Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование взаимосвязи структуры, функции и стабильности в молекуле гормона роста человека: опыт изучения гибридных белков

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование взаимосвязи структуры, функции и стабильности в молекуле гормона роста человека: опыт изучения гибридных белков"

I 6 од

- 8 Ш 1.Я

11а правах рукописи УДК 577.113.5

ЛЕВИЧКИН ИЛЬЯ ВАЛЕНТИНОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ СТРУКТУРЫ, ФУНКЦИИ И СТАБИЛЬНОСТИ В МОЛЕКУЛЕ ГОРМОНА РОСТА ЧЕЛОВЕКА: ОПЫТ ИЗУЧЕНИЯ ГИБРИДНЫХ БЕЛКОВ

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1998

Работа выполнена в Лаборатории дизайна и инженерии белков Центра «Биоинженерия» РАН

Научные руководители:

академик РАН, доктор биол. наук М.П. Кирпичников канд бисш. наук А. А. Шульга

Официальные оппоненты: доктор биол. наук А.Г. Тоневицкий доктор биол. наук С.М. Деев

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится « _» июня 1998 года в 11 часов на заседании

Диссертационного совета Д 200.30.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, Москва, ул. Вавилова, дом 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардга РАН .

Автореферат разослан «_ /5" » мая 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат фармацевтических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Гормон роста человека, продуцируемый передней долей тофиза, состоит из одной полипептидной цепи длиной 191 аминокислотный остаток, на из основных его функций - стимуляция соматического роста. Однако, помимо >го, ГР человека обладает также лакгогенной, инсулинподобной и диабетогенной гивностями, вызывает активацию макрофагов и ряд других биологических эффектов.

ГР был впервые испытан в медицинской практике в 1958 году и с тех пор все тире вменяется для лечения случаев гипофизарной карликовости у детей, а также в 1естве анаболического средства при лечении ожогов и костных переломов. ;ширение практики клинического применения ГР ведет к необходимости детального 'чения его физико-химическических свойств и биологических активностей.

Тот факт, что в основе многочисленных эффектов, вызываемых ГР, лежит его кобность связываться со специфическими рецепторами, расположенными в мбранах клеток, означает, что каждой из активностей этого гормона может быть ггавлен в соответствие определенный участок (или участки) его полипептидной цепи, сартировании такого рода участков за последние 10-15 лет достигнут значительный лресс, в немалой степени благодаря применению методов генной инженерии, гановлен молекулярный механизм узнавания ГР своих рецепторов и цепочка )ытий, которая следует за связыванием лиганда. Решена третичная структура ГР говека в индивидуальном состоянии и в комплексе с рецепторами. Однако, (уктурные основы стабильности ГР изучены слабо. Имеется всего лишь одна работа, : авторы измерили вклад в белковую стабильность остатков, находящихся на №конце рой спирали ГР человека (гЬикоУБку с1 а1., 1994). Взаимосвязь между активностью и бильностью ГР не изучалась вообще. Нет ни одпого случая, когда бы удавалось !ыситъ стабильность гормона при помощи изменения его первичной структуры.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось установление имоотношений между структурой, функцией и стабильностью молекулы ГР человека I помощи конструирования гибридов, составленных из сегментов гзкородственных белков ГР человека/ГР свиньи, и сравнительного изучения их йств. Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие задачи: а) работка метода получения представительного набора гибридных ледовательностей ДНК; б) получение генов гибридных гормонов; в) разработка

высокоэффективной системы экспрессии и очистки гормонов; г) изучеш биологической активности и физико-химических свойств гибридов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработан оригинальны метод получения гибридных последовательностей ДНК - метод рекомбинаци гомологов. Этот метод был использован дня создания набора гибридных генов i основе генов ГР человека и ГР свиньи. Получены бактериальные штамм! продуцирующие в больших количествах природные и мутантные белки (до 300 мг/л Разработала оригинальная схема очистки гормонов. Определена лактогенн; активность гибридов в тесте на клетках Nb2-11С лимфомы и картирован участок 40-' в молекуле ГР человека, ответственный за проявление данной активности. Изучет внутриклеточная растворимость гибридных гормонов при их синтезе в Е. coli. Показа! взаимосвязь между внутриклеточной растворимостью гибридов и их биологическс (лактогенной) активностью. Проведено сравнительное изучение термостабильносл полученных гибридных молекул и их равновесной денатурации в присугствЕ гидрохлорида гуанидина. Обнаружена прямая корреляция между термостабильность гибридных белков и интенсивностью их спектров кругового дихроизма. Установле! прямая зависимость между степенью кооперативное™ перехода глобула - клубок пс действием гидрохлорида гуанидина и внутриклеточной растворимостью гибриднь гормонов.

Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации доложены i следующих российских и международных конференциях: VI-ой Конференщ Российской Федерации «Новые направления биотехнологии» (Пущино, 1994 Международном Зимнем Симпозиуме по Биотехнологии в Майами «Белков; инженерия и структурная биология» (США, 1995), Международной конференщ памяти акад. A.A. Баева (Москва, 1996) и VIII-ой Конференции Российской Фсдеращ «Новые направления биотехнологии» (Москва, 1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано восемь печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на страниц;

машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальго части, результатов и обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Рабо содержит таблиц и рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Разработка и применение метода рекомбинации гомологов для создания ридных белков ГР человека/ГР свиньи.

Гены химерных гормонов получали при помощи метода рекомбинации гомологов 2. 1). Фрагмент ДНК, содержащий ген ГР свиньи, выделяли из плазмидного вектора xHsyn/rec, любезно предоставленного П.М. Рубцовым (Лаборатория гормонов и епторов, ИМБ РАН). В ходе однонаправленной ПЦР с этого фрагмента, используя в естве затравки олигонуклеотид pPGHp3 (5' GGGCAGTTAGAAGGCACAGCTGCT ЗТССАСЗ'), комплементарный 3' концу гена, получали набор гетерогенных по [не одноцепочечных фрагментов ДНК. Фрагменты использовали в качестве ймеров для проведения направленного мутагенеза по Кункелю (Kunkel R,, 1987), -рицей в котором служила урацилсодержащая одноцепочечная ДНК с геном ГР овека. Гегеродуплексиыми молекулами ДНК (1/3 частью) трансформировали dut+, ;+ штамм кишечной палочки XL-1. ДНК отдельных клонов секвенировали по методу ffepa. Всего бьщо проанализировало 32 клона. Последовательность нуклеотидов в .-делах гибридных генов определяли полностью. Результаты представлены на :унке 2. Обнаружено, что в шести клонах ген ГР человека был полностью заменен на ; ГР свиньи, 11 клонов сохранили полную нуклеотидную последовательность гена ГР говека, а 15 клонов содержали различные гибридные варианты. Следует отметить, ) 5'-концевые последовательности генов ГР были идентичны. Только в этом случае ¡можна полная замена гена ГР человека.

Поскольку причиной образования фрагментов-затравок различной длины является 5' экзонуклеазная активность Vent-полимеразы, можно было ожидать появления Зридов только одного типа, а именно составленных из N-концевого фрагмента гена человека и С-концевого фрагмента гена ГР свиньи. Однако, к нашему удивлению, л получен также ряд незапланированных гибридов: четыре с последовательностями свиньи на 5'-конце гена (рис. 26) и два с "мозаичными" заменами (рис. 2в). Такие эианты могут возникать вследствие работы системы репарации в том случае, если 5'-нец мутагенного праймера не замкнут ковалентно, по той или иной причипе, с 3'-нцом вновь синтезированной цепи ДНК. В самом деле, как показали проведенные ми опыты, трансфекция гетеродуплексной ДНК в штамм Е. coli ВМН 71-18 mutL, фектный по системе репарации, приводит к образованию гибридов с заменами только

ген ГР человека

одно цепоя ечная ураодл-содержащая ДНК-матрица

ген ГР свиньи

ген ГР человека

(Ц)

ген ГР свиньи

3'

£соМ

ныт

рвНрЗ

|пцр

одноцепочечные ПЦР-фрашсетъг (Ш) различной длипы

(IV)

ген ГР свиньи ген 1Р человека

ген ГР сяиньи ген ГР человека

сштгез второй цепи, лигиро ванне

трансформация в пп амм сЫ?ип^ЕсоН

набор гибридных гепов ГР человека/ГР свиньи

Рисунок 1. Применение метода рекомбинации гибридных генов для создания набор гибридных генов ГР человека/ГР свиньи: I - Получение одноценочечно урацилсодержащей ДНК-матрицы; II - Выделение ресгрикционного фрагмент: содержащего ген ГР свиньи; 1П - Проведение однонаправленной ПЦР; IV - Сайт направленный мутагенез по Кунхелю.

на 3 '-конце гена ГР человека.

Следует отметить, что в паре генов ГР человека/ГР свиньи нет идентичи расположенных сайтов рестрикции. Это обстоятельство делает невозможны конструирование генов гибридных белков посредством рекомбинации г рестрикционным сайтам. Метод рекомбинации гомологов позволяет решить эп проблему и получить в одном простом эксперименте представительный набс гибридных генов, не прибегая к синтезу большого количества олигонуклеотидо Заменяемые участки имеют различную протяженность и равномерно перекрывай всю длину изучаемой молекулы. Места для отжига ПЦР-праймеров выбираютс

а

О ГР человека

| ГР свиньи

ГР свиньи "12-191" "22-191"

"76-191" С

"87-191" С

"103-191" С

"145-191" С

"163-191" С

"167-191" С

ГР человека С

I 6/32 12/32 | 1/32 I 1/32 I 1/32 | 1/32 I 1/32

■ 1/32

■ 1/32

□ 11/32

в

"12-35"

"1-45/ 168-191"

И 1/32 I 1/32

100 120 140 160 180а

исунок 2. Ряд гибридных генов ГР человека/ГР свиньи. Слева указаны обозначения [бридов. Цифры обозначают номера аминокислотных остатков в гибриде, которые ¿ни перенесены из ГР свиньи. Справа указаны частоты встречаемости гибридов по ¡зультатам секвенирования 32 случайно выбранных клонов, полученных в результате иократного применения метода рекомбинации гибридных генов: а-варианты с менами на С-конце гена ГР человека ("ожидавшиеся варианты"); б- гибридные гены заменами на №конце гена ГР человека; в - гибриды с мозаичными заменами.

юизвольно и могут непосредственно фланкировать интересующую область гена, етод применим также для экспрессии ряда генов родственных белков в векторе, ггорый ранее был сконструирован для экспрессии одного из них. При этом появляется >зможность манипулировать только с кодирующими частями генов, не затрагивая манкирующие их нуклеотидные последовательности. Эффективность конструирования [бридных генов высока и составляет около 50% без применения специфических зтодов селекции. Этот метод был опробован также при конструировании генов [бридных РНК аз барназа/биназа, где он также показал высокую эффективность.

На основе сконструированного набора гибридных генов могут быть получены шолнительные гибриды путем рекомбинации по рестрикционным сайтам. Например, 1риант "12-95" был собран из фрагментов гепов "1-95" и "12-191", по аналогичной :еме были получены также гибриды "87-141" и "138-173".

2. Синтез гибридных гормонов в клетках К coli

Ген ГР человека, равно как и гибридные гены, переклонировали в векто] pGEMEXl ("Promega", США) по сайтам Ndcl и Hindlll, что давало возможное™ использовать для их экспрессии все необходимые регуляторные элементь транскрипции и трансляции гена белка оболочки 10 фага Т7. Сайт расщеплена рестриктазой Ndel в районе инициирующего кодона гена ГР человека был введен нам! ранее при помощи метода олигонуклетид-направленного мутагенеза по Кункелю.

Экспрессию генов проводили в штамме Е. coli BL21 (DE3). Этот штамм являете лизогенным по бактериофагу X(DE3), несущему участок ДНК с геном lacfi и геном I РНК-полимеразы под контролем промотора /acUV5. Таким образом, содержание Т РНК-полимеразы в клетке, а значит и активность целевого гена, клонированного i составе экспрессионного вектора, регулируется индуктором ИГПГ.

Все выбранные нами гибридные гены, всего 13 (рис. 3), а также ген ГР человека экспрессировались в бактериях с выходом белка от 200 до 300 мг па литр культуры.

3. Изучение растворимости химерных белков ГР человека/ГР свиньи в клетка: К coli.

При 37°С более 95% ГР человека локализуется внутри клетки в виде крупны: нерастворимых агрегатов, называемых тельцами включения. Хотя ранее рядом авторо: уже была разработана процедура рефолдинга как ГР человека, так и ГР свиньи из теле] включения, нам представлялось нецелесообразным воспользоваться этими процедурам] для очистки гибридных белков по двум причинам. Во-первых, для растворения тели включения ГР используются жесткие условия - высокие концентрации денатурируюпда агентов и высокие значения pH. Это могло привести к необратимым химическш модификациям гормона. Наш собственный опыт говорит о том, что препараты Г: человека, очищенные из телец включения, крайне неустойчивы при длительно! хранении и склонны к потере биологической активности пр: замораживании/оттаивании. И, во-вторых, процедуры рефолдинга из телец включени ГР свиньи и человека существенно различаются, вследствие чего для каждого новог гибридного белка нам пришлось бы разрабатывать уникальный протокол выделен® Поэтому мы решили подобрать такие условия выращивания клеток, которые б] обеспечили максимальный выход растворимого белка.

Одним из наиболее простых способов добиться этого является понижен»

а

"12-35"

"12-95" "87-141" "138-173" "167-191" "163-191" "145-191" "103-191" "76-191" "22-191" "12-191"

□ ГР-

| ГР свиньи

"40-75" "76-95"

—I—I—I—1—I—1—I—I—I—I—I—i—|—I—I—1—I—I

20 40 60 80 100 120 140 160 180 в.о.

■сунок 3. Структура гибридных генов, экспрессированых в Е. coli: а - гибриды, лученные методом рекомбинации гомологов либо путем рекомбинации фрагментов бридных генов по сайтам рестрикции; б- гибридные гены, полученные полюггельно для более детального изучения влияния замен аминокислотных татков на участке 12-95 ГР человека.

мпературы культивирования клеточной биомассы. Этот подход оказался езвычайно продуктивным в случае ГР человека и ряда гибридных гормонов, шример, при 24°С уже практически весь ГР человека оказывается растворимым ис. 4). Гибридный вариант "138-173" в диапазоне температур от 37 до 24°С наруживается преимущественно в тельцах включения, однако при дальнейшем иижении температуры содержание растворимого белка постоянно растет и достигает 1Имерно 30% при 9°С (рис. 5а).

Попытка применить такой же прием для получения водорастворимого ГР свиньи ончилась неудачей. Во всем диапазоне температур от 37°С до 9°С (при более низкой мпературе культура Е. coli прекращает рост) ГР свиньи обнаруживается в тельцах лючения. Таким же образом ведут себя и гибридные белки с заменами на С-конце, а кже гибрид "87-141". Видимо, склонность этих белков к образованию телец

о

45 кД 31 кД

21,5 кД 14,5 кД

М I 2 3 4 5 6

ЯП* В Ът фф фг

& - - Ц дН

-ттфт

З/С 30°С 24°С

Рисунок 4. Влияние температуры культивирования на внутриклеточную локализацию ГР человека. 1, 3, 5 - суммарный белок штамма, продуцирующего ГР человека, 2, 4, 6 -фракция растворимых белков этого же штамма, М - маркеры молекулярных масс. По; дорожками указана температура культивирования.

включения объясняется отличиями в их кинетике фолдинга. В ряде работ былс показано, что фолдинг ГР человека протекает значительно быстрее, по сравнению < фолдингом ГР свиньи, для которого характерно образование долгоживущю интермедиатов, склонных к ассоциации. Совершенно неожиданные результаты быш получены при анализе внутриклеточной локализации гибрида "12-95". Уже при 37°( этот белок полностью солюбилизирован. Более того, около 20% этого белка остаетс; растворимым, если выращивать клетки при 42°С (рис. 56). Такое поведение резк< отличает его как от ГР человека, так и от ГР свиньи.

Заинтересовавшись этим эффектом (а также отсутствием у этого вариант! лактогенной активности, см. раздел 7), нами были созданы два дополнительны: гибридных варианта - "40-75" и "76-95" (рис. 36). Таким образом, область 12-95 был; разбита на три неперекрывающихся района: 12-35 (этот вариант был получен ране (рис. 2в), 40-75 и 76-95. Растворимость гибридных гормонов при различны: температурах изучалась также как и ранее. Оказалось, что вариант "76-95" проявляе большую склонность к образованию телец включения, чем ГР человека (рис. 5г). Пр] 30°С в растворимой форме присутствует около 20% этого белка, а при 24°С - толью около 30% (в случае ГР человека - 25% и 100% соответственно). Гибриды "12-35" I

а

1 2 3 4 5 6 7 8

5кД 1кД

5кД 5 кД •

б

12 3 4

в

12 3 4

3/С 18°С 13°С 9°С

42°С 37°С 37°С 30°С

1 2 3 4 5 6

45 кД -31 кД-

21,5 кД-14,5 кД-

щ щ-ттт

^в? -

#

37°С 30°С 24°С

1 2 3 4 5 6

44« .--'»

" „V-

42?С 37°С 30°С

'исунок 5. Влияние температуры культивирования на растворимость гибридных ГР: а вариант "138-173", б - "12-95", в - "12-35", г - "76-95", й - "40-75". На нечетные [орожки нанесен суммарный клеточный белок, на четные - фракция растворимых ¡елков соответствующих штаммов - продуцентов. Под дорожками указана температура ультивирования клеток.

40-75", напротив, обладают повышенной по сравнению с ГР человека растворимостью, 'же при 30иС около 100% этих гибридных белков солюбилизировано, а при 37°С эта для составляет примерно 7% для гормона "12-35" и около 30%- в случае гибрида

"40-75" (рис. 5в и Ö).

Таким образом, гомологичные замены остатков в пределах участка 12-75 Г человека препятствуют образованию телец включения. При этом наблюдаете "аддитивное" действие вводимых замен - гибрид "12-95" более солюбилизирова] нежели "12-35" или "40-75".

Согласно существующим представлениям, процесс сворачивания белковой глобул начинается с так называемого гидрофобного коллапса, сопровождающегося ил предшествующего образованию элементов вторичных структур. В случае ГР этот эта длится десятки миллисекунд и является самым быстрым этапом фолдинга (Youngman i al., 1995). Для него характерны взаимодействия аминокислотных остатко; составляющих гидрофобное ядро молекулы. Детальное изучение фолдинга РНКаз Bacillus amyloliquefaciens (барназы) и анализ структуры других микробных РНК; показывает, что аминокислотные остатки, вступающие во взаимодействия, характерны для нативного белка уже на ранних этапах сворачивания полипептидной цепи, наиболе консервативны, что может отражать решающую роль этих остатков в направлении бел! на правильный путь фолдинга, минуя образование непродуктивных конформаций. К заключительных этапах фолдинга происходит "доводка" или уточнение третично структуры белка (самый продолжительный этап в сворачивании полипептидной цепи характерным временем от нескольких секунд и более) и образуется устойчивая систем внутримолекулярных водородных связей. Рассмотрим подробнее, каким образо аминокислотные замены, произведенные в ГР человека, могут влиять на этот процесс.

Наибольшее влияние на величину константы скорости ассоциации комплекс оказывают электростатические взаимодействия. Следовательно, изменен? распределения зарядов на поверхности белковой глобулы может как облегчить, так наоборот, затруднить установление межмолекулярных контактов, приводящих образованию телец включения. В обоснованности такого вывода убеждают и результат ряда авторов, согласно которым мутации, затрагивающие заряженные аминокислот! изменяют характер распределения белка между растворимой фракцией и тельцам включения (Chrunyk В. et al., 1993; Mitraki А. et al., 1991). В рассматриваемых гибрида были произведены множественные замены заряженных аминокислотных остатков Hisl8Gln, Argl9His, Gln29Lys, Glu33Arg, Lys38Glu, Glu39Gly, Lys41Arg, Arg64Ly Glu65Asp, Lys70Arg, Asn72Asp, Glu88Gly, Arg94S, Ser95Arg - что, безусловно, изменил

арактер распределения зарядов на поверхности глобулы и могло повлиять на процесс ежмолекулярной агрегации и, следственно, на растворимость белка.

В свою очередь, в стабилизации межмолекулярных комплексов большое значение грают гидрофобные взаимодействия. Стоит отметить, что в обоих гибридах, роявляющих повышенную растворимость - "12-35" и "40-75", - имеются замены эоматических остатков. В гибриде "12-35" в положении 25-го остатка вместо Phe стоит Ja, а в гибриде "40-75" делегирован Phe44. Зависимость растворимости гормонов от гмпературы позволяет говорить о возможном гидрофобном характере взаимодействий ри формировании нерастворимых внутриклеточных ассоциатов, поскольку известно, го эти взаимодействия усиливаются с температурой.

Полагают, что на образование телец включения влияют сразу несколько факторов, их числу можно отнести: ограниченную растворимость белка в нативной энформации, склонность к агрегации полипептидных цепей сразу после освобождения з рибосомы или в состоянии стабильного интермедиата, восстанавливающие условия итоплазмы клеток Е. coli. Возможно, цепочка событий, приводящая к внутриклеточной реципитации каждого конкретного белка, имеет свои особенности. В случае ГР еобходимо учитывать, например, наличие в его молекуле дисульфидных связей, [евозможность их образования в цитоплазме клеток Е. coli в значительной степени естабилизирует структуру белка (в случае ГР человека вклад двух дисульфидных связей эставляет около 9 ккал/моль) и, несомненно, способствует накоплению стабильных авновесных интермедиатов фолдинга и ассоциатов подобно тому, как это имеет место в пучае ГР быка и свиньи.

Участок 12-75 включает в себя первую а-спираль и неструктурированную область ежду первой и второй а-спиралями. В молекуле ГР человека оба эти элемента грукгуры и, кроме того, С-концевая а-спираль, пространственно сближены и участвуют построении двух центров связывания (эпитопов) с рецептором ГР или пролактина. (В олекуле ГР свиньи, поскольку он не является лактогеном, соответствующий центр вязывания с рецептором пролактина отсутствует). Эпитопы сильно перекрываются, но е совпадают. В их центральной части расположен кластер из гидрофобных минокислотных остатков, окруженных гидрофильными и частично гидратированными статками. Аналогично организованные эпитопы имеются и у рецепторов. В комплексе ецептор - лиганд комплементарные эпитопы взаимодействуют друг с другом, образуя

сильно упакованный гидрофобный кор, вокруг которого формируются несколько солевы мостиков и водородных связей. Можно предположить, что именно взаимодейсгви экспонированных гидрофобных остатков, составляющих эпитопы, является движуще силой в образовании внутриклеточных ассоциатов ГР. Повреждение центра связывания рецептором пролакгина в результате "прививки" сегментов из неактивного белка могл бы приводить в таком случае к повышению растворимости гибридных гормонов in viví что мы и наблюдаем в эксперименте.

Полученные нами данные по биологическому тестированию гибридов на крысино линии клеток Nb2-llC лимфомы (см. раздел 7), говорят о том, что наиболыпе растворимостью in vivo обладают именно те белки, у которых либо полносты отсутствует, либо сильно повреждена лактогенная активность, - варианты "12-95" и "4С 75". Таким образом, не исключено, что образование телец включения являете следствием суперпродукции биологически активных белков в гетерологичных системах.

4. Препаративное выделение ГР человека и гибридных гормонов.

ГР человека и те из гибридов, которые удалось получить в растворимом виде - "12 95", "12-35", "40-75", "76-95" и "138-173", - были очищены в препаративны количествах (от 2 до 40 мг гомогенпого лиофилизованного белкового препарата).

После разрушения клеток ультразвуком, отделения водонерастворимого дебриса осаждения нуклеиновых кислот полиэтиленимином белки разделяли анионнообменно хроматографией на колонке, заполненной Q-сефарозой, и затем гидрофобно хроматографией на колонке "Phenyl Superóse HR 10/10" ("Pharmacia", Швеция Окончательную доочистку проводили на колонке "Mono Q HR 10/10" ("Pharmacia' Швеция). Таким образом, нами была разработана "щадящая" процедура получения ГР его гибридов - все этапы очистки проводили в водных буферных растворах, в содержащих денатурантов, в диапазоне изменения рН от 7,0 до 7,6. Степень очистк белковых препаратов, по результатам ПААГ-электрофореза, составила не менее 95"/ Все дисульфидные связи в белках окислены. Гель-фильтрация на откалиброванной п молекулярным весам колонке показала, что молекулы ГР и гибридных белков находятс в мономерной форме.

Как показали дальнейшие эксперименты, очищенные таким образом препарат] гормонов полностью пригодны для физико-химических и биологических исследований.

Масс-спектрометрический анализ очищенных препаратов ГР человека и его [бридных аналогов.

Правильность первичной структуры изучаемых белков и чистоту выделенных >епаратов проверяли при помощи масс-спекгрометрии. Эта работа была проведена «местно с Д-ром Аденьером из Технологического Университета в Компьене, Франция. :зультаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты масс-спектрометрического анализа очищенных препаратов.

Образец Молекулярная масса белка (М,)*, а.е.м.

Расчетное значение Экспериментальное значение

ГР человека 21982 21977

"12-95" 21490 21485

"12-35" 21873 21866

"40-75" 21709 21701

"76-95" 21944 21937

'Приведены теоретические значения молекулярных масс с учетом отщепления М-сонцевого остатка метионина.

Молекулярные массы образцов совпадают в пределах ошибки эксперимента с ючетными значениями и, следовательно, есть все основания полагать, что первичная ■руктура белков не отличается от заданной. В использованной нами системе экспрессии роисходит эффективное отщепление N-концевого остатка метионина. Гомогенность репаратов ГР составляет пе менее 95%.

, Металло-хелат аффинный гель электрофорез ГР человека и гибридных белков .

Ранее в работах Cunningham и соавт. было показано, что наличие ионов цинка резко эвышает сродство ГР человека к рецептору пролактина человека (РеПРЛЧ). В рисутствии 50 мкМ ZnClz константа связывания гормона с рецептором почти на четыре орядка выше, чем в присутствии 1 мМ EDTA. Сайт связывания цинка формируется вумя аминокислотными остатками в молекуле РеПРЛЧ (Asp217 и His218) и двумя чинокислспными остатками в молекуле гормона (Hisl8 и Glul74) и расположен в месте энтакта гормона и рецептора (Somers et al., 1994; Cunningham et al., 1990). Отсутствие актогенной активности у ГР неприматов связывали с отсутствием в 18-ом положении олипептидной цепи остатка His, вследствие чего эти гормоны теряют способность оординировать атом цинка. Хотя у ряда гормонов, в том числе и у ГР свиньи, в близком

19-ом положении имеется остаток His, считалось, что этот остаток стсричесю недоступен, поскольку находится на гидрофобной стороне спирали, обращенной внутр] белка. Ионы цинка увеличивают в несколько раз лакгогенную активность ГР человека i тесте на клетках Nb2-llC лимфомы, из чего можно сделать вывод, что ионы цинк: важны также и для связывания ГР человека с лактогенными рецепторами крысы Поскольку ионы Zn2+ играют такую большую роль во взаимодействии ГР человека < РеПРЛЧ, нам представлялось крайне важным изучить способность гибридов связывал соответствующие ионы.

Метод мегалло-хелат аффинного гель электрофореза (МХАГЭ) позволяем определять константы диссоциации комплекса хелатированный металл-белок и н: основании этого строить предположения о топографии металл-связывающих сайтов н; поверхности белковой глобулы. Мы применили МХАГЭ для исследованш взаимодействия двух сконструированных нами белков - "12-35" и "12-95" - ( хелатированным ионом Zn2\ Выбор белков основывался на том, что, во-первых, в обою гибридах His 18 отсутствует и, значит, по существующим представлениям, они не должны связывать ион цинка. Во-вторых, как будет показано ниже, один из них - "12-35' - обладает в полной мере лактогенной активностью, а другой - "12-95" - ее утратил Таким образом, сравнительное изучение гибридов позволило бы установить взаимосвязт между активностью гормона и его способностью связывать ионы цинка. Эта работа былг выполнена совместно с Лабораторией молекулярных взаимодействий и технологии разделения Технологического Университета в Компьене, Франция и Лабораторией инженерии белков Центра "Биоинженерия" РАН.

Проведенные нами эксперименты по металло-хелат аффинному электрофорезу ГР человека и гибридных вариантов "12-35" и "12-95" в системе полиакриламид/ПЭГ-ИДК-Zn(II) однозначно показали, что гибриды "12-35" и "12-95" не утратили способности к взаимодействию с хелатированным ионом Zn2+. Более того, определенные нами константы диссоциации Кл для белков "12-35" и "12-95" (6,4 и 10,3 мМ соответственно, против 20,9 мМ для ГР человека) указывают на более прочное связывание этих белков с сорбентом. (Kd определяли по методу Bog-Hanscn и Taketo, используя уравнение: (do-d)/do=L/(L+Kd), где d - расстояние, пройденное белком при концентрации лиганда L, do -расстояние, пройденное белком при нулевой концентрации лиганда, Ка - константа диссоциации комплекса). Этому можно дать два объяснения. Первое заключается в том,

5 ГР может взаимодействовать с ионом Zn2+ в хелатированном состоянии иначе, чем свободным ионом. Второе объяснение состоит в том, что в молекуле ГР человека, 5можно, имеется два или более металл-связывающих сайта, которые обеспечивают инаково прочное взаимодействие с хелатированным ионом цинка. I основании полученных данных можно предположить, что отсутствие лакгогенной гивности ГР свиньи и гибрида "12-95" (см. раздел 7) следует приписать не их способности связывать ион Хп*, а каким-либо иным причинам, например, сильному вреждению интерфейса связывания с рецептором.

Исследование лактогенной активности гибридных аналогов ГР человека.

Лактогенную активность мутантных аналогов ГР определяли в стандартном тесте пролиферацию клеток крысиной лимфомы линии №2-11С. Эта работа была иолнена совместно с Центром молекулярной диагностики и лечения, Москва.

Активность оценивали по увеличению количества предварительно нхронизированных клеток в ответ на добавление в культуру ГР либо его мутантных алогов. Гормоны, не обладающие лакгогенной активностью, в частности ГР приматов, пролиферативной активностью в данном тесте не обладают. Результаты мерения пролиферативной активности исследуемых гормонов при различных нцентрациях представлены на рисунке 6. Деление клеток детектируется уже при 0,2 А ГР человека, при увеличении концентрации гормона число клеточных делений в иницу времени монотонно возрастает, выходя на плато при концентрациях 30 пМ и ппе. Видно, что гибриды "12-35", "76-95" и "138-173" не отличаются (или слабо личаются) по активности от ГР человека. Напротив, гибрид "12-95" полностью рачивает пролиферативную активность, что, очевидно, вызвано введением множества мен. В этом гибриде область, соответствующая последовательности ГР свиньи, нимает 40% полипептидной цепи, включая большую часть первой спирали, полностью орую, а также участок между ними. С целью выявления функционально значимых йонов в пределах участка 12-95 нами были созданы гибриды "12-35", "40-75" и "76>". При этом участок 12-95 оказывается поделенным на три неперекрывающихся лона: в гибриде "12-35" замены локализуются в первой спирали (за исключением :рвых пяти ее аминокислотных остатков), в "76-95" - во второй спирали целиком, а в 0-75" - в пределах участка между двумя спиралями. Здесь надо отметить, что согласно иным Сшшт^ат и соавт., аминокислотные остатки 1-12, а также 35-38 находятся вне

УВЕЛИЧЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК ЗА 72 ЧАСА, %

300 П

200

250

100

150

I I I 11111 [-1—I I I 1ПИ[-1—11111'lUj-1—ГТТТТТТТ]-1 I I

"П

0,01 ОД 10 100

КОНЦЕНТРАЦИЯ ГОРМОНА, пМ

Рисунок 6. Стимуляция пролиферации предварительно синхронизированных клеток N1)2-11С различными концентрациями ГР человека и гибридных гормонов:

■ -ГР человека, ф -"12-95", ♦-"12-35", ▲ - "40-75", • - "76-95", ▼-"138-173".

функционально-важных областей, что, до некоторой степени, позволяет исключить и: из рассмотрения.

При испытании лактогенной активности вариантов "12-35", "40-75" и "76-95" в тесте н клетках КВ2-лимфомы были получены следующие результаты. Аналогично "138-173' гибриды "12-35" и "76-95" неотличимы по активности от ГР человека. Гибрид "40-75' напротив, демонстрировал ярко выраженное снижение пролиферативной активности Так, клетки начинали пролиферировать лишь при концентрации белка "40-75' равной 8 пМ (для ГР человека такая "пороговая" концентрация равна 0,2 пМ), удвоение количества клеток в течение 72 часов происходит при концентрации гормон "40-75" равной 440 пМ (тогда как в случае ГР человека при 2 пМ). Совершены! очевидно, что причиной резкого снижения активности гормона являются мутации участке 40-75: Lys41Arg, APhe44, Pro48Ala, Thr50Ala, ScrSlAla, Lcu52Phe, Ser57Thi Thr60Ala, Ser62Thr, Asn63Gly, Arg64Lys, Glu65Asp, Thr67Ala, Lys70Arg, Asn72 Asf Leu73Val.

Согласно данным Cunningham, Wells и соавт., аминокислотные остатка взаимодействующие с РеПРЛЧ, располагаются в середине первой спирали (Hisl8, His21 Phe25), середине участка, соединяющего первую и вторую спирали (Ile58, Ser62, Asn63

С-конце четвертой спирали (Argl67, Lysl68, Lysl72, Glul74, Phel76, Argl78). Два ггатка гормона (Hisl8 и Glul74), а также два остатка рецептора (Asp217 и His218) юрдинируюг ион Zn2+ в интерфейсе связывания гормон-рецептор. Димеризация :цепторов я'вляется, по-видимому, необходимым условием передачи гормонального «гнала внутрь клетки. Во всяком случае, всего лишь одна замена Glyl20Arg, юкирующая димеризацию рецепторов, инактивировала гормон в тестах на клетках 1мфомы крысы NB2-11С и клетках мыши FDC-P1, трансфсцированных геном РеПРЛЧ, оделенным из клеток гепатомы человека.

Ряд данных говорит о том, что механизмы связывания гормона с рецепторами эисы и человека отличаются. Например, в случае мутанта Lys 168 Ala'Glu 174Ala, для эторого было показано падение в 8000 раз аффинности к клонированному РеПРЛЧ, Знаружено драматическое падение активности (более чем в 6000 раз в перерасчете на гйствующие концентрации (ECso) гормонов) в тесте на клетках FDC-P1, несущих тонированные РеПРЛЧ, и лишь незначительное падение активности на клетках NB2-1С (всего лишь в 12 раз). Возвращаясь к результатам наших опытов, отметим, что стивность гибрида "12-35" не отличается от активности ГР человека. Тогда как по хнным Wells замена участка 11-33 приводит к возрастанию константы диссоциации змилекса гормон-РеПРЛЧ более чем в 400 раз. Обнаруженная нами полная потеря стивности гибридом "12-95" и более чем 200-кратное падение активности гибрида "405" в тесте на КЪ2-лимфоме, означает, что в пределах участка 40-75 находятся лпношелотные остатки, формирующие сайт взаимодействия с рецептором пролактина тысы.

Спектроскопия кругового дихроизма гибридных гормонов роста.

Результаты, описываемые в этом и двух последующих разделах были получены )вместно с Лабораторией конформационной стабильности белков и физических егодов анализа, ЙМБ РАН.

Количественный сравнительный анализ гибридов оказывается возможным только в )м случае, если в ходе мутагенеза не происходит существенных изменений третичной груктуры белка. Поэтому для отслеживания конформационных изменений в гибридах ыл применен КД в далекой УФ-области спектра. КД-спектроскопия в диапазоне длин элн 185-250 нм является методом, чувствительным к изменению процентного ) держания а-спиралей и р-слоев в белковых молекулах и позволяет контролировать

Рисунок 7. Спектры кругового дихроизма ГР человека и гибридных гормонов: 1 гибрида "12-35", 2 - "12-95", 3 - "40-75", 4 - ГР человека, 5 - "76-95".

изменения во вторичной структуре белка при введении аминокислотных замен в ег первичную структуру.

Спектр КД ГР человека (рис. 7, кривая 4) является типичным для белка с высоки! содержанием а-спиралей (по данным рентгеноструктурного анализа, в построении ег четырех а-спиралей принимают участие 54-58% аминокислотных остатко! спектр содержит два характерных минимума на 208 и 222 нм, и совпадает опубликованным ранее). Все спектры гибридных белков (рис. 7) имеют форм; практически идентичную форме спектра ГР человека. Это свидетельствует об отсутстви существенных изменений в их вторичной структуре. Однако, амплитуды спектров характеристических минимумах и максимумах несколько различаются. Эти отличи могут быть вызваны либо изменениями внутренней геометрии а-спиралсй, н приводящими к изменению общего их количества (данный феномен был ранее описа Сирег и соавт.), либо изменением окружения ароматических остатков Последне отражается на точности определения концентраций белка, используемых нр вычислении молярной эллиптичности.

9. Термостабильность гибридных гормонов роста.

Существует гипотеза, согласно которой остатки, вовлеченные в связывани лиганда или катализ, не являются оптимальными для белковой стабильности. В случа

\ лизоцима (Shoichet et al., 1995) и белкового ингибитора барстара (Schreiber et al., 394) справедливость этой гипотезы нашла подтверждение. Поскольку гибридные >рмопы имели различную пролиферативную активность, предоставлялась возможность эоверить справедливость этой гипотезы и на ГР человека, измерив конформационную ■абильность каждого из гибридов.

лияние мутаций на термодинамические параметры тепловой денатурации гормонов >шо изучено при помощи метода дифференциальной сканирующей икрокалориметрии. На рисунке 8 приведены зависимости избыточной молярной ¡плоемкости ГР человека и его гибридных аналогов от температуры. Во всех случаях эоцесс денатурации был необратим. Парциальная теплоемкость ГР человека и ■бридов при 25°С одинакова и составляет (0,34 ± 0,02) кал/К-г. Это значение является тичным для компактных глобулярных белков. Величина калориметрической ггальпии денатурации ГР человека, определенная по площади пика теплопоглощения, шна 48 ккал/моль, что вдвое меньше средних значений энтальпии денатурации, ютветствующей полному разворачиванию белковой глобулы. Температура ¡натурационного перехода ГР человека, соответствующая максимуму шориметрического пика (рис. 8, кривая 1), равна 81°С. Из рисунка 8 видно, что в висимости от произведенных замен наблюдается смещение кривых теплопоглощения 1к в область более высоких, так и в область более низких температур. Для гибридов 0-75", "12-95" и "12-35" температура денатурации повышается на 2,7, 4,0 и 8,3°С, ютветственно, а для гибрида "76-95" понижается на 6°С. Значения температур :пловой денатурации исследуемых белков приведены в таблице 2.

Для сопоставления термодинамической и структурной информации для ГР шовека и гибрида "12-95" была снята температурная зависимость эффекта КД на длине >лны 222 нм. Раствор белка нагревали до 90 С со скоростью 1 К/мин. ГР человека зетерпевал кооперативный переход при температуре 81,2°С, а мутант "12-95" - при ),6°С. Эти значения очень близки к полученным ранее при помощи метода :анирующей микрокалориметрии (табл. 2). Однако, амплитуда КД для ГР человека при :мпературе 90°С составила около 50% от первоначальной. Это свидетельствует о [хранении в денатурированном белке около 50% а-спиральных структур.

Сравнение результатов КД и калориметрии позволило обнаружить корреляцию гжду амплитудой спектров КД на 222 нм при 20°С, которая является мерой количества

Температура,°С

Рисунок 8. Зависимость избыточной молярной теплоемкости ГР человека и гибридны гормонов от температуры: 1 - ГР человека, 2 - гибрид "76-95", 3 - "40-75", 4 - "12-95", 5 гибрид "12-35".

и качества а-спиральных структур, и температурой денатурации изучаемых белков (таб. 2). Увеличению амплитуды КД в ряду из пяти гибридных белков соответствует рос температуры денатурации этих белков. Это косвенно подтверждает наше предположен о том, что интенсивность сигналов КД определяется геометрией а-спиралей. В само деле, структурные перестройки спиралей неминуемо должны приводить к изменсни] количества взаимодействий, стабилизирующих молекулу в целом, а это, в свою очеред; должно влиять на температуру денатурации белка. Отметим, что для гибридног варианта "40-75", замены в котором вообще не затрагивают а-спиралей, амплитуг спектра КД при 222 нм практически совпадает с этим параметром для ГР человека, изменение термостабильности минимально.

10. Равновесная денатурация гидрохлоридом гуанидина ГР человека и гибридны белков.

Изучению процесса равновесной денатурации ГР человека, а также некоторы других ГР (свиньи, быка), под действием ОиНС1 посвящено много работ. Показано, чт ГР человека является белком, очень устойчивым к действию денатурирующих агенто! чего нельзя сказать о ГР свиньи и быка. Так, по данным разных авторов, равновесие

точка денатурационного перехода для ГР человека при нейтральных значениях рН достигается при 4,5-4,6 М виНС!, в то время как для ГР свиньи - при 2,7-3,1 М ОиНС1, а

и -К ч

« Я и Л а

1«

1 =

и « о И к в

ч к

К и

о Н

»9 я

Д я

100 1

80-

60

40 -

20-

2 4 6

Концентрация виНС!, М

Концентрация ОиНС1, М

ясунок 9 Равновесная денатурация ГР человека и гибридных белков при помощи иНС1: а - зависимость интенсивности КД на 222 нм от концентрации виНО ля: ■ - ГР человека, • - гибрида "12-95", А- гибрида "12-35", Т- гибрида "40-75", ► - гибрида "76-95"; б - рассчет зависимости свободной энергии денатурации Л в ля тех же белков.

для ГР быка - при 3,1-3,8 М GuHCl. В диапазоне концентраций ГР 0,1-1 мг/мл свободн, энергия Гиббса перехода нативное - денатурированное состояние (AGh2OJ для 1 человека была определена как 11-14 ккал/моль. Однако, при увеличении концентрат гормона AGh20 имеет тенденцию к понижению и достигает значения 6,5 ккал/моль nf концентрации ГР человека 11 мг/мл. По-видимому, это связано с усилением нроцессс межмолекулярной ассоциации в концентрированных растворах белков. Для ГР свиньи быка свободная энергия разворачивания (AGh20) составляет соответственно около 7 и ккал/моль. Хотя исследования зависимости этих величин от концентрации белка i проводились, не вызывает сомнения, что такая зависимость существует, посколы агрегация под действием GuHCl наблюдается даже в разбавленных растворах эп белков (менее 0,5 мг/мл) (Bastiras et al., 1992 и Brems et al., 1990).

Данные по равновесной денатурации ГР человека и гибридных белков гк действием GuHCl представлены на рис. 9. Для анализа денатурационных кривых nav был применен метод линейной экстраполяции, в соответствии с которым свободн; энергия разворачивания (AGd) белка в растворе GuHCl с концентрацией [D] равняет! AGH20 - m [D],

По результатам анализа для каждого из гибридов были определены: свободн; энергия денатурации в отсутствии денатуранта AGh20, D;0% - концентрация денатурат в равновесной точке денатурационного перехода, а также параметр ш, который можь рассматривать в качестве меры кооперативное™ разворачивания белковой молекул (таблица 2).

Таблица 2. Молярная эллиптичность при 222 нм, температура тепловой денатурацш и параметры равновесной денатурации под действием GuHCl для ГР человека и en гибридов.

Гормон [61J22X10-4 т*. AGlliO, D50%, m,

град см2дмоль"! (°C) ккал/моль M ккал/моль M"'

hHG («12-35») -2,228 89,3 14,4 4,77 -3,02

hGH («12-95») -2,061 85,0 19,5 4,85 -4,02

hGH («40-75») -1,986 83,7 13,0 4,54 -2,85

hGH (wt) -1,939 81,0 10,9 4,54 -2,39

hGH («76-95») -1,815 75,0 10,2 4,33 -2,36

Ошибка определения величин AGH20 и m составляет 8%, D50% и [6]222 - 1%, Td - 0,2%.

Видно, что в результате введения мутаций свободная энергия разворачивания ЗН20 практически всех белков увеличилась, в одном случае ("12-95") весьма сильно -эчти в два раза Это тем более странно, что гибриды содержат последовательности из Р свиньи, более лабильного к воздействию химических денатурантов нежели ГР уювека. Единственным исключением является гибрид "76-95", у которого AGH30 юныпилось, хотя и незначительно, если принять во внимание ошибку эксперимента, [метим, что характерные для каждого из гибридов концентрации денатуранта в точке тновесного перехода отличаются слабо и основной вклад в увеличение ДОН:0 вносит :личина т. Ранее было показано, что эта величина прямо пропорциональна разнице в ¡ступной площади поверхности нативного и денатурированного белка (AASA) (Myers et ., 1995). Таким образом, можно сделать вывод, что, либо увеличение m связано с геличением компактности гибридов, либо же с уменьшением межмолекулярной регации в процессе разворачивания под действием GuHCl. Наличие агрегатов делает ¡правомочным применение метода линейной экстраполяции, рассматривающего юцесс денатурации как одномолекулярную реакцию перехода между двумя i стояниями, и эффективно уменьшает расчетную величину AGHjO за счет уменьшения эдуля m (DeFelippis et al., 1993).

Данные по тепловой и химической денатурации гибридов хорошо согласуются друг другом. И в том и другом случае стабильность практически всех белков, за ;ключепием "76-95", выше, чем ГР человека. Однако, корреляция не является «олютной. Наиболее устойчивым к тепловой денатурации оказался гибрид "12-35", гда как свободная энергия разворачивания, рассчитанная по данным плавления иНС1, оказалась выше у гибрида "12-95". Эти различия могут быть обусловлены тождественностью конечного состояния белка при различных денатурирующих 13дсйствиях на него. Так, ранее Aune с соавт. показали, что при добавлении GuHCl к зличным белкам после их тепловой денатурации происходит дальнейшее разрушение таточной вторичной структуры белка, сохранившейся после тепловой денатурации, эугой причиной неполного соответствия результатов экспериментов по химической и пловой денатурации гибридов может быть упомянутая выше ассоциация юмежуточных (частично развернутых) форм исследуемых белков.

Сравнивая абсолютные значения m и внутриклеточную растворимость гибридных рмонов, нами была обнаружена интересная закономерность - чем выше абсолютная

величина m, тем выше растворимость белка. Так, белок "12-95", значение m дл которого максимально по абсолютной величине, (-4,02 ккап/моль М"1), имсс наибольшую растворимость в ряду изученных гормонов (при 37°С - 100%-а растворимость). Гибриды "12-35" и "40-75" с промежуточными значениями m (-3,02 и 2,85 ккал/моль М'1 соответственно) солюбилизированы полностью только при 30иС Белки "76-95" и ГР человека, значение ш для которых оказалось наименьшим (-2,36 и 2,39 ккал/моль М'1 соответственно), имеют явную тенденцию к образованию теле включения (при 30°С растворимо 20% белка "76-95" и 25% ГР человека). Это наводит н мысль, что величина ш зависит от склонности испытуемых белков образовываг стабильные ассоциаты в ответ на дестабилизацию структуры. В самом деле, как внутр: клетки, так и в денатурирующем растворе структура гормона очень лабильна. В одно; случае это объясняется невозможностью образования дисульфидных связей восстанавливающей атмосфере цитоплазмы клеток Е. coli (известно, чт энергетический вклад дисульфидных связей в конформационную стабильность Г, человека очень существенен - около 9 ккал/моль), а в другом - является следствие! множественных взаимодействий аминокислотных остатков белка с молекулам! денатуранта. И в том и в другом случае, это создает предпосылки для образовали крупных белковых ассоциатов (телец включения) посредством гидрофобны взаимодействий аминокислотных остатков, которые в нативном белке располагаютс внутри глобулы.

Корреляция, обнаруженная нами, может указывать на то, что денатурация гибридо под действием GuHCl сопровождается ассоциацией интермедиатов, которая реализуете через взаимодействие тех же аминокислотных остатков, что и образование теле: включения в процессе биосинтеза

выводы

Разработан оригинальный метод конструирования гибридных генов - метод рекомбинации гомологов. При помощи этого метода получены гены гибридных белков ГР человека/ГР свиньи.

Изучена внутриклеточная растворимость гибридных гормонов в штаммах Е. coli и произведена очистка некоторых из них -"12-95", "12-35", "40-75", "76-95" и "138173" - в препаративных количествах.

Изучено взаимодействие ГР человека и химерных белков "12-95" и "12-35" с хелатированным ионом Zn2+ методом металло-хелат аффинного гель электрофореза в системе полиакриламид/ПЭГ-ИДК^п(П). Показано, что мутации Ilisl 8Gln и /\rgl9His не изменяют характер связывания ГР человека с хелатированным ионом Zn2+.

Определена биологическая активность четырех гибридных белков ГР человека/ГР свиньи в тесте на клетках Nb2-llC лимфомы крысы. Установлено, что участок последовательности ГР человека 40-75 важен для связывания с рецептором пролактина крысы. Показана лучшая внутриклеточная растворимость гибридов с пониженной лактогенной активности.

Проведено сравнительное исследование ГР человека и гибридов "12-95", "12-35", "40-75" и "76-95" методами дифференциальной сканирующей адиабатической микрокалориметрии, кругового дихроизма и равновесной денатурации под действием гидрохлорида гуанидина. Обнаружена прямая корреляция между термостабильностью гибридных белков и интенсивностью их спектров КД при длине волны 222 им.

Установлена прямая зависимость между абсолютной величиной т, характеризующей степень кооперативное™ перехода глобула-клубок под действием гидрохлорида гуанидина, и внутриклеточной растворимостью гормонов.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. И.В.Левичкин, А.А.Шульга, Д.А.Арсеньева, М.П.Кирпичников (1998 "Внутриклеточная растворимость гибридных гормонов роста" - Молскулярнг биология, т.32, 2, стр.317-322.

2. Ю.В.Белоусова, А.А.Шульга, А.Э.Габриэлян, И.В.Левичкин, С.А.Лопатш Б.К.Чернов, И.В.Захарова, Н.В.Кузина, Л.И.Михайлова, Е.Ю.Москалев; Т.Я.Кондратенко, Е.С.Северин, К.Г.Скрябин, М.П.Кирпичников (1996): "Биологическа активность рекомбинантного гормона роста человека и его мутантных аналогов". Молекулярная биология, т.ЗО, 3, стр.673-680.

3. И.В.Левичкин, А.А.Шульга, Ф.Т.Курбанов, М.П.Кирпичников (1995): "Новы подход к конструированию гибридных генов - "метод рекомбинации гомологов" Молекулярная биология, т. 29, 5, стр. 983-991.

4. A.A.Schulga, I.V.Levichkin, F.T.Kurbanov, A.L.Okorokov, G.E.Posmogovi M.P.Kirpichnikov (1994): "An approach to construction of hybrid polypeptide molecule; homologue recombination method" - Nucl. Acids Res., v.22, 18, p.3808-3810.

5. И.В.Левичкин, А.А.Шульга, Ю.В.Белоусова, И.И.Протасевич, Д.А.Арсеньев; А.А.Макаров, К.Г.Скрябин, М.П.Кирпичников (1998): "Исследование взаимосвяз структуры, функции и стабильности в молекуле гормона роста человека: опыт изучеми гибридных белков" - VIII конференция Российской Федерации "Новые направлени биотехнологии", тезисы докладов, Москва, стр.61.

6. А.А.Шульга, Ф.Т.Курбанов, И.В.Левичкин, Б.Ранджбар, И.И.Протассви1 М.П.Кирпичников (1996): "Близкородственное "скрещивание" белков: изучени гибридных гормонов роста и РНКаз" - Международная конференция, посвященна памяти академика Баева, тезисы докладов, Россия, стр.105.

7. A.A.Schulga, I.V.Levichkin, F.T.Kurbanov, M.P.Kirpichnikov (1995): "An approac to construction of hybrid proteins" - Miami 1995 Biotechnology Winter Symposia, Advances i; Gene technology: Protein Engineering and Structural Biology, abstracts, Miami, USA, (vol.6] P 9.

8. И.В.Левичкин, А.А.Шульга, Ф.Т.Курбанов, М.П.Кирпичников (1994): "Новьи подход к конструированию гибридных генов" - IV конференция Российской Федераци! "Новые направления в биотехнологии", тезисы докладов, Пущино, стр.86.