Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эпитопный анализ и исследование иммунохимических свойств тропонина I из сердца человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Эпитопный анализ и исследование иммунохимических свойств тропонина I из сердца человека"

На правах рукописи

ФИЛАТОВ ВЛАДИМИР ЛЬВОВИЧ

ЭПИТОПНЫЙ АНАЛИЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ТРОПОНИНА I ИЗ СЕРДЦА ЧЕЛОВЕКА

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1998

Работа выполнена в Проблемной Лаборатории "Химия ферментов" кафедры биоорганической химии Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

чл.-корр. РАН, доктор химических наук Северин Е.С.

кандидат физико-математических наук Буларгина Т. В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Хайлова Л.С.

кандидат биологических наук Сологуб В. К.

Ведущая организация:

Всероссийский Кардиологический Научный Центр РАМН

Защита состоится "21° сентября 1998 года в 1430 на заседании Ученого Совета Д. 171.02.01 при Центре медико-биологических и экологических проблем РАЕН по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, 8.

Автореферат разослан "1" августа 1998 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

кандидат биологических наук ' В.В. Отраднова

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Циклический процесс сокращения-расслабления поперечно-полосатой, сердечной и скелетной мускулатуры регулируется изменением концентрации ионов Са2* внутри клетки. В том случае, когда мышца расслаблена, концентрация ионов Са2+ понижена и составляет « -]0"7 М. При повышении внутриклеточной концентрации Са2+ до Ю^-Ю"4 М происходит инициация сокращения. Важнейшую роль в осуществлении Са-зависимой регуляции сокращения играет белковый комплекс, состоящий из трех субъединиц -тропонина И (Тп1), тропонина Т (ТпТ) и тропонина С (ТпС), объединенных в эквимолярном соотношении. Тп1 ингибирует взаимодействие актина с миозином в условиях пониженной концентрации Са2+ внутри клетки. Тропонин С при связывании ионов Са2+ инициирует цепь конформационных превращений в белках тропонинового комплекса и актинового филамента, приводящих к деблокированию циклического акто-миозинового взаимодействия. Тп1 и ТпС являются "молекулярными переключателями" процесса мышечного сокращения. Эти белки находятся в тесном контакте друг с другом,- Хотя изучение молекулярных механизмов сокращения мышцы продолжается в течение более 30 лет, до сих пор точно не определены участки аминокислотной последовательности Тп1, вовлеченные во взаимодействие с ТпС.

Сравнительно недавно было показано, что увеличение концентрации сердечной изоформы Тп! в сыворотке крови человека свидетельствует о некрозе клеток миокарда. Тп1 как биохимический маркер острого инфаркта миокарда (ИМ) обладает рядом уникальных свойств, делающих его лучшим из известных в настоящее время маркеров. Чтобы создать высокочувствительную иммунологическую систему для диагностики ИМ, необходимо не только иметь высокоаффинные антитела, специфичные к сердечной форме Тп1, но и знать участки их взаимодействия с антигеном (эпитопы). Несмотря на то, что исследования Тп1 проводятся во многих лабораториях по всему миру, до сих пор неясно, в какой форме белок выделяется в кровь больных с ИМ. Это приводит к существенным затруднениям при работе с диагностическими системами. Как мы постарались показать в данной работе, детальная

характеристика моноклональных антител (МАТ) может быть весьма полезной при исследовании биохимических свойств антигена.

Цели и задачи работы

♦ Проведение точного эпитопного картирования Tnl.

♦ Изучение факторов, оказывающих влияние на взаимодействие МАТ с Tnl.

♦ Иммунохимическое исследование Tnl в крови больных с ИМ.

Научная новизна и практическая ценность работы

♦ Для исследования взаимодействия Tnl с ТпС впервые применен метод скринирования пептидной библиотеки Tnl, с помощью которого определены 5 участков взаимодействия Tnl с ТпС.

♦ С точностью до трех аминокислотных остатков определены участки связывания 31 МАТ.

♦ Изучено влияние некоторых биохимических факторов на взаимодействие МАТ с Tnt.

♦ Даны рекомендации по использованию МАТ к сердечной изоформе Tnl в диагностике ИМ

Апробация работы

Результаты работы были доложены на съезде Европейской Ассоциации Клинической Химии в 1997 году (Bazel, Switzerland), на съезде Американской Ассоциации Клинической Химии в 1998 году (Chicago, USA), на Конгрессе Клинической Химии в 1998 году (Turku, Finland), на Международной конференции по фундаментальным наукам в 1998 году (Москва, Россия), на Международном симпозиуме "Биологическая подвижность: современные методы исследования" в 1998 году (Пущино, Россия), а также на совместном научном коллоквиуме Центра медико-биологических и экологических проблем РАЕН и Московского научно-исследовательского института медицинской экологии 21 мая 1998 года.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Структура и объем работы

Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты работы и их обсуждение и список цитированной литературы. Работа изложена на страницах печатного текста и иллюстрирована рисунками и таблицами.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Сердечная изосЬорма Tnl. Препарат Tnl был выделен из сердечной ткани человека как описано в (Katrukha et al, 1995).

Моноклональные антитела к сердечной изофооме Tnl. МАТ к Tnl были получены в нашей лаборатории и описаны в (Katrukha et al, 1997; Filatov et al 1998).

Твердофазный синтез пептидов на целлюлозной основе проводили с использованием набора реактивов и материалов фирмы "Genosys Biotechnologies" (Frank, 1992).

Определение участков взаимодействия антител с Tnl. Целлюлозную мембрану с иммобилизованными на ее поверхности пептидами инкубировали в ФСБТ, содержащем сухое молоко (10%) и бычий сывороточный альбумин (3%). Затем мембрану последовательно инкубировали в ФСБТ, содержащем анти-Tnl антитела (20 мкг/мл) и 5% лошадиную сыворотку крови, и в ФСБТ, содержащем вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, лошадиную сыворотку крови и бычий сывороточный альбумин. Для визуализации связывания МАТ с пептидами нами было предложено использовать иммуноферментный метод с усиленной хемилюминесценцией (Кричка с соавт., 1991).

Определение участков взаимодействия Tnl с ТпС. Исследуемую мембрану с иммобилизованными на ней пептидами инкубировали в буфере 50 мМ трис-HCI, рН 7,0, 150 мМ NaCI, 2 мМ CaCI2, 0,1% Твин-20), содержащем 10 мкг/мл сердечного ТпС, затем - в том же буфере с моноклональными анти-ТпС антителами в концентрации 10 мкг/мл, и на последнем этапе - в том же буфере с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена.

Образовавшиеся иммунные, комплексы проявляли с использованием иммуноферментного метода с усиленной хемилюминесценцией (Кричка с соавт., 1991).

Моделирование некроза сердечной ткани. Фрагменты сердечной ткани человека (левый желудочек) весом 2-3 г. инкубировали в 0,15 М растворе NaCI (3:1 вес/объем), содержащем 0,2% NaN3l при 37°С в течение заданных промежутков времени. Образец ткани после инкубации замораживали в жидком азоте и растирали до порошкообразного состояния, затем белковую фракцию из полученного таким образом препарата экстрагировали буферным раствором (1:10 вес/объем), содержащем 25 мМ трис-HCI, рН 7,5 и ингибиторы протеаз, в течение 5 минут. Суспензию ткани центрифугировали при 5000 g в течение 2 минут, осадок экстрагировали повторно в тех же условиях. Супернатанты после центрифугирования объединяли и добавляли к раствору сухую мочевину до конечной концентрации 6 М. Экстракцию белков из осадка после центрифугирования проводили трижды в тех же условиях буферным раствором, содержащим 50 М трис-HCI, рН 7,5, 6 М мочевину 5 мМ ЭДТА и 10 мМ J3-меркаптоэтанол и ингибиторы протеаз. Конечные супернатанты объединяли и хранили при температуре -70°С.

Иммунофлуорометрия. Иммунологическую активность Tnl измеряли в экстрактах ткани с помощью иммунофлуорометрической системы (Lovgren, 1985).

ДСН-электрофорез в полиакоиламидном геле проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970), концентрирующий гель содержал 4% акриламида, разделяющий - градиент концентрации акриламида (7,5-15%).

Вестерн-блоттинг. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану после ДСН-гель-электрофореза проводили по методу Товбин с соавторами (Towbin, etal., 1992).

Иммобилизация ТпС на BrCN-активированной сефарозе. ТпС иммобилизовали на сефарозе 4В по методике, рекомендованной производителем (Pharmacia, Щвеция), с некоторыми модификациями.

Исследование взаимодействия фрагментов Tnl с иммобилизованным ТпС. Экстракт белков сердечной ткани (после инкубации при 37°С в течение 8 часов - см. выше) наносили на ТпС-сефарозу, уравновешенную буфером,

содержащим 7 М мочевину, 50 мМ трис-НС1, рН 8,0, 15 мМ р-меркаптоэтанол, 2 мМ СаС1г. Не связавшийся с носителем материал удаляли, промывая носитель тем же буферным раствором. Элюцию белков, связавшихся с аффинным носителем .проводили в том же буфере с добавлением 10 мМ ЭГТА вместо СаОг- Контрольный эксперимент с сефарозой, не содержащей ТпС, проводили в тех же условиях. Белки элюата разделяли методом ДСН-гель-электрофореза и переносили на нитроцеллюлозную мембрану методом Вестерн-блоттинга. Для визуализации фрагментов Тп1 мембрану с иммобилизованными на ней белками обрабатывали МАТ 19С7, специфичными к сердечной изоформе Тп1.

фосфорилирование_7л/ сАМР-зависимой_протеинкиназрй.

Высокоочищенный лиофильно высушенный препарат Тп1 растворяли в дистиллированной воде до конечной концентрации 2 мг/мл. Инкубационная смесь для фосфорилирования содержала 15 мМ МдС12, 0,5 мМ ДТТ, 0,5 мМ ЭГТА, 50 мкМ АТФ, 0,18 мкКи/мл у-[32Р]-АТР и сАМР-зависимую протеинкиназу (60 единиц активности). Реакцию фосфорилирования инициировали добавлением субстрата. Смесь инкубировали, встряхивая, при 30°С в течение 2 часов. Степень фосфорилирования Тп1 определяли путем сравнения с контрольным образцом, не содержавшим АТР.

• После завершения реакции фосфорилирования белки в препарате разделяли методом электрофореза и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Полоски нитроцеллюлозной мембраны окрашивали различными антителами. Обработке в аналогичных условиях подвергали также исходный нефосфорилированный ТШ (контрольный эксперимент).

Крмпьютерное моделирование профиля гидрофильности ТнИ проводили по методу Кайт и Дулитл (Ку{е апс! ОооШ!е, 1982), используя программу Рго13са1е Швейцарского Института Биоинформации (http://expasy.hcuge.ch/cgi-Ып/рго1Бса1е.р1)

Результаты и их обсуждение

Для эпитопного картирования Тп1 мы использовали недавно разработанный метод твердофазного синтеза библиотеки линейных пептидов, представляющих полную последовательность исследуемого белка. Молекула

Тп1 из сердца человека состоит из 209 -аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 23,9 кДа (ВИаугаг е1 е1., 1996). Нами была синтезирована библиотека пептидов Тп1, состоящая из 67 десятичленных пептидов. Каждый пептид отличался от предыдущего сдвигом на 3 аминокислотных остатка вправо вдоль аминокислотной последовательности Тп1 (Рис.1)

1 10 20

ADGSSDAAREPRPAPAPIRRRS......-(-аминокислотная последовательность Тп1

АОСБЗОААКЕ <- пептид 1

SSDAAREPRP <- пептид 2

ААРЕРРРАРА <- пептид 3 EPRPAPAPIR пептид 4 PAPAPIRRRS <- пептид 5

Рис. 1 Схема, иллюстрирующая взаимное расположение пептидов Тп1 на целлюлозной мембране.

Синтез осуществлялся методом конденсации с использованием производных аминокислот, защищенных с ЫНг-конца флуоренилметилокси карбонильной группировкой, а с СООН-конца активированных остатком пентафторфенилового эфира. Использованная в наших экспериментах целлюлозная мембрана была предварительно обработана таким образом, что в определенных местах (круглые пятна диаметром « 5 мм) к гидроксильным группам целлюлозы были ковалентно присоединены дипегтгиды р-аланина, служившие матрицей для дальнейшего синтеза. Наращивание пептидной цепи проводилось одновременно для всех пептидов. Цикл присоединения одной аминокислоты состоял из следующих стадий: (Рис 2)

Снятие (\1Н2-защитной группы t

Активированная аминокислота

конденсация

Блокировка непрореагировавших амино-групп

I

Удлиненный на одну аминокислоту пептид---

Рис. 2 Схема пептидного синтеза по методу Франк (Frank, 1992).

Снятие №Н2-за1цитной группы осуществлялось путем инкубации мембраны в 20% растворе пиперидина в диметилформамиде (ДМФ), блокировка непрореагировавших свободных аминогрупп пептида - путем ацетилирования 4% уксусным ангидридом в ДМФ. Степень протекания реакции конденсации качественно оценивали в конце каждого цикла используя 0,01% раствор бромфенолового синего в ДМФ.

После полного завершения синтеза целлюлозную мембрану в течение 1 часа инкубировали в 50% трифторуксусной кислоте в дихлорметане с добавлением 2,5% триизобутилсилана с целью полного деблокирования концевых (МИг-групп и боковых цепей некоторых аминокислотных остатков. Исследование взаимодействия пептидов с МАТ проводили с использованием иммуноферментного метода с усиленной хемилюминесценцией, который отличается высокой чувствительностью. Пептиды, вступающие во взаимодействие с определенными антителами, были видны на рентгеновской пленке как темные пятна (Рис. 3). В контрольном эксперименте исследовалось взаимодействие вторичных антител с иммобилизованными пептидами. В условиях эксперимента такого неспецифического связывания не наблюдали. Удаление иммунных комплексов с поверхности мембраны (регенерацию) проводили, инкубируя ее в течение 30 мин. в 50 мМ трис-НС1, рН 8,0, 100 мМ р-меркаптоэтанол и 2% ДСН при температуре 95°С.

Рис. 3 Определение участка связывания антител 10в4 с Тп1 . Затемненные области соответствуют пятнам №6 и 7, последовательности соответствующих пептидов - 17Р1ЯЙ1188ЫУЙ2в ,в[1Р183ЫУЙАУАТ}. Участок, представляющий собой пересечение этих последовательностей (^ЯЭЗЫУЯгв), является эпитопом для антител 10С4.

Библиотека пептидов Тп1 была синтезирована дважды, причем во второй раз аминокислотные последовательности иммобилизованных пептидов отличались от аналогичных пептидов первой серии сдвигом на 1 остаток вправо, что дало нам возможность более точно определить эпитопы исследуемых антител.

Полученные нами результаты эпитопного картирования 31 МАТ к Тп1 свидетельствуют о том, что большинство (90%) исследованных антител взаимодействуют с линейными участками последовательности Тп1. Длина эпитопных участков для большинства антител составляла 3-10 аминокислотных остатков, что хорошо согласуется с литературными данными. Составив эпитопную карту Тп1, мы смогли определить фрагменты первичной структуры белка, обладающие наибольшей иммуногенностью. Это участки, ограниченные остатками 16-30, 85-91, 189-195 (Рис. 4).

NREVSOWRKNI □ALSOMEQRKKKFES

Рис. 4 Схема расположения эпитопов МАТ к Tnl. Расположение эпитопов определялось по данным исследования двух наборов пептидов. Затемнен участок первичной структуры, специфичный для сердечной изоформы Tnl.

Участки наибольшей иммуногенности, определенные нами, в целом совпадают с районами высокой гидрофильности, вычисленными с использованием компьютерной обработки первичной структуры Tnl.

Характерно, что наибольшее количество эпитопов находится внутри участка 1-31, являющегося уникальным для сердечной изоформы Tnl и обладающего высокой подвижностью (Dong et al., 1997с).

Точное определение участков связывания белка с антителами позволяет подобрать пары антител, пригодные для использования в диагностических системах. Такие антитела должны удовлетворять ряду требований. Во-первых, они должны взаимодействовать с белком с высоким аффинитетом. Во-вторых, их эпитопы должны быть разделены в пространстве, иначе при связывании двух видов антител с антигеном в системе типа "сэндвич" неизбежна их конкуренция за участки связывания.

Имея в своем распоряжении библиотеку пептидов Tnl, представляющих полную аминокислотную последовательность этого белка, мы исследовали возможность использования этой библиотеки для определения участков

контакта Тп1 и ТпС, чье: взаимодействие ифает ключевую роль в регуляции мышечного сокращения. Мембрана с иммобилизованными на ней пептидами ТнИ последовательно инкубировали: с ТпС (в условиях, благоприятствующих связыванию нативных белков), с анти-ТпС МАТ и с вторичными МАТ, конъюгированными с пероксидазой хрена. Для визуализации образовавшихся иммунных комплексов мы применили иммуноферментный метод с усиленной хемилюминесценцией (Кричка с соавт., 1991). Данные эксперимента представлены на Рис. 5. В контрольном эксперименте мембрана инкубировалась с анти-ТпС МАТ без преинкубации с ТпС.

'8* " - " ---- -;•• "•

- - >г- ■ -

Рис. 5 Определение участков взаимодействия Тп1 и ТпС. Эксперимент проводился, как описано в разделе "Материалы и методы исследования".

Анализируя результаты эксперимента, мы пришли к выводу о существовании 5 участков взаимодействия Тп1 с ТпС, расположенных в районах, ограниченных остатками 11-23, 44-61, 64-73, 127-148 и 154-169 (Рис. 6).

N_'__С

I \ЧЧ чЧЧЧчЧЧЧЧ: \ЧЧЧЧ^ \ЧЧЧЧ I

Рис. 6 Схема расположения участков первичной структуры Тп1, взаимодействующих с ТпС (выделены штриховкой).

Эти участки включают 35% аминокислотной последовательности Тп1 и расположены как в Ы-концевой, так и в С-концевой и центральной частях молекулы. Наши результаты хорошо согласуются с данными литературы, согласно которым взаимодействие Тп1 с ТпС захватывает протяженные районы

первичной структуры Tnl (Olah and Trewhella, 1994). Уникальность полученных нами данных состоит в том, что, используя метод, ранее не применявшийся для этих целей, мы подтвердили существование описанных в литературе центральных и С-концевых участков связывания и, кроме того, установили существование дополнительного участка связывания, расположенного на NH2-конце молекулы . Представляет интерес тот факт, что этот участок включает два соседних остатка Ser-22 и Ser-23, фосфорилирование которых сАМР-зависимой протеинкиназой в ответ на ß-адренэргическую стимуляцию сердца приводит к изменению сократительных свойств сердечной мышцы.

взаимодейcmвис ТпI с антителами

Вскоре после создания иммунологических систем для диагностики ИМ было замечено, что при измерении концентрации Tnl в одном и том же образце крови пациента с помощью различных диагностических систем получаются результаты, отличающиеся порой на порядок (Christenson et al., 1998). Нами было высказано предположение, что фракция Tnl в крови больных с ИМ неоднородна. Существуют несколько форм этого белка, различающихся по биохимической природе. Эти формы Tnl по-разному взаимодействуют с антителами. Факторами, влияющими на это взаимодействие, могут быть:

1. Пространственное блокирование части эпитопов. Tnl выделяется в кровоток после некроза миоцитов в виде комплекса с другими компонентами тропонинового комплекса. Участки связывания антител, полученных при иммунизации животных очищенным препаратом Tnl, в крови больных могут быть блокированы ТпС или ТпТ. Недавно в нашей лаборатории было установлено, что большая часть Tnl в кровотоке больных с ИМ находится не в свободной форме, а в виде комплекса с ТпС (Katrukha et al., 1997).

2. Разрушение или удаление части эпитопов в результате протеолиза, происходящего в некротизированной ткани или после выхода Tnl в кровоток.

3. Фосфорилирование Tnl по аминокислотным остаткам Ser-22 и Ser-23 под действием сАМР-зависимой протеинкиназы, приводящее к крупным конформационным перестройкам в структуре белка (Dong et al., 1997b,с).

В настоящей работе мы исследовали влияние на взаимодействие МАТ с Tnl двух факторов: неспецифического протеолиза и фосфорилирования Tnl сАМР-зависимой протеинкиназой.

Tnl является крайне нестабильным, легко деградирующим белком. Гибель клеток во время ИМ сопровождается разрушением мембранных структур, в том числе лизосом, и освобождением ферментов, вызывающих протеолитическое расщепление многих белков, в том числе Tnl. В нашей работе мы попытались ответить на вопрос, присутствует ли Tnl в крови больных с ИМ в виде интактного белка или в виде протеолитических фрагментов. Для этой цели мы смоделировали процесс некротизации сердечной мышечной ткани человека, протекающий in vivo как следствие ишемии миокарда. Фрагменты левого желудочка сердца человека инкубировали при 37°С в течение заданных промежутков времени. Затем белки экстрагировали сначала буферным раствором с низкой ионной силой, содержащим ФМСФ, пепстатин А и бензамидинхлорид в качестве ингибиторов протеаз, а затем буферным раствором 50 мМ трис-HCI, рН 7,5, содержащим также 6 М мочевину,5 мМ ЭДТА и 10 мМ p-меркаптоэтанол и те же ингибиторы протеаз.

Для исследования Tnl в экстрактах сердечной ткани использовался метод иммунофлуоресцентного анализа и Вестерн блоттинг. Иммунологическая система была построена по "сэндвич'-типу и включала пары антител, антигенные детерминанты которых расположены в различных частях молекулы Tnl. Антитела подложки были ковалентно связаны с биотином и в ходе определения прочно связывались со стрегттавидином, которым была покрыта поверхность иммунологического планшета. Детекторные антитела были помечены стабильным хелатом европия.

—■ ча

¡5 120-о о

ш 100-з: £

га 80-к

га

«

О 60-<D

т

S

. о «с

' о

>. 5

5

S о J—|-,-,-,-,-,-, , г-

0 5 10 15 20

Время инкубации ткани, часы

Рис. 7 Стабильность ТЫ в экстракте сердечной ткани человека, измеренная в "сэндвич"-системе с помощью разных пар антител. - ♦ - 18Н7-биот - 16A11-EU, ■ + - 19С7-биот - 16А11-Еи, - ■ - 7F4-6uom - 16A11-EU, ■ Т -14G5-6uam - 16А11-Еи, - * - 14G5-6uom- 7F4-Eu

Из полученных нами результатов (Рис. 7) следует, что иммунологическая активность Tnl не остается постоянной, изменяясь с течением времени, причем по-разному в зависимости от эпитопной специфичности используемых антител. Иммунологическая активность Tnl в иммунофлуоресцентной системе с двумя антителами, эпитопы которых находятся в области остатков 41-109 (18Н7-16А11 и 19С7-16А11), изменяется менее всего - через 20 часов инкубации активность составляла около 40% от первоначального уровня. В то же время активность Tnl, измеренная с использованием пар антител 7F4-16A11, 14G5-16А11, резко уменьшается с течением времени и через 20 часов инкубации составляет всего 5-10% от первоначального уровня. Эти пары антител подобраны таким образом, что эпитопы одних антител (участок 25-29 для антител 14G5 и участок 190-196 для антител 7F4) расположены в крайних N- и С-концевых частях молекулы, а эпитоп других - в центре молекулы (участок 8791 для антител 16А11). Наименьший уровень активности Tnl был обнаружен в системе 14G5-7F4. Мы предположили, что при инкубации Tnl в условиях, моделирующих некроз миокарда,. происходит расщепление белка преимущественно по участкам, расположенным в N и С-конце молекулы, тогда как центральная часть • в меньшей степени подвержена протеолизу.

Существование С-концевого участка неспецифического протеолитического расщепления косвенно подтверждено и в недавней работе немецких исследователей (АгЬеИе1а1., 1998).

Для того чтобы проверить предположение о том, что протеолиз Тп1 с наибольшей вероятностью происходит по участкам, расположенным преимущественно в Ы- и С-концевых районах молекулы, мы проанализировали состав фрагментов Тп1 в некротизированной сердечной ткани человека. Белки экстракта сердечной ткани, инкубированной в течение 8 часов при 37°С, разделяли методом гель-электрофореза по Лэммли и переносили на нитроцеллюлозную мембрану методом Вестерн-блоттинга. Имея в своем распоряжении панель МАТ с точно определенными антигенными детерминантами, мы установили участки преимущественного неспецифического протеолиза Тп1. В Вестерн-блоттинге некоторые антитела "узнавали" до 7 пептидов Тп1, тогда как другие - гораздо меньше (Рис. 8). Антитела 10Р4, 19С7, 414, 16А11, зпитопы которых ограничивают область аминокислотной последовательности 34-91, взаимодействуют с наибольшим количеством пептидов. Это наблюдение является дополнительным подтверждением нашего предположения о том, что данный участок первичной структуры Тп1 является более устойчивым к действию протеаз, нежели участки, расположенные в Ы- и С-концевых частях молекулы.

30 кДа->

«-сердечный Tnl

20 кДа->

14 кДа->

1234 56789 10

Рис. 8 Взаимодействие протеолитических фрагментов Tnl с разными МАТ. Фрагмент миокарда инкубировали при 37'С в течение 8 часов, белки экстрагировали и разделяли методом гель-электрофореза. После переноса на нитроцелпюлозную мембрану Tnl и его фрагменты прокрашивались различными МАТ: 10В11 (1), 4G6 (2); 10F4 (3); 19С7 (4); 414 (5); 16А11 (6); 18Н7 (7); 1QB7 (8); 6F9 (9) и 7F4 (10). Положения Tnl и маркеров молекулярных весов указаны стрелками.

В описанном выше эксперименте использовался экстракт ткани, которую инкубировали в условиях, имитирующих некроз миокарда, в течение 8 часов. Большая часть Tnl в экстракте представлена в виде протеолитических фрагментов с молекулярными массами от 14 до 28 кДа. Таким образом, результаты наших экспериментов позволяют заключить, что Tnl в сердечной ткани и крови больного через 20-30 часов после приступа ИМ, вероятно, находится в виде фрагментов. Это в частности означает, что поздняя диагностика ИМ, осуществляемая с помощью анти-Tnl антител, эпитопы которых располагаются в участках, отщепляемых протеазами, будет приводить к заниженным или ложноотрицательным результатам. Поэтому в диагностических системах целесообразно использовать только антитела, эпитопы которых находятся внутри наиболее устойчивого к действию протеаз участка первичной структуры Tnl, ограниченного остатками 34-91. -

Для того чтобы подтвердить, что явление деградации Tnl происходит также in vivo, мы измерили его концентрацию в серии образцов сыворотки крови больных с ИМ с помощью диагностических систем, использующих антитела к разным участкам молекулы Tnl (Рис 9).

Рис. 9 Концентрация Tnl в сыворотке крови пациента, измеренная в системах 14G5-6uom- 7F4 Ей (- В -) и 19С7-6иот - ВЕ10-Еи (-•-).

Первая система - 19С7-биот.-8Е10-Еи - пригодна для измерения как целого Tnl, так и его фрагментов, так как эпитопы данных антител находятся внутри наиболее стабильного участка белка - в районе 40-91 остатков. Вторая использованная нами система - 14G5-6hot.-7F4-Eu - пригодна для измерения концентрации только интактного белка, так как эпитопы этих антител расположены в крайних NH2- и СООН-концевых районах последовательности Tnl, которые наиболее подвержены протеолизу. В течение первых часов после начала заболевания концентрация Tnl, измеренная с помощью двух систем, была приблизительно одинаковой. Однако с течением времени увеличивалось различие в численных значениях концентраций Tnl, определяемых с помощью этих систем. В системе 19С7-биот.-8Е10-Еи спустя 60 часов после приступа концентрация Tnl в 3 раза выше, чем в системе 14G5-6kot.-7F4-Eu.

Таким образом, полученные данные подтверждают наше предположение о быстром протеолизе Tnl in vivo при ИМ: через 50-70 часов около 70% белка присутствует в крови больного уже в виде протеолитических фрагментов.

Одним из основных преимуществ Tnl по сравнению с другими биохимическими маркерами ИМ является возможность его применения в поздней и очень поздней диагностике заболевания. Результаты наших исследований свидетельствуют, что успешное использование системы для поздней диагностики ИМ возможно лишь в том случае, если входящие в ее

состав антитела "узнают" наиболее стабильный центральный участок первичной структуры Тп1. Если же применяется система на основе антител, чьи эпитопы расположены в лабильных участках молекулы Тп1, при диагностике ИМ несколько дней спустя после начала заболевания возможны ложно-отрицательные результаты. Влияниеобразовам

Исследуя проблему устойчивости центрального участка первичной структуры Тп1 к действию протеаз, мы предположили, что причиной его стабильности может, по крайней мере частично, быть экранирование определенных участков Тп1 молекулой ТпС. Из данных литературы известно, что эти два белка образуют прочный комплекс друг с другом, который не разрушается даже под воздействием 6 М мочевины (ТоЬастап, 1996). Аффинность взаимодействия Тп1 с ТпС зависит от концентрации ионов Са2+. Основные участки взаимодействия с ТпС лежат в центральной и С-концевой области Тп1 (Рис. 6). Для экспериментальной проверки гипотезы мы исследовали взаимодействие Тп1 и его протеолитических фрагментов (полученных в результате протеолитической деградации белка в некротизированной ткани) с ТпС, иммобилизованным на сефарозе. Если наше предположение верно, то взаимодействовать с иммобилизованным ТпС должны протеолитические пептиды, в состав которых входит участок между аминокислотными остатками 34-91. Экстракт сердечной ткани человека, которую инкубировали 8 часов в условиях, моделирующих некроз, наносили на колонку с ТпС-сефарозой в присутствии 2 мМ СаСЬ, чтобы обеспечить прочное связывание Тп1 и его пептидов с ТпС. Белки, связавшиеся с носителем, элюировали буфером, содержавшим вместо 2 мМ СаС1г 10 мМ ЭГТА. Затем их разделяли методом электрофореза и переносили на нитроцеллюлозную мембрану, после чего мембрану "окрашивали" антителами 19С7, эпитоп которых расположен внутри стабильного участка Тп1. В контрольном эксперименте исследовалось неспецифическое взаимодействие Тп1 и его пептидов с сефарозой без иммобилизованных белковых лигандов.

Анализ результатов эксперимента (Рис. 10) показал, что практически все пептиды, взаимодействующие с антителами 19С7, связываются с ТпС, иммобилизованным на сефарозе, и не взаимодействуют с чистой сефарозой.

Таким образом, было показано, что протеолитические пептиды Тп1, включающие область 34-91, способны образовывать комплекс с ТпС. По всей видимости, Тп1 находится в некротизированной сердечной ткани и крови больных ИМ в виде чрезвычайно гетерогенной смеси нативного белка, его протеолитических пептидов и их комплексов с ТпС.

Сердечный Tnl-»

Рис. 10 Исследование взаимодействия Тп1 и его протеолитических пептидов с ТпС-сефарозой. 1 - ТЫ в экстракте некротизированной сердечной ткани человека, 2 - Tnl в материале, элюированном с ТпС-сефарозы, 3 - ТЫ в материале, элюированном с сефарозы, не содержащей белковых лигандов (контрольный эксперимент).

Влияние .Ф°.?.Ф9Р.илированияш 7л/ с AMP'?.?. Шсимой. протеинкиназо й jn vitro

Известно, что сАМР-зависимая протеинкиназа модифицирует только два остатка, Ser-22 и Ser-23, в составе аминокислотной последовательности сердечной изоформы Tnl (Van Eyk and Solaro, 1996). Физиологическим эффектом такого фосфорилирования является уменьшение Са2+-связывающей способности ТпС (Malhotra et al., 1997), что приводит к тому, что мышечное сокращение инициируется при более высоких концентрациях внутриклеточного Са2+. Недавно было установлено, что фосфорилирование Ser-22 и Ser-23 вызывает значительные изменения конформации всей молекулы Tnl (Dong et al., 1997c). Логично предположить, что такие изменения будут влиять и на связывание Tnl с антителами. Чтобы проверить это предположение, мы провели фосфорилирование очищенного препарата сердечного Tnl сАМР-зависимой протеинкиназой и исследовали взаимодействие модифицированного белка с МАТ, используя методику Вестерн-блоттинга (Рис.

11). В наших экспериментах включение фосфата составляло 1,4 моля на моль белка.

НФ НФ НФ НФ НФ НФ НФ НФ

19С11 16Г1 13 П 19С7 4СЗ 16 АН 18Н7 10В7

Рис. 11 Исследование взаимодействия антител с фосфорилированным и нефосфорипированныи Тп1 методом Вестерн-блоттинга. н -нефосфорилированный исходный Тп1, ф - белок, фосфорилированный сАМР-зависимой протсинкиназой. Цифрами под рисунком обозначены МАТ, использовавшиеся в эксперименте.

Наиболее существенные различия во взаимодействии с фосфо- и дефосфо-формами Тп1 были обнаружены для антител, эпитопы которых расположены в непосредственной близости от сайта фосфорилирования либо перекрывают его (19С11, 13Р2, 16Р1). Некоторые антитела, эпитопы которых расположены поблизости от места фосфорилирования, например 19С7 (эпитоп ограничен остатками 41-49) и 4С2 (эпитоп ограничен остатками 23-29) взаимодействуют практически одинаково как с фосфорилированным, так и с нефосфорилированным Тп1. Антитела 16А11, 18Н7, 10В7, эпитолы которых располагаются в центральной и С-концевой частях молекулы Тп1, связываются с обоими формами белка одинаково. Следовательно, с большой долей уверенности можно предположить, что конформационные изменения, сопряженные с фосфорилированием Тп1, затрагивают в основном М-концевую часть белка. Аналогичные результаты были получены при исследовании фосфо- и дефосфо- форм белка иммунофлуоресцентным методом (данные не приводятся).

' Таким образом, было подтверждено наше предположение о существенном влиянии степени фосфорилирования Тп1 на его взаимодействие с МАТ. При стандартизации диагностических систем на основе МАТ к Тп1, произведенных различными компаниями целесообразно учитывать фосфорилирование Тп1. Выводы

1. Проведен эпитопный анализ Тп1 из сердца человека. С точностью до трех аминокислотных остатков определены участки связывания 31 типа монокпональных антител.

2. Определены наиболее иммуногенные участки первичной структуры Тп1, каковыми являются М-концевой район (остатки 16-30), центральный (остатки 85-91) и С-концевой участок (остатки 189-195).

3. В структуре сердечного Тп1 установлено 5 участков взаимодействия с ТпС. Взаимодействие ТпС с Ы-концевым участком Тп1 продемонстрировано впервые.

4. Исследован процесс деградации сердечного Тп1 в условиях, моделирующих состояние некроза миокарда. Показано, что протеолиз осуществляется преимущественно по сайтам, расположенным внутри участков 1-34 и 91-209 первичной структуры Тп1.

5. Установлено, что Тп1, присутствующий в крови больных с ИМ, представляет собой смесь интактного белка и его протеолитических фрагментов, возможно связанных с ТпС.

6. Установлено, что фосфорилирование Тп1 сАМР-зависимой протеинкиназой приводит к ослаблению взаимодействия с Тп1 ряда антител, эпитопы которых включают участок фосфорилирования.

7. Даны рекомендации по подбору антител для использования в системах диагностики ИМ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Филатов В., Катруха А. Эпитопный анализ Тп1 из сердца человека. Исследование взаимодействия белков тропонинового комплекса. Международная конференция по фундаментальным наукам, Москва, Россия, апрель 1998.

2. Филатов В.Л., Катруха А.Г. Применение БРОТ-метода для определения

участков связывания белков тропонинового комплекса. Международный симпозиум "Биологическая подвижность: современные методы исследования", Пущино, Россия, август 1998.

3. Katrukha A.G., Bereznikova A.V., Esakova T.V., Filatov V.L., Bulargina T.V., Gusev N.B. A new method of human cardiac troponin I and troponin T purification, Biochemistry and Molecular Biology International,1995, V36, N1,195-202

4. Filatov V., Katrukha A., Bereznikova A., Esakova Т., Bulargina Т., Kolosova O., Severin E„ and Gusev N. Epitope mapping of anti-troponin I monoclonal antibodies, 1998, Biochemistry and Molecular Biology International, in press

5. Katrukha A., Bereznikova A., Filatov V., Severina M, Esakova T, Pettersson K, Lovgren T. In vivo clearance of cardiac Tnl, abstract, 12th IFCC European Congress of Clinical Chemistry, Basel, Switzerland, August 1997, 113.

6. Katrukha A., Bereznikova A., Severina M, Filatov V, Esakova T, Pettersson K, Lovgren T. Stability of cardiac Tnl in human serum, abstract, 12й1 IFCC European Congress of Clinical Chemistry, Basel, Switzerland, August 1997, 118.

7. Katrukha A., Bereznikova A., Filatov V., Akinfieva E., Severina M., Bulargina Т., Pettersson K., Kolosova O., Gusev N„ Epitope analysis of human cardiac Tnl by SPOT-technique. 50th annual meeting of American Association of Clinical Chemistry, Chicago, USA, August 1998, Clinical Chemistry, 44, 6, Supplement,, p. A124.

8. Katrukha A., Bereznikova A., Filatov V., Esakova Т., Severina M„ Akinfieva E., Bulargina Т., Pettersson K„ Gusev N., Gratsianski G., Trifonov I. Mixed sandwich system for measurement Tnl-TnC complex in AMI persons. 50th annual meeting of American Association of Clinical Chemistry, Chicago, USA, August 1998, Clinical Chemistry, 44, 6, Supplement,, p. A122.

9. Katrukha A., Bereznikova A., Filatov V., Esakova Т., Kolosova O., Akinfieva E., Bulargina Т., Pettersson K., Gusev N., Stability of Tnl in necrotic human tissue. 50m annual meeting of American Association of Clinical Chemistry, Chicago, USA, August 1998, Clinical Chemistry, 44, 6, Supplement,, p. A126.

10.Katrukha A., Bereznikova A., Filatov V., Bulargina Т., Gratsianski G., Trifonov I Pettersson K., Lovgren Т., Gusev N., Pulkki K. Stability of cardiac Tnl measured by different assays, 1998, Scand. J. Clin. Lab. Invest., 58, Suppl. 228, 90.

11. Katrukha A., Bereznikova A., Filatov V., Bulargina Т., Gratsianski G., Trifonov I Pettersson K., Lovgren Т., Gusev N., Penttila H. Kinetics of cardiac Tnl release in

the bloodstream in AMI persons measured by different assays, 1998, Scand. J. Clin. Lab. Invest., 58, Suppl. 228, 90. Список используемых сокращений. ФСБТ - фосфатно-солевой буфер, содержащий Твин-20 ДСН - додецилсульфат натрия ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭГТА - р-аминоэтиловый эфир этиленгликоль - N,N,N' ,N'-тетрауксусной кислоты

ДТТ - дитиотреитол

ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид

АТР - аденозинтрифосфорная кислота

кДа - килодапьтон

Мв - молекулярный вес

сАМР - цикло-3',5',-аденозинмонофосфорная кислота

Tnl - тропонин I

ТпТ - тропонин Т

ТпС - тропонин С

ИМ - инфаркт миокарда

МАТ - моноклональные антитела

8Е10-Еи - антитела 8Е10, модифицированные хелатом европия 19С7-биат.- биотинилированные антитела 19С7 ДМФ - диметилформамид

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Филатов, Владимир Львович, Москва



МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИИ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

им. М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Филатов Владимир Львович

Эпитопный анализ и исследование иммунохимических свойств тропонина I из сердца человека.

03.00.04. - биохимия

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.х.н., профессор Северин Е.С.

к.ф.-м.н. Буларгина Т.В.

МОСКВА

1998

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................................................................5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................................................................7

Белки тропонинового комплекса и их роль в регуляции мышечного сокращения.....................................7

Tponomml........................................................................................................................................................7

Общая характеристика..................................................................................................................................................7

Участки взаимодействия Tul с актином и ТпС.............................................................................................................8

Участки взаимодействия Tnl с ТпТ............................................................................................................................13

Фосфорилирование Tnl...............................................................................................................................................14

Физиологический эффект фосфоршшрования Tnl.....................................................................................................16

Тропонин Т......................................................................................................................................................20

Структура и изоформный состав тропонина Т...........................................................................................................20

Взаимодействие тропонина Т с тропомиозином...................................................................................................21

Взаимодействие тропонина Т с тропонином 1.......................................................................................................23

Взаимодействие тропонина Т с тропонином С......................................................................................................24

Роль тропонина Т в процессе регуляции мышечного сокращения.............................................................................25

Фосфорилирование тропонина Т................................................................................................................................26

Тропонин С.....................................................................................................................................................28

Общая характеристика и изоформный состав............................................................................................................28

Пространственное строение ТпС................................................................................................................................29

СООН-концевой домен...............................................................................................................................................31

Центральная Ot-спираль..............................................................................................................................................33

ИНг-концевой домен...................................................................................................................................................34

Молекулярный механизм инициации сокращения. Структурные и функциональные различия скелетной и

сердечной изоформ ТпС..............................................................................................................................................36

Участки взаимодействия ТпС с остальными компонентами тонкого филамента......................................................41

Молекулярная модель мышечного сокращения.............................................................................................42

TnI как биохимический маркер инфаркта миокарда....................................................................................45

Моноююнальные антитела и способы определения их эпитопной специфичности...............................52

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................................................................................57

Материалы.........................................................................................................................................................57

Методы...............................................................................................................................................................57

Твердофазный синтез пептидов на целлюлозной основе.............................................................................57

Определение участков взаимодействия антител и Тн1...............................................................................58

Моделирование некроза сердечной ткани.................................................................................................... 59

Иммунофлуориметрия...................................................................................................................................59

ДСН-гель-электрофорез по методу Лэммли (Laemmli, 1970)...................................................................... 60

Вестерн-блоттинг.........................................................................................................................................60

Иммупохимическая окраска белков, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране........................61

Иммобилизация человеческого сердечного ТпС на BrCN-активированной сефарозе.................................61

Исследование взаимодействия Тн1 с иммобилизованным ТпС.....................................................................61

Фосфорилирование Тн1 сАМР-зависимой протеинкиназой..........................................................................62

Определение участков взаимодействия Тн1 с ТпС.......................................................................................63

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ..............................................................................................................64

Синтез библиотеки пептидов TnI и эпитопное картирование моноклональных антител.......................64

Определение участков взаимодействия TnI с TnC.......................................................................................75

Изучение биохимических факторов, оказывающих влияние на взаимодействие TnI с антителами.... 80

Протеолитическая деградация TnI и ее влияние на связывание с моноклональными антителами..........81

Фосфорилирование TnI сАМР-зависимой протеинкиназой и его влияние на взаимодействие с антителами...................................................................................................................................................93

ВЫВОДЫ...............................................................................................................................................................98

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................................................99

БЛАГОДАРНОСТИ.............................................................................................................................................124

Список используемых сокращений

Tnl-Tnl ТпС - ТпС ТпТ - ТпТ

ИП - ингибиторный пептид

АТР - аденозинтрифосфорная кислота

сАМР - цикло -3'-5'-аденозинмонофосфорная кислота

ПКА - сАМР-зависимая протеинкиназа

ПКС — Са2+-фосфолипод-зависимая протеинкиназа

I1KG - cGMP-зависимая протеинкиназа

cGMP - цикло -3'-5'-гуанозинмонофосфорная кислота

ИМ - инфаркт миокарда

СКМВ - изоформа MB креатинфосфокиназы

ФСБТ- фосфатно-солевой буфер, содержащий Твин-20

ДСН - додецилсульфат натрия

ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид

ЭГТА - (Этилендиокси)диэтилендинитрилотетрауксусная кислота

ЭДТА -этилендиаминтетрауксусная кислота

ДТТ-дитиотреитол

МАТ - моноклональные антитела

SРОТ-метод - метод одновременного множественного твердофазного синтеза пептидов на целлюлозной основе

Введение

Циклический процесс сокращения-расслабления поперечно-полосатой сердечной и скелетной мускулатуры позвоночных регулируется, как и многие другие процессы в клетке, изменением концентрации ионов Са2+ внутри клетки. В том случае, когда мышца расслаблена, концентрация ионов Са2+ понижена и составляет « 10"7 М. При повышении внутриклеточной концентрации Са2+ до 10"5-10"4 М происходит инициация сокращения. Важнейшую роль в осуществлении Са2+-зависимой регуляции сокращения играет белковый комплекс, состоящий из трех субъединиц - тропонина И (Тп1), тропонина Т (ТпТ) и ТпС (ТпС), объединенных в эквимолярном соотношении. Тп1 ингибирует взаимодействие актина с миозином в условиях пониженной концентрации Са2+ внутри клетки. ТпС - белок, являющийся сенсором ионов Са2+, при связывании он инициирует цепь конформационных превращений в белках тропонинового комплекса и акгинового филамента, приводящих к деблокированию циклического акто-миозинового взаимодействия. Тп1 и ТпС являются «молекулярными переключателями» процесса мышечного сокращения, точный механизм которого остается до конца невыясненным. Тп1 и ТпС находятся в тесном контакте друг с другом, а характер их взаимодействия изменяется в зависимости от фазы сокращения. Хотя изучение молекулярных механизмов сокращения мышцы продолжается в течение более 30 лет, до сих пор точно не определены участки аминокислотной последовательности Тп1, вовлеченные во взаимодействие с ТпС. В данной работе сделана попытка применить для установления участков контакта этих белков нетипичный метод -исследование библиотеки пептидов одного белка с помощью другого, находящегося в конформации, близкой к нативной. Полученные с помощью этого метода данные в целом подтверждают выводы других исследователей, кроме того, мы описали новый участок взаимодействия сердечных изоформ Тп1 и ТпС, расположенный в N1-концевой части Тп1.

Сердечно-сосудистые заболевания в настоящее время являются самой распространенной причиной смерти в развитых странах. Одним из таких заболеваний является инфаркт миокарда (ИМ), особенностью которого является стремительность развития патологического процесса. Для того, чтобы как можно

раньше начать терапию больного, врач должен располагать точной диагностической информацией о заболевании. В последние годы в диагностике ИМ широко используются некоторые белки клеточного метаболизма и сократительной системы кардиомиоцитов - креатинфосфокиназа, лактатдегидрогеназа, легкие и тяжелые цепи миозина (Keffer, 1996). Врач-кардиолог при постановке диагноза больному руководствуется прежде всего данными биохимических тестов. Однако, до недавнего времени использование биохимических маркеров ИМ было сопряжено со многими трудностями, прежде всего с их недостаточной кардиоспецифичностью. Несколько лет назад английские ученые установили, что увеличение концентрации сердечной изоформы Tnl в сыворотке крови человека свидетельствует о некрозе клеток миокарда (Cummins, 1987). Tnl как биохимический маркер острого инфаркта миокарда обладает рядом уникальных свойств, делающих его лучшим из известных в настоящее время маркеров. В частности, его уникальная кардиоспецифичность и некоторые особенности строения, о которых будет сказано далее, превращают его в уникальный инструмент, с помощью которого врач может поставить диагноз больному с почти стопроцентной достоверностью. Чтобы создать высокочувствительную иммунологическую систему для диагностики ИМ, необходимо не только иметь высокоаффинные антитела, специфичные к сердечной форме Tnl, но и знать участки их взаимодействия с антигеном (эпитопы). Несмотря на то, что исследования Tnl проводятся во многих лабораториях по всему миру, до сих пор неясно, в какой форме белок выделяется в кровь больных с ИМ и как возможная гетерогенность Tnl в крови влияет на достоверность диагноза ИМ. Это приводит к существенным затруднениям при работе с диагностическими системами. Как мы постарались показать в данной работе, на взаимодействие Tnl с моноклональными антителами существенное влияние оказывают по крайней мере два фактора: неспецифический протеолиз Tnl, происходящий в ишемизированном участке сердечной ткани и фосфорилирование Tnl сАМР-зависимой протеинкиназой. Данные факты имеют большое практическое значение при создании новых диагностических систем.

Обзор литературы

Белки тропонинового комплекса и их роль в регуляции мышечного сокращения

Циклический процесс сокращения-расслабления поперечно-полосатой мускулатуры позвоночных контролируется белковым комплексом (Ebashi and Kodama, 1966). Этот комплекс получил название "нативного тропомиозина" (Ebashi and Kodama, 1966). Позднее было показано, что "нативный тропомиозин" может быть разделен на два компонента - тропомиозин и тропонин. Хартшорн и Мюллер продемонстрировали, что тропонин, в свою очередь, может быть разделен по крайней мере на два компонента, которые исследователи назвали тропонинами А и В (Hartshorne and Mueller, 1968). Позднее, Гризер и Гергели (Greaser and Gergely, 1971) разделили белок, названный тропонином, на три субъединицы, названные ими тропонинами I, Т, С. Tnl способен ингибировать АТФазную активность актомиозина. ТпС блокирует ингибирующее действие Tnl, но полное восстановление регуляции мышечного сокращения происходило только в присутствии третьего компонента Тн комплекса -тропонина Т, который способен взаимодействовать с тропомиозином и прикреплять Тн комплекс к актиновому филаменту (Greaser and Gergely, 1971).

Тропонин!

Обииая характеристика

Tnl - белок, осуществляющий ингибирование акто-миозиновой АТФазы в присутствии тропомиозина (Greaser and Gergely, 1971). К настоящему времени описаны три изоформы Tnl в поперечно-полосатой мускулатуре позвоночных - две изоформы в скелетных мышцах (из быстрых и медленных скелетных волокон) и одна изоформа в сердечной мышечной ткани (Syska et. al, 1974, Dhoot et. al, 1978). Tnl состоит из 181-211 аминокислотных остатков, при этом изоформы Tnl сердца имеют больший размер, обусловленный наличием дополнительного приблизительно 30-членного пептида, расположенного в N-концевой части

молекулы белка (Wilkinson and Grand, 1975, Grand et. al, 1976, Wilkinson and Grand, 1978). Tnl - полярный белок с преобладанием положительно заряженных остатков, вследствие этого рассчитанная величина pi составляет «9,9.

Изоформы Tnl кодируются тремя различными генами. Известно, что ген Tnl из сердца человека входит в состав 19-ой хромосомы (MacGeogh et. al, 1991, Bhavzar et. al, 1996) и состоит из 8 зкзонов. Экспрессия генов изоформ Tnl регулируется в зависимости от стадии развития ткани, в которой происходит экспрессия (Gorza et. al, 1993). В сердце зародыша человека экспрессируются как сердечная изоформа белка, так и изоформа из медленных скелетных волокон. После рождения экспрессия скелетно-мышечной изоформы Tnl блокируется, а синтез сердечной изоформы наоборот, стимулируется. Это приводит к тому, что спустя 9 месяцев после рождения в сердце человека экспрессируется только сердечная изоформа белка (Sasse et. al, 1993). Регуляция экспрессии изоформ Tnl происходит на уровне транскрипции, так как изменения количества соответствующих мРНК в клетках миокарда соответствует изменениям количества белка. В противоположность сердцу, в скелетной мышце и в эмбриональном, и в зрелом состояниях экспрессируются лишь скелетно-мышечные изоформы Tnl (Amphlett et. al, 1976).

Как уже отмечалось, главной функцией Tnl является ингибирование АТРазной активности актомиозина (Greaser and Gergely, 1971). Это ингибирование усиливается в присутствии тропомиозина, и полностью снимается в присутствии насыщенного ионами Са2+ TnC (Van Eyk and Hodges, 1988). Таким образом, для понимания механизма функционирования Tnl необходимо подробно проанализировать его взаимодействие с актином, тропомиозином и тропонином С.

Участки взаимодействия Tnl с актином и ТпС.

Для того, чтобы картировать участки Tnl, обеспечивающие его взаимодействие с другими компонентами актинового филамента, Tnl подвергали гидролизу под действием бромциана. Среди фрагментов Tnl скелетных мышц был выявлен пептид, ограниченный остатками 96-116, который сохранял способность интактного белка ингибировать АТРазную активность актомиозина (Syska et. al, 1976). Этот ингибиторный пептид (ИП) подавляет сокращение скинированных скелетных и сердечных мышечных волокон, из которых предварительно был удален

интактный Tnl (Ruegg et. al, 1989, Van Eyk et. al, 1993). Помимо этого ИП сохраняет способность интактного белка взаимодействовать с актином и тропонином С (Syska et. al, 1976). Позднее было установлено, что в структуре Tnl есть еще один дополнительный ингибиторный пептид, ограниченный остатками 140-148 (Tripet et. al, 1997), также способный подавлять АТРазную активность актомиозина. По данным ЯМР первый ингибиторный пептид (остатки 96-116) взаимодействует с остатками 1-7 и 19-44 актина (Levine et. al, 1988), т.е. располагается вблизи участков, обеспечивающих взаимодействие миозина с актином. Положение второго ингибиторного пептида Tnl на молекуле актина остается неизвестным. В литературе отмечают сходство первичных структур двух ингибиторных пептидов Tnl (остатки 101-114 и 121-132) (Pearlstone et. al.,1997). В настоящее время подробно проанализирована роль отдельных аминокислотных остатков в структре первого (главного) ингибиторного пептида Tnl.

Минимальная последовательность, сохраняющая ингибиторные свойства, ограничена остатками 104-115 (Van Eyk and Hodges, 1988, Talbot and Hodges, 1979). Ингибиторные пептиды, полученные из Tnl сердца и скелетных мышц имеют довольно консервативную первичную структуру, тем не менее Tnl скелетных мышц более эффективно ингибирует АТРазную активность актомиозина и сократительную активность скинированных волокон (Talbot and Hodges, 1981b; Ruegg et. al, 1989). Высказывается предположение, что указанное различие обусловлено тем, что в ингибиторном пептиде Tnl сердца есть всего лишь одна неконсервативная замена. В ингибиторном пептиде Tnl скелетных мышц положения 109 и 110 заняты Pro, в то время как в ингибиторном пептиде Tnl сердца гомологичные положения заняты остатками Pro и Thr. Считается, что ингибиторный пептид скелетных мышц 96NQKLFDLRGKFKRPPLRRVRMh6 представляет собой две амфифильных а -спирали, жестко соединенных в виде шпильки дипептидом Рго-109-Рго-110. В случае Tnl сердца две а-спирали ингибиторного пептида обладают большей подвижностью и вследствие этого менее эффективно ингибируют АТРазную активность актомиозина.