Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

БИОХИМИЧЕСКИЙ И ИММУНОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА КЛЕТОК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "БИОХИМИЧЕСКИЙ И ИММУНОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА КЛЕТОК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ"

о/ь-ъ^т

На пранак рукописи

Соколова Марина Константиновна

Биохимический и иммунохимический анализ пространственной организации актинового ни тоске лета клеток высших растений

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Сараю»-2008 г.

Работа выполнена в Институте биохимии к физиологии растении и микро^анизмои Российской академии наук (ИБФРМ РАН)

Зашита «vctohtcs «23» апреля 2008 г. к 10 часов на часедании диссертационног о сонета при Институт« биохимии и физиологии растений н микроорганизмов Российской академии наук (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов. [3),

С диссертацией можно ознакомиться и научной библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат диссертации размешен на сай ге ht)p://wvvw. i bppm.saralov.ru/obya v.dis.html

Автореферат разослан « 27 » февраля 2008 года.

ü^iiimíí рукпвонпсль:

доктор биолог« чес (ti ix наук I Iocob Александр Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Коннова Светлана Анатольевна

доктор биологических наук Кляч ко I (елла Леопольдом на

Веду им я организация:

Институт цитологии РАН

УчСпый секретарь диссергшиоиного сонета доктор биологически* наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Как известно, жизнь во всех ее разнообразных проявлениях представляет собой непрерывное движение. Способность двигаться - одно из свойств живого на Земле.

Сложный ансамбль внутриклеточных органелл характеризуется определенным положением и определенными путями перемещения в клетке, и необходимость управлять мембранными процессами требует тонкой организации внутриклеточной подвижности. У всех изученных клеток, будь то амеба, клетка млекопитающего или растения, комплекс подвижности построен из похожих элементов. Тем не менее, каждый тип клеток отличается своим, особым спектром цитоскелетиых белков, присутствующих в определенном соотношении и специфическим образом расположенных (Baskin, 2000).

На данном этапе исследований становится все более очевидным, что цитоскелет является той самой структурой клетки, которая динамически объединяет ее отдельные элементы и обеспечивает функциональную стабильность многих внутриклеточных процессов. Изучению разных аспектов функционирования и регуляции, в частности, актинового литоскелета посвящено огромное количество работ.

В последние годы в литературе стали появляться разнообразные сведения об актинах из растительных объектов (Chaffey, 2005). Изучение актина в растениях по-прежнему сопряжено с рядом трудностей в связи с низким содержанием его в цитоплазме растительной клетки и высокой лабильностью по отношению к протеазам (ChalTey, Barlow, 2002). Поэтому эти сведения остаются весьма отрывочными и неполными по сравнению с животными объектами. В связи с этим проблема биохимической идентификации и пространственной визуализации акти новых компонентов является весьма актуальной (Mu, Brady et al., 2000; HtW. Laing ei al,, 2002; Kwok, Hanson, 2004; Sheahan, Staiger et al., 2004). Будучи одним из основных компонентов сложного комплекса шпоскслста растительной клетки, актнн принимает участ ие в осуществлении большинства функций как внутри одной клетки: формирование микрокомлартментов (для ферментных ансамблей, биосинтеза белка), направленное движение цитоплазмы и органелл (Клячко, 2005), определение пространственного расположения составляющих клетки (Клячко, 2004), синтез клеточной стенки, митоз и мейоз; так и в системе межклеточных взаимодействий: участие в передаче си тала с мембранных рецепторов, в регуляции транспорта веществ через гшазмодесмы (Клячко, 2003), а также в механизме флоомного транспорта (Kehr, Itaebel et а/., 1999).

Разнообразные методы идентификации аггина (Stunner, Bsumann. 1998; Rediiy, 2001; Peruski, 2003; Runions, Brach et al., 2006) детально разработаны лишь для мышечных объектов, в то время как для растений эти методы нуждаются в существенной модификации с учетом биохимической специфики объекта. Таким

г~ "рГАУ-МСХЛ \ имени К.А. Тимирязева ; ЦНБ имени Н.И. Ж-.езнова

образом, изучение топографии и биохимической организации сложного надмолекулярного комплекса белков, в основе которой лежит актиновый цитоскелет, необходимо для формирования Со:их полной картины функционирования живой клетки растений. Кроме того, для понимания работы актинового цитоскелета очень важно дифференцирование полимерного и мо номерного состояния этого белка я клетке.

Целью данной работы было изучение пространствен ной организации системы белков актннового цитоскелета клеток высших растений.

В работе ре шолись следующие задачи:

1. создать набор маркЕров для идентификации различных форм актина на основе фуккцжтйльно-активного фрагмента молекулы мышечного м ночи на и фаговых антиактнновых миниантител;

2. с использованием порученных маркС ров изучить морфологические особенности конфигурации актш¡-содержащих структур клеток растений;

3. на препаратах разрушенных протопластов растительных клеток исследовать трёхмерную организацию актннового цитоскелета н его связь с органеллами;

4. сравнить информативное! ь методов нммунофлуоресцентной и электронно-микроскопической идентификации и визуализации актина в клетках растений.

Научная новизна ряботы

Показаны особенности н детали строения актинов ых филаментов на протопластах клеток каллусных тканей моркови к) табака, о также клеток мезофилла листьев табака и бобов.

Разработан метол получения специфического маркёра к актину на основе тяжелого меромиозина (функционального фрагмента молекулы миозина) н коллоидного золота.

Продемонстрирована принципиальная возможность идентификации растительных актинов с помощью антиактнновых миниантител, полученных методом фагового дисплея.

Практическая значимость работы

Разработанный нами подход с применением конъюгатов коллоидного золота с рядом узнающих молекул (антителами, мин «антителами, фаллоидином и тяжелым меро миозином), а также конъюгаюв флуоресцентных меток с теми же молекулами может быть использован для создания тест-систем на белки актннового цитоскелета на основе иммунохпектронной и нммунофлуоресцентной микроскопии. Это позволяет достаточно надежно и оперативно идентифицировать различные формы актинов и открывает широкие перспективы для выяснения роли актина в структурно-функциональной организации растительной и животной клеток в фундаментальных и

прикладных исследованиях.

Полученные препараты ис пользуются для решения широкого круга фу ндамента льны х и прикладных задач в лабораториях Института физиологии растений им. К,А. Тимирязева Российской академии наук, а также Никитского ботанического сада - Национального научного центра Украины.

Не защиту выносятся следующие основные положения;

1. поверхность протопластов растений после их специальной подготовки для сканирующей электронной микроскопии представляет собой сетчатую структуру, которая содержит элементы цитоскелста;

1. хлоропласты связаны в единую сеть, одним из компонентов которой является актин;

3. созданные специфические маркеры: тяжелый меромиозин-коллоилное золото и полученные методом фагового дисплея мнниантитела - позволяют выявлять как филаментиую, так и мономерную формы актина, соответственно, методами дот-анализа и различными вариантами микроскопии;

4. разработанный набор маркеров в сочетании с использованными микроскопическими и биохимическими методами позволяет выявлять детальную организацию актин ового цктоскелета в клетках растений.

Работ» выполнена в лаборатории физиологии растительной клетки 11БФРМ РАН в рамках следующих бюджетных тем: «Изучение пространственно-временной организации белков цктоскелета клеток растений», научный руководитель темы д.б.н. Соколов 0,11, № госрегистрации 01890008367; «Изучение роли актннового цнтоскелета в адаптивных и коммуникационных реакциях клеток растений», научный руководитель темы д.б.н. Соколов О.И^Хг ««регистрации 01200606178.

Данная работа была также частично поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований: № 99-04-48833; № 04-04-48601.

Личный »клад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве с д.б.н, Соколовым О.И. и к.б.н. Ильчукоаым В.В, На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении н анализе которых роль автора была определяющей. В иммунохимнческнх экспериментах использовались мнниантитела, полученные сотрудниками ИБФРМ РАН к.в.н. Староверовым С.А. и КостешаП.В.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены и обсуждены на IV съезде Всероссийского общества физиологов растений и Международной конференции «Физиология растений - наука Ш тысячелетня», Москва, Россия, октябрь 4-9, 1999; XIV Коми республиканской молодежной научной конференции, Сыктывкар, Россия, апрель 18-20, 2000; конференции «Цитоскелет и

клеточная регуляция». Пущи но, Россия, май 11*12,2000; Int. Symp. «Signalling systems of Plant Cells», Moscow, Russia, June 5-7, 200); Int. Syrup. «Biological motility; New trends in research», Pushchino, Russia, Лир. 20-26, 2001; 2-Й Международной конференции «Анатомия и морфология растений*, Санкт-Петербург, Россия. 2002; VIH Int, Conf, «The Biology оГ Plant Celts in vüro and Biotechnology», Saratov, Russia, Sept. 9-13, 2003; V съезде общества физиологов растений России и Международной конференции «Физиология растений — основа фитобиотехнологии», Пенза, Россия, сентябрь 15-21, 2003: Всероссийской конференции «Молекулярные меха um мы взаимодействия микрооргашпмов » растений: фундаментальные и прикладные аспект», Саратов, Россия, июнь 15-17, 2005; Int Symp. «The Plant Cytoskeleton: Genomic and Bioinformatic Tools for Biotechnology and Agriculture», Yalta, Ukraine, September 19-23, 2006; VI съезде общества физиологов растений России и Международной конференции «Современная фитология растений: от молекул до экосистем», Сыктывкар. Россия, нюнь 18-24,2007.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, в тон числе 2 статьи в репетируемых журналах m списка ВАК,

Структура работы. Диссертация изложена на 131 странице, содержит 42 рисунка, 5 таблиц и состоит из введения, основной части, содержащей три главы (обзор литературы, экспериментальная часть, результаты и обсуждение), заключения, выводов н списка использованной литературы (334 источника).

Содержание работы

В обзоре литературы даны современные сведения о системе белков цнтоскелета эукариот и систематизированы данные об актиновом цитоскелете растений, его функциях и методах идентификации. В экспериментальной части описываются объекты исследований, использованные методы, полученные результаты и их обсуждение. Работа завершаете* обобщающим заключением и выводами.

Разработка к получение функционального маркера к К-аюпшу на основе тяжелого меромкозина. Дня исследования актинового цнтоскелета необходимо иметь надёжные инструменты — маркеры на актин. Однако предлагаемые разными фирмами маркеры не перекрывают все варианты и потребности визуализации или количественной оценки соотношения полимерной и мономерной форм актина, оценки функциональной активности F-актииа в том или ином типе клеток. Кроме иммуноглобулиновых и фалдоидиновых маркёров, для изучения акти нового цнтоскелета, ассоциированного с актин-севбывающими белками, весьма перспективным представляется разработка и использование "функционалы 1ых" маркСров. В частности, в работах Nakayama с соавт. (1998) были использованы фрагменты головок миозина (одного из яктин-ассоциированных белков). иесушие домены, ответственные за мехаиохимическое

взаимодействие двух белков, обеспечивающих актомиозиновую подвижность in vivo и in vitro.

Мышечный миозин при низкой ионпой силе способен образовывать толстые биполярные филаменты. Его молекула представляет собой асимметричный гексамер с массой 460 кД. В молекуле различают фибриллярную часть, состоящую из двух переплетенных спиралей, каждая их которых имеет на одном конце глобулярную головку, несущую две субъедин и иы (легкие цепи). Таким образом, гексамер включает одну пару тяжелых цепей (молекулярная масса 200 кД) и две лары легких цепей (молекулярная масса 15 и 27 кД). Все миозины обладают АТФ-азиой активностью и способны связываться с F-актином (Engelhardt, Ljubimova, 1939; Поглазов, Левицкий, 1982; Foth et at^ 2006). У растений миозин был найден в листьях Egeria (OlisuVa, Inoue, 1979), в эндокарпе Lycopersicon (Vahey, Titus etat., 1982), проводящих тканях Heracleum (Соколов, I9S3) и усиках Pisum (Ma, Yen, 1989). По некоторым свойствам эти миозины имеют сходство со скелетным мышечным миозином.

Ещё в начале 50-х годов были получены сведения о возможности расщепления молекулы миозина протеолитическими ферментами в определенных «шарнирных» участках (Szent-Gyorgy, 1953; Spud ich, Krön et al., 1985). Одним из полученных таким образом фрагментов оказался так называемый тяжелый меромиозин (ТММ), который представляет собой водорастворимый фрагмент молекулы с массой 350 кД, содержащий глобулярную часть и остаток фибриллярного хвоста молекулы (Pollard, Stafford ei al-, 1978). Он, как и целый миозин, обладает всеми АТФ-азнымн активностями и сохраняет способность взаимодействовать с полимерным актином.

Для получения ТММ нами был проведен ограниченный протсолнз миозина скелетных мышц кролика трипсином к получена водорастворимая фракция ТММ. На рис. 1 представлен электронно-микроскопический снимок полученной фракции ТММ. Диаметры отдельных фрагментов колеблются от 19 до 32 им. Так как расщепление происходило под действием трипсина, то мы получили не только глобулярные

фрагменты (головки), но и фрагменты с небольшой хвостовой частью молекулы миозина - так называемые "остатки хвостов", которые при низкой ионной силе раствора

Рис. I. Электронная микроскопия фрагментов тяжелого мерой нозина, полученного путем протеолиэа миозина трипсином (увеличение 44000)

способны к незначительной, по сравнению с «хвостами», агрегации. Помимо этого а препарате ТММ, по-видимому, присутствуют и другие фрагменты миозина, что также вызывает образование агрегатов, пилимых на рис. I. При приготовлении маркёра ТММ' коллоидное золото мы избавлялись от таких агрегатов путем ультраиентрифугировання препарата при 100 ООО в в течение 30 мин.

Полученный ТММ должен был сохранить ферментативную активность и способность взаимодействовать с I"-актином. Поэтому мы провели качественный анализ АТФ-азноЯ активности ТММ и его специфической чувствительности к действию двухвалентных катионов Са2\ и характерной К*-ЭДТА АТФ-азной активности.

Таблица Определение АТФ-азной активности мндаина и ТММ

Реакционная среда: 50 мМ КС1,10 wM Трио-HCI.pH 7.0,0.S мМ АТФ Улельная ферментативная активность миозина, мкмоль Фн/мг-мин Удельная ферментативная активность ТММ, мкмоль ФН/мг'мнн

1 мМ MgCI2 0.69 0.72

t мМ CaCJi 1.15 1.16

0.5 М K.CI и 10 мМ ЭЖА 2.30 2.35

Фн - неорганический фосфггт Как видно из таблицы, ТММ обладает всеми, присущими целой молекуле миозина АТФ-азными активностями, в том числе и характерной К+-ЭДТА АТФ-ааой. Полученный ТММ был сконъюгироеан с частицами коллоидного золота (15 нм) по стандартной процедуре (Дыкман, Богатырев и др„ 2002).

Электронно-микроскопнчсское шучение взаимодействии маркера ГММ-К"{ с Р-актнном. С применением электронной микроскопии установлено, что полученный маркер ТММ-КЗ специфически взаимодействует с актином (рис. 2). Важно отметить то, что фон практически не содержит свободных частиц маркера, что творит о его высокой специфичности. Ташке следует отмстить, что частицы маркСра взаимодействуют только с актином (не агрегируют между собой) и высоко монодисперсны.

' V- ' J

„"V .

r-'Ш

Рис, 2, Мечение маркером ТММ-КЗ куриного и кроличьего F-актина в концентрации 150 мкг/мл. Препараты дополнительно контрастировали 1 %-м у ран ил ацетатом

Среди других маркСров ш актин ТММ-КЗ уникален тем, что, как и миозин, является актин-связывающим белком, акткп-связывающие участки которого находятся именно на головках. Дня наблюдения взаимодействия полученного маркёра с актиноны м к нитями в ЭМ не требуется его дополнительного контрастирования, так как КЗ является электронно-плотным материалом. Следует отметить, что полученный маркер сохраняет способность взаимодействовать с актином так же, как и исходный ТММ, поскольку при конъюгации он связывается с частицами КЗ нековалентно, и слабые связи не нарушают нативность молекулы.

Таким образом, нами был получен биоспепифнческий маркер ТММ-КЗ, который даёт уникальную возможность идентифицировать актины как животного, так и растительного происхождения при микроскопированнн и в дот-анализе. Кроме того, данный маркСр является функциональным, то есть при внесении АТФ частицы маркёра диссоциируют от актиновых филаменгов и способны перемешаться вдоль них. Следовательно, с использованием данного маркера появляется уникальная возможность наблюдать н моделировать in vitro взаимодействие актина н миозина, которое лежит в основе биологической подвижности.

Получение янтнактм новых антител с помощью технологии фагового дисплея миниантител. Антитела находят широчайшее применение в медицине к научных исследованиях. Существенным шагом явилась разработка технологии монокл опальных антител. В последние годы был разработан подход, заключающийся в использовании так называемого фагового дисплея фрагментов антител. Эта технология состоит в конструировании библиотек антител, экспонированных на нитевидных фагах или (| «нем идах. Впервые возможность экспрессии одноцепочечных последовательностей, составленных из вариабельных доменов антител а составе гибридного белка оболочки фага, была продемонстрирована в работах Грсга Винтера и Джона МакКаферти в (990 году. Они же разработали метод быстрой и эффективной селекции клонов, несущих высокоаффинные антитела, с помощью антигена.

В работе использовали комбинаторную фаговую библиотеку миниантител овцы, любезно предоставленную профессором Уильямом Харрисом (Harris, Cunningham, 1995), В качестве антигена для селекции миниантител использовали очищенный актин нз скелетных мышц кролика. Для выделения наиболее специфичных и высокоаффинных миниантител проводили 3 раунда селекции. От раунда к раунду постепенно понижали концентрацию фаговых частиц от 10" до М10 мл*1. Кроме того, уменьшали время инкубации актина с фаговой библиотекой: в первом раунде инкубацию проводили в течение ночи при 4"С, во втором и третьем раундах - 1.5 ч и 1 ч при комнатной температуре,

Обогашенную таким образом библиотеку рассеваяи на чашки Петри. После трех

раундов аффинной селекции проводили иммуноскрннинг колоний с применением системы ЕС и Около 80% выросших колоний далн положительный сигнал, что указывает на высокую эффективность процедуры аффинной селекции библиотеки. Для дальнейшей работы было выбрано 11 клонов, которые дали наиболее выраженный сигнал (яркость пятна).

Для миниантител, продуцируемых выбранными клонами, были определены константы аффинности с помощью метода, описанного в работе (ВеаНу, ВеаЯу е( а!„ 1987). Из значений К^ (1.6 • 10т М*1) можно сделать вывод, что использование комбинаторной фаговой библиотеки с проведением нескольких раундов селекции позволило нам получить клоны, продуцирующие растворимые миниантител а со средней аффинностью к кроличьему актину. Эти миниантител а оказались пригодными для имму ногистохимичес кого выявления актина, тем более что антитела с более высокими значениями К^ часто приводят к ложноположительным результатам.

Создай не тест-систем к различным формам актина на основе золотых маркёров. Метод дот-анализа с применением биоспецифических маркбров - конъюгатов КЗ, находит все более широкое распространение благодаря его высокой чувствительности и простого выполнения.

На рис. 3 представлена детекция гладкомышечного Бахтина маркёром ТММ-КЗ в дот-анализе. Дополнительно этот маркйр позволяет оценивать и функциональные свойства АТФ-зависнмот а ктом йот инового взаимодействия.

Рис. 3. Дот-анализ куриного Р-актина (а, <)), О-актииа (Ь) и БСЛ (с) а последовательных двукратных разведениях (начальная концентрация 1 мг/мл) с использованием маркера ТММ-КЗ, контроль специфичности АТФ-зависииого связывания ТММ-КЗ в присутствии 5 мМ АТФ (й)

Мы сравнили чувствительность и специфичность полученных антнактнновых фаговых миниантител. Фаговые миниантител а выявляют препараты актина как из гладких и поперечнополосатых мышц животных (курицы, кролика), так и нз листьев бобов (рис. 4>.

Ог^г^з

№ • о о

! -Г'Г к.

«1 --■.

О* О]' .-"I у- >7-

Рис. 4. Дот-анализ актинов различного происхождения с использованием фаговых мнниаитител, Последовательные двойные раз&сдення: 1 - куриного гладкомышечного актина (начальная концентрация 0.4 мг/млк, 2-актииа из листьев Г. /aba (ОД5 мг/мл), 3 -кроличьего актина (0.25 мг/мл), 4 — овальбумин (контроль)

Чувствительность иммунодот-анализа с миннантителами в детектировании трех разных актинов различалась незначительно: так, для куриного актина она составила 12 нг, кроличьего — 4 иг, растительного — 15 иг. Широкая специфичность в отношении разных актинов и близкие значения чувствительности их выявления позволяют предполагать, что полученные миниантитсла связываются с антигенной детерминантов, высоко консервативной для всех трех актинов.

Кроме того в нашей лаборатории ранее были получены поликлональные кроличьи антитела к актину из гладких мышц куриных желудков, которые способны выявлять как б-, так и Р-форму куриного и кроличьего актина в дот-анализе им му ною лоты м маркёром на их основе с одинаковой чувствительностью — 25 нг. Растительный актин эти антизела не выявляют.

Помимо этого мы подтвердили ранее полученные данные (Рихтер, Грингауэ н др., 1990; Грннгауз, Негрецкий и др„ 1998), что маркер фаллоидин-Ю дайт уникальную возможность выявлять только р-форму актина. Синтезированный нами аналогичный марк£р способен выявлять как растительный, так н мышечный Р-актин с чувствительностью 50 нг, мышечный О-актин связывания с маркером не показал. Необходимо отметить, что во всех вариантах применения маркёров ~ конъюгатоа коллоидного золота в качестве контролей мы использовали меченные коллоидным золотом нее пе циф ические реагенты - бычий сывороточный альбумин иди овал ъбу мин.

Таким образом, представленные выше маркёры могут быть использованы для анализа актннового цитоскелета в любых препаратах. Миниантнтела способны выявлять актин в любых растительных и животных клетках. Фаллоидин-КЗ специфично выявляет Р-формы актина, а маркОр ТММ-КЗ позволяет оценивать функциональные свойства АТФ-зависимого актом нозиново го взаимодействия. Дот-анализ можно использовать как экс пресс-метод для предварительной оценки количества актина в препаратах, а также выявления его О- и И-форм.

Исследование т«по1рафип цитоскелета растительных клеток с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Наличие клеточной стенки представляет определённые трудности для изучения цитоскелета растений. Получение изолированных протопластов даёт возможность обойти эти трудности. Для наблюдения

с помощью СЭМ был испольтован модифицированный нами метод подготовки протопластов, не связанный с применением аппарата "критическая точка4.

Основная масса свежевы делен них протопластов из каллусной ткани моркови и табака и листьев табака и бобов имела одинаковую топографию поверхности. Протопласты диаметром от 10 до 25 мкм имели незначительно шероховатую поверхность без видимых структурных образовании с немногочисленными порами (рис. 5А). По-видимому, при обработке препаратов осмиевой кислотой (РоНак, УапккИ. 1985) в плазмалемме фиксируются все белковые мембранные н трансмембранные комплексы в липидном окружении. Такую же фиксацию обычно используют при подготовке препаратов классическим способом - с применением аппарата «критическая точка» (^¡к. Бтокг^кауа на!., 1992).

Существенные отличия мы наблюдали в вариантах без стадии дополнительной фиксации осмиевой кислотой.

Л Б В

1*нс. 5. Топо1 рафия поверхности протопластов:

Л) протопласт клетки листа табака Фиксация: 0.5% глутзровый альдегнд+2% форм ал ьдегид.

Постфиксания: 1%осмиевая кислота, Масоггабиая линейка- 1.5 мкм; Б) протопласт клетки каълусной ткани моркови. Фиксация как для (Л). Постфиксацню

осмиевой кислотой не проводили. Масштабная ли ней ка - 1,5 мкм: II) протопласт клетки каллусной ткани моркови. Фиксация и постфиксацня как для (Б). Масцпабная линейка- 1.1 мкм

Выявлено два тина протопластов, отличающихся топографией поверхности: 1. диаметром около 15 мкм с бугристой поверхностью и округлыми образованиями размером 0,5-1.5 мкм, периметр которых окаймлбн глобулами размером 0.3 мкм (рис. 5Б); 2. диаметром 10-12 мкм с сетчатой поверхностью без видимых структурных образований (рис. 5В). Сетчатая поверхность представлена конусовидными ячейками различной высоты. Протопласты без фиксации осмиевой кислотой, скорее всего, теряют липнлиые компоненты при обезвоживании органическими растворителями, и мы наблюдаем сетчатую структуру поверхности. Деталыгый анализ микрорельефа поверхности выявляет значительное количество пор, похожих по топографии на окаймленные пузырьки.

При наблюдении в СЭМ мы обнаружили агрегаты протопластов, соединенных многочисленными тяжами, которые, возможно, представляют собой зле меты плазмодесм.

Мы предполагаем, что выявляемый СЭМ сложный микрорельеф поверхности протопластов образован в том числе и компонентами цитоскелета, в частности а клиновой составляющей. В ряде случаев происходило разрушение протопластов, что приводило к экспонированию внутреннего кортикального слоя цитоплазмы (рис, 6). По сравнению с внешней, внутренняя поверхность имеет более сложную топографию.

Рис. 6. Внутренняя топография разрушенных протопластов:

А) протопласт нз каллуса моркови. Фиксация: 0,5%глутзровый альдегид + 2% формальдегид. 1м;з посгфиксацин осмиевой кислотой. Масштабная линсПка- 1.5 мкм;

Б) протопласт из каллуса табака. Фиксация как для (А). Масштабная линейка- 1.5 мкм

На рис, 6 видно, что внутренний слой представляет густую сеть переплетенных тяжей, филаментов и их агрегатов. Хотя говорить об идентификации актиновой составляющей на препаратах, подготовленных для СЭМ. не представляется возможным, тем не менее, основываясь на данных, полученных нами в других вариантах микроскопии, можно с большой долей вероятности утверждать о наличии актина в этом надмолекулярном ансамбле. Известно, что получение протопластов является стрессовым фактором для клетки, при этом часть цитоматрикса может разбираться. И вей-таки мы наблюдали, что определенная доля органелл остается закрепленной на толстых тяжах (рис. 7>. По-видимому, они представляют собой траиецитоплазматические тяжи, которые являются частью единой сенсорной системы клетки, контролирующей расположение органелл и их движения а ответ на внешние сигналы.

Полученные нами результат позволяют дополнить сведения о том, что в ходе онтогенеза растительной клетки происходят существенные изменения в структуре субкортикального цитоматрикса. Так, на стадии перехода от деления к растяжению клетки характеризуются менее развитой системой субкортикального цитоматрикса, а на стадии растяжения происходит его утолщение. В дифференцированных клетках

А

Б

субкортикальный цитоматрикс вновь принимает вид "рассеян ной" сети, что предположите л ьно связано с обеспечением функциональной активности плазмалеммы, А Б

Рис. 7. Органеллы нз разрушенных протопластов листа табака. Фиксация и ностфнксашя как в рис. б. Масштабная линейка - 3 мкм

Изучение топографии и объёмной организации хлоропласте в в протопластах.

Как было сказано ранее, без постфиксации препаратов осмиевой кислотой часть протопластов разрушается, открывая внутриклеточную органи-шцию, в том числе и органелл (рис. 8). Мы обнаружили, что на препаратах протопластов из листьев табака и бобов хлоропласты часто образуют единую структуру, соединяясь друг с другом несколькими "толстыми" тяжами (рис. 8А).

А Б

Рис. 8. Внутриклеточная организация комплекса хлоро пластов:

А) разрушенный протопласт из мезофилла табака Фиксация: 0.5% глутаровый альдегид + 2% формыьдегил. Посгфмксацию осмиевой кислотой не проводили. Масштабная линейка-3 мкм;

Б) организация хлоро пластов в клетках листа бобов. Масштабная линеПка-5 мкм

Тяжи, соединяющие хлоропласты (если предположить их наиболее вероятную актиновую природу), могут иметь двойную функцию. Во-лерных, они могут участвовать с помощью моторных белков в перемещении органелл, обеспечивая наиболее оптимальное расположение хлоропластов. Во-вторых, удерживать хлоропласты в токе

цитоплазмы.

Применение маркёра фаллоидни-коллонлиос золото в световой микроскопии. Принципы визуализации золотых маркёров в световом микроскопе основаны на свойствах КЗ поглощать (просвечивающая) и рассеивать (гемнонолъная и эпиполяризационная микроскопия) видимый свет.

Исследования проводили на тонких срезах каллусных тканей табака и моркови, а также листьев табака н бобов, заключенных в полиэтилен гликоль 1500, С помощью маркёра фаллои дин-КЗ и последующею усиления солями серебра (Миронов. Комисарчик и др., 1994) можно локализовать актии-содержашие структуры клеток (рис. 9). А В

Рис. 9, Лктин-содержащие структуры на полутонком срезе каллусиой ткани табака, Фаллондин-КЗ, усиление серебром (масштабная линейка 50 мкм): Л) автофлуоресненцня клеток каялусноН ткани табака: Н) выявление актинов ых фияамекгов

Традиционным приёмом, обеспечивающим хорошую сохранность морфологических структур, является заключение материала в парафин или в синтетические смолы. Однако эта процедура может привести к разрушению или изменению антигенных детерминант, позтому мы заключали растительные ткани в полизтиленгликоль, что: 1) исключает воздействие ксилола и других органических растворителей; 2) позволяет снизить температуру заключения; 3) вызывает меньшее сжатие ткани (5% от исходного объема, вместо 50%- в парафине); 4) занимает н два раза меньше времени; 5) обеспечивает сохранность антигенных детерминант. Заключение в полиэтиленгликоль позволяет получать тонкие срезы до 0.25 мкм.

Па срезах каллусных тканей моркови и табака можно выделить несколько типов распределения филаментов актина:

1. в цитоплазме клетки наблюдается рассеянное распределение маркёра (рис. 9);

2. меристематические зоны представлены клетками с большим количеством И-актина (рис. ЮЛ);

3. много маркера выявляется вокруг ядер клегок (рис. 10Б);

4. очень мало маркёра обнаруживается в сильно вакуолизированных клетках (рис. 10В).

Рис. 10. Выявление актнн-содержащих структур на полутонки* срезах каллусиой

ткани моркови. Фаллоидин-КЗ (усиление серебром):

A) меристематическая зона;

Б) актшювыс фнламеиты, выявляемые вокруг ядер;

B) сильно вакуолкзнроаанные клетки

В неэмбриогенных клетках каллусной ткани можно видеть обширную актиновую сеть (рис. 10В). которая выявляется на полутонких срезах в виде диффузного распределения фал ло шипового маркЕра. Клетки почти любой каллусной ткани сильно вакуолнэированы, здесь не наблюдается четко выраженной структуры. Внутри некоторых клеток (рис. ЮБ) видна интенсивная "посадка" маркёра, свидетельствующая о значительном содержании актинового компонента. Судя по размерам и расположению органелл, акгиновые филаменты группируются около ядра. В литературе подобную структуру называют корзинкой и одной из еЗ белковых составляющих являются филаменты актина. Но на рис. 9 н 10В количество актиновых филаментов около ядер незначительно. Скорее всего, это связано с фазой клеточного цикла. На срезах листьев бобов (рис, 11) маркёр фаллоидин-КЗ, усиленный серебром, обнаруживается в наибольшем количестве вокруг хлоропластов. По литературным данным, хлоропласт окружены цнтоскелетпой сетью, и главной составляющей являются микрофиламенты. Также много филаментов актина визуализируется в эпидермальнмх и устьнчных клетках.

Рис. 11. Выявление Р-акгвна на поперечном срезе листа бобов: А) автофлуоресцеиция Б) фаллоидин-КЗ, усиление серебром (один и тог же препарат)

Рис. 12. Акгнновме фил агенты в протопластах из листа табака, Фаллоидин-КЗ, усиление серебром:

А) актнновые филаченты в субкортикальной зоне клетки: Б) акти новые фнламенты в комплексе хлоропластов

На препаратах протопластов (рис, 12) видны места наибольшего распределения р-актина в субкортикальной зоне клетки и вокруг хлоропластов (черное окрашивание серебром). По-видимому, актин и составе сложной сети цитоскелсто не может быть полностью выявлен этим маркером в связи с экранированием участков связывания фаллондика другими актин-ассо1 жированными белками. Также следует принять во внимание присутствие й-формы актина, которая не визуализируется фаллоидиновым маркёром.

Таким образом, нам удалось выявить две преимущественные конфигурации акти ново го цитоскелета, характерные для исследованных нами растительных объектов:

а) субкортикальная цитоплазматическая микрофиламентная сеть;

б) сеть, окружающая поверхности органелл,

Кммунфхимнчсеккй анализ белков яктннового цитоскелета растений с использованием фаговых миннангктсл. Достаточно высокая чувствительность фаговых мнниантител в выявлении актинов различного происхождения позволила использовать их в им му но гистохимических методах окрашивания.

Мы использовали непрямой вариант иммуномечения («сэндвич-метод» или «мостиковый метод»), который позволил получить яркое чёткое свечение маркСра (в качестве первичных использовали антиактиновые фаговые миниантитела, вторичных -антифаговые кроличьи антитела, и третичных - ИТС-меченые ослиные антикролнчьи антитела). Специфичность реакций проверяли, сопровождая каждую серию опытов рядом контролей. Миниантитела выявляют как филаментный. так и мономерный актин. Па рисунке 13А видна субкортикальная сеть, выявляемая на тенях протопластов. Н разрушенном протопласте наблюдается не только субкортикальная актнновяя сеть (рис, 13Б), но н наличие актина вокруг хлоропластов (рис. 131)).

Л Б В

Рис. 13. Л ».типовая сеть иа тенях протопластов из листьев бобов. Выявление

фаговым» мнниантителамн (непрямое нммуцомечение):

A) ойший вкд октиновой сети протопласта;

Б) субкортикальная акта новая сеть в разрушенном протопласте;

B) актин вокруг ялороп ластов

Сравнительный а нал из актин-содержащих структур в клетках растений. Для

комплексного анализа актин-содержащих структур в клетках растений мы сравнивали результаты, полученные с маркерами, сделанными в нашей лаборатории, а также маркЕром фаллоидии-TRITC фирмы "Sigma" (США) при разнообразных вариантах микроскопии. Особое внимание было уделено изучению структурной организации субкортикального слоя цитоскелета клеток растений и организации хлоро пластов с помощью сканирующей, иммунофлуоресцентной и электронной микроскопии.

Как уже отмечалось выше, на "сколах1" протопластов (рис. 6А) была обнаружена "шуба", толстый слой (до нескольких мкм) субкортикального цитоматрнкса, состоящий из сети переплетенных филаментов и их пучков в виде кольцевидных образований и волнообразных складок. Мы предполагаем, что такое сильное развитие субкортикального цитоскедета в протопластах из клеток каллусной ткани моркови обусловлено его участием не только в обеспечении функциональной активности гьзазмалеммы. по и в механическом подяержаиии формы клеток.

Биохимическая природа элементов, составляющих субкортикальный слой цитоматрикса. остается пока не полностью изученной. Однако иа "тенях" протопластов нами показало, что в его образовании (рис. 12 и 13) участвуют актиновые элементы, выявляемые разными маркёрами.

Антиактиновымн фаговыми миннантнтелами (рис. 13К) мы выявляем как мономеры, так и филам енты актина в субкортикальной зоне протопластов, а в ряде случаев необходима дифференциация филаментов от мономеров. Поэтому кроме антител также использовали фаллоидин, который специфически связывается только с F-актином (рис. 12). Такой подход позволяет более полно охарактеризовать актиновый интоскелет.

Цитоске летный остов, сохраняющийся после фиксации клеток, отличается сложным строением, в нем сохранены многие элементы, связывающие цитоскелет с ядром, оргонеллами и плат модем мой. Ьелки иитоскелета соединяются друг с другом специфичным для каждого типа клеток образом и формируют сложные, динамические, взаимодействующие между собой структуры.

Рис. 14. Локализация Р-акгнн содержащих субкортикальных структур:

А) ультратонкие срезы апикальных клеток стебля мари красной. Фадлоиднн-КЗ (Ю нм| Масштабна* линейка - 100 нм. (ПМ -плазмалемма, ЦП —цитоплазма): Б) полугонкне срезы клеток каллус ной культуры фикуса лировидного. Фаллондин-ТШТС

Четкость выявления тех или иных структур во многом объясняется функциональным состоянием клеток. В связи с этим мы дополнили наши традиционные объекты исследования контрастными ио физиологическому статусу тканями — меристематнческими клетками апекса стебля мари красной (рис. 14А) и большими ларенхимкыми клетками каллусной ткани фикуса лировидного (рис. 14Б). На ультратонких срезах стеблевого алекса (рис. 14Л) можно четко выделить олек трон неплотные структуры с интенсивным мечением маркером фадлоиднн-КЗ. Прежде все1\>. это густа* электронно-плотная сеть тонких фплачентов, хорошо различимая в субкортикальной зоне клеток. Известно, что в этих компартментах клетки идут активные физиологические процессы, связанные е растяжением и синтезом вторичной клеточной стенки, в которых значительную роль. наря,'|у с микрогрубочками, играют и микрофиламенты. Актиповые филамеиты могут контролировать характер распределения микротрубочек и, таким образом, влиять на расположение и ориентацию фибрилл целлюлозы клеточной стенки.

Каллусныс клетки (рис. 14Б) обладают менее развитой клеточной стенкой. Субкортикальный цитоматрикс этих клеток показывает значительное количество актнновых фила ментов, которые распола! тмотся по периметру клетки параллельно оси растяжения м, скорее всего, могут служить транспортными напраиляюшими для

А

Б

декретируемых везикул.

Верн£мся к наличию элементов цитоскслета в организации хлоропластов, что было показано в ряде работ (Karidasamy, Meagher, 1999; Baluska, Jasik etat., 2001; Cardenas, Lovy-Wheeler et a/.. 2005). Хлоропласты остаются в единой сети при мягком лизисе мембраны (рис, 8). В системе хлоропластов, по литературным данным, имеется два варианта организации микрофиламентов актина, подтверждаемых н нашими результатами: продольные пучки актиновых тяжей (рис. 13В) и беспорядочно ориентированные филаменты. Последние были выявлены нами в виде рассеянной сети на некотором расстоянии от поверхности органелл (рис. 12).

Рис. 15. Локазнзация Р-актнн содержащих структур вокруг хлоропластов:

Л) ультратонкие срезы апикальных клеток стебля мари красной.

Фатжждин-КЗ{10 нм). Масштабная линейка-100 им;

Б) отдельные хлоропласта т листьев бобов. Фаллоиднн-ТШТС

На рнс. 15Л хорошо различимы электронно-плотные сете видные структуры с интенсивной посадкой фаллондинового маркёра как в субкортикальной зоне, так и вокруг хлоропласта. При разрушении комплекса хлоропластов (рис. 15Б) вокруг индивидуальных хлоропластов хорошо видна интенсивная посадка маркСра фаллоидин-Т1?ГГС, что говорит о значительном присутствии полимерного актина вокруг органелл. Следует отметить, что при подготовке таких препаратов Р-актин быстро разрушается, видимо, под воздействием эндогенных протеаз, поэтому было важно разработать условия для максимального сохранения актнноеых филаментов для микроскопических исследований.

Известно, что актиновые микрофиламе»ггы играют важную роль а создании лабильной системы заякоривання хлоропластов и изменения их ориентации, причем этот процесс может осуществляться через регуляцию баланса пулов мономерного и фнламентного актина вблизи поверхности органеллы.

А

Б

ЗАКЛЮЧЕН) №

Живая растительная клетка содержит тонко регулируемую систему белков цитоскелета и обладает способностью адекватным обратом реагировать на изменяющиеся условия внешней среды. Обнаруживаются все новые и новые шпоскелетные белки. Однако современных знаний недостаточно для понимания сложной архитектуры питоекелета и "хореографии клетки"*, т.е. движения се различных компонентов во времени и пространстве. Но такое движение и позволяет клетке поддерживать множественные функции. Цитоскелет не только определяет внутреннюю организацию отдельной клетки, роль цитоскелетл шире — создаваемые им силы натяжения могут определять архитектуру многоклеточных образований - тканей и органов растений.

Сведения, имеющиеся в литературе, говорят о структурной н генетической консервативности актинов клеток животных и растений. Данные о взаимодействии препаратов актина растений с антителами к актину из тканей животных, связывание их е маркёрами на основе фаллондина подтверждают функциональное и структурное родство актинов животного и растительного происхождения на уровне биохимических препаратов. Это говорит о наличии сходных функций, выполняемых актиновым цитоскслетом. Актин в клетках существует в динамическом равновесии полимерной и мономерной форм. Одним из важных компонентов штоскелета являются актиновые микрофиламенты. Применение маркёра "фадлои дин-коллоидное золото" дало возможность визуализации элементов актинового остова в протопластах, тонких и ультратонких срезах и субклеточных препаратах. В цитоплазме исследуемых клеток выявлены преимущественные конфигурации а кти ново го скелета: а) толстые филаментные тяжи, пронизывающие цитоплазму и вакуоли; б) цитоплазматнчсская микрофнламентная сеть, которая окружает и внутриклеточные орншеллы; в) субкортикальная сеть Р-актина,

Таким образом, световые и электронно-микроскопические данные иаших исследований и других авторов дают основание рассматривать актиновый цитоскелет растений как обширную и динамичную трехмерную структуру, объединяющую всё пространство растительной клетки от плаз мал еммы до оргзнелл.

Изучение топографии и структурной организации сложной надмолекулярной системы белков, в оеноие которой лежит актнновый цитоскелет, необходимо для формирования более полной картины функционирования растительной клетки. Выяснение разнообразных функций цитоекедета во многом основано на исследованиях его структурной организации и выявлении составляющих его компонентов. Возможно, этому могут способствовать оригинальные маркёры и новые подходы визуализации актннового цитоскелета, представленные в данной работе.

ВЫВОДЫ

t. В клетках растений выявлены и проанализированы два типа организации актинового цитоскелета: субкортикальна* иитоплазматическая сеть и сеть, окружающая поверхности органелл.

2. Внутренняя поверхность протопластов, по данным сканирующей электронной микроскопии, имеет более сложную организацию, по сравнению с наружной. Мммунохимическое мечение позволяет выявить "реплики" мест прикрепления клеточных органелл и их связь с актиновым цитоскелетом.

3. Методом фагового дисплея получены микиантитела к актину, которые с высокой чувствительностью способны детектировать актины растительного происхождения в дот»анал1т и иммунофлуорссцентной микроскопии,

4. Специфический маркёр на основе коньюгата тяжелого меромиозина с коллоидным золотом выявляет актин в дот-анализе и электронной микроскопии. С его помощью можно оценивать функциональные свойства АТФ-зааисимого актомиозннового взаимодействия.

5. Все созданные маркёры (антитела, миниантитела, фаллоидин и тяжелый меромнозин в комплексе с коллоидным золотом и флуоресцентными метками) могут быть применены в методах дот-анализа, световой и электронной микроскопии для получения полноценной информации о состоянии актинового цитоскелета как в отдельной растительной клетке, так и в тканях растений.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

], Соколов О.П,, Кривопалов Ю.В., Соколова М.К., Ильчуков В.В, Элементы актинового цитоскелета в протопластах клеток растений П Тез, 4-го съезда о-ва физиологов растений России и между'народной конф. "Физиология растений - наука 111 тысячелетня", Москва,октябрь4-9,1999.-С. 123-124.

2. Соколов О,И,, Кривопалов Ю.В., Соколова М.К., Ильчуков В.В. Топография поверхности и элементы актинового цитоматрикса протопластов клеток растений // Тез, конф. "Цитоскелет и клеточная регуляция". Пущи по, май 11-12,2000. • С, 34.

3. Соколов О.Н., Кривопалов Ю.В., Соколова М.К., Ильчуков В.В. Топография поверхности и структурная организация хлоропластов в протопластах клеток листьев табака // Тез. 14-Й Коми респ. молодежной науч. конф., Сыктывкар, апрель 18-20, 2000, - С. 208-209,

4. Соколов О.И., Кривопалов Ю.В-, Соколова М.К., Ильчуков В.В., Носов A.B. Топография поверхности и элементы цитоматрикса протопластов растительных клеток // Физиология растений. - 2001. - Т. 48, № 3. - С. 447-454.

5. Sokolov O.I., Krivopaiov Vu.V., Sokolova M.K-, Il'chukov V.V., Nosov A,V. Surface topography and cytomatrix elements in protoplasts from plant cells // Abstr, Int. Symp, "Biological motility: new trends in research", Pushchino, Aug. 20-26,-2001. - P, 148-150.

6. Sokolov О.1., Krivopaiov Yu.V., Sokotova M.K., Il'chukov V.V., Nosov A.V. Tbe role of

actin cytosketelon ¡n ccll wall formal ion of plant protoplasts (SUM study) // Ibid. -1'. 110.

7. Дыкман Jl.A., Богатырев U.A., Зайцева U.C., Соколова M.К., Иванов В.В., Соколов О.И. Использование коныогатоа коллоидною •золота для идентификации актинов различного происхождения H Биофизика. * 2002. - Т. 47. - Вып. 4, - С, 632-640.

8. Иль чу ко в В.В.. Соколова М.К., Кривопалов Ю.В.. Соколов О.И. Топография поверхности п|>отопластом клеток растений // Тез. 2-й международной конф. "Анатомия и морфология растений". Санкт-Петербург. 20Û2. - С. 243-244.

9. Sokolov O.I.. Krivopalov Yu.V., It'chukov V.V.. Sokolova M.K. Surface topography of plant-cell protoplasts during cultivation it Abstr. R lui. Conf "nie Uto logy of Plant Cells in vitro and Biotechnology", Saratov, Sept. 9-13,2003, - P.292-293.

10.Соколова M.K,, Ильчукоп В.В., Криво налов Ю.В., Соколов О.И. Актнновый питоматрикс и субклеточная органнкншя растнтслыюн клетки И Тез. 5-го съезда о-ва физиоло1\>в растений России и международной конф. "Физиология растений • основа фитобмотехнологнн", Пенза, сентябрь 15-21, 2003. - С. 111-112,

11.Ильчуков В.В.. Соколова М.К., Соколов О.И. Субкортикальный иитоскелет клеток растений // Тез. Всеросс. конф. "Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты", Саратов, июнь 15-17. 2005, - С.45-46.

12.0рлои B.I1.. Соколова М.К., Соколов О.И. Участие белка 56-Ша в структурировании актиновых филаментов и его локализация в клетках листьев Vicia /aba L И Там же, • С. 50-51.

l3.0rlov V.P„ Sokolova M.К.. Sokolov O.I. [.fleet of a 56-kDa protein on the structure of actin filaments and its localisai ion in the cells of Vicia faba L // Abstr, Int. Conf. "The plant cylo skeleton: genomic and bioinformatic tools for biotechnology and agriculture*', Yalta. Ukraine, Sept. 19-23.2006. - P. 73.

14.Орлов В.П., Соколова M.К.. Соколов О.И. Влияние белка 56 кД на структуру актиновых филаментов и ею локализация в клетках листьев Vicia faba L. // Тез. 6-ix> съезда о-ва физиологов растений России и международной конф. «Современная физиология растений; от молекул ло экосистем», Сыктывкар, июнь 18-24. 2007. - С. 191-193.

15. Ильчуков tï.IU Соколова М.К.. Соколов О.И. Структура нитоматрикса протопластов клеток растений // Там же. - С, 164-166.

16, Соколов О.И,, Ильчуков В,В.. Соколова М.К. Разработка и применение наиомаркСроп для изучения структуры цитоматрикеа клеток высших растений // Тез. 15-й международной конференции «Высокие технологии в биологии, медицине и reo жологии», Новороссийск, сентябрь 10-14,2007, - С, 114-M 5.

Подписано в печать 20.02,08, Гарнитура Times New Roman Я, Фцрмаг бОчИ-1 1/16. Объем I усл. нсч. д. Тираж 100 чт._

Отпечатано н ИСФРМ РАН •11049 Сара roe. up, 'km настов. LI.