Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие полисом растений с актиновым цитоскелетом

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие полисом растений с актиновым цитоскелетом"

а- #

/\5 На правах рукописи

"' V

АКСЕНОВА Лариса Александровна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПОЛИСОМ РАСТЕНИЙ С АКТИНОВЫМ ЦИТОСКЕЛЕТОМ

Специальность 03.00.12 физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1998

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте Физиологи растений им. К. А. Тимирязева РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Н. Л. Клячко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А. В. Носов

доктор биологических наук Н. Б. Гусев

Ведущее учреждение: Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН

Защита состоится "9 " ЩОЮЯ^ 1998 года в ^^часов на заседании Диссертационного совета К 002.45.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, Ботаническая ул., 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФР РАН. Автореферат разослан "#/9" 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

/

М. И. Азаркович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОБЛЕМЫ

Актуальность проблемы. Белковый синтез в клетках прокариот и эукариот, включая растения, это сложный процесс, в котором участвует большое число макромолекулярных комплексов: мРНП, рибосомы, амино-ацил-тРНК-синтетазы и т-РНК, факторы инициации, элонгации и терминации синтеза белка. Регуляция координированной экспрессии всех компонентов, необходимых для белкового синтеза и регуляция их активности также являются очень сложными процессами, требующими высокой точности и зависят от множества экзогенных и эндогенных факторов.

В последнее время стало очевидным, что одним из механизмов трансляционного контроля является регуляция пространственной организации белок-синтезирующей системы. Эта проблема включает в себя вопросы, связанные (1) с асимметричной внутриклеточной локализацией матриц, рибосом и факторов белкового синтеза, приводящей к возникновению градиентов белков и, в конечном счете, к полярности клеток, что особенно важно для правильного протекания клеточного цикла, оогенеза и других процессов, (2) с внутриклеточным транспортом матриц, (3) с передачей внеклеточного сигнала на транслирующие полисомы, (4) с регуляцией интенсивности трансляции в процессе роста и развития растений и их адаптации к стрессам.

Работы, продемонстрировавшие связь полисом в клетках «ивотных с цитоскелетом, достаточно многочисленны и подробно рассмотрены в ряде превосходных обзоров (Nielsen et al., 1983; Hesketh i Pryme, 1991; Клячко, 1998). Свое начало' эти исследования берут с 976 года, когда Wolosewick и Porter под электронным микроскопом видели полисомы, расположенные вблизи элементов актинового [итоскелета.

В случае растительных полисом обнаружить их связь с цитоскелетом очень трудно в связи с особенностями строения клеток -присутствие клеточной стенки определяет необходимость жесткой гомогенизации тканей, затрудняющей извлечение интактного цитоскелета, а наличие большой вакуоли требует изобретения специальных буферов, нейтрализующих вредное действие вакуолярного сока. Однако известно несколько работ, посвященных этой проблеме фау^еэ е1 а1., 1991, 1992, 1998), а также работы проведенные ранее в нашей лаборатории (Зак и соавт., 1993,1996; 2л.к е1 а1„ 1997).

В последнее время, с развитием и углублением интереса исследователей к цитоскелету (что совпало с развитием новых методических возможностей) представления о цитоскелете расширяются, углубляются, пересматриваются. Публикации последних лет носят взрывной характер. Появляются работы о многочисленных актинах и актиноподобных белках, характеризуются их уникальные свойства. Накапливаются данные об их участии в « различных биохимических процессах.

Механизм связи полисом с актиновым цитоскелетом не изучен ни для растений, ни для животных. Однако считается, что это не прямая связь непосредственно с актином: существуют белковые мостики, попытки идентификации которых предпринимаются для животных клеток ^агр^в й а1., 1993). Становится очевидным, что в таком взаимодействии участвуют разнообразные актин-связывающие и/или актиноподобные белки.

В связи со сказаным, изучение растительных полисом, связанных с актиновым цитоскелетом и исследование белков, опосредующих эту связь, помогут понять физиологический смысл такого взаимодействия.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение субпопуляции цитоскелетно-связанных полисом в сравнении со свободными и мембранно-связанными полисомами, а также субклеточных фракций, обогащенных элементами цитоскелета и характеризация белков, возможно, участвующих во взаимодействии полисом с цитоскелетом. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Выделить субпопуляции полисом, связанных с цитоскелетом.

2. С использованием моноклональных анти-актиновых антител идентифицировать актин в препаратах полисом и других субклеточных фракциях.

3. Идентифицировать другие нерибосомные белки препаратов полисом, возможно, участвующих во взаимодействии полисом с цитоскелетом.

4. Исследовать трансляционную активность цитоскелетно-связанных полисом.

Научная новизна работы. Используя различную чувствительность мембран и цитоскелета к ионным и неионным детергентам, были выделены субпопуляции свободных, мембранно-связанных и цитоскелетно-связанных полисом. В препаратах полисом обнаружен актин с мол. весом 42 кД сходным с таковым у канонического актина животных. Было исследовано внутриклеточное распределение, иммунологическая специфичность и некоторые свойства нерибосомных белков, присутствовавших в препаратах полисом и оценена возможность участия этих белков в качестве посредников во взаимодействии полисом и цитскелета. Были продемонстрированы цитоскелетная природа, сродство к рибосомам и некоторое структурное сходство белка 40 кД с актином. Обнаружена активация трансляционной активности цитоскелетно-связанных полисом.

Практическая ценность работы. Представленная работа является фундаментальным исследованием, которое вносит существенный вклад в современные представления о пространственной организации белок-синтезирующей системы растений. Разработка данной проблемы интересна с позиций формирования интегративного взгляда на внутриклеточные процессы.

Публикации и апробация работы. Материалы диссертации изложены на 3-ем ежегодном симпозиуме ВОФР (Москва, 1997) и на 19-ом ежегодном симпозиуме американских физиологов растений (Риверсайд, 1997).

По материалам диссертации опубликовано 3 работы.

Структура и обьем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы.

Работа изложена на страницах машинописного текста,

содержит .3.. таблицы, .13. рисунков, ....... фотографий. Список

использованной литературы включает наименований, из которых ¡42. иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Растительный материал и постановка опытов. Растения бобов ( Vicia faba L.), сорт Русские черные, выращивали в 3-л сосудах с почвой в факторостатных условиях (125 Вт/м2, фотопериод 16 ч), при температуре днем 22°С и ночью 18°С в течении 12 дней. Проростки пшеницы (Triticum aestiwm L.), сорт Мироновская 808, выращивали в кюветах на влажной фильтровальной бумаге при температуре 20°С в темноте в течение 4 дней. Проростки ячменя (Hordeum vulgare L.), сорт Шалом, выращивали в ящиках с почвой при температуре 24°С на

свету (30 Вт/м2, фотопериод 16 ч) в течение 4 дней. Растительный материал фиксировали, замораживая в жидком азоте, и хранили при -70°С до использования.

Выделение свободных, мембранно-связанных и иитоскелетно-связанных полисом. Составы всех буферных растворов, используемых при субклеточном фракционировании представлены в Табл. 1. В зависимости от задач эксперимента мы использовали различные процедуры выделения полисом, и одна из схем, позволяющая разделить свободные полисомы (СП), мембранно-связанные полисомы (МСП) и цитоскелетно-связанные полисомы (ЦСП) представлена на Рис. 1. Принцип разделения МСП и ЦСП основан на различной чувствительности мембран и цитоскелета к ионным и неионным детергентам.

Навеску листьев гомогенизировали с пятикратным объемом высокосолевого буфера А, препятствующего действию РНКаз, и центрифугировали 5 мин при 8000 Супернатант центрифугировали 30 мин при 30 000 g для осаждения связаных полисом. Осадок

Таблица 1. Буферы, используемые при выделении субклеточных фракций

Буфер А 200 мМ Трис-ацетат, рН 8.9,60 мМ КС1, 30 мМ Мц-анетат, 4 мМ 2-меркаптоэганол

Буфер В 40 мМ Трис-ацетат, рН 8.9,20 мМ КС1, 10 мМ \^-ацетат, 4 мМ 2-меркаптоэтанол

Буфер С 10 мМ Трис-ацетат, рН 8.9,25 мМ КС1, 5 мМ М§-ацетат

Цитоскелет-стабилизирующий буфер О 5 мМ НереБ, рН 7.5, 10 мМ !^-ацетат, 2 мМ ЭГТА, 1 мМ ФМСФ

гомогенат

8000 % 5'

осадок супернатант

30 ООО £ 30'

Рис. I. Схема выделения свободных, мембранно-связанных и цитоскелетно-связанных полисом.

ресуспендировали в буфере А и добавляли Тритон Х-100 до конечной концентрации 2% для солюбилизации мембран и повторно центрифугировали при 30 ООО g для осаждения ЦСП, которые затем освобождали ионным детергентом ДОХ-Na. Все субпопуляции полисом очищали центрифугированием в течение 2 ч при 160 ООО g через подушку 1.75 М сахарозы в буфере В, суспендировали в буфере С и хранили при -70°С.

В ряде опытов во все буферы для выделения полисом добавляли ингибиторы протеаз: 2.1 мг/л N-пропилгаллат, 10 мг/л бензамидин-НС1 и 174 мг/лФМСФ.

Фракиионирование полисом в градиентах кониентраиии сахарозы. Препараты полисом наносили на 15 - 55% (вес : объем) линейные градиенты сахарозы в буфере С и центрифугировали 75 мин при 260 000 g. Градиенты сканировали при 254 нм, и процентное содержание полисом и моносом определяли по площадям соответствующих пиков.

Другие субклеточные фракции. Листья бобов гомогенизировали в десятикратном объеме буфера А, либо цитоскелет-стабилизирующего буфера D (табл. 1). Гомогенат центрифугировали при 250 g 5 мин. Супернатант фильтровали через Мираклоз и последовательно центрифугировали при 4000 g 15 мин, 15 000 g 20 мин, 30 000 g 30 мин и 195 000 g 2 ч. Осадки ресуспендировали в равных объемах буферов для гомогенизации.

Трансляция полисом в бесклеточной системе. Экстракты из зародышей пшеницы получали методом Reisfeld и Edelman (1982). Реакционная смесь в общем объеме 25 мкл содержала: 20 мМ Hepes-КОН, pH 7.6, 4.5 мМ Mg-ацетат, 120 мМ К-ацетат, 2 мМ ДТТ, 1 мМ АТФ, 20 мкМ ГТФ, 8 мМ креатинфосфат, 1 мкг креатинкиназы, 100 мкМ спермидин, 0.4 - 0.6 опт. ед. экстракта из зародышей пшеницы, 0.3 - 1.0 опт. ед. препарата полисом, 20 мкКи [35S]- метионин (120

Ки/ммоль). Инкубацию проводили при 26°С в течении 60 мин. Включение метки в белок определяли по методу Mans и Novelli (1961).

Электрофорез белков. Полипептиды экстрагировали в денатурирующих условиях буфером, содержащим 50 мМ Трис-ацетат, pH 6.8, 2% ДДС-Na, 2 мМ 2-меркаптоэтанол, 10% глицерин, и разделяли в JWC-Na/12.5% ПААГе как описано Laemmli (1970). После электрофореза гели окрашивали Кумасси голубой R-250 и сканировали при 550 нм на хроматосканере ("Desaga", Германия).

По денситограммам с электрофореграмм определяли содержание белка 40 кД в препаратах полисом относительно интегральных рибосомных белков. Поскольку рибосомные белки присутствуют в количестве одной копии на рибосомную частицу, такой расчет позволяет определить величину относительного содержания этого белка на рибосому.

Вестеун-б.чоттинг и иммунологическая идентификация белков. Для иммуноблотинга белки с незафиксированного геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану "Schleicher & Schuell" (Германия) полусухим способом в приборе Multifor II Novabiot, как описано Towbin и соавт. (1979). Буфер переноса: 25 мМ Трис-НС1 , pH 8.3, 192 мМ глицин, 0.01% ДЦС-Na, 20% метанол. Белки различных фракций анализировали на сродство к аффинно очищенным поликлональным кроличьим антителам против С-терминального фрагмента актина (А-2066, Sigma, США), моноклональным мышиными антителам против актина из желудков цыплят (N350, Amersham, Англия) и полшслональными антителами против р40 белка из Arabidopsis lhaliana L., (любезный дар проф. Э. Дэвиса, Университет штата Небраска, США) как описано в работе Аксеновой и соавт. (1998).

Реакция ограниченного протеолиза была проведена по методу Cleveland et al. (1977). После электрофореза участки геля, содержащие

40 кД белок и актин были вырезаны и помещены в карманы геля для повторного электрофореза. Поверх наслаивали буфер, содержащий протеиназу из Staphylococcus ' aureus V8 (1 мг/мл). Протеолиз происходил одновременно с электрофорезом.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение фракиии иитоскелетно-связанных полисом. На рис. 2 представлены профили распределения в градиентах концентрации сахарозы полисом различных субпопуляций, выделенных из 4-дневных этиолированных проростков пшеницы, 4-дневных зеленых проростков ячменя и зеленых листьев 12-дневных растений конских бобов. Препараты полисом, связанных с мембранами или элементами цитоскелета, содержали заметно меньше моносом (что хорошо известно для МСП и менее изучено в случае ЦСП), а фракция полисом представлена более тяжелыми полисомами, что, возможно, отражает лучшие условия, создаваемые для трансляции in vivo, или лучшую защиту таких полисом от действия РНКаз в процессе выделения.

Усложняя схему выделения полисом, мы смогли выделить еще две субпопуляции полисом: (1) полисомы, не экстрагируемые ни Тритоном Х-100, ни ДОХ-Na, так называемые прочно связанные полисомы, и (2) полисомы, осаждаемые при низкоскоростном центрифугировании (8000 g), которые, возможно, связаны с наиболее крупными фрагментами цитоскелетной сети.

Свободные полисомы из листьев бобов составляли примерно 35% тотальных полисом, около 35% полисом осаждалось уже при первом, низкоскоростном центрифугировании гомогената и 30% полисом были обнаружены в других мембранно- и цитоскелетно-связанных фракциях.

номер фракции

Рис. 4. Профили распределения свободных, мембранно-связанных и цитоскелетно-связанных полисом из зеленых листьев конских бобов, зеленых проростков ячменя и этиолированных проростков пшеницы в градиентах концентрации сахарозы.

Стрелка указывает положение моносом.

Таким образом, около 70% полисом присутствовало в клетках листьев бобов в связи с мембранами и цитоскелетом.

Идентификаиия актина в субклеточных фракииях из листьев бобов. Поскольку известно, что полисомы животных связаны с актиновыми микрофиламентами, можно было ожидать присутствия актина в препаратах полисом, в случае, если эта связь достаточно прочна. Поэтому мы предприняли попытку идентификации актина в полисомах из листьев бобов.

Актин идентифицировали Вестерн-блот анализом, используя поликлональные и моноклональные анти-актиновые антитела против актина животного происхождения. Афинно очищенные поликлональные анти-актиновые антитела (А-2066, Sigma, США) взаимодействовали с несколькими белками из препаратов полисом. Среди них присутствовал и белок, совпадающий по мол. весу с актином из желудков цыплят - 42 кД. Моноклональные антитела против животного актина (N350, Amersham, Англия), которые, как известно, реагируют и с растительным актином, были, напротив, весьма специфичны и взаимодействовали только с одной полосой, соответствующей по подвижности (42 кД) едва различимой полоске белка на гелях, окрашенных Кумасси (рис. 3).

Присутствие актина в препаратах полисом говорит о том, что связь рибосома—актин достаточно прочная, и мономеры или олигомеры актина остаются в связи с рибосомами после фрагментации цитоскелета при выделении полисом. В работе Зак и соавт. (Zak et al., 1997) при использовании в качестве маркера фаллоидина, конъюгированного с коллоидным золотом, было показано, что актин в препаратах полисом присутствует в полимерном либо олигомерном состоянии.

кД

94 . 67 "

43 ■ 30 ■

20.1 ' 14.4 -

%

Рис. 3. Идентификация актина в препаратах полисом из зеленых листьев конских бобов, а - Электрофореграммы, окрашенные Кумасси 11-250; б - Вестерн-блоты белков проявленные анти-актиновыми моноклональными антителами N350.

1 - актин из желудков цыплят;

2 - препараты полисом.

12 12

Актин был иммунологически идентифицирован и в других субклеточных фракциях, в частности в осадке, остающимся после последовательной экстракции полисом ионными и неионными детергентами и содержащим прочно связанные полисомы, что говорит о том, что актин не подвергался значительному разрушению во время длительной процедуры выделения полисом.

Таким образом, препараты полисом из листьев конских бобов содержали актин, что, возможно, отражает их связь с цитоскелегом, существовавшую в интактной клетке.

Ассоциированный с рибосомами р40 белок как возможный посредник взаимодействия рибосома-иитоскелет. Поскольку, вероятно, полисомы связаны с актиновым цитоскелетом через белковые мостики, белки—посредники, очевидно, должны обладать большим, чем актин сродством к рибосомам и присутствовать в рибосомных препаратах в сравнительно больших количествах, особенно в препаратах цитоскелетно-связанных полисом.

Среди кандидатов на роль посредника во взаимодействии полисом с актиновым цитоскелетом называют, в частности, кислый белок р40, ассоциированный с рибосомами из животных и растительных объектов. Этот белок, по-видимому, является частью трансляционной машины, будучи прочно связанным с полисомами, а при диссоциации рибосом - с их 40S субъединицами (Garcia-Hernandez et al., 1994; Auth, Brawerman, 1992) и может взаимодействовать с актиновым цитоскелетом, участвуя в реорганизации актиновых микрофиламентов (Keppel, Schaller, 1991).

Используя поликлональные антитела против этого белка из Arabidopsis ihaliana L., мы показали, что р40 белок присутствовал в исследуемых препаратах полисом из листьев бобов и проростков пшеницы (рис. 4). Однако, его количество во фракции свободных полисом было таким же или даже большим, чем во фракции связаных полисом, что не соответствует представлению о белке-посреднике между полисомами и цитоскелетом.

40 кП белок из листьев Vicia faba. Заметные количества другого нерибосомного белка с мол. весом 40 кД были обнаружены в препаратах полисом в более ранних работах, проведенных в нашей лаборатории (Зак и соавт., 1995). Количество этого белка варьировало относительно количества интегральных рибосомных белков под влиянием таких факторов как возраст листьев, условия освещения и температура при выращивании растений. Было показано, что этот белок прочно связан с рибосомами, следуя за ними при фракционировании в градиенте концентрации сахарозы. Он реагировал с некоторыми го испытанных поликлональных антител против животного актина, и поэтому первоначально был принят за одну из форм растительного актина.

В настоящей работе мы провели более подробное исследование

Рис. 4. Вестерн блоты белков свободных и мембранно-связанных полисом из листьев бобов и тотальных полисом из этиолированных проростков пшеницы, (а) Электрофоретически разделенные белки были окрашены Кумасси голубым Я-250 или (б) перенесены на нитроцеллюлозную мембрану и проявлены антителами против р40 белка из А. IШита I-(1) СП из листьев бобов; (2) МСП из листьев бобов; (3) полисомы пшеницы; (4) актин из желудков цыплят.

1 2 3 4 1 2 3 4

Рис. 5. Распределение белка 40 кД между субклеточными фракциями, (а) Электрофореграммы белков в субклеточных фракциях,

полученных с использованием цитоскелет-стабилизирующего буфера Р. (б) и (в) Процентное распределение белка 40 кД во фракциях, выделенных в буфере Л и 6, соответственно; (1-4) фракции 4000,15 ООО, 30 ООО и 195 ООО г.

12 3 4

внутриклеточной локализации, свойств и иммунологической специфичности этого белка.

При дифференциальном центрифугировании гомогената из листьев бобов, основная масса этого белка (68% в случае буфера А и 78% в случае цитоскелет-стабилизирующего буфера И) осаждается уже при 4000 g, где он присутствует наряду с другими мажорными белками с мол. весом 55 и 29 - 27 кД (рис. 5). Заметное дополнительное количество белка можно осадить при 15 ООО g. Это скорее всего говорит о том, что белок присутствует в клетке в высокополимерной или связаной форме. Интересно, что белок 40 кД практически не обнаружен во фракции 30 000 g, а при 195 000 ^ в осадке снова обнаруживается 3 - 15% этого белка. Трудно предположить, что полимерный белок или сеть полимерных белков случайным образом фрагментируются так, чтобы дать такую картину распределения. Скорее этот факт говорит о достаточно прочной связи белка со "свободными" полисомами, осаждаемыми во фракции 195 000 g. Белок во фракции 15 000 g, может присутствовать в полимерной форме или быть связанным с МСП, осаждаемыми в этой фракции.

Интересно, что те же три белка (55, 40 и 29 кД), которые доминировали во фракции 4000 g, мы обнаружили наряду с актином в материале, остающемся после экстракции полисом различными детергентами, что, как нам кажется, является доводом в пользу цитоскелетной природы этих белков.

40 кД белок присутствовал и в препаратах полисом, причем МСП и ДСП содержали на порядок больше этого белка, чем препараты СП (Табл. 2, рис. 4).

Высокое содержание 40 кД белка во фракциях связаных полисом коррелировало со способностью этих полисом седиментировать при изменении ионных условий при очень низких скоростях

Таблица 2. Относительное содержание 40 кД белка в препаратах СП, МСП и ЦСП.

№ опыта фракция полисом

СП МСП ЦСП

1 0.024 0.166 0.160

2 0.025 0.128 0.147

3 0.06 0.104 -

4 0.031 0.126 -

5 0.06 0.121 -

6 0.03 0.08 0.190

среднее 0.03810.007 0.121 ±0.002 0.165 ±0.013

а б

л г з ч

Рис. 6. Осаждение полисом при низкоскоростном центрифугировании (5000 g, 5 мин).

(а) Элгхтрофореграммы белков СП и МСП, подвергнутых низкоскоростному центрифугированию и (б) степень обогащения полисомами низкоскоростных осадков.

(I) Актин из желудков цыплдт; (1) СП в осадке; (2) СП в супернатанте; ф МСП в осадке; ) МСП в супернатанте.

центрифугирования (5000 g, 5 мин) (рис. 6). При этом происходило 20-кратное обогащение седиментирующих полисом белком 40 кД. Возможно, этот белок и является фактором, аггрегирующим рибосомы.

Итак, характер распределения 40 кД белка при фракционировании клеточного гомогената il при низкоскоростном центрифугировании препаратов полисом говорит в пользу его связи как с цитоскелетом, так и с рибосомами.

40 кД белок из листьев Vicia faba: актин или родственный актину белок? Попытки иммунологической идентификации 40 кД белка привели к противоречивым результатам. Белок давал положительный сигнал при взаимодействии с анти-актиновыми поликлональными антителами, полученными О.И. Соколовым (ИФБМР РАН, Саратов) против актина из желудков цыплят (Зак и соавт., 1996). С другой стороны, поликлональные антитела против С-терминального участка актина (А-2066, Sigma) и моноклональные антитела N350 против животного актина не реагировали с 40 кД белком.

Другим способом обнаружения сходства белка 40 кД и актина стали опыты по ограниченному протеолизу этих белков весьма специфичной протеиназой из Staphylococcus aureus V8. Известно, что V8 расщепляет актин всего на два фрагмента: один, с мол. весом 27 кД, представляет собой N-концевой участок (примерно 2/3 молекулы актина), а другой — С-концевой участок с мол. весом 16 кД (около 150 аминокислот) (Mornet, 1984). Из рис. 7 очевидно, что продукты протеолиза 40 кД белка и актина из желудков цыплят были весьма близки, хотя и не идентичны. Более крупный фрагмент протеолиза белка 40 кД точно совпадал с соответствующим фрагментом актина, в то время как второй фрагмент 40 кД белка был несколько мельче

соответствующего фрагмента актина, что соответствует несколько меньшему мол. весу белка.

На основании полученных результатов можно было бы предположить, что 40 кД белок является продуктом некоторой протеолитической деградации актина в процессе выделения полисом, хотя проведенные нами опыты с добавлением различных ингибиторов протеаз в буферы для выделения говорят против такого предположения.

Очевидно, что вопрос об актиновой природе 40 кД белка пока окончательно не решен, хотя накопленные нами сведения позволяют предположить участие этого белка в процессе взаимодействия полисом с актиновым цитоскелетом.

Рис. 7. Продукты переваривания белка 40 кД и актина из желудков цыплят протеазой из St. aureus V8. (1) Белок 40 кД; (2) актин из желудков цыплят; (3) протеаза V8,40 мкг/мл.

1 2 3

Активность трансляции различных субпопуляций полисом в

бесклеточной системе. Взаимодействие полисом с цитоскелетом in vivo.

очевидно, может влиять на процесс трансляции, обеспечивая пространственное сближение компонентов белкового синтеза дгм более эффективного функционирования или с помощью каких-то других механизмов. Действительно, имеются данные о том, что взаимодействие аппарата трансляции с цитоскелетом полезно для трансляции (Lenk, Penman, 1979; Cereva et al., 1981; Van Venrooij et al., 1981; Ornelles et al., 1986). В других работах не было найдено прямой взаимосвязи между трансляцией матриц и их связью с цитоскелетом (Moon et al., 1983). Все эти данные были получены для клеток животных.

б

25 60

время, мин

£

25 60

время, мин

Рис. 8. Временной ход включения [355]-метионина в белок полисомами, выделенными из проростков ячменя в бесклеточной системе из зародышей пшеницы.

(д) — СП; (•) — МСП; (ф) — ЦСП; (а) — в расчете на оптическую плотность препарата; (б) — с поправкой на долю полисом в препарате.

В проведенных опытах по трансляции разных субпопуляций полисом в бесклеточной системе из зародышей пшеницы мы получили предварительные данные, свидетельствующие о большей трансляционной активности связаных полисом, выделенных из проростков ячменя (рис. 8). Эти данные в сочетании с наблюдаемыми нами различиями в профилях распределения полисом в градиентах концентрации сахарозы (больший процент тяжелых полисом во фракциях МСП и ЦСП) (рис. 1) позволяют предположить большую активность синтеза белка in vivo, протекающего на лесах цитоскелета и мембран.

ВЫВОДЫ

1. Из зеленых листьев конских бобов, этиолированных проростков пшеницы и зеленых проростков ячменя выделены субпопуляции полисом, связанных с цитоскелетом.

2. Вестерн-блот анализ с моноклональными анти-актиновыми антителами показал, что препараты полисом из листьев конских бобов содержат актин с мол. весом 42 кД, что, возможно, отражает их связь с цитоскелетом. существовавшую в интактной клетке.

3. Нерибосомный белок с мол. весом 40 кД присутствовал в препаратах полисом; мембранно-связанные и цитоскелетно-связанные полисомы были особенно обогащены этим белком.

4. Характер распределения 40 кД белка при фракционировании клеточного гомогената и при низкоскоростном центрифугировании препаратов полисом говорит в пользу его связи как с цитоскелетом, так и с рибосомами.

5. Продукты ограниченного протеолиза 40 кД белка специфической протеиназой из Staphyllococcus aureus V8 были очень близки, хотя не полностью идентичны продуктам протеолиза канонического актина из желудков цыплят, однако 40 кД белок не взаимодействовал с моноклональными антителами N350 против актина животного происхождения.

6. Поликлональные антитела против ассоциированного с рибосомами кислого белка из Arabidopsis thaliana (р40 белок) обнаружили присутствие этого белка в препаратах полисом го листьев 5обов и проростков пшеницы. Одинаковое количество р40 белка в фепаратах свободных и связаных полисом делает маловероятным его частое во взаимодействии полисом с цитоскелетом.

7. В бесклеточной системе трансляции из зародышей пшеницы ембранно- и цитоскелетно-связанные полисомы синтезировали белок

более высокой скоростью, чем свободные полисомы.

» * *

Работа осуществлена при поддержке РФФИ (фанты N 94-04673, N 97-04-48602, N 96-15-98030).

Публикации

1. Аксенова JL А., Куликова A. JL, Соколов О. И., Зак Е. А., Клячко H. JL, 40 кД Белок из листьев Vicia faba: актин или родственный актину белок II Тезисы докладов 3-его ежегодного симпозиума общества физиологов растений (27 - 28 июня 1997, Москва), Москва, 1997, с. 1.

2. Аксенова JI. А., Зак Е. А., Куликова A. JL, Клячко Н. Л., 40 кД белок из листьев Vicia /aba: актин или родственный актину белок? // Физиология растений, 1998, т. 45, № 2, с. 208-217.

3. Klyachko N. L., Zak Е. A., Sokolov О. I., Aksenova L. A., Plant polysomes bound to the actin cytoskeleton // Proc. 19th Symp. Plant Physiol., Riverside, 1997, p. 16.

W^. /oo J/rUjUÛ