Тропонин I как маркер инфаркта миокарда

Катруха, Алексей Генрихович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Тропонин I как маркер инфаркта миокарда
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Тропонин I как маркер инфаркта миокарда"

На правах рукописи

.: ол

<3 1> 1! - J

КАТРУХА АЛЕКСЕЙ ГЕНРИХОВИЧ

ТРОПОНИН I КАК МАРКЕР ИНФАРКТА МИОКАРДА. БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ.

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА

2000

Работа выполнена в отделе биохимии Московского научно-исследовательского института медицинской экологии Комитета здравоохранения правительства г. Москвы

Научный консультант: доктор химических наук, профессор Северин С.Е

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Муронец

доктор биологических наук, профессор Свешнию доктор биологических наук, академик РАМН, член-корреспондент РАН, профессор Ткачук В.А Ведущая организация: Московская Медицинская Академия им.

И.М.Сеченова

Защита состоится «31» мая 2000 года в 11.00 часов на заседании Ученого Совета Д. 171.02.01 при Центре медико-биологических и экологических проблем РАЕН по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра медико-биологических и экологических проблем.

' — \ / '

(

В.В. Отраднова

Автореферат разослан «28» апреля 2000 г.

^ у / , / 1У

/ / I '- '•

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы В настоящее время инфаркт миокарда (ИМ) стоит на

первом месте среди причин смерти, опережая онкологические и инфекционные заболевания. Достоверная и своевременная диагностика ИМ играет важнейшую роль в его терапии. Чем раньше поставлен диагноз и начато терапевтическое или оперативное вмешательство, тем эффективнее будет дальнейшее лечение и благоприятнее прогноз. В последние годы наиболее достоверным признаком наличия у больного ИМ считается биохимический признак - повышение в кровяном русле концентрации белков - маркеров некроза клеток сердечной мышцы. В разное время в этом качестве использовались лактатдегидрогеназа, креатинкиназа, легкие цепи миозина, миоглобин. В 1987 году (Cummins et al, 1987) было предложено для диагностики ИМ использовать сердечную форму тропонина I (cardiac troponin I; cTnl). Tnl - компонент тропонинового комплекса, или просто тропонина, играющего важную роль в регуляции мышечного сокращения. Тропониновый комплекс состоит из трех компонентов, прочно связанных друге другом. Тропонин С (ТпС) - Са2* - связывающий белок, тропонин I - белок, ингибирующий АТФ-азную активность актомиозина и тропонин Т (ТпТ), белок, обеспечивающий прикрепление тропонина к тропомиозину.

Сердечная форма Tnl может быть обнаружена в крови больного уже через 3 - 6 часов после появления первых признаков заболевания, достигает пиковых значений концентрации в течение 16-20 часов и сохраняется в кровотоке длительное время - 6 - 8 дней. Таким образом cTnl может быть использован как для ранней, так и для поздней диагностики ИМ. Важно также отметить, что в отличие от других, использовавшихся ранее маркеров ИМ, концентрация cTnl в крови повышается только в случае развития патологического процесса, связанного с некрозом клеток миокарда. Большое значение имеет и тот факт, что cTnl может использоваться для диагностики микроинфарктов, а повышение его концентрации в крови больных с нестабильной стенокардией имеет прогностическое значение. Все вышесказанное - высокая специфичность, чувствительность, широкий временной интервал в течение которого

cTnl сохраняется в крови больного делают этот белок уникальным маркером ИМ.

Список сокращений: АТФ - аденозинтрифосфорная кисло та, СРС - counts per second; ДМФА -диметилформамид, ДСН - додецилсупьфат натрия, ДТТ - дитиотреитол; ДЭАЭ-целлюлоза -диэтиламиноэтил-целлюлоза; ИМ - инфаркт миокарда; кДа килодальтон; КМ-целлюлоза - карбоксиметил-целлюлоза; МАТ -монокпональные антитела, ТСА ~ Трис-солееой буфер с азидом натрия (20 мМ Tris-HCI, рН 7.8,150 тМ NaCI, 0.1% азида натрия); ТпС-тропонин С; Tnl- тропонин I; cTnl - сердечная изоформа тропонина I; ТпТ- тропонин Т; с ТпТ - сердечная изоформа тропонина Т; ФСБ - фосфатно-солевой буфер (10 мМ фосфат калия, рН 7.5; 150 мМ NaCI); ФСБТ - фосфатно-солевой буфер, содержащий 0.1% теин 20; цАМФ - цикло-аденозинмонофосфорная кислота; ЭГТА - этипенгликоль — бис(/}-аминоэтилловый эфир) - N,N,N',N', -тетрауксусной кислоты; ЭДТА - этилен диамин тетраацетат, 19С7-биот - биотинилированные антитела; 8Е10-Еи - антитела, меченные Ей3*

Несмотря на то, что как маркер ИМ сТп1 известен уже более десяти лет, д последнего времени неразрешенным оставался ряд серьезных вопросов, связанных его применением в этом качестве. Так, например, концентрация этого белка в одном том же образце крови, определенная с использованием различных коммерчески диагностических систем, может различаться на порядок и даже более. Описаны случае когда одна диагностическая система не была в состоянии обнаружить какие-т количества сТп1 в крови больного, хотя другие системы демонстрировали достаточн высокий уровень содержания этого белка в образце. По-разному диагностически системы реагируют на присутствие в исследуемом образце ЭДТА (используется пр сборе образцов плазмы) (Ка1гик11а е1 а1, 1997) или гепарина (применяется ка лекарственный препарат для снижения свертываемости крови) (Ка^икЬа е1 а1, 1999). Во эти факторы долгое время являлись препятствием для широкомасштабного внедрени тропониновых диагностических систем в мировую клиническую практику. Врач предпочитали использовать для диагностики заболевания хотя и менее надежны' (менее чувствительные и специфичные), но хорошо известные, более понятньп диагностические системы для количественного определения миоглобина, МВ изоформь креатинкиназы, лактатдегидрогеназы.

С нашей точки зрения, описанные выше сложности, связанные < использованием уже имеющихся диагностических систем, обусловлены двум: основными факторами. Во-первых, - с недостаточным пониманием того, в како! биохимической форме сТп1 представлен в кровотоке больного. Во-вторых, - < затянувшимся процессом по выработке единого международного иммунологическоп стандарта этого белка. Оба фактора тесно взаимосвязаны. Незнание биохимически: особенностей сТп1, выделяющегося в кровоток больного из пораженной мышцы, ж позволяет осуществить целенаправленный поиск поли- или монокпональных антител которые должны быть использованы при разработке диагностических систем Использование в диагностических системах антител с различной эпитопно! специфичностью может приводить к невоспроизводимости результатов тестировани! одного и того же образца в различных системах. Незнание биохимии анализируемого вещества приводит также к невозможности выбора международного иммунологическоп стандарта. Различные компании используют для калибрования своих диагностически: систем различные формы белка - очищенный сТп1, рекомбинантный сТп1 протеолитические или синтетические фрагменты молекулы. Ответить на вопрос - какав из этих форм полнее отражает свойства белка, тестируемого у больных? - можно толькс хорошо представляя, в какой форме сТп1 находится в пораженной мышце, в како( форме выделяется и в какой форме сохраняется в кровотоке больного с ИМ

Данная работа является одной из первых попыток получения новых и систематизирования уже имеющихся знаний о биохимической природе cTnl, выделяющегося из пораженной мышцы, и белка, циркулирующего в крови. Мы использовали широкий набор биохимических и иммунохимических методов для того, чтобы понять, какие свойства cTnl важны для его детекции в крови больного. Здесь мы предлагаем пути стандартизации как уже имеющихся диагностических систем, так и систем, которые на данный момент находятся на стадии разработки. Наши наблюдения могут послужить основой для создания действительно надежной системы диагностики некроза клеток сердечной мышцы человека, основанной на детекции cTnl в крови больного.

Цель диссертационного исследования.

Целью данной работы является исследование биохимических особенностей cTnl в крови больных с ИМ и использование найденных закономерностей для разработки методологии стандартизации диагностических систем для количественного определения cTnl в крови больных.

Задачи исследования.

В задачи исследования входило:

1. Разработка нового высокоэффективного метода выделения высокоочищенного препарата cTnl из сердечной мышцы человека.

2. Получение моноклональных антител, специфичных к сердечной изоформе cTnl.

3. Проведение точного эпитопного картирования полученных моноклональных антител (МАТ) к cTnl.

4. Изучение факторов, оказывающих влияние на взаимодействие МАТ с cTnl.

5. Исследование процесса деградации молекулы cTnl в сердечной мышце при некрозе.

6. Иммунохимическое исследование cTnl в крови больных с ИМ.

7. На основе полученных моноклональных антител и данных иммунохимических исследований - создание высокочувствительной и специфичной экспериментальной диагностической системы для количественного определения cTnl в крови.

8. Исследование возможности использования тропонинового комплекса в качестве иммунологического стандарта в тропониновых диагностических системах.

Научная новизна работы

В данной работе получила дальнейшее развитие выдвинутая ранее концепция (Cummins et al, 1987) использования cTnl в качестве маркера ИМ, что привело к созданию принципиально нового направления в диагностике ИМ, тяжелого

заболевания, поражающего в настоящее время различные возрастные группы населения.

С точностью до трех аминокислотных остатков определены участки связывания 31 МАТ к сТп! с антигеном, локализованы участки наибольшей иммуногенности молекулы сТп1.

Изучено влияние ряда биохимических факторов на взаимодействие МАТ сТп1.

Изучен процесс деградации молекулы сТп! в сердечной ткани при некрозе. Локализован наиболее устойчивый к воздействию эндогенных протеаз участок молекулы сТп1. Показано, что устойчивость данного участка молекулы обусловлена взаимодействием сТп! с молекулой ТпС.

Изучены некоторые особенности биохимии сТп1 в крови больных с ИМ. Показано, что сТп! в крови больных представлен разнообразными с биохимической точки зрения формами:

- в виде свободной молекулы и в виде комплекса с ТпС;

- в виде целой молекулы и в виде протеолитических фрагментов;

- в виде фосфорилированной и дефосфорилированной форм.

Практическая ценность работы

Разработан новый метод получения высокоочищенного препарата сТп! и других компонентов тропонинового комплекса (ТпС и сТпТ) из сердечной мышцы человека.

Предложен новый метод иммунизации мышей, позволяющий получить высокоаффиные МАТ, в равной степени узнающие, как свободную форму сердечного сТп1, так и сТп! в составе тропонинового комплекса. Полученные монокпональные антитела детально охарактеризованы и могут быть использованы не только для разработки диагностических систем, но и в фундаментальных научных исследованиях.

Даны рекомендации по использованию МАТ к сердечной изоформе Тп1 в диагностике ИМ. Подобраны пары монокпональных антител, одинаково эффективно взаимодействующие со всеми биохимическими формами сТп1, существующими в крови больных ИМ.

Создана высокочувствительная и надежная экспериментальная диагностическая система для количественного определения сТп! в крови больных. Проведены предварительные клинические испытания данной системы, убедительно продемонстрировавшие возможность ее применения в клинической практике.

На базе проведенных иммунохимических исследований предложен новый метод создания стабильного препарата сТп!. Показана целесообразность применения

полного тропонинового комплекса в качестве иммунологического стандарта для калибровки диагностических систем, используемых для количественного определения cTnl в крови.

Апробация работы Основные положения диссертации были доложены на конференции "Laboratory Medicine '95 -11lh European congress of International Federation of Clinical Chemistry" (Tampere, Finland, 1995), на конференции "47,h Meeting of American Association for Clinical Chemistry" (Annahaim, USA, 1995), на конференции "XVI International Congress of Clinical Chemistry" (London, UK, 1996); на конференции "The International Congress on Clinical Enzymology" (Cambridge, UK, 1996), на конференции "Прикладные аспекты исследований скелетных, сердечных и гладких мышц" (Пущино, 1996), на научной конференции, посвященной памяти академика С.Е.Северина (Москва, 1996), на конференции "11th European Congress of International Federation of Clinical Chemistry" (Bazel, Switzerland, 1997); на конференции "49m Meeting of American Association for Clinical Chemistry" (Atlanta, USA , 1997), на конференции "XXVI Nordic Congress of Clinical Chemistry" (Turku, Finland, 1998); на конференции "50th Meeting of American Association for Clinical Chemistry" (Chicago, USA, 1998); на Международной конференции по фундаментальным наукам (Москва, Россия, апрель 1998), на Международном симпозиуме «Биологическая подвижность: современные методы исследования» (Пущино, Россия, август 1998), на 7 Бергемееровской конференции "Markers for Cardiac Damage - Current Status and Future Trends" (Tutzing, Germany, 1999); на на конференции "XVII International Congress of Clinical Chemistry" (Firenze, Italy, 1999), на конференции "Satellite meeting of "XVII International Congress of Clinical Chemistry" - Cardiac markers meeting" (Venecia, Italy 1999), на конференции "51st Meeting of American Association for Clinical Chemistry" (New Orleans, USA, 1999); на конференции "XXIst Congress of the European Society of Cardiology" (Barcelona, Spain, 1999); на VI Российском Национальном Конгрессе "Человек и Лекарство" (Москва, 1999); на конференции "Lancet Conference" (Copenhagen, Denmark, 1999).

Публикации По теме диссертации опубликовано 7 статей в научных журналах и 29 тезисов в сборниках докладов 19-ти конференций.

Структура и объем диссертации Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты работы и их обсуждение и список цитированной литературы. Работа изложена

на_страницах печатного текста и иллюстрирована _рисунками и

_таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы

Сведения, собранные и проанализированные в обзоре литератур воссоздают современное представление о cTnl как компоненте тропониновс комплекса, важнейшего регуляторного компонента мышечной системы, и о роли этс белка в диагностике патологических процессов, связанных с некрозом клеток сердечн мышцы.

Материалы и методы исследования

Получение моноклональных антител С5. Моноклональные антитела С5 получа согласно традиционной методике (Köhler et al., 1970) после иммунизации мышей бычы cTnl.

Образцы ткани. Образцы скелетной и сердечной ткани человека хранили замороженными при температуре -70°С. Все образцы ткани тестировались на налич антител к возбудителю сифилиса, вирусам гепатита В и С, ВИЧ 1 и 2. Аффинная очистка моноклональных антител на PrA-Sepharose и определен, концентрации моноклональных антител. Асцитную жидкость, содержаще моноклональные антитела, обрабатывали 50% сульфатом аммония, центрифугирова) при 5000 g в течение 10 мин. Осадок растворяли в буфере, содержащем 1.5 М глицин pH 8.9, и 3 М NaCI, фильтровали и наносили на колонку с PrA-Sepharos уравновешенную тем же буфером. Элюцию антител субклассов lgG2a, lgG2b и Ige осуществляли 0.1 М цитратным буфером с pH 4.0, а антител класса IgG, тем > буфером с pH 3.0. Концентрацию антител определяли по методу Лоури, используя д] получения калибровочной прямой стандарт поликлональных мышиных антит« (Calbiochem).

Приготовление аффинной колонки для выделения тропонинового комплекс Аффинно очищенные антитела С5 иммобилизовали на BrCN-активированной сефаро: в 0.1 М бикарбонатном буфере, pH 8.5, содержащем 300 мМ NaCI. Получение конъюгата моноклональных антител с биотином. Биотинилировану антител проводили в 0.1 М боратном буфере (pH 8.8) с активированным производны биотина в течение 4 часов при комнатной температуре.

Получение конъюгата моноклональных антител с хелатом европия. Конъюгг моноклональных антител со стабильным хелатом европия получали, инкубир} антитела с 200 - кратным избытком активированного производного хелата в 50 m¡ бикарбонатном буфере (pH 9.8) в течение ночи при температуре +4°С.

Образцы сыворотки. Образцы крови больных с ИМ, нестабильной стенокардией, и здоровых доноров инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут, центрифугировали с охлаждением (5 мин., 5000 д), сыворотку замораживали и <ранили при -20°С.

Твердофазный синтез пептидов. Твердофазный синтез пептидов на целлюлозной матрице проводили с использованием набора реактивов и материалов фирмы xGenosys Biotechnologies» ( Frank, 1992).

Определение участков взаимодействия антител с cTnl. Целлюлозную мембрану с иммобилизованными на ее поверхности пептидами инкубировали в ФСБТ, содержащем сухое молоко (10%) и бычий сывороточный альбумин (3%). Затем мембрану последовательно инкубировали в ФСБТ, содержащем анти-cTnl антитела ¡20 мкг/мл) и 5% лошадиную сыворотку, и в ФСБТ, содержащем вторичные антитела, <онъюгированные с пероксидазой хрена, лошадиную сыворотку и бычий сывороточный альбумин. Для визуализации связывания МАТ с пептидами нами было предложено использовать иммуноферментный метод с усиленной хемилюминесценцией. Моделирование некроза сердечной ткани. Фрагменты сердечной ткани человека [левый желудочек) весом 2 - 3 г инкубировали в 0,15 М растворе NaCI (3:1 вес/объем), годержащем 0,2% NaN3, при 37°С в течение заданных промежутков времени. Образец гкани после инкубации замораживали в жидком азоте и растирали до порошкообразного состояния. Затем белковую фракцию из полученного таким образом препарата экстрагировали буферным раствором (1:10 вес/объем), содержащем 25 мМ грис-HCI, рН 7,5 и ингибиторы протеаз, в течение 5 минут. Суспензию ткани центрифугировали при 5000 g в течение 2 минут, осадок экстрагировали повторно в rex же условиях. Супернатанты после центрифугирования объединяли и добавляли к раствору сухую мочевину до конечной концентрации 6 М. Экстракцию белков из осадка после центрифугирования проводили трижды в тех же условиях буферным раствором, содержащим 50 М трис-HCI, рН 7,5, 6 М мочевину 5 мМ ЭДТА и 10 мМ р-меркаптоэтанол и ингибиторы протеаз. Конечные супернатанты объединяли и хранили при температуре -70°С.

ЦСН-эпектрофорез в полиакриламидном геле проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970). Концентрирующий гель содержал 4% акриламида, разделяющий - градиент концентрации акриламида (7,5 - 15%).

Western blotting. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану после ДСН-гель-

элекгрофореза проводили по методу Товбин с соавторами (Towbiri, et al., 1992).

Иммобилизация ТпС на BrCN-активированной сефарозе. ТпС иммобилизовали на сефарозе 4В по методике, рекомендованной производителем (Pharmacia, Sweden), с некоторыми модификациями.

Исследование взаимодействия фрагментов cTnl с иммобилизованным ТпС. Экстрам белков сердечной ткани (после инкубации при 37°С в течение 8 часов - см. выше наносили на TnC-сефарозу, уравновешенную буфером, содержащим 7 М мочевину, 5( мМ трис-HCI, рН 8,0, 15 мМ р-меркаптоэтанол, 2 мМ CaCI2. Не связавшийся с носителеп материал удаляли, промывая носитель тем же буферным раствором. Элюцию белков связавшихся с аффинным носителем, проводили в том же буфере с добавлением 10 mIV ЭГТА вместо CaCI2. Контрольный эксперимент с сефарозой, не содержащей ТпС проводили в тех же условиях. Белки элюата разделяли методом ДСН-гель электрофореза и переносили на нитроцеллюлозную мембрану методом Western blotting Для визуализации фрагментов cTnl мембрану с иммобилизованными на ней белкам!' обрабатывали MAT 19С7, специфичными к сердечной изоформе cTnl. Фосфорилирование cTnl сАМР-зависимой протеинкиназой. ВысокоочищенныР лиофильно высушенный препарат cTnl растворяли в дистиллированной воде дс конечной концентрации 2 мг/мл. Инкубационная смесь для фосфорилирования содержала 15 мМ MgCI2, 0,5 мМ ДТТ, 0,5 мМ ЭГТА, 50 мкМ АТФ, 0,18 мкКи/мл y-32P-AM<t и цАМФ-зависимую протеинкиназу (60 единиц активности). Реакцию фосфорилирование инициировали добавлением субстрата. Смесь инкубировали, встряхивая, при 30°С е течение 2 часов.

Результаты и их обсуждение Выделение cTnl.

Необходимость разработки нового метода выделения cTnl для нас была обусловлена несколькими факторами. Во-первых, - это недостаточная эффективность описанных ранее методов выделения, которые приводили к существенным потерям белка, что в случае работы с человеческой тканью абсолютно недопустимо. Во-вторых, все описанные ранее методы выделения были разработаны для очистки белка из свежей животной ткани и занимали обычно 3-4 дня. Однако, известно, что cTnl крайне чувствителен к действию протеаз. Крупные протеолитические фрагменты белка мало отличаются от исходной молекулы по своим физико-химическим свойствам, и поэтому разделить смесь нативного cTnl и его фрагментов традиционными методами невозможно. В результате cTnl, выделенный по описанным ранее методам, практически всегда содержит примеси - крупные фрагменты белка.

Поскольку мы не имели возможности получать свежую (постоперационную) сердечную ткань человека, мы вынуждены были работать с трупным материалом. Трупная ткань практически всегда содержит значительные количества (до 50%) протеолитических фрагментов cTnl. Но даже и в тех случаях, когда содержание протеолитических фрагментов в ткани не было существенным, метод выделения

однородного препарата белка должен был быть достаточно быстрым, чтобы до минимума сократить время воздействия эндогенных протеаз на cTnl.

Для определения степени прогеолитической деградации cTnl в сердечной ткани мы использовали иммунохимический метод. Перед началом выделения образец ткани гомогенизировали в буфере для приготовления образцов для ДСН-гель-электрофореза, кипятили в течение 5 минут и наносили на гель с градиентом акриламида 10 -15%. После проведения электрофоретического разделения белки из геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану по методу полусухого Western Blotting и визуализировали антителами клона С5 (Рис. 1), узнающими С-концевую область cTnl. Для дальнейшей работы использовались только те образцы ткани, которые не содержали протеолитических фрагментов cTnl. Схема предложенного нами метода выделения представлена на Рис. 2.

- _ i ::f г, i ■ • ; . <- Продукты прогеолитической

деградации cTnl I

Рис. 1. Предварительное тестирование ткани методом Western Blotting перед началом выделения cTnf. Цифрами обозначены различные образцы ткани.

Отобранную таким образом ткань (100 г) измельчали в гомогенизаторе системы Waring Blendor в течение 30 сек в восьми объемах буфера, содержащего 20 мМ Tris-HCI (рН 7.5), и ингибиторы протеаз. Гомогенат ткани центрифугировали 10 мин. при 10000 g и осадок снова гомогенизировали в том же буфере с добавленным до концентрации 1% тритоном Х-100. После центрифугирования осадок промывали в течение 15 мин. при легком перемешивании буфером, содержащим 150 мМ КН2Р04 (рН 6.5), 0.3 М KCI, 0.2 мМ АТФ, ЮмМ ЭДТА. Отмывка в таких условиях позволяет избавиться от существенной части миозина, затрудняющего работу с экстрактом. Полученную суспензию центрифугировали 30 мин. при 15000 д. Тропониновый комплекс экстрагировали из собранного осадка 800 мл буфера, содержащего 25 мМ Tris-HCI (рН 7.5), 0.7 М LiCI, 5 mM ЭДТА и ингибиторы протеаз при температуре 0°С, при медленном перемешивании в течение одного часа. Полученный вязкий экстр акт центрифугировали 1 час при 20000 д, супернатант собирали, а осадок подвергали повторной экстракции в тех же условиях. После центрифугирования супернатанты объединяли и наносили на аффинную колонку, которая, как это указано в разделе

"Материалы и методы", готовилась на основе BrCN-активированной сефарозы и моноклональных антител С5. Ранее нами было показано, что антитела С5 обладают широкой специфичностью. В Western Blotting антитела С5 "узнавали" как сердечную, так и скелетные формы cTnl карася, курицы, кролика, быка и человека, на основании чего нами был сделан вывод, что зпитопом данных антител является весьма консервативный участок молекулы cTnl.

Предварительное тестирование ткани в Western Blotting

Гомогенизация ткани и отмывки от цитшольиых и части сократительных белков Экстракция тропонинового комплекса

Очистка тролонинового комплекса на колонке с антителами к cTnl

Разделение компонентов тропошшового комплекса на ДЭАЭ- и КМ- целлюлозе

Рис 2. Схема очиски компонентов тропонинового комплекса.

Перед нанесением полученного экстракта аффинную колонку (25x100 мм) уравновешивали буфером, которым экстрагировали тропониновый комплекс. Экстракт наносили со скоростью 100 мл/час, после чего промывали тем же буфером. Тропониновый комплекс элюировали 0.1 М глициновым буфером с рН 2.0. Данные электрофореза (Рис. 3) свидетельствуют, что на этой стадии выделения достигается очень высокая степень очистки тропонина (по расчетам примерно в 200 - 300 раз). Полученный таким образом препарат содержит 85-90% (от содержания в экстракте) тропонинового комплекса с чистотой 70 - 80 %. Важно также отметить, что использование аффинной хроматографии позволило нам получить достаточно чистый препарат тропонина уже через 4-5 часов после начала выделения и свести, таким образом, до минимума время контакта сТп! с эндогенными протеазами.

На следующей стадии элюат с аффинной колонки высаливали 50% сульфатом аммония и центрифугировали при 10000 д в течении 20 мин. Известно, что компоненты тропонинового комплекса настолько прочно связаны друг с другом, что разделить их можно только в присутствии высоких концентраций денатурирующих реагентов таких как мочевина или гуанидинхлорид. Поэтому осадок растворяли в минимальном объеме

буфера, содержащего 20 мМ Tris - HCI, (рН 7.5), 7 М моче вину, 10 мМ ¡3-меркаптоэтанол и 5 мМ ЭДТА и диализовали против этого же буфера в течение ночи. После диализа смесь белков наносили на колонку с DE-52 целлюлозой (Whatman, 25x100 мм), уравновешенную тем же буфером.

сТпТ

Рис. 3 Выделение тропонинового комплекса. ДСН-гель-зпектрофорез. Дорожки 1 и 2- экстракт до нанесений на аффинную колонку, дорожки 3 и 4- элюат с аффинной колонки

12 3 4

cTnl проходил через колонку, не взаимодействуя с носителем, тогда как сТпТ I ТпС элюировали градиентом NaCI (0-0.5 М), приготовленным на буфере нанесения. ' препарату cTnl добавляли ацетат натрия до концентрации 20 мМ, рН доводили до .5 и дочищали на колонке с КМ-целлюлозой (10x20 мм), уравновешенной буфером, одержащим 20 мМ ацетат натрия (рН 4.5), 8 М мочевину, 10 мМ p-меркаптоэтанол и 5 iM ЭДТА. Элюировали белок градиентом NaCI (0.0 - 0.5М), приготовленным на том же уфере. cTnl выходит с колонки при концентрации соли 150 мМ. ДСН-гель-пектрофорез тропонинового комплекса, элюированного с аффинной колонки, и эмпонентов тропонинового комплекса после окончательной очистки представлен на ис. 4.

Следует отметить, что по разработанной нами методике из 100 г сердечно-ышечной ткани обычно удается получить до 20 - 25 мг cTnl, 35 - 40 мг сТпТ и 15 - 20 г ТпС.

Использовавшиеся нами для приготовления аффинной колонки оноклональные антитела С5 "узнают" достаточно консервативный участок молекулы Гп1, характерный не только для сердечной, но и для скелетных изоформ белка, а ¡кже для Tnl многих позвоночных. Поэтому мы успешно использовали данный метод небольшими модификациями) для очистки тропонинов из человеческой скелетной /скулатуры, а также для очистки тропонинов из скелетной и сердечной мышечной ани других видов животных (кролик, коза).

Рис. 4 Очистка компонентов тропонинового комплекс, ДСН-гель-электрофорез.

Дорожки 1 и 5 - тропониновый комплекс после элюции

аффинной колонки.

Дорожка 2-ТпС.

Дорожка 3 - сТп/.

Дорожка 4 - сТпТ.

1 2 3 4 5

Таким образом, предложенный нами новый метод очистки позволяет выделит до 50 - 60 % содержащихся в сердечной мышце тропонинов за очень короткий срок -дня - и получить высокоочищеный препарат сТп1, практически не загрязненны протеолитическими фрагментами. Разработанный нами метод предварительног тестирования дает возможность еще до начала выделения отобрать пригодные дл этого образцы ткани. Кроме этого, благодаря универсальности использованных дл приготовления аффинной колонки моноклональных антител, описанный метод можн применять не только для очистки тропонинов из человеческой сердечной мышцы, но для их выделения из скелетной мускулатуры, а также из сердечных и скелетных ткане других видов животных.

Получение моноклональных антител после иммунизации очищенными препаратами сТп! из сердца быка и человека.

За десять лет работы с Тп1 нами было получено и частично или детальн охарактеризовано более 50 моноклональных антител, специфичных к сердечной форм этого белка. Первые гибридомы были получены после иммунизации мышей бычьи сТл1, следующее поколение гибридом было получено после иммунизации животнь очищенным препаратом человеческого сТп1. Иммунизацию антигеном из сердца бык

мы вынуждены были проводить из-за того, что на начальном этапе работы мы еще не располагали очищенным препаратом cTnl из сердца человека. Две гибридомы, полученные после первых иммунизаций, узнавали также и человеческий cTnl. Антитела клона С5 были нами использованы впоследствии для разработки нового метода очистки белков тропонинового комплекса (см. выше раздел "Выделение cTnl").

Последние, наиболее интересные с точки зрения применения в диагностических системах, моноклональные антитела были получены после иммунизации полным тропониновым комплексом, выделенным из сердечной мышцы человека (см. ниже раздел "Получение нового поколения моноклональных антител к тропонину I").

Концентрация cTnl в крови больных с ИМ находится в области довольно низких значений - в диапазоне от 0.2 до 100 нг/мл. Поэтому необходимо, чтобы моноклональные (или лоликлональные) антитела, используемые при разработке диагностических систем, взаимодействовали с антигеном с достаточно высоким аффинитетом. Аффинитет получаемых антител находится в прямой зависимости от времени, прошедшего с начала иммунизации животного. Поэтому мы разработали протокол иммунизации, рассчитанный на 4 месяца. Как уже было указано ранее, первые два поколения моноклональных антител были получены после иммунизации животных очищенными препаратами сердечного Tnl быка и человека. К концу четвертого месяца после начала иммунизации проводили тестирование животных на содержание антител к cTnl. Клетки селезенки животных с наивысшим титром антител использовали для гибридизации с мышиной миеломной линией Sp 2/0. Полученные клоны гибридных клеток тестировали методом иммуноферментного анализа с преадсорбированным антигеном на взаимодействие с сердечной формой Tnl, а затем положительные клоны проверяли на взаимодействие со скелетными формами белка. Отбирали клоны, не имеющие перекрестного взаимодействия со скелетным Tnl. После этого клетки дважды рекпонировали методом предельных разведений. Устойчивые клеточные линии наращивали до количества 5x106 - 107 клеток и вводили внутрибрюшинно мышам линии BALB/C для получения асцитной опухоли. Антитела из асцитной опухоли очищали на РгА - Sepharose и хранили в фосфатно - солевом буфере с 0.1 % азидом натрия до использования. После очистки специфичность моноклональных антител была еще раз подтверждена методом Western Blotting. Полагают, что после проведения ДСН-гель электрофореза и переноса на нитроцеллюлозу белок теряет свою вторичную и третичную структуру. Однако, все полученные нами моноклональные антитела взаимодействовали с cTnl, перенесенным на нитроцеллюлозную мембрану. Это позволяет нам предположить, что ни одно из исследуемых моноклональных антител не взаимодействует с информационными

детерминантами; все МАТ "узнают" только линейные участки молекулы.

В результате проделанной работы нами было получено 12 гибридом, продуцирующих антитела, специфичные к сердечной изоформеТп! человека.

Попытка создания диагностической системы для количественного определения сТп! в крови больных с ИМ.

Для создания диагностической системы мы использовали идею "сэндвич"-иммунофлуоресцентного анализа. Схематично принцип такого анализа изображен на Рис. 5.

Рис. 5. Схема иммунофлуоресцентного анализа, использовавшаяся при разработке диагностической системы.

Из всех полученных моноклональных антител, а также антител клона 414 (компания HyTest, Finland) готовили следующие конъюгаты:

а/, моноклональное антитело - производное биотина; б/, моноклональное антитело - стабильный хелат европия; Биотинилированные антитела использовали в качестве подложки, а антитела, меченые европием - как детекторные.

Для постановки эксперимента применяли планшеты с преадсорбированным стрептавидином. В лунку 96-ти луночного планшета одновременно вносили раствор биотинилированных и Eu-меченых антител и антиген, растворенный в нормальной человеческой сыворотке. Смесь антител с антигеном инкубировали 30 мин. при комнатной температуре при активном перемешивании. При этом биотинилированные антитела связывались со стрептавидином, и в случае, если антитела имели различные эпитопы, образовывался "сэндвич". После этого планшет отмывали от несвязавшегося материала, добавляли раствор, усиливающий флуоресцентный сигнал и флуоресценцию измеряли на 1234 DELFIA ® флуориметре. Все полученные антитепа были протестированы в таком эксперименте как в качестве подложки, так и в качестве детекторных антител. В результате проведенного исследования нам удалось: - составить карту эпитопов полученных антител (Рис. 6);

- выбрать пары антител, дающие наиболее сильный сигнал при такой постановке эксперимента.

Как видно из Рис. 6, полученные нами моноклональные антитела взаимодействовали с тремя индивидуальными и двумя перекрывающимися эпитопами.

Для дальнейшей работы были отобраны десять пар антител, для которых обнаружена наивысшая чувствительность при раститровке антигена. На основе этих пар антител были созданы иммунофлуоресцентные системы с чувствительностью не ниже 0.1 нг/мл и линейным участком калибровочной прямой от 0.2 до 100 нг/мл.

Пара антител а

Рис. 7 Измерение концентрации сТп! в крови одного и того же больного в двух различных системах

Время после начала приступа (часы)

Несмотря на то, что все выбранные для дальнейшей работы пары антител давали вполне удовлетворительные результаты при работе с очищенным препаратом белка, предварительные клинические испытания с образцами крови больных поставили перед нами ряд вопросов. На Рис. 7 представлен график, демонстрирующий кинетику изменения концентрации сТп1 в крови больного с ИМ. Концентрацию сТп1 измеряли с помощью двух разных диагностических систем.

Как следует из рисунка, концентрация сТп1, определенная в одном и том же образце крови, но с использованием различных диагностических систем (откалиброванных по единому стандарту), по непонятным для нас причинам различалась в несколько раз. К этому моменту и в клинической литературе появились сообщения с аналогичными данными, полученными при использовании коммерческих диагностических систем.

Исследование биохимических свойств сТп! в крови больных с ИМ.

Неоднозначные результаты, полученные при измерении концентрации сТп! в крови больных с ИМ с использованием различных диагностических систем, поставили перед нами задачу выяснения причин наблюдаемых нами явлений. Мы предположили, что антитела, использовавшиеся нами для конструирования диагностических систем по-разному "узнают" очищенный препарат сТп1 и сТп1, который находится в крови больных с ИМ. Чтобы понять, какие пары антител можно использовать для создания диагностической системы, прежде всего необходимо было выяснить - в какой биохимической форме сТп! находится в крови больных и какие факторы могут повлиять на взаимодействие антител с антигеном.

В Таблице 1 представлены факторы, которые, на наш взгляд, могут оказывать влияние на взаимодействие антител и антигена.

Таблица 1

Посттрансляционная модификация Как может влиять на взаимодействие антител с антигеном

Формирование комплекса с сТпТ и ТпС Изменение конформации сТп! Экранирование части эпитопов

Частичная деградация молекулы сТп! под действием эндогенных протеаз в процессе некротизации ткани Изменение первичной структуры и конформации сТп! Потеря части эпитопов

Фосфорилирование 5ег-22 и Эег-23 цАМФ-зависимой протеинкиназой Изменение конформации сТп! Изменение части эпитопов

Образование комплексов с отрицательно заряженными макромолекулами (гепарин) Изменение конформации сТп! Экранирование части эпитопов

Наиболее важным из перечисленных выше факторов, на наш взгляд,

является взаимодействие сТп! с ТпС. Известно, что образование комплекса между двумя этими белками (особенно прочного в присутствии ионов кальция) приводит к существенным изменениям в конформации молекулы сТп1. Изменение конформации может оказывать серьезное влияние на взаимодействие антител с антигеном (01асЬ е1 а1, 1994). Кроме этого ТпС, формируя комплекс с сТп1, может создавать пространственные затруднения для взаимодействия моноклональных антител с их эпитопами на поверхности сТп!.

комплекса сТп! - ТпС на взаимодействие исследуемых нами антител с антигеном, был поставлен эксперимент, схема которого представлена на Рис. 8. Во всех исследуемых системах измерялся уровень сигнала при добавлении а) сТп1; б) сТп1, преинкубированного с 6-ти молярным избытком ТпС в присутствии ионов кальция; в) сТп1, преинкубированного с 6-ти молярным избытком ТпС в присутствии 5 мМ ЭДТА. Результаты этого эксперимента представлены на Рис. 9.

Рос. 8 Схема эксперимента по исследованию влияния ТпС на взаимодействие антител с сГп/.

сТп1 и смешивали с избытком ТпС и преинкубировали в присутствии ионов Саг*. Влияние образования бинарного комплекса на взаимодействие сТп1 с МАТ исследовали, используя "сэндвич" иммунофлюоресцентный метод.

Как видно из Рис. 9, практически все пары антител (за исключением двух) реагировали на добавление ТпС к раствору сТп1. Для одних пар, например 7Р4 -10В11, это выражалось в увеличении сигнала, что, очевидно, можно объяснить положительным влиянием конформационных изменений сТп1 при формировании комплекса с ТпС на эпитоп одного из антител. Для большинства же исследовавшихся пар антител образование бинарного комплекса приводило к снижению (в нескольких

Для того, чтобы проверить, оказывает ли влияние формирование бинарного

10000

Ь)

а, О

0 ч 1 2 3 4 } 6 7 8 9 10

Еи-МАЬя 10В и 414 2 А 3 П1В11 8Е10 414 7« 414 7Г4 414

В ¡о 1-М АЬ £ 7« 7 Р4 2 АЗ 10 Г4 111Г4 10Г4 8 ЕЮ 10В11 10В11

Рис. 9. Влияние ТпСна связывание антител с сТп1.

Светло-серые столбики - сигнал, полученный при добавлении в систему сТп1; темно-серы: столбики - добавлен сТп1, преинкубированный с ТпС в присутствии Са2*, белые - сТт преинкубированный с ТпС в присутствии ЭДТА.

случаях весьма существенному) уровня сигнала. Так, например, для пары антител 7Р4 414 мы наблюдали только 3% от исходной иммунологической активности пр1 добавлении ТпС. Связывание кальция при добавлении ЭДТА приводит к ослабленик взаимодействия между ТпС и сТп1, и, как следствие, к восстановлению исходного уровн! сигнала для большинства пар антител. На основании полученных данных нами был; предложена схема влияния ТпС на взаимодействие антител с сТп1, представленная н; Рис. 10. Как видно из этого рисунка, при образовании бинарного комплекса ( присутствии ионов кальция, ТпС закрывает (или существенно видоизменяет) участо! связывания антител 414 и частично изменяет участки связывания ряда других антител В отсутствии ионов кальция взаимодействие между двумя белками становится не такил прочным и ТпС частично экранирует (видоизменяет) только участок связывания 41' антител.

Как следует из Рис. 9, для нескольких пар антител (например, 7Р4 -414) образование бинарного комплекса препятствует взаимодействию антител < антигеном. Следовательно, такие пары антител можно использовать для измерена только свободного сТп1. В то же время пары антител, на которые образование комплекс; не оказывает влияния или исходный уровень сигнала восстанавливается после добавления ЭДТА, можно использовать для измерения концентрации общего (ка! свободного, так и в форме комплекса с ТпС) сТп!.

+Са2*

-Со2

Рис. 10 Влияние тропонина С на эпитопы монокпональных антител в присутствии (А) и отсутствии (В) ионов кальция.

До последнего времени оставалось невыясненным, в каком виде (свободная молекула или комплекс с ТпС) сТп! попадает в кровоток больных с ИМ. Для разрешения этого вопроса мы использовали две пары антител - 7Р4 - 414 и 10Р4 - 7Р4 (в присутствие ЭДТА) - чтобы провести измерения, соответственно, свободного и общего сТп! в крови больных с ИМ. Результаты тестирования сыворотки крови одного из наиболее характерных больных с ИМ, приведены на Рис. 11. Из этого рисунка следует, что основная часть сТп! в крови больных с ИМ присутствует в виде комплекса

Полученные данные носят косвенный характер, так как были получены с использованием МАТ, специфичных только к сТп1. Для исследования содержания комплексной формы сТп! в крови больных мы применили идею "смешанной" "сэндвич" - иммунофлуоресцентной системы, основанной на использовании в качестве антител подложки МАТ к сТп! (МАТ 19С7 - третья генерация антител к сТп1, см. ниже), а в качестве детекторных антител - МАТ к ТпС (МАТ 7В9), одинаково эффективно узнающих как свободную форму ТпС, так и связанную с сТп! (Рис.12А). В результате была получена высокочувствительная иммунофлуоресцентная система с участком линейности от 0.05 до 100 нг/мл, чувствительностью 0.03 нг/мл (по сТп! в составе комплекса) (Рис. 12Б) и не узнающая свободные формы обоих белков (данные не приводятся). Для калибрования обеих систем мы использовали полный тропониновый комплекс, выделенный из сердечной мышцы человека.

с ТпС.

Рис. 11 Изменение концентрации свободного (-о-) и общего (-О-) сТп1 в крови больного с ИМ, проведенное с использованием двух различных диагностических систем (7Р4-414 и 10Р4-7Р4).

Используя такую новую иммунофлуоресцентную систему, а также систему для определения концентрации сТп1, мы протестировали сыворотки двадцати больных с подтвержденным диагнозом "ИМ". У всех больных концентрация сТп! в составе бинарного комплекса с ТпС равнялась (или была незначительно меньше - на 5 - 10 %) концентрации сТп1, измеренной с помощью сТп1-специфичной диагностической системы (Рис. 12В). Таким образом, мы смогли подтвердить ранее полученнные нами данные, свидетельствующие о том, что основная часть сТп1 выделяется в кровоток больного в виде комплекса с ТпС. Кроме того, полученные результаты являются обоснованием возможности использования такой "смешанной " диагностической системы для детекции сТп! в крови больных с ИМ.

™ о 20 <0 60

Концентрация сТп||нг/м1* Время после ИМ (часы)

Рис 12. А. Схематическое изображения смешанного "сэндвича'. Б. Калибровочная кривая для полученной диагностической системы. В. Измерение концентрации сТп/ (-г) и сТп! в комплексе с ТпС (- <*■) в крови больного с ИМ.

Известно также, что в сердечной мышце сТп1 находится в комплексе не только с ТпС, но и с сТпТ. Поэтому очень важно было исследовать, сохраняется ли и этот комплекс в крови больного. По аналогии со смешанным "сэндвичем" для детекции комплекса сТп1 - ТпС, нами была создана новая иммунофлуоресцентная система для количественного определения бинарного комплекса сТп1 - сТпТ. Для этого, так же, как и в предыдущем случае, в качестве антител подложки использовали анти-сТп1 МАТ 19С7, а в качестве детекторных антител - анти-сТпТ МАТ, "узнающие" как свободную форму белка, так и сТпТ в составе тропонинового комплекса. Исследования сывороток больных с использованием такой диагностической системы показали, что примерно в 60% случаев концентрация комплекса сТп! - сТпТ в крови больных была ниже предела чувствительности системы (0.25 нг/мл по сТп1). Примерно в 40% исследованных образцов мы наблюдали некоторое увеличение концентрации такого комплекса в крови больного, совпадающее по времени с пиком концентрации сТп1. Однако, даже в области максимальных значений молярная концентрация комплекса составляла 5 - 10% от концентрации сТп! (Рис.13). Таким образом, нами впервые было показано, что в отличие от комплекса сТп! - ТпС, комплекс сТп! - сТпТ не сохраняется (или практически не сохраняется) в крови больного, и, очевидно, основная часть сТпТв крови больных находится в свободной форме.

О 10 20 30 40 50 ео 70

Время после начала приступа (часы)

Рис 13. Изменение концентрации сГл/ (- • -) и сТп1 в комплексе с сТпТ (■ я •) в крови больного с ИМ.

Полученные результаты имеют большое практическое значение. Теперь стало очевидно, что если разработчики диагностической системы при работе с очищенной формой сТп! отдадут предпочтение паре антител типа 7Р4 - 414, то такая

система будет выявлять в крови больного только незначительную часть антигена и, соответственно, чувствительность такой системы может оказаться недостаточной для детекции сТп1 при микроинфарктах, когда его концентрация в крови находится в диапазоне от 0.5 до 5 нг/мл.

Получение нового поколения монокпонапьных антител ктропонину I.

Таким образом, нами впервые было показано, что основная часть сТп1, выделяющегося в кровоток больного при ИМ, представлена в виде комплекса с ТпС. Поэтому, некоторые моноклональные антитела, полученные после иммунизации мышей очищенной формой сТп1, не "узнают" белок в крови больных. Следовательно, для создания надежной, высокочувствительной диагностической системы необходимо использовать высокоаффинные МАТ, одинаково взаимодействующие как со свободной формой белка, так и сТп1 в комплексе с другими тропонинами. Для увеличения вероятности получения антител с заданными свойствами мы предложили проводить иммунизацию животных не очищенным препаратом сТп1, как это было принято ранее, а сТп1 в форме тройного комплекса с сТпТ и ТпС, выделенного непосредственно из сердечной мышцы человека.

Лунки, содержащие гибридомные клоны

V (кулыуральная среда. Ееоированне)

Наличие антител к сердечному тропониновому комплекту

4" (положительные)

Наличие антител к сердечному тропонину I

4 (положительные) Наличие антител к скелетному тропонину I

4 (офииаюльлые)

Наличие антител к сердечным тропошшам Т и С

(огрштельные)

Двукратное реклонированне 1

Наращивание м замораживание

Рис.14. Схема тестирования и отбора гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к сердечному тропонину I в составе тропонинового комплекса.

Иммунизацию мышей линии BALB/c проводили в течение четырех месяцев. На первом этапе внутрибрюшинно вводили 0.05 мг белка в полном адьюванте Фрейнда, после чего трижды с периодичностью в один месяц вводили такое же количество белка в неполном адьюванте. Заключительные две иммунизации (без адьюванта) проводили за семь и за два дня до забора селезенки.

Гибридизацию спленоцитов с клетками миеломной линии Balb/c осуществляли по традиционной методике, а тестирование полученных гибридомных клеток - по схеме, представленной на Рис.14.

Таким образом, было получено 16 гибридом, продуцирующих антитела, "узнающие" cTnl как в свободном виде, так и в составе тропонинового комплекса.

Предложенная схема иммунизации и тестирования полученных клонов оказалась удачной еще и потому, что одновременно нами были получены гибридомы, продуцирующие МАТ к сТпТ (6 клонов) и кТпС (4 клона).

Эпитопное картирование cTnl Для эпитопного картирования cTnl мы использовали недавно разработанный метод твердофазного синтеза библиотеки линейных пептидов, представляющих полную последовательность исследуемого белка. Молекула cTnl из сердца человека состоит из 209 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 23,9 кДа (Bhavzar et el., 1996). Нами были синтезированы две библиотеки пептидов cTnl, состоящие из 67 десятичленных пептидов. Каждый пептид отличался от предыдущего сдвигом на 3 аминокислотных остатка от N-конца вдоль аминокислотной последовательности cTnl (Рис.15). Отличие первой пептидной библиотеки от второй заключалось в том, что во второй библиотеке аминокислотные последовательности иммобилизованных пептидов отличались от аналогичных пептидов первой серии сдвигом на 1 остаток от N-конца, что дало нам возможность более точно определить эпитопы исследуемых антител.

Пептиды первой серии

1 10 20

ADGSSDAAREPRPAPAPIRRRS...

ADGSSDAARE SSDAAREPRP AAREPRPAPA EPRPAPAPIR PAPAPIRRRS

Пептиды второй серии

2 10 20 DGSSDAAREPRPAPAPIRRRSS...

DGSSDAAREP

SDAAREPRPA AREPRPAPAP PRPAPAPIRR APAPIRRRSS

Рис.15. Схема, иллюстрирующая взаимное расположение пептидов сТл/ на целлюлозной мембране.

Синтез осуществлялся методом конденсации с использованием производных аминокислот, защищенных с 1\1-конца флуоренилметилоксикарбонильной группировкой, а с С-конца - активированных пентафторфениловым эфиром. Использованная в наших экспериментах целлюлозная мембрана была предварительно обработана таким образом, что в определенных местах (круглые пятна диаметром » 5 мм) к гидроксильным группам целлюлозы были ковалентно присоединены дипептиды аланина, служившие матрицей для дальнейшего синтеза. Наращивание пептидной цепи проводилось одновременно для всех пептидов. Цикл присоединения одной аминокислоты состоял из следующих стадий: (Рис.16).

Снятие 1\1Н2-защитной группы

Активированная аминокислота

конденсация

Блокировка непрореагировавших амино-групп

Удлиненный на одну аминокислоту пептид--

Рис.16. Схема пептидного синтеза по методу Франк (Frank, 1992).

Снятие N-защитной группы осуществлялось путем инкубации мембраны в 20% растворе пиперидина в диметилформамиде (ДМФА), блокировка непрореагировавших свободных аминогрупп пептида - путем ацетилирования 4% уксусным ангидридом в ДМФА. Степень протекания реакции конденсации качественно оценивали в конце каждого цикла используя 0,01% раствор бромфенолового синего в ДМФА.

После полного завершения синтеза целлюлозную мембрану в течение 1 часа инкубировали в 50% трифторуксусной кислоте в дихлорметане с добавлением 2,5% триизобутилсилана с целью полного деблокирования концевых NH2-rpynn и боковых цепей некоторых аминокислотных остатков. Исследование взаимодействия пептидов с МАТ проводили с использованием иммуноферментного метода с усиленной хемилюминесценцией, который отличается высокой чувствительностью. Пептиды, вступающие во взаимодействие с определенными антителами, были видны на

рентгеновской пленке как темные пятна (Рис.17). В контрольном эксперименте исследовалось взаимодействие вторичных антител с иммобилизованными пептидами. В условиях эксперимента неспецифического связывания вторичных антител с пептидами не наблюдали. Удаление иммунных комплексов с поверхности мембраны (регенерацию) проводили, инкубируя ее в течение 30 мин. в 50 мМ трис-НС1, рН 8,0, 100 мМ р-меркаптоэтаноле и 2% ДСН при температуре 95°С.

Рис.17. Определение участка связывания антител 10G4 с сТЫ . Затемненные области соответствуют пятнам №6 и 7, последовательности соответствующих пептидов - i7PIRRRSSNYR2t 20RRSSNYRA YA2S. Участок, представляющий собой пересечение этих последовательностей feoRRSSNYRjs), является эпишопом для антител 10G4.

Полученные нами результаты эпитопного картирования 31 МАТ к cTnl свидетельствуют о том, что большинство (90%) исследованных антител взаимодействуют с линейными участками последовательности cTnl. Длина эпитопных участков для большинства антител составляла 3-10 аминокислотных остатков, что хорошо согласуется с литературными данными. Составив эпитопную карту cTnl, мы смогли определить фрагменты первичной структуры белка, обладающие наибольшей иммуногенностью. Это участки, ограниченные остатками 16-30, 85-91, 189-195 (Рис. 18).

Участки наибольшей иммуногенности, определенные нами, в целом совпадают с районами высокой гидрофильности, вычисленными с использованием компьютерной обработки первичной структуры cTnl (данные не приводятся). Характерно, что наибольшее количество эпитопов находится внутри участка 1-31, являющегося уникальным для сердечной изоформы Тп! и обладающего высокой подвижностью (Dong et al., 1997).

Рис. 18. Схема расположения эпитопое МАТ к сТп1. Для сравнения приведены первичные последовательности двух скелетных изоформ Тп1.

Используя экстракты сердечной ткани мы протестировали часть полученных антител на перекрестное взаимодействие с сТп1 различных видов позвоночных животных (Таблица 2). Исследования показали, что большинство протестированных

Таблица 2

Клок Изотнп Локализация эпитопа Взаимодействие ссерд ечной формой Ты других видов животных (Western blottinq)

Бык Свнья k'ma Cofia ta К|МИ4К Кошка Крыса Мьшп. Pi. Ля

1UBII 1ЙС1 16-APÍRR-20 + - + - + + + + -

J6FI lgC2b 20 • RRSSN • 24 ++ + *

22В11 IgGZb 20 • RRSSN • 24 ■ + * *

4С2 ICG2a 23 • SNYRAYA - 29 •н- ++ ++ ++ ++ •и- + ++ ++

14G5 IgGl 25 • YRAYA - 29 + + + + + + + + +

AG6 IEG2- 25 • YRAYATEP - 32 ++ 4-f -И- ++ ++ ++ ++ ■Н- ++

1(1 F4 IcC2a 54 • AKKK • 37 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +

19С7 lgG2b 41 •SASRKLQLK-49 ++ -М- + ++ + ++ ++ ++ + ++

414 ICGI 56 - AKQELE - 61 + + + - + + + +

8Е10 IgGl 87 • LGFAE - 91 + + + + + + +

lfl All ikgi 87 • LGFAE - 91 + + + + + + + -

17F3 iggl 88 - GFAE - 91 + + + + + -

1SH7 IEGI 102 • RVDKVDE - 108 + + + + + + + + +

fiFV IcG2a 189 - dwrknid - 195

4А2 IgGl 189- DWRKNIDALS- 198 + + + + + + + + +

7F4 IEGI 190 • WRKNIDA - 196 + + + + + + + +

антител узнает достаточно консервативные участки молекулы cTnl. Наиболее консервативными оказались эпитопы MAT 19С7 и 6F9. Эти антитела взаимодействовали с сердечной формой cTnl всех протестированных видов животных, включая cTnl из сердца рыб. Таким образом, большинство полученных антител может быть использовано для проведения исследований не только cTnl из сердца человека, но и тропонинов других видов животных.

Протеолитическая деградация cTnl в некротизированной сердечной ткани и ее влияние на взаимодействие cTnl с антителами.

сТп! крайне нестабилен и легко подвергается протеолитической деградации. Гибель клеток во время ИМ сопровождается разрушением мембранных структур, в том числе лизосом, и освобождением разнообразных протеаз, вызывающих расщепление многих белков, в том числе cTnl. В каком виде - в виде нативной молекулы или в виде протеолитических фрагментов cTnl выделяется в кровоток больных с ИМ, до недавнего времени оставаось невыясненным. Потеря белком части первичной последовательности в результате протеолитического расщепления может привести к тому, что некоторые моно- или поликлональные антитела, имеющие эпитопы на удаленном фрагменте, перестанут узнавать белок, циркулирующий в кровотоке. Это в свою очередь может привести к тому, что диагностическая система, использующая такие антитела, будет давать заниженные или ложноотрицательные результаты при тестировании образцов крови больных. Для выяснения того, в какой форме cTnl попадает в кровоток, мы смоделировали процесс некротизации сердечной мышечной ткани человека, протекающий in vivo как следствие ишемии миокарда. Фрагменты левого желудочка сердца человека инкубировали при 37°С в течение заданных промежутков времени. Затем белки экстрагировали вначале буферным раствором с низкой ионной силой, содержащим ингибиторы протеаз, а затем буферным раствором 50 мМ трис-HCI, рН 7,5, содержащим также 6 М мочевину, 5 мМ ЭДТА и 10 мМ р-меркаптоэтанол и те же ингибиторы протеаз.

Для исследования cTnl в полученных экстрактах сердечной ткани использовался метод иммунофлуоресцентного анализа и Western blotting. Иммунологическая система была построена по «сэндвич»-типу и включала пары антител, антигенные детерминанты которых расположены в различных частях молекулы cTnl.

Из полученных нами результатов (Рис. 19) следует, что иммунологическая активность cTnl в некротической ткани не остается постоянной. Мы наблюдали существенное снижение активности уже в первые часы после начала инкубации. При

Время ИНкЛ&ЦМ (<вкы)

А Б

Рис. 19. Стабильность cTnl в экстракте сердечной ткани человека, измеренная в

всэндвичи-системе с помощью разных пар антител. -..... 18Н7-6иот - 16А11-Еи, - -г - 19С7-

биот - 16А11-Еи, - я - 7F4-6uom - 16A11-EU, - - - 14G5-6uam - 16А11-Еи, - * - 14G5-6uom - 7F4-Eu (А). Схема, демонстрирующая расположение эпитопов МАТ, использованных в эксперименте (Б).

этом отчетливо прослеживается зависимость изменений иммунологической активности от локализации эпитопов антител. Менее всего (40% от первоначального уровня через двадцать часов инкубации) изменилась иммунологическая активность cTnl в иммунофлуоресцентных системах с двумя антителами, эпитопы которых находятся в области остатков 41-109 (18Н7-16А11 и 19С7-16А11) - центральной части молекулы cTnl. В то же время активность cTnl, измеренная с использованием пар антител 14G5-16А11 или 7F4-16А11 (одно из МАТ узнает центральную часть молекулы, другое - N- или С- концевые участки), резко уменьшается с течением времени и через 20 часов инкубации составляет всего 5-10% от первоначального уровня. Наименьший уровень иммунологической активности cTnl был обнаружен в системе 14G5-7F4, в которой оба МАТ специфичны к периферийным участкам молекулы cTnl. Мы предположили, что при инкубации cTnl в условиях, моделирующих некроз миокарда, происходит расщепление белка преимущественно по участкам, расположенным в N- и С-конце молекулы, тогда как центральная часть в меньшей степени подвержена протеолизу. Существование неспецифического протеолитического расщепления в С-концевом участке молекулы cTnl косвенно подтверждено и в недавней работе немецких исследователей (Ardelt et al., 1998).

Для подтверждения гипотезы о более высокой стабильности центрального участка молекулы cTnl по сравнению с N- и С- концевыми частками молекулы, мы исследовали cTnl и его фрагменты в экстракте некротизированной ткани сердечной мышцы человека. Белки экстракта сердечной ткани, инкубированной в течение 8 часов

при 37°С, разделяли методом гель-электрофореза по Лэммли и переносили на нитроцеллюлозную мембрану методом Western blotting. Используя в качестве инструмента для детекции cTnl и его фрагментов МАТ различной эпитопой специфичности (центральная часть, N- и С- концы молекулы), мы убедительно показали, что, действительно, различные участки молекулы имеют различную устойчивость к воздействию эндогенных протеаз. Как следует из Рис. 20 антитела различались в своей способности узнавать различные протеолитические фрагменты cTnl. MAT 10F4, 19С7, 414, 16А11, эпитопы которых ограничивают область аминокислотной последовательности 34-91, взаимодействуют с наибольшим количеством пептидов ( >7 ), среди которых есть и пептиды с молекулярной массой менее 10 kDa. В свою очередь, антитела, специфичные к концевым участкам молекулы взаимодействуют, в основном, только с весьма крупными пептидами. Таким образом, наши исследования потверждают предположение о том, что центральная часть молекулы cTnl является наиболее устойчивой к действию протеаз по сравнению с N- и С-концевыми участками.

M.W.M.

Рис. 20. Взаимодействие протеолитических фрагментов сГл/ с разными МАТ. Фрагмент миокарда инкубировали при 37°С в течение 8 часов, белки экстрагировали и разделяли методом гель-электрофореза. После переноса на нитроцеллюлозную мембрану сТп/ и его фрагменты прокрашивались различными МАТ. Снизу представлено схематическое изображение локализации эпитопов МАТ, использовавшихся в эксперименте; стелками показаны полоски нитроцеллюлозы, прокрашенные соответствующими антителами. Положения маркеров молекулярных масс указаны стрелками слева, а наиболее значимые пептиды - стрелками справа.

В описанном выше эксперименте мы исследовали экстракт ткани, которую инкубировали в условиях, имитирующих некроз миокарда, в течение 8 часов. Уже через этот короткий период времени большая часть сТп! в ткани представлена

протеолитическими фрагментами с молекулярными массами от 10 до 28 кДа. Таким образом, результаты наших исследований позволяют предположить, что через 20 - 30 часов после приступа большая часть cTnl в сердечной ткани и крови больного будет представлена не целой молекулой, а ее протеолитическими фрагментами.

Вопрос - в какой форме - в виде целой молекулы или ее протеолитических фрагментов находится cTnl в крови больных в различные периоды времени после начала заболевания, до недавнего времени оставался открытым. Для исследования этого вопроса мы измерили концентрацию cTnl в серийных образцах сыворотки крови больных с использованием двух экспериментальных диагностических систем, различающихся по эпитопной специфичности МАТ (Рис. 21). Диагностическая система, основанная на использовании антител 19С7. - 8Е10 - пригодна для измерения как целого cTnl, так и его фрагментов. Эпитопы антител 19С7 и 8Е10 находятся внутри наиболее стабильного участка белка - в районе 40-91 остатков. Другая диагностическая система -14G5 - 7F4 - пригодна для измерения концентрации только интактного белка, так как эпитопы этих антител расположены в крайних N- и С-концевых районах последовательности cTnl, которые, как это было показано нами ранее, наиболее подвержены протеолизу. В течение первых 4-8 часов после начала заболевания концентрация cTnl, измеренная с помощью двух систем, была приблизительно одинаковой. Однако, с течением времени увеличивалось различие в численных значениях концентраций cTnl, определяемых с помощью этих систем. Через 60 часов после начала приступа концентрация cTnl, измеренная с использованием диагностической системы 19С7 - 8Е10 была в 3 и более раз выше, чем концентрация белка, полученная при использовании системы 14G5 - 7F4.

Таким образом, полученные данные подтверждают наше предположение о быстром протеолизе cTnl in vivo в пораженном участке сердечной мышцы. Важно отметить,что уже через 50 - 70 часов после начала приступа около 70% белка присутствует в крови больного в виде протеолитических фрагментов.

Одним из основных преимуществ cTnl по сравнению с другими биохимическими маркерами ИМ является возможность его применения как для ранней, так и для поздней и очень поздней диагностики заболевания. cTnl может быть обнаружен в крови больного существующими биохимическими методами через 5-7 дней после начала заболевания, в то время как наиболее широко распространенные маркеры ИМ миоглобин и MB изоформа креатинкиназы достигают значений, характерных для нормы, через 1 и 2 дня, соотетственно. Результаты наших исследований свидетельствуют, что создание надежной системы для поздней диагностики ИМ возможно лишь в случае, если входящие в ее состав антитела «узнают» наиболее стабильный центральный участок молекулы cTnl. Если же для этой цели

Время после начала приступа (часы)

Рис. 21. Изменение концентрации сТп1 в сыворотке крови пациента, измеренная с использованием двух различных диагностических систем. Пара антител 14135 - 7Р4 (- я -) может быть использована только для детекции целой молекулы сТп!, так как эпитопы обоих антител расположены в лабильных участках молекулы, легко подвергающихся протеолитической. В свою очередь эпитопы пары антител 19С7 - 8Е10 (-Ф-) расположены в центральной стабильной части молекулы и эта комбинация антител может быть использована для детекции как целой молекулы, так и ее протеолитических фрагментов.

применяется система на основе антител, узнающих лабильные участки молекулы сТп1, то через несколько дней после начала заболевания возможно получение сильно заниженных или ложно-отрицательных результатов.

Влияние молекулы ТпС на стабильность сТп!

Исследуя причины устойчивости центрального участка молекулы сТп1 к эздействию эндогенных протеаз, мы предположили, что, по крайней мере, частично эта хтойчивость может быть объяснена экранированием определенных участков сТп1 олекулой ТпС. Согласно литературным данным оба белка образуют настолько эочный комплекс друг с другом, что он сохраняется даже под воздействием 6 М очевины (ТоЬастап, 1996). Аффинность взаимодействия является Са2*-зависимой, т.е. ^щественно повышается в присутствии ионов Са2*. Для проверки настоящей гипотезы, ы исследовали взаимодействие сТп! и его протеолитических фрагментов, полученных результате протеолитической деградации белка в некротизированной ткани, с ТпС, ^мобилизованным на сефарозе. Если наше предположение верно, то 1аимодействовать с иммобилизованным ТпС должны все протеолитические пептиды, в

состав которых входит участок, ограниченный аминокислотными остатками 30 -110.

Экстракт сердечной ткани человека, которую инкубировали 8 часов в условиях моделирующих некроз, наносили на колонку с TnC-сефарозой в присутствии 2 мМ CaCI; в буфере, содержащим 6М мочевину. Белки, связавшиеся с носителем, элюировалу буфером, содержавшим 10 мМ ЭГТА, разделяли методом гель-электрофореза ¡/ переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану «окрашивали» антителами 19С7, эпитоп которых расположен внутри стабильного участка cTnl (Рис. 22). Е контрольном эксперименте исследовали неспецифическое взаимодействие cTnl и его пептидов с сефарозой без ТпС.

Анализ результатов эксперимента (Рис. 22) показал, что практически все пептиды, взаимодействующие с антителами 19С7, связываются с ТпС, иммобилизованным на сефарозе, и не взаимодействуют с чистой сефарозой.

Таким образом было показано, что протеолитические пептиды cTnl, включающие область 34-91, способны образовывать комплекс с ТпС. По всей видимости, cTnl находится в некротизированной сердечной ткани и крови больных ИМ е виде чрезвычайно гетерогенной смеси нативного белка, его протеолитических пептидоЕ и их комплексов с ТпС.

cTnl

1 2 3

Рис. 22. Эксперимент, демонстрирующий способность низкомолекулярных пептидов сТл/ связываться с ТпС.

Первая дорожка - экстракт сердечной ткани, инкубированной при 37 "С в течение восьми часов; вторая дорожка - тот же экстракт, нанесенный на аффинную колонку с ТпС i элюированный раствором ЭДТА; третья дорожка - тот же экстракт, нанесенный нг сефарозу без ТпС и элюированный ЭДТА.

После проведения электрофореза белки были перенесены на нитроцеллюлозную мембран) и прокрашены антителами 19С7.

Влияние (Ьосфорилирования cTnl цАМФ-зависимой поотеинкиназой in vitro на связывание антител с с 7л/. Известно, что сАМР-зависимая протеинкиназа фосфорилирует два сериновых остатка сердечной формы Tnl, Ser-22 и Ser-23, в ответ на адренэргическую стимуляцию (Van Eyk and Solara, 1996). Фосфорилирование остатков Ser-22 и Ser-23

приводит к уменьшению Са2*-связывающей способности TnC (Malhotra et al., 1997). В свою очередь уменьшение Са2,-связывающей способности ТпС приводит к тому, что мышечное сокращение может быть инициировано только при более высоких концентрациях внутриклеточного С а2*. Недавно было показано, что фосфорилирование Ser-22 и Ser-23 вызывает значительные изменения конформации всей молекулы cTnl (Dong et al., 1997с). Логично предположить, что такие изменения будут влиять и на связывание ряда моноклональных антител с молекулой cTnl. Чтобы проверить это предположение, мы провели фосфорилирование очищенного препарата сердечного Tnl цАМФ-зависимой протеинкиназой и исследовали взаимодействие модифицированного белка с МАТ, используя методику Western blotting. Наиболее существенные различия во взаимодействии с фосфорилированными и дефосфорилированными формами cTnl были обнаружены для антител, эпитопы которых расположены в непосредственной близости от сайта фосфорилирования, либо перекрывают его (19С11, 13F2, 16F1, 22В11 и другие). В то же время, некоторые антитела, эпитопы которых также расположены в непосредственной близости от участка фосфорилирования, например 10В11 (эпитоп ограничен остатками 16-20) и 19С7 (эпитоп ограничен остатками 41-49) взаимодействуют практически одинаково как с фосфорилированным, так и с нефосфорилированным cTnl. Антитела 16А11, 18Н7, 10В7, эпитопы которых располагаются в центральной и С-концевой частях молекулы cTnl, связываются с обеими формами белка одинаково. Следовательно, с большой долей уверенности можно предположить, что конформационные изменения, сопряженные с фосфорилированием cTnl, не оказывают существенного влияния на эпитопы антител, расположенных в центральной и N-концевой частях молекулы. Аналогичные результаты были получены при исследовании фосфо- и дефосфо- форм белка методом твердофазного иммуноферментного анализа (данные не приводятся).

Рис. 23. Исследование взаимодействия антител с фосфорилированным и нефосфорилированным Tnl методом Western blotting.

-Pi - нефосфорилированныО исходный Tnl,

+PI- белок, фосфорилированный цАМФ-зависимой

протеинкиназой.

А, Б, в- MAT22В11, 10В11 и8Е10 соответственно.

Используя МАТ 22В11, не взаимодействующие с фосфорилированной формой cTnl (Рис. 23) мы создали диагностическую систему, пригодную для измерения только дефосфорилированной формы белка (Рис. 24А). В качестве антител подложки в данной системе использовали МАТ 8Е10. Как следует из Рис. 24Б данная система не узнавала cTnl, фосфорилированный протеинкиназой А.

Описанная выше диагностическая система была использована нами для исследования содержания нефосфорилированного cTnl в крови больных с инфарктом миокарда. Результаты измерений уровния cTnl в крови одного из наиболее характерных больных представлены на Рис. 24В. Для измерения концентрации общего (фосфорилированного и нефосфорилированного) cTnl мы использовали пару антител 8Е10 - 10В11. МАТ 10В11 на фосфорилирование молекулы cTnl практически не реагируют, а так как эпитоп этих антител расположен в непосредственной близости от эпитопа антител 22В11, то протеолитическая деградация молекулы cTnl не должна была существенно повлиять на результаты измерений.

111)11 ЦВМ 8EI (I

Я щ

V м

зИД щ

ff ip

f ¡¿¡-к

SEI». 1IIB11

го м во ео

время после начала приступа (часы)

Рис. 24. Схематическое изображение расположения эпитопов МАТ, использовавшихся для количественного определения общего (8Е10 - 10В11) и нефосфорилированного (8 ЕЮ - 22В11) сТл/ (А). Влияние фосфорилирования молекулы с ТЫ на узнавание антигена парами антител (Б). Кинетика выделения общего (-•-) и нефосфорилированного (• о -) сТп! в кровоток больного с ИМ.

Влияние гепарина на связывание антител с сТп! При лечении больных с подозрением на ИМ часто применяется внутривенное введение гепарина, снижающего свертываемость крови. Молекула гепарина, несущая на своей поверхности значительный отрицательный заряд, может образовывать комплекс

(комплексы) с положительно заряженной молекулой сТп1. Нами было показано, что формирование комплекса гепарин - сТп! может приводить к изменениям во взаимодействии ряда антител с антигеном. Мы исследоали влияние различных концентраций гепарина на изменение уровня сигнала в иммунофлуоресцентных диагностических системах основанных на применении монокпональных антител различной эпитопной специфичности. Как следует из Рис. 25, некоторые пары антител реагировали на присутствие гепарина в образце снижением сигнала, в некоторых случаях, весьма существенным. Таким образом, присутствие гепарина в сыворотке крови больного может приводить к занижению чувствительности диагностических систем, в которых используются антитела, реагирующие на образование комплекса гепарина с молекулой сТп1. Использование в диагностических системах МАТ, не реагирующих на гепарин, позволит избежать подобные осложнения.

50000-

40300"

зоооо-

20000"

10СГО-

1 2 3 4 5 6

Юрита 8Е1МС2 8Е10-19СГ 10В7-19С7 10В7-7Н 19С11-16А11

Рис. 25. Влияние гепарина на взаимодействие пар антител с сГп/. | сТп! (30 нг/мл) - гепарин

] сТл/ (30 нг/мл) + гепарин (50 Ш/мл)

| сТп! (30 нг/мл) + гепарин (200 Ю/мл)

Создание новой диагностической системы для количественного определения

сГп!

Как следует из всего вышесказанного, моноклональные антитела, ютользуемые для сознания надежной диагностической системы должны удовлетворять следующим требованиям:

а) в равной степени эффективно узнавать как свободный сТп1, так и сТп1 в комплексе с ТпС;

б) зпитоп антител должен быть расположен в стабильной части молекулы сТп1;

в) антитела не должны быть чувствительны к фосфорилированию сТп1 цАМФ-зависимой протеинкиназой А;

г) взаимодействие антител с антигеном не должно быть подвержено влиянию молекул несущих существенный отрицательный заряд (например, таких как гепарин);

Все антитела, удовлетворяющие данным требованиям, были протестированы попарно методом "сэндвич" - иммунофлуоресцентного анализа как в качестве антител подложки, так и в качестве детекторных антител. Антитела подложки были мечены биотином, детекторные антитела - стабильным хелатом Ей3* . Смесь детекторных антител, антител подложки и антигена инкубировали 20 минут при комнатной температуре в 96-ти луночных планшетах с преадсорбированным стрептавидином. При этом биотинилированные антитела связывались со стрептавидином и в случае, если антитела имели различные эпитопы, образовывался "сэндвич". После этого планшет отмывали от несвязавшегося материала, добавляли раствор, усиливающий флуоресцентный сигнал и измеряли флуоресценцию на 1234 ОЕ1_Р1А" флуориметре. Из всех тестированных комбинаций была выбрана одна пара антител - 19С7-биот. -8Е10-Еи3*. На основе этой пары монокпональных антител нами была создана высокочувствительная диагностическая система для количественного определения сТп! (Рис. 26).

от о. о

100000 -

10000-

1000 Г

100

0.1

Концентрация сТп! (нг/мл)

Рис. 26. Калибровочная кривая для новой диагностической системы( — - ) МАТ 19СТ, меченные биотином; МАТ ВЕЮ - конъюгированные со стабильныи хелатом европия.

Эпитопы этих антител расположены в стабильной к протеолизу области молекулы сТп1 (19С7-41-5А31Ж1.<21.К-49, 8Е10-87-иЗРАЕ-91).

В присутствии ЭДТА, снижающего взаимодействие между сТп1 и ТпС, новая диагностическая система одинаково эффективно узнает как свободный сТп1, так и сТп! в составе тропонинового комплекса (Рис. 27).

»о«» о - НВяКяЯ

=и_I_

тп | Тп 1 в составе

(30 нг1мл) комплекса

(30 нг/мл)

Рис. 27. Тестирование стандартных разведений сТп/ в изолированной форме и в форме нашивного тропонинового комплекса с использованием новой диагностической системы в присутствие ЭДТА

Как уже отмечалось ранее, кроме ТпС, отрицательный эффект на взаимодействие антител с сТп1 могут оказывать также и некоторые другие макромолекулы, несущие значительный отрицательный заряд, например, такие как гепарин. Нами было изучено влияние гепарина на результаты анализа при использовании нашей новой диагностической системы. В качестве контроля использовали пару МАТ, на которые гепарин оказывает отрицательное влияние (Рис. 28). Как видно из Рис. 28, добавление гепарина в образец, содержащий сТп1, в концентрации 50 МЕ/л и 200 МЕ/л практически не влияет на результат анализа с использованием новой диагностической системы.

19С7-8Е10

10B7-7F4

Рис. 28. Влияние гепарина на иммунологическую активность cTnl в новой диагностической системе (МАТ 19С7 - 8Е10) и в контрольной диагностической системе, реагирующей на гепарин (МАТ 10ВТ - TF4).

Таким образом, нами была разработана высокочувствительная, надежная диагностическая система для количественного определения сТп1 в крови больных. Высокий аффинитет использованых в диагностической системе антител позволил снизить время инкубации образца с антителами до 20 минут. Такая систеа позволяет уже менее, чем через полчаса после забора крови, поставить правильный диагноз.

Использование тропониновоео комплекса для приготовления стандартов сТп1.

Как уже было отмечено ранее (раздел «Протеолитическая деградация сТп! в некротизированной сердечной ткани и ее влияние на взаимодействие сТп1 с антителами») сТп1 крайне восприимчив к действию протеаз. Разработчики диагностических систем столкнулись с этой проблемой на этапе приготовления стандартов белка. В растворенном виде сТп1 оказывался крайне неустойчивым и быстро терял иммунологическую активность. Однако, нам удалось показать, что стабильность сТп1 в крови больных с ИМ существенно выше, чем стабильность очищенного белка, растворенного в нормальной человеческой сыворотке. Поэтому, мы предположили, что компоненты тропонинового комплекса могут защищать сТп1 от воздействия эндогенных протеаз и, таким образом, сТп1 в комплексе с другими тропонинами будет более стабильным, чем свободный белок (см. раздел «Влияние молекулы ТпС на стабильность сТп!»). Помимо этого, сТп1 в виде комплекса с другими тропонинами будет представлять собой ту самую форму, в которой белок выделяется в кровоток больного с ИМ. Как мы и предполагали, (Рис. 29) стабильность сТп1 в комплексе с сТпТ и ТпС оказалась существенно выше, чем стабильность очищенного белка и иммунологическая активность стандартов сТп1, приготовленных на основе тропонинового комплекса практически не изменялась в ходе инкубации при +4°С в течение недели и более. Таким образом, на основании данных, полученных при изучении биохимии сТп1 в крови больных, нам удалось решить достаточно сложную практическую задачу.

И миуиочогич сси а

О)

0 2 * 6 в 10 12 14 16 18 20

Время инкубации (дни)

Рис. 29. Стабильность двух форм сТп! - свободного с7п/ (-и-) и с 7л/ в виде тропонинового комплекса (-о-) в человеческой сыворотке при инкубации при температуре +4°С.

Использование тропонинового комплекса для калибровки диагностических

систем.

Ранее уже было отмечено, что результаты тестирования одного и того же образца крови с использованием различных диагностических систем могут различаться на порядок и более. Мы предположили, что причиной различий может быть использование производителями для калибровки диагностических систем различных форм белка (или его синтетических фрагментов), отличных по своим иммунологическим характеристикам от белка, циркулирующего в кровотоке больного. Ввиду того, что основная масса cTnl в крови больных представлена в виде комплекса с ТпС, а у некоторых больных и в виде тройного cTnl - ТпС - сТпТ комплекса, с нашей точки зрения, логично было бы использованть для калибровки диагностических систем нативный тропониновый комплекс. Препарат тропонинового комплекса, используемый в качестве иммунологического стандарта, должен быть очищен без применения буферных растворов с экстремальными значениями рН, содержащих мочевину и другие денатурирующие реагенты в высоких концентрациях с тем, чтобы конформация cTnl максимально соответствовала конформации белка в живой клетке. Обычно тропониновый комплекс, очищенный в таких условиях, содержит примеси других белков (актина, миозина, тропомиозина), и поэтому определение концентрации cTnl в такой белковой смеси требует специальных подходов. Для определения концентрации cTnl (равно как и других компонентов тропонина) в составе тропонинового комплекса мы разработали метод, основанный на сканировании геля после электрофоретического разделения белков комплекса и белковых стандартов (Рис. 30 А и Б). Белки тропонинового комплекса, а также известные количества белка -стандарта (cTnl, ТпС или сТпТ) электрофоретически разделяли на одном и том же геле (Рис. ЗОА). Полосы, соответствующие исследуемому белку, сканировали на лазерном гель - сканере Ultroscan XL - Enhanced Laser Densitometer, LKB-Bromma). На основании данных сканирования стандартного белка строили калибровочную кривую (Рис. ЗОБ), с помощью которой рассчитывали концентрацию белка в составе комплекса.

На основе охарактеризованного таким образом препарата тропонинового комплекса нами были приготовлены стандартные разведения для калибровки как уже имеющихся в продаже, так и разработанных нами экспериментальных диагностических систем (пары MAT 18Н7 - 8Е10 и 19С7 - 8Е10). Одновременно в тех же условиях (те же приборы и реактивы), производили тестирование ряда образцов сыворотки больных ИМ. На основании полученных калибровочных графиков мы смогли пересчитать концентрацию cTnl в крови больных. Полученные данные представлены в Таблице 3. Как следует из Таблицы 3, в том случае, когда диагностические системы эткалиброваны по внутреннему стандарту, приготовленному производителем

Рис. 30. А. Разделение компонентов тропонинового комплекса (дорожки 1 и 2) и стандартных разведений сТп! (дорожки 3-5) методом гель электрофореза; Б. Калибровочная кривая зависимости суммарной оптической плотности белковой полосы от количества белка в пробе.

диагностической системы, концентрации, определяемые в одном и том же образце сыворотки, могут различаться в 10 - 20 раз. Подобные различия мы наблюдали и в случае, когда коммерческие и экспериментальные диагностические системы были откалиброваны с использованием очищенного (из сердечной ткани или рекомбинантного) сТп! (данные не приводятся). Однако, если калибровку диагностических систем осуществлять с использованием тропонинового комплекса, то корреляция между полученными результатами была несравненно более высокой. С нашей точки зрения это наблюдение свидетельствует о том, что сТп! в составе тропонинового комплекса в большей степени соответствует той форме белка, которая выделяется в кровоток больного.

Полученные нами данные были представлены Международному Комитету по стандартизации тропониновых диагностических систем, и было предложено исследовать тропониновый комплекс на предмет возможного использования в качестве международного иммунологического стандарта.

Таблица 3

Внутренний стандарт Концентрация Tn I (нг/мл)

Ш17-8Е10 Opus magnum 19С7-8Е10 AiSYM

Образец 1 - 15.8 5,4 48.6

Образец 2 90.7 272 55.2 670

Образец 3 14.2 50.4 15.6 114.5

Образец 4 12.8 133 21.6 257.4

Образец 5 39.5 257 65.4 722

Образец 6 5.65 23.3 6.2 49.7

Образец 7 4.3 20 6.3 72.8

Образец 8 40.7 142 39 461.2

Образец 9 4.1 8.1 4.6 22.2

Тропоннновый комплекс в качестве стандарта Концентрация Тп I (нг/мл)

18Н7-8Е10 Opus magnum 19С7-8Е10 AxSYM

Образец 1 - 2.2 4.3 3.95

Образец 2 90.7 62 44 45.8

Образец 3 14.2 8.8 12.7 9

Образец 4 12.8 27.2 18 19.15

Образец 5 39.5 57.5 51 49

Образец 6 5.65 3.5 4.9 4.1

Образец 7 4.3 3 5.4 5.8

Образец 8 40.7 28.5 32 32.7

Образец 9 4.1 0.96 3.9 1.95

Выводы

• Разработан новый высокоэффективный метод выделения сТп1 и других компонентов тропонинового комплекса из сердечно-мышечной ткани человека.

• Получено более 50 линий гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела, специфичные к сердечной форме Тп1.

• Осуществлено детальное эпитолное картирование полученных моноклональных антител.

• Показано влияние образования бинарного комплекса сТп1-ТпС на взаимодействие части моноклональных антител с сТп1.

¡первые показано, что в кровяное русло больных с ИМ сТп1 выделяется в основном в 1иде комплекса с ТпС.

• Исследована деградация молекулы сТп1 под воздействием эндогенных протеа в сердечной ткани человека при некрозе. Показано, что наиболее устойчивой протеолизу частью молекулы сТп1 является участок, ограниченный 30 - 111 аминокислотными остатками. Стабильность данного участка молекуль обеспечивается взаимодействием сТп1 с ТпС.

• Показано влияние фосфорилирования молекулы сТп1 цАМФ-зависимо! протеинкиназой на взаимодействие ряда моноклональных антител I антигеном. Впервые исследовано содержание фосфорилированной I дефосфорилированной форм сТп1 в крови больных с ИМ.

• Исследовано влияние присутствующего в образце гепарина на взаимодействие моноклональных антител с антигеном.

• На основе полученных моноклональных антител разработан; высокочувствительная и надежная экспериментальная система дл! количественного определения сТп1 в крови.

• Предложена новая методика приготовления стабильных стандартов сТп1 н; основе полного нативного тропонинового комплекса.

• Показана целесообразность использования полного нативного тропониновоп комплекса в качестве международного иммунологического стандарта дл; проведения калибровки тропониновых диагностических систем.

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Katrukha A.G., Bogatcheva N.V., Gusev N.B.. Isolation of human cardiac troponin T ant localisation of epitopes recognized by monoclonal antibodies to cardiac troponin T. FEBS Letters, 1993, v.315, N1, pp. 25-28.

2. Katrukha A.G., Bereznikova A.V., Esakova T V., Filatov V.L., Bulargina T.V., Gusev N.B.. / new method of human cardiac troponin I and troponin T purification. Biochemistry ant Molecular Biology International, 1995, v.36, N1, pp. 195-202.

3. Lahikainen H., Katrukha A.G., Bereznikova A.V., Filatov V.L, Bulargina T.V., Gusev N.B.. New monoclonal antibodies to human cardiac troponin T. Proceeding of the Laboratory Medicine "95 11th IFCC European Congress of Clinical Chemistry, Tampere, Finland,1996 N647.

4. Katrukha A.G.,. Severina, M.E Eskola J., Petterson K., Lovgren Т., Bereznikova A.V., Guse N.B.. Time-resolved fluoroimmunoassay of cardiac troponin I. American Association for Clinics Chemistry, 47th Annual Meeting, 1995 , Clinical Chemistry, v. 41, N6, p 53.

5. Katrukha A.G., Bulargina T.V., Severina M.E., Bereznikova A.V., Esakova T.V., Mitrunen K., Petterson K„ Lovgren Т.. Cardiac troponin I - cardiac troponin С complex in sera patients with acute myocardial infarction. International Congress of Clinical Chemistry, London, 1996, p 221.

6. Katrukha A.G., Bereznikova A.V., Esakova, T.V. Mitrunen K., Mykkanen P., Petterson K., Lovgren Т.. Cardiac troponin С influences the binding of monoclonal antibodies to cardiac troponin I. International Congress of Clinical Chemistry, London, 1996, pp 221-222.

7. Katrukha A.G., Severina M.E., Bereznikova A.V., Esakova T.V., Gusev N.B., Petterson K., Lovgren Т.. Phosphorylation of human cardiac troponin I by protein kinase A affects its immunological activity. International Congress of Clinical Enzymology, 1996, Cambrige, p 25, 51.

8. Katrukha A.G., Severina M.E., Bereznikova A.V., Esakova T.V., Petterson K., Lovgren Т.. Decrease of non-specific binding of cardiac troponin I. International Congress of Clinical Enzymology, 1996, Cambrige, p 58.

9. Катруха А.Г., Березникова A.B., Есакова T.B., Северина М.Е., Леттерсон К., Гусев Н.Б. Тропонин I находится в комплексе стропонином С в сыворотке крови больных с инфарктом миокарда. Всероссийская конференция «Прикладные аспекты исследований скелетных, сердечных и гладких мышц», Пущино 1996, с. 98.

10. Катруха А.Г., Гусев Н.Б. Использование компонентов тропонина в качестве маркеров повреждения сердца. Всероссийская конференция «Прикладные аспекты исследований скелетных, сердечных и гладких мышц», Пущино 1996, с. 99.

11. Katrukha A.G., Bereznikova A.V., Pulkki К., Vuopio-Pulkki L.-M., Esakova T.V., Gusev N.B., Severina M.E., Petterson K., Lovgren Т.. Kinetics of liberation of free and total troponin I in sera of patients with acute myocardial infarction. American Association for Clinical Chemistry, 49m Annual Meeting, 1997 , Clinical Chemistry, v. 43, N6, p 106.

12. Katrukha A.G., Bereznikova A.V., Esakova T.V., Severina M.E., Petterson K., Lovgren Т.. Troponin complex for the preparation of troponin I calibrators and standards. American Association for Clinical Chemistry, 49,h Annual Meeting, 1997 , Clinical Chemistry, v. 43, N6, p 106.

13. Katrukha A.G., Bereznikova A.V., Esakova T.V., Severina M.E., Filatov V.L., Petterson K., Lovgren Т.. In vivo clearance of cardiac troponin I. European Congress of Clinical Chemistry, Basel, 1997, p. 113.

14. Katrukha A.G., Bereznikova A.V., Esakova T.V., Severina M.E., Filatov V.L., Petterson K., Lovgren Т.. Stability of cardiac troponin 1 in human serum. European Congress of Clinical Chemistry, Basel, 1997, p. 118.

15. Katrukha A.G., Bereznikova A.V., Esakova T.V., Petterson K., Lovgren Т., Filatov V.L., 3ulkki K., Vuopio-Pulkki L.-M., Gusev N.B. Troponin I is released in the blood stream of

patients with acute myocardial infarction not in the free form, but as a complex. Clinic Chemistry, 1997, v.43, N 8, pp 1379 -1385.

16. Филатов В.Л., Катруха А.Г. Эпитолный анализ Tnl из сердца человека. Исследован взаимодействия белков тропонинового комплекса. Международная конференция фундаментальным наукам, Москва, Россия, апрель 1998.

17. Филатов В.Л., Катруха А.Г. Применение SPOT-метода для определения участк связывания белков тропонинового комплекса. Международный симпозиум «Биологическ подвижность: современные методы исследования», Пущино, Россия, август 1998.

18. Filatov VL, Katrukha AG, Bereznikova AV, Esakova TV, Bulargina TV, Severina ME, et Epitope mapping of anti-Tnl monoclonal antibodies. Biochem Mol Biol Intern 1998; 45, 6; 11"/ 87.

19. Katrukha AG, Bereznikova AV, Filatov VL, Esakova TV, Kolosova OV, Pettersson K, Lovgr T, Bulargina TV, Trifonov !R, Gracianskyi NA, Pulkki K, Vuopio-Pulkki L-M, Gusev NB. Cardi troponin I degradation: application for reliable immunodetection. Clin Chem 1998; 44:12; 24; 2440

20. Katrukha A., Bereznikova A., Filatov V., Akinfieva E., Severina M., Bulargina Т., Petterss K., Kolosova 0., Gusev N., Epitope analysis of human cardiac Tnl by SPOT-technique. 5 annual meeting of American Association of Clinical Chemistry, Chicago, USA, August 195 Clinical Chemistry, 44, 6, Supplement,, p. A124.

21. Katrukha A., Bereznikova A., Filatov V., Esakova Т., Severina M., Akinfieva E., Bulargina' Pettersson K., Gusev N., Gratsianski G., Trifonov I. Mixed sandwich system for measurems Tnl-TnC complex in AMI persons. 501h annual meeting of American Association of Clink Chemistry, Chicago, USA, August 1998, Clinical Chemistry, 44, 6, Supplement,, p. A122.

22. Katrukha A., Bereznikova A., Filatov V., Esakova Т., Kolosova O., Akinfieva E., Bulargina Pettersson K., Gusev N., Stability of Tnl in necrotic human tissue. 50lh annual meeting American Association of Clinical Chemistry, Chicago, USA, August 1998, Clinical Chemistry, t 6, Supplement,, p. A126.

23. Katrukha A., Bereznikova A., Filatov V., Bulargina Т., Gratsianski G., Trifonov I Petterss K„ Lovgren Т., Gusev N., Pulkki K. Stability of cardiac Tnl measured by different assays, 19$ Scand. J. Clin. Lab. Invest., 58, Suppl. 228, 90.

24. Katrukha A., Bereznikova A., Filatov V., Bulargina Т., Gratsianski G., Trifonov I., Petterss K., Lovgren Т., Gusev N., Penttila H. Kinetics of cardiac Tnl release in the bloodstream in A persons measured by different assays, 1998, Scand. J. Clin. Lab. Invest., 58, Suppl. 228, 90.

25. Katrukha A., Bereznikova A., Pettersson K. New approach to standartisation of hum cardiac Troponin I (cTnl), 1999, Scand. J. Clin. Lab. Invest., 59, Suppl. 230, 124-127.

26. Wacker M., Heinola J., Katrukha A., Pulkki K„ Pettersson K„ Lovgren T. A quantitative wh< blood immunoassay for rapid determination of cardiac specific troponin ;l Clin Chem Lab Med

1999; Special Supplement, S 461, H 140.

27. A. Katrukha, A. Bereznikova, V. Filatov, O. Kolosova, K. Pettersson, T. Bulargina. Troponin T degradation in necrotic human cardiac tissue. Clin Chem Lab Med 1999; Special Supplement, S 449, H 093.

28. Katrukha A., Bereznikova A.,. Filatov V, Kolosova O., Pettersson K., Eskola-Williams A., Bulargina T. Six cardiac troponin I (cTnl) assays compared using different native and recombinant preparations of the free and complexed antigen. Clin Chem Lab Med 1999; Special Supplement, S 448, H 090.

29. Katrukha A., Bereznikova A., Filatov V., Kolosova O., Pettersson K., Trifonov I., Gracianskyi N. , Gusev N., Bulargina T. . Binary cTnl - cTnT complex in AMI serum. Clin Chem Lab Med 1999; Special Supplement, S 449, H 092.

30. Katrukha A., Bereznikova A., Filatov V., Kolosova O., Pettersson K., Bulargina T. Monoclonal antibodies affected by cTnl phosphorylation. Part of cTnl in the blood of AMI patients is phosphorylated? Clin Chem Lab Med 1999; Special Supplement, S 448, H 091.

31. Trifonov I., Katrukha A., Averkov O., Yavelov I., Vaulin N., Gratsiansky N. Fatti-acid binding protein, troponin I and inhospital ishaemic events in unstable coronary artery disease. The Lancet conference June 10-11, 1999, Copenhagen, Denmark, The Challenge of Acute Coronary Syndromes p.14

32. Katrukha A., Bereznikova A., Filatov V., Esakova T„ Kolosova O., Pettersson K., Bulargina Т., Trifonov I., Gratsiansky N.. Gusev N., Severin S. Improved detection of minor ischemic cardiac injury in patients with unstable angina with measurements cTnl and FABP. Clinical Chemistry, 45, 6, Supplement,, p. A122.

33. Trifonov I., Katrukha A., Averkov O., Yavelov I., Vaulin N., Gratsiansky N. Admission level of fatti-acid binding protein and troponin I and inhospital ishaemic events in patients with unstable coronary artery disease. Eur Heart J, V20, Abstr Suppl August/September 1999, p. 398.

34. Трифонов И.P., Катруха А.Г., Неелов И.С., Аверков О.В., Грацианский Н.А. Сопоставление прогностической значимости сердечного тропонина I и белка, связывающего жирные кислоты, при остром коронарном синдроме без подъема сегмента ST. VI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва 1999 г. .тезисы докладов, с.480.

35. Трифонов И.Р., Катруха А.Г., Явелов И.С., Аверков О.В., Ваулин Н.А., Грацианский НА Нестабильная стенокардия: сравнительное изучение прогностической значимости сердечного тропонина I и белка, связывающего жирные кислоты. Кардиология, 9, 1999, 41-47.

36. Filatov V.L., Katrukha A.G., Bulargina T.V., Gusev N.B. Troponin; structure, properties, and mecanism of functioning. Biochemistry (Moscow), 1999, v 64, N 9, 969-985

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Катруха, Алексей Генрихович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Диагностика инфаркта миокарда.

1.1.1. Миоглобин

1.1.2. Белок, связывающий жирные кислоты

1.1.3. Лактатдегидрогеназа 25 1.1.4 Креатинкиназа

1.1.5. Тропонин Т

1.1.6. Тропонин I

1.2. Тропонин I. Биохимия и применение в медицине 28 1.2.1. Тропониновый комплекс 28 1.2.2 Тропонин Т 29 1.2.3. Тропонин С 31 1.2 4. Тропонин!

1.2.5. Регуляция мышечного сокращения

1.2.6. Взаимодействие тропонина I с тропонином Т.

1.2.7. Фосфорилирование Tnl.

1.2.8. Ингибиторные участки Tnl и его взаимодействие с актином и тропомиозином.

1.2.9. Тропонин I в диагностике ИМ.

1.3. Белок, связывающий жирные кислоты

1.3.1. Общая характеристика

1.3.2. FABP как маркер инфаркта миокарда

ГЛАВА 2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Получение моноклональных антител С5.

2.2. Определение классов и субклассов моноклональных антител.

2.3. Аффинная очистка моноклональных антител на РгА-Sepharose.

2.4. Определение концентрации моноклональных антител.

2.5. Образцы ткани.

2.6. Тестирование тканей.

2.7. Приготовление аффинной колонки для выделения тропонинового комплекса.

2.8. Определение концентрации cTnl, сТпТ.

2.9. Получение конъюгата моноклональных антител с биотином.

2.10. Получение конъюгата моноклональных антител схелатом европия

2.11. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле.

2.12. Окраска геля.

2.13. Иммуноблоттинг.

2.14. Приготовление растворов тропонина I.

2.15. Твердофазный иммуноферментный анализ.

2.16. Идентификация белков тропонинового комплекса.

2.17. Образцы сывороток от больных с инфарктом миокарда, нестабильной стенокардией и от здоровых доноров.

2.18. Выделение FABP.

2.19. Выделение тропонинового комплекса.

2.20. Приготовление аффинной колонки для получения сыворотки, не содержащей cTnl.

2.21. Твердофазный синтез пептидов на целлюлозной основе

2.22. Взаимодеиствие моноклональных антител с синтетическими пептидами.

2.23. Моделирование некроза сердечной ткани.

2.24. Иммобилизация человеческого сердечного ТпС на BrCN-активированной сефарозе.

2.25. Исследование взаимодействия Tnl с иммобилизованным

2.26. Фосфорилирование cTnl цАМФ-зависимой протеинкиназой.

2.27. Определение участков взаимодействия cTnl с ТпС.

ГЛАВА

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Разработка нового метода выделения cTnl из сердца человека.

3.2 Получение моноклональных антител к cTnl.

3.3 Попытка разработки диагностической системы для количественного определения cTnl в крови больных с ИМ.

3.4 Влияние образования бинарного комплекса TnC - cTnl на взаимодействие антител с антигеном.

3.5 Изучение кинетики выведения очищенного cTnl и cTnl в форме комплекса с другими тропонинами из кровотока экспериментальных животных

3.4. Использование метода смешанного сэндвича для количественного определения бинарного комплекса cTnl - TnC в крови больных.

3.5. Комплекс cTnl - сТпТ в крови больных инфарктом миокарда.

3.6. Получение нового поколения моноклональных антител к тропонину I, одинаково эффективно узнающих как свободный cTnl, так и cTnl в комплексе с другими тропонинами.

3.7. Синтез библиотеки пептидов cTnl и эпитопное картирование моноклональных антител.

3.8. Перекрестное взаимодействие МАТ с сердечными изоформами сТпI других видов животных.

3.9. Определение участков взаимодействия cTnl с ТпС.

3.10. Изучение биохимических факторов, оказывающих влияние на взаимодействие cTnl с антителами 158 3.10.1. Протеолитическая деградация cTnl в ткани сердечной мышцы при некрозе.

3.10.2. Влияние молекулы ТпС на стабильность cTnl

3.10.3. Влияние фосфорилирования cTnl цАМФ-зависимой протеинкиназой in vitro на связывание антител с cTnl.

3.10.4. Влияние гепарина на связывание антител с cTnl

3.11. Создание новой диагностической системы для количественного определения cTnl

3.12. Исследование влияния различных факторов на пару моноклональных антител 19С7 - 8Е10.

3.13. Предварительные клинические испытания новой диагностической системы.

3.14. Определение верхней границы нормы для cTnl.

3.15. Диагностическая система для количественного определения белка, связывающего жирные кислоты (FABP).

3.16. Исследование содержания cTnl и FABP в сыворотках больных инфарктом миокарда и нестабильной стенокардией.

3.17. Использовние полного тропонинового комплекса с качестве стандарта в диагностических системах 201 3.18. Использование тропонинового комплекса для калибровки диагностических систем.

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Тропонин I как маркер инфаркта миокарда"

Сердечно-сосудистые заболевания, а среди них - инфаркт миокарда (ИМ), стоят на первом месте среди причин смерти, опережая онкологические, инфекционные и другие заболевания. Часто болезнь развивается стремительно, и у врачей остаются часы, иногда минуты на то, чтобы поставить правильный диагноз. Поэтому, именно в случае ИМ ранняя и достоверная диагностика, своевременно начатое лечение могут спасти миллионы человеческих жизней.

Во всех развитых странах для диагностики ИМ в настоящее время применяются биохимические методы, основанные на измерении в крови концентрации или ферментативной активности белков - маркеров ИМ. Первым таким белком - маркером в середине пятидесятых годов стала аспартатаминотрансфераза (Ladue J. et al., 1954; Karmen A. et al., 1954). Позже, через год появились сообщения о возможности использования для диагностики ИМ лактатдегидрогеназы (Wroblewski F. et al., 1955; Vessell E. et al., 1957), затем появились работы, посвященные креатинкиназе (Dreyfus J.et al., 1960; Van der Veen K. et al., 1966; Konttinen A. et al., 1975), миоглобину (Grenadier E.et al., 1983), легким и тяжелым цепям миозина (Trahem С. et al., 1978) и целому ряду других белков, которые впоследствии долгое время использовались в клинической практике. Все эти белки различались по молекулярной массе, времени появления в кровотоке после начала заболевания, времени выведения из кровотока и другим параметрам. Однако, всех их объединяло один очень важный недостаток - все они не были абсолютно кардиоспецифичны. Даже "золотой стандарт" последних двух десятилетий - MB изоформа креатинкиназы не позволяла врачам поставить правильный диагноз со стопроцентной гарантией.

В 1987 году было предложено использовать в качестве маркера некроза клеток сердечной мускулатуры белок тропонин I (Tnl) (Cummins В. et al., 1987). Tnl наряду с двумя другими белками - тропонинами Т и С (ТпТ и ТпС) является компонентом тропонинового комплекса, входящего в состав тонких филаментов поперечнополосатой и сердечной мускулатуры. Ранее было показано, что в организме человека существует изоформа Tnl (Syska Н. et al., 1974), которая исключительно кардиоспецифична, не синтезируется в других органах и имеет существенные различия в первичной структуре по сравнению с двумя другими изоформами этого белка, характерными для скелетной мускулатуры. Такие различия позволили получить сначала поликлональные, а затем и моноклональные антитела к сердечному Tnl (cTnl), не имеющие перекрестного взаимодействия со скелетными формами. И уже в 1992 году две группы исследователей из Англии и США сообщили о создании диагностических систем для количественного определения cTnl в крови больных (Larue С. et al., 1992; Bodor G. et al., 1992). С этого момента начинается широкомасштабное использование этого маркера в клинической практике, и на данный момент практически все крупнейшие мировые компании-производители медицинских диагностических систем выпускают или готовятся к выпуску диагностических систем для количественного или качественного определения cTnl в крови больных.

Причиной успеха cTnl у врачей-кардиологов стала, как указывалось выше, его исключительная кардиоспецифичность. На данный момент со всей очевидностью показано, что концентрация этого белка в крови превышает значения, характерные для нормы, только в случае наличия участка некротизации клеток сердечной мышцы (Bertinchant et а!., 1996; Altinier S.et al., 1997). В отличие от миоглобина, креатинкиназы, тропонина Т и всех других использовавшихся ранее белков - маркеров ИМ, концентрация cTnl в крови не повышается ни в случае серьезных острых или хронических поражений скелетной мускулатуры, ни в случае почечной недостаточности. Таким образом, с врачи-кардиологи впервые получили в свое распоряжение уникальный инструмент с помощью которого появляется возможность поставить диагноз с очень высокой степенью достоверности.

Следует также отметить, что концентрация cTnl в крови здоровых людей очень низка. Это дает возможность регистрировать даже самое небольшое увеличение его концентрации в случае другого заболевания, зачастую связанного с гибелью клеток миокарда - нестабильной стенокардии.

Однако, несмотря на то, что cTnl широко используется в клинике уже почти на протяжении десяти лет, до сих не существует единого международного стандарта для тропониновых диагностических систем. Очевидно, такая ситуация сложилась из-за того, что до последнего времени оставался невыясненным вопрос, в какой биохимической форме этот белок попадает в кровяное русло и в каком виде существует в кровотоке. Без этих знаний невозможно выбрать одну, наиболее подходящую для использования с этой целью форму белка из многообразия полученных на данный момент форм cTnl (изолированной, в комплексе с другими белками, рекомбинантной и т.д.)- Отсутствие точных знаний о представленной в кровотоке форме cTnl, делает невозможным и правильный подбор моно- или поликлональных антител для создания надежных диагностических систем, дающих достоверный результат при количественном исследовании cTnl в крови больного.

Следствием такого положения вещей явилось абсолютное отсутствие корреляции между результатами, полученными при использовании различных диагностических систем. На практике результаты измерения концентрации cTnl в одном и том же образце крови больного двумя различными (даже утвержденными FDA) диагностическими системами могут различаться на порядок и даже более. Это, в свою очередь, приводит в замешательство врачей, использующих тропониновые диагностические системы в клинической практике. Невозможность сравнить результаты, полученные в разных лабораториях на разных приборах, существенно тормозит развитие теоретических разработок, связанных с практическим применением данного маркера в клинической практике.

Работы по получению моноклональных антител к cTnl и по разработке диагностической системы для количественного определения этого белка в крови больных были начаты в нашей лаборатории в 1991 году. После первых же экспериментов по тестированию образцов сыворотки больных с помощью полученных антител, выяснилось, что cTnl в крови больного неоднороден и, что вероятно, представлен в виде различных биохимических форм. Для нас стало очевидно, что без детального изучения биохимических свойств этого белка в кровотоке невозможно создание надежной диагностической системы.

За прошедший с 1991 г. период нам удалось прояснить некоторые биохимические особенности cTnl циркулирующего в крови больного. Нами впервые было показано, что во-первых, значительная часть cTnl существует в крови больных с ИМ в виде комплекса с TnC (Katrukha et al., 1997), а во-вторых, большая часть cTnl в крови, представлена в виде протеолитических фрагментов, а не в виде целой молекулы, как считалось ранее (Katrukha et al., 1998). Мы убедительно показали влияние фосфорилирования молекулы cTnl цАМФ-зависимой протеинкиназой на взаимодействие ряда антител с антигеном и на необходимость учитывания этого фактора при подборе антител для диагностической системы. Было также установлено отрицательное воздействие гепарина на уровень сигнала ряда диагностических систем, что приводит к серьезному искажению результатов измерения белка в крови.

Анализируя результаты наших исследований, мы смогли подготовить рекомендации по подбору и тестированию антител, пригодных для создания надежных диагностических систем. Нами впервые было предложено использовать полный тропониновый комплекс для изготовления стабильных стандартов cTnl в диагностических системах, а наша идея по использованию этого комплекса в качестве международного иммунологического стандарта считается многими учеными наиболее перспективным направлением в развитии процесса стандартизации тропониновых диагностических систем.

Единственным недостатком cTnl как маркера некроза клеток сердечной мышцы является его недостаточно раннее появление в крови больных после появления первых признаков заболевания. Для того, чтобы лечение больных с ИМ и нестабильной стенокардией было наиболее эффективным и не сопровождалось всевозможными осложнениями, необходимо начинать его в течение полутора-двух часов после начала приступа. Однако, повышение концентрации cTnl в крови больного наблюдается обычно не раньше, чем через 4-6 часов после начала сердечного приступа, когда уже существенный участок сердечномышечной ткани подвергается необратимым некротическим изменениям. Безусловно, в этом случае терапевтическое вмешательство становится гораздо менее эффективным. Обычно в клинической практике для ранней диагностики ИМ используются диагностические системы, основанные на количественном определении в крови больного миоглобина. Однако, миоглобин не является кардиоспецифичным белком и при его применении в диагностике ИМ велик риск появления ложноположительных результатов.

В последнее время все больший интерес со стороны исследователей и компаний - производителей диагностических систем уделяется белку, связывающему жирные кислоты (fatty acid binding protein; FABP) как к возможному кандидату на замещение миоглобина при ранней диагностике ИМ (Glatz et al., 1988). FABP, имея сходную с миоглобином кинетику выделения после ИМ, является несравненно более кардиоспецифичным. Кроме того было показано, что использозание FABP наиболее эффективно именно при поражении сердечной мускулатуры.

В данной работе мы приводим результаты исследований, наглядно демонстрирующих, что FABP совместно с cTnl может быть успешно использован не только для диагностики ИМ, но и для диагностики заболеваний, связанных с незначительными повреждениями сердечной мышцы-такими как микроинфаркты и нестабильная стенокардия.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Катруха, Алексей Генрихович

ВЫВОДЫ

• Разработан новый высокоэффективный метод выделения cTnl и других компонентов тропонинового комплекса из сердечно-мышечной ткани человека.

• Получено более 50 линий гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела, специфичные к сердечной форме Tnl.

• Осуществлено детальное эпитопное картирование полученных моноклональных антител.

• Показано влияние образования бинарного комплекса cTnl-TnC на взаимодействие части моноклональных антител с cTnl.

• Впервые показано, что в кровяное русло больных с ИМ cTnl выделяется в основном в виде комплекса с ТпС.

• Исследована деградация молекулы cTnl под воздействием эндогенных протеаз в сердечной ткани человека при некрозе. Показано, что наиболее устойчивой к протеолизу частью молекулы cTnl является участок, ограниченный 30 - 110 аминокислотными остатками. Стабильность данного участка молекулы обеспечивается взаимодействием cTnl с ТпС.

• Показано влияние фосфорилирования молекулы cTnl цАМФ-згвисимой протеинкиназой на взаимодействие ряда моноклональных антител с антигеном. Впервые исследовано содержание фосфорилированной и дефосфорилированной форм cTnl в крови больных с ИМ.

• Исследовано влияние присутствующего в образце гепарина на взаимодействие МАТ с антигеном.

• На основе полученных моноклональных антител разработана высокочувствительная и надежная экспериментальная система для количественного определения cTnl в крови.

• Предложена новая методика приготовления стабильных стандартов cTnl на основе полного нативного тропонинового комплекса.

• Показана целесообразность использования полного нативного тропонинового комплекса в качестве международного иммунологического стандарта для проведения калибровки тропониновых диагностических систем.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Катруха, Алексей Генрихович, Москва

1. A., Cardiac troponin I. A marker with high specificity for cardiac injury. Circulation1993,88, 101-106. • Adams J.E. 3rd; Davila-Roman V.G.; Bessey P.Q.; Blake D.P.; Ladenson J.H.;

2. Jaffe A.S. Improved detection of cardiac contusion with cardiac troponin I. Am.

3. Heart. J. 1996; 131(2): 308-12.• Adams J.E. 3rd; Schechtman K.B.; Landt Y.; Ladenson J.H.; Jaffe A.S.

4. Comparable detection of acute myocardial infarction by creatine kinase MBisoenzyme and cardiac troponin I. Clin. Chem. 1994; 40(7 Pt 1): 1291-5. • Adams J.E. 3rd; Sicard G.A.; Allen B.T.; Bridwell K.H.; Lenke L.G.; Davila

5. EF-hand of troponin С for Ca2+ coordination, by genetic engineering. (1992) J.

6. Biol. Chem., 267, 15469-15474.• Bailey, K. (1946) Nature, 157, 368-369. • Bass NM, Manning JA, Tissue expression of three structurally different fatty acid binding proteins from rat heart muscle, liver, and intestine, Biochem Biophys Res

7. J. Lamy, F. Paolucci, B. Pau, Interet du dosage de la troponine I cardiaquehumaine dans le diagnostic de I'infarctus aigu du myocarde. JArch-Mal-Coeur1. Vaiss. 1996, 89(1): 63-8 • Bodor G.S., Anderson P.A., Ladenson J.H., Crimmins D.L., Allen P.D., and

8. Hoppe-Seyler, 1989, 370, 229-238.• Breitbart, R.E., Nguyen, H.T., Medford, R.M., Destree, A.T., Mahdavi, V., and

9. Nadal-Ginard, B. (1985) Cell, 41, 67-82.• Brisson, J.R., Sykes, B.D., Smillie, L.B., and Golosinska, K. Interaction of tropomyosin and troponin T: a proton nuclear magnetic resonance study. 1986,

10. Overhauser effect to determine the structure of a Gly-110 inhibitory troponin Ipeptide analog when bound to cardiac troponin C.I992, Biochim. Biophys. Acta, 1160,25-54. • Chandra M.; da Silva E.F.; Sorenson M.M;. Ferro J.A.; Pearlstone J.R.; Nash

11. Corsico В, Cistola DP, Frieden C, Storch J The helical doглain of intestinal fattyacid binding protein is critical for collisional transfer of fatty acids to phospholipid membranes. Proc Natl Acad Sci U S A 1998; 95(21): 12174-8

12. Crisman T.S., Claffey K.P., Saouf R., Hanspal J., Brecher P. Measurement of ratheart fatty acud binding protein by ELISA: tissue distribution, developmental changes and subcellular distribution. J. Mol. Cell. Cardiol., 1989, 21, 577-83.

13. Crisman TS, Claffey KP, Saouaf R, Hanspal J, Brecher P, Measurement of ratheart fatty acid binding protein by ELISA. Tissue distribution, developpmental changes and subcellular distribution. J Mol Cell Cardiol, 1987; 19(5): 423-31.

14. Cummins В.; Auckland M.L; Cummins-P. Cardiac-specific troponin-lradioimmunoassay in the diagnosis of acute myocardial infarction. Am Heart J. 1987(a), 113(6): 1333-44

15. Cummins В.; Cummins P. Cardiac specific troponin I release in canineexperimental myocardial infarction: development of a sensitive enzyme linked immunoassay. J. Mol. Cell. Cardiol. 1987(b); 19(10): 999-1010.

16. Dhoot, G.K., Cell, P.G.H., and Perry, S.V. The localization of the different formsof troponin I in skeletal and cardiac muscle cells. Exp. Cell. Res., 1978; 117, 357370.

17. Dobrovol'sky, A.В., Gusev, N.B., and Friedrich, P. Crosslinking of troponincomplex with 1,3-difluoro-4,6-dinitrobenzene. Identification of the crosslink formed between troponin С and troponin I in the absence of Ca "^". 1984,

18. Biochim. Biophys. Acta, v.789, p.144-151.• Dohet С, Ruegg J.С, Trayer 1.Р., and Ai-Hillawi E. Reconstitution of skinned cardiac fibres with human recombinant cardiac troponin-l mutants and troponin

19. A.; Schipman N.; Kantelip J.P. Use of cardiac troponin I as a marker ofperioperative myocardial ischemia. Ann. Thorac. Surg. 1995; 59(5): 1192-4. • Etievent J.P.; Chocron S.; Toubin G.; Taberlet C; Alwan K.; Clement F.; Cordier

20. Fujimori K., Smillie L.B., and Reinach F.C. Structural and regulatory functions ofthe NH2- and COOH-terminal regions of skeletal muscle troponin I. J. Biol.

21. Chem., 1994, 269, 5230-5240.• Farah C.S.; Miyamoto C.A.; Ramos C.H.; da Silva A.C.; Quaggio R.B; Fujimori

22. K.; Smillie LB.; Reinach F.C. Stnjctural and regulatory functions of the NH2 and

23. Severin E, Gusev N. Epitope mapping of anti-troponin antibodies, Biochem. Mol.

24. F., Jaffe A.S. Prognostic Influence of elevated values of cardiac troponin I inpatients with unstable angina. Circulation. 1997; 90(6): 2618-21. • Galvani, M., Ottani, F., Ferrini, D., Ladenson, J.H., Destro, A., Baccos, D.,

25. MP, van der Vusse GJ Fatty-acid-binding protein as a plasma marker for theestimation of myocardial infarct size in humans. Br Heart J 1994;71 (2): 135-40 • Glatz JF, van Bilsen M, Paulussen RJ, Veerkamp JH, van der Vusse GJ,

26. Reneman RS Release of fatty acid-binding protein from isolated rat heartsubjected to ischemia and reperfusion or to the calcium paradox. Biochim

27. Biophys Acta 1988; 1;961(1):148-52• Glatz JF, Van der Vusse GJ, Maessen JG, Van Dieijen-Visser MP, Hermens

28. A.S. Elevated donor cardiac troponin I. A marker of acute graft failure in infantheart recipients. Circulation. 1994; 90(6): 2618-21. • Greig, A., Hirschberg, Y., Anderson, P.A.W., Hainsworth, C, and Malouf, N.N.

29. T, Nomura M, Nagamura Y, Watanabe Y, Hishida H, Tanaka T, Kawamura К

30. Biol. Chem. 1980; 255(20): 9635^0.• Julian DG, Camm AJ, Frangin G, Janse MJ, Munoz A, Schwartz FJ, Simon F.

31. Randomised trial of effect of amiodarone on mortality in patients with leftventricular dysfunction after recent myocardial infarction: EMIAT. European

32. Myocardial Infarct Amiodarone Trial Investigators. Lancet 1997 Mar8;349(9053):657-74 • Karmen A., Wroblewski F., Ladue J.S. Transaminase activity in human blood. J.

33. Clin. Invest,1954, 34, 126-33.• Kato К., Ishiguro Y., Ariyoshi Y. Enolase isozymes as disease markers:

34. Distribution of three enolase subunits in various human tissues. Dis markers,1983, 1,213-20. • Katrukha A, Bereznikova, A, Esakova T, Severina M, Pettersson K., Lovgren, T,

35. Troponin complex for the preparation of tropoin I calibrators and standards.

36. American Association for Clinical Chemistry, 49'^ Annual Meeting, 1997, Clin1. Chem, 43{6):106. • Katrukha A.G., Bereznikova A.V., Esakova T.V., Filatov V.L., Bulargina T.V., and

37. Gusev N.B. A new method of human cardiac troponin I and troponin Tpurification. 1995, Biochem. Mol. Biol. Int., 36, 195-202. • Katrukha AG, Bereznikova AV, Filatov VL, Esakova TV, Kolosova OV,

38. Pettersson K, Lovgren T, Bulargina TV, Trifonov IR, Gracianskyi NA, Pulkki K,

39. Vuopio-Pulkki L-M, Gusev NB. Cardiac troponin I degradation: application forreliable immunodetection. Clin Chem 1998; 44, 12, 2433-2440. • Katrukha, A.G., Bereznikova, A.V., Esakova, T.V., Pettersson, K., Lovgren, Т.,

40. Biochemistry, 26, 7035-7042.• Levine, B.A., Moir, A.J.R., and Репу, S.V. The interaction of troponin-l with the

41. N-terminal region of actin ;1988, Eur. J. Biochem., 172, 389-397.• Li, M.X., Sykes, B.D., Smillie, L.B.; Kay, СМ.; Tsuda, S., and Gagne, S.M.

42. Hamm C.W.; O'Hanesian M.A.; Wagner G.S.; Kleiman N.S.; Harrell F.E. Jr;

43. NH2 terminus of fast skeletal muscle troponin I in its biological activity. 1992 J.

44. Reinach F.C. Concerted action of the high affinity calcium binding sites inskeletal muscle troponin С J. Biol. Chem. 1995; 270(17): 9770-7. • Specht 1996, Bartetzko N, Hohoff, Kuhl, Franke R, Borchers T, Spener F,

45. Matsuda Early detection of cardiac damage with heart fatty acid-binding proteinafter cardiac operations. Ann Thorac Surg 1998; 65(1):54-8 • Swiderek К., Heilmeyer L.M. Jr., Hoffmann F., Schachtele C, Meyer H.E., and

46. Jaquet K. Sites phosphorylated in bovine cardiac troponin T and I.

47. J.D. The role of the four Ca^ "" binding sites of troponin С in the regulation ofskeletal muscle contraction. J. Biol. Chem. 1996; 271(14): 8381-6. • Takeishi, Y., Chu, G., Kirkpatrick, D.M., Li, Z., Wakasaki, H., Kranias, E.G., King,

48. G.L. and Walsh, R.A. In vivo phosphorylation of cardiac Tnl by protein kinase

49. Kawamura K, Morita H, Abe S, et al Human heart-type cytoplasmic fatty acidbinding protein in serum and urine during hyperacute myocardial infarction. Int J

50. J Biol Chem 1990;265(27): 16255-61• Vallins. W., Brand N., Dabhade N., Bulter-Browne G., Yacoub M.H., Barton

51. Maessen JG, Punt CD, Van Dieijen MP, Van der Vusse GJ, Glatz JF

52. Sanders G., Independent prognostic value of C/reactive protein and troponin I inpatients with unstable angina or non-Q-wave myocardial infarction.

53. Cardiovascular research 1999, 42, 240-245.• Wodzig KW, Kragten JA, Hermens WT, Glatz JF, van Dieijen-Visser MP

54. Estimation of myocardial infarct size from plasma myoglobin or fatty acid-bindingprotein. Influence of renal function. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1997; 35(3): 191-8 • Wodzig KW, Kragten JA, Modrzejewski W, Gorski J, van Dieijen-Visser MP,

55. Proposal for the multinational monitoring of trends and determination incardiovascular disease. Geneva: Cardiovascular Disease unit of WHO, 1981. • Wroblewski F., Ladue J.S. Lactic dehydrogenase activity in blood. Proc. Soc.

56. Asayama K, Ishii H,Human heart-type cytoplasmic fatty acid-binding protein asan indicator of acute myocardial infarction Heart Vessels 1995;10(6):304-9. • Young AC, Scapin G, Kromminga A, Patel SB, Veerkamp JH, Sacchettini JC,

57. Histochem Cell Biol 1995; 103(2):147-561. Р0ССИ(>СКЛ51. , 1. Ч Б Л И О Т Е ' ^ . ^ Г у

Информация о работе

Катруха, Алексей Генрихович
доктора биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.04

Диссертация

Тропонин I как маркер инфаркта миокарда - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Тропонин I как маркер инфаркта миокарда ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Тропонин I как маркер инфаркта миокарда"

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Катруха, Алексей Генрихович

Введение Диссертация по биологии, на тему "Тропонин I как маркер инфаркта миокарда"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Катруха, Алексей Генрихович

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Катруха, Алексей Генрихович, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Тропонин I как маркер инфаркта миокарда
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия