5А9 не индуцируют его тирозинкиназной активности (Сорокин и др., 1989).

Вначале необходимо было обозначить временные границы исследования. Нужно было определить время первого исследуемого состояния клеток от помещения их на лиганд и последнего. Для определения последней границы провели исследование изменений актинового цитоскелета в интервале времени от 1 ч после помещения клеток на лиганд до 24 ч. Оказалось, что после 2-3 ч распластывания клеток на лигандах актиновый цитоскелет начинает постепенно дезорганизовываться, появляются клетки без сети актинового цитоскелета, изменяются формы клеток в сторону неправильных, вытянутых.

Клетки, в конечном счёте, открепляются. Эти явления, по-видимому, мало зависят от действия на клетки иммобилизованного лиганда.

Другая граница была определена в исследовании изменений ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов при культивировании клеток на гидрофильном пластике или полилизине в течение 20 и 60 мин после помещения клеток на подложку. Известно, что в течение этого времени ни на пластике, ни на полилизине клетки не распластываются и сеть актинового цитоскелета в них не образуется. В то же время ДНК-связывающая активность транскрипционных факторов в наших экспериментах изменялась. Это говорило о том, что сигнал от касания клеток к подложке проходит к ядру без наличия организованной сети актиновых филаментов и, соответственно, необходимо исследовать ДНК-связывающую активность транскрипционных факторов также в тех случаях, когда актиновый цитоскелет ещё не сформирован.

Таким образом, были определены временные границы исследования: начиная с самых ранних сроков после помещения клеток на лиганд, когда сеть актинового цитоскелета в них ещё не образовалась, до 2 ч распластывания, пока сохраняются выделенные специфические типы актинового цитоскелета.

На следующем этапе исследования провели определение и подсчёт долей типов пространственной организации актинового цитоскелета при распластывании клеток на лигандах. Оказалось, что существует закономерная смена типов актинового цитоскелета в течение процесса распластывания клеток.

В процессе проведения данного исследования стало очевидно, что установить конкретную зависимость активации транскрипционных факторов от стадий формирования актинового цитоскелета будет невозможно по следующим причинам. Во-первых, взаимодействие клеток с белками внеклеточного матрикса может влиять на организацию актинового цитоскелета и на активацию транскрипционных факторов параллельными, но независимыми путями. Количество посредников между актиновыми структурами и транскрипционными факторами тоже может быть различно. Во-вторых, процесс организации цитоскелета при распластывании клеток сопровождается одновременным образованием и перестройками различных актиновых структур, которые вместе образуют общий тип пространственной организации цитоскелета на данной ступени его формирования. Следовательно, невозможно связать изменения в активации того или иного транскрипционного фактора с появлением или исчезновением той или иной конкретной структуры актинового цитоскелета.

Поэтому было решено упростить задачу и попытаться в ходе данного исследования ответить на ряд более простых вопросов.

1. На каких стадиях формирования актинового цитоскелета при распластывании клеток активируются избранные транскрипционные факторы? Происходит ли эта активация однократно в процессе всего хода распластывания клеток или многократно? Зависит ли динамика их активации от типа лиганда?

2. Можно ли установить временные соответствия между стадиями формирования цитоскелета, когда превалирует определённый тип его пространственной организации, и активацией транскрипционных факторов?

Для клеток, распластанных на всех исследуемых лигандах, были выделены стадии формирования актинового цитоскелета и определены их временные границы.

1 а) Анализ динамики формирования актинового цитоскелета в процессе распластывания клеток на фибронектине показал, что через 10 мин после нанесения клеток на лиганд (рис. 1, /, а) 90 % всех клеток только прикрепились, структур актинового цитоскелета ещё нет, наблюдается диффузное окрашивание преимущественно по

периферии клеток (назовём эту стадию формирования актинового цитоскелета стадией олигомеризации). Через 20 мин (рис.1, I, б) примерно 80% всех клеток начинают распластываться, имеют в прямой проекции округлую форму, актиновый цитоскелет представлен тонкими пучками филаментов, расположенными циркулярно по периферии, и агрегатами актина в центре клеток (стадия краевых структур). Через 30 мин и далее до 2 ч доминируют округлые или полярные клетки (рис. 1, /, в) с пучками актина по всему объёму цитоплазмы, фокальными контактами, стресс-фибриллами и диффузно распределёнными агрегатами актина (стадия цитоплазматических структур). Максимум доли этих клеток (~ 75 %) приходится на промежуток времени от 40 до 50 мин после нанесения клеток на лиганд. Через 60 мин доля таких клеток снижается примерно до 52 %, хотя они и продолжают доминировать. Появляется больше полярных клеток. В то же время увеличивается до 30 % доля клеток с наиболее развитой, специфичной для распластывания на фибронектине организацией актинового цитоскелета (рис. 1, /, г). Большая доля этих клеток (~ 35 %) приходится на 90-ю мин (стадия развитого цитоскелета). Они имеют округлую или многоугольную форму, хорошо выраженные стресс-фибриллы и фокальные контакты, не имеют агрегатов актина. Через 2 ч после нанесения клеток на лиганд появляются полярные клетки только с агрегатами актина (рис. 1, I, д). Выявляются клетки ещё одного типа (рис. 1, I, е). Такие клетки уже через 10 мин после начала инкубации на лиганде хорошо распластаны, имеют хорошо выраженные стресс-фибриллы, которые расположены радиально от центра клеток. Общий вид и доля этих клеток (~ 10 %) в дальнейшем не изменяются («ранний» тип организации актинового цитоскелета, который, вероятно, зависит от стадии клеточного цикла). Следует отметить, что через 30 мин после посадки клеток на лиганд наблюдается наибольшее разнообразие форм цитоскелета.

Все стадии формирования актинового цитоскелета идут последовательно и занимают определённые промежутки времени. Соответственно этим промежуткам времени регистрируются максимумы долей клеток, характеризующихся наличием цитоскелета на соответствующей стадии формирования. Максимум долей клеток, имеющих актиновый цитоскелет на стадии олигомеризации, регистрируется в период от 5 до 15 мин после нанесения клеток на лиганд; на стадии краевых структур - в период 1525 мин; на стадии цитоплазматических структур - в период 25-55 мин; на стадии развитого цитоскелета - в период 55-120 мин. В отличие от выше перечисленных типов, клетки последнего типа в период своего максимума не составляют абсолютного большинства клеток. В это время по абсолютному значению продолжают доминировать клетки предыдущего типа.

1 б) На тех же сроках распластывания клеток проводили анализ специфической ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов, взаимодействующих с консенсусными последовательностями kB, SRE и АР!. Поскольку ранее было установлено, что выявленные комплексы специфичны, анализу подвергались все области образования электрофоретических полос, соответствующих данным ДНК-белковым комплексам. На рис. 1, II приведены типичные элетрофореграммы ДНК-белковых комплексов для клеток, распластанных на фибронектине. Обращает на себя внимание волнообразный характер изменения ДНК-связывающей активности для всех исследуемых транскрипционных факторов.

Так как исходное состояние культивируемых клеток (рис. 1,//, а, дорожка И) по степени ДНК-связывающей активности изучаемых транскрипционных факторов было различным, за начальную точку отсчёта принимали ДНК-связывающую активность

10 мин

20 мин

Î0

30-50 мин

60-90 мин

120 мин

Рис, L Динамика актинового цитоскелета и ДНК-связывающей активности NFkB, SRF и API в процессе распластывания клеток на фибронектине.

/ {а, б, в, г, д) - стадии формирования актинового цитоскелета; d клетки к акого типа присутствуют только на 120 мин их распластывания 18 % от общего числа клеток); е клетки, постоянно присутствующие на всех сроках исследования без изменения доли (- 10%); сверху над фотографиями указано время от начала распластывания, когда доля клеток данною типа максимальна; ж диаграмма, отображающая изменения доли клеток каждого тина (а, б, е. г) с течением времени; Величина рамки 60 х 78 мкм, II - динамика ДИК-связывающей активности белковых комплексов, содержащих транскрипционные факторы NFkB (а), SRF (6) и АР1 (#), Для АР] представлена полная фотография злектрофорефаммы* Электрофоре™ ческие полосы у нижнего края электрофоре! рам мы - не связавшийся с белком ДИК-фрагмент. Данный фрагмент использовали для оценки и получения значении активности связывания белковых комплексов с консенсусными последовательностями кВ> SRE и АР1\ lit денетограммы полос соответствующих эдекгрофореграммам (//, а-а); но вертикали оптическая плотность, отн, ед. И исходные клетки, выращенные на пластике; 0 - клетки в суспензионном состоянии; 2, S ДНК-белковые комплексы (квадра/ттии скобками обозначена ширина областей сканирования). На диаграммах ДНК-связывающей активности (///) погрешность одною измерения не превышает размера точки.

транскрипционных факторов в клетках после перевода их в суспензионное состояние (дорожка 0). В этом случае всегда наблюдали активацию транскрипционных факторов, и, таким образом, выравнивали исходное состояние клеток.

При анализе уровня ДНК-связывающей активности NFkB обнаружили, что общий ход кривых интенсивностей всех электрофоретических полос (комплексы 1, 2, 3 на рис. 1,111) совпадает. Легко выделяются области повышения активности для всех трёх ДНК-белковых комплексов. Выявляется 2 последовательных цикла возрастания ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов (первый - от 0 до 20-30 мин и второй - от 20-30 до 60-90 мин) со средним периодом первого цикла около 25 мин (025 мин) и второго - 50 мин (25-75 мин). В повторных опытах описанные выше соотношения сохранялись.

В отличие от хода изменений ДНК-связывающей активности белковых комплексов, содержащих NFkB, временной ход изменений уровня связывания SRE разными белковыми комплексами различается (рис. 1, III, б). Данные повторных опытов не дают полного совпадения. Только для комплекса 1 можно выявить во всех опытах постоянное увеличение ДНК-связывания через 30 мин от начала распластывания клеток.

Представляет интерес временное соотношение активности у двух выявляемых ДНК-белковых комплексов, содержащих API (рис. 1, III, в). В то время как у комплекса 1 во всех опытах выявляется максимум ДНК-связывающей активности в период от 20 до 30 мин после посадки клеток на лиганд, у комплекса 2 в этот период времени наблюдается минимум активности. Хотя регистрируемые пики активности API повторяются во всех повторных опытах, направление общего вектора изменений ДНК-связывания не сохраняется.

Сопоставляя между собой данные для всех трёх исследуемых транскрипционных факторов при распластывании клеток на фибронектине, следует подчеркнуть, что основные изменения в уровне их ДНК-связывающей активности приходятся на период от 10 до 40 мин после нанесения клеток на лиганд и выражаются в значительной частоте повышений и понижений этого уровня. В дальнейшем их ДНК-связывающая активность не приходит к исходным значениям. Пики активности транскрипционных факторов продолжают возникать, но с меньшей частотой. Хорошо заметны качественные различия в ходе кривых изменений активности разных транскрипционных факторов.

1 в) Сравнительный анализ изменений ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов и смены типов актинового цитоскелета при распластывании клеток на фибронектине показал, что для NFkB они, вероятно, изменяются согласованно (рис. 2). Действительно, минимум на 10-й мин соответствует стадии олигомеризации (рис. 2, о); максимум на 20-30-й мин - стадии краевых структур (рис. 2 б). Следующий минимум (40-50 мин) приходится на время абсолютного доминирования клеток с актиновым цитоскелетом на стадии цитоплазматических структур (рис. 2, в). В дальнейшем, одновременно с типом «в» появляются клетки на стадии развитого цитоскелета (рис. 2, г). Максимум во временном интервале 60-90 мин соответствует стадии клеток «г». Клеткам с цитоскелетом на стадии цитоплазматических структур соответствует, по-видимому, именно минимум ДНК-связывающей активности NFkB. Если бы это было иначе, то мы бы увидели длительное повышение ДНК-связывающей активности NFkB в течение всего времени его доминирования. В данном случае максимум в интервале 60-90 мин может объясняться присутствием в это время значительной доли клеток на стадии развитого цитоскелета. Анализ ДНК-связывания SRF и API при распластывании клеток на фибронектине и анализ ДНК-связывания транскрипционных

факторов при распластывании клеток на ламинине 2/4 или антителах к рецептору

О 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Время, мин

Рис. 2. Сравнительный анализ изменений уровня ДНК-связывающей активности NFkB клеток и смены их типов, соответствующих последовательны м стадиям формирования актинового пито скелета.

Данный j рафик напучен наложением графическою нзображсЕтия выделенных временных с : ади й формирования актинового mi госкелета {тёмные прямоугольные поносы) Eta ¡рафик, отображающий периоды максимальных it минимальных значений активности NFkIÍ {чёрная яолиашан линии), а, б, ■'. г KJieiKH чинов, соответс;нчюелих стадиям формирован^ jkj инокою ци:чх:ке.лпа; но юр^онi.uin отображено t¡4-мч. мин; на верлскалк указаны значения только максимума '"Г.! ) и минимума (min) Данные экяченлх не изображают истинные значения нигененвностей ллекгрофорегичеекп* полос, но г ч к.> фиксирую1! наличие iuiH отсутствие максимума или минимума. Вертикальными стрелками (нисходящими и восходящими) отображено соответствие максимумов и минимумов ДМК-связывающей акчинЕЮСГи NKkü стадиям формирования окчиноного цитоскелета.

ЭФР проводился аналогично показанному на рис, 2.

Для SRF сравнительный анализ изменений ДНК-связывающей активности и смены типов актинового цитоскелета при его формировании в течение распластывания клеток па фибронектине (рис. I) не даёт оснований для установления уверенных соотношений между ними. Повышение уровня ДНК-связывающей активности комплекса 1 SRF через 30 мин может быть связано с тем, что именно и этот промежуток времени наблюдается наибольшая скорость распластывания клеток. Несовпадение результатов в отдельных Временных интервалах свидетельствует, вероятнее всего, об отсутствий зависимости между уровнем ДНК-связывающей активности данного транскрипционного фактора и значимыми перестройками актинового цитоскелета в эти промежутки времени.

Д.чя API сравнительный анализ показал, что его ДНК-связывающая активность, вероятно, не согласуется со сменой типов актинового цитоскелета при его формировании в течение распластывания клеток на фибронектине. Гак, для комплекса I наблюдается наличие нескольких максимумов и минимумов активности во время существования максимума доли клеток, имеющих один тип актинового цитоскелета. В частности, он Имеет варьирующие сроки начала изменений ДНК-связывания, что даёт дополнительный основания к выводу о независимости изменений уровня его ДНК-связывающей активности и процесса формирования актинового цитоскелета. Уровень

ДНК-связывающей активности комплекса 2, по крайней мере, до 50 мин распластывания клеток изменяется в противоположной фазе к уровню комплекса 1 и тоже имеет варьирующие сроки начала изменений ДНК-связывания.

Таким образом, при распластывании клеток на фибронектине только ДНК-связывающая активность кВ-зависимых белковых комплексов наиболее вероятно изменяется согласованно со стадиями формирования актинового цитоскелета. Стабильная активация ДНК-связывающей активности комплекса 1 8Г1Р на 30-й мин после начала инкубации клеток на лиганде, по-видимому, связана с формированием сети актиновых филаментов при образовании ламелл в течение распластывания клеток.

Аналогичным образом анализировали ДНК-связывающую активность транскрипционных факторов при распластывании клеток на ламинине 2/4 или антителах к рецептору ЭФР (рис. 3; рис. 4).

2 а) Анализ динамики формирования актинового цитоскелета в процессе распластывания клеток на ламинине 2/4 показал, что через 10 мин после нанесения клеток на лиганд (рис. 3 I, а,) 95 % всех клеток имеют актиновый цитоскелет на стадии олигомеризации. Но, по сравнению с распластыванием на фибронектине, уже на этой стадии у клеток выявляется незначительная полярность. Через 20 мин большинство клеток достаточно хорошо распластаны. Подавляющая доля клеток (~ 85 %), несмотря на некоторые внешние различия, имеет актиновый цитоскелет на стадии образования цитоплазматических структур (рис. 3, I, б, в, г). В отличие от распластывания на фибронектине здесь нет фокальных контактов и стресс-фибрилл, пучки актина расположены, в основном, продольно или перпендикулярно длинной оси клеток. Через 30 мин общее соотношение клеточных типов изменяется мало. Структуры актинового цитоскелета утолщаются. В части клеток отчётливо проявляются «фокусы» актина, от которых отходят актиновые пучки (рис. 3,1, в'). Через 50 мин после нанесения клеток на лиганд наблюдается истончение актиновых структур, появление агрегатов, что, по-видимому, свидетельствует о начале следующей стадии реорганизации цитоскелета. Через 60-90 мин такую картину можно наблюдать практически во всех клетках. По форме через 90 мин распластывания около 78 % клеток напоминают клетки типа «в». Так же как и при распластывании клеток на фибронектине, выявляются клетки типа «ранней» организации актинового цитоскелета (рис. 3,1, с)). Его доля (~ 4 %) с течением времени не изменяется.

Таким образом, стадии формирования актинового цитоскелета и максимумы количества клеток того или иного типа при распластывании на ламинине 2/4 не совпадают. Одна и та же стадия образования цитоскелета может наблюдаться как в клетках доминирующего на данный момент типа, так и в клетках других типов. Выделили следующие стадии формирования актинового цитоскелета". 1 - стадия олигомеризации, 010 мин; 2 - стадия цитоплазматических структур, 20-40 мин; 3 - стадия реорганизации актинового цитоскелета, 40-90 мин.

2 б) Сопоставляя уровень ДНК-связывающей активности М7кВ (рис. 3, II, а) с выделенными стадиями формирования актинового цитоскелета при распластывании клеток на ламинине 2/4 (рис. 3, /), можно убедиться, что наибольшие значения активности приходятся на период 20-40 мин после посадки клеток на лиганд, то есть как раз на стадию образования цитоплазматических структур. Обе стадии несформированного цитоскелета характеризуются снижением уровня ДНК-связывающей активности №кВ. Общий ход ДНК-связывающей активности разных белковых комплексов ОТкВ совпадает. Совпадают также и данные повторных опытов.

2 в) Соответственно стадиям формирования актинового цитоскелета изменяется и уровень ДНК-связывающей активности ЗГ<1: (рис. 3, II, б). Отметим, что ход

кривых комплексов 2 и 3 в средней части диаграммы (рис. 3, III, б) сходен с ходом кривых для ОТкв (рис. 3, III, а). Но в отличие от ОТкВ кривые уровней ДНК-связывающей активности комплекса 1 и комплексов 2, 3 у БИР идут в противофазе друг к другу.

Как и в случае распластывания клеток на фибронектине, ход ДНК-связывающей активности разных белковых комплексов, содержащих АР1, не совпадает (рис. 3, II, в, III, в). Имеется несогласованность начала изменений ДНК-связывания (период от 0 до 10 мин) обоих белковых комплексов. Наблюдается несоответствие значений уровня ДНК-связывания комплекса 2 на одних и тех же сроках в разных опытах. Ход изменений ДНК-связывающей активности комплекса 1 в разных опытах сходен, но пики активности довольно сильно смещены относительно друг друга так, что периоды их возникновения не совпадают со стадиями формирования актинового цитоскелета.

Таким образом, при распластывании клеток на ламинине 2/4 ДНК-связывающая активность ОТкВ и Б И7 изменяется, по-видимому, согласованно со стадиями формирования актинового цитоскелета, а ДНК-связывающая активность АР1 - нет.

3 а) Актиновый цитоскелет всех клеток через 10 мин после нанесения на антитела к рецептору ЭФР находится на стадии олигомеризации. Через 10 мин распластывания на антителах клетки явно менее распластаны, чем на фибронектине или ламинине к этому же времени (рис. 4,1, а). Они абсолютно не полярны. Через 20 мин 55 % клеток начинают активно распластываться (рис. 4,1, б). Они имеют округлую форму и покрыты множеством мелких микроворсинок, содержащих пучки актина. В цитоплазме другие структуры актинового цитоскелета не выявляются, наблюдается только диффузное окрашивание клеток с более яркой циркулярной областью ближе к периферии, от которой отходят микроворсинки (стадия первичных структур). Через 30 мин 62 % клеток имеют очень характерные цитоскелетные структуры, состоящие из коротких пучков актина, сходящихся к одному центру (рис. 4,1, в). Таких центров относительно немного. Они расположены правильно по кругу, ограничивая объём клетки (стадия центрообразования). Клетки с цитоскелетом на стадии центрообразования постепенно (через 60 мин) сменяются клетками, характеризующимися очень тонкой ламеллой. Эта ламелла с трудом выявляется на препаратах (рис. 4,7, г) (стадия тонкой ламеллы). В это же время появляются хорошо распластанные клетки с наиболее развитой организацией актинового цитоскелета. Максимум этих клеток приходится на 120-ю мин (стадия развитого цитоскелета; рис. 4, /, <)). Клетки имеют правильную округлую форму, широкую круговую ламеллу с актином по краю, кольцевой пояс волокнистых актиновых структур ближе к центру и крупный агрегат актина в центре клетки.

Таким образом, клетки, содержащие актиновый цитоскелет на стадии олигомеризации, доминируют в период времени от 5 до 15 мин после помещения клеток на антитела, на стадии первичных структур - от 15 до 25 мин, на стадии центрообразования - от 25 до 50 мин, на стадии тонкой ламеллы - от 50 до 100 мин и на стадии развитого цитоскелета - от 100 мин и далее.

3 б) Сравнение изменений ДНК-связывающей активности МРкВ и ЖР с ходом формирования актинового цитоскелета при распластывании клеток на антителах к рецептору ЭФР выявляет вероятную их согласованность. Первый пик ДНК-связывающей активности №кВ совпадает со стадией центрообразования, а второй - со стадией развитого цитоскелета. Наоборот ДНК-связывающая активность комплекса 1 БИР наиболее высока на стадиях первичных структур и тонкой ламеллы. Изменения ДНК-связывающей активности АР1 не согласуются со стадиями формирования актинового цитоскелета. Здесь опять, как и во всех предыдущих случаях, наблюдается несогласованность начала изменений ДНК-связывания.

90 мин

10 120 мин

10 мии

3d-50 мин

50 мим

d(NFkB)

в(АР1)

J0 гэ 30 40 50 60 rJQ 120

Время, мим

к t •} » з <4 s «i ф

Время уин

и ft ^ за ю с К w к »Л бреия «Ин

Рис. 3. Динамика актинового цитоскелета и ДНК-евязываюшей активности транскрипционных факторов NFkB* SRF и API в процессе распластывания клеток на ламинине 2/4.

/ {а, 6, в..') варианты клеток (не соответетиуют стадиям формирования актшшкого цнтоекелета, объяснения и тексте i; ó клетки типа , поста йн но црисучстнуклцею на всех сроках исследования беч нч членений до ян от oóuwi о числа клеток ( 4 %); н' - клетки nina «в» череч 30-50 мин от начала распластывания. стрсчкаш/ покачаны «фокусы» схождения пучков актина. клетки шпа «.'» череч 60-90 мин; с диаграмма, отображающая изменения долей клеток каждого тина (a, ó, в, г) с течением времени, 11 и /// то же, что и на рис. 1.

Таким образом, при распластывании клеток на антителах 5А9 к рецептору ЭФР согласованно со стадиями формирования АЦ изменяется ДНК-свя*ывающая активность

NFkB и SRF, а ДНК-связывающая активность API изменяется со стадиями формирования в клетках АЦ не согласованно.

4 Для того чтобы установить, какие из образующихся пучков актиновых фнламентов являются истинно стресс-фибриллами, было проведено выявление винкулина на разных стадиях распластывания клеток на фибронектине и ламинине 2/4 в течение 2 ч.

При распластывании клеток на фибронектине винкулин уже на стадии краевых структур частично сосредотачивается на концах актиновых пучков, что может свидетельствовать об образовании стресс-фибрилл на этой стадии формирования актинового цитоскелета. Остальная часть цитоплазмы клеток на стадии краевых структур, кроме области ядра, остаётся свободной от винкулина. На стадии цитоплазматических структур агрегаты винкулина на концах актиновых филаментов укрупняются. Центральная область, содержащая винкулин, расширяется к периферии клеток. На стадии развитого цитоскелета чётко прослеживаются стресс-фибриллы с фокальными контактами на концах, в которых содержится винкулин. Остальная часть винкулина более или менее равномерно распределяется по всему объёму цитоплазмы клеток.

При распластывании клеток на ламинине 2/4 винкулин на более ранних стадиях формирования актинового цитоскелета обнаруживается в несколько большей степени в ядерной и околоядерной областях, чем на периферии клеток. На более поздних стадиях винкулин более или менее равномерно распределяется по всему объёму цитоплазмы клеток. Такое распределение винкулина напоминает распределение винкулина при распластывании клеток на фибронектине. Но в отличие от фибронектина, при распластывании клеток на ламинине винкулин в структурах на концах актиновых пучков не наблюдался.

Таким образом, при распластывании клеток на фибронектине точки роста стресс-фибрилл, по-видимому, образуются уже на самых ранних стадиях формирования актинового цитоскелета. Одновременно с процессом формирования стресс-фибрилл происходит постепенное перераспределение винкулина, не участвующего в образовании фокальных контактов, от области ядра к периферии клеток. При распластывании клеток на ламинине 2/4 ни на какой стадии формирования актинового цитоскелета, по-видимому, не наблюдается образование стресс-фибрилл.

Обобщая полученные результаты, можно сказать, что каждой стадии формирования актинового цитоскелета при распластывании клеток на лигандах соответствует определенный тип его пространственной организации. Причем при распластывании клеток на фибронектине или антителах к рецептору ЭФР каждой стадии формирования актинового цитоскелета соответствует определённый выделенный нами тип клеток, а при распластывании клеток на ламинине 2/4 один и тот же тип цитоскелета могут иметь клетки различных типов.

5 При исследовании изменений ДНК-связываюгцей активности всех ТФ оказалось, что они не носят характера монотонного повышения активности или поддержания её на одном уровне, а имеют несколько пиков активности. Частота возникновения пиков уменьшается по мере распластывания клеток в среднем в 1.5-2 раза для всех ТФ. Так, если время между ближайшими пиками в начале распластывания клеток составляет 15-25 мин, то к 1-1,5 ч распластывания - 40-50 мин.

Колебания уровня активности наблюдали и ранее для NFkB, активацию которого исследовали при стимуляции фактором некроза опухолей (TNFa) в нескольких клеточных линиях (Hoffman et al„ 2002; Ting, Endy, 2002; Nelson et al., 2004).

Исследуя ДНК-связывающую активность тем же методом торможения в геле, Хоффманн с сотрудниками на мышиных фибробластах, нокаутированных по генам ТкВ р и £, обнаружили пики активности NFkB с периодом 1.5-2 ч, который тоже увеличивался по мере удаления от начала воздействия TNFa (Hoffmann et al., 2002). Примерно такой же по длительности цикл (100 мин) перемещения NFkB из ядра в цитоплазму и обратно был обнаружен в нейробластомиых клетках под действием TNFa в опытах других авторов (Nelson et al., 2004).

Выявленные в данной работе колебания активности NFkB, SRF и API не могут быть объяснены только лишь миграцией факторов из цитоплазмы в ядро и обратно. Так например, SRF и API имеют преимущественно ядерную локализацию (Ding et al., 2001; Hess et al., 2004). Вероятно, здесь могут играть роль быстрые конформационные перестройки молекулы ТФ в результате действия сигнальных молекул, поступающих из цитоплазмы. Причину и механизм колебаний предстоит ещё выяснить.

Сравнивая изменения ДНК-связывающей активности разных ТФ, можно констатировать, что профили этих изменений имеют характерный вид как для каждого ТФ, так и для каждого исследуемого лиганда. Следует отметить, что максимумы и минимумы активности ТФ отражают не увеличение или уменьшение реакционной способности фактора, а количество его молекул, связавшихся с ДНК.

Обращает на себя внимание тот факт, что для каждого из изученных ТФ имеется несколько ДНК-связывающих белковых комплексов. Из различий их подвижности следует, что они имеют разную молекулярную массу, которая должна определяться их различным белковым составом, что, в свою очередь, может определять особенности их трансактивирующей активности, то есть запуск экспрессии различных генов.

В этой связи показательно, что ДНК-связывающая активность белкового комплекса I SRF, который, по всей видимости, содержит кроме самого димера SRF ещё один из белков Ets-семейства (p62TSF, Elk или SAP-1), образуя тройной комплекс (Zinck et al., 1993), в данной серии опытов всегда противоположна по своему значению активности других комплексов, в состав которых входит только димер SRF (Zinck et al., 1993). Эти данные могут объяснять дифференциальную активность генов, зависимых от SRF.

Сходным образом активность различных ДНК-связывающих комплексов NFkB тоже имеет характерные отличия в определённые периоды распластывания клеток. Особенно это касается самого высокомолекулярного комплекса. Учитывая, что данный транскрипционный фактор может взаимодействовать с актином как прямо (Are et al., 2000), так и опосредованно (Бабаков и др., 2004), вполне возможно допустить, что значимые влияния на ДНК-связывающую активность различных его белковых комплексов могут быть обусловлены особенностями реорганизаций цитоскелета в процессе распластывания клеток.

При сопоставлении изменений морфологии и активации ТФ уровень ДНК-связывания для некоторых из них можно соотнести со стадиями формирования АЦ. Наиболее чётко с этими стадиями соотносится активность NFkB. Обращает на себя внимание, что пики его активности приходятся на стадии формирования АЦ, которые характеризуются наличием хорошо выраженных контактов при распластывании клеток на фибронектине. На ламинине 2/4 и антителах аналогичным является наличие так называемых «фокусов», которые тоже, по-видимому, представляют собой какие-то комплексы адгезии, так как к ним крепятся пучки микрофиламентов.

ДНК-связывающая активность SRF зависит, по-видимому, не столько от наличия стресс-фибрилл и разнообразных пучков актиновых филаментов, сколько от формирования сети актиновых филаментов в процессе роста ламеллы на периферии клетки

или на её ведущем крае, Так, его активность наблюдалась именно в фазы либо быстрого распласт ывания клеток, либо их поляризации, в отличие от ОТкВ, для активации которою характерны устойчивые состояния АЦ. Это предположение подтверждают и данные о влиянии глобулярного актина на активность й!?]- (5ойгорои1о$ е! а!., 1999) и влиянии па включение глобул актина в актинон!, 1е фил а менты (ЗсЬгаН е( а!., 2002),

20 мин

30 40 Время, мин

60-00 мин

120 мин

100 #80;

I* бо.;

Б S

¡ 40

20 0

III

Рис, 4. Динамика а «типового u¡ носке лета и ДНК-свнзыватшеи активности транскрипционных факторов NFkB, SRF и API в процессе расшатывания клеток на антителах 5А9 к рецептору ЭФР.

I^ci: 1Ч1ИЫ : I - ■);■ COO", L";ey ю[ с Iа.'.ичм формирования üMHM(i;í¡i: v ЦНП>1ЖС;|(М в к Л-. ке, ОГч.яснения чо же.

■v.v ii к |'|'л i и

э(мгкв)

за 1Ю

ЯШ' '

■«I-

nJp

и а «9 л w м « Л! Время, чин

В процессе анализа разных экспериментальных подходов в настоящей работе не удалось выявить соответствий между динамикой ДНК-связывающей активности API и сменой клеточных типов ни на одном из исследованных лигандов. По-видимому, активация API не имеет отношения к реорганизациям АЦ, и в этом случае активирующую роль выполняют другие механизмы. Это может говорить о том, что АЦ не принимает участия в регуляции проведения любых сигналов от мембраны клетки к её ядру.

Из полученных данных следует, что формирование того или иного типа АЦ, а также профиль изменений уровня ДНК-связывающей активности того или иного ТФ зависят от лиганда, на котором распластываются клетки и, соответственно, от образующихся сложных белковых комплексов адгезии.

Использованные в работе иммобилизованные лиганды фиброиектин, ламинин 2\4 и онтитела к рецептору ЭФР различаются между собой по количеству мест связывания с поверхностными рецепторами клетки. Так, например, ламинин имеет около 10 таких аминокислотных последовательностей, фибронектин - значительно меньше, а антитела взаимодействуют только с одним рецептором. Поэтому вполне возможно, что взаимодействие клетки с субстратом может осуществляться не однократно, а иметь несколько стадий взаимодействия, когда могут происходить последовательно контакты с разными участками белковой молекулы. Кроме того, рецептор ЭФР при взаимодействии со специфическим лигандом может взаимодействовать с другими поверхностными рецепторами (Riese et al., 1996; Miyamoto et al., 1996).

Принимая во внимание сложность таких взаимодействий, можно было ожидать, что при распластывании клеток на ранних стадиях будет происходить ряд последовательных реакций, индуцирующих активацию соответствующих ТФ. Волнообразный характер ДНК-связывающей активности ТФ в процессе распластывания вполне согласуется с таким предположением.

Оценить вероятность и экспериментально проверить это предположение, по-видимому, удастся только с помощью выключения из взаимодействия с лигандом тех или иных поверхностных рецепторов, например, путём предобработки клеток антителами к соответствующим интегринам. Подобный подход уже был использован для клеток А431 и нормальных кератиноцитов для оценки роли разных рецепторов в осуществлении миграции клеток, распластанных на лиганде (Калмыкова и др. 2003).

Полученные при распластывании клеток результаты необходимо было проверить и по возможности уточнить. За основу последующих проверок взяли действие на сеть актиновых филаментов ЭФР, который, как показано, при воздействии на клетку приводит сначала к дезорганизации, а потом к восстановлению её актиновой сети (Are et al., 2001).

6 а) С этой целью провели выделение и подсчёт клеточных типов при воздействии ЭФР на клетки, распластанные на лигандах в течение 1 ч. Оказалось, что после быстрой разборки АЦ (в течение 5 мин), когда все клетки похожи друг на друга, популяция клеток, распластанных на фибронектине и ламинине, распадается на два основных типа (через 30 мин после начала инкубации клеток с ЭФР). Часть клеток возвращается к исходному типу. Другая часть тоже восстанавливает сеть актиновых филаментов, но к исходному типу не возвращается. Эти клетки характеризуются наличием фокальных контактов как у клеток, распластанных на фибронектине, так и на ламинине. Последний факт выявлен впервые потому, что обычно при распластывании клеток на ламинине типичные фокальные контакты не обнаруживаются. Такое действие ЭФР в данном случае можно объяснить только взаимодействием рецепторов ЭФР с интегриновыми рецепторами. Данное предположение подтверждают результаты экспериментов других авторов о

кластеризации интегриновых и ЭФР-рецепторов (Miyamoto et al., 1996), а также данные о прямом взаимодействии ЭФР-Р и актина (Van der Heyden et al., 1997).

6 б) Анализ ДНК-связывающей активности ТФ показал, что её волнообразные изменения сохраняются после 1 ч распластывания клеток в течение всего времени проведения экспериментов по воздействию на клетки ЭФР. Более того, изменения ДНК-связывающей активности ТФ в результате воздействия на клетку ЭФР тоже имеют волнообразный характер. Это создавало дополнительные трудности для анализа уровня ДНК-связывающей активности ТФ, поскольку он зависел, фактически, от сложения двух волновых процессов, точные периоды и амплитуды которых были не известны.

Таким образом, выявляемый при денситометрии уровень ДНК-связывающей активности являлся результатом сложения действия ЭФР на активность ТФ и её волнообразных изменений, происходящих независимо от действия ростового фактора.

Чтобы устранить эти недостатки для каждой исследуемой временной точки был сделан свой контроль: клетки, распластанные на том же лиганде в течение всего времени от помещения их на лиганд и инкубации с ЭФР. Полученные таким образом контрольные значения активности вычитались из ответных значений, что позволяло выявить истинное влияние ЭФР на уровень ДНК-связывающей активности ТФ.

Сравнительный анализ изменений уровня ДНК-связывающей активности ТФ и перестроек АЦ в данной серии опытов подтвердил все сделанные ранее заключения и внёс несколько уточнений: изменения уровня ДНК-связывающей активности белкового комплекса 2 NFkB согласуются с процессами сборки и разборки стресс-фибрилл и (или) пучков актиновых филаментов; изменения уровня ДНК-связывающей актинвости белкового комплекса 1 SRF согласуются с процессами сборки и разборки сети актиновых филаментов с основании ламеллы.

7 В следующей серии экспериментов ограничились только исследованием изменений уровня ДНК-связывающей активности комплекса 2 NFkB и комплекса 1 SRF, которые изменялись согласованно с перестройками АЦ. Главная задача этой серии экспериментов, как и предыдущей, заключалась в подтверждении и уточнении ранее полученных результатов (1. Изменения уровня ДНК-связывающей активности комплекса 2 NFkB согласуются с процессом сборки-разборки стресс-фибрилл и пучков актиновых филаментов. 2. Изменения уровня ДНК-связывающей активности комплекса 1 SRF согласуются с процессом сборки-разборки сети актиновых филаментов в основании ламеллы клеток). Однако, в отличие от опытов с ЭФР, где использовался прямой подход (т. е. сделанные заключения относили к предшествующим заключениям, полученным в опытах по распластыванию клеток в течение 1 ч), нужно было использовать обратный подход (т. е. предсказать заранее, каким образом будет изменяться уровень ДНК-связывающей активности ТФ в результате того или иного воздействия и сравнить результат опыта с предсказанным). Фактически, нужно было смоделировать уже изученные в данном исследовании процессы разборки или сборки сети АЦ. Такой подход был необходим для корректного доказательства сделанных заключений, поскольку все данные были получены одним методом без использования альтернативных подходов.

За основу будущей модели взяли действие ЭФР на АЦ и ДНК-связывающую активность ТФ. Это действие можно разделить на две фазы: фазу дезорганизации сети АЦ и фазу последующей организации АЦ (Are et al., 2001). Таким образом, создавалась возможность смоделировать действие ЭФР, заменив его на какой-либо другой агент, в течение первой или второй фазы действия. На наш взгляд, удобнее всего было моделировать фазу дезорганизации АЦ, поскольку при моделировании второй фазы действия ЭФР было бы непонятно, что мы наблюдаем: продолжающееся действие ЭФР

или того реагента, которым воздействуем на клетки. ЭФР-Р обладает достаточно высоким сродством к ЭФР (Cohen et al., 1982b), комплекс ЭФР-ЭФР-Р интернализуется (Никольский и др., 1987) и даже может попадать в ядро клетки (Holt et al., 1995). Что же касается моделирования первой фазы действия ЭФР, то существует достаточное количество веществ, приводящих к дезинтеграции АЦ и легко удаляемых из клеток. Одно из таких веществ - цитохалазин Д. В нашем случае нужно было разрушить сеть АЦ цитохалазином Д, смоделировав первую фазу действия ЭФР, потом отмыть его и добавить ЭФР, который осуществлял бы собственное действие во вторую фазу.

Действие цитохалазина Д на АЦ заключается в дезорганизации сети актиновых филаментов, димеризации глобулярного актина, гидролизе актиновой АТФ до АДФ и кепировании образовавшихся димеров с «-» конца (Sampath, Pollard, 1991). Изменения трансактивирующей активности NFkB и SRF в ответ на воздействие цитохалазином Д изучали с помощью регистрации увеличения или уменьшения экспрессии NFkB- и SRF-зависимых генов. Например, в ответ на воздействие цитохалазина Д показано повышение экспрессии nfkb-зависимого гена IL-8 эпителиальных клеток тонкого кишечника (Nemeth et al., 2004), SRF-зависимой экспрессии гена а-актина кардиомиоцитов (Wei et al., 2001) и гена fos мышиных клеток линии NIH3T3 (Sotiropoulos et al., 1999). Влияние цитохалазина Д на ДНК-связывающую активность изучалось только для NFkB. Обнаружено повышение уровня ДНК-связывания NFkB в ответ на воздействие цитохалазина Д (Nemeth et al., 2004). Однако во всех случаях повышение как трансактивирующей, так и ДНК-связывающей активности наблюдали не ранее чем через 2 ч после начала инкубации клеток с цитохалазином Д. На более ранних сроках данные характеристики никто не смотрел.

Мы использовали инкубацию клеток с цитохалазином Д в течение 30 мин. За это время происходит полная разборка сети актиновых филаментов.

Чтобы проверить, работает ли наша модель, сначала провели эксперименты с клетками, выращенными на пластике. В качестве исходного процесса, как уже говорилось, было взято действие ЭФР на АЦ и ДНК-связывающую активность ТФ. С результатами воздействия ЭФР сравнивали результаты последовательного действия ЭФР и цитохалазина Д. Наше предположение подтвердилось. Действительно, во всех принципиальных моментах действие ЭФР и последовательное действие цитохалазина Д и ЭФР соответствовали друг другу. Таким образом, создалась возможность предсказать, как будет изменяться ДНК-связывающая активность ТФ при последовательном воздействии цитохалазина Д и ЭФР на клетки, распластанные на лигандах.

Результаты экспериментов с цитохалазином Д подтвердили сделанные ранее заключения: изменения уровня ДНК-связывающей активности белкового комплекса 2 NFkB согласуются с процессами сборки и разборки стресс-фибрилл и (или) пучков актиновых филаментов; изменения уровня ДНК-связывающей активности белкового комплекса 1 SRF согласуются с процессами сборки и разборки сети актиновых филаментов в основании ламеллы. Кроме того, оказалось возможным сделать дополнительное предположение относительно изменений уровня ДНК-связывающей активности SRF. Уровень его активности в отсутствие ламелл и, соответственно, сети актиновых филаментов в её основании, соотносится, по-видимому, с концентрацией глобулярного актина в цитоплазме клетки.

Таким образом, наличие тех или иных стабильных состояний - типов пространственной организации АЦ может мало влиять на проведение сигнала, ДНК-связывающую активность ТФ и, следовательно, экспрессию генов. Скорее всего, на все эти процессы влияет процесс реорганизации тех или иных структур АЦ. Так, в наших

экспериментах получилось, что на ДНК-связывающую активность SRF могут влиять именно процессы сборки и разборки сети актиновых филаментов в основании ламелл и (или) уменьшения или увеличения G-актина, а на активность NFkB - процессы сборки и разборки стресс-фибрилл или пучков актиновых филаментов.

Все наши данные относительно SRF согласуются с исследованиями, сделанными ранее (Sotiropoulos et al., 1999; Posern et al., 2004). По данным работам следует, что активность SRF зависит от количества глобулярного актина. Если G-актин включается в фибриллы, то, соответственно, действие его на SRF становится меньше за счёт выключения из взаимодействия с SRF связавшихся молекул актина. Можно предположить подобный механизм и для регуляции NFkB.

8 Чтобы уточнить возможный механизм влияния быстрых перестроек АЦ на ДНК-связывающую активность NFkB, провели исследование перемещений р65 в течение распластывания клеток на лигандах и воздействия на распластанные клетки ЭФР и (или) цитохалазином Д. Направленность перемещений р65 сравнивали с направлением изменений уровня ДНК-связывающей активности комплекса 2 NFkB. Следует отметить, что по нашим данным, только уровень ДНК-связывающей активности комплекса 2 NFkB согласуется с перестройками АЦ. Именно в этом комплексе другими авторами обнаружено присутствие субъединицы р65, в то время как ДНК-белковый комплекс 3, по их данным, содержит только р50 и р52 (Nemeth et al., 2004). По нашим данным, субъединица р65 присутствует и в ДНК-белковом комплексе 3 наряду с другими формами NFkB, но в значительно меньших количествах относительно этих форм, чем в комплексе 2. По-видимому, именно по этой причине изменения уровня ДНК-связывающей активности комплекса 3 NFkB не во всех случаях соотносятся с перестройками АЦ.

Как и следовало ожидать, длительно протекающие перемещения р65 из цитоплазмы клеток в ядро и обратно не согласовались с быстрыми изменениями его уровня ДНК-связывающей активности. Более того, на ранних сроках воздействия на клетки ЭФР или цитохалазина они были разнонаправленными: в то время как р65 следовал из цитоплазмы в ядро, уровень его ДНК-связывающей активности в ядре не увеличивался, а, наоборот, падал. Эти данные говорят об отсутствии прямой зависимости ДНК-связывающей активности р65 от его ядерно-цитоплазматических перемещений.

NFkB в цитоплазме находится в составе надмолекулярных комплексов. По крайней мере, часть этих комплексов, по-видимому, физически связаны с АЦ (Are et al., 2000). В состав комплексов могут входить не только ингибиторные субъединицы ГкВ, но и другие регуляторные молекулы, как в сплайсосоме (Habib et al., 2001), и актин-связывающие белки (Бабаков и др., 2004). При разрушении сети АЦ эти комплексы могут не дисоциировать на отдельные составляющие или дисоциировать частично. Показано, что для транспорта NFkB в ядро и обратно не обязательно высвобождение его от 1кВ (Huang et al., 2000). Таким образом, видимо, неактивный NFkB в комплексе с другими белками может находиться в ядре клетки и мигрировать в этом состоянии между цитоплазмой и ядром. Такую мысль косвенно подтверждает наличие на наших электрофорезах ядерных экстрактов с мечеными кй-олигонуклеотидными последовательностями (не всегда заметного) наиболее медленного комплекса 1.

С другой стороны, в ядре клеток А431 всегда присутствует некоторое количество свободного NFkB (Verma et al., 1995; Дариева и др., 1999). Именно этот NFkB может быстро реагировать на быстрые перестройки АЦ. Прямое взаимодействие G-актина и NFkB не показано. Однако показано взаимодействие с NFkB актинина 4 (Бабаков и др., 2004). Кроме того, этот белок обнаружен также в ядре (Honda et al., 1998). Учитывая известный механизм действия глобулярного актина на активность SRF, можно

предположить похожие взаимодействия для NFkB с актишшом 4. Такое предположение подтверждают также наши неопубликованные данные о том, что актинии 4 присутствует в фокальных контактах и взаимодействует со стресс-фибриллами или пучками актиновых филаментов. Именно с перестройками этих структур связана, по настоящим исследованиям, и активность NFkB.

Таким образом, актинии 4 представляется удобным кандидатом для осуществления регуляторных воздействий, связанных с перестройками АЦ, на ДНК-связывающую активность NFkB.

ВЫВОДЫ

1. Распластывание клеток на иммобилизованных лигандах сопровождается закономерной сменой типов пространственной организации актинового цитоскелета, наблюдаемых в большинстве клеток популяции в течение определённых временных интервалов. Особенности формирования и смена типов актинового цитоскелета зависят от лиганда, на котором распластываются клетки.

2. При распластывании клеток А431 в течение 2 ч на иммобилизованных лигандах и при инкубации в течение 2 ч с ЭФР клеток, распластанных на иммобилизованных лигандах, уровень ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов NFkB, SRF и API изменяется волнообразно с коротким периодом 15-40 мин. Особенности изменений уровня ДНК-связывающей активности данных транскрипционных факторов зависят от типа лиганда, на котором распластываются клетки.

3. Изменения уровня ДНК-связывающей активности белкового комплекса 2, содержащего субъединицу р65 NFkB, и тройного белкового комплекса, содержащего димер SRF и один из белков Ets-семейства согласуются с перестройками актинового цитоскелета. Изменения ДНК-связывающей активности API с перестройками актинового цитоскелета не согласуются. Изменения ДНК-связывающей активности NFkB согласуются с процессами сборки-разборки стресс-фибрилл, пучков актиновых филаментов и фокальных контактов. Изменения ДНК-связывающей активности SRF согласуются с процессами сборки-разборки сети актиновых филаментов в основании ламелл клеток.

4. Прямой зависимости короткопериодических изменений уровня ДНК-связывающей активности NFkB от ядерно-цитоплазматических перемещений р65 не выявлено.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Петухова О. А., Туроверова Л. В., Кропачсва И. В., Емельянов А. П„ Пинасе Г. П. 2001. Изменения в популяции клеток эиидермоидной карциномы А431, распластанных на разных субстратах» при действии лизофосфатидидовой кислоты (ЛФК) и эпидермального фактора роста (ЭФР) в соответствии со структурой а кг и нового цитоскелета. Цитология. 43(9): 884.

2. Петухова О. А., Туроверова Л. В., Кропачева И. В., Емельянов А. И., Пинасе Г. П. 2002. ДНК-связываюшая активность факторов транскрипции SRF, NFkB И API при изменении организации актинового цитоскелета под влиянием иммобилизованных белков внеклеточного матрикса. Тезисы научных докладов II] Съезда Биохимического общества, СПб, с.411.

3. Petoukhova О. A., Turoverova L. У., Kropacheva I. V., EmeVyanov A. N., PinaevG.P. 2003. DNA binding activities of transcription factor SRF, NFkB and API in A431 cells spread on immobilized extracellular matrix proteins. Eur. J. Biochem. V. 270. Suppl. 1. p. 98.

4. Емельянов A. tl... Петухова О. А., Туроверова Л. В., Кропачева И. В., Пииаев Г. П. 2003. Динамика ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов SRF, АР-1 и NFkB ядерных экстрактов клеток А431 в зависимости от времени распластывания на фибронектнне, ламинине 2/4 и антителах к рецептору ЭФР. Цитология. 45(9): 873.

5. Петухова О. А, Туроверова Л. В., Емельянов А. Н., Кропачева И. В., Пииаев Г. П. 2005. ДНК-связывающая активность транскрипционных факторов, взаимодействующих с последовательностями SRE, NF-кВ и АР-1» индуцированная адгезией клеток А431, коррелирует с перестройками актинового цитоскелета. Цитология. 47(2): 175183.

6. Емельянов А. Н., Большакова А. В., Петухова О. А., ТуровероваЛ. В., Кропачева И. В., Пинаев Г. П. 2005. Особенности распределения р65 субъединицы транскрипционного фактора NF-kB в клетках А431, распластанных на фибронектине, ламинине или антителах к рецептору ЭФР. Цитология. 47(9): 808.

7. Емельянов А. Н., Большакова А. В., Петухова О. А., ТуровероваЛ. В., Кропачева И. В., Пинаев Г. П. 2005. Распределение р65 субъединицы транскрипционного фактора NFkB в клетках А431, распластанных на фибронектине, ламинине или антителах к рецептору ЭФР, при разборке актинового цитоскелета цитохалазином. Цитология. 47 (9): 809.

8. Petukhova О., Emelyanov A., Bolsliakova A., Turoverova L., BabakovV., Kropacheva /.,. Magrmsson К-Е, PinaevG.. 2005. Effect of EGF on redistribution of p65 NF-KB/RelA in A431 cells spread on immobilized ligands. Abstracts the American Society for Cell Biology, 45th Annual Meeting, p. 100a.

9. Емельянов А. И., Петухова О. А., ТуровероваЛ. В., Кропачева И. В., Пинаев Г. П. 2006. Динамика ДНК-связываюшей активности факторов транскрипции в процессе распластывания клеток А431 на иммобилизованных лигандах. Цитология. 48(11): 935-947.

10. Большакова А. В., Емельянов АЛ., Петухова О. А, Бабаков В. П., Туроверова Л. В, Тептлер Д. Г, Магиуссон К.-Е., Пинаев Г. П. 2006. Перераспределение р65 субъединицы транскрипционном фактора NF-kB в клетках А431 при восстановлении актинового цитоскелета и стимуляции ЭФР. Цитология. 48(9): 746.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

3. Бабаков В. //., Бобков Д. Е., Петухова О. А., Туроверова Л. В., Кропачева И. В., Подольская Е. П., Пипаев Г. П. 2004. а-Актинин-4 и р65-субъединица транскрипционного фактора NFkB соло кал изу юте я и совместно мшрируют в ядро в клетках А431 под действием эпидермального фактора роста. Цитология. 46: 1064-1071.

2. Дариева 3. А., Поспелов В. А., Поспелова Т. В. ¡999. транскрипционный фактор NF-кВ/Ке! конститутивно активирован и локализуется в ядре El A+cHA-Ras трансформантов. Цитология. 41: 622-627.

3. Калмыкова И. В., Черепанова О. А., Блинова М. И., Пинаев Г. П. 2003. Вклад интегриновых рецепторов в процесс миграции клеток А431 на ламинине 2/4 по действием ЭФР. Цитология. 45: 882.

4. Никольский Н. Н., Сорокин А. Д., Сорокин А. Б. 1987. Эпидермальный фактор роста. Ленинград, Наука: 200с.

5. Петухова О. А., Туроверова Л. В., Кропачева И. В., Пинаев Г. П. 2004. Анализ морфологических особенностей популяции клеток энидермоидной карциномы А431, распластанных на иммобилизованных лигандах. Цитология. 46(1): 5-15.

6. Сорокин А. Б., Нестеров А. М, Сорокин А. Д., Игнатова Т. Н., Галактионов К. И., Кудрявцева Н. В., ¡989. Получение и характеристика моноклональных антител к наружному домену рецептора ЭФР эпидермальной карциномы человека А431. Цитология 31(5): 549-555.

7. Черепанова О. А., Калмыкова Н. В., Вороикииа Н. В., Аре А. Ф., Горелик Ю. В., Пинаев Г. П. 2002. Различия в характере взаимодействия нормальных и трансформированных кератоцитов человека с изоформами ламинина. Цитология 44(2): 151-152.

8. Are A. F., GalkinV.E., Pospelova Т. V„ PinaevG. P. 2000. The p65/Re!A subunit of NF-кВ interacts with actin containing structures. Exp. Cell Res. 256: 533-544.

9. Are A., Pinaev G., Burova E., Lindberg U. 2001. Attachment of A431 cells on immobilized antibodies to the EGF receptor promotes cell spreading and reorganization of the microfilament system. Cell Motil. Cytoskelet. 48:24-36.

10. Batchelor C. L., Woodward A. M, Crouch D. H. 2004. Nuclear ERM (ezrin, radixin, moesin) proteins: regulation by cell density and nuclear import. Exp. Cell Res. 296: 208-222.

11. Clark T. G„ MerriamR. W. 1977. Diffusible and bound actin nuclei ofXenopus laevis oocytes. Cell. 12: 883-991.

12. CohenS. 1962. Isolation of a mouse submaxillary gland protein accelerating incisor eruption and eyelid opening in the newborn animal. J. Biol. Chem. 237:1555-1562.

13. Ding W, Gao S., Scott R. E., 2001. Senescence represses the nuclear localization of the serum response factor and differentiation regulates its nuclear localization with lineage specificity. J Cell Sci. 114: 1011-1108.

14. Geiger В., Bershadsky A., Pankov R., Yamada К. M. 2001. Transmembrane extracellular matrix-cytoskeleton crosstalk. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2: 793-805.

15. Geneitis D., Treisman R., 2001. Differential isage of signsl transduction pathways defines two types of serum response factor target gene. J. Biol.Chem. 276: 24531-24539.

16. Genersch E., Schuppan D., Lichtner R. B. 1996. Signaling by epidermal growth factor differentially affects integrin-mediated adhesion of tumor cells to extracellular matrix proteins. J. Mol. Med. 74: 609-616.

17. Habib A. A., Chatterjee S., Park S-K., Ratan R. R., Lefebvre S., Varianian T. 2001. The epidermal growth factor receptor interacting protein and nuclear factor kB (NF-kB)-inducing kinase to activate NF-kB. J. Biol. Chem. 276: 8865-8874.

18. Hall A. 1998. Rho GTPases and actin cytoskeleton. Science. 279: 509-514.

19. Hess J., Angel P., Schorpp-Kistner M, 2004. AP-1 subunits: quarrel and harmony among siblings. J. Cell Sci. 117: 596573.

20. Hoffmann A., Levchenko A., Scott M. L., Baltimore D. 2002. The IkB - NF-кВ signaling module: temporal control and selective gene activation. Science 298: 1241-1245.

21. Holt J. Т., Gopal Т. V., Moult on A. D., Nienhuis A. W. 1986. inducible production of c-fos antisense RNA inhibits 3T3 cell proliferation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83: 4794-8.

22. Honda K„ Yamacla T„ Endo R, Ino Y„ Goloh M., Tsuda H„ Yamada Y, Chiba 11., HirohashiS. 1998. Actinin-4, a novel actin-bundling protein associated with cell motility and cancer invasion. J. Cell Biol. 140: 1383-1393.

23. Hopkins A. M„ Li £>., Mrsny R. J., Walsh S. V., Nusrat A., 2000. Modulation of tight junction function by G proteincoupled events. Adv. Drug Deliv. Rev. 41(3): 329-40.

24. Huang T. 7'., Kudo N.. Yoshida M, Miyamoto S. 2000. A nuclear export signal in the N-termina! regulatory domain of lkappaBalpha controls cytoplasmic localization of inactive NF-kappaB/lkappaBalpha complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97: 1014-9.

25. Hynes R. O. 1999. Cell adhesion: old and new questions. Trends Cell Biol. 9: M33-M37.

26. MaUiriA., Symons M„ Henningan R. F„ Hurislone A. F. L.. Lamb R„ Wheeler T„ Ozanne B. W. 1998. The transcription factor AP-1 is required for EGF-induced activation of Rho-like GTPases, cytoskeletal rearrangement, motility, and in vivo invasion of A431 cells. J. Cell Biol. 143:1087-1099.

27. Manioiis A. J., Chen C. S., Ingber D. E. 1997. Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure. Proc. Natl. Acad. Sci. 94(3): 849-854.

28. May M. J., Ghosh S. 1998. Signal transduction through NFkB. Immunol. Today 19: 80-88.

29. Miyamoto S., Teramolo H., GutkindJ.S., Yamada K. M. 1996. Integrins can collaborate with growth factors for phosphorylation of receptor tyrosine kinases and MAP kinase activation: roles of integrin aggregation and occupancy of receptors. J. Cell Biol. 135: 1633-42.

30. Miyamoto S., KatzB.Z., Lafrenie R M., Yamada K. M. 1998. Fibronectin and integrins in cell adhesion, signaling and morphogenesis. Ann. N-Y Acad. Sci. 857:119-129.

31. Nelson D. E., Ihekwaba A. E. C, Elliot M., Johnson J. R., Gibney C. A., Foreman B. E., Nelson G., See V., Horion C. A., Spiller D. G., Edwards S. W., McDowell H. P., UnittJ.F.. Sullivan E„ Grimley R„ Benson N.. BroomheadD„ KellD.B., While M. R. H. 2004. Oscillations in NF-kB signaling control the dynamics of gene expression. Science 306: 704-708.

32. NemetbZH., Wong H. R., Odoms K., Deitch E. A., Szabo C„ Viii E. S., HaskoG. 200-1. Proteasome inhibitors induce inhibitory kappa B (1 kappa B) kinase activation, I kappa B alpha degradation, and nuclear factor kappa B activation in HT-29 cells. Mol Pharmacol. 65(2): 342-349.

33. PosernG., Miralles F., GuettlerS., Treisman R. 2004. Mutant actins that stabilise F-actin use distinct mechanisms to activate the SRF coactivator MAL. EMBO I. 23: 3973-83.

34. Puck T. T., Kiystosek A. 1992. Role of the cytoskeleton in genome regulation and cancer. Int. Rev. Cytol. 132: 75-108.

35. Ridley A. L., Hall A. 1992. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell 70: 389-399.

36. Riese D. J., KimE.D., Elenins K., Buckley S., Klagsbrim M„ Plowman G. D., Stern D. F. 1996. The epidermal growth factor receptor couples transforming growth factor-alpha, heparin-binding epidermal growth factor-like factor, and amphiregulin to Neu, ErbB-3, and ErbB-4. J. Biol. Chem. 271: 20047-52.

37. Sampath P., Pollard T. D. 1991. Effects of cytochalasin, phalloidin, and pll on the elongation of actin filaments. Biochemistry^ 19;30: 1973-80.

38.SastryS.K., Horwitz A. F. 1993. Integrin cytoplasmic domains: mediators of cytoskeletal linkages and extra- and intracellular initiated transmembrane signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 5: 819-831.

39. Schoenwaelder S. M„ Burridge K. 1999. Bidirectional signaling between the cytoskeleton and integrins. Curr. Opin. Cell Biol, 11:274-286.

40. Schratl G., Philippar U., BergerJ., Sxhwarz H., Heidenreich O., Nordheim A. 2002. Serum response factor is crucial for actin cytoskeletal organization and focal adhesion assembly in embryonic stem cells. J. Cell Biol. 156: 737-750.

41 .SmallJ.V., RottnerK., KaverinaI., Anderson K.I. 1998. Assembling an actin cytoskeleton for eel! attachment and movement. Biochim. Biophys. Acta. 1404: 271-81.

42. Small J. V., Rottner A'.. Kaverina I. 1999. Functional design in the actin cytoskeleton. Curr. Opin. Cell Biol. 11: 54-60.

43. Sotiropoulos A., Gineitis D., CopelandJ., Treisman R. 1999. Signal-regulated activation of serum response factor is mediated by changes in actin dynamic. Cell. 98: 159-169.

44. Ting A. Y„ EndyD. 2002. Decoding NF-kB signaling. Science 298: 1189-1190.

45. Van Aelst L., S'Souza-Schorey C. 1997. Rho GTFases and signaling networks. Genes Develop. 11: 2295-2322.

46. Van der HeydenM.A., Oude Weernink P. A., Van Oirschot B. A., Van Bergen en Henegouwen P. M., BoonstraJ, Rijksen G. 1997. Epidermal growth factor-induced activation and translocation of c-Src to the cytoskeleton depends on the actin binding domain of the EGF-receptor. Biochim Biophys Acta. 1359: 211 -21.

47. Vermal.M., Stevenson J. K„ SchwarzE.M., Van Antwerp D, Miyamoto S. 1995. Rel/NF-kappa B/I kappa B family: intimate tales of association and dissociation. Genes Dev. 9:2723-35.

48. Wei L., WangL., Carson J. A., AganJ. E„ Imanaka-Yoshida K„ Schwartz R. J. 2001. betal integrin and organized actin filaments facilitate cardiomyocyte-specific RhoA-dependent activation of the skeletal alpha-actin promoter. FASEB J. 15: 78596.

49. Yamada K. M., Miyamoto S. 1995. Integrin transmembrane signaling and cytoskeletal control. Curr. Opin. Cell Biol. 7:681689.

50. Yamada K. M., Geiger B. 1997. Molecular interactions in cell adhesion complexes. Curr. Opin. Cell Biol. 9: 76-85.

51. Yin H. L., Janmey P. A. 2003. Phosphoinositide regulation of the actin cytoskeleton. Annu. Rev. Physiol. 65:761-89.

52. Zinck R., HipskindR. A., Pingout V, Nordheim A. 1993. C-fos transcriptional activation and repression correlate temporally with the phosphorylation status of TCF. EMBO J. 12: 2377-2387.

Автор выражает глубокую признательность сотрудникам Института цитологии проф. Пинаеву Г. П., своему научному руководителю к.б.н. Петуховой О. А., к.б.н. Туроверовой Л. В., к.б.н. Кропачёвой И. В., д.б.н. Морозову В. И., к.б.н. Бабакову В. Н., к.б.н. Чистяковой И. А., асп. Большаковой А. В.,

к.б.н. Блиновой М. И., к.б.н. Калмыковой Н. В., к.б.н. Черепановой О. А. и д.б.н. Корниловой Е. С. за помощь в работе.

Особенно благодарен автор своей жене Анне Юрьевне Марковой за неоценимые помощь и поддержку в течение всего времени выполнения работы.

Лицензия ЛР №020593 от 07.08.97

Подписано в печать 13.12.2006. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 1078Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: 550-40-14 Тел./факс: 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Емельянов, Артем Николаевич

1. ВСТУПЛЕНИЕ.

2. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

3.1. КЛЕТОЧНАЯ АДГЕЗИЯ.

3.1.1. Внеклеточный матрикс (ВКМ).

3.1.2. Белки ВКМ ламинин 2/4 (ЛМ), фибронектин (ФН) и их рецепторы.

3.1.3. Фокальная адгезия.

3.1.4. Актиновый цитоскелет (АЦ).

3.1.4.1. Формирование актиновых структур в процессе распластывания клетки на субстрате.

• 3.1.4.2. Роль актин-связывающих белков в формировании актиновых структур

3.2. ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ СИГНАЛИЗАЦИЯ.

3.2.1. Внеклеточные сигнальные молекулы и их рецепторы.

3.2.1.1. Эпидермальный фактор роста (ЭФР) и его рецептор (ЭФР-Р).

3.2.2. Основные пути проведения сигнала в клетке, активируемые ЭФР.

3.2.3. Транскрипционные факторы (ТФ) NFkB, SRF и API.

3.2.3.1. NFkB.

3.2.3.2. SRF.

3.2.3.3. API.

3.2.3.4. Активация NFkB, SRF и API эпидермальным фактором роста. ф 3.2.3.5. Малые ГТФ-азы семейства Rho.

3.2.3.6. Активация NFkB, SRF и API в результате возбуждения интегриновых рецепторов.

3.3. УЧАСТИЕ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА В ПРОВЕДЕНИИ СИГНАЛА.

3.3.1. Мембранный уровень сигнализации.

3.3.2. Цитоплазматический уровень сигнализации.

3.3.3. Ядерный уровень сигнализации.

3.3.3.1. Ядерно-цитоплазматический транспорт.

3.3.3.2. Участие актина в ядерных событиях.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Емельянов, Артем Николаевич

7. ВЫВОДЫ

8. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Петухова О. А., Туроверова JI. В., Кропачева И. В., Емельянов А. Н., ПинаевГ.П.

2001. Изменения в популяции клеток эпидермоидной карциномы А431, распластанных на разных субстратах, при действии лизофосфатидиловой кислоты (ЛФК) и эпидермального фактора роста (ЭФР) в соответствии со структурой актинового цитоскелета. Цитология. 43(9): 884.

2. Петухова О. А., Туроверова Я. В., Кропачева И. В., Емельянов А. Н., ПинаевГ.П.

2002. ДНК-связывающая активность факторов транскрипции SRF, NFkB И API при изменении организации актинового цитоскелета под влиянием иммобилизованных белков внеклеточного матрикса. Тезисы научных докладов III Съезда Биохимического общества, СПб, С.411.

3. Petoukhova О. A., Tur over ova L. V., Kropacheva I. V., Emel'yanov A. N., PinaevG.P.

2003. DNA binding activities of transcription factor SRF, NFkB and API in A431 cells spread on immobilized extracellular matrix proteins. Eur. J. Biochem. V. 270. Suppl. 1. p. 98.

4. Емельянов A. H.,. Петухова О. А., Туроверова JI. В., Кропачева И. В., ПинаевГ.П. 2003. Динамика ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов SRF, АР-1 и NFkB ядерных экстрактов клеток А431 в зависимости от времени распластывания на фибронектине, ламинине 2/4 и антителах к рецептору ЭФР. Цитология. 45(9): 873.

5. Петухова О. А, Туроверова Л. В., Емельянов А. Н., Кропачева И. В., ПинаевГ. П. 2005. ДНК-связывающая активность транскрипционных факторов, взаимодействующих с последовательностями SRE, NF-кВ и АР-1, индуцированная адгезией клеток А431, коррелирует с перестройками актинового цитоскелета. Цитология. 47(2):175-183.

6. Емельянов А. Н., Большакова А. В., Петухова О. А., Туроверова JI. В., Кропачева И. В., Пинаев Г. П. 2005. Особенности распределения р65 субъединицы транскрипционного фактора NF-kB в клетках А431, распластанных на фибронектине, ламинине или антителах к рецептору ЭФР. Цитология. 47(9): 808.

7. Емельянов А. #., Большакова А. В., Петухова О. А., ТуровероваЛ. В., КропачеваИ. В., Пинаев Г. П. 2005. Распределение р65 субъединицы транскрипционного фактора NFkB в клетках А431, распластанных на фибронектине, ламинине или антителах к рецептору ЭФР, при разборке актинового цитоскелета цитохалазином. Цитология. 47 (9): 809.

8. PetukhovaO., EmelyanovA., Bolshakova A., Tur over ova L., BabakovV., Kropacheva I.,. Magnusson K-E, Pinaev G. 2005. Effect of EGF on redistribution of p65 NF-icB/RelA in A431 cells spread on immobilized ligands. Abstracts the American Society for Cell Biology, 45th Annual Meeting, p. 100a.

9. Емельянов A. H., Петухова О. А., ТуровероваЛ. В., КропачеваИ. В., Пинаев Г. П. 2006. Динамика ДНК-связывающей активности факторов транскрипции в процессе распластывания клеток А431 на иммобилизованных лигандах. Цитология. 48(11): 935-947.

10. Большакова А. В., Емельянов А.Н., Петухова О. А, Бабаков В. Н., Туроверова Л. В, ТентлерД.Г, Магнуссоп К.-Е., Пинаев Г. П. 2006. Перераспределение р65 субъединицы транскрипционного фактора NF-kB в клетках А431 при восстановлении актинового цитоскелета и стимуляции ЭФР. Цитология. 48(9): 746.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Емельянов, Артем Николаевич, Санкт-Петербург

1. Арэ А. Ф. 2000. Взаимодействие поверхностных рецепторов клетки с различными иммобилизованными и свободными лигандами определяет структуру актинового цитоскелета. Диссертация на соискание ученой степени канд. биол. наук. С.-Петербург.

2. Арпауцтов А. М„ Никольский Н. Н. 1998. Транспорт в ядро изоформ р42 и р44 МАР-киназы, вызванный эпидермальным фактором роста, требует интактного актинового цитоскелета. Цитология. 40:639-647.

3. Бабаков В. Н., КропачеваИ. В., Петухова О. А., Туроверова Л. В., Пинаев Г. П. 2004 (а). внутриклеточное распределение актин-связывающих белков, фосфорилированных по тирозину, при распластывании клеток А431 на разных лигандах. Цитология. 46: 10551063.

4. Дариева 3. А., Поспелов В. А., Поспелова Т. В. 1999. транскрипционный фактор кВЛ1е1 конститутивно активирован и локализуется в ядре Е1А+сНА-Яаз трансформантов. Цитология. 41: 622-627.

5. Калмыкова Н. В., Черепанова О. А., Блинова М. К, Пинаев Г. П. 2003. Вклад интегриновых рецепторов в процесс миграции клеток А431 на ламинине 2/4 по действием ЭФР. Цитология. 45:882.

6. Крутецкая 3 К, Лебедев О. Е., Курилова Л. С. 2003. Механизмы внутриклеточной сигнализации. СПб, СПбГУ: 208 с.

7. Маниатис Т., Фрич Э., СэмбрукДж. 1984. Методы генетической инженерии. Москва, Мир, с. 480.

8. Математическая энциклопедия. 1982. под ред. Виноградова И. М. М. Советская энциклопедия. Т. 3, с. 963.

9. Ферменты и нуклеиновые кислоты. 1997. Под ред. Лызловой С.Н., Владимирова В.Г. Спб издательство СПбГУ: с. 19.

10. Хребтукова И. А., Никольская А. Н., СоркинА. Д., Сорокин А. В., ПинаевГ.П. 1989. Кэппинг рецепторов к эпидермальному фактору роста и участие цитоскелета в этом процессе у клеток А431. Цитология. 31:1211-1220.

11. Черепанова О. А., Калмыкова Н. В., Воронкина Н. В., АреА.Ф., Горелик Ю. В., Пинаев Г. П. 2002. Различия в характере взаимодействия нормальных и трансформированных кератоцитов человека с изоформами ламинина. Цитология 44(2): 151-152.

12. AffolterM., MontagneJ., WalldorfU., GroppeJ., Kloter U., LaRosaM., Gehring W. J. 1994. The Drosophila SRF homolog is expressed in a subset of tracheal cells and maps within a genomic region required for tracheal development. Development. 120: 743-53.

13. Batchelor C. L„ Woodward A. M., Crouch D. H. 2004. Nuclear ERM (ezrin, radixin, moesin) proteins: regulation by cell density and nuclear import. Exp. Cell Res. 296:208-222.

14. Berridge M. J. 1993. Cell signalling. A tale of two messengers. Nature. 365: 388-9.

15. Bonizzi G., Karin M. 2004. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25:280-8.

16. BoonstraJ. 1999. Growth factor-induced signal transduction in adherent mammalian cells is sensitive to gravity. FASEB J. 13: S35-42.

17. BoonstraJ., MoesM. J. 2005. Signal transduction and actin in the regulation of G1-phase progression. Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 15:255-76.

18. BradfordM.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 525-529.

19. BretscherA. 1989. Rapid phosphorylation and reorganization of ezrin and spectrin accompany morphological changes induced in A-431 cells by epidermal growth factor. J. Cell Biol. 108: 921-930.

20. Cairns B. R., Erdjument-Bromage H., TempstP., Winston F., Kornberg R. D. 1998. Two actin-related proteins are shared functional components of the chromatin-remodeling complexes RSC and SWI/SNF. Mol. Cell. 2: 639-651.

21. Calderwood D. A., Shattil S. J., Ginsberg M. H. 2000. Integrins and actin filaments: reciprocal regulation of cell adhesion and signaling. J Biol Chem. 275: 22607-10.

22. Calderwood D. A. 2004. Integrin activation. J. Cell Sci. 117: 657-66.

23. Carlsson L., Nystrom L. E., Lindberg U., Kannan K. K., Cid-Dresdner H., Lovgren S. 1976. Crystallization of a non-muscle actin. J Mol Biol. 105:353-66.

24. Carpenter G. 1992. Receptor tyrosine kinase substrates: src homology domains and signal transduction. FASEB J. 6: 3283-9.

25. ChaiJ., Tarnawski A. S. 2002. Serum response factor: discovery, biochemistry, biological• roles and implications for tissue injury healing. J. Physiol. Pharmacol. 53: 147-57.

26. ChanA. Y., RaftS., BaillyM., Wyckof/J.B., SegallJ.E., CondeelisJ. S. 1998. EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells. J. Cell Sci. Ill: 199-211.

27. Chinenov Y., Kerppola T. K. 2001. Close encounters of many kinds: Fos-Jun interactions that mediate transcription regulatory specificity. Oncogene. 20:2438-52.

28. Clark E. A., Brugge J. S. 1995. Integrins and signal transduction pathways: the road taken. Science. 268(5208):233-9.

29. Clark T. G., Merriam R. W. 1977. Diffusible and bound actin nuclei of Xenopus laevis oocytes. Cell. 12: 883-991.

30. Cohen S. 1962. Isolation of a mouse submaxillary gland protein accelerating incisor eruption ^ and eyelid opening in the newborn animal. J. Biol. Chem. 237:1555-1562.

31. Cohen S, UshiroH, StoscheckC, ChinkersM. 1982. A native 170,000 epidermal growth factor receptor-kinase complex from shed plasma membrane vesicles. J. Biol. Chem. 257: 152331.

32. Dhanasekaran N. Reddy E. P., 1998. Signaling by dual specificity kinases. Oncogene. 17: 1447-1445.

33. Ding W, Gao S., Scott R. E., 2001. Senescence represses the nuclear localization of the serum response factor and differentiation regulates its nuclear localization with lineage specificity. J Cell Sci. 114:1011-1108.

34. EngelJ. 1992. Laminins and other strange proteins. Biochemistry. 31:10643-51.

35. Engval E., Wewer U. AC, 1996. Domains of laminin. J. Cell Biochem. 61:493-501.

36. Extracellular matrix: structure and functions. 1985. Ed. ReddiH. UCLA Symposiaon Molecular and CellularBiology. 25 p.

37. Foo S. Y., Nolan G. P. 1999. NF-kappaB to the rescue: RELs, apoptosis and cellular transformation. Trends Genet. 15:229-35.

38. Fuller B. 1961. Tensegrity. Portfolio Artnews Annual. 4: 112-127.

39. GeigerB., Bershadsky A., PankovR., YamadaKM. 2001. Transmembrane extracellular matrix-cytoskeleton crosstalk. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2: 793-805.

40. Geneitis D„ Treisman R., 2001. Differential isage of signsl transduction pathways defines two types of serum response factor target gene. J. Biol.Chem. 276:24531-24539.

41. Genersch E., Schuppan D., Lichtner R. B. 1996. Signaling by epidermal growth factor differentially affects integrin-mediated adhesion of tumor cells to extracellular matrix proteins. J. Mol. Med. 74: 609-616.

42. Giancotti F. G. 1997. Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression. Curr. Opin. Cell Biol. 9: 691-700.

43. Giancotti F. G., RuoslahtiE. 1999. Integrin signaling. Science. 1999 285:1028-32.

44. Gorlich £>., Kutay U. 1999. Transport between the cell nucleus and the cytoplasm. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15: 607-60.

45. Gumbiner B. M. 1996. Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture andmorphogenesis. Cell. 84:345-57.

46. Habib A. A., Chatterjee S., ParkS-K., RatanR.R., LefebvreS., VartanianT. 2001. The epidermal growth factor receptor interacting protein and nuclear factor kB (NF-kB)-inducing kinase to activate NF-kB. J. Biol. Chem. 276: 8865-8874.

47. Hall A. 1998. Rho GTPases and actin cytoskeleton. Science. 279: 509-514.

48. HartwigJ. H., Kwiatkowski D. J. 1991. Actin-binding proteins. Curr. Opin. Cell Biol. 3: 8797.

49. Heo W. D., Meyer T. 2003. Switch-of-function mutants based on morphology classification• of Ras superfamily small GTPases. Cell. 113:315-28.

50. Hess J., Angel P., Schorpp-Kistner M. 2004. AP-1 subunits: quarrel and harmony among siblings. J. Cell Sci. 117: 5965-73.

51. HMC.S., Wynne J., TreismanR. 1995. The Rho family GTPases RhoA, Racl, and CDC42Hs regulate transcriptional activation by SRF. Cell 81:1159-70.

52. Hoffmann A., LevchenkoA., Scott M.L., Baltimore D. 2002. The IkB NF-kB signaling module: temporal control and selective gene activation. Science 298:1241-1245.

53. Holt J. T., GopalT. V., MoultonA. D., NienhuisA. W. 1986. Inducible production of c-fos antisense RNA inhibits 3T3 cell proliferation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83:4794-8.

54. Holt S. J., Alexander P., InmanC.B., DaviesD.E. 1995. Ligand-induced translocation of epidermal growth factor receptor to the nucleus of NR6/HER fibroblasts is serum dependent.

55. Exp. Cell Res. 217: 554-8.

56. Honda K„ YamadaT., EndoR., InoY., GotohM., TsudaH., YamadaY., ChibaH., Hirohashi S. 1998. Actinin-4, a novel actin-bundling protein associated with cell motility and cancer invasion. J. Cell Biol. 140:1383-1393.

57. Hopkins A. M., LiD., MrsnyR.J., WalshS. V., NusratA., 2000. Modulation of tight junction function by G protein-coupled events. Adv. Drug Deliv. Rev. 41(3): 329-40.

58. Huang T. T., Kudo N., Yoshida M., Miyamoto S. 2000. A nuclear export signal in the N-terminal regulatory domain of IkappaBalpha controls cytoplasmic localization of inactive NF-kappaB/IkappaBalpha complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97:1014-9.

59. Huxford T., MalekS., Ghosh G. 1999. Structure and mechanism in NF-kappa B/I kappa B signaling. Cold. Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 64: 533-40.

60. HynesR. 0. 1990. Fibronectins. Springer N.Y. Berlin-Heidelberg. 440 p.

61. Hynes R. O. 1992. Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. Cell. 69: 11-25.

62. Hynes R. O.1999. Cell adhesion: old and new questions. Trends Cell Biol. 9: M33-M37.

63. HynesR. O. 2002. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110: 673-87.

64. Ingber D. E. 2003(a). Tensegrity I. Cell structure and hierarchical systems biology. J. Cell Sci. 116:1157-73.

65. JaaroH, RubinfeldH., HanochT., Seger R. 1997. Nuclear translocation of mitogen-activated protein kinase kinase (MEK1) in response to mitogenic stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94: 3742-7.

66. Janmey P. A. 1994. Phosphoinositides and calcium as regulators of cellular actin assembly and disassembly. Annu. Rev. Physiol. 56:169-91.

67. Jockusch B. M., Hinssen H, 1996. Nonmuscle motility and the actin-based cytoskeleton. Comprehensive Human Phkysiology. 1:225-243.

68. Johansen F. E., Prywes R. 1994. Two pathways for serum regulation of the c-fos serum response element require specific sequence elements and a minimal domain of serum response factor. Mol. Cell Biol. 14: 5920-8.

69. Kaplan K. B., SwedlowJ.R., Morgan D.O., VarmusH.E. 1995. c-Src enhances the spreading of src-/- fibroblasts on fibronectin by a kinase-independent mechanism. Genes. Dev. 9: 1505-17.

70. Khrebtukova I. A., Kwiatkowska K., GudkovaD.A., SorokinA.B., PinaevG.P. 1991. The role of microfilaments in the capping of epidermal growth factor receptor in A-431 cells. Exp. Cell Res. 194:48-55.

71. Kjoller L., Hall A. 1999. Signaling to Rho GTPases. Exp. Cell Res. 253:166-79.

72. Kingston R. E. 1990. DNA-Protein Interactions. In: Current protocols in molecular biology. N. Y., John Wiley & Sons: 12.0.1-12.2.10.

73. Kumar C. C. 1998. Signaling by integrin receptors. Oncogene. 17:1365-73.

74. Kwiatkovska K, Khrebtukova I. A., GudkovaD.A., PinaevG.P., SobotaA. 1991. Actin-binding proteins involved in the capping of epidermal growth factor receptors in A-431 cells. Exp. Cell Res. 196: 255-263.

75. Activation at low pH overrides Ca2+ requirement. J. Biol. Chem. 268: 8999-9004.

76. Lassing I., LindbergU. 1985. Specific interaction between phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate and profilactin. Nature. 314 :604-606.

77. LemmonM.A., BuZ., LadburyJ.E., ZhouM., PinchasiD., Lax I., Engelman D. M., • Schlessinger J. 1997. Two EGF molecules contribute additively to stabilization of the EGFRdimer. EMBO J. 16:281-94.

78. Lin T. H., Aplin A. E„ Shen Y, Chen Q., SchallerM., RomerL., Aukhill., Juliano R. L. 1997 Integrin-mediated activation of MAP kinase is independent of FAK: evidence for dual integrin signaling pathways in fibroblasts. J. Cell Biol. 136:1385-95.

79. Luo J.L., Kamata H„ Karin M. 2005. IKK/NF-kappaB signaling: balancing life and death~a new approach to cancer therapy. J. Clin. Invest. 115:2625-32.

80. MakarovS. S. 2001. NF-kappa B in rheumatoid arthritis: a pivotal regulator of inflammation, hyperplasia, and tissue destruction. Arthritis Res. 3:200-6.

81. ManiotisA. J., ChenC.S., IngberD.E. 1997. Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure. Proc. Natl. Acad. Sci. 94(3): 849-854.w

82. Malliri A., SymonsM., Henningan R. F., Huristone A. F. L., LambR., Wheeler T„ OzanneB. W. 1998. The transcription factor AP-1 is required for EGF-induced activation of

83. Rho-like GTPases, cytoskeletal rearrangement, motility, and in vivo invasion of A431 cells. J. Cell Biol. 143:1087-1099.

84. Massague J, PandiellaA. 1993. Membrane-anchored growth factors. Ann. Rev. Biochem. 62:515-41.

85. Matsudaira P., JanmeyP. 1988. Pieces in the actin-severing protein puzzle. Cell. 54:13940.

86. Matsudaira P. 1994. The fimbrin and alpha-actinin footprint on actin. J. Cell Biol. 126: 285-7.

87. May M. J., GhoshS. 1998. Signal transduction through NFkB. Immunol. Today 19: 80-88.

88. Miyamoto S., KatzB. Z, Lafrenie R M., YamadaK. M. 1998. Fibronectin and integrins in cell adhesion, signaling and morphogenesis. Ann. N-Y Acad. Sci. 857:119-129.

89. Mizuno K„ OkanoL, OhashiK., Nunoue K., KumaK., MiyataT., NakamuraT. 1994. Identification of a human cDNA encoding a novel protein kinase with two repeats of the LIM/double zinc finger motif. Oncogene. 9:1605-12.

90. Mosher F. D„ 1989. Fibronectin. San-Diego Calif. Academic press.

91. Nelson D. E„ Ihekwaba A. E. C., Elliot M„ Johnson J. R., Gibney C. A., Foreman B. E., Nelson G., See V., HortonC.A., Spiller D. G„ Edwards S.W., McDowell H. P., UnittJ.F.,

92. Sullivan E„ Grimley R„ Benson N., BroomheadD., KellD. B., White M. R. H. 2004. Oscillations inNF-icB signaling control the dynamics of gene expression. Science 306:704-708.

93. OhashiT., KiehartD. P., EricksonH. P. 1999. Dynamics and elasticity of the fibronectin matrix in living cell culture visualized by fibronectin-green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A. 96:2153-8.

94. PahlH.L. 1999. Activators and target genes of Rel/NF-kappaB transcription factors. Oncogene. 18: 6853-66.

95. Parsons J. T., Martin K.H., Slack J. K., Taylor J. M., WeedS. A. 2000. Focal adhesion kinase: a regulator of focal adhesion dynamics and cell movement. Oncogene. 19: 5606-13.

96. Pawson T. 1995. Protein modules and signalling networks. Nature. 373: 573-80.

97. Paw son T., Nash P. 2000. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and development 14:1027-1047.

98. Pederson T„ Aebi U. 2003. Actin in the nucleus, what form and what for? J. Struct. Biol. 140:3-9.

99. Pestic-Dragovich L., Stojiljkovic L„ Philimonenko A. A., NowakG., KeY., Settlage R. E., Shabanowitz J., Hunt D. F., HozakP., de Lanerolle P. 2000. A myosin I isoform in the nucleus. Science. 290:337-341.

100. Peters D. M„ Mosher D. F. 1987. Assembly and alignment of fibronectin-coated gold beads into fibrils by human skin fibroblasts. Scanning Microsc. 1:757-63.

101. Platanias L. C. 2003. Map kinase signaling pathways and hematologic malignancies. Blood. 101:4667-79.

102. Pollard T. D., Cooper J. A. 1986. Actin and actin-binding proteins. A critical evaluation of mechanisms and functions. Annu. Rev. Biochem.55:987-1035.

103. PorflriE., McCormick F. 1996. Regulation of epidermal growth factor receptor signalingby phosphorylation of the ras exchange factor hSOSl. J. Biol. Chem. 271:5871-7.

104. Posern G., MirallesF., GuettlerS., TreismanR. 2004. Mutant actins that stabilise F-actin use distinct mechanisms to activate the SRF coactivator MAL. EMBO J. 23:3973-83.

105. PuckT. T., KrystosekA. 1992. Role of the cytoskeleton in genome regulation and cancer. Int. Rev. Cytol. 132: 75-108.

106. Qin J., Vinogradov O., Plow E. F. 2004. Integrin bidirectional signaling: a molecular view. PLoS Biol. 2: 0726-0729.

107. RaghowR. 1994. The role of extracellular matrix in postinflammatory wound healing and• fibrosis. FASEB J. 8:823-31.

108. ReddyS. P., MossmanB. T. 2002. Role and regulation of activator protein-1 in toxicant-induced responses of the lung. Am J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283: LI 161-78.

109. Rosales C., O'Brien V., Romberg L., Juliano R. 1995. Signal transduction by cell adhesion receptors. Biochim. Biophys. Acta. 1242: 77-98.

110. Rottner K., Hall A., Small J. V. 1999. Interplay between Rac and Rho in the control of substrate contact dynamics. Curr. Biol. 9:640-8.

111. Roy L. M., Gittinger C. K., Landreth G. E. 1989. Characterization of the epidermal growth factor receptor associated with cytoskeletons of A431 cells. J. Cell Physiol. 140:295-304.

112. Ruoslahti E, VuentoM, EngvallE., 1978. Interaction of fibronectin with antibodies and collagen in radioimmunoassay. Biochim. Biophys. Acta 534:210-218.

113. Sampath P., Pollard T. D. 1991. Effects of cytochalasin, phalloidin, and pH on the elongation of actin filaments. Biochemistry. 19;30:1973-80.

114. SastryS. K., HorwitzA. F. 1993. Integrin cytoplasmic domains: mediators of cytoskeletal linkages and extra- and intracellular initiated transmembrane signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 5: 819-831.

115. Al.SastryS. K., BurridgeK., 2000. Focal adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics. Exp. Cell Res. 261:25-36.

116. Sasaki M., Yamada Y., 1987. The laminin B2 chain has a multidomain structure honologous to the B1 chain. J. Biol. Chem. 262:17111-17.

117. Savage C. R., Inagami T, Cohen S. 1972. The primary structure of epidermal growth factor. J. Biol. Chem. 247(23): 7612-21.

118. Schlessinger J. 1990. Mutational analisis of the epidermal growth factor-receptor kinase. Biochem. Soc. Symp. 56:13-19.

119. Schmidt A., Hall M. H. 1998. Signalling to the actin cytoskeleton. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14: 305-338.

120. Schmidt C„ PengB., LiZ., SclabasG.M., FujiokaS., NiuJ., Schmidt-Supprian M., Evans D. B., Abbruzzese J. L., Chiao P. J. 2003. Mechanisms of proinflammatory cytokine-induced biphasic NF-kappaB activation. Mol. Cell. 12:1287-300.

121. Schoenwaelder S. M., BurridgeK. 1999. Bidirectional signaling between the cytoskeleton and integrins. Curr. Opin. Cell Biol. 11:274-286.

122. Schratt G., Philippar U., BergerJ., SxhwarzH., Heidenreich 0., NordheimA. 2002. Serum response factor is crucial for actin cytoskeletal organization and focal adhesion assembly in embryonic stem cells. J. Cell Biol. 156:737-750.

123. SechlerJ.L., CorbettS.A., WenkM.B„ Schwarzbauer J. E. 1998. Modulation of cell-extracellular matrix interactions. Ann. N. Y. Acad. Sci. 857:143-54.

124. Sen R., Baltimore D. 1986. Inducibility of k immunoglobulin enhancer-binding protein NF-kB by a post-translational mechanism. Cell. 47: 921-928.

125. Shaw P. E. 1992. Ternary complex formation over the c-fos serum response element: p62TCF exhibits dual component specificity with contacts to DNA and an extended structure in the DNA-binding domain of p67SRF. EMBO J. 11:3011-9.

126. ShiotaJ., IshikawaM., SakagamiH, TsudaM., BarabanJ.M., TabuchiA. 2006. Developmental expression of the SRF co-activator MAL in brain: role in regulating dendritic morphology. J. Neurochem. 98:1778-88.

127. Singer1.1., KawkaD. W., ScottS„ MumfordR.A., LarkM. W. 1987. The fibronectin cell attachment sequence Arg-Gly-Asp-Ser promotes focal contact formation during early fibroblast attachment and spreading. J. Cell Biol. 104: 573-584.

128. Small J. V., Rottner K., Kaverina L, Anderson K. I. 1998. Assembling an actin cytoskeleton for cell attachment and movement. Biochim. Biophys. Acta. 1404:271-81.

129. Small J. V., Rottner K., Kaverina I. 1999. Functional design in the actin cytoskeleton. Curr. Opin. Cell Biol. 11:54-60.

130. SmolaH., Stark H. J., Thiekotter G., MiranceaN., KriegT., FusenigN. E. 1998. Dynamics of basement membrane formation by keratinocyte-fibroblast interactions in organotypic skin culture. Exp Cell Res. 239: 399-410.

131. SonisS. T. 2002. The biologic role for nuclear factor-kappaB in disease and its potential• involvement in mucosal injury associated with antineoplastic therapy. Crit. Rev. Oral. Biol. Med.13:380-9.

132. Sotiropoulos A., GineitisD., CopelandJ., TreismanR. 1999. Signal-regulated activation of serum response factor is mediated by changes in actin dynamic. Cell. 98:159-169.

133. Spencer J. A., Misra R. P. 1996. Expression of the serum response factor gene is regulated by serum response factor binding sites. J. Biol. Chem. 271: 16535-43.

134. Sun H. Q., Yamamoto M., MejillanoM., YinH.L. 1999. Gelsolin, a multifunctional actin regulatory protein. J. Biol. Chem. 274:33179-82.

135. Staiger C. J., Blanchoin L, 2006. Actin dynamics: old friends with new stories. Curr. Opin. Plant. Biol.

136. Svitkina T. M., VerkhovskyA. B., McQuade K. M., Borisy G. G. 1997. Analysis of the actin-^ myosin II system in fish epidermal keratocytes: mechanism of cell body translocation. J. Cell1. Biol. 139: 397-415.

137. Tarn W. F., Sen J., Sen R. 2001. NF-kappa B in cell life and death. In books: Transcription factors: normal and malignant development in blood cells. 551-570. Wiley-Liss, Inc.

138. Thomas S. M., Brugge J. S. 1997. Cellular functions regulated by Src family kinases. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 13:513-609.

139. Ting A. K, EndyD. 2002. Decoding NF-kB signaling. Science 298:1189-1190.

140. TreismanR. 1986. Identification of a protein-binding site that mediates transcriptional response of the c-fos gene to serum factors. Cell. 46: 567-74.

141. Ullrich A., Schlessinger J. 1990. Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity. Cell 61: 203-212.171 .Van AelstL., S'Souza-SchoreyC. 1997. Rho GTFases and signaling networks. Genes Develop. 11:2295-2322.

142. Van OpstalA., BijveltJ.J., Margadant C., Boonstra J. 2005. Role of signal transduction and actin in G1 phase progression. Adv. Enzyme. Regul. 45:186-200.

143. Vermal. M., Stevenson J. K., SchwarzE. M., Van Antwerp D, MiyamotoS. 1995. Rel/NF-kappa B/I kappa B family: intimate tales of association and dissociation. Genes Dev. 9:2723-35.

144. Volberg 71, RomerL., Zamir E., Geiger B. 2001. pp60(c-src) and related tyrosine kinases: a role in the assembly and reorganization of matrix adhesions. J. Cell Sci. 114:2279-89.

145. Wang Y. L. 1984. Reorganization of actin filament bundles in living fibroblasts. J. Cell Biol. 99:1478-85.

146. Weber A. 1999. Actin binding proteins that change extent and rate of actin monomer-polymer distribution by different mechanisms. Mol. Cell Biochem. 190: 67-74.

147. WeedS. A., Parsons J. T. 2001. Cortactin: coupling membrane dynamics to cortical actin assembly. Oncogene. 20: 6418-34.

148. Wehrle-Haller B„ ImhofB.A. 2003. Actin, microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration. Int. J. Biochem. Cell Biol. 35: 39-50.

149. Wei L., WangL., Carson J. A., AganJ. E., Imanaka-Yoshida K., Schwartz R. J. 2001. betal integrin and organized actin filaments facilitate cardiomyocyte-specific RhoA-dependent activation of the skeletal alpha-actin promoter. FASEB J. 15: 785-96.

150. WestermarkB., MagnussonA., HeldinC.H. 1982. Effect of epidermal growth factor on membrane motility and cell locomotion in cultures of human clonal glioma cells. J. Neurosci. Res. 8:491-507.

151. Whitaker J. R., Granum P. E., 1980. An absolute method for protein determination based on difference in absorbance at 235 and 280 nm. Anal. Biochem. 109(1):156-159.

152. WhitmarshA. J., Davis R.J. 1996. Transcription factor AP-1 regulation by mitogen-activated protein kinase signal transduction pathways. J. Mol. Med. 74: 589-607.

153. Wight T. N., Kinsella M. G., Qwarnstrom E. E. 1992. The role of proteoglycans in cell adhesion, migration and proliferation. Curr. Opin. Cell Biol. 4: 793-801.

154. YamadaK. M., MiyamotoS. 1995. Integrin transmembrane signaling and cytoskeletal control. Curr. Opin. Cell Biol. 7:681-689.

155. YamadaK. M., GeigerB. 1997. Molecular interactions in cell adhesion complexes. Curr. Opin. Cell Biol. 9: 76-85.

156. YangY., LiouH. C, SunXH. 2006. Idl potentiates NF-kappa B activation upon TCR signaling. J. Biol. Chem.

157. Yin H. L„ JanmeyP. A. 2003. Phosphoinositide regulation of the actin cytoskeleton. Annu. Rev. Physiol. 65:761-89.

158. ZamirE., KatzM., PosenY., ErezN., YamadaK.M., KatzB.Z, LinS., LinD.C., Bershadsky A., KamZ., GeigerB. 2000. Dynamics and segregation of cell-matrix adhesions in cultured fibroblasts. Nat. Cell Biol. 2:191-6.

159. ZhongH., MayM.J., JimiE., GhoshS. 2002. The phosphorylation status of nuclear NF-kappa B determines its association with CBP/p300 or HDAC-1. Mol. Cell. 9: 625-36.

160. ZinckR., HipskindR. A., Pingout V., NordheimA. 1993. C-fos transcriptional activation and repression correlate temporally with the phosphorylation status of TCF. EMBO J. 12: 23772387.

Информация о работе

Емельянов, Артем Николаевич
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2006
ВАК 03.00.25

Диссертация

Изменения ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов при реорганизациях актинового цитоскелета клеток А431 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы