Изменения структуры и свойств тропомиозина при стабилизации и дестабилизации различных участков его молекулы

Невзоров, Илья Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изменения структуры и свойств тропомиозина при стабилизации и дестабилизации различных участков его молекулы
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изменения структуры и свойств тропомиозина при стабилизации и дестабилизации различных участков его молекулы"

На правах рукописи

НЕВЗОРОВ Илья Анатольевич

Изменения структуры и свойств тропомиозина при стабилизации и дестабилизации различных участков

его молекулы

03.01.04 - биохимия

4848219

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 К ЮН 2011

Москва 2011

4848219

Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Учреждения Российской Академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель:

Защита состоится « 16» июня 2011 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Учреждении Российской Академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 1.

доктор биологических наук, профессор Д.И. Левицкий

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук С.Ю. Хайтлина

кандидат биологических наук А.В. Воротников

Ведущая организация:

Учреждение Российской Академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан « » мая 2011 года

Ученый секретарь диссертационного кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Тропомиознн (ТМ) является одним из ключевых компонентов регуляторного аппарата тонких филаментов во всех типах мышц. Вытянутые молекулы ТМ связываются с семью мономерами актина и тропониновым комплексом в составе тонкого филамента. Современные представления о механизме регуляции сокращения скелетной и сердечной мышцы сформулированы в виде теории «стерического блокирования», согласно которой ТМ способен перемещаться на поверхности актинового филамента, открывая или закрывая участки взаимодействия актина с головками молекул миозина. Положение ТМ на актине зависит от нескольких факторов, ключевыми из которых являются концентрация ионов кальция и наличие головок миозина. Данные кинетических и структурных исследований показывают, что для ТМ характерны три состояния, которые отражают его различные положения на поверхности актинового филамента. Эти состояния принято обозначать как «blocked» (связывание миозина с актином невозможно), «closed» (разрешено только «слабое» связывание) и «ореп» (осуществляется изомеризация актомиозинового комплекса и переход «слабого» связывания в «сильное») [McKillop & Geeves, 1993; Vibert et al., 1997].

Молекула ТМ представляет собой димер а-спиралей, образующих левозакрученную суперспираль (coied-coil). Это объясняется наличием в первичной структуре ТМ непрерывающихся семичленных повторов (гептад). Соответственно, аминокислотную последовательность ТМ можно изобразить как (ab cdef g)„, где положения а и d обычно заняты гидрофобными остатками, а в положениях ей g находятся остатки с заряженным радикалом. В целом, гидрофобные взаимодействия образуются в месте контакта спиралей и стабилизируют coiled-coil, тогда как электростатические взаимодействия между остатками ей g обусловливают специфичность образования двойной спирали и ее стабильность. Остатки с, d и / обычно гидрофильны и определяют взаимодействие ТМ с другими белками. Таким образом, стабильность молекулы ТМ зависит от природы остатков в положениях a, d, е и g, а также от спиралеобразующей способности всех остальных аминокислотных остатков, включая отмеченные выше.

Для ТМ характерно наличие 4 генов, которые в результате альтернативного сплайсинга дают суммарно более 30 изоформ. В скелетных мышцах человека ТМ присутствует главным образом в виде гомодимеров а- и |3-изоформ, тогда как для гладкой мышцы характерно наличие а|3-гетеродимеров.

вызываемых ими структурных изменений ТМ интересно с точки зрения как фундаментальной науки, так и биомедицины. Известно, например, что мутация Arg91Gly в Р-изоформе ТМ ассоциирована с дистальным артрогриппозом - тяжелым наследственным заболеванием мышц. Кроме того, было установлено, что функциональными последствиями данной мутации является значительное снижение сродства молекул ТМ к актину и слишком высокая сократительная активность мышц. Тем не менее, оставалось непонятным, какие именно изменения в структуре мутантного ТМ приводят к таким эффектам.

Другим подходом в изучении структуры и функций ТМ является направленное изменение первичной структуры его молекулы (например, путем введения точечных мутаций) с последующим анализом свойств таких мутантных белков. В последнее время внимание исследователей стала привлекать центральная часть молекулы ТМ, которая по данным ограниченного протеолиза трипсином является наименее стабильным участком молекулы. Недавно S. Lehrer с соавторами показали, что замена остатка Aspl37 на Leu полностью предотвращает расщепление трипсином центральной части молекулы ТМ [Sumida et al., 2008]. Поскольку Aspl37 является заряженным остатком в положении d (т.е. в гидрофобном коре молекулы), авторы объясняли дестабилизацию центральной части ТМ наличием этого остатка. Тем не менее, заряженные остатки также присутствуют в положении d ив других участках молекулы, однако протеолиз там не происходит, несмотря на наличие множества потенциальных участков расщепления трипсином. Отметим, что при изучении дестабилизации центральной части ТМ от внимания исследователей ускользало наличие в ней консервативного остатка Gly 126, который, предположительно, сильно снижает стабильность двойной a-спирали ТМ. Таким образом, механизм дестабилизации центральной части молекулы ТМ оставался до конца непонятным. Поскольку данные трипсинолиза позволяли судить лишь о локальных изменениях в области участка расщепления, оставалось совершенно неясным, каковы в действительности размеры нестабильной центральной части молекулы ТМ. Кроме того, немалый интерес вызывает вопрос о функциональной значимости дестабилизации центрального участка молекулы.

Целью данной работы стало изучение структуры и свойств мутантных форм ТМ, несущих замены Arg9lGly (R91G), Glyl26Ala (G126A) и Glyl26Arg (G126R). В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:

1) С помощью сайт-направленного мутагенеза получить рекомбинантные белки: Р-изоформы ТМ гладких и скелетных мышц человека, несущие мутацию R91G, и а-изоформу ТМ скелетных мышц человека, несущую мутации G126A или G126R.

2) Методами ограниченного протеолиза трипсином, дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) и кругового дихроизма (КД) изучить влияние указанных мутаций на структуру и стабильность молекулы ТМ и различных ее участков.

3) Используя метод химического «сшивания», исследовать влияние мутации Г19Ю в Р-изоформе ТМ человека на ее способность к образованию ар-гетеродимеров с а-изоформой ТМ.

4) Изучить влияние мутаций в 126 А и 0126К в скелетномышечном а-ТМ человека на его сродство к Р-актину, а также на его регуляторные свойства в составе полностью реконструированных тонких филаментов.

Научная новизна. В работе впервые подробно исследован характер тепловой денатурации гладкомышечной и скелетномышечной изоформ Р-ТМ. С помощью метода ДСК установлено наличие в молекуле Р-ТМ двух калориметрических доменов (т.е. участков молекулы, которые денатурируют кооперативно и независимо друг от друта). Для идентификации этих доменов впервые было применено сочетание метода ДСК с измерениями температурных зависимостей флуоресценции эксимеров пирена. С помощью такого подхода установлено, что менее термостабильный домен представляет собой концевую часть молекулы, тогда как более термостабильный домен соответствует ее С-концевой части. Проведено подробное изучение эффекта мутации Я910 на структуру и термостабильность гладкомышечной и скелетной изоформ р-ТМ человека. Показано, что эта мутация вызывает драматическое снижение термостабилыюсти всего 1Ч-концевого домена молекулы ТМ.

Методом химического сшивания показано, что мутация Я9Ш в гладкомышечной изоформе Р-ТМ резко снижает ее способность образовывать ар-гетеродимеры с гладкомышечным а-ТМ. Предложен термодинамический механизм, описывающий снижение эффективности образования аР-гетеродимеров ТМ под действием мутации 1*910.

С помощью метода ДСК впервые показано, что для некоторых участков молекулы скелетномышечного а-ТМ характерно некооперативное плавление, что свидетельствует об их высокой конформационной подвижности. Впервые предложена и проверена идея об участии аминокислотного остатка 01у126 в дестабилизации центральной части молекулы а-ТМ. Использование мутантных форм а-ТМ, несущих замены 0126А и 0126К, впервые позволило объяснить необычный характер протеолиза молекулы ТМ трипсином и установить, что некооперативное плавление имеет место именно в центральной части молекулы ТМ. Более того, впервые удалось определить приблизительные размеры этой нестабильной части молекулы ТМ (60-70 аминокислотных остатков, что соответствует четверти длины молекулы ТМ). На основании полученных данных высказана гипотеза о

структурной организации молекулы ТМ, согласно которой молекула состоит из двух доменов разной стабильности (И-концевого и С-концевого) и нестабильного центрального участка между ними.

Продемонстрировано, что конформационная подвижность центральной части ТМ не является, вопреки распространенному мнению, необходимым фактором для связывания ТМ с актиновым филаментом. Кроме того, показано, что стабилизация центральной части молекулы ТМ может оказывать заметное влияние на регуляторные свойства ТМ в полностью реконструированных тонких филаментах, что проявляется в увеличении АТРазной активности актомиозина.

Научно-практическая ценность. Полученные данные значительно расширяют и углубляют представления об особенностях структурной организации молекулы тропомиозина, а также представляют несомненную важность для понимания тех молекулярных механизмов, которые лежат в основе различных тяжелых заболеваний мышц, ассоциированных с миопатическими мутациями в молекуле тропомиозина.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (г. Пущино-на-Оке Московской области, 2008; 2010) и на 37-м Европейском мышечном конгрессе (г. Оксфорд, Великобритания, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ (3 статьи в рецензируемых журналах и 4 тезисов).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (5 глав), заключения, выводов и списка цитируемой литературы (145 источников). Диссертация изложена на 135 страницах, содержит 36 рисунков и 4 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы.

В обзоре литературы подробно рассмотрены структура, свойства и главные функции ТМ. Особое внимание уделено рассмотрению характерных для ТМ отклонений от канонической структуры двойной спирали.

Материалы и методы

Рекомбинантньш TM (ß-TM дикого типа и с мутацией R91G; а-ТМ дикого типа и с мутациями G126A и G126R) экспрессировали в штамме E.coli BL21(DE3)pLysS в соответствии со стандартной методикой [Studier et al., 1990]. Миозин получали из скелетных мышц кролика. Субфрагмент 1 миозина (S1) получали протеолизом миозина а-химотрипсином при низкой ионной силе [Weeds & Taylor, 1975]. Актин выделяли из ацетонового порошка скелетных мышц кролика [Spudich & Watt, 1971]. За час до использования мономерный G-актин полимеризовали, добавляя MgCl2 до конечной концентрации 5 мМ, и использовали в F-форме. Для калориметрических экспериментов F-актин был стабилизирован добавлением 1,5-кратного молярного избытка фаллоидина.

Калориметрические исследования проводили на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4М (Институт биологического приборостроения РАН, г. Пущино) с капиллярными платиновыми ячейками. Образцы, содержащие ТМ (30 мкМ), 30 мМ Hepes (pH 7,3), 100 мМ KCl и 1 мМ MgCl2, прогревали с постоянной скоростью 1 К/мин от 10°С до 70°С. Для проверки обратимости тепловой денатурации исследуемых белков, после первого сканирования и последующего охлаждения образцов проводили их повторное сканирование. Тепловая денатурация ТМ была обратима, тогда как актин денатурировал необратимо. Для обработки и анализа кривых теплопоглошения белков использовали пакеты программного обеспечения „Origin 1.16" и „Origin 7.0" фирмы „MicroCal" (США). Процедура деконволюции проводилась способом, описанным в статье [Freire & Biltonen, 1978], с использованием программы «Origin 1.16» (MicroCal).

Температурные зависимости средней остаточной эллиптичности при 222 nm (6222) регистрировали на дихрографе Chirascan Circular Dichroism Spectrometer (Applied Photophysics) в кварцевой кювете с длиной оптического пути 2 мм в интервале от 5°С до 60°С при скорости нагрева 1 К/мин, т. е. при той же скорости нагрева, что и в калориметрических экспериментах. Различия заключались лишь в том, что в экспериментах, проводимых методом КД, концентрация ТМ была снижена до 2 мкМ, а буфер Hepes был заменен на 10 мМ калий-фосфатный буфер (pH 7,3), содержащий 100 мМ NaCl и 1 мМ MgCl2.

Приготовление пиренил-меченого ТМ осуществляли по методике Ишии и Лерера [Ishii & Lehrer, 1990]. Во всех случаях выход меченого белка составлял не менее 90%. Температурные зависимости флуоресценции пиреновых эксимеров в препаратах ТМ регистрировали при длине волны 485 нм и скорости нагрева 1 К/мин на флуоресцентном спектрофотометре Сагу Eclipse (Varían, Australia).

Для проведения ограниченного протеолиза использовали трипсин, обработанный ингибитором химотрипсина ТРСК. Реакцию проводили в 30 мМ буфере Hepes-NaOH, рН 7,3, содержащем 100 мМ NaCl и 1 мМ MgCl2. Весовое соотношение [ТМ]:[трипсин] составляло 250:1.

Определение актин-активируемой АТРазы S1 проводили в 10 мМ Hepes-NaOH, рН 7,3, 50 мМ NaCl, 0,1 мМ ДТТ и 0,1 мМ PMSF по выделению неорганического фосфата, который измерялся стандартным колориметрическим способом.

Для определения сродства ТМ к актину проводили аналитическое соосаждение при 20°С. Для этого пробы, содержащие 10 цМ F-актин и 0-3 цМ ТМ в стандартном буфере, подвергали центрифугированию при 100000 х g в течение 30 мин на центрифуге Beckman TL100A (Beckman, США). Супернатанты и осадки анализировали с помощью SDS-электрофореза в 12% ПААГ.

Температурные зависимости диссоциации комплекса TM-F-актин регистрировали по изменению светорассеяния при угле в 90° [Wegner, 1979; Kremneva et al., 2004]. Эксперименты проводили на флуоресцентном спектрофотометре Сагу Eclipse (Varían) при длине волны 350 нм в тех же условиях и при той же скорости нагрева, что и в калориметрических экспериментах.

Основные результаты и их обсуждение

I. Исследование структуры и свойств р-ТМ, несущего мутацию R91G

1) Термостабилыюсть р-ТМ и влияние па нее мутации R91G

Прежде всего мы исследовали тепловую денатурацию р-ТМ дикого типа и его мутантной формы R91G с помощью методов ДСК и КД. Сразу отметим низкую термостабильность р-ТМ (температура максимума калориметрического пика для белка дикого типа составляет 40,5°С) (рис. 1а). Кроме того, следует отметить, что основному пику тепловой денатурации Р-ТМ предшествует некоторое низкокооперативное плавление, которое начинается при весьма низких температурах, с самого начата записи кривой ДСК (рис. 1а). Наличие такой некооперативной денатурации подтверждается и при исследованиях температурных зависимостей разворачивания a-спиралей р-ТМ, регистрируемых методом КД (рис. 16): хорошо видно, что денатурация начинается при очень низких температурах, с самого начала записи (~5°С). Природа этого процесса на сегодняшний день представляется дискуссионной. Исходя из литературных данных [Dragan and Privalov, 2002], подобная некооперативная денатурации при низких температурах характерна для многих белков, имеющих структуру двойной а-спирали.

На представленных кривых ДСК хорошо видно, что присутствие мутации Я9Ю оказывает сильное влияние на термостабилыюсть Р-ТМ. Данный эффект выражается в появлении на термограмме нового пика с максимумом при 27,8°С (рис. 1а). Энтальпия этого нового перехода (площадь под данным пиком) составляет почти половину от общей калориметрической энтальпии тепловой денатурации р-ТМ, что свидетельствует о дестабилизации существенного фрагмента молекулы вследствие точечной замены остатка А^91 на остаток глицина. Отметим, что присутствие мутации сказывается и на характере тепловой денатурации Р-ТМ, измеренной методом КД (рис. 16). Кривая, отражающая утрату а-спиральной структуры при нагревании, в случае мутантной формы Р-ТМ имеет двухфазный характер, что также отражает дестабилизацию некоторой части молекулы.

- 10

0 100

< « 60

8 а

8 с

3 о

40 [■

и в 20 0 90

ч и

I 45 я

Ё. 30

1 15

-1 л .....2 / \ (а)

г . ' \< •У / V / ^ Ь ^ / / / V !/ \ ; \ л \

тЛ (б)

(в)

зк?

Рис. 1. Температурные зависимости тепловой денатурации рскомбинантного Р-ТМ дикого типа (кривые I) и с мутацией Я9Ю (кривые 2), измеренной методами ДСК (а) и КД (б), а также по изменениям эксимсрной флуоресценции пиреновой метки, присоединенной к остатку Сув-36 в молекуле Р-ТМ (в). Концентрация белка составляла 2 мг/мл (30 мкМ) (а), 0,13 мг/мл (2 мкМ) (б) или 0,066 мг/мл (1мкМ) (в). Скорость нагрева во всех случаях составляла 1 К/мин.

10 20 30 40 50 60 Температура (°С)

Весьма интересно было установить границы распространения дестабилизирующего эффекта мутации Для этого нами был применен подход, основанный на изучении

температурных зависимостей флуоресценции эксимеров пирена. Одиночные цепи Р-ТМ

(как белка дикого типа, так и его мутантной формы) были помечены пиренил-йодацетамидом по единственному в молекуле остатку цистеина Cys-36. Суть данного подхода заключается в том, что в составе полностью свернутой молекулы тропомиозина, состоящей из двух цепей, плоские ароматические остатки пирена образуют эксимер, что сопровождается появлением на спектре флуоресценции пика с максимумом при 485 нм. Тепловая денатурация тропомиозина сопровождается диссоциацией его цепей, что приводит к закономерному тушению флуоресценции эксимеров вследствие разрушения их структуры. На рис. 1в представлены температурные зависимости флуоресценции эксимеров пирена, ковалентно присоединенного к остатку Cys36 в р-ТМ дикого типа и в (3-ТМ с мутацией R91G. Хорошо видно, что в случае мутантной формы (]-ТМ кривая убыли эксимерной флуоресценции смещена на ~10°С в низкотемпературную область. Это свидетельствует о том, что дестабилизирующий эффект мутации R91G отчетливо регистрируется в области остатка Cys36, к которому присоединена пиреновая метка, что подразумевает его распространение на достаточно большое расстояние вдоль линейной молекулы тропомиозина. Данный факт весьма примечателен, т. к. он свидетельствует о наличии высокой внутренней кооперативности, характерной по крайней мере для некоторых участков молекулы Р-ТМ. Важно при этом отметить очень хорошую корреляцию между температурой денатурации нового термолабильного теплового перехода, появляющегося на кривой ДСК в препарате Р-ТМ с мутацией R91G (27,8°С) (рис. 1а) и температурой полуперехода на кривой температурной зависимости эксимерной флуоресценции пиреновой метки, присоединенной к остатку Cys-36 в этом препарате (27,5°С) (рис. 1в). Сопоставляя эти данные, можно заключить, что точечная мутация R91G вызывает значительные структурные изменения в молекуле Р-ТМ, резко снижая термостабильность всей N-концевой половины молекулы.

Следует отметить, что в описанных выше экспериментах мы использовали Р-ТМ, характерный для гладких мышц и некоторых немышечных клеток. Сходные, хотя и не столь выразительные результаты (т. е. значительное снижение термостабильности N-концевой части молекулы Р-ТМ, вызываемое мутацией R91G) были получены и в экспериментах, проведенных с р-ТМ скелетных мышц (данные не представлены). Исследования тепловой денатурации скелетного Р-ТМ были, однако, значительно осложнены по целому ряду причин. Несмотря на то, что первичные структуры гладкомышечного и скелетномышечного Р-ТМ полностью идентичны вплоть до 188-го остатка (полипептидные цепи обоих белков состоят из 284 аминокислотных остатков), они сильно различаются в С-концевой области [Perry, 2001; Gunning et al„ 2005]. Вследствие этого в скелетномышечном Р-ТМ существенно снижается термостабильность его С-концевой части, что уже не позволяет разделять на кривой ДСК тепловые переходы, соответствующие денатурации N- и С-концевых частей Р-ТМ с мутацией R91G, столь же

отчетливо, как это удалось сделать в случае гладкомышечного Р-ТМ (рис. 1а). Другая сложность, с которой мы столкнулись в экспериментах со скелетномышечным Р-ТМ, заключалась в том, что некооперативная тепловая денатурация при низких температурах проявлялась в этом случае еще в большей степени, чем в случае гладкомышечного Р-ТМ. И, наконец, в каждой цепи скелетномышечного р-ТМ содержится не один, а два остатка цистеина (Сув-Зб и Суз-190), что в значительной степени препятствует идентификации тепловых переходов на кривой ДСК путем измерения температурных зависимостей эксимерной флуоресценции пиренил-меченого р-ТМ.

2) Влияние мутации 119Ю в ¡¡- ТМ на его взаимодействие с Р-актином

Помимо изучения свойств индивидуального Р-ТМ в растворе, нам представлялось целесообразным изучить свойства мутантного р-ТМ в комплексе с Б-актином, поскольку это позволило бы приблизиться к пониманию физиологического эффекта мутации Я9Ю. Для этого мы в первую очередь исследовали температурные зависимости диссоциации Р-ТМ с поверхности актинового филамента, измеряемые по изменениям светорассеяния (рис. 2А). Оказалось, что мутация 1*910 сильно снижает температуру диссоциации р-ТМ с поверхности актинового филамента (с 37°С для Р-ТМ дикого типа до 30°С для Р-ТМ с мутацией 1191 С) (рис. 2А).

- Р-5тТМ ЭТ (Т^ = 37,2°С)

- р-БтТМ И91С (Т|о> = 30,3"С)

20 25 30 35 40 45 50 Температура, С

- |5-5тТМ ЭТ

- Р-8тТМ Я910

0.5

и 0.0

1 2 3

Свободный ТМ, мкМ

Рис. 2. Влияние мутации К9Ю в Р-ТМ на его взаимодействие с Р-актином.

(А) - Нормализованные температурные зависимости светорассеяния комплексов гладкомышечного р-ТМ дикого типа (Р-БшТМ \УТ) и с мутацией 1*910 (Р-БиТМ 1*9Ю) с Я-актином. Концентрация ТМ - 10 мкМ, Р-актшш - 46 мкМ. Скорость нагрева 1 "С/мин. Т^ -температура полумаксималъной диссоциации комплексов ТМ с Р-актином (т.е. температура, при которой интенсивность светорассеяния снижается на 50%). (Б) - Аналитическое соосаждение р-5шТМ \\'Т и р-ЗшТМ 1*91 в с Р-актином.

Температура диссоциации ТМ с поверхности Р-актина зависит как от сродства ТМ к актину, так и от термостабильности самого ТМ. Для выяснения того, какой именно фактор ответственен за снижение температуры диссоциации, нами были поставлены эксперименты по аналитическому соосаждению р-ТМ \УТ и Р-ТМ К9Ю с Р-актином (рис. 2Б). Результаты данных экспериментов показали, что мутация Я9Ю вызывает драматическое снижение сродства р-ТМ к актину (рис. 2Б). Это значит, что данная мутация сильно снижает стабильность комплексов гладкомышечного р-ТМ с Р-актином.

3) Влияние мутации 11910 в ¡¡-ТМ па его способность к формированию а(1-гетеродимеров с а-ТМ.

Из литературных данных известно, что тропомиозин гладких мышц представлен практически полностью в виде гетеродимеров р- и а-цепей. Поскольку описанные выше результаты были получены исключительно на томодимерах р-ТМ, представляло несомненный интерес исследовать влияние мутации Я9Ю в Р-ТМ на стабильность и свойства сф-гетеродимеров ТМ. В связи с этим нами был разработан особый подход, который позволяет проверить эффективность образования ар-гетеродимеров ТМ. Суть подхода заключается в том, что в гомодимерах тропомиозина сульфгидрильные группы, принадлежащие разным цепям (по одной в каждой из них) расположены друг напротив друга и при обработке некоторыми реагентами (например, дитио-бис-нитробензойной кислотой, ДТНБ) могут образовывать дисульфидную связь. В полипептидной цепи а-ТМ единственная ЯН-группа цистеина расположена в 190-м положении, тогда как в Р-ТМ она находится в положении 36. Таким образом, при образовании ар-гетеродимеров из смеси аа- и рр-гомодимеров ТМ формирование дисульфидной связи между 5Н-группами соседних цепей становится невозможным, что легко проследить с помощью электрофореза в ПААГ, проводимого в отсутствие восстанавливающих агентов. Результаты, полученные с помощью данной методики, указывают на то, что образование сф-гетеродимеров из смеси аа- и РР-гомодимеров гладкомышечных ТМ происходит только при физиологической температуре (37°С), а при комнатной температуре (22°С) образования гетеродимеров не наблюдается. Наиболее интересным результатом явилось то, что наличие мутации 1191 в в Р-ТМ практически в два раза уменьшало эффективность образования гетеродимеров (рис. 3). К сожалению, проверить влияние мутации Я9Ш в скелетномышечной изоформе Р-ТМ на образование гетеродимеров с а-ТМ не удалось, поскольку выход гетеродимеров был слишком мал даже в случае белка дикого типа. Тем не менее, результаты, полученные на гладкомышечной изоформе Р-ТМ, представляют несомненный интерес и могут быть использованы для объяснения механизма развития дистального артрогриппоза.

р-тм \УТ

|5-ТМ К9Ш

а-а5тГпЦ и!

а-« 5тТт^ <

И)$тТт «< 8916

р91М

О' 5 10' 15 за

ЛЙУЙ& ¿¡¿Ш

чШ®;

а 5 ю'

30'

100

•—•—

аа-ЯтТМ + |3|3-8тТМ \УТ аа-БтТМ + РР-БтТМ

О 5 10 15 20 25 30 Время, мин

Рис. 3. Влияние мутации К9Ю в р-ТМ на формирование оф-гетеродимеров из смеси ОЮ- и (3(3-гомодимеров гладкомышечного ТМ. (А) - Электрофореграммы эквимолярных смесей СТО- и РР-гомодимеров гладкомышечного ТМ, полученные в процессе их инкубации при 37°С с последующей обработкой ДТНБ. Степень образования сшитых аа-гомодимеров обратно пропорциональна степени образования а(5-гетеродимеров из смеси аа- и [Зр-гомодимеров ТМ. (Б) - Кинетика превращения аа-гомодимеров гладкомышечного ТМ в сф-гетеродимеры при инкубации с РР-гомодимерами р-ЭгаТМ \\'Т и р-БтТМ ИЭЮ.

Завершая этот раздел, можно заключить, что мутация R91G оказывает очень сильное влияние на структуру и свойства {5-ТМ: эта мутация вызывает значительные структурные изменения в его молекуле, резко снижая термостабильность ее N-концевой части, в значительной степени подавляет способность Р-ТМ к образовыванию ар-гетеродимеров с а-изоформой ТМ и существенно снижает сродство Р-ТМ к F-актину.

II. Роль остатка Glyl26 в структуре и функциях ТМ

1) Консервативный остаток Glyl26 дестабилизирует центральную часть молекулы ТМ.

Описанные выше результаты изучения влияния мутации R91G на структуру Р-ТМ показывают, что данная мутация оказывает дестабилизирующие влияние на двойную a-спираль ТМ. Этот результат нельзя назвать неожиданным, поскольку известно, что глицин обладает наименьшей способностью к образованию a-спиралей по сравнению со всеми остальными аминокислотами. С этой точки зрения, однако, кажется удивительным тот факт, что в положении 126 в молекуле ТМ имеется очень консервативный остаток глицина, присутствующий практически во всех изоформах ТМ у многих видов животных. Примечательно то, что положение 126 сходно с положением 91 тем, что в структуре гептадного (семичленного) повтора в аминокислотной последовательности ТМ оба эти остатка, в положениях 91 и 126, занимают одну и ту же позицию g, соответствующую аминокислоте с заряженным радикалом. Таким образом, оба эти положения гомологичны и, более того, расположены достаточно близко, однако введение глицина в одно из них (91) вызывает драматическое снижение термостабильности существенной части молекулы, тогда как в друтом положении (126) остаток глицина присутствует постоянно во многих изоформах и у многих видов. Таким образом, возникает вопрос о роли высококонсервативного, но неканонического остатка Glyl26 в структуре и функционировании молекулы ТМ. Не исключено, например, что Glyl26 может дестабилизировать структуру молекулы ТМ в ее центральной части, и это, в свою очередь, важно для ее функционирования. Отметим, что в литературе имеются указания на то, что локальная нестабильность в центральной области молекулы ТМ может играть важную роль при взаимодействии троиомиозина с актином. Более того, ранее было показано, что замена другого консервативного неканонического остатка Aspl37 в центральной части молекулы ТМ на остаток лейцина полностью предотвращала протеолиз ТМ трипсином по остатку Argl33 [Sumida et al, 2008]. Основываясь на этих предпосылках, мы предположили, что замена дестабилизирующего остатка Glyl 26 на остатки, стабилизирующие двойную a-спираль ТМ, также должны стабилизировать молекулу ТМ в

ее центральной области и, возможно, сказываться на функциональных характеристиках ТМ. Для проверки этого предположения мы сконструировали два мутантных а-ТМ скелетных мышц, несущих замены Glyl2óAla (аланин стабилизирует a-спираль, но, подобно глицину, обладает незаряженным радикалом) или Glyl26Arg (аргинин в положении 126 не препятствует образованию a-спирали, а также должен образовывать солевой мостик с остатком Glul31 противоположной цепи).

Для исследования стабильности а-ТМ дикого типа (а-ТМ WT) и несущего мутации G126A и G126R, мы использовали методы ограниченного протеолиза трипсином, ДСК и КД. Данные трипеннолиза показали, что обе мутации полностью предотвращали расщепление а-ТМ трипсином по остатку Argl33 в центральной части молекулы (рис. 4). Эти данные, по сути, повторяют результат, полученный ранее на а-ТМ, несушем замену Aspl37Leu [Sumida et al., 2008]. Такое сходство результатов свидетельствует о том, что неканонические остатки Aspl37 и Glyl26 действуют согласованно и вызывают дестабилизацию центральной части молекулы а-ТМ.

ff I 5' 11/ ЗУ ^ ü' 2' 5' 1С ЫГ I Г 5' 1;Г W (fí

а-TmWT a-TmG126A а-Tm G126R

. 80 н

ra 60

§ 40 с

3 20-

a. о

~ 0-

\ -о

- • - a-Tm WT

—c^a-TmG126A

—*—a-TmG126R

Рис. 4. Расщепление трипсином а-ТМ дикого типа (а-ТМ \\Т) и с мутациями в126А и С126К. (А) - Злектрофореграммы геле». Указано время инкубации с трипсином.

(Б) - Кинетика исчезновения полосы нерасщеплекного ТМ на электрофореграммах.

10 20 » 40 50 Время переваривай™, мм

Отметим, что полученный нами результат позволяет объяснить некоторые ранее наблюдавшиеся феномены. Известно, например, что в молекуле а-ТМ имеется более 30 потенциальных участков расщепления трипсином, равномерно распределенных вдоль всей

молекулы, но расщепление наблюдается только в одном месте - по остатку Argl33. Ранее этот феномен объясняли тем, что остаток Aspl37 находится в положении d и дестабилизирует гидрофобный кор молекулы [Sumida et al., 2008]. Тем не менее, наличие заряженных остатков в гидрофобном коре а-ТМ не ограничивается положением 137, однако в других участках расщепление трипсином не наблюдается. Наши данные указывают на то, что остаток Gly 126, наряду с остатком Aspl37, вызывает дополнительную дестабилизацию центральной части, что и обусловливает ту картину трипсинолиза, которая наблюдается в случае а-ТМ дикого типа.

Следует обратить внимание на то, что расщепление трипсином только в одном месте, по остатку А^133, означает наличие локальной дестабилизации молекулы а-ТМ в этой области. Именно поэтому мы закономерно заинтересовались вопросом, имеет ли дестабилизирующий эффект остатков АврШ и С1у126 более глобальный характер. Исходя из этого, в последующих экспериментах мы применили метод ДСК для детального анализа тепловой денатурации а-ТМ дикого типа и с мутациями в 126А и С126К. На рис. 5 представлены кривые избыточного теплопоглощения для а-ТМ дикого типа и его мутантов 0126А и С126 К. Из рисунка видно, что обе мутации оказывают заметный эффект на тепловую денатурации а-ТМ. В этом отношении, наиболее интересна низкотемпературная область графика, где кривая ДСК для а-ТМ '\УТ имеет более крутой наклон, чем в случае мутантов а-ТМ 0126А и а-ТМ 01261*. Подобный характер зависимости теплоемкости белка от температуры указывает на то, что при повышении температуры некоторые части белка денатурируют некооперативно. Такая денатурация характеризует белки, структура которых обладает пониженной компактностью и плотностью упаковки, т.е. высокой конформационной подвижностью

О 10 20 30 40 50 60 70 Температура (°С)

врп

Рис. 5. Температурные зависимости удельной

теплоемкости, полученные методом ДСК для а-ТМ \УТ, а-ТМ С126А и а-ТМ 0126К. Прямая линия (ВРТ1) соответствует теплоемкости, рассчитанной для полностью свернутого глобулярного белка, имеющего стабильную компактную третичную структуру и такую же молекулярную массу, что и а-ТМ.

(«флексибильностыо»). Сниженный наклон начального участка кривой ДСК, наблюдаемый в случае мутантов ос-ТМ 0126А и а-ТМ С126Е, говорит о пониженной конформационной подвижности центральной части молекулы а-ТМ. Вместе с тем, интегрирование всех кривых на рис 5 относительно кривой теплоемкости полностью свернутого белка (ингибитор трипсина из поджелудочной железы крупного рогатого скота, ВРТ1 на рис. 5) дает примерно одинаковые значения. Это означает, что для денатурации всех исследованных препаратов а-ТМ требуется одинаковое количество тепловой энергии. Между тем, амплитуда кооперативных переходов в случае мутантов а-ТМ С126А и а-ТМ 012611 заметно больше, чем у а-ТМ '\\ГГ (рис. 5). Таким образом, введение мутаций 0126А и 0126И в а-ТМ вызывает изменение характера плавления его центральной части с некооперативного на кооперативный.

Рис. 6. Температурные зависимости удельной избыточной теплоемкости (Ср), полученные методом ДСК для а-ТМ \УТ (А), а-ТМ в 126А (Б) и а-ТМ вИбИ (В). Пунктиром показаны результаты деконволюции экспериментальных кривых ДСК (после вычитания инструментальной и химической базовых линий) на отдельные тепловые переходы, которые соответствуют калориметрическим доменам 1 и 2 в молекуле а-ТМ (т.е. частям молекулы, которые денатурируют кооперативно и независимо друг от друга).

Эффект увеличения энтальпии кооперативных переходов наиболее ярко проявляется на термограммах с вычтенной химической базовой линией (рис. 6). В случае а-ТМ с мутациями 0126А и 012611 энтальпия первого теплового перехода (калориметрического

домена 1 на рис. 6), который соответствует плавлению С-концевого домена а-ТМ, заметно возрастает по сравнению с а-ТМ \УТ, что обусловливает заметное увеличение суммарной энтальпии кооперативной денатурации у мутантных белков (Таблица 1).

Используя данные ДСК, мы смогли оценить размер нестабильного участка в центральной части молекулы а-ТМ. Для этого нами была исследована денатурация а-ТМ, связанного с филаментами Р-актина. Механизм денатурации ТМ, связанного с актином, был описан ранее в нашей лаборатории. Вкратце, актин вызывает стабилизацию связанного с ним ТМ, который денатурирует только после диссоциации с поверхности актинового филамента, что проявляется в появлении на термограмме нового кооперативного теплового перехода (пик АТ на рис. 7). Температура максимума этого нового перехода очень хорошо коррелирует с температурой диссоциации ТМ с поверхности актиновых филаментов (7^) (рис. 7, Таблица 1). Этот новый переход (пик АТ) отражает денатурацию всех тех частей молекулы ТМ, которые в отсутствие актина денатурируют при более низких температурах (в том числе и тех, которые денатурируют некооперативно). Таким образом, связывание с актином вызывает изменение характера тепловой денатурации некоторых участков молекулы ТМ с некооперативного на кооперативный.

300

30 35 40 45 50 55 60 65 Температура (°С)

АТ

Рис. 7. Сравнение температурных зависимостей тепловой денатурации а-ТМ С126К в комплексе с Н-актином, полученных методом ДСК (А) и диссоциации этого комплекса, регистрируемой по снижению интенсивности светорассеяния (Б). Условия: 10 мкМ а-ТМ С126И, 45 мкМ Р-актин, 60 мкМ фаллоидин. Скорость нагрева в обоих случаях составляла 1 К/мин. Температурная область выше 65°С,

соответствующая необратимой денатурации стабилизированного фаллоидином Р-актина (Тт ~ 80°), не показана. Пунктиром показаны результаты деконволюции кривых ДСК на отдельные тепловые переходы (калориметрические домены).

Таблица 1. Основные параметры тепловой денатурации а-ТМ \>/Т, а-ТМ С126А и а-ТМ в1261* в отсутствие и в присутствии Б-актина и диссоциации а-ТМ с поверхности актиновых филаментов. Абсолютная погрешность величины Тт (АТ) (температуры максимума пика АТ, индуцируемого Р-актином на термограммах а-ТМ) не превышала ± 0,2°С. Относительная погрешность величины калориметрической энтальпии (ДЯса|) не превышала ± 10%. -температура полумаксимальной диссоциации комплексов а-ТМ с Р-актином (т.е. та температура, при которой интенсивность светорассеяния снижается на 50%, см. рис. 7). Погрешность определения величины Т^ не превышала ± 0,2°С.

а-ТМ Тт (АТ), "с "С АЯса 1 (-Р-актин), кДж/моль АЯса! (+Р-актин), кДж/моль

\УТ 46,7 47,0 920 1100

С126А 49,7 49,9 1350 1270

в 1261* 51,1 51,1 1170 1140

Сравнение энтальпий тепловой денатурации ТМ в отсутствие и в присутствии Р-актина (Таблица 1) позволяет определить энтальпию некооперативной денатурации, которая характерна для некоторых участков ТМ Данный подход был применен нами и в случае а-ТМ, несущего мутации 0126А и 01261*. Согласно нашим расчетам, энтальпия некооперативной тепловой денатурации центральной части молекулы а-ТМ составляет около 300 кДж/моль, что соответствует примерно 60-70 аминокислотным остаткам, т.е. четверти длины молекулы.

2) Влияние стабилизации центральной части а-ТМ на его функциональные свойства.

Особый интерес в нашей работе представляли эффекты мутаций 0126А и 01261*, стабилизирующих центральную часть а-ТМ, на функциональные свойства данного белка. В литературе распространено мнение о том, что конформационная подвижность ТМ играет важнейшую роль в его функционировании, в частности - в связывании с актином. Отметим, что на сегодняшний день нет единого мнения или единой рабочей модели взаимодействия Р-актина с ТМ. Ввиду этого, исследования в данном направлении представляют исключительный интерес.

Для выяснения того, как влияют мутации С-126А и 01261* в а-ТМ на его сродство к Р-актину, нами были поставлены эксперименты по аналитическому соосаждению (рис. 8). Результаты этих экспериментов показали, что ни одна из этих мутаций не оказывает заметного влияния на сродство а-ТМ к актину при двух разных значениях ионной силы (100 мМ и 200 мМ №С1). Подобные данные были ранее получены американскими

авторами, которые изучали а-ТМ с центральной частью, стабилизированной мутацией D137L [Sumida et al., 2008]. Таким образом, мы можем заключить, что нестабильность (а, следовательно, и конформационная подвижность) центральной части а-ТМ не оказывает влияния на его связывание с актином.

1.0 А I 100mMNaCl|

0.8

0.6 _ у/

0.4 0.2 • a-TM WT A a-TMG126A □ a-TMG126R

0.0 , i

1.0 Б | 200 mM NaCl 1

0.8 -

0.6 -

0.4 А

0.2 - Jr

0.0 . i .......i

0.5 1.0 1.5 2.0 [Свободный ТМ], рМ

2.5

3.0

Рис. 8. Связывание а-ТМ \УТ, а-ТМ в126А и а-ТМ 01261* с Б-актином при разных значениях ионной силы - 100 мМ (А) и 200 мМ ИаС1 (Б). После соосаждения а-ТМ с И-актином (10 мкМ) содержание белков в

супернатантах и осадках анализировали с помощью 508-электрофореза в 12% ПААГ.

рСа

Рис. 9, Влияние мутаций G126A и G126R в а-ТМ на Са2+-зависимую актин-

активируемую АТРазу миозина (S1) в реконструированных тонких филаментах, состоящих из F-актина, а-ТМ, тропонина и S1.

Интересный эффект наблюдался при изучении АТРазной активности актомиозина в системе полностью реконструированного тонкого филамента (т.е. филамента, содержащего Б-актин, тропомиозин и тропониновый комплекс). Из рис. 9 видно, что при высокой концентрации ионов Са"+ (при рСа = 5) присутствие а-ТМ 012611 в составе тонкого филамента вызывало почти двукратное увеличение АТРазной активности по сравнению с а-ТМ \УТ и а-ТМ 0126А. Таким образом, стабилизация центральной части а-ТМ, вызываемая заменой 0126К, оказывает заметное влияние на регуляторные функции а-ТМ, но не влияет на его сродство к актину. Весьма неожиданным кажется отсутствие подобного эффекта в случае а-ТМ 0126А. Интерпретировать данный результат достаточно сложно, однако вполне вероятно, что подобная разница объясняется различными механизмами стабилизации, которые реализуются в случае мутаций 0126Я и С126А. Появление остатка А^ в положении 126 должно приводить к образованию дополнительной электростатической связи между двумя цепями ТМ, чего не должно быть в случае замены 0126А. Таким образом, две эти мутации накладывают определенные ограничения на разные виды информационной подвижности молекулы а-ТМ: Мутация 0126А препятствует локальному расплетанию а-спирали, а мутация 0126Я, помимо этого, препятствует скольжению двух цепей а-ТМ друг относительно друга вдоль оси молекулы. Вполне вероятно, что именно такое скольжение необходимо для нормального функционирования ТМ в составе тонкого филамента.

Заключение.

Итак, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что одиночная мутация К9Ю вызывает дестабилизацию (снижение термостабильности) почти половины молекулы Р-ТМ, тогда как мутации 0126А и 012611 стабилизируют центральную часть молекулы а-ТМ, делая ее исходно некооперативную тепловую денатурацию кооперативной.

Нами было показано, что мутация Я9Ю драматически снижает термостабильность Ы-концевой половины молекулы р-ТМ, вследствие чего вся эта часть молекулы мутантного белка плавится при температурах ниже физиологической. Учитывая то, что (3-ТМ Я9Ю обладает низким сродством к актиновым филаментам, можно заключить, что в физиологических условиях стабилизация Р-ТМ Я9Ю актином вряд ли возможна. Кроме того, нами было установлено, что р-ТМ, несущий мутацию Я9Ю, обладает существенно сниженной способностью образовывать аР-гетеродимеры с а-ТМ. Все эти свойства мутантного Р-ТМ могут приводить к изменению соотношения различных изоформ ТМ в мышечной ткани. Отметим, что в литературе имеются описания наследственных

миопатий, многие из которых сопровождаются изменением содержания различных изоформ ТМ. Эти изменения, в свою очередь, коррелируют с вариациями в соотношении различных типов волокон в мышечной ткани, что напрямую связано с морфологией мышц и ее изменениями при миопатиях. Вполне вероятно, что подобный механизм развития заболевания может выражаться и в случае дистального артрогриппоза, ассоциированного с мутацией Я9Ю в р-ТМ.

Удивительным свойством молекулы ТМ является то, что несмотря на кажущуюся однородность структуры (фибриллярный а-спиральный белок), свойства различных участков молекулы резко отличаются друт от друга. Введение остатка глицина в положение 91 закономерно снижает стабильность а-спирали; интересно, однако, что это дестабилизирующее действие распространяется практически на всю К-концевую половину молекулы (3-ТМ. Таким образом, можно заключить, что для структуры этой части молекулы характерна высокая кооперативность, которая, видимо, отражает высокую плотность упаковки и низкую конформационную подвижность. Между тем, центральный участок молекулы ТМ (60-70 аминокислотных остатков) содержит в себе консервативный остаток глицина и, как мы показали, характеризуется некооперативной денатурацией. Это свойство является проявлением высокой конформационной подвижности данного участка. Таким образом, подтверждается ранее предложенная модель устройства молекулы ТМ: два относительно стабильных и достаточно жестких домена (14- и С-концевой) соединены подвижным центральным участком.

Высокая конформационная подвижность молекулы ТМ и ее влияние на функциональные свойства данного белка давно являлись предметом острой дискуссии. Предполагалось, в частности, что конформационная подвижность именно центральной части молекулы ТМ важна для его актин-связывающей функции. Результаты настоящей работы показывают, что увеличение стабильности центральной части ТМ, вызываемое мутациями в126А и 012611, и, как следствие, уменьшение ее конформационной подвижности, не влияет на параметры связывания ТМ с Б-актином. Между тем, стабилизация центральной части оказывает влияние на регуляторные свойства ТМ. Интересно, что в этом случае наиболее важным оказывается стабильность именно двуспиральной структуры ТМ, а не каждой из его а-спиралей в отдельности.

В заключение отметим, что если раньше ТМ являлся одним из самых типичных представителей в своем классе белков с суперспиральной структурой, то в последнее время данная концепция активно пересматривается. Отмечаются необычные, характерные только для ТМ черты структуры, которые обусловливают выполняемые им важнейшие функции в регуляции мышечного сокращения.

Выводы

С использованием методов дифференциальной сканирующей калориметрии, спектроскопии кругового дихроизма, флуоресценции, ограниченного протеолиза трипсином, химического «сшивания» и соосаждения тропомиозина (ТМ) с актином исследовано влияние мутации Arg91Gly в p-изоформе ТМ гладких и скелетных мышц человека (р-ТМ) и мутаций Glyl26Ala и Glyl26Arg в а-изоформе ТМ скелетных мышц человека (а-ТМ) на структурные и функциональные свойства тропомиозина. На основании полученных результатов были сделаны следующие выводы:

1) Точечная мутация Arg91Gly вызывает значительные структурные изменения в молекуле р-ТМ, резко снижая термостабильность N-концевой половины молекулы. Показано также, что эга мутация существенно снижает способность Р-ТМ к образованию ap-гетеродимеров с а-изоформой ТМ.

2) Мутация Arg91 Gly существенно снижает сродство Р-ТМ к F-актину.

3) Замены неканонического остатка Gly 126 в центральной части молекулы а-ТМ на канонические остатки Ala и Arg стабилизируют эту область молекулы. Это выражается в предотвращении расщепления а-ТМ трипсином и в изменении характера тепловой денатурации центральной части а-ТМ с некооперативного на кооперативный.

4) Проведена оценка размера нестабильной центральной области молекулы а-ТМ и установлено, что она включает 60-70 аминокислотных остатков (приблизительно четверть длины молекулы).

5) Стабилизация центральной части молекулы а-ТМ не влияет на сродство тропомиозина к F-актину. При этом мутация Glyl26Arg (но не Glyl26Ala) оказывает заметное влияние на регуляторные свойства тропомиозина в полностью реконструированных тонких филаментах, что проявляется в увеличении АТРазной активности актомиозина при высоких концентрациях ионов кальция.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Невзоров И.А., Редвуд Ч.С., Левицкий Д.И. (2008) «Влияние мутации Arg91Gly на термостабильность Р-тропомиозина». Биофизика, т. 53, № 6, с. 917-921.

2. Nevzorov I.A., Redwood C.S., and Levitsky D.I. (2008) "Stability of two P-tropomyosin isoforms: effects of mutation Arg91 Gly". J. Muscle Res. Cell Motil., v. 29, p. 173-176.

3. Nevzorov I.A., Nikolaeva O.P, Kainov Y.A., Redwood C.S., and Levitsky D.I. (2011) "Conserved non-canonical residue Gly-126 confers instability to the middle part of the tropomyosin molecule". J. Biol Chem., v. 286, № 18, p. 15766-15772.

Тезисы докладов:

1. Nevzorov I.A., Redwood C.S. and Levitsky D.I. (2008) "Effects of mutation R91G in P-tropomyosin on its thermal unfolding". Abstracts of International Symposium "Biological Motility: Achievements and Perspectives" (Pushchino, Moscow Region, May 11-15, 2008), p. 43^14.

2. Nevzorov I.A.. Redwood C.S., and Levitsky D.I. (2008) "Mutation Arg91Gly in P-tropomyosin drastically alters its structural properties". Abstracts of XXXVII European Muscle Conference (Keble College, Oxford, UK, 13-16 September 2008), p. 39.

3. Levitsky D.I., Kremneva E.V., Nevzorov I.A.. Nikolaeva O.P., Maytum R„ Redwood C., and Geeves M.A. (2008) "Actin-induced changes in the thermal unfolding of various tropomyosins". Abstracts ofXXXVIl European Muscle Conference (Kebie College, Oxford, UK, 13-16 September 2008), p. 32.

4. Nevzorov I.A.. Matlashov M.E., Redwood C.S., Nikolaeva O.P., and Levitsky D.I. (2010) «On the role of a conserved glycine residue in tropomyosin structure and function». Abstracts of International Symposium "Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies" (Pushchino, Moscow region, Russia, May 11-15, 2010), p. 193-194 (устный доклад).

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант 09-04-00339) и Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН.

Подписано в печать 21 апреля 2011 г. Объем 1,2 п. л. Тираж 100 экз. Заказ № 372 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Невзоров, Илья Анатольевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Структура тропомиозина

1. Открытие тропомиозина и первоначальные сведения о его структуре

2. Структура соПес1-соП: основные черты и номенклатура

Факторы, определяющие стабильность структуры СС

3. Тропомиозин: распространение и изоформы

4. Особенности первичной структуры ТМ

5. Стабильность молекулы ТМ

6. Атомные структуры тропомиозина 25 И. Функциональные свойства тропомиозина

1. Взаимодействие ТМ с фибриллярным актином

Кооперативностъ взаимодействия и факторы, ее определяющие

Факторы, определяющие сродство ТМкР-актину

Гипотеза Оез1аи~связывания

2. Регуляторная функция ТМ

Общие сведения о механизме мышечного сокращения 43 Регуляция взаимодействия головки миозина с актиновым филаментном

III. Миопатические мутации в тропомиозинах

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Препаративные методы

Приготовление компетентных клеток Е.соИ

Сайт-направленный мутагенез

Экспрессия рекомбинантного ТМ в клетках Е. соИ

Выделение актина га ацетонового порошка

Выделение субфрагмента 1 миозина (Б!)

Выделение тропонина из ацетонового порошка мышц кролика

Получение ТМ, меченого Ы-(1-пиренш)йодацетамидом

2. Аналитические методы

Определение концентрации белков

ЗИБ-Электрофорез в ПААГ 59 Образование дисульфидной связи с помощью

5,5'-дитиобис(2-нитробензоата)

Ограниченный протеолиз тропомиозина трипсином

Соосаждение тропомиозина сР- актином

Определение Са2+ -чувствительностиреконструированного тонкого филомента 62 Исследования тепловой денатурации ТМметодом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК)

Спектроскопия кругового дихроизма 64 Исследование температурных зависимостей диссоциации комплекса

ТМ с Г-актином методом светорассеяния 65 Температурные зависимости эксимерной флуоресценции пиренил-меченого тропомиозина

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава I. Исследование структуры и свойств Р-тропомиозина, несущего мутацию 1191С

I. 1. Термостабильность Р-тропомиозина (р-ТМ) и влияние на нее мутации Я9Ш

1.1.1. Гладкомышечный Р-тропомиозин ф-БтТт)

1.1.2. Скелетный Р-тропомиозин (р-БкТт)

I. 2. Способность Р-ТМ к формированию аР-гетеродимеров с а-ТМ и влияние на нее мутации Б191 й

1.2.1. Образование гетеродимеров между а- и р-цепями ТМ

1.2.2. Влияние мутации К9Ю в гладкомышечном р-ТМ на его способность образовывать аР-гетеродимеры с а-ТМ

I. 3. Влияние мутации Ы9Ш в Р-ТМ на его взаимодействие с Б-актином

1.3.1. Гладкомышечный Р-тропомиозин ф-8тТт)

1.3.2. Скелетный Р-тропомиозин ф-БкТт)

Глава И. Роль остатка С1у-126 в структуре и функциях ТМ

II.1. Консервативный неканонический остаток С1у-126 дестабилизирует центральную часть молекулы ТМ

II. 1.1. Изучение локальной стабильности а-БкТт ЖТ и его мутантов а-8кТт а26А и а-5кТт 012611 методом ограниченного протеолиза

II. 1.2. Изучение тепловой денатурации а-БкТт ЖГи его мутантов — а-БкТт в126А и а-БкТт в126Я

II. 1.3. Тепловая денатурация а-ТМ и его мутантов в присутствии

Р-актина

112. Влияние стабилизации центральной части а-БкТМ на его функциональные свойства

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменения структуры и свойств тропомиозина при стабилизации и дестабилизации различных участков его молекулы"

Тропомиозин (ТМ) является одним из ключевых компонентов регуляторного аппарата тонких филаментов во всех типах мышц. Вытянутые молекулы ТМ связываются с семью мономерами актина и тропониновым комплексом в составе тонкого филамента. Современные представления о механизме регуляции сокращения скелетной и сердечной мышцы сформулированы в виде теории «стерического блокирования», согласно которой ТМ способен перемещаться на поверхности актинового филамента, открывая или закрывая участки взаимодействия актина с головками молекул миозина. Положение ТМ на актине зависит от нескольких факторов, ключевыми из которых являются концентрация ионов кальция и наличие головок миозина. Данные кинетических и структурных исследований показывают, что для ТМ характерны три состояния, которые отражают его различные положения на поверхности актинового филамента. Эти состояния принято обозначать как «blocked» (связывание миозина с актином невозможно), «closed» (разрешено только «слабое» связывание) и «ореп» (осуществляется изомеризация актомиозинового комплекса и переход «слабого» связывания в «сильное») [McKillop & Geeves, 1993].

Молекула ТМ представляет собой димер а-спиралей, образующих левозакрученную суперспираль (coied-coil). Это объясняется наличием в первичной структуре ТМ непрерывающихся семичленных повторов (гептад). Соответственно, аминокислотную последовательность ТМ можно изобразить как (a b с d е f g)n, где положения а и d обычно заняты гидрофобными остатками, а в положениях ей g находятся остатки с заряженным радикалом. В целом, гидрофобные взаимодействия образуются в месте контакта спиралей и стабилизируют coiled-coil, тогда как электростатические взаимодействия между остатками ей g обусловливают специфичность образования двойной спирали и ее стабильность. Остатки с, duf обычно гидрофильны и определяют взаимодействие ТМ с другими белками. Таким образом, стабильность молекулы ТМ зависит от природы остатков в положениях a, d, е и g, а также от спиралеобразующей способности всех остальных аминокислотных остатков, включая отмеченные выше.

Для ТМ характерно наличие 4 генов, которые в результате альтернативного сплайсинга дают суммарно более 30 изоформ. В скелетных мышцах человека ТМ присутствует главным образом в виде гомодимеров а- и Р-изоформ, тогда как для гладкой мышцы характерно наличие аР-гетеродимеров.

Ввиду простоты своего устройства, молекула ТМ представляет собой идеальный объект для изучения взаимосвязи структуры и функции в молекулах белков. В этом отношении особый интерес представляют аминокислотные замены (мутации) в ТМ, ассоциированные с различными заболеваниями - например, миопатиями. Как правило, такие мутации имеют ярко выраженный функциональный фенотип, поэтому изучение вызываемых ими структурных изменений ТМ интересно с точки зрения как фундаментальной науки, так и биомедицины. Известно, например, что мутация Arg91 Gly в (3-изоформе ТМ ассоциирована с дистальным артрогриппозом - тяжелым наследственным заболеванием мышц. Кроме того, было установлено, что функциональными последствиями данной мутации является значительное снижение сродства молекул ТМ к актину и слишком высокая сократительная активность мышц. Тем не менее, оставалось непонятным, какие именно изменения в структуре мутантного ТМ приводят к таким эффектам. Выяснение этого вопроса составило одну из главных целей данной диссертационной работы.

Итак, целью данной работы стало изучение структуры и свойств мутантных форм ТМ, несущих замены Аг§9Ю1у (1*91 в), С1у126А1а (С126А) и С1у126Ащ (012611). В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:

1) С помощью сайт-направленного мутагенеза получить рекомбинантные белки: р-изоформы ТМ гладких и скелетных мышц человека, несущие мутацию Я9Ю, и а-изоформу ТМ скелетных мышц человека, несущую мутации 0126А или 012611.

3) Используя метод химического «сшивания», исследовать влияние мутации Я9Ю в Р-изоформе ТМ человека на ее способность к образованию сф-гетеродимеров с а-изоформой ТМ.

4) Изучить влияние мутаций 0126А и 012611. в скелетномышечном а-ТМ человека на его сродство к Б-актину, а также на его регуляторные свойства в составе полностью реконструированных тонких филаментов.

Научная новизна и практическая значимость.

В работе впервые подробно исследован характер тепловой денатурации гладкомышечной и скелетномышечной изоформ Р-ТМ. С помощью метода ДСК установлено наличие в молекуле Р-ТМ двух калориметрических доменов (т.е. участков молекулы, которые денатурируют кооперативно и независимо друг от друга). Для идентификации этих доменов впервые было применено сочетание метода ДСК с измерениями температурных зависимостей флуоресценции эксимеров пирена. С помощью такого подхода установлено, что менее термостабильный домен представляет собой >1-концевую часть молекулы, тогда как более термостабильный домен соответствует ее С-концевой части. Проведено подробное изучение эффекта мутации 11910 на структуру и термостабильность гладкомышечной и скелетной изоформ Р-ТМ человека. Показано, что эта мутация вызывает драматическое снижение термостабильности всего И-концевого домена молекулы ТМ.

Методом химического сшивания показано, что мутация Я9Ш в гладкомышечной изоформе р-ТМ резко снижает ее способность образовывать сф-гетеродимеры с гладкомышечным а-ТМ. Предложен термодинамический механизм, описывающий снижение эффективности образования аР-гетеродимеров ТМ под действием мутации К9Ю.

С помощью метода ДСК впервые показано, что для некоторых участков молекулы скелетномышечного а-ТМ характерно некооперативное плавление, что свидетельствует об их высокой конформационной подвижности. Впервые предложена и проверена идея об участии аминокислотного остатка С1у126 в дестабилизации центральной части молекулы а-ТМ. Использование мутантных форм а-ТМ, несущих замены в126А и С126К, впервые позволило объяснить необычный характер протеолиза молекулы ТМ трипсином и установить, что некооперативное плавление имеет место именно в центральной части молекулы ТМ. Более того, впервые удалось определить приблизительные размеры этой нестабильной части молекулы ТМ (60-70 аминокислотных остатков, что соответствует четверти длины молекулы ТМ). На основании полученных данных высказана гипотеза о структурной организации молекулы ТМ, согласно которой молекула состоит из двух доменов разной стабильности (К-концевого и С-концевого) и нестабильного центрального участка между ними.

Полученные данные значительно расширяют и углубляют представления об особенностях структурной организации молекулы тропомиозина, а также представляют несомненную важность для понимания тех молекулярных механизмов, которые лежат в основе различных тяжелых заболеваний мышц, ассоциированных с миопатическими мутациями в молекуле тропомиозина.

Обзор литературы

I. Структура тропомиозина

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Невзоров, Илья Анатольевич

Выводы

С использованием методов дифференциальной сканирующей калориметрии, спектроскопии кругового дихроизма, флуоресценции, ограниченного протеолиза трипсином, химического «сшивания» и соосаждения тропомиозина (ТМ) с актином исследовано влияние мутации Arg91Gly в Р-изоформе ТМ гладких и скелетных мышц человека (Р-ТМ) и мутаций Glyl26Ala и Glyl26Arg в а-изоформе ТМ скелетных мышц человека (а-ТМ) на структурные и функциональные свойства тропомиозина. На основании полученных результатов были сделаны следующие выводы:

1) Точечная мутация Arg91Gly вызывает значительные структурные изменения в молекуле Р-ТМ, резко снижая термостабильность N-концевой половины молекулы. Показано также, что эта мутация существенно снижает способность р-ТМ к образованию ap-гетеродимеров с а-изоформой ТМ.

2) Мутация Arg91Gly существенно снижает сродство Р-ТМ к F-актину.

3) Замены неканонического остатка Glyl26 в центральной части молекулы а-ТМ на канонические остатки Ala и Arg стабилизируют эту область молекулы. Это выражается в предотвращении расщепления а-ТМ трипсином и в изменении характера тепловой денатурации центральной части а-ТМ с некооперативного на кооперативный.

Заключение

Итак, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что одиночная мутация 119 Ш вызывает дестабилизацию (снижение термостабильности) почти половины молекулы (3-ТМ, тогда как мутации 0126А и С12611 стабилизируют центральную часть молекулы а-ТМ, делая ее исходно некооперативную тепловую денатурацию кооперативной.

Нами было показано, что мутация Я9Ю драматически снижает термостабильность 1Ч-концевой половины молекулы (3-ТМ, вследствие чего вся эта часть молекулы мутантного белка плавится при температурах ниже физиологической. Учитывая то, что р-ТМ 1191 в обладает низким сродством к актиновым филаментам, можно заключить, что в физиологических условиях стабилизация (3-ТМ Я9Ш актином вряд ли возможна. Кроме того, нами было установлено, что (3-ТМ, несущий мутацию Я9Ю, обладает существенно сниженной способностью образовывать оф-гетеродимеры с а-ТМ. Все эти свойства мутантного Р-ТМ могут приводить к изменению соотношения различных изоформ ТМ в мышечной ткани. Отметим, что в литературе имеются описания наследственных миопатий, многие из которых сопровождаются изменением содержания различных изоформ ТМ. Эти изменения, в свою очередь, коррелируют с вариациями в соотношении различных типов волокон в мышечной ткани, что напрямую связано с морфологией мышц и ее изменениями при миопатиях. Вполне вероятно, что подобный механизм развития заболевания может выражаться и в случае дистального артрогриппоза, ассоциированного с мутацией Ы91С в р-ТМ.

Удивительным свойством молекулы ТМ является то, что несмотря на кажущуюся однородность структуры (фибриллярный а-спиральный белок), свойства различных участков молекулы резко отличаются друг от друга. Введение остатка глицина в положение 91 закономерно снижает стабильность а-спирали; интересно, однако, что это дестабилизирующее действие распространяется практически на всю ТЯ-концевую половину молекулы Р-ТМ. Таким образом, можно заключить, что для структуры этой части молекулы характерна высокая кооперативность, которая, видимо, отражает высокую плотность упаковки и низкую конформационную подвижность. Между тем, центральный участок молекулы ТМ (60-70 аминокислотных остатков) содержит в себе консервативный остаток глицина и, как мы показали, характеризуется некооперативной денатурацией. Это свойство является проявлением высокой конформационной подвижности данного участка. Таким образом, подтверждается ранее предложенная модель устройства молекулы ТМ: два относительно стабильных и достаточно жестких домена (ЪГ- и С-концевой) соединены подвижным центральным участком.

Высокая конформационная подвижность молекулы ТМ и ее влияние на функциональные свойства данного белка давно являлись предметом острой дискуссии. Предполагалось, в частности, что конформационная подвижность именно центральной части молекулы ТМ важна для его актин-связывающей функции. Результаты настоящей работы показывают, что увеличение стабильности центральной части ТМ, вызываемое мутациями 0126А и 012611, и, как следствие, уменьшение ее конформационной подвижности, не влияет на параметры связывания ТМ с Б-актином. Между тем, стабилизация центральной части оказывает влияние на регуляторные свойства ТМ. Интересно, что в этом случае наиболее важным оказывается стабильность именно двуспиральной структуры ТМ, а не каждой из его а-спиралей в отдельности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Невзоров, Илья Анатольевич, Москва

1. Левицкий Д.И. (2004) Применение метода дифференциальной сканирующей калориметрии для структурно-функциональный исследований мышечных белков (обзор). Успехи биол. химии, т. 44, с. 133-170.

2. Финкелыптейн А.В., Птицын О.Б. «Физика белка». 2-е изд. Книжный дом «Университет», Москва, 2002.

3. Arndt К.М., Pelletier J.N., Miller К.М., Plickthun A., Alber T. (2002) Comparison of in vivo selection and rational design of heterodimeric coiled coils. Structure 10, 1235— 1248.

4. Bagshaw C.R. and Trentham D.R. (1973) The reversibility of adenosine triphosphate cleavage by myosin. Biochem. J. 133, 323-328.

5. Bamburg J.R. (1999) Proteins of the ADF/cofilin family: essential regulators of actin dynamics. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15, 185-230.

6. Betcher-Lange S.L. and Lehrer S.S. (1978) Pyrene excimer fluorescence in rabbit skeletal aa tropomyosin labeled with N-(l-pyrene)maleimide. J. Biol. Chem. 253, 3757-3760.

7. Betteridge D.R. and Lehrer S.S. (1982) Two conformational states of didansylcystine-labeled rabbit cardiac tropomyosin. J. Mol. Biol. 167,481—496.

8. Blanchoin L., Pollard T.D., and Hitchcock-DeGregori S.E. (2001) Inhibition of the Arp2/3 complex nucleated actin polymerization and branch formation by tropomyosin. Curr. Biol. 11, 1300-1304.

9. Brandt P.W., Cox R.N. and Kawai M. (1980) Can the binding of Ca2+ to two regulatory sites on troponin С determine the steep pCa/tension relationship of skeletal muscle? Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77, 4717-4720.

10. Boussouf S.E. and Geeves M.A. (2007) Tropomyosin and troponin cooperativity on the thin filament. Adv. Exp. Med. Biol. 592, 99-109.

11. Brown H.R and Schachat F.H. (1985) Renaturation of skeletal muscle tropomyosin: Implications for in vivo assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82,2359-2363.

12. Brown J.H. (2010) How sequence directs bending in tropomyosin and other two-stranded alpha-helical coiled coils. Protein Sci. 19, 1366-1375

13. Brown J.H., Cohen C., and Parry D. (1996) Heptad breaks in alphahelical coiled coils: stutters and stammers. Proteins 26, 134-145

14. Brown J. H., Kim K.H., Jun G., Greenfield N.J., Dominguez R., Volkmann N., Hitchcock-DeGregori S.E., and Cohen C. (2001) Deciphering the design of the tropomyosin molecule. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 8496-8501.

15. Brown J. H., Zhou Z., Reshetnikova L., Robinson H., Yammani R. D., Tobacman L.S., and Cohen C. (2005) Structure of the mid-region of tropomyosin: bending and binding sites for actin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102, 18878-18883.

16. Bullough P.A., Hughson F.M., Skehel J.J. and Wiley D.C. (1994) Structure of influenza haemagglutinin at the pH of membrane fusion. Nature 371, 37-43

17. Burkhard P., Stetefeld J., and Strelkov S.V. (2001) Coiled coils: a highly versatile protein folding motif. TrendsCellSci. 11, 82-88.

18. Cassell M. and Tobacman L.S. (1996) Opposite effects of myosin subfragment 1 on binding of cardiac troponin and tropomyosin to the thin filament. J. Biol. Chem. 271, 12867-12872.

19. Dabrowska R., Nowak E. and Drabikowski W. (1983) Some functional properties of nonpolymerizable and polymerizable tropomyosin. J. Muscle Res. Cell Motil. 4, 143— 161.

20. Donner K., Ollikainen M., Ridanpaa M., Chricten H.-J., Goebel H., Visser M., de Pelin K., and Wallgren-Petersson C. (2002) Mutations in the P-tropomyosin (TPM-2) gene — a rare cause of nemaline myopathy. Neuromuscular Disorders 12, 151-158.

21. Dragan A.I. and Privalov P.L. (2002) Unfolding of a leucine zipper is not a simple two-state transition. J. Mol. Biol. 321, 891-908.

22. Eaton B.L. (1976) Tropomyosin binding to F-actin induced by myosin heads. Science 192, 1337-1339.

23. Eaton B.L., Kominz D.R., and Eizenberg E. (1975) Correlation between the inhibition of acto-heavy meromyosin ATPase and the binding of tropomyosin to F-actin: effects of Mg2+, KC1, troponin I and troponin C. Biochemistry 14, 2718—2725.

24. Engelhardt W.A. and Liubimova M.N. (1939) Myosin and adenosine triphosphatase. Nature 144, 688.

25. Fatkin D. and Graham R.M. (2002) Molecular mechanisms of inherited cardiomyopathies. Physiol. Rev. 82, 945-980.

26. Freire E. and Biltonen R.L (1978) Statistical mechanical deconvolution of thermal transitions in macromolecules. I. Theory and application to homogeneous system. Biopolymers 17, 463^179.

27. Frye J., Klenchin V.A., and Rayment I. (2010) Structure of the tropomyosin overlap complex from chicken smooth muscle: insight into the diversity of N-terminal recognition. Biochemistry 49, 4908 4920.

28. Fujime S. and Ishiwata S. (1971) Dynamic study of F-actin by quasielastic scattering of laser light. J. Mol. Biol. 62, 251-265.

29. Gimona M. (2008) Dimerization of tropomyosins. Adv. Exp. Med. Biol. In: Advances in experimental medicine and biology, vol. 644 "Tropomyosin" (Edited by Peter Gunning), Springer, p. 73-84.

30. Golitsina N., Yougmi A., Greenfield N., Thierfelder L., Iizuka K., Seidman J., Seidman C., Lehrer S., and Hitchkock-DeGregori S.E. (1997) Effects of two FHC-causing mutations on a-Tm structure and function. Biochemistry 36, 4637—4642.

31. Goonasekara C.L., Gallivan L.J., Jackman D.M., and Heeley D.H. (2007) Some binding properties of Omp T digested muscle tropomyosin. J. Muscle Res. Cell Motil. 28, 175-182.

32. Goonasekara C.L. and Heeley D.H. (2008) Conformational properties of striated muscle tropomyosins from some salmonid fishes. J. Muscle Res. Cell Motil. 29, 135— 143.

33. Gorecka A. and Drabikowski W. (1977) Digestion of tropomyosin with trypsin. FEBS Lett. 75, 145-148.

34. Grabarek Z., Grabarek J., Leavis P.C. and Gergely J. (1983) Cooperative binding to the Ca2+-specific sites of troponin C in regulated actin and actomyosin. J. Biol. Chem. 258, 14098-14102.

35. Graceffa P. (1989) In-register homodimers of smooth muscle tropomyosin. Biochemistry 28, 1282-1287.

36. Graceffa P. and Lehrer S.S. (1980) The excimer fluorescence of pyrene-labeled tropomyosin. J. Biol. Chem. 255,11296-11300.

37. Greaser M.L. and Gergely J. (1971) Reconstitution of troponin activity from three protein components. J. Biol. Chem. 246, № 13, 4226^233.

38. Greene L.E. and Eisenberg E. (1980) Cooperative binding of myosin subfragment-1 to the actin-troponin-tropomyosin complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2616-2620.

39. Greenfield N. and Hitchcock-DeGregori S. (1993) Conformational intermediates in the folding of a coiled-coil model peptide of the N-terminus of tropomyosin and aa-tropomyosin. Protein Sci. 2, 1263-1273.

40. Greenfield N .J., Palm T., and Hitchcock-DeGregori S.E. (2002) Structure and interactions of the carboxyl terminus of striated muscle alpha-tropomyosin: it is important to be flexible. Biophys J. 83, 2754-2766.

41. Gunning P.W., Schevzov G., Kee A.J., and Hardeman E.C. (2005) Tropomyosin isoforms: divining rods for actin cytoskeletal function. Trends in Cell Biol. 15, 333341.

42. Hammel R.L., Hitchcock-DeGregori S.E. (1997) The sequence of the alternatively spliced sixth exon of alpha-tropomyosin is critical for cooperative binding but not for interaction with troponin. J. Biol. Chem. 272, 22409-22416.

43. Herrmann H., Haner M., Brettel M., Ku N.-O. and Aebi U. (1999) Characterization of distinct early assembly units of different intermediate filament proteins. J. Mol. Biol. 286, 1403-1420.47

Информация о работе

Невзоров, Илья Анатольевич
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Изменения структуры и свойств тропомиозина при стабилизации и дестабилизации различных участков его молекулы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы