Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимический и иммунохимический анализ пространственной организации актинового цитоскелета клеток высших растений

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимический и иммунохимический анализ пространственной организации актинового цитоскелета клеток высших растений"

На правах р> копией

111111

ООЗ 1В5224.

Соколова Марина Константиновна

Биохимическим и иммунохнмический анализ пространственной организации актинового цигоскелета клеток высших растений

03 00 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

С ара гон - 2008 I

1 3 МАР 2ПР8

Работа выполнена в Иныигутс биохимии и фи!иоло! ии растении и микроорганизмов Российской академии наук (ИЬФРМ РАН)

Защита состойся «23» апреля 2008 г в 10 часов на юседаиии диссер1ационного совета при Институте биохимии и физиологии растении и микроорганизмов Российской академии наук (410049, i Саратов просп 'Энтузиасте 13)

С дисссртациеи можно ознакомиться в научной библиотеке ИЬФРМ РАН Автореферат диссертации размещен на сайге http //www ibppm Saratov ru/obyav dis html

Автореферат paiocian « 27 » феврачя 2008 юла

Научный руководи! с'ib

доктор биотогических наук Носов Александр Владнмирович

Официальные оппоненты

доктор биотогичееких наук Коннова Светлана Анатольевна

доктор биологических наук Кпячко Нел та Леопольдовна

Ведущая opi аннзания

Институт цитологии РАН

Ученый секретарь диссертациошюю совета юктор биоло| ичсских нау к

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Как известно, жизнь во всех ее разнообразных проявлениях представляет собой непрерывное движение Способность двигаться - одно из свойств живого на Земле

Сложный ансамбль внутрикле1 очных органелл характеризуется определенным положением и определенными путями перемещения в клетке, и необходимость управлять мембранными процессами требует тонкой организации внутриклеточной подвижности У всех изученных клеток, будь то амеба, клетка млекопитающего или растения, комплекс подвижности построен из похожих элементов Тем не менее, каждый тип клеток отличается своим, особым спектром цитоскелетных белков, присутствующих в определенном соотношении и специфическим образом расположенных (Baskm, 2000)

На данном этапе исследований становится все более очевидным, что цитоскелет является той самой структурой клетки, которая динамически объединяет ее отдельные элементы и обеспечивает функциональную стабильность многих внутриклеточных процессов Изучению разных аспектов функционирования и регуляции, в частности, «цсгинового цитоскелета посвящено огромное количество работ

В последние годы в литературе стали появляться разнообразные сведения об актинах из растительных объектов (Chaffey, 2005) Изучение актина в растениях по-прежнему сопряжено с рядом трудностей в связи с низким содержанием его в цитоплазме растительной клетки и высокой лабильностью по отношению к протеазам (Chaffey, Barlow, 2002) Поэтому эти сведения остаются весьма отрывочными и неполными по сравнению с животными объектами В связи с этим проб тем а биохимической идентификации и пространственной визуализации актиновых компонентов является весьма актуальной (Hu, Brady et al, 2000, Hitt, Lamg et al, 2002, К wok, Hanson, 2004, Sheahan, Staiger et al, 2004) Будучи одним из основных компонентов сложного комплекса цитоскелета растительной клетки, актин принимает участие в осуществлении большинства функций как внутри одной клетки формирование микрокомпартментов (для ферментных ансамблей, биосинтеза белка), направленное движение цитоплазмы и органелл (Клячко, 2005), определение пространственного расположения составляющих клетки (Клячко, 2004), синтез клеточной стенки, мигоз и мейоз, так и в системе межклеточных взаимодействий участие в передаче сигнала с мембранных рецепторов, в регуляции транспорта веществ через плазмодесмы (Клячко, 2003), а также в механизме флоэмного транспорта (Kehr, Haebel et al, 1999)

Разнообразные методы идентификации актина (Sturmer, Baumann 1998, Reddy, 2001, Peruski, 2003, Runions, Brach et al, 2006) детально разработаны лишь для мышечных объектов, в то время как для растений эти методы нуждаются в существенной модификации с учетом биохимической специфики объекта Таким

образом, изучение топографии и биохимической организации сложного надмолекулярного комплекса белков, в основе которой лежит актиновый цитоскелет, необходимо для формирования более полной картины функционирования живой клетки растений Кроме того, для понимания работы актинового цитоскелета очень важно дифференцирование полимерного и мономерного состояния этого белка в клетке

Целью данной работы было изучение пространственной организации системы белков актинового цитоскелета клеток высших растений В работе решались следующие задачи

1 создать набор маркеров для идентификации различных форм актина на основе функционально-активного фрагмента молекулы мышечного миозина и фаговых антиактиновых миниантител,

2 с использованием полученных маркёров изучить морфологические особенности конфигурации актин-содержащих структур клеток растений,

3 на препаратах разрушенных протопластов растительных клеток исследовать трехмерную организацию актинового цитоскелета и его связь с органеллами,

4 сравнить информативность методов иммунофлуоресцентной и электронно-микроскопической идентификации и визуализации актина в клетках растений

Научная новизна работы

Показаны особенности и детали строения актиновых филаментов на протопластах клеток каллусных тканей моркови и табака, а также клеток мезофилла листьев табака и бобов

Разработан метод получения специфического маркера к актину на основе тяжелого меромиозина (функционального фрагмента молекулы миозина) и коллоидного золота

Продемонстрирована принципиальная возможность идентификации растительных актинов с помощью антиактиновых миниантител, полученных методом фагового дисплея

Практическая значимость работы

Разработанный нами подход с применением конъюгатов коллоидного золота с рядом узнающих молекул (антителами, миниантителами, фаллоидином и тяжёлым меромиозином), а также конъюгатов флуоресцентных меток с теми же молекулами может быть исполыован для создания тест-систем на белки актинового цитоскелета на основе иммуноэлектронной и иммунофлуоресцентной микроскопии Это позвопяет достаточно надежно и оперативно идентифицировать различные формы актинов и открывает широкие перспективы для выяснения роли актина в структурно-функциональной организации растительной и животной клеток в фундаментальных и

прикладных исследованиях

Полученные препараты используются для решения широкого круга фундаментальных и прикладных задач в лабораториях Института физиологии растений им К А Тимирязева Российской академии наук, а также Никитского ботанического сада - Национального научного центра Украины

На защиту выносятся следующие основные положения*

1 поверхность протопластов растений после их специальной подготовки для сканирующем электронной микроскопии представляет собой сетчатую структуру, которая содержит элементы цитоскелета,

2 хлорогшасты связаны в единую сеть, одним из компонентов которой является актин,

3 созданные специфические маркеры тяжелый меромиозин-коллоидное золото и полученные методом фагового дисплея миииантитела - позволяют выявлять как фипаментную, так и мономерную формы актина, соответственно, методами дот-анализа и различными вариантами микроскопии,

4 разработанный набор маркеров в сочетании с использованными микроскопическими и биохимическими методами позволяет выявлять детальную организацию актинового цитоскелета в клетках растений

Работа выполнема в лаборатории физиологии растительной клетки ИБФРМ РАН в рамках следующих бюджетных тем «Изучение пространственно-временной организации бет ко в цитоскелета клеток растений», научный руководитель темы дбн Соколов О И, № госрегистрации 01890008367, «Изучение роли актинового цитоскелета в адаптивных и коммуникационных реакциях клеток растений» научный руководитель темы дбн Соколов О И , № госрегистрации 01200606178

Данная работа была также частично поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований № 99-04-48833; № 04-04-48601

Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве с д б н Соколовым О И и к б н Ильчуковым В В На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении и анализе которых роль автора была определяющей В иммунохимических экспериментах использовались миииантитела, полученные сотрудниками ИБФРМ РАН к в н Староверовым С А и Костеша Н В

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены и обсуждены на IV съезде Всероссийского общества физиологов растений и Международной конференции «Физиология растений - наука III тысячелетия», Москва, Россия, октябрь 4-9, 1999, XIV Коми республиканской молодежной научной конференции, Сыктывкар, Россия, апрель 18-20, 2000, конференции «Цитоскелет и

клеточная регуляция», Пущино, Россия, май 11-12, 2000, Int Symp «Signalling systems of Plant Cells», Moscow, Russia, June 5-7, 2001, Int Symp «Biological motility New trends in research», Pushchmo, Russia, Aug 20-26, 2001, 2-й Международной конференции «Анатомия и морфология растений», Санкт-Петербург, Россия, 2002, Vlli Int Conf «The Biology of Plant Cells m vitro and Biotechnology», Saratov, Russia, Sept 9-13, 2003, V съезде общества физиологов растений России и Международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии», Пенза, Россия, сентябрь 15-21, 2003, Всероссийской конференции «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений фундаментальные и прикладные аспекты», Саратов, Россия, июнь 15-17, 2005, Int Symp «The Plant Cytoskeleton Genomic and Bioinformatic Tools for Biotechnology and Agriculture», Yalta, Ukraine September 19-23, 2006, VI съезде общества физиологов растений России и Международной конференции «Современная физиология растений от молекул до экосистем», Сыктывкар, Россия, июнь 18-24, 2007

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК

Структура работы. Диссертация изложена на 131 странице, содержит 42 рисунка, 5 таблиц и состоит из введения, основной части, содержащей три главы (обзор литературы, экспериментальная часть, результаты и обсуждение), заключения, выводов и списка использованной литературы (334 источника)

Содержание работы

В обзоре литературы даны современные сведения о системе белков цитоскелета эукариот и систематизированы данные об актиновом цитоскелете растений, его функциях и методах идентификации В экспериментальной части описываются объекты исследований, использованные методы, полученные результаты и их обсуждение Работа завершается обобщающим заключением и выводами

Разработка и получение функционального маркёра к F-актину на основе тяжечого меромиозина. Для исследования актинового цитоскелета необходимо иметь надежные инструменты - маркеры на актин Однако предлагаемые разными фирмами маркеры не перекрывают все варианты и потребности визуализации или количественной оценки соотношения полимерной и мономерной форм актина, оценки функциональной активности F-актина в том или ином типе клеток Кроме иммуноглобулиновых и фаллоидиновых маркеров, дтя изучения актинового цитоскелета, ассоциированного с актин-связывающими белками, весьма перспективным представляется разработка и использование "функциональных" маркеров В частности, в работах Nakayama с соавт (1998) были использованы фрагменты головок миозина (одного из актин-ассоциированных белков), несущие домены, ответственные за механохимическое

взаимодействие двух белков, обеспечивающих актомиозиновую подвижность in vivo и in vitro.

Мышечный миозин при низкой ионной силе способен образовывать толстые биполярные филаменты. Его молекула представляет собой асимметричный гексамер с массой 460 кД. В молекуле различают фибриллярную часть, состоящую из двух переплетенных спиралей, каждая их которых имеет на одном конце глобулярную головку, несущую две субъединицы (легкие цепи). Таким образом, гексамер включает одну пару тяжелых цепей (молекулярная масса 200 кД) и две пары легких цепей (молекулярная масса 15 и 27 кД). Все миозины обладают АТФ-азной активностью и способны связываться с F-актином (Engelhardt, Ljubimova, 1939: Поглазов, Левицкий, 1982: Foth et al., 2006). У растений миозин был найден в листьях Egeria (Ohsuka, Inoue, 1979), в эндокарпе Lycopersicon (Vahey, Titus et al., 1982), проводящих тканях Heracleum (Соколов, 1985) и усиках Pisum (Ma, Yen, 1989). По некоторым свойствам эти миозины имеют сходс тво со скелетным мышечным миозином.

Ещё в начале 50-х годов были получены сведения о возможности расщепления молекулы миозина протеолитическими ферментами в определённых «шарнирных» участках (Szent-Gyorgy, 1953; Spudich, K.ron et al., 1985). Одним из полученных таким образом фрагментов оказался так называемый тяжелый меромиозин (ТММ), который представляет собой водорастворимый фрагмент молекулы с массой 350 кД, содержащий глобулярную часть и остаток фибриллярного хвоста молекулы (Pollard, Stafford et al., 1978). Он, как и целый миозин, обладает всеми АТФ-азными активностями и сохраняет способность взаимодействовать с полимерным актином.

Дтя получения ТММ нами был проведен ограниченный протеолиз миозина скелетных мышц кролика трипсином и получена водорастворимая фракция ТММ. На рис. 1 представлен электронно-микроскопический снимок полученной фракции ТММ. Диаметры отдельных фрагментов колеблются от 19 до 32 нм. Так как расщепление происходило под действием трипсина, то мы получили не только глобулярные

фрагменты (головки), но и фрагменты с небольшой хвос товой частью молекулы миозина - так называемые "остатки хвостов", которые при низкой ионной силе раствора

Рис. 1. Электронная микроскопия фрагментов тяжелого меромиозина, полученного путем протеолиза миозина трипсином (увеличение 44000)

способны к незначительной, по сравнению с «хвостами», агрегации. Помимо этого в препарате ТММ, по-видимому, присутствуют и другие фрагменты миозина, что также вызывает образование агрегатов, видимых на рис. 1. При приготовлении маркёра ТММ-коллоидное золото мы избавлялись от таких агрегатов путем ультрацентрифугирования препарата при 100 ООО g в течение 30 мин.

Полученный ТММ должен был сохранить ферментативную активность и способность взаимодействовать с Р-актином. Поэтому мы провели качественный анализ АТФ-азной активности ТММ и его специфической чувствительности к действию двухвалентных катионов Са2+, Mg2т и характерной К+-ЭДТА АТФ-азной активности.

Таблица. Определение АТФ-азиой активности миозина и ТММ

Реакционная среда: 50 мМ KCI, 10 мМ Трис-НС1, рН 7.0, 0.5 мМ АТФ Удельная ферментативная активность миозина, мкмоль Фн/мгмин Удельная ферментативная активность ТММ, мкмоль Фн/мг мин

1 мМ MgCl2 0.69 0.72

1 мМСаСЬ 1.15 1.16

0.5 MKCI и 10 мМ ЭДТА 2.30 2.35

Фн - неорганический фосфат Как видно из таблицы. ТММ обладает всеми, присущими целой молекуле миозина АТФ-азными активностями, в том числе и характерной К+-ЭД'ГА А'ГФ-азой. Полученный ТММ был сконъюгирован с частицами коллоидного золота (15 нм) по стандартной процедуре (Дыкман, Богатырёв и др., 2002).

Электронно-микроскопическое изучение взаимодействия маркёра ТММ-КЗ с Р-актином. С применением электронной микроскопии установлено, что полученный маркёр ТММ-КЗ специфически взаимодействует с актином (рис. 2). Важно отметить то. что фон практически не содержит свободных частиц маркёра, что говорит о его высокой специфичности. Также следует отметить, что частицы маркёра взаимодействуют только с актином (не агрегируют между собой) и высоко монодисперсны.

*

Рис. 2. Мечение маркёром ТММ-КЗ куриного и кроличьего F-актина в концентрации 150 мкг/мл. Препараты дополнительно контрастировали ]%-м урани.пацетатом

Среди других маркеров на актин ТММ-КЗ уникален тем, что, как и миозин, является актин-связывающим белком, актин-связывающие участки которого находятся именно на головках Для наблюдения взаимодействия полученного маркера с актиновыми нитями в ЭМ не требуется его дополнительного контрастирования, так как КЗ является электронно-плотным материалом Следует отметить, что полученный маркер сохраняет способность взаимодействовать с актином так же, как и исходный "I ММ. поскольку при конъюгации он связывается с частицами КЗ нековалентно, и слабые связи не нарушают нативность молекулы

Таким образом, нами был получен биоспецифический маркер ТММ-КЗ, который дает уникальную возможность идентифицировать актины как животного, так и растительного происхождения при микроскопировании и в дот-анализе Кроме того, данный маркёр является функциональным, то есть при внесении АТФ частицы маркера диссоциируют от аютиновых филаментов и способны перемещаться вдоль них Следовательно, с использованием данного маркера появляется уникальная возможность наблюдать и моделировать т vitro взаимодействие актина и миозина, которое лежит в основе биологической подвижности

Получение антнактнновых ангител с помощью технологии фагового дисплея миниантител. Антитела находят широчайшее применение в медицине и научных исследованиях Существенным шагом явилась разработка технологии моноклональных антител В последние годы был разработан подход, заключающийся в использовании так называемого фагового дисплея фрагментов антител Эта технология состоит в конструировании библиотек антител, экспонированных на нитевидных фагах или фагемидах Впервые возможность экспрессии одноцепочечных последовательностей, составленных из вариабельных доменов антител в составе гибридного белка оболочки фага, была продемонстрирована в работах Грега Винтера и Джона МакКаферти в 1990 году Они же разработали метод быстрой и эффективной селекции клонов, несущих высокоаффинные антитела, с помощью антигена

В работе использовали комбинаторную фаговую библиотеку миниантител овцы, любезно предоставленную профессором Уильямом Харрисом (Harris, Cunningham, 1995) В качестве антигена для селекции миниантител использовали очищенный актин из скелетных мышц кролика Для выделения наиболее специфичных и высокоаффинных миниантител проводили 3 раунда селекции От раунда к раунду постепенно понижали концентрацию фаговых частиц от 1012 до Ю10 мл"1 Кроме того, уменьшали время инкубации актина с фаговой библиотекой в первом раунде инкубацию проводили в течение ночи при 4°С, во втором и третьем раундах - 1 5 ч и 1 ч при комнатной температуре

Обогащенную таким образом библиотеку рассевали на чашки Петри После трех

раундов аффинной селекции проводили иммуноскрининг колоний с применением системы ЕСЬ. Около 80% выросших колоний дали положительный сигнал, что указывает на высокую эффективность процедуры аффинной селекции библиотеки. Для дальнейшей работы было выбрано 11 клонов, которые дали наиболее выраженный сигнал (яркость пятна).

Для миниантител, продуцируемых выбранными клонами, были определены константы аффинности с помощью метода, описанного в работе (Веайу, Веайу а/., 1987). Из значений Л"афф (1.6 • 107 М"') можно сделать вывод, что использование комбинаторной фаговой библиотеки с проведением нескольких раундов селекции позволило нам получить клоны, продуцирующие растворимые миниантитела со средней аффинностью к кроличьему актину. Эти миниантитела оказались пригодными для иммуногистохимического выявления актина, тем более что антитела с более высокими значениями К^ часто приводят к ложноположительным результатам.

Создание тест-систем к различным формам актина на основе золотых маркёров. Метод дог-анализа с применением биоспецифических маркёров - конъюгатов КЗ, находит все более широкое распространение благодаря его высокой чувствительности и простоте выполнения.

На рис. 3 представлена детекция гл&цкомышечного Р-актина маркёром ТММ-КЗ в дот-анализе. Дополнительно этот маркёр позволяет оценивать и функциональные свойства АТФ-зависимого актомиозинового взаимодействия.

Рис. 3. Дот-анализ куриного Р-актина (а, с1), О-актина (Ь) и БСА (с) в последовательных двукратных разведениях (начальная концентрация I мг/мл) с использованием маркёра ТММ-КЗ. контроль специфичности АТФ-зависимого связывания ТММ-КЗ в присутствии 5 мМ АТФ (с!)

Мы сравнили чувствительность и специфичность полученных антиактиновых фаговых миниантител. Фаговые миниантитела выявляют препараты актина как из гладких и поперечнополосатых мышц животных (курицы, кролика), так и из листьев бобов (рис. 4).

г § .

3 • ■ е С ■

Чувствительность иммунодот-анализа с миниантителами в детектировании трех разных актинов различалась незначительно: так, для куриного актина ovia составила 12 нг, кроличьего - 4 нг, растительного - 15 нг. Широкая специфичность в отношении разных актинов и близкие значения чувствительности их выявления позволяют предполагать, что полученные миниантитела связываются с антигенной детерминантой, высоко консервативной для всех трех актинов.

Кроме того в нашей лаборатории ранее были получены поликлональные кроличьи антитела к актину из гладких мышц куриных желудков, которые способны выявлять как G-, так и F-форму куриного и кроличьего актина в дот-анализе иммунозолотым маркёром на их основе с одинаковой чувствительностью - 25 нг. Растительный актин эти антитела не выявляют.

Помимо этого мы подтвердили ранее полученные данные (Рихтер, Грингауз и др.. 1990; Грингауз, Негрецкий и др.. 1998), что маркёр фаллоидин-КЗ даёт уникальную возможность выявлять только F-форму актина. Синтезированный нами аналогичный маркёр способен выявлять как растительный, так и мышечный F-актин с чувствительностью 50 нг, мышечный G-актин связывания с маркёром не показал. Необходимо отметить, что во всех вариантах применения маркёров - конъюгатов коллоидного золота в качестве контролен мы использовали меченные коллоидным золотом неспецифические реагенты - бычий сывороточный альбумин или овальбумин.

Таким образом, представленные выше маркёры могут быть использованы для анализа актинового цитоскелета в любых препаратах. Миниантитела способны выявлять актин в любых растительных и животных клетках. Фаллоидин-КЗ специфично выявляет F-формы актина, а маркёр ТММ-КЗ позволяет оценивать функциональные свойства АТФ-зависимого актомиозинового взаимодействия. Дот-анализ можно использовать как экспресс-метод для предварительной оценки количества актина в препаратах, а также выявления его G- и F-форм.

Исследование топографии цитоскелета растительных клеток с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Наличие клеточной стенки представляет определённые трудности для изучения цитоскелета растений. Получение изолированных протопластов даёт возможность обойти эти трудности. Для наблюдения

Рис. 4. Дот-анализ актинов различного происхождения с использованием фаговых миниантител. Последовательные двойные разведения: 1 - куриного гладкомышечного актина (начальная концентрация 0.4 мг/мл), 2 -актина из листьев V. faba (0.25 мг/мл), 3 -кроличьего актина (0.25 мг/мл), 4 -овальбумин (контроль)

с помощью СЭМ был использован модифицированный нами метод подготовки протопластов, не связанный с применением аппарата "критическая точка".

Основная масса свежевыделенных протопластов из каллусной ткани моркови и табака и листьев табака и бобов имела одинаковую топографию поверхности. Протопласты диаметром от 10 до 25 мкм имели незначительно шероховатую поверхность без видимых структурных образований с немногочисленными порами (рис. 5А). По-видимому, при обработке препаратов осмиевой кислотой (РоНак, УагпёеН. 1985) в плазмалемме фиксируются все белковые мембранные и трансмембранные комплексы в липидном окружении. Такую же фиксацию обычно используют при подготовке препаратов классическим способом - с применением аппарата «критическая точка» Пав1к, Йтокпзкауа егя/.. 1992).

Существенные отличия мы наблюдали в вариантах без стадии дополнительной фиксации осмиевой кислотой.

А В В

Рис. 5. Топография поверхности протопластов:

A) протопласт клетки листа табака Фиксация: 0.5% глутаровый альдегид+2% формальдегид. Постфиксация: 1%осмиевая кислота. Масштабная линейка- 1.5 мкм;

Б) протопласт клетки каллусной ткани моркови. Фиксация как для (А). Постфиксацию осмиевой кислотой не проводили. Масштабная линейка - 1.5 мкм:

B) протопласт клетки каллусной ткани моркови. Фиксация и постфиксация как для (Б). Масштабная линейка - 1.1 мкм

Выявлено два типа протопластов, отличающихся топографией поверхности: 1. диаметром около 15 мкм с бугристой поверхностью и округлыми образованиями размером 0.5-1.5 мкм, периметр которых окаймлён глобулами размером 0.3 мкм (рис. 5Б); 2. диаметром 10-12 мкм с сетчатой поверхностью без видимых структурных образований (рис. 5В). Сетчатая поверхность представлена конусовидными ячейками различной высоты. Протопласты без фиксации осмиевой кислотой, скорее всего, теряют липидные компоненты при обезвоживании органическими растворителями, и мы наблюдаем сетчатую структуру поверхности. Детальный анализ микрорельефа поверхности выявляет значительное количество пор, похожих по топографии на окаймленные пузырьки.

При наблюдении в СЭМ мы обнаружили агрегаты протопластов, соединённых многочисленными тяжами, которые, возможно, представляют собой элементы плазмодесм.

Мы предполагаем, что выявляемый СЭМ сложный микрорельеф поверхности протопластов образован в том числе и компонентами цитоскелета. в частности актиновой составляющей. В ряде случаев происходило разрушение протопластов, что приводило к экспонированию внутреннего кортикального слоя цитоплазмы (рис. 6). По сравнению с внешней, внутренняя поверхность имеет более сложную топографию.

А Б

Рис. 6. Внутренняя топография разрушенных протопластов:

А) протопласт из каллуса моркови. Фиксация: 0.5% глутаровый альдегид + 2% формальдег ид. Без постфиксации осмиевой кислотой. Масштабная линейка- 1.5 мкм;

Б) протопласт из каллуса табака. Фиксация как для (А). Масштабная линейка - 1.5 мкм

На рис. 6 видно, что внутренний слой представляет густую сеть переплетенных тяжей, филаментов и их агрегатов. Хотя говорить об идентификации актиновой составляющей на препаратах, подготовленных для СЭМ, не представляется возможным, тем не менее, основываясь на данных, полученных нами в других вариантах микроскопии, можно с большой долей вероятности утверждать о наличии актина в этом надмолекулярном ансамбле. Известно, что получение протопластов является стрессовым фактором для клетки, при этом часть цитоматрикса может разбираться. И всё-таки мы наблюдали, что определенная доля оргаиелл остается закрепленной на толстых тяжах (рис. 7). По-видимому, они представляют собой трансцитоплазматические тяжи, которые являются частью единой сенсорной системы клетки, контролирующей расположение органелл и их движения в ответ на внешние сигналы.

Полученные нами результаты позволяют дополнить сведения о том, что в ходе онтогенеза растительной клетки происходят существенные изменения в структуре субкортикального цитоматрикса. Гак, на стадии перехода от деления к растяжению клетки характеризуются менее развитой системой субкортикального цитоматрикса, а на стадии растяжения происходит его утолщение. В дифференцированных клетках

субкортикальный цитоматрикс вновь принимает вид "рассеянной" сети, что предположительно связано с обеспечением функциональной активности плазмалеммы. А Б

Рис. 7. Органеллы из разрушенных протопластов листа табака. Фиксация и постфиксация как в рис. 6. Масштабная линейка - 3 мкм

Изучение топографии и объёмной организации хлоропластов в протопластах.

Как было сказано ранее, без постфиксации препаратов осмиевой кислотой часть протопластов разрушается, открывая внутриклеточную организацию, в том числе и органелл (рис. 8). Мы обнаружили, что на препаратах протопластов из листьев табака и бобов хлоропласты часто образуют единую структуру, соединяясь друг с другом несколькими "толстыми" тяжами (рис. 8А).

А Б

Рис. 8. Внутриклеточная организация комплекса хлоропластов:

А) разрушенный протопласт из мезофилла табака. Фиксация: 0.5% глутаровый альдегид + 2% формальдегид. Постфиксацию осмиевой кислотой не проводили. Масштабная линейка-3 мкм;

Б) организация хлоропластов в клетках листа бобов. Масштабная линейка - 5 мкм

Тяжи, соединяющие хлоропласта (если предположить их наиболее вероятную актиновую природу), могут иметь двойную функцию. Во-первых, они могут участвовать с помощью моторных белков в перемещении органелл, обеспечивая наиболее оптимальное расположение хлоропластов. Во-вторых, удерживать хлоропласты в токе

цитоплазмы.

Применение маркёра фаллоидин-коллоидное золото в световой микроскопии.

Принципы визуализации золотых маркёров в световом микроскопе основаны на свойствах КЗ поглощать (просвечивающая) и рассеивать (темнопольная и эпиполяризационная микроскопия) видимый свет.

Исследования проводили на тонких срезах каллусных тканей табака и моркови, а также листьев табака и бобов, заключенных в полиэтиленгликоль 1500. С помощью маркёра фаллоидин-КЗ и последующего усиления солями серебра (Миронов, Комисарчик и др., 1994) можно локализовать актин-содержашие структуры клеток (рис. 9). А Б

Рис. 9. Актин-содержащие структуры на полутонком срезе каллусной ткани табака. Фаллоидин-КЗ, усиление серебром (масштабная линейка 50 мкм): А) автофлуоресценция клеток каллусной ткани табака; Б) выявление актиновых филаментов

Традиционным приёмом, обеспечивающим хорошую сохранность морфологических структур, является заключение материала в парафин или в синтетические смолы. Однако .эта процедура может привести к разрушению или изменению антигенных детерминант, поэтому мы заключали растительные ткани в полиэтиленгликоль, что: 1) исключает воздействие ксилола и других органических растворителей; 2) позволяет снизить температуру заключения; 3) вызывает меньшее сжатие ткани (5% от исходного объёма, вместо 50% - в парафине); 4) занимает в два раза меньше времени; 5) обеспечивает сохранность антигенных детерминант. Заключение в полиэтиленг ликоль позволяет получать тонкие срезы до 0.25 мкм.

На срезах каллусных тканей моркови и табака можно выделить несколько типов распределения филаментов актина:

1. в цитоплазме клетки наблюдается рассеянное распределение маркёра (рис. 9);

2. меристематичеекие зоны представлены клетками с большим количеством Р-актина (рис. 10А);

3. много маркёра выявляется вокруг ядер клеток (рис. ЮБ);

4. очень мало маркёра обнаруживается в сильно вакуолизированных клетках (рис. 10В).

Рис. 10. Выявление агсгин-содержащих структур на полутонких срезах каллусной

ткани моркови. Фаллоидин-КЗ (усиление серебром):

A) меристематическая зона;

Б) актиновые филаменты, выявляемые вокруг ядер;

B) сильно вакуолизированные клетки

В неэмбриогенных клетках каллусной ткани можно видеть обширную актиновую сеть (рис. 10В). которая выявляется на полутонких срезах в виде диффузного распределения фаллоидинового маркёра. Клетки почти любой каллусной ткани сильно вакуолизированы. здесь не наблюдается четко выраженной структуры. Внутри некоторых клеток (рис. 10Б) видна интенсивная "посадка" маркёра, свидетельствующая о значительном содержании актинового компонента. Судя по размерам и расположению органелл, актиновые филаменты группируются около ядра. В литературе подобную структуру называют корзинкой и одной из её белковых составляющих являются филаменты актина. Но на рис. 9 и 10В количество актиновых филаментов около ядер незначительно. Скорее всего, это связано с фазой клеточного цикла. На срезах листьев бобов (рис. 11) маркёр фаллоидин-КЗ, усиленный серебром, обнаруживается в наибольшем количестве вокруг хлоропластов. Но литературным данным, хлоропласты окружены цитоскелетной сетью, и главной её составляющей являются микрофиламенты. Также много филаментов актина визуализируется в эпидермальных и устьичных клетках.

А Б

Рис. 11. Выявление И-актина на поперечном срезе листа бобов: А) автофлуоресценция Б) фаллоидин-КЗ, усиление серебром (один и тот же препарат)

А Б

Рис. 12. Актиновые филаменты в протопластах из листа табака. Фаплоидин-КЗ, усиление серебром:

А) акгиновые филаменты в субкортикальной зоне клетки; Б) акгиновые филаменты в комплексе хлоропластов

На препаратах протопластов (рис. 12) видны места наибольшего распределения Р-актина в субкортикальной зоне клетки и вокруг хлоропластов (черное окрашивание серебром). По-видимому, актин в составе сложной сети цитоскелета не может быть полностью выявлен этим маркёром в связи с экранированием участков связывания фаллоидина другими актин-ассопиированными белками. Также следует принять во внимание присутствие О-формы актина, которая не визуализируется фаллоидиновым маркёром.

Таким образом, нам удалось выявить две преимущественные конфигурации актинового цитоскелета, характерные для исследованных нами растительных объектов:

а) субкортикальная цитоплазмагическая микрофиламентная сеть;

б) сеть, окружающая поверхности органелл,

Иммунохимнческнй анализ белков актинового цитоскелета растений с использованием фаговых мнннантител. Достаточно высокая чувствительность фаговых миниантител в выявлении актинов различного происхождения позволила использовать их в иммуногистохимических методах окрашивания.

Мы использовали непрямой вариант иммуномечения («сэндвич-метод» или «мостиковый метод»), который позволил получить яркое чёткое свечение маркёра (в качестве первичных использовали антиактиновые фаговые миниангитела, вторичных -антифаговые кроличьи антитела, и третичных - ГГГС-меченые ослиные антикроличьи антитела). Специфичность реакций проверяли, сопровождая каждую серию опытов рядом контролей. Миниантитсла выявляют как филаментный, так и мономерный актин. На рисунке 13А видна субкортикальная сеть, выявляемая на тенях протопластов. В разрушенном протопласте наблюдается не только субкортикальная актиновая сеть (рис. 13Б), но и наличие актина вокруг хлоропластов (рис. 13В).

Рис. 13. Акгиновая сеть на тенях протопластов из листьев бобов. Выявление

фаговыми миниантителами (непрямое иммуномечение):

A) общий вид актиновой сети протопласта;

Б) субкортикальная актиновая сеть в разрушенном протопласте;

B) актин вокруг хлоропластов

Сравнительный анализ актин-содержащих структур в клетках растений. Для

комплексного анализа акгин-содержащих структур в клетках растений мы сравнивали результаты, полученные с маркёрами, сделанными в нашей лаборатории, а также маркёром фаллоидин-TRlTC фирмы "Sigma" (США) при разнообразных вариантах микроскопии. Особое внимание было уделено изучению структурной организации субкортикального слоя цитоскелета клеток растений и организации хлоропластов с помощью сканирующей, иммунофлуоресцентной и электронной микроскопии.

Как уже отмечалось выше, на "сколах" протопластов (рис. 6А) была обнаружена "шуба", толстый слой (до нескольких мкм) субкортикального цитоматрикса, состоящий из сети переплетённых филаментов и их пучков в виде кольцевидных образований и волнообразных складок. Мы предполагаем, что такое сильное развитие субкортикального цитоскелета в протопластах из клеток каллусной ткани моркови обусловлено его участием не только в обеспечении функциональной активности плазмалеммы, но и в механическом поддержании формы клеток.

Биохимическая природа элементов, составляющих субкортикальный слой цитоматрикса. остаётся пока не полностью изученной. Однако на "тенях" протопластов нами показано, что в его образовании (рис. 12 и 13) участвуют актиновые элементы, выявляемые разными маркёрами.

Антиактиновыми фаговыми миниантителами (рис. 13Б) мы выявляем как мономеры, так и филаменты актина в субкортикальной зоне протопластов, а в ряде случаев необходима дифференциация филаментов от мономеров. Поэтому кроме антител также использовали фаллоидин, который специфически связывается только с F-актином (рис. 12). Такой подход позволяет более полно охарактеризовать актиновый цитоскелет.

Цитоскелетный остов, сохраняющийся после фиксации .клеток, отличается сложным строением, в нем сохранены многие элементы, связывающие цитоскелет с ядром, органеллами и плазмалеммой. Белки цитоскелета соединяются друг с другом специфичным для каждого типа клеток образом и формируют сложные, динамические, взаимодействующие между собой структуры.

Рис. 14. Локализация Р-актин содержащих субкортикальных структур:

А) ультратонкие срезы апикальных клеток стебля мари красной. Фаллоидин-КЗ (10 нм). Масштабная линейка - 100 нм. (ПМ -плазмалемма, ЦП - цитоплазма); Б) полутонкие срезы клеток каллусной культуры фикуса лировидного. Фаллоидин-ТЮТС

Чёткость выявления тех или иных структур во многом объясняется функциональным состоянием клеток. В связи с этим мы дополнили наши традиционные объекты исследования контрастными по физиологическому статусу тканями -меристематическими клетками апекса стебля мари красной (рис. 14А) и большими паренхимными клетками каллусной ткани фикуса лировидного (рис. 14Б). На ультратонких срезах стеблевого апекса (рис. 14А) можно четко выделить электронно-плотные структуры с интенсивным мечением маркёром фаллоидин-КЗ. Прежде всего, это густая электронно-плотная сеть тонких филаментов, хорошо различимая в субкортикальной зоне клеток. Известно, что в этих компартментах клетки идут активные физиологические процессы, связанные с растяжением и синтезом вторичной клеточной стенки, в которых значительную роль, наряду с микротрубочками, играют и микрофиламенты. Актиновые филаменты могут контролировать характер распределения микротрубочек и, таким образом, влиять на расположение и ориентацию фибрилл целлюлозы клеточной стенки.

Каллусные клетки (рис. 14Б) обладают менее развитой клеточной стенкой. Субкортикальный цитоматрикс этих клеток показывает значительное количество актиновых филаментов, которые располагаются по периметру клетки параллельно оси растяжения и, скорее всего, могут служить транспортными направляющими для

А

Б

секретируемых везикул.

Вернёмся к наличию элементов цитоскелета в организации хлоропластов, что было показано в ряде работ (Kandasamy, Meagher. 1999; Baluska, Jasik et aL, 2001; Cardenas, Lovy-Wheeler et al., 2005). Хлоропласты остаются в единой сети при мягком лизисе мембраны (рис. 8). В системе хлоропластов, по литературным данным, имеется два варианта организации микрофиламентов актина, подтверждаемых и нашими результатами: продольные пучки актиновых тяжей (рис. 13В) и беспорядочно ориентированные филаменты. Последние были выявлены нами в виде рассеянной сети на некотором расстоянии от поверхности органелл (рис. 12).

А Б

Рис. 15. Локализация F-актин содержащих структур вокруг хлоропластов:

А) ультратонкие срезы апикальных клеток стебля мари красной.

Фаллоидин-КЗ (10 им). Масштабная линейка - 100 нм;

Б) отдельные хлоропласты из листьев бобов. Фаллоидин-TRITC

На рис. 15А хорошо различимы электронно-плотные сетевидные структуры с интенсивной посадкой фаллоидинового маркёра как в субкортикальной зоне, так и вокруг хлоропласта. При разрушении комплекса хлоропластов (рис. 15Б> вокруг индивидуальных хлоропластов хорошо видна интенсивная посадка маркёра фаллоидин-TRITC, что говорит о значительном присутствии полимерного актина вокруг органелл. Следует отметить, что при подготовке таких препаратов F-актин быстро разрушается, видимо, под воздействием эндогенных протеаз. поэтому было важно разработать условия для максимального сохранения актиновых филаментов для микроскопических исследований.

Известно, что актиновые микрофиламенты играют важную роль в создании лабильной системы заякоривания хлоропластов и изменения их ориентации, причем этот процесс может осуществляться через регуляцию баланса пулов мономерного и филаментного актина вблизи поверхности органеллы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Живая растительная клетка содержит тонко регулируемую систему белков цитоскелета и обладает способностью адекватным образом реагировать на изменяющиеся условия внешней среды Обнаруживаются все новые и новые цитоскелетные белки Однако современных знаний недостаточно для понимания сложной архитектуры цитоскелета и "хореографии клетки", т е движения ее различных компонентов во времени и пространстве Но такое движение и позволяет клетке поддерживать множественные функции Цитоскелет не только определяет внутреннюю организацию отдельной клетки, роль цитоскелета шире - создаваемые им силы натяжения могут определять архитектуру многоклеточных образований - тканей и органов растений

Сведения, имеющиеся в литературе, говорят о структурной и генетической консервативности актинов клеток животных и растений Данные о взаимодействии препаратов актина растений с антителами к актину из тканей животных, связывание их с маркерами на основе фалпоидина подтверждают функциональное и структурное родство актинов животного и растительного происхождения на уровне биохимических препаратов Это говорит о наличии сходных функций, выполняемых актиновым цитоскелетом Актин в клетках существует в динамическом равновесии полимерной и мономерной форм Одним из важных компонентов цитоскелета являются актиновые микрофиламенты Применение маркера "фаллоидин-коллоидное золото" дало возможность визуализации элементов актинового остова в протопластах, тонких и ультратонких срезах и субклеточных препаратах В цитоплазме исследуемых клеток выявлены преимущественные конфигурации актинового скелета а) толстые филаментные тяжи, пронизывающие цитоплазму и вакуоли, б) цитогшазматическая микрофиламентная сеть, которая окружает и внутриклеточные органеллы, в) субкортикальная сеть Г-актина

Таким образом, световые и электронно-микроскопические данные наших исследований и других авторов дают основание рассматривать актиновый цитоскелет растений как обширную и динамичную трехмерную структуру, объединяющую все пространство растительной клетки от плазмалеммы до органелл

Изучение топографии и структурной организации сложной надмолекулярной системы белков, в основе которой лежит актиновый цитоскелет, необходимо для формирования более полной картины функционирования растительной клетки Выяснение разнообразных функций цитоскелета во многом основано на исследованиях его структурной организации и выявлении составляющих его компонентов Возможно, этому могут способствовать оригинальные маркеры и новые подходы визуализации актинового цитоскелета, представленные в данной работе

ВЫВОДЫ

1 В клетках растений выявлены и проанализированы два типа организации актинового цитоскелета субкортикальная цитоплазматическая сеть и сеть, окружающая поверхности органелл

2 Внутренняя поверхность протопластов, по данным сканирующей электронной микроскопии, имеет более сложную организацию, по сравнению с наружной Иммунохимическое мечение позволяет выявить "реплики" мест прикрепления клеточных органелл и их связь с актиновым цитоскелетом

3 Методом фагового дисплея получены миниантитела к актину, которые с высокой чувствительностью способны детектировать актины растительного происхождения в дот-анализе и иммунофлуоресцентной микроскопии

4 Специфический маркер на основе конъюгата тяжелого меромиозина с коллоидным золотом выявляет актин в дот-анализе и электронной микроскопии С его помощью можно оценивать функциональные свойства АТФ-зависимого актомиозинового взаимодействия

5 Все созданные маркеры (антитела, миниантитела, фаллоидин и тяжелый меромиозин в комплексе с коллоидным золотом и флуоресцентными метками) могут быть применены в методах дот-анализа, световой и электронной микроскопии для получения полноценной информации о состоянии актинового цитоскелета как в отдельной растительной клетке, так и в тканях растений

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1 Соколов О И, Кривопалов Ю В, Соколова М К, Ильчуков В В Элементы актинового цитоскелета в протопластах клеток растений // Тез 4-го съезда о-ва физиологов растений России и международной конф "Физиология растений - наука III тысячелетия", Москва, октябрь 4-9, 1999 - С 123-124

2 Соколов О И, Кривопалов Ю В , Соколова М К, Ильчуков В В Топография поверхности и элементы актинового цитоматрикса протопластов клеток растений // Тез конф "Цитоскелет и клеточная регуляция", Пущино, май 11-12, 2000 - С 34

3 Соколов О И , Кривопалов Ю В , Соколова М К, Ильчуков В В Топография поверхности и структурная организация хлоропластов в протопластах клеток листьев табака // Тез 14-й Коми респ молодежной науч конф, Сыктывкар, апрель 18-20 2000 - С 208-209

4 Соколов О И, Кривопалов Ю В , Соколова М К, Ильчуков В В , Носов А В Топография поверхности и элементы цитоматрикса протопластов растительных клеток//Физиология растений -2001 -Т 48, №3 - С 447-454

5 Sokolov OI, Krivopalov Yu V, Sokolova MK, Il'chukov VV, Nosov AV Surface topography and cytomatnx elements in protoplasts from plant cells // Abstr Int Symp "Biological motility new trends in research", Pushchmo, Aug 20-26,-2001 -P 148-150

6 Sokolov О I, Krivopalov Yu V , Sokolova M К, Il'chukov V V, Nosov A V The role of

actin cytoskeleton in cell wall formation of plant protoplasts (SI M study) // Ibid - P 110

7 Дыкман JIA Богатырев В А, Зайцева ИС, Соколова МК Иванов В В Соколов О И Использование коньки атов коллоидного золота для идентификации актинов различного происхождения // Биофизика -2002 - Т 47 - Вып 4 - С 632-640

8 Ильчуков В В Соколова МК, Кривопалов ЮВ Соколов О И 1опография поверхности протопластов клеток растений // lei 2-й международной конф ' Анломия и морфоло! ия растении Саны-Петсрбур! 2002 - С 243-244

9 Sokolov О I Knvopalov Yu V , Il'chukov V V Sokolova M К Surface topography of plant-cell protoplasts during cultivation // Abstr 8 Int Conf " The Biology of Plant Cells in v/iro and Biotechnology", Saratov, Sept 9-13 2003 - P 292-293

10 Соколова M К, И иъчукоп В В Кривопалов ЮВ, Соколов О И Актиновый цигоматрикс и субклеточная органи)ация растительной кпетки // Тез 5-го иеда о-ва физиологов растении России и международной конф "Физиология растений - основа фитобиотехнологии", Пенза, сентябрь 15-21. 2003 - С 111-112

11 Ильчуков В В Соколова МК, Соколов О И Субкортикальный цитоскелет клеток растений // Тез Всеросс конф 'Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений фундаментальные и прикладные аспекты', Саратов, июнь 15-17 2005 - С 45-46

12 Орлов В П Соколова М К , Соколов О И Участие бетка 56-kDa в структурировании актиновых филаметпов и его локализация в клетках листьев I iciafaba L // Там же -С 50-51

13 Orlov V Р , Sokolova М К , Sokolov О 1 Cffect of a 56-kDa protein on the structure of actin filaments and its localization in the cells of Vtaa jaba L // Abstr Int Conf ' The plant cytoskeleton genomic and bioinformatic tools for biotechnology and agriculture Yalta Ukraine, Sept 19-23.2006 -P 73

14 Орлов В II, Соколова МК, Соколов О И Влияние бетка 56 кД на структуру актиновых филаченгов и его локализация в клетках лиси.ев liciafaba L // lej 6-го съезда о-ва физиологов растений России и международной конф «Современная физиоло!ия растений от молекул до жосисгем» Сыктывкар, июнь 18-24 2007 - С 191-193

13 Ильчуков В В Соколова М К Соколов О И Структура цитома1риксл протопластов к теток рас гений// Гам же - С 164-166

16 СоколовОИ Ильчу ков В В Соколова М К Разработка и применение наномаркеров для изучения структуры цитоматрикса клеток высших растений // Тез 15-й международной конференции «Высокие технологи в биологии медицине и геожологии», Новороссийск, сентябрь 10-14, 2007 - С 114-115

Подписано в печать 20 02 08 I арнтура Timts New Roman 8 Формат 60\84 1/16 Объем I уст печ л Тираж 100 >м_

Or печатано в ИСФРМ РАН 41049 (_ ара гав пр ')нгушастов П

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Соколова, Марина Константиновна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1 Понятие цитоскелета и цитоматрикса клетки.

1.2 Организация и элементы цитоматрикса растительной клетки.

1.2.1 Морфогенез и синтез клеточной стенки растений.

1.2.2 Внутриклеточные движения в растениях.

1.3 Локализация и роль актина в клетках растений.

1.3.1 Организация актинового цитоскелета растений.

1.3.2 Участие актина в передаче сигналов и сигнальных каскадах.

1.4 Участие актинового цитоскелета в пространственной организации хлоропластов.

1.5 Современные методы идентификации и визуализации актинового цитоскелета.

2. Экспериментальная часть.

2.1 Объекты исследования, приборы и реактивы.

2.2 Получение тяжёлого меромиозина и определение его ферментативной активности.

2.3 Выделение протопластов из растительных тканей.

2.4 Подготовка растительных тканей к микроскопии.'.

2.5 Другие использованные методы.

3. Результаты и их обсуждение.

3.1 Разработка и получение функционального маркёра к Б-актину на основе тяжелого меромиозина.

3.2 Электронно-микроскопическое изучение взаимодействия маркёра тяжелый меромиозин-коллоидное золото с Р-актипом.

3.3 Получение антиактиновых антител с помощью технологии фагового дисплея миииантител.

3.4 Создание тест-систем к различным формам актина на основе золотых маркёров.

3.5 Исследование топографии цитоскслета растительных клеток с помощью сканирующей электронной микроскопии.

3.6 Изучение топографии и объёмной организации хлоропластов в протопластах.

3.7 Усиление чувствительности маркёра фаллоидин-коллоидное золото ионами серебра.

3.8 Применение маркёра фаллоидин-коллоидное золото в световой микроскопии.

3.9 Иммунохимический анализ белков актинового цитоскелета растений с использованием фаговых миниантител.

3.10 Сравнительный анализ актин-содержащих структур в клетках растений.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биохимический и иммунохимический анализ пространственной организации актинового цитоскелета клеток высших растений"

Актуальность проблемы

Как известно, жизнь во всех ее разнообразных проявлениях представляет собой непрерывное движение. Способность двигаться - одно из свойств живого на Земле. Без подвижности сперматозоидов яйцеклетка не оплодотворится. Без клеточного движения I оплодотворенная яйцеклетка не перейдет к дальнейшему развитию. Без активных изменений в размере клеток и их миграции пе сформируется сложный эмбриоид. Без движения лейкоциты не соберутся вовремя у очагов воспаления и не "проглотят" вторгшиеся микроорганизмы. Без быстрого и активного движения цитоплазмы в аксонах и больших растительных клетках их периферийные участки останутся без питания. Без мускульных сокращений мы будем парализованы и не сможем сделать какое-нибудь осознанное движение. Даже дрожжи, неспособные осуществлять движение из-за жесткой клеточной стенки, зависят от внутриклеточной подвижности для обеспечения секреции и почкования! Многие прокариоты используют вращение жгутика для движения.

В клетках эукариот сложная организация внутриклеточных органелл, которая характеризуется определенным положением и определенными путями перемещения в клетке, и необходимость управлять мембранными процессами требует развития сложной системы внутриклеточной подвижности. Живая клетка определенным образом ориентирует свои оргаиеллы и субклеточные частицы и всё в ней находится в состоянии направленного движения, поддерживаемого за счет метаболизма. Каждому типу клеток присущи свой характер подвижности и своя пространственная организация. С функциональной точки зрения цитоскелет и есть совокупность структур, ответственных за пространственную организацию клетки. У всех изученных клеток комплекс подвижности построен из похожих элементов, они могут приспосабливаться к любым ситуациям, будь то амеба, клетка млекопитающего или растения. В клетке имеется сложнейшая система восприятия сигналов окружающего мира и многообразных реакций на них. Сходство в строении основных компонентов подвижности указывает на то, что они кодируются генами, которые сохранились малоизменными на протяжении клеточной эволюции. Общие для всех типов клеток принципы строения цитоскелета находят свое конкретное воплощение в видо- и ткане-специфичпых формах. Хотя структурные белки цитоскелета в большинстве своем высококонеервативны, специфические модификации набора вспомогательных белков делают возможной тонкую настройку организации цитоскелета в соответствии с функциями различных типов клеток. Каждый тип клеток отличается своим, особым спектром цитоскелетных белков, присутствующих в определенном соотношении и специфическим образом расположенных [1]. В дополнение к вариациям в строении цитоскелета у клеток разного типа, он может изменяться и в одной и той же клетке. Некоторые из таких изменений являются реакцией на те или иные внешние стимулы и могут быть автономными или зависеть от синтеза белка или РНК, тогда как другие связаны с жизненным циклом клетки. Кроме того, есть такие изменения цитоскелета, которые становятся заметны лишь на протяжении развития многих поколений клеток.

Исследование механизмов двигательных реакций у живых существ началось с изучения поперечнополосатых мышц, обладающих ярко выраженной способностью к сокращению. Именно из мышц были впервые выделены основные сократительные белки актин, миозин, регуляторные белки [2, 3].

На данном этапе развития исследований цитоскелета становится все более очевидным, что эта система является той самой структурой клетки, которая динамически объединяет ее отдельные элементы и обеспечивает функциональную стабильность многих внутриклеточных процессов [1]. Изучению разных аспектов функционирования и регуляции, в частности актинового цитоскелета, посвящено огромное количество работ. В последние годы в литературе стали появляться разнообразные сведения об актинах из растительных объектов [1, 4]. Изучение актина в растениях по-прежнему сопряжено с рядом трудностей в связи с низким содержанием его в цитоплазме растительной клетки и высокой лабильностью по отношению к протеазам [5]. Поэтому эти сведения остаются весьма отрывочными и неполными по сравнению с животными объектами. В связи с этим проблема биохимической идентификации и пространственной визуализации актиновых компонентов является весьма актуальной [6-10]. Будучи одним из основных компонентов сложного комплекса цитоскелета растительной клетки, актин принимает участие в осуществлении большинства функций как в цитоплазме: формирование микрокомпартментов (для ферментных ансамблей, биосинтеза белка), направленное движение цитоплазмы и органелл [11], пространственное определение взаиморасположения составляющих клетки [12], синтез клеточной стенки, митоз и мейоз; так и в системе межклеточных взаимодействий: участие в передаче сигнала с мембранных рецепторов, в регуляции транспорта веществ через плазмодесмы [13], а также в механизме флоэмного транспорта [14].

За последние годы возрос объём информации о сравнительной характеристике тканей на клеточном и, особенно, на субклеточном уровне; на новом методическом уровне интенсивной разработке подвергается проблема взаимосвязи структуры и функции; изучаются вопросы гистогенеза растения и клеточной дифференциации.

Подходы к идентификации актина [15-18] разнообразными методами детально разработаны лишь для животых объектов, в то время как для бактерий и растений эти методы нуждаются в существенной модификации с учетом их биохимической и морфологической специфики. Следует отметить, что для детального рассмотрения функционирования актинового цитоскелета очень важны методы дифференциальной оценки состояния (полимер — мономер) этого белка в цитоплазме. Таким образом, изучение топографии и биохимической организации сложной надмолекулярной системы белков, в основе которой лежит актиновый цитоскелет, необходимо для формирования более полной картины функционирования клеток растений.

В связи с вышеизложенным, целью данной работы было изучение пространственной организации системы белков актинового цитоскелета клеток высших растений. В работе решались следующие задачи:

1. создать набор маркёров для идентификации различных форм актина на основе функционально-активного фрагмента молекулы мышечного миозина и фаговых антиактиновых миниантител;

2. с использованием полученных маркёров изучить морфологические особенности конфигурации актин-содержащих структур клеток растений;

3. на препаратах разрушенных протопластов растительных клеток исследовать трёхмерную организацию актинового цитоскелета и его связь с органеллами;

4. сравнить информативность методов иммунофлуоресцентной и электронно-микроскопической идентификации и визуализации актина в клетках растений.

Научная новизна работы

Показаны особенности и детали строения актиновых филаментов на протопластах клеток каллусных тканей моркови и табака, а также клеток мезофилла листьев табака и бобов. Разработан метод получения специфического маркёра к актину на основе тяжелого меромиозина (функционального фрагмента молекулы миозина) и коллоидного золота. Продемонстрирована принципиальная возможность идентификации растительных актинов с помощью антиактиновых миниантител, полученных методом фагового дисплея.

Практическая значимость работы

Разработанный нами подход с применением конъюгатов коллоидного золота с рядом узнающих молекул (антителами, миниантителами, фаллоидином и тяжёлым меромиозином), а также конъюгатов флуоресцентных меток с этими зондами может быть использован для создания тест-систем на белки актинового цитоскслета на основе иммуноэлектронной и иммунофлуоресцентной микроскопии. Это позволяет достаточно надёжно и оперативно идентифицировать различные формы актинов и открывает широкие перспективы для выяснения роли актина в структурно-функциональной организации растительных клеток в фундаментальных и прикладных исследованиях.

Полученные препараты используются для решения широкого круга задач в лабораториях Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, а также Никитского ботанического сада - Национального научного центра Украины.

На защиту выносятся следующие положения:

1. поверхность протопластов растений после их специальной подготовки для сканирующей электронной микроскопии представляет собой сетчатую структуру, которая содержит элементы цитоскелета;

2. хлоропласты связаны в единую сеть, одним из компонентов которой является актин;

3. созданные специфические маркёры: тяжёлый меромиозин—коллоидное золото и полученные методом фагового дисплея миниантитела - позволяют выявлять как филаментную, так и мономерную формы актина, соответственно, методами дот-анализа и различными вариантами микроскопии;

4. разработанный набор маркёров в сочетании с использованными микроскопическими и биохимическими методами позволяет выявлять детальную организацию актинового цитоскелета в клетках растений.

Работа выполнена в лаборатории физиологии растительной клетки ИБФРМ РАН в рамках следующих бюджетных тем: «Изучение пространственно-временной организации белков цитоскелета клеток растений», научный руководитель темы д.б.н. Соколов О.И., № госрегистрации 01890008367; «Изучение роли актинового цитоскелета в адаптивных и коммуникационных реакциях клеток растений», научный руководитель темы д.б.н. Соколов О.И., № госрегистрации 01200606178.

Данная работа была также поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований: № 99-04-48833; № 04-04-48601.

Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве с д.б.н. Соколовым О.И. и к.б.н. Ильчуковым В.В. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении и анализе которых роль автора была определяющей. В иммунохимических экспериментах использовались миниантитела, полученные сотрудниками ИБФРМ РАН к.в.н. Староверовым С.А. и Костеша Н.В.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены и обсуждены на IV съезде Всероссийского общества физиологов растений и международной конференции «Физиология растений - наука III тысячелетия», Москва, Россия, октябрь 4-9, 1999; XIV Коми республиканской молодёжной научной конференции, Сыктывкар, Россия, апрель 18-20, 2000; Конференции «Цитоскелет и клеточная регуляция», Пущино, Россия, май 11-12, 2000; Int. Symp. «Signalling systems of plant cells», Moscow, Russia, June 5-7, 2001; Int. Symp. «Biological motility: New trends in research», Pushchino, Russia, Aug. 20-26, 2001; 2-й Международной конференции «Анатомия и морфология растений», Санкт-Петербург, Россия, 2002; VIII Int. Conf. «The

Biology of Plant Cells in vitro and Biotechnology», Saratov, Russia, Sept. 9-13, 2003; V съезде общества физиологов растений России и Международной конференции «Физиология растений — основа фитобиотехнологии», Пенза, Россия, сентябрь 15-21, 2003; Всероссийской конференции «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты», Саратов, Россия, июнь 15-17, 2005; Int. Symp. «The Plant Cytoskeleton: Genomic and Bioinformatic Tools for Biotechnology and Agriculture», Yalta, Ukraine, September 19-23, 2006; VI съезде общества физиологов растений России и Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем», Сыктывкар, Россия, июнь 18-24, 2007.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Соколова, Марина Константиновна

Выводы

1. В клетках растений выявлены и проанализированны два типа организации актинового цитоскелета: субкортикальная цитоплазматическая сеть и сеть, окружающая поверхности органелл.

2. Внутренняя поверхность протопластов, по данным сканирующей электронной микроскопии, имеет более сложную организацию, по сравнению с наружной. Иммунохимическое мечепие позволяет выявить «реплики» мест прикрепления клеточных органелл и их связь с актиновым цитоскелетом.

3. Методом фагового дисплея получены миниантитела к актину, которые с высокой чувствительностью способны детектировать актины растительного происхождения в дот-анализе и иммунофлуоресцентной микроскопии.

4. Специфический маркёр на основе конъюгата тяжёлого меромиозина с коллоидным золотом выявляет актин в дот-анализе и электронной микроскопии. С его помощью можно оценивать функциональные свойства АТФ-зависимого актомиозинового взаимодействия.

5. Все созданные маркёры (антитела, миниантитела, фаллоидин и тяжёлый меромиозин в комплексе с коллоидным золотом и флуоресцентными метками) могут быть применены в методах дот-анализа, световой и электронной микроскопии для получения полноценной информации о состоянии актинового цитоскелета как в отдельной растительной клетке, так и в тканях растений.

Заключение

Живая растительная клетка содержит тонко регулируемый цитоскелет и обладает способностью адекватным образом реагировать на изхменяющиеся условия внешней среды. Обнаруживаются все новые и новые цитоскелетные белки. Однако современных знаний о цитоскелетньтх белках недостаточно для понимания сложной архитектуры цитоскелета.

Архитектура цитоскелета зависит от типа клеток, степени их дифференцировки и условий окружения. Цитоскелет большинства клеток организован анизотропно и асимметрично; это динамичная, способная непрерывно изменяться структура. Спонтанная сборка в клетке из растворимых компонентов возможна для немногих цитоскелетньтх элементов, в большинстве же случаев происходит постоянная перестройка уже существующих структур. К настоящему времени накоплено множество данных о расположении цитоскелетных белков в клетках разного типа. Наше знание архитектуры цитоскелета еще не позволяет разобраться в том, что можно назвать "хореографией клетки", т.е. в движении ее различных компонентов во времени и пространстве. Но такое движение и позволяет клетке поддерживать множественные функции. Цитоскелет не только определяет внутреннюю организацию отдельной клетки, роль цитоскелета шире, -создаваемые им силы натяжения могут определять архитектуру многоклеточных образований — тканей и органов растений.

Сведения, имеющиеся в литературе, говорят о структурной и генетической консервативности актина, для животных и растительных клеток. Это свидетельствует о его функциональной универсальности в цитоплазме живой клетки, но с генетической точки зрения растительный актин проявляет гораздо большее разнообразие внутри одного вида и даже между тканями и клетками одного растения. В процессе эволюции сохранилась такая изовариантность и она может являться доказательством наличия полифункциональиой, основанной на актине, системы цитоскелета в растительной клетке.

Данные о взаимодействии препаратов актина растений с антителами к актину из тканей животных; связывание с маркёром фаллоидин-коллоидное золото подтверждают функциональное и структурное родство актинов животного и растительного происхождения на уровне биохимических препаратов. Это говорит о наличии сходных функций, выполняемых актиновым цитоскелетом в живых клетках.

Актин в клетках существует в динамическом равновесии полимерной и мономерной форм. Одним из важных компонентов цитоскелета являются актиновые микрофиламенты. Применение маркёра «фаллоидин-коллоидное золото» дало возможность визуализации элементов актинового остова в протопластах, тонких и ультратонких срезах и субклеточных препаратах. В цитоплазме исследуемых клеток выявлены преимущественные конфигурации актинового скелета: а) толстые филаментные тяжи, пронизывающие цитоплазму и вакуоли; б) цитоплазматическая микрофиламентная сеть, которая окружает и внутриклеточные органеллы; в) субкортикальная сеть F-актина.

Таким образом, световые и электронно-микроскопические данные наших исследований и других авторов дают основание рассматривать актиновый цитоскелет растений как обширную и динамичную трехмерную структуру, объединяющую всё пространство растительной клетки от плазмалеммы до органелл.

Изучение топографии и структурной организации сложной надмолекулярной системы белков, в основе которой лежит актиновый цитоскелет, необходимо для формирования более полной картины функционирования растительной клетки.

Выяснение многочисленных физиологических функций цитоскслета во многом основано на исследованиях его структурной организации и выявлении составляющих его компонентов. Возможно, этому могут способствовать оригинальные маркёры и новые подходы визуализации актинового цитоскелета, представленные в данной работе.

В дополнение к данному заключению хочу выразить глубокую благодарность научному руководителю моей диссертации д.б.н. Носову A.B. Хочу выразить искреннюю благодарность всем коллегам - сотрудникам ИБФРМ РАН: Соколову О.И., Ильчукову В.В., Дыкману Л.А., Богатырёву В.А., Мельникову А.Г., Кривопалову Ю.В., Остудину H.A.; Мошкову И.Е. (ИФР РАН, Москва) принимавшему участие в обсуждении результатов и за помощь в оформлении автореферата.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соколова, Марина Константиновна, Саратов

1. Baskin T.I. The Cytoskeleton // Biochemistry and Molecular Biology of Plants /

2. Buchanan В., Gruissem W., Jones R. eds. Am. Soc. Plant Physiol. - 2000. - P. 202 -258.

3. Кольцов H.K. Организация клетки. JI.: Бимедгиз, 1936. — 476 с.

4. Красовская И.Е. Сократительные белки немышечных клеток. I. Актино- имиозиноподобные белки // Движение немышечных клеток и их компонентов / Отв. ред. Г.М.Франк. Л.: Наука, 1977. - С. 22 - 34.

5. Chaffey N. The plant cytoskeleton in ccll differentiation and development // Hussey P.

6. Book Reviews / Annals Botany. 2005. - V. 95. - P. 1253 - 1255.

7. Chaffey N., Barlow P. Myosin, microtubules, and microfilaments: co-operation betweencytoskeletal components during cambial cell division and secondary vascular differentiation in trees // Planta. 2002. - V. 214. - P. 526 - 536.

8. Hermann R., Walther P., Muller M. Immunogold labeling in scanning electronmicroscopy // Histochem. Cell Biol. 1996. - V. 106. - P. 31 - 39.

9. Hu S., Brady S.R., Kovar D.R., Staiger C.J., Clark G.B., Roux S.J., Muday G.K.1.entification of plant actin-binding proteins by F-actin affinity chromatography // Plant J. 2000. - V. 24. - P. 127 - 137.

10. Hitt A.L., Laing S.D., Olson S. Development of a fluorescent F-actin blot overlay assayfor detection of F-actin binding proteins // Analytical Biochemistry. 2002. - V. 310.-P. 67-71.

11. Kwok E.Y., Hanson M.R. In vivo analysis of interactions between GFP-labeledmicrofilaments and plastid stromules // BMC Plant Biology. 2004. - V. 4. - P. 1471 -2229.

12. Клячко Н.Л. Цитоскелет и внутриклеточная подвижность у растений //

13. Физиология растений. 2005. - Т. 52. - С. 786 - 795.

14. Клячко Н.Л. Актиновый цитоскелет и форма растительной клетки // Физиологиярастений.-2004. Т. 51. - С. 918-925.

15. Клячко H.JL Фитогормоны и цитоскелет // Физиология растений. 2003. - Т. 50.1. С. 475 -480.

16. Sturmer K., Baumann O. Immunolocalization of a putative unconventional myosin on the surfaceof motile mitochondria in locust photoreceptors // Cell Tissue Res. — 1998. -V. 292.-P. 219-227.

17. Reddy A.S.N. Calcium: silver bullet in signaling // Plant Science. 2001. - V. 160. - P.381 -404.

18. Peruski A.H., Peruski L.F. Immunological Methods for Detection and Identification of1.fectious Disease and Biological Warfare Agents // Clin. Diagn. Lab. Immunol. -2003,-V. 10.-P. 506-513.

19. Runions J., Brach Т., Kuhner S., Hawes C. Photoactivation of GFP reveals proteindynamics within the endoplasmic reticulum membrane // J. Exp. Botany. 2006. - V. 57.-P. 43 -50.

20. Васильев Ю.М. Клетка, как архитектурное чудо // Соросовский образовательныйжурнал. 1999. - Т. 8. - С. 18 - 23.

21. Васильев Ю.М. Клетка, как чудо архитектуры // Соросовский образовательныйжурнал. 2000. - Т. 6. - С. 2 - 7.

22. Васильев Ю.М. Клетка, как чудо архитектуры // Соросовский образовательныйжурнал. 2001. -Т. 7. - С. 2 - 6.

23. Фултон А. Цитоскелет. Архитектура и хореография клетки. М.: Мир. — 1987. 117 с.

24. Egelmann Е., De Rosier D.J. Image analysis shows that variations in actins crossoverspacing are random, not compensatory // Biophys. 1992. - V. 63. - P. 1299 - 1305.

25. Volkmann N., De Rosier D.J., Matsudaira P., Hancin D. An atomic model of actinfilaments cross-linked by fimbrin and its implications for bundle assembly and function // J. Cell Biology 2001. -V. 153. - P. 947 - 956.

26. Levitsky D.I., Nikolaeva O.P., Orlov V.N., Pavlov D.A., Ponomarev M.A., Rostkova

27. E.V. Differential scanning calorimetric studies on myosin and actin // Biochemistry Engl. Tr. 1998. - V. 63. - P. 322 - 333.

28. Terashima M., Yamamori C., Tsuchiya M., Shimoyama M. ADP-ribosylation of tubulinby chicken NAD-arginine ADP- ribosyltransferase suppresses microtubule formation // J. Nutr. Sci. Vitaminol. 1999. - V. 45. - P. 393 - 400.

29. Walker R.A., O'Brien E.T., Pryer N.K., Soboeiro M.F., Voter W.A., Erickson H.P.,

30. Salmon E.D. Dynamic Instability of Individual Microtubules Analyzed by Video Light Microscopy: Rate Constants and Transition Frequencies // J. Cell Biol. — 1988. — V. 107.-P. 1437- 1448.

31. Su F., Gu W., Zhai Z.H. The keratin intermediate filament-like system in the plant mesophyll cells // Science In China Series B, Chemistry Life Sciences & Earth Sciences. 1990.-V. 33.-P. 1084- 1091.

32. Cohen C. Why fibrous proteins are romantic // J. Struct. Biol. 1998. - V. 122. - P. 316.

33. Ip W. Modulation of Desmin Intermediate Filament Assembly by a Monoclonal Antibody // J. Cell Biol. 1988. - V. 106. - P. 735 - 746.

34. Gong B.J., Mabuchi K., Takahashi K., Nadalginard B., Tao T. Characterization of Wild Type and Mutant Chickcn Gizzard Alpha-Calponin Expressed in E. Coli II Journal of Biochemistry. 1993.-V. 114. - P. 453 - 456.

35. Goldman R.D., Chou Y.H., Prahlad V., Yoon M. Intermediate filaments: dynamicprocesses regulating their assembly, motility, and interactions with other cytoskeletal systems // Faseb J. 1999. - V. 13. - P. S261 - S265.

36. Isaacs W.B., Cook R.K., Van-Atta J.C., Redmond C.M., Fulton A.B. Assembly ofvimentin in cultured cells varies with cell type // Journal of Biological Chemistry. — 1989. V. 264. - P. 17953 - 17960.

37. Yoon M., Moir R.D., Prahlad V., Goldman R.D. Motile properties of vimentinintermediate filament networks in living cells // J. Cell Biol. 1998. - V. 143. - P. 147 - 157.

38. Baldauf S.L., Palmer J.D. Animals and fungi are each other's closest relatives: congruentevidence from multiple proteins // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1993. - V. 90. - P. 1 1558- 11562.

39. Fuchs E., Yang Y. Crossroads on Cytoskeletal Highways // Cell. 1999. - V. 98. - P.547.550.

40. Selden L.A., Gcrshman L.C., Kinosian H.J., Estes J.E. Conversion of ATP-actin reverses the affinity of monomelic actin for Ca vs Mg2+ // FEBS Lett. 1987. - V. 217.-P. 89-93.

41. Podlubnaya Z., Kulikova N., Dabrowska R. The effect of Ca on the structure ofsynthetic filaments of smooth muscle myosin // J. Muscle Res. Cell Motil. — 1999. V. 20.-P. 547-554.

42. Gremm D., Wegner A. Co-operative binding of Ca ions to the regulatory binding sitesof gelsolin // Eur. J. Biochem. 1999. - V. 262. - P. 330 - 334.

43. Earley J.J., Su X.L., Moreland R.S. Caldesmon inhibits active crossbridges inunstimulated vascular smooth muscle An antisense oligodeoxynucleotide approach // Circ. Res. - 1998. - V. 83. - P. 661 - 667.

44. Pollard T. D., and Eamshaw W. C. Cell Biology. Philadelphia, 2004. 813 P.

45. Winder S.J., Ayscough K.R. Actin-binding proteins // J. Cell Science. 2005. - V. 118. -P. 651 -654.

46. Arora P.D., Janmey P.A., McCulloch C.A. A role for gelsolin in stress fiber-dependentcell contraction // Exp. Cell Res. 1999. - V. 250. - P. 155 - 167.

47. Avrova S.V., Borovikov Y.S., Eflmova N.N., Chacko S. Calcium modulatesconformational changes in F-actin induced by smooth muscle heavy meromyosin // FEBS Lett. 1998. - V. 430. - P. 266 - 268.

48. Avrova S.V., Borovikov Y.S., Efimova N.N., Horiuchi K.Y., Chacko S. Calcium ionsmodulate regulation of smooth muscle contraction mediated by phosphorylation of myosin regulatory light chains // Biochemistry Engl. Tr. 1999. - V. 64. - P. 335 -337.

49. Asada Т., Collings D.A. Molecular Motors in Higher Plants // Trends. Plant Sci. 1993. -V. 2.-P. 29-37.

50. Шестаков Д.А., Цатурян Л.К. Моделирование структуры прочно связанногокомплекса актина и миозина методом молекулярной механики // Биофизика. — 2006.-Т. 51.-С. 57-64.

51. Shaffer J.F., Razumova M.V., Tu A.-Y., Regnier M., Harris S.P. Myosin S2 is not required for effects of myosin binding protein-C on motility // FEBS Letters. 2007. -V. 581.-P. 1501 - 1504.

52. Stephens D.J., Banting G. In vivo dynamics of the F-actin-binding protein neurabin-II // Biochem. J. 2000. - V. 345. - P. 185 - 194.

53. Lambrechts A., Kwiatkowsk A.V., Lanier L.M., Bear J.E., Vandekerckhove J., Ampe

54. C., Gertler F.B. cAMP-dependcnt Protein Kinase Phosphorylation of EVL, a Mena/VASP Relative, Regulates Its Interaction with Actin and SH3 Domains // J. Biological Chemistry. -2000. V. 275.-P. 36143-36151.

55. Haering C.H., Lowe J., Hochwagen A., Nasmyth K. Molecular Architecture of SMC Proteins and the Yeast Cohesin Complex // Molecular Cell. 2002. - V. 9. - P. 773 -788.

56. IToule F., Rousseau S., Morrice N., Luc M., Mongrain S., Turner C.E., Tanaka S.,

57. Moreau P., Huot J. Extracellular Signal-regulated Kinase Mediates Phosphorylation of Tropomyosin- 1 to Promote Cytoskeleton Remodeling in Response to Oxidative Stress: Impact on Membrane Blebbing//Mol. Biology Cell. -2003. V. 14.-P. 1418- 1432.

58. Lim E.-K., Roberts M.R., Bowles D.J. Biochemical Characterization of Tomato Annexin p35 Independence Of Calcium Binding And Phosphatase Activities // J. Biological Chemistry. 1998. - V. 273. - P. 34920 - 34925.

59. Holzinger A., De Ruijter N., Emons A.M., Lutz-Meindl U. Spectrin-Like Proteins In

60. Green Algae (DESMIDIACEAE) // Cell Biology Intern. 1999. - V. 23. - P. 335 -344.

61. Kovar D.R., Gibbon B.C., McCurdy D.W., Staiger C.J. Fluorescently-labeled fimbrindecorates a dynamic actin filament network in live plant cells // Planta. — 2001. V. 213.-P. 390-395.

62. Deeks M.J., Hussey P.J., Davies B. Formins: intermediates in signal-transduction cascades that affect cytoskeletal reorganization // Trends Plant Science. — 2002. — V. 7.-P. 492-498.

63. Binder M., Ortner S., Erben H., Schnciner O., Wiedermann G., Valenta R., Duehene M.

64. The basic isoform of profilin in pathogenic Entamoeba histolytica cDNA cloning, heterologous expression, and actin-binding properties // Eur. J. Biochem. — 1995. V. 233.-P. 976-981.

65. Chicurel M.E., Chen C.S., Ingber D.E. Cellular control lies in the balance of forces //

66. Curr.Opin.CellBiol. 1998.-V. 10.-P. 232-239.

67. De Lozanne A., Berlot C.H., Leinwand L.A., Spudich J.A. Expression in Escherichiacoli of a Functional Dictyostelium Myosin Tail Fragment // J. Cell Biol. 1987. - V. 105.-P. 2999-3006.

68. Donnelly S.M., Sullivan D.J., Shanley D.B., Coleman D.C. Phylogenetic analysis andrapid identification of Candida dubliniensis based on analysis of ACT 1 inlron and exon sequences//Microbiology. UK. 1999.-V. 145.-P. 1871 - 1882.

69. Eichinger L., Noegel A.A., Schleicher M. Domain structure in actin-binding proteins:

70. Expression and functional characterization of truncated Severin // Journal of Cell Biology. 1991.-V. 112.-P. 665-676.

71. Jackson D., Hake S. Morphogenesis on the move: cell-to-Cell trafficking of plantregulatory proteins // Curr. Opin. Genet. Develop. 1997. -V.l.- P. 495 - 500.

72. Lowe J., Van den Ent F., Amos L.A. Molecules of the Bacterial Cyloskeleton // Annu.

73. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2004. - V. 33. - P. 177 - 198.

74. Ent F.V.D., Amos L., Lowe J. Bacterial ancestry of actin and tubulin // Microbiology.2001.-V. 4.-P. 634-638.

75. Ent F.V.D., Amos L.A., Lowe J. Prokaryotic origin of the actin cyloskeleton // Nature.2001.-V.413.-P. 39-44.

76. Jones L.J.F., Caraballido-Lopez R., Errington J. Control of Cell Shape in Bacteria:

77. Helical, Actin-like Filaments in Bacillus subtilis-ll Cell. 2001. - V. 104. - P. 913 -922.

78. Vale R.D. The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport // Cell. 2003. - V.112.-P. 467-480.

79. Samaj J., Baluska F., Voigt B., Schlicht M., Volkman D., Menzel D. Endocytosis, Actin

80. Cytoskeleton, and Signaling//Plant Physiology. 2004. - V. 135.-P. 1150 - 1161.

81. Carlier M.-F., Ressad F., Pantaloni D. Control of Actin Dynamics in Cell Motility //

82. Biological Chemistry. 1999. - V. 274. - P. 33827 - 33830.

83. Ma X., Margolin W. Genetic and Functional Analyses of the Conserved C-Terminal

84. Core Domain of Escherichia coli FtsZ // J. Bacteriology. 1999. - V. 181. - P. 7531 -7544.

85. Soufo H.J.D., Graumann P.L. Actin-like Proteins MreB and Mbl from Bacillus subtilis Are Required for Bipolar Positioning of Replication Origins // Current Biology. 2003. -V. 13.-P. 1916- 1920.

86. Loomis W.F., Swith D.W. Molecular phylogeny of Dictyostelium discoideum by proteinsequence comparison // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1990. - V. 87. - P. 9093 - 9097.

87. Margolin W. A green light for the bactcrial cytoskeleton // Trends Microbiology. —1998.-V. 6.-P. 233 -238.

88. Egelman E.H. Molecular evolution: Aclin's long lost relative found // Current Biology. —2001,-V. 11.-P. 1022- 1024.

89. Kruse Т., Moller-Jensen J., Lobner-Olesen A., Gerdes K. Dysfunctional MreB inhibitschromosome segregation in Escherichia coli II EMBO J. 2003. — V. 22. - P. 5283 -5292.

90. Kutschera U., Niklas K.J. Endosymbiosis, cell evolution, and speculation // Theory

91. Biosciences. 2005. - V. 124. - P. 1 - 24.

92. Mathur J., Hulskamp M. Microtubules and Microfilaments in Cell Morphogenesis in

93. Higher Plants // Current Biology. 2002. - V. 12. - P. 669 - 676.

94. Nebl Т., Pestonjamasp K.N., Leszyk J.D., Crowley J.L., Oh S.W., Luna E.J. Proteomic

95. Analysis of a Detergent-resistant Membrane Skeleton from Neutrophil Plasma Membranes // J. Biological Chemistry. 2002. - V. 277. - P. 43399 - 43409.

96. Данилова М.Ф, Козубова Г.М. Атлас ультраструктуры растительных тканей.

97. Петрозаводск: Карелия, 1980. 453 с.

98. Saedler R., Role of Distorted 2, gnarled and spirrig in cell morphogenesis of Arabidopsis thaliana II Dissertation. Universität zu Köln, 2005. - 102 P.

99. Kost В., Mathur J., Chua N.-H. Cytoskeleton in plant development // Current Opinion

100. Plant Biology. 1999. - V. 2. - P. 462 - 470.

101. Kost В., Chua N.-H. The Plant Cytoskeleton:Vacuoles and Cell Walls Make the

102. Difference // Cell. 2002. - V. 108. - P. 9 - 12.

103. Cassab G.I. Plant Cell Wall Proteins // Annu. Rev. Plant Physiol. 1998. - V. 49. - P. 281

104. Соколов О.И., Кривопалов Ю.В., Соколова М.К., Ильчуков В.В., Носов А.В.

105. Топография поверхности и элементы цитоматрикса протопластов растительных клеток // Физиология растений. — 2001. -Т. 48. С. 447 — 454.

106. Бутенко Р.Г. Изолированные протопласты растений объект и модель дляфизиологических исследований. Культура клеток растений. М.: ФБК-ПРЕСС, 1981.-84 с.

107. Михайлов В.И., Мандульский В.Д., Матиенко Б.Т. Цитоскелет протопластовклеток высших растений // Докл. АН УССР. 1984. -Т. 12. - С. 112 - 123.

108. Лозовая ВВ. Особенности формирования клеточной стенки изолированнымипротопластами высших растений. М.: Наука. - 1987. - 126 с.

109. Emons A.M. Helicoidal microfibril deposition in a tip-growing cell and microtubulealignment during tip morphogenesis: a dry-Cleaving and freeze-substitution study // Can. J. Bot. 1988. - V. 67. - P. 2401 - 2408.

110. Emons A.M. Methods for visualizing cell wall texture // Acta Botanica Neerlandica. —1988,-V. 37.-P. 31-38.

111. Miller D.D., de Ruijter N.C., Bisseling Т., Emons A.M. The role of actin in root hairmorphogenesis: studies with lipochito- oligosaccharide as a growth stimulator and cytochalasin as an actin perturbing drug // Plant J. 1999. - V. 17. - P. 141 - 154.

112. Collings D.A., Emons M.C. Microtubule and actin filament organization during acentraldivisions in potato suspension culture cells // Protoplasma. 1999. - V. 207. - P. 158 -168.

113. Fowler J.E., Quatrano R.S. Plant cell morphogenesis: Plasma membrane interactionswith the cytoskeleton and cell wall // Annu. Rev. Cell Biol. 1997. - V. 13. - P. 697 -743.

114. Quader II., Herth W., Ryser U., Schnepf E. Cytoskeletal Elements in Cotton Seed Hair

115. Development in vitro: Their Possible Regulatory Role in Cell Wall Organization // Protoplasma. 1987. - V. 137. - P. 56 - 62.

116. Крахмалёв B.A., Закиров Т.А. Прижизненные наблюдения строения и роставолосков семяпочек хлопчатника // Физиология растений. 2000. - Т. 47. - С. 279 -285.

117. Lloyd C.W. The cytoskeleton in plant growth and development / Academic Press.1.ndon-New York. 1982. - 146 p.

118. Lloyd C.W. The Plant Cytoskeleton: The Impact of Fluorescence Microscopy // Annu.

119. Rev. Plant Physiol. 1987. - P. 119 - 139.

120. Cardenas L., Vidali L., Domyngues J., Perez H., Sanchez F., Hepler P.K., Quinto C.

121. Rearrangement of Actin Microfilaments in Plant Root Hairs Responding to Rhizobium Nodulation Signals // Plant Physiology. 1998. - V. 116. - P. 871 - 877.

122. Voigt B., Timmers A.C.J., Samaj J., Hlavacka A., Ueda T., Preuss M., Nielsen E.,

123. Mathur J., Emans N., Stenmark H., Nakano A., Baluska F., Menzel D. Actin-based motility of endosomes is linked to the polar tip growth of root hairs // European J. Cell Biol. 2005. - V. 84. - P. 609 - 621.

124. Yokota E., Takahara K., Shimmen T. Actin-Bundling Protein Isolated from Pollen

125. Tubes of Lily Biochemical and Immunocytochcmical Characterization // Plant Physiol. 1998. - V. 116. - P. 1421 - 1429.

126. Yokota E., Muto S., Shimmen T. Calcium-Calmodulin Suppresses the Filamentous

127. Actin-Binding Activity of a 135-Kilodalton Actin-Bundling Protein Isolated from Lily Pollen Tubes // Plant Physiology. 2000. - V. 123. - P. 645 - 654.

128. Matsuoka K., Bednarek S. Protein transport within the plant cell endomembrane system:an update // Current Opinion Plant Biology. 1998. - V. 1. - P. 463 - 469.

129. Chytilova E., Macas J., Sliwinska E., Rafelski S.M., Lambert G.M., Galbraith D.W. Nuclear Dynamics in Arabidopsis thaliana // Molecular Biology Cell. 2000. - V. 11. -P. 2733 -2741.

130. Chen Z.-Y., Hasson T., Zhang D.-S., Schwender B.J., Derfler B.H., Mooseker M.S.,

131. Corey D.P. Myosin- Vllb, a Novel Unconventional Myosin, Is a Constituent of Microvilli in Transporting Epithelia // Genomics. 2001. - V. 72. - P. 285 - 296.

132. Miyagishima S.-Y., Takahara M., Kuroiwa T. Novel filaments 5 nm in diameterconstitute the cytosolic ring of the plastid division apparatus // Plant Cell. 2001. - V. 13.-P. 707-721.

133. Fehrenbacher K., Huckaba T., Yang H- C., Boldogh I., Pon L. Actin comet tails,endosomes and endosymbionts // Experimental Biology. 2003. - V. 206. - P. 1977 -1984.

134. Kim H., Park M., Kim S.J., Hwang I. Actin Filaments Play a Critical Role in Vacuolar

135. Trafficking at the Golgi Complex in Plant Cells // Plant Cell. 2005. - V. 17. - P. 888

136. Каппуччинелли П. Подвижность живых клеток . — М.: Мир, 1982. — 124 с.

137. Brown S.S. Motor proteins in Saccharomyces cerevisiae II Canadian Journal of Botany. 1995.-V. 73.-P. S371.

138. Brokaw C.J. Are motor enzymes bi-directional? // Cell Motil. Cytoskeleton. 1997.1. V. 38.-P. 115-119.

139. Baker J.P., Titus M.A. Myosins: matching functions with motors // Curr. Opin. Cell Biol. 1998,-V. 10.-P. 80-86.

140. Baker J.P., Titus M.A. A family of unconventional myosins from the nematode

141. Caenorhabditis elegans II J. Mol. Biol. 1997. - V. 272. - P. 523 - 535.

142. Курилова JI.C., Крутецкая З.И., Лебедев O.E. Влияние латрункулина В, джасплакинолида и брефельдипа А на депозависимый вход Са2+ в макрофаги // Цитология. 2006. - Т. 48. - С. 867 - 873.

143. Поглазов Б.Ф. Аденозинтрифосфатазная активность и двигательная реакциярастений // Доклады Академии Наук. 1956. -Т. 109. -С. 597 - 599.

144. Поглазов Б.Ф. Структура и функции сократительных белков / 1965. - 223 с.

145. Соколов О.И., Богатырев В.А., Туркина М.В. Миозин из проводящих тканей Heracleum sosnovskyi: взаимодействие с мышечным актином и образование филаментов// Физиология растений. 1986. - Т. 33. - С. 421 -431.

146. Поглазов Б.Ф, Бурнашева С.А. Немышечные двигательные системы. -М.: Мир,1989.- 175 с.

147. Smith Н.В. The Nucleocytoplasmic Continuum: Pushing the (Nuclear) Envelope // Plant ( Cell.- 1999.-V. 11.-P. 989-991.

148. Kussel-Andermann P., El-Amraoui A., Safieddine S., Hardelin J.-P., Nouaille S.,

149. Camonis J., Petit C. Unconventional Myosin VIIA Is a Novel A-kinase-anchoring Protein // J. Biological Chemistry. 2000. - V. 275. - P. 29654 - 29659.

150. Goodson H.V., Spudich S.A. Molecular evolution of the myosin family: relationshipsderived from comparisons of amino acid sequences // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1993.-V. 90.-P. 659-663.

151. Titus M.A. Unconventional myosins: new frontiers in actin-based motors // Trends Cell

152. Biology. 1997. - V. 7. - P. 119 - 123.

153. Foth B.J., Goedecke M.C., Soldati D. New insights into myosin evolution andclassification//PNAS.-2006.-V. 103.-P. 3681 -3686.

154. Sheetz M.P., Spudich J.A. Movement of myosin-Coated fluorescent beads on actin cables in vitro IINature. 1983. - V. 303. - P. 31 - 35.

155. Williamson R.E. Actin in motile and other processes in plant cells // Can. J. Bot. 1980. -V. 58.-P. 766-772.

156. Grolig F. Nuclcar centering in Spirogyra: force integration by microfilaments along microtubules // Planta. 1998. - V. 204. - P. 54 - 63.

157. Kashiyama T., Ito K., Yamamoto K. Functional Expression of A Chimeric Myosin

158. Containing Motor Domain of Chara Myosin and Neck and Tail Domains of Dictyostelium Myosin II // J. Mol. Biol. 2001. - V. 311. - P. 461 - 466.

159. Balish M.F., Moeller E.F., Coluccio L.M. Overlapping distribution of the 130- and 110kDa myosin I isoforms on rat liver membranes // Arch. Biochem. Biophys. — 1999. V. 370.-P. 285-293.

160. Awata J.-Y., Kashiyama T., Ito K., Yamamoto K. Some Motile Properties of Fast

161. Characcan Myosin // J. Mol. Biol. 2003. - V. 326. - P. 659 - 663.

162. Lee Y.-R.J., Liu B. Cytoskeletal Motors in Arabidopsis. Sixty-One Kinesin sand

163. Seventeen Myosins // Plant Physiolgy. 2004. - V. 136. - P. 3877 - 3883.

164. Rcddy A.S.N., Day l.S. Analysis of the myosins encoded in the recently completed Arabidopsis thaliana genome sequence // Genome Biology. 2001. - V. 2. - P. 1-17.

165. Assaad F.F. Of weeds and men: what genomes teach us about plant cell biology //

166. Current Opinion Plant Biology. 2001. - V. 4. - P. 478 - 487.

167. Song H., Golovkin M., Reddy A.S.N., Endow S.A. In vitro motility of AtKCBP, a calmodulin-binding kinesin protein of Arabidopsis II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1997,-V. 94.-P. 322-327.

168. Oppenheimer D.G., Pollock M.A., Vacik J., Szymanski D.B., Ericson B., Feldmann K.,

169. Marks M.D. Essential role of a kinesin-like protein in Arabidopsis trichome morphogenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94. - P. 6261 - 6266.

170. Vallee R.B., Gee M.A. Make room for dynein // Trends Cell Biology. 1998. - V. 8.1. P. 490 494.

171. Schmelzer E. Cell polarization, a crucial process in fungal defence // Trends Plant

172. Science. 2002. - V. 7. - P. 411 - 415.

173. Ketelaar T., Faivre-Moskalenko C., Esseling J.J., de Ruijter N.C.A., Grierson C.S.,

174. Dogterom M., Emons A.M.C. Positioning of Nuclei in Arabidopsis Root Hairs: An Actin-Regulated Process of Tip Growth // Plant Cell. 2002. - V. 14. - P. 2941 - 2955.

175. Paves H., Truvc E. Incorporation of mammalian actin into microfilaments in plant cellnucleus // BMC Plant Biology. 2004. - V. 4. - P. 1 - 9.

176. Logan D.C., Scott I., Tobin A.K. The genetic control of plant mitochondrial morphologyand dynamics // Plant J. 2003. - V. 36. - P. 500 - 599.

177. Logan D.C., Knight M.R. Mitochondrial and cytosolic calcium dynamics aredifferentially regulated in plants // Plant Physiology. 2003. - V. 133. - P. 21 - 24.

178. Logan D.C. Mitochondrial dynamics // New Phytologist. 2003. - V. 160. - P. 463478.

179. Logan D.C. The mitochondrial compartment // J. Exp. Botany. 2006. - V. 57. - P.1225- 1243.

180. Toyooka K., Okamoto T., Minamikawa T. Mass Transport of Proform of a KDEL-tailed

181. Cysteine Proteinase (SH-EP) to Protein Storage Vacuoles by Endoplasmic Reticulum-derived Vesicle Is Involved in Protein Mobilization in Germinating Seeds // J. Cell Biology. 2000. - V. 148. - P. 453 - 463.

182. Du Y., Ferro-Novick S., Novick P. Dynamics and inheritance of the endoplasmicreticulum // Cell Science. 2006. - V. 117. - P. 2871 - 2878.

183. Nebenfuhr A., Gallagher L., Dunahay T.G., Frohlic J.A., Mazurkiewicz A.M., Meehl

184. J.B., Staehelin A. Stop-and-Go Movements of Plant Golgi Stacks Are Mediated by the Acto-Myosin System//Plant Physiol. 1999.-V. 121.-P: 1127-1141.

185. Biegel D., Pachter J.S. mRNA Association With the Cytoskeletal Framework Likely

186. Represents a Physiological Binding Event // J. Cellular Biochemistry. 1992. - V. 48. -P. 98- 106.

187. Reue K. mRNA quantitation techniques: Considerations for experimental design andapplication // J. Nutr. 1998. - V. 128. - P. 2038 - 2044.

188. Cali B.M., Anderson P. mRNA surveillance mitigates genetic dominance in

189. Caenorhabditis elegans II Mol. Gen. Genet. 1998. - V. 260. - P. 176 - 184.

190. Bassell G, Singer RH. mRNA and cytoskeletal filaments. 1997. - 109 - 119 p.

191. Kiger A.A., Baum В., Jones S., Jones M.R., Coulson A., Echeverri C., Perrimon N. Afunctional genomic analysis of cell morphology using RNA interference // J. Biology. — 2003.-V. 2.-P. 27.1 -27.15.

192. Kwon S.J., Choi E.Y., Choi Y.J., Ahn J.H., Park O.K. Proteomics studies of posttranslational modifications in plants // J. Exp. Botany. 2006. - V. 57. - P. 1547 -1551.

193. Aniento F., Robinson D.G. Testing for endocytosis in plants // Protoplasma. 2005.1. V. 226.-P. 3-11.

194. Зак E.A., Каравайко H.H., Соколов О.И., Николаева М.К., Клячко H.JI.

195. Идентификация нерибосомных полипептидов в препаратах полисом из листьев Vicia faba L. // Физиология растений. 1995. - Т. 42. - С. 79 — 86.

196. Зак Е.А., Бочарова М.А., Соколов О.И., Клячко H.JI. Полисомы растений,связанные с цитоскелетом // Доклады Академии Наук. — 1995. Т. 344. - С. 549 -551.

197. Abe S., Ilo Y., Davies Е. Ribosome Aggregating Protein // Plant Physiol.Biochem.1995.-V. 33.-P. 1-15.

198. Hayward R.D., Koronakis V. Direct modulation of the host cell cytoskeleton by Salmonella actin binding proteins // Trends Cell Biology. - 2002. - V. 12. - P. 15 -20.

199. Mathur J. The ARP2/3 complex: giving plant cells a leading edge // BioEssays. 2005. - V. 27.-P. 377-387.

200. Hable W.E., Kropf D.L. The Arp2/3 complex nucleates actin arrays during zygotepolarity establishment and growth // Cell Motility Cytoskeleton. 2005. - V. 61. - P. 9 -20.

201. Williamson R.E. Actin in the alga Chara corallina II Nature. 1974. - V. 248. - P. 801 -802.

202. Palevitz B.A., Ash J.F., Hepler P.K. Actin in green alga Nitella II Proc. Natl. Acad. Sci.

203. USA. 1974.-V. 71.-P. 363-366.

204. Marcnant H.J. Actin in green algae Coleochaete and Mougeotia II Planta. 1976. - V.131.-P. 119-125.

205. Blackman L.M., Overall R.L. Immunolocalisation of the cytoskelcton to plasmodesmataof Chara carollina II Plant J. 1998. - V. 14. - P. 733 - 741.

206. Воробьева И.А., Поглазов Б.Ф. Выделение сократительного белка из водоросли Nitella flexilis II Биофизика. 1963. - T. 8. - С. 4475 - 4478.

207. Евдокимов М.В., Приезжев А.В., Романовский Ю.М., Черняева Е.Б. Исследованиеподвижности протоплазмы в клетках водоросли Nitella методом оптической доплеровской спектроскопии // Биофизика. 1982. - Т. 27. - С. 918 - 920.

208. Zawadzki Т., Fensom D.S. Transnodal transport of 14C in Nitella flexilis. I. Tandem cellswithout applied pressure gradients // J. Exp. Bot. 1987. - V. 37. - P. 1341 - 1352.

209. Takahashi IT, Takano H., Kuroiwa H., Itoh R., Toda K., Kawano S., Kuroiwa T. Apossible role for actin dots in the formation of the contractile ring in the ultra-micro alga Cyanidium caldarium RK-1 // Protoplasma. 1998. - V. 202. - P. 91 - 104.

210. Tirlapur U.K., Faleri C., Cresti M. Immunoelectron microscopy of myosin associatedwith the generative cells in pollen tubes of Nicotiana tabacum L. // Sex Plant Reprod. — 1996.-V. 9.-P. 233 -237.

211. Torres G.A.M., Lelandais-Briere C., Besin E., Jubier M.-F., Roche O., Mazubert C.,

212. Corre-Menguy F., Hartmann C. Characterization of the expression of Phaseolus vulgaris OCT1, adehydration-regulated gene that encodes a new type of phloem transporter // Plant Molecular Biology. 2003. - V. 51.-P. 341 -349.

213. Quader H., Schnepf E. Actin filament array during side branch initiation in protonema cells of the moss Funaria hygrometrica: an actin organizing center at the plasma membrane // Protoplasma. 1989. - V. 151. - P. 167 - 170.

214. Condeelis J. The Identification of F-actin in the Pollen Tube and Protoplasts of Amarillis belladonna И Exp. Cell Res. 1974. - V. 88. - P. 435 - 439.

215. Forer A., Jackson W.T. Actin in the Higher Plants Haemanthus katharine Baker //

216. Cytobiol. 1975. - V. 10. - P. 217 - 226.

217. Yen L.F., Liu X.O., Cai S.T. Polymerization of Actin from Maize Pollen // Plant Physiol. 1995.-V. 107.-P. 73-76.

218. Jackson W.T., Doyle B.G. Characterization of Actin from Root Tips of Phaseolusvulgaris I I J. Cell Biology. 1977. - V. 75. - P. 268.

219. Vahey M., Scordilis S.P. Contractile proteins from the tomato // Can. J. Bot. 1980. -V. 58.-P. 797-801.

220. Vahey M., Titus M.A., Trautwcin R., Scordilis S.P. Tomato Actin and Myosin:

221. Contractile Proteins from a Higher Land Plant // Cell Motility. 1982. - V. 2. - P. 131 - 147.

222. Metcalf III T.N., Szabo L.J., Schubert K.R., Wang J.L. Ultrastructural and1.munochemical Analyses of the Distribution of Microfilaments in Seedlings and Plants of Glycine max II Protoplasma. 1984. - V. 120. - P. 91 - 99.

223. Куликова A.JI., Туркина M.B., Курсанов A.JI. Поиски актиноподобного белка вофлоэме Heracleum sosnowskyi II Физиология растений. 1980. - Т. 27. - С. 301 -307.

224. Куликова A.JI. Количество и формы актина в проводящих тканях Heracleum sosnowskyi II Физиология растений. 1986. - Т. 33. - С. 629 - 636.

225. Quader Н., Deichgraber G., Schnepf Е. The cytoskeleton of Cobaea seed hairs: Patterning during cell-wall differentiation 11 Planta. 1986. - V. 168. - P. 1-10.

226. Sokolov O.I., Gringauze O.K., Richtcr T.J. Plant Actin Identification With Colloidal

227. Gold Markers // Biologia Plantarum. 1994. - V. 36. - P. SI8.

228. Shah D.M., Hightower R.C., Meagher R.B. Complete Nucleotide Sequence of a

229. Soybean Actin Gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - V. 79. - P. 1022 - 1026.

230. Rcece K.S., McElroy D., Wu R. Genomic nucleotide sequence of four rice (Oryzasativa) actin genes // Plant Molecular Biology. 1990. - V. 14. - P. 621 - 624.

231. Nairn C.J., Winesett L., Ferl R.J. Nucleotide Sequence of an Actin Gene From Arabidopsis thaliana II Gene. 1988. - V. 65. - P. 247 - 257.

232. Goldman W.H., Tempel M., Sprenger I., Isenberg J., Ezzell R.M. Viscoelasticity ofactin-gelsolin networks in the presence of filamin // Eur. J. Biochem. 1997. - V. 246. -P. 373 -379.

233. Mccurdy D.W., Sammut M., Gunning B.E. Immunofluorescent Visualization of Arraysof Transverse Cortical Actin Microfilaments in Wheat Root-Tip Cells // Protoplasma. — 1988.-V. 147.-P. 204-206.

234. Harper J.D., Mccurdy D.W., Sanders M.A., Salisbury J.L., John P.C. Actin dynamicsduring the cell cycle in Chlamydomonas reinhardtii II Cell Motil Cytoskeleton. 1992. - V. 22.-P. 117-126.

235. Traas J.A., Doonan J.H., Rawlins D.J., Shaw P.J., Watts J., Lloyd C.W. An Actin

236. Network Is Present in the Cytoplasm throughout the Cell Cycle of Carrot Cells // J. Cell Biology. 1987. - V. 105. - P. 387 - 395.

237. Cyr R.J., Palevitz B.A. Organization of Cortical Microtubules in Plant Cells // Curr.

238. Opin. Cell Biol. 1995. - V. 7. - P. 65 - 71.

239. Goto Y., Ueda K. Microfilament bundles of F-actin in Spirogyra observed byfluorescence microscopy // Planta. 1988. - V. 173. - P. 442 - 446.

240. Bereiter-Hahn J. Involvement of Microcompartmentation in The Regulation of Cell

241. Proliferation // Microcompartmentation / Jones D.P., ed. Boca Raton. - 1988. - P. 55 -69.

242. Lloyd C.W. Probing the plant cytoskeleton//Nature. 1991.-V. 350.-P. 189- 190.

243. Cyr R.J. Calcium/calmodulin affects microtubule stability in lysed protoplasts // J. of

244. Cell Science. 1991. - V. 100. - P. 311 - 318.

245. Callis J. Regulation of Protein Degradation // Plant Cell. 1995. - V. 7. - P. 845 - 857.

246. Gausmann U., Franzl E., Kurischko C. Distribution of the actin cytoskeleton during thecell cycle of Yarrowia lipolytica and the visualization of the tubulin cytoskeleton by immunofluorescence // Yeast. 1999. - V. 15. - P. 1079 - 1086.

247. Pierson E.S., Lichtscheidl I.K., Derksen J. Structure and behavior of organelles in livingpollen tubes of Lilium longiflorum II Journal of Experimental Botany. 1990. - V. 41. -P. 1461 - 1468.

248. Jones H.D., Schliwa M., Drubin D.G. Video microscopy of organelle inheritance andmotility in budding yeast // Cell Motility and the Cytoskeleton. 1993. - V. 25. - P. 129-142. ,

249. Menzel D. An interconnected plastidom in Acetabularia: Implications for themechanism of chloroplast motility // Protoplasma. 1994. - V. 179. - P. 166-171.

250. Uchida G., Chinzei T., Matsuura H. Reverse motion of organelles with myosinmolecules along bundles of the actin filaments in a Characean internodal cell // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. - V. 257. - P. 223 - 227.

251. Wendt M., Sievers A. Restitution of Polarity in Statocytes from Centrifuged Roots // Plant Cell Env. 1986. - V. 9. - P. 17 - 23.

252. Samaj J., Baluska F., Hirt PI. From signal to cell polarity: mitogcn-activated proteinkinases as sensors and effectors of cytoskeleton dynamicity // J. Exp. Botany. 2004. -V. 55.-P. 189- 198.

253. Cai G., Del Casino C., Cresti M. Cytoskeletal Basis of Organelle Trafficking in the

254. Angiosperm Pollen Tube // Annals Botany. 2000. - V. 85. - P. 69 - 77.

255. Cardenas L., Lovy-Wheeler A., Wilsen K.L., Iiepler P.K. Actin Polymerization

256. Promotes the Reversalof Streaming in the Apex of Pollen Tubes // Cell Motility Cytoskeleton.-2005.-V. 61. P. 112 - 127.

257. Snowman B.N., Kovar D.R., Shevchenko G., Franklin-Tong V.E., Staiger C.J. SignalMediated Depolymerization of Actin in Pollen during the Self-Incompatibility Response // Plant Cell. 2002. - V. 14. - P. 2613 - 2626.

258. Justus C.D., Anderhag P., Goins J.L., Lazzaro M.D. Microtubules and microfilamentscoordinate to direct a fountain streaming pattern in elongating conifer pollen tube tips //

259. Planta. 2004. - V. 219. - P. 103 - 109.

260. Kinosian H.J., Selden L.A., Estes J.E., Gershman L.C. Actin filament annealing in thepresence of ATP and phalloidin // Biochemistry. 1993. - V. 32. - P. 12353 - 12357.

261. Foissner I., Wasteneys G.O. A cytochalasin-sensitive actin filament meshwork is aprerequisite for local wound wall deposition in Nitella internodal cells // Protoplasma. — 1997.-V. 200.-P. 17-30.

262. Adami R., Choquet D., Grazi E. Rhodamine phalloidin F-actin Critical concentrationversus tensile strength // Eur. J. Biochem. 1999. - V. 263. - P. 270 - 275.

263. Zackroff R.V., Hufnagel L.A. Relative potencies of different cytochalasins for theinhibition of phagocytosis in ciliates // J. Eucaryot. Microbiol. 1998. - V. 45. - P. 397 -403.

264. Szymanski D.B., Marks M.D., Wick S.M. Organized F-actin is essential for normal trichome morphogenesis in Arabidopsis II Plant Cell. 1999. - V. 11. - P. 2331 -2347.

265. Zhang X., Dyachok J., Krishnakumar S., Smith L.G., Oppenlieimer D.G. Regular

266. Trichome BRANCPI1 in Arabidopsis Encodesa Plant Homolog of the Actin-Related Protein 2/3 Complex Activator Scar/WAVE That Regulates Actin and Microtubule Organization // Plant Cell. 2005. - V. 17. - P. 2314 - 2326.

267. Szymanski D.B. Breaking the WAVE complex: the point of Arabidopsis trichomes //

268. Current Opinion Plant Biology. 2005. - V. 8. - P. 103 - 112.

269. Frank M.J., Smith L.G. A small, novel protein highly conserved in plants and animalspromotes the polarized growth and division of maize leaf epidermal cells // Current Biology. 2002. - V. 12. - P. 849 - 853.

270. Smith L.G., Oppenheimer D.G. Spatial control of cell expansion by the plantcytoskeleton // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2005. - V. 21. - P. 272 - 295.

271. Stevens J.M., Galyov E.E., Stevens M.P. Actin-dependent movement of bacterialpathogens // Nature reviews Microbiology. 2006. - V. 4. - P. 91 - 101.

272. Schmidt A., Hall M.N. Signaling to the actin cytoskeleton // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1998,-V. 14.-P. 305-338.

273. Tuxworth R.I., Titus M.A. Unconventional Myosins: Anchors in the Membrane Traffic

274. Relay // Traffic. 2000. - V. 1. - P. 11 - 18.

275. Gu Y., Wang Z., Yang Z. Rop/Rac GTPase: an old new master regulator for plantsignaling // Current Opinion Plant Biology. 2004. - V. 7. - P. 527 - 536.

276. Balachandran S., Xiang Y., Schobert C., Thompson G.A., Lucas W.J. Opening upplasmodesmata // Trends Plant Science. 1998. - V. 3. - P. 74 - 84.

277. Aaziz R., Dinant S., Epel B.L. Plasmodesmata and plant cytoskeleton // Trends Plant

278. Sciencc. 2001. - V. 6. - P. 326 - 330.

279. Thompson G.A., Schulz A. Macromolecular trafficking in the phloem // Trends Plant

280. Science. 1999. - V. 4. - P. 1 - 7.

281. Ingram J., Barlels D. The Molecular Basis of Dehydration Tolerance in Plants // Annu. Rev. Plant Physiol. 1996. - V. 47. - P. 377 - 403.

282. Leung J., Giraudat J. Abscisic Acid Signal Transduction // Annu. Rev. Plant Physiol.1998.-V. 49.-P. 199-222.

283. Diouf D., Diop T.A., Ndoye I. Actinorhizal, mycorhizal and rhizobial symbioscs: howmuch do we know? // African J. Biotechnology. 2003. - V. 2. - P. 1-7.

284. Cavalier-Smith T. Economy, Speed and Size Matter: Evolutionary Forces Driving Nuclear Genome Miniaturization and Expansion // Annals Botany. 2005. - V. 95. — P. 147- 175.

285. Hussey P.J., Ketelaar T., Deeks M.J. Control of the actin cytoskeleton in plant cellgrowth // Annu. Rev.Plant Biol. 2006. - V. 57. - P. 87 - 96.

286. Drobak B.K., Franklin-Tong V.E., Staiger C.J. The role of the actin cytoskeleton in plant cell signaling // New Phytologist. 2004. - V. 163. - P. 13 - 30.

287. Estrada P., Kim G., Coleman G., Takizawa P., Novick P., Ferro-Novick S. Myo4p and

288. She3p arc required for cortical ER inheritance in Saccharomyces cerevisiae II Cell Biology. 2003. - V. 163. - P. 1255 - 1266.

289. Krauze K., Makuch R., Stepka M., Dabrowska R. The First Caldesmon-Iike Protein in

290. Higher Plants // Biochemical Biophysical Research Communications. 1998. - V. 247. -P. 576-579.

291. Huang S., Gao L., Blanchoin L., Staiger C.J. Heterodimeric Capping Protein from Arabidopsis is Regulated by Phosphatidic Acid // Molecular Biology Cell. — 2006. V. 24.-P. 888-999.

292. Gusev N.B. Some Properties of Caldesmon and Calponin and the Participation of These

293. Proteins in Regulation of Smooth Muscle Contraction and Cytoskeleton Formation // Biochemistry (Moscow). 2001. - V. 66. - P. 1112 - 1121.

294. Martin M.L., Busconi L. A Rice Membrane-Bound Calcium-Dependent Protein Kinase

295. Activated in Response to Low Temperature // Plant Physiolgy. 2001. - V. 125. - P. 1442-1449.

296. Allwood E.G., Smertenko A.P., Hussey P.J. Phosphorylation of plant actindepolymerising factor by calmodulin-likedomain protein kinase // FEBS Letters. — 2001.-V. 499.-P. 97- 100.

297. Lenartowska M., Karas K., Marshall J., Napier R., Bednarska E. Immunocytochemicalevidence of calreticulin-like protein in pollen tubes and styles of Petunia hybrida Hort. // Protoplasma. 2002. - V. 219. - P. 23 - 30.

298. Kusner D.J., Barton J.A., Qin C., Wang X., Iyer S.S. Evolutionary conservation ofphysical and functional interactions between phospholipase D and actin // Archives Biochemistry Biophysics. 2003. - V. 412. - P. 231 - 241.

299. Blanchoin L., Pollard T.D. Interaction of Actin Monomers with Acanthamoeba

300. Actophorin (ADF/Cofilin) and Profilin // J. Biological Chemistry. 1998. - V. 273. -P. 25106-25111.

301. Gutsche- Perelroizen I., Lepault J., Ott A., Carlier M.-F. Filament Assembly from

302. Profilin-Actin // J. Biological Chemistry. 1999. - V. 274. - P. 6234 - 6243.

303. Baluska F., Salaj J., Mathur J., Braun M., Jasper F., Samaj J., Chua N.-H., Barlow P.W.,

304. Volkman D. Root Hair Formation: F-Actin-Dependent Tip Growth Is Initiated by Local Assembly of Profilin-Supported F-Actin Meshworks Accumulated within Expansin-Enriched Bulges // Developmental Biology. 2000. - V. 227. - P. 618 - 632.

305. Galkin V.E., VanLoock M.S., Orlova A., Egelman E.H. A New Internal Mode in F-Actin Helps Explain the Remarkable Evolutionary Conservation of Actin's Sequence and Structure // Current Biology. 2002. - V. 12. - P. 570 - 575.

306. Lopez I., Anthony R.G., Maeiver S.K., Jiang C.-J., Khan S., Weeds A.G., Hussey P.J. Pollen specific expression of maize genes encoding actin depolymerizing factor-like proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93. - P. 7415 - 7420.

307. Albanesi J.P., Fujisaki H., Plammer III J.A., Korn E.D., Jones R., Sheetz M.P.

308. Monomeric Acantbamoeba Myosin I Support Movement in vitro II J. Biol. Chem. -1985. V. 260. - P. 8649 - 8652.

309. Zot H.G., Doberstein S.K., Pollard T.D. Myosin-I Moves Actin Filaments on a

310. Phospholipid Substrate: Implications for Membrane Targeting // J. Cell Biol. 1992. -V. 116.-P. 367-376.

311. Zot H.G., Pollard T.D. Motility of Myosin I on Planar Lipid Surfaces // Method. Cell

312. Biol. 1993. - V. 39. - P. 51 - 63.

313. Enz R. The actin-binding protein Filamin-A interacts with the metabotrophic glutamatereceptor type7//FEBS Letters. -2002. V. 514. -P. 184 - 188.

314. Kim H.J., Triplett B.A. Characterization of GhRacl GTPase expressed in developingcotton (Gossypium hirsutum L.) fibers // Bioehim. Biophys. Acta. — 2004. — V. 3. — P. 214-221.

315. Goosney D.L., de Grado M., Finlay B.B. Putting E. coli on a pedestal: a unique system to study signal transduction and the actin cytoskeleton // Trends Cell Biology. 1999. — V. 9.-P. 11-14.

316. Кулаева O.H. Хлоропласт и его полуавтономность в клетке // Соросовский

317. Образовательный Журнал. 1997. - Т. 7. - С. 2 - 9.

318. Лотова Л.И. Морфология и анатомия высших растений. М.: Эдиториал УРСС,2000. 528 с.

319. Креславский В.Д., Карпентиер Р., Климов В.В., Мурата Н., Аллахвердиев С.И.

320. Молекулярные механизмы устойчивости фотосинтетического аппарата к стрессу // Биологические мембраны. 2007. - Т. 24. - С. 195-217.

321. Miyagishima S., Nishida К., Kuroiwa Т. An evolutionary puzzle: chloroplast andmitochondrial division rings // Plant Science. 2003. - V. 8. - P. 1360 - 1385.

322. Алёхина H. Д., Балнокин IO. В., Гавриленко В. Ф., Жигалова Т. В., Мейчик Н. Р.,

323. Носов А. М., Полесская О. Г., Харитонашвили Е. В., Чуб В.В. Физиология растений. -М.: Академия, 2005. — 634 с.

324. Kandasamy М.К., Meagher R.B. Actin-organelle interaction: Association withchloroplast in Arabidopsis leaf mesophyll cells // Cell Motility Cytoskel. — 1999. — V. 44. P. 110-118.

325. Baluska F., Jasik J., Edelmann H.G., Salajova Т., Volkmann D. Latrunculin B-Induccd

326. Plant Dwarfism: Plant Cell Elongation Is F-Aetin-Dependent // Developmental Biology. -2001. -V. 231.-P. 113-124.

327. Sakurai N., Domoto K., Takagi S. Blue-light-induced reorganization of the actincytoskeleton and the avoidance response of chloroplasts in epidermal cells of Vallisneria gigantea II Planta. 2005. - V. 221. - P. 66 - 74.

328. Sakai Т., Kagawa Т., Kasahara M„ Swartz Т.Е., Christie J.M., Briggs W.R., Wada M.,

329. Okada K. Arabidopsis nphl and npll: Blue light rcceptors that mediate both phototropism and chloroplast relocation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - V. 98. . - P.6969 - 6974.

330. Oikawa K., Kasahara M., Kiyosue Т., Kagawa Т., Suetsugu N., Takahashi F., Kanegae

331. Т., Niwa Y., Kadota A., Wada M. Chloroplast Unusual Positioningl Is Essential for Proper Chloroplast Positioning // Plant Cell. 2003. - V. 15. - P. 2805 -2815.

332. Fischer K., Schopfer P. Physical strain-mediated microtubule reorientation in theepidermis of gravitropically or phototropically stimulated maize coleoptiles // Plant J. — 1998.-V. 15.-P. 119-123.

333. Васильев Ю.М. Клетка, как архитектурное чудо // Соросовский образовательныйжурнал. 1996. - Т. 2. - С. 36 - 43.

334. Харченко М.В., Корнилова Е.С., Меликова М.С. Изменения организации системымикротрубочек в ходе эндоцигоза рецептора ЭФР // Цитология. 2007. - Т. 49. -С. 243 - 248.

335. Wen К.-К., Yao X., Rubenstein Р.А. GTP-Yeast Actin // J. Biological Chemistry.2002. V. 277. - P. 41101 - 41109.

336. Yu M., Yuan M., Ren H. Visualization of actin cytoskeletal dynamics during cell cyclein tobacco( Nicotiana tabacum L.cv Bright Yellow) cells // Biology of the Cell. 2006. -V. 98.-P. 295-306.

337. Клячко H.JI. Актин растений: множественные уровни регуляции // Физиологиярастений. 2006. - Т. 53. - С. 790 - 798.

338. Хайтлина С.Ю. Методы выделения и очистки актина. Оценка чистоты инативности // Биофизические и биохимические методы исследования белков. — 1978. С. 122- 139.

339. Vandekerckhove J., Weber К. Actin Amino Acid Sequences. Comparison of Actin from

340. Calf Thymus, Bovine Brain, and S V- 40 Transformed 3T3 Cells with Rabbit Skeletal Muscle Actin // J. Mol. Biol. 1978. - V. 126. - P. 783 - 788.

341. Pollard T.D., Cooper J.A. Actin and Actin-Binding Proteins. A Critical Evaluation of

342. Mechanism and Function // Annu. Rev. Biochem. 1986. - V. 55. - P. 987 - 996.

343. Поглазов Б.Ф, Левицкий Д.И. Миозин и биологическая подвижность. — М.: Наука,1982,- 160. с.

344. Можаева Л.В., Боева Т.Г. Изучение аденозинтрифосфатазной активности исократительных свойств клеток корня // Изв. ТСХА. 1970. - Т. 14. - С. 152 - 167.

345. Пантелеева Н.С. Миозин (180 обмен и фосфорилировапие) Л.: ЛГУ, 1975. - 83 с.1.Я

346. Пантелеева Н.С. Применение изотопа О для изучения механизма расщепления АТФ миозином // Биофизические и биохимические методы исследования мышечных белков. 1978. - С. 198-210.

347. Попов Е.М. Современные достижения рентгеноструктурных исследований белков // Проблема белка. М.: Наука, 1996. - С. 54 - 137.

348. Orlova A., Prochniewicz Е., Egelman Е.Н. Structural dynamics of F-actin: II.

349. Cooperativity in structural transitions // J. Molecular Biology. 1995. - V. 245. - P. 598-607.

350. Egelman E.H., Francis N., DeRosier D.J. F-actin is a helix with a random variable twist

351. Nature. 1982. - V. 298. - P. 131 - 135.

352. Egelman E.H. The Structure of F-Actin // J. Muscle Res. Cell Motil. 1985. - V. 6. - P.129.151.

353. Egelman E.H., Orlova A., McGough A. Only one F-actin model // Nature. Struct.

354. Biology. 1997. - V. 4. - P. 683 - 684.

355. Lauzon A.M., Trybus K.M., Warshaw D.M. Molecular mechanics of two smoothmuscle heavy meromyosin constructs that differ by an insert in the motor domain // Acta Physiol. Scand. 1998. - V. 164.-P. 357-361.

356. Kiehart D.P. Molecular Genetic Dissection of Myosin Heavy Chain Function // Cell.1990.-V. 60.-P. 347-350.

357. Orlova A., Egelman E.H. Structural Basis for the Destabilization of F-Actin by Phosphate Release Following ATP Hydrolysis // J. Mol. Biol. 1992. - V. 227. - P. 1043- 1053.

358. Kucik D.F., Elson E.L., Wang Y.L. Actin tracks // Nature. 1991. - V. 354. - P. 362363.

359. Carlier M.F. Actin: Protein Structure and Filament Dynamics // J. Biol. Chem. — 1991.1. V. 266.-P. 1-4.

360. Gundersen G.G., Aebi U., Chisholm R., Allen P.G., Borisy G.B. Actin: Dissecting thestructural basis of its oligomerization, polymerization, and polymorphism // Biol. Bull. 1998.-V. 194.-P. 340-341.

361. Туркина M.B., Куликова А.Л., Соколов О.И., Богатырев В.А. Актино- имиозиноподобиые белки в тканях высших растении. Тезисы докл. научн. конф. "Молекулярные механизмы и энергетика подвижности". 1985. - С. 66.

362. Туркина М.В., Куликова А.Л., Соколов О.И., Богатырев, В.А. Белки типамышечных актина и миозина в тканях высших растений. Тезисы докл. V Всес. биохим. съезда. М.: Наука, 1986. - С. 295 - 296.

363. Рихтер Т.Я., Грингауз O.K., Соколов О.И. Выявление и характер мечения F-актинамаркёром фаллоидин коллоидное золото // Цитология. 1990. - Т. 32. - С. 11141119.

364. Turkina M.V., Kulikova A.L., КорреГ L.A., Akatova L.Z., Butenko R.G. Actin andthermostable actin-binding proteins in wheat cell culture // Fiziologiya Rastenii. 1995. -V. 42.-P. 348-355.

365. Туркина M.B., Куликова А.Л., Коппель Л.А., Акатова Л.З., Бутенко Р.Г. Актин и термостабильные актин-связываюшие белки в культуре клеток пшеницы // Физиология растений. 1995. - Т. 42. - С. 348 - 355.

366. Грингауз O.K., Негрецкий В.А., Соколов О.И. Идентификация F-актина растенийфаллоидин-коллоидпым золотом. 2. Клетки и субклеточные препараты II Физиология растений. 1998. - Т. 45. - С. 235 - 240.

367. Aspenstrom P. A Cdc42 target protein with homology to the non-kinase domain of FERhas a potential role in regulating the actin cytoskeleton // Curr. Biol. 1997. - V. 7. 1. P. 479-487.

368. Kost В., Spielhofer P., Chua N.H. A GFP-mouse talin fusion protein labels plant aetinfilaments in vivo and visualizes the aetin cytoskeleton in growing pollen tubes // Plant J. 1998. - V. 16.-P. 393 -401.

369. Billinton N., Knight A.W. Seeing the Wood through the Trees: A Review of Techniquesfor Distinguishing Green Fluorescent Protein from Endogenous Autofluorescence // Analytical Biochemistiy. 2001. - V. 291. - P. 175 - 197.

370. Nakayama H., Yamaga T. Visualization of F-actin filaments by a fluorescently labelednucleotide analogue // Biophys. Chem. 1998. - V. 75. - P. 1-6.

371. Nakayama H., Yamagada Т., Kunioka Y. Fine Profile of Actomyosin Motility

372. Fluctuation Revealed by Using 40-nm Probe Beads // Biocem. Biophys. Res. Com. -1998. V. 246.-P. 261-266.

373. Левицкий Д.И., Поглазов Б.Ф. Изучение роли двухвалентных и одновалентныхкатионов в работе миозиновой АТФазы // Биохимия. 1980. - Т. 46. - С. 2233 -2242.

374. Vasill I.K. Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. N.Y.: Acad. Press.1984. 825 p.

375. Михайлов В.И. Морфодинамика субмикроскопических структур изолированныхпротопластов клеток основной паренхимы при воздействии физических и химических факторов. Кишинёв: Молдова, 1990. - 20 с.

376. Jasik J., Smolenskaya I.N., Zorinyants S.E., Nosov A.V., Baulina O.I., Kristin J.

377. Cytological study on wheat (Triticum timopheevi Zhuk.) protoplasts // Biologia Plantarum. 1992. - V. 34. - P. 193 - 201.

378. Caneko Y. Preparation of Plant Protoplasts for SEM. Observation by t-Butanol Freeze-Drying Method // J. Electron. Microsc. 1990. - V. 39. - P. 426 - 428.

379. Миронов А.А, Комиссарчик Я.Ю, Миронов В.А. Методы электронноймикроскопии в биологии и медицине. С.-Петербург: Наука, 1994. - 400 с.

380. Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the

381. Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. - V. 193. - P. 265 - 275.

382. Brada D., Roth J. "Golden Blot" Detection of Polyclonal and Monoclonal Antibodies

383. Bound to Antigenes on Nitrocellulose by Protein A-gold Complexes // Analytical Biochemistiy. 1984. - V. 142.-P. 79-83.

384. Поглазов Б.Ф. Регуляторные функции актина в клетке // Известия АН СССР,

385. Сер.биол. 1983. - Т. 5. - С. 667 - 677.

386. Ohsuka К., Inoue A. Identification of Myosin in a Flowering Plant, Egeria densa II J.

387. Biochem. 1979. - V. 85. - P. 375 - 378.

388. Соколов О.И. Возможная роль растительного миозина во флоэмном транспорте // Тез. II Всес. Съезд о-ва Физиологов растений. 1992. - С. 196.

389. Ma Y.Z., Yen L.F. Actin and Myosin in Pea Tendrils // Plant Physiol. 1989. - V. 89.1. P. 586-589.

390. Szent-Gyorgy A.G. Meromyosins, the subunits of myosin // Arch. Biochem. Biophys.1953.-V. 42.-P. 305 -320.

391. Squire J.M. General model for Myosin filament structure. III. Molecular packingarrangements in myosin filaments // J. Mol. Biol. 1973. - V. 77. - P. 291 - 323.

392. Squire J.M. General model for the structure of all myosin- Containing filaments // Nature. 1971. - V. 233. - P. 457 - 462.

393. Palevitz B.A., Hepler P.K. Identification of Actin in situ at the Ectoplasm-endoplasm1.terface of Nitella II J. Cell Biology. 1975. - V. 65. - P. 29 - 38.

394. Klein K., Wagner G., Blatt M.R. Heavy-meromyosin decoration of microfilaments from Mougeotia protoplasts // Planta. 1980. - V. 150. - P. 354 - 356.

395. Ishikawa M., Bischoff R., Holtzer H. Formation of arrowhead completes with heavymeromyosin in a variety of cell types // J. Cell Biology. 1969. - V. 43. - P. 312 - 328.

396. Spudich J.A., Kron S.J., Sheetz M.P. Movement of myosin-Coated beads on orientedfilaments reconstituted from purified actin // Nature. 1985. - V. 315. - P. 584 - 586.

397. Левицкий Д.И. Легкие цепи миозина и их роль в регуляции мышечногосокращения // Успехи биол. химии. 1986. - Т. 27. - С. 74 - 102.

398. Pollard T.D., Stafford W.F., Porter М.Е. Charaterization of a Second Myosin from Acanthamoeba castellainii II J. Biol. Cem. 1978. - V. 253. - P. 4798 - 4808.

399. Engelhardt V.A., Ljubimova M.N. Myosin and adenosinetriphosphatase // Nature.1939.-V. 144.-P. 668-669.

400. Энгельгардт В.А., Любимова M.H. К механохимии мышцы // Биохимия. 1942.1. Т. 7.-С. 205-231.

401. Friess Е.Т. The effect of a chelating agent on myosin ATPase // Arch. Biochem.

402. Biophys. 1954,-V. 51.-P. 17-23.

403. Левицкий Д.И. Структурные особенности и функциональная роль молекулмиозина // Структура и функции белков сократительных систем. Л.: Наука, 1987.-31 с.

404. Levitsky D.I., Shnyrov V.L., Khvorov N.V., Bukatina A.E., Vedenkina N.S.,

405. Permyakov E.A., Nikolaeva O.P., Poglazov B.F. Effects of nucleotide binding on thermal transitions and domain structure of myosin subfragment 1 // Eur. J. Biochem. — 1992. V. 209. - P. 829 - 835.

406. Sata M., Matsuura M., Ikebe M. Characterization of the Motor and Enzymatic

407. Properties of Smooth-Muscle Long Si and Short HMM Role of the 2- Headed Structure on the Activity and Regulation of the Myosin Motor // Biochemistry. - 1996. -V.35.-P. 11113-11118.

408. Kelley C.A., Sellers J.R., Gard D.L., Bui D., Adelstein R.S., Baines I.C. Xenopus

409. Nonmuscle Myosin Heavy-Chain Isoforms Have Different Subcellular Localizations and Enzymatic- Activities // J. Cell Biology. 1996. - V. 134. - P. 675 - 687.

410. Harris W.J., Cunningham C. Antibody therapeutics. Berlin: Springer. - 1995. - 150 p.

411. Beatty J.D., Beatty B.G., Vlahos W.G. // J. Immunol. Meth. 1987. - V. 100. - P. 173179.

412. Стародуб Н.Ф., Артюх В.П., Назаренко В.И., Коломиец Л.И. В биохимическихисследованиях белковый иммуноблот и иммунодот // Украинский биохимический журнал. 1987. - Т. 59. - С. 108 - 120.

413. Pollak J.M, Varndell I.M. Immunolabeling for Electron Microscopy. — Amsterdam. — 1985.-370 p.

414. Дыкман Л.А., Богатырев B.A., Зайцева И.С., Соколова М.К., Иванов В.В., Соколов О.И. Использование конъюгатов коллоидного золота для идентификации актинов различного происхождения // Биофизика. 2002. - Т. 47. - Вып. 4. - С. 632 - 640.