Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунохимическое исследование гормона роста в биологических жидкостях и тканях человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммунохимическое исследование гормона роста в биологических жидкостях и тканях человека"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДЙЦИНЗКИХ НАУК ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТ АЛЬНОЙ ЭНДОКРИЮЛЭГИИ вэнц

На правах рукописи УДК 513. 71-007.152-07:616. 634:577.175. 322

ГРИГОРЬЯН Алексей Львович

ЮДОТЮХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕД0Е4НЙЕ ГОРУОНА РОСТА в' БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ И ТКАНЯХ ЧЕЛОВЕКА.

03.00. 04 - биохгасш

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Мэсгаа - 1992

Работа выполнена .вс Всероссийском а ндо кринологиче с ком научнс центре РАШ

Директор - член-корр. РАШ И. И. Дедов

Научный руководитесь: доктор биологических наук А. А. Булатов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Н. П. ГснчароЕ доктор биологических наук П. Ы. Рубцов

Ведущее учреждение - Московская медицинская академия

им. И. М. Сеченове.

Защита диссертации состоится ^^_ 1992 г.

в'/^"час. на заседании специализированного совета /Д 001.13.01/ при ВЭНП. РАМН /Москва, ул. Дмитрия Ульянова, 11/.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВЭНЦ РАШ Автореферат разослан _ 1992 г.

Ученый секретарь

специализированного совета Е я Игнатков

доктор медицинских наук

-1-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Все большую актуальность в эндокринологии приобретает проблема молекулярного полиморфизма гормонов пептидной природы, его значения в эндокринной регуляции в норме и при патологии. Прежде всего это относится к белковым и гликопротеидным гормонам гипофиза, имеющим наиболее сложное химическое строение, б частности. к гормону роста (ГР). На современном этапе исследований установлено. что этот гормон, выполняющий чрезвычайно важную роль в росте, развитш и жизнедеятельности организма, присутствует в гипофизе в виде нескольких молекулярных изоформ, различающихся массой и зарядом молекул. Соотношение отдельных изоформ ГР и других гапофизарных гормонов может изменяться под влиянием различных физиологических и фармакологических воздействий. На основании этих фактов высказываются предположения о специфической роли изоформ ГР в сложных рогуля-торных механизмах, в возникновении нарушений эндокринной регуляции процессов роста и других эндокринных функций, в частности, при гиперсекреции ГР (Ваишапп. 1988; Булатов А.А. ,1990). В связи с этим возникает необходимость изучения молекулярных форм этого гормона не только в гипофизе, но и в циркулирующей крови, а также в других биологических жидкостях и тканях с привлечением адекватных методов исследования.

Сложность проблемы изучения природного полиморфизма ГР . его Физиологического и патогенетического значения ссстокт в отсутствии высокоэффективных методов, позволяющих качественно к количественно охарактеризовать изоформы гормона в биологических кидкостях и тканях человека. Однако, реальные возможности приблизиться к пониманию этой проблемы открываются благодаря разработке иммунохимических подходов, основанных на использовании моно- и поликлональных*'антител.

Сегодня уже можно говорить о том. что именно применение ионок-лональных антител (МКА) с избирательной эпитопной специфичностью открывает принципиально новые возможности в изучении полиморфизма оед-ковых гомонов. Основными преимуществами МКА являются: абсолютная специфичность, стабильность по своим характеристикам, бозмоеность стандартизации реагентов. Кроме того, МКА можно использовать для разработки эффективных методов выделения и очистки препаратов гормона с помощью высокоспецифичных иммуносорбентов. Создание таких ииму-носорбентов открывает новые возможности я в изучении близкородствен-

ных ГР полипептвдой. Клесте с тем далеко не исчерпаны возможности применения хуикизучения ГР. его природного полиморфизма поликлональ-ных антител.

На примере иследования ряда белковых гормонов можно видеть что эффективным инструментом для исследования их молекулярных вариантов могут служить системы иммуноблоттинга на основе поли- и моноклональ-ных антител к гормону. Это позволяет с оптимизмом смотреть на перспективы применения иммуноблоттинга в сочетании с другими методами, в частности, с иммуносорбцией на МКА для изучения ГР и его природных вариантов в биологических жидкостях и тканях человека, включая случаи эндокринных нарушений.

Цель и задачи исследования Основная цель работы состояла в разработке комплекса иммунохимических подходов для исследования ГР в бИ1 логических жидкостях и тканях человека и изучении с их помощью полиморфизма иммунореактивного гормона при эндокринной патологии. "

В соответствии с целью исследования решались следующие задачи: Получить ключевые реагенты для иммунохимических систем анализа гормона роста в биологических жидкостях и тканях человека, в том числе моноклональные антитела.

2. Разработать на основе моноклональных антител к ГР иммуносор-бент с целыэ оптимизации методов выделения и детекции ГР и его изо-форм в биологических жидкостях и тканях человека.

3. Разработать специфические высокочувствительные системы иммуноблоттинга на основе моно- и поликлональных антител к ГР для детекции ГР и его природных изоформ.

4. С помощью икмуносорбции на МКА и систем иммуноблоттинга исследовать молекулярные формы ГР в биологических жидкостях и тканях че ловека.в том числе у отдельных больных с эндокринной патологией.

Научная новизна исследования В настоящей работе разработан комплекс иммунохимических реагентов, подходов и методов-, позволяющих изучать ГР и его молекулярные формы в биологических жидкостях и тканях человека. Иммуносорбент на основе МКА к ГР впервые был применен для концентрирования ГР из крови и мочи человека - биологических жидкостей с крайне низким содержанием ГР. и. дальнейшего изучения этого гормона. Научная новизна настоящего исследования заключается также в последовательном использовании иммунохимических систем н-. основе моно- и поликлональных антител для изучения природной гетерогенности ГР человека. Такая комбинация методов -позволила охарактеризовать спектр иммунореактиЕНых молекулярных форм ГР в сыворотке крс-

ви и моче больных с акромегалией и обнаруаить помимо основной молекулярной формы ГР крупные иммунореактлвные фрагменты гормона, не описанные другими исследователями. Использование системы иммуноблот-тинга на основе поликлональных антител к ГР позволило впервые описать молекулярные формы ГР, секретируемые культурами клеток соматот-ропином человека..

Теоретическая и практическая значимость работы Результаты настоящих исследований представляют теоретический и практический интерес как для специалистов-биохимиков, занимающихся изучением свойств, физиологической функции и полиморфизма ГР, так и для эндокринологов-клиницистов. занимающихся изучением соматотропной функции при различных формах патологии. Они расширяют современные представления о природной молекулярной гетерогенности ГР, в том числе при эндокринных заболеваниях.

В результате проведенной работы получен штамм гибридных культивируемых клеток - продуцент моноклональиых антител к соматотропину человека,, который зарегистрирован и депонирован во Всероссийскую коллекцию клеточных культур при Институте цитология РАН под регистрационным номером ВСКК(П) 399Д. По результатам работы по получению данного штамма подана заявка на изобретение N 4835631/13 (050607), по которой получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства. Получение моноклональных антител создает основу для создания современных диагностикумов для клинической эндокринологии.

На основе МКА. высокоспецифичшх по отношению к ГР человека, создан иммуносорбент. с высокой связывающей способностью, который может применяться для выделения и изучения ГР и его имыунореактивных форм из биологических жидкостей и тканей человека. Использование полученного иммуносорбента позволяет быстро и эффективно выделять из экстрактов гипофиза человека иту.ологтескн и биологически активный ГР.

Разработанные системы иммуноблотгинга на основе моно- и полик-локал-ных антител к ГР создают методическую основу для изучения "ри-родного полиморфизма ГР человека и его значения в патогенезе и диагностике эндокринных нарушений.

Обнаружение в моче в качестве основной иммунореахтизной Форш интактного ГР с молекулярной массой 22 К указывает на возможность интегральной характеристики соматотропной функции гипофиза по экскреции гормона с мочой.

Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуадены на

III Всесоюзном сьедде-'эндокринологов /Ташкент. 1989г./. на XVII Научной конференции молодых ученых и специалистов Харьковского НИИ эндокринологии и химии гормонов и на межлабораторной конференции Института экспериментальной эндокринологии ВЭНЦ Российской АМН.

Публикации По материалам диссертации опубликованы 4 работы, получено положительное решение по заявке на авторское свидетельство.

Объем и структура диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований, их обсуждения. заключения, выводов и списка литературы /134 ссылки/. Работа изложена на ЮЗ страницах машинописного текста, иллюстрирована 13 рисунками и 3 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В качестве исходного материала для исследования в работе использовали высушенную ацетоном ткань гипофизов людей после экстракции из нее гликопротеидных гормонов, сыворотку крови и утренние порции мочи больных с акромегалией, ткань плаценты женщин, а также клетки и образцы среды первичных культур соматотропином человека. Первичные культуры соматотропином были предоставлены для исследования главным научным сотрудником ИЭЭ ВЭНЦ Российской АМН И.С.Комоло-вым. Весь перечисленный материал быстро замораживали и хранили до исследования при -30°С.

В работе использовали высокоочищенные препараты гормона роста человека, а также пролактина и плацентарного лактогена человека, пролактина крупного рогатого скота и свиньи, гормона роста быка, выделенные в ИЭЭ ВЭНЦ РАМН, а также биосинтетический гормон роста, полученный в Институте молекулярной биологии РАН.

Для получения специфической поликлональной антисыворотки к гормону роста человека проводили иммунизацию кроликов, вводя антиген внутрикожно. Курс иммунизации состоял из первичной иммунизации и последующих подколок.

Работа по получению гибридом и моноклональных антител к гормону роста человека проводилась совместно с нами в лаборатории репродукции человека (зав. - проф. М.Ш. Вербицкий) НИИ морфологии человека РАМК. Для иммунизации мышей.линии BALB/C использовали высокоочищен-ный гормон роста человека. После получения гибридом путем слияния

клеток селезенки иммунизированных мышей с клетками миеломной линии "Х-63.Ag8.653 проводилось тестирование супернатантов гибридных клонов на наличие МКА к гормону роста непрямым иммуноферментным анализом (ИФА).

Для получения МКА в препаративных количествах гибридомные клетки выращивали в виде асцита в брюшной полости мышей BALB/c. МКА из асцитной жидкости мышей получали высаливанием насыщенным сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-52 ("Whatmann, ,Англия) в градиенте 0,005-0.25 М натрий фосфатного буфера рН 8,0.

Субкласс МКА устанавливали в реакции двойной иммунодиффузии, используя антисыворотки к подклассам тяжелых цепей иммуноглобулинов мыши ("Serotec". Англия). Кроме того, проводили электрофорез очищенных МКА в редуцирующих и нередуцирувдих условиях в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия .

Эпитопную специфичность МКА против гормона роста устанавливали твердофазным ИФА после фиксации на плашках пшофизарного гормона роста человека. Коныогат МКА с пероксидазой лрена получали периио-датным методом.

Очищенные МКА при помощи бромциановой сшивки ковалентно иммоби-лизовывали на сефарозе 4В по стандартной схеме, рекомендованной фирмой "Pharmacia'' (Швеция) с небольшой модификацией: вместо бикарбо-натного буфера рН 8,8 использовали 0.05 М фосфатный буфер с рН 7,8.

Для экстракции гормона роста нз высушенной ацетоном ткани гипофизов людей после экстракции из нее глихопротеидаых гормонов 2 г высушенной ткани суспендировали в 40 мл (20 объемов) охлажденной дис-тилированной воды, оставляли на 1 ч при 4°С, затем добавляли 2 мл 1 н NaOH. через 5 мин доводили рН до 10,5 и оставляли на ночь при перемешивании. По окончании экстракщл рН смеси доводили до 7.0 4 н НС1. Ткань отделяли центрифугированием при 4000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость фильтровали на бюхнеровской воронке и исполь-зова.л для выделения гормона роста с помощью иммуносорбента.

Экстракция гормона роста из ткани плаценты человека включала в себя несколько этапов: 1. гомогенизация ткани в 0,1 Н натрий-бикар-бонатном буфере рН 9.5 2. высаливание сульфатом аммония (до 25% и 55% насыщения )3.сбор образовавшегося осадка, обессоливание. лиофили-зация.

Для характеристики иммуносорбента и подбора оптимальных условий сорбции и элюции использовали очищенный препарат гормона роста, по-

лученный из экстрш$таггипофизов людей методом Salraa . Исходным материалом для^мяуносорбции гормона служили: экстракт из ацетониро-ванной ткани гипофизов людей, сыворотка крови и моча людей с акромегалией. а также экстракт ткани плаценты женщин.

Сыворотку крови (1-3 мл) перед нанесением на иымуноаффинную колонку разбавляли в 3 раза 0.15 М NaCl.

Концентрирование гормона из мочи с помощью иммуносорбента проводили после диализа мочи (80-200 мл) при 4° С против 10 мМ натрий фосфатного буфера в течение 48 часов со сменой буферного раствора через 24 часа.

Размер хроматографической колонки с иммуносорбентом составлял 1 см х '5 см.. Подготовленные экстракты ацетонированных гипофизов и плаценты человека . сыворотку или мочу медленно пропускали через имму-носорбент. После завершения пропускания биологического материала колонку промывали 10 мМ натрий фосфатным буфером . а в случае мочи дополнительно 1.5 М NaCl. Связавшийся материал элюировали 3 М роданидом аммония (рН 4,0) или 1 М роданиом аммония (рН 7.4).

Электрофорез белка в пластинах полиакриламидного геля проводили методом диск-электрофореза по Laemmll в присутствии■додецилсульфата натрия в трис-HCl буфере рН 8,3 при 15% концентрации акриламида в разделяющем геле в присутствии восстановителя - 10% меркаптоэтанола, или без него. Гели окрашивали раствором Кумасси R-250 .

После завершения электрофореза детекцию белковых'фракций осуществляли также методом радиоиммуноблоттинга после их электрофорети-ческого переноса с геля на нигроцеллюлозную мембрану Hybond -С (Amersham, Англия) методом Towbln и соавт. Иммунодетекцию иммобилизованных белков на мембране осуществляли в двух вариантах: а) путем инкубации с моноспецифической поликлональной антисывороткой к гипо-физарному ГР человека и с белком A ("Pharmacia". Швеция), меченным 125-1 либо б) путем инкубации с моноклинальными антителами к ГР „человека, меченными 125-1, с последующей радиоавтографией. В качестве маркеров молекулярной массы в электрофоретических исследованиях слун хорошо охарактеризованный стандарт гипофизарного ГР. а также набор стандартов молекулярного веса ("Pharmacia", Швеция). Иодирование гормона роста, МКА и белка А проводили методом Greenwood и соавт. с хлорамином Т.

Иммунологическую активность препаратов гормона роста определяли с помощью радиоиммунологической системы, разработанной в лаборатории на основе высокоочишенного ГР человека в качестве меченного 125-1

лиганда, а также моноспецифической антисыворотки морской свинки к этому гормону с титром 1:250000. Чувствительность определения сос-тйвляла о.5 нг / мл .

Ростовую активность препаратов ГР определяли в "тибиа-тесте" на гипофизэктомированных крысах в лаборатории биологических исследований гормональных соединений (зав. лабораторией профессор В.П. Федотов) ИЭЭ ВЭНЦ РАМН.

Аминокислотный анализ ГР проводили на автоматическом анализаторе. "Биотроник, 7000", ФРГ. после гидролиза проб 5.7 Н НС1 при 110 С в течение 24 час.

Я-концевые аминокислоты определяли по реакции с дансил-хлоридом с последующей двумерной хроматографией дансилпроизводных на полиамидных пластинах.

Концентрацию белка в экстрактах тканей и препаратах гормона определяли методом Лоури или путем измерения оптической плотности раствора при 280 нм.

Для определения достоверности различий величин рассчитывали доверительную вероятность по двустороннему, критерлю Стыодента. За доверительный принимали результат с 5Ж-ным уровнем значимости (РС0.05).

Результата исследований и их обстаяение

Получение и характеристика моноклональннх антител к гормону

При гибридизации клеток селезенки гипериммунной мыши с ниелом-ной клеточной линией X-63.Ag.653 был обнаружен рост гибридных клеток в 64Ж лунок. В 8 лунках определялась положительная реакция при непрямом ИФА на ГР. После клонирования гибридом из 2 лунок методом лимитирующих разведений были полпены 2 клона, продуцирующие МГА к ГР человека: МКА СТГ 1 и МКА СТГ 2. Эти клоны и были отобраны для дальнейших исследования.

Обе разновидности МКА. продуцируемые двумя стабильньши п"5ри-домными клонами, принадлежали к 15 С1-изотипу и давали при электрофорезе в полиакриламидном геле в невосстаиавливавщих условиях одну полосу . соответствующую белкам с молекулярной массой 160 .К. а в восстанавливающих условиях - две полосы, одна из которых соответствовала белкам с молекулярной массой 50 К "(тяжелая цепь), а дру-ая -25 К (легкая цепь).

Специфичность МКА СТГ 1 и МКА СТГ 2 была испытана путем непря-

мого иммунофермедтного анализа (ИФА) на способность связывать гомологичный антиген ГР - гипофизарный и биосинтетический, а также ГР быка, плйиентарный лактоген человека, пролактин человека, быка и свиньи. Выбор данных антигенов был продиктован-наличием видовой специфичности СТГ. а также структурной гомологией СТГ. пролактина и плацентарного лактогена. МКА ИТ 1 и МКА СТГ 2 реагировали только с СТГ человека и не взаимодействовали с другими структурно родственными антигенами, что свидетельствует о высокой специфичности полученных МКА. С помощью ИФА выявлено, что МКА СТГ 1 и МКА СТГ 2 направлены скорее всего против общей антигенной области, т. е. не различаются по эпитопной специфичности.

Ввиду того что титр МКА СТГ 2 в асците (1:206000) был значительно выше титра МКА СТГ 1. МКА СТГ 2 были исследованы более детально.

Изучение связывания МКА СТГ 2 с СТГ гип и СТГ био в ИФА показало. что МКА СТГ.2 обладают примерно равной иммунореактивностыз к этим антигёнам. Это может свидетельствовать о том. что.МКА СТГ 2 взаимодействуют с антигенной детерминантой, присущей доминирующему мономерному компоненту ГР человека (22 К). В тех же условиях МКА СТГ 2 не реагировали с плацентарным лактогеном человека, имеющим высокую степень структурного сходства (85 Ж) с ГР человека . Отсутствие реакции со структурно родственным плацентарным лактогеном человека может свидетельствовать о том. что эпитоп, узнаваемый полученными антителами, является уникальным для ГР человека.

Способность МКА СТГ 2 к ГР гипофизарному выявить методом имму-н о детекции в точках на нитроцеллюлозных фильтрах 1- нг гормона указывает на высокую степень аффинности МКА СТГ 2:

При решении различных научных и практических задач требуется количественное определение гормона роста в препаратах гормона, биологических жидкостях и тканевых экстрактах. В связи с этим была изучена возможность использования полученных МКА в нескольких вариантах систем ИФА. Согласно полученным данным,, МКА СТГ1 и МКА СТГ 2 имеют скорее всего близкую эпитопнув специфичность, поэтому они яе могли быть использованы в одной системе определения ГР человека твердофазным ИФА в его "сзндвич"-варианте. При попытке использовать МКА СТГ 2 в качестве фиксирующих антител установлена их низкая сорбирующая способность по отношению к полистирольным планшетам. Поэтому в результате испытания МКА СТГ 2 в нескольких ' вариантах твердофазных систем ИФА был подобран следующий вариант "сэндвич"-системы: монос-

Тйцифйческие аффинно-очиценные поликлональные антитела к ГР гипофк-эарнсму фиксировали на плашках в концентрации 1С мкг в 1 юз бикар&о-нйВДог'о буфера и затем'инкубировали с разными разведениями ГР гипс-физарнййу в фосфатной; для идентификации 'антигена использова-

ли коньюгат ЙКА СТГ 2 с йероксидазой хрена. Диаваз^ количественного определения ГР в такой системе составил 32 - 200 нг/мя. Таким образом было показано, что данные моноклонапьные антитела пригодны для использования в качестве специфического детектора в иммунофериектой тест- системе,для определения ГР человека при выделении гормона, а также для определения биоинтетического ГР.

Получение иммуносорбента на основе моноклональных антител к гормону роста и его применение для выделения гормона роста из экстрактов гипофизов человека и других тканей

Реальной возможностью существенно упростить процедуру изоляции гормона роста может быть использование для этих целей метода иммуно-сорбции на иммобилизованных моноклональных антителах.

Иммуносорбент на основе моноклональных ант.;тел был получен, как описано в главе "Материалы и методы". При оценке эффективности полученного иммуносорбента. с использованием гормона роста . выделенного и очищенного хроматографическим методом, было показано, что связывающая способность МКА, иммобилизованных на сефарозе 4В. составляла 0,6 мг гормона на 1 мл геля сорбента. При использовании для элюции 3 М.роданида аммония удавалось элюироъагь не менее 90 % гормона от адсорбировавшегося на колонке. Таким обррзом, пригоТб&Л^ннкй сорбент можно было использовать для выделения ГР из экстракта гипофизов.

Выход гормона роста после иммуноаффинной хроматографии гипофи-зарного экстракта.и обессоливания на G-25 из 2 г ацё'т'онированных гипофизов составил 5.4 мг. ,

Ввиду того, что при элюции с иммуносорбента биологического материала растворами роданида аммония в высоких концентрациях сущест вует возможность десорбции вместе с гормоном антител, иммобилизованных на сефарозе, белковый материал после элюции с иммуносорбента был исследован на предмет наличия антител. Для эТого препарат ГР после обессоливания на сефадексе G-25 fine Сол подвергнут гель-фильтрации на сефадексе' G-100 fine. В результате не был зарегистрирован выход белков с молекулярной массой, соответствующей молекулярной "ассе антител. Исследование препаратов ГР после иммуноаффинной хроматографии методами электрофореза и иммуноблоттинга таете не выявило при-

сутствие в препаратах гормона дополнительных компонентов, которые можно было бьытентифицировать как антитела. На основании этих данных можно^аключить, что подобранные условия элоции ГР с иммуносор-бента разными концентрациями роданида аммония являются адекватными и не приводят к десорбции иммобилизованных на сорбенте МКА.

Препарат гормона, полученный из экстракта гипофизов за одну стадию после элоции с иммуноаффинной колонки 3 М роданидом аммония, после обессоливания на сефадексе С-25 и лиофилизавди был охарактеризован по ряду свойств.

Показано, что аминокислотный состав препарата близок к теоретическому составу ГР человека. Препарат ГР был гомогенен по и-концевой аминокислоте (фенилаланин). что указывало на высокую чистоту препарата. полученного за одну стадию иммуноаффинной хроматографией.

Дальнейшая характеристика гормона роста, снятого с аффинной колонки, в электрофорезе с додецилсульфатом натрия (окраска белка Ку-масси) и в системе радиоиммуноблоттинга (рис. 1). свидетельствует с соответствии его электрофоретических компонентов компонентам высоко-очищенного гормона роста, выделенного хроматографическими методами 1! взятого в качестве референтного препарата, и подтверждает его высокую чистоту. „_

Л 2. Ъ Ч 5 6

Рис. 1. ' Радиоиммун'облоттинг препаратов гормона, роста (проявление с помощью поликлональной антисыворотки кролика в сочетании с белком А. меченным 125-1). 1-3 - редуцирующие условия, 4-6 - нереду-цисукщие условия. 1;4 - гормон роста, выделенный из экстракта плаценты; 2:5 - гормон роста, элюированный с иммуносорбента 3 М роданидом аммония; 3;6 - гормон роста, выделенный классическими хроматог-раоическими методами.

ГаЛмтш . Ростсткаулпрзщая активность гориона роста, выделенного шзушафЕрзнной хрсггатогрэ$яеСа в гвЗиа-гасге ш гипофазэктамгрованшх грысах.

Препарат Доза в Количество Ширина вшйшзарко!:

маг * ХВВ02ШХ дласхшки тийаа £ ак» Ш * № )

Контроль 0,9Й раствор —- 10 171 ± 7,8

Гораон роста I 20 8 210 £ 6,9

Гормон роста 3 20 8 210 - 7,4

Контроль 0,9$ раствор л/а(Х, 10 165 ¿5,5

Гормон роста I 20 10 210 ~ 5,4

60 8 260 * 7,4

Гормон роста 2 20 9 191 ± 5,4

60 8 220 £ 6,3

Общая доза препаратов, вводимая в явченш дней. . - гордон роста, выделенный по ма?одд' З^гагл ; - гормон роста, выделенный елвтаей § М родавадом агагозшз I - горжзн роста, выделеншй аладаэй I М роданвдом шиюшш

Изучение биологической активности полученного препарата в "ти-биа-тесте" на^гяпофизэктомированных крысах показало, что препарат обладал свойственной данному гормону ростовой активностью (табл. ).

При испытании в радиоиммунологической системе для гипофизарного ГР человека препарат гормона роста, выделенный с помощью иммуноаф-финной хроматографии проявлял достаточно высокую иммунологическую активность.

Вместе с тем обращало на себя внимание, что его активность после элюции 3 М роданидом аммония была несколько ниже биологической и иммунологической активности препарата гормона, полученного по традиционной методике. Возможно, это является результатом отрицательного воздействия высокой концентрации роданида аммония, так как известно. что использование высоких концентраций солей для элюции белков с иммуносорбентов может вызывать частичную потерю биологической активности антигена.

Испытание биологической и иммунологической активности препарата ГР. элшрованного не 3 М. а 1 М роданидом аммония, подтвердило это предположение. Как видно из таблицы, оба препарата в дозе 20 мкг е равной степени стимулируют увеличение ширины эпифизарной пластинки "тибиа" у гипофизэктомированных крыс. Результаты испытания данные препаратов в радиоиммунологической системе свидетельствуют об отсутствии у этих препаратов существенных различий в иммунологической активности.

Следует отметить, что' в условиях десорбции 1 М роданидом аммония эффективность элюции ГР оставалась высокой и составляла 40-60%.

Как недавно установлено , плацента человека является место* синтеза структурного варианта ГР ("плацентарного ГР"), сохраняющего способность взаимодействовать с антителами против гипофизарного гормона роста. Ввиду крайне низкого содержания варианта гормона в плаценте обычные хроматографические приемы для.его очистки представляют особую сложность.

В настоящей работе была исследована возможность применения мо-ноклональных антител, специфически узнающих только ГР человека и не взаимодействующих с плацентарным лактогеном. для адсорбции структурного варианта ГР из экстракта плаценты человека, так как недавно установлено, что этот структурный вариант ГР обладает иммунореактив-ностыз по отношению к антителам к ГР гипофизарному. Для максимально? десорбции материала, связавшегося на иммуносорбенте, использовал

~ -

раствор 3 M роданида аммония (рН 4,0). Полученный в результате десорбции материал исследовали с помощь» электрофореза в полиакрила-мидном геле с последующим радиоиммуноблоттангом. Как видно на рис. I (дорожки 1,4) методом радиоиммуноблоттинга с использованием моноспецифической кроличьей антисыворотки против ГР человека выявляются им-мунореактивные компоненты .сходные по электофоретической подвижности с компонентами гипофизаркого ГР (рис. 1. дорожки 3.6). Сконцентрирс-ванный из экстракта плаценты материал обладал также активностью в радиоиммунологической системе. Тем самым была подтверждена возможность использования полученного иммуносорбента для выделения ГР иь различных тканевых экстрактов.

Создание систем иммуноблоттинга на основе моноклокаль-

ных и поликлональных антител к гормону роста Эффективным инструментом исследования молекулярных вариантов гормонов в препаратах . а также в различных биологических жидкостях и тканях является метод иммуноблоттинга. Принцип метода состоит в иммунодетекции гормонов и их молекулярных.. Форм, перенесенных на нит-роцеллюлозные мембраны путем электропереноса после электрофоретичес-кого разделения в поляакриламидном геле. Для детекции ГР были разработаны два варианта систем иммуноблоттинга: на основе МКА СТГ 2. меченых 125-1, и на основе моноспецифической поликлональной антксыво-ротки кролика к ГР в сочетании с белком А. меченным 125-1.

Система иммуноблотинга на основе МКА к ГР Результаты радиоиммуноблоттинга с применением меченых Ш представлены на рис. 2. Можно видеть, что в системе иммуноблоттинга в зависимости от количества внесенного ГР гип с помощью 125-I-MKA СТГ 2 удается обнаружить разное ч**сло иммунореактивньк компонентов гормона. При внесении в гель 150 нг ГР гип (А) выявляется один имму-нореактивный компонент, соответствующий мономерной форме гормона (22 К варгант). Увеличение количества гип позволило идентифицирог ать компонент, соответствующий димерной форме гормона, а также инмуноре-активный компонент с меньшей, чем у мономера, молекулярной массой (В). Таким образом, применение данного варианта системы иммуноблоттинга позволяет с высокой чувствительностью детектировать ГР в его' препаратах.

_НУ

а б в

гио. 2. Радиоиммуноблоттинг гипофизарного ГР (проявление с помощью моноклональных антител, меченных 125-1). Количество гормона (б нг). внесенного в гель:а-500.6-250.в-150.

Система иммуноблоттинга на основе полкклональной антисыворотки к ГР и меченного белка А.

Специфичность антисыворотки кролика к ГР. которую использовали во втором варианте системы иммунодетекции ГР. былахгановлена ранее в исследованиях, проведенных в нашей лаборатории . Сродство поликло-нальных антител к ГР , исследованное методом иммунодетекции в точках на нитроцеллюлозных фильтрах, оказалось высоким: методом иммунодетекции в точках, или методом дот -блоттинга. удается выявить 1 нг ГР гипофизарного (рис. 3).

Результаты радиоиммуноблоттинга после электрофоретического разделения ГР гип представлены на рис. 4. С помощью системы иммунодетекции на основе моноспецифической поликлональной антисыворотки при элехтрофоретическом разделении 100 нг ГР гип был обнаружен ряд имму-нореактивных компонентов гормона: основной компонент,'соответствующий мономерной форме ГР, компонент, соответствующий димерной форме, а также формы с большей и меньшей, чем у основного компонента, молекулярной массой, представляющие собой соответственно расщепленную форму гормона и его 20 К вариант.

Таким образом, на данном этапе исследования было установлено, что разработанные варианты систем иммуноблоттинга на основе монокпо-нальных и поликлональных антител против гормона роста высокочувствительны. высокоспецифичны, и их можно использовать для характеристика препаратов ГР гипофизарногс

Рис. 3 . Выявление ГР гип в точках на нитроцеллюлозных фильтрах с покошью поликлональной антисыворотки кролика в сочетания с белком А, меченным -1251, Содержание ГР гип /в нг/ в точке; а-1000, 6-500, в-ЮО, г-10, д-1. Разведение белка А: I - 2 х Ю5 имцЛяш на I мл, £ - 5 х 10 имп/шщ на I мл

<1 -тг

Рис. 4 . Радаоишуноблохгияг ГР гип /проявление с помощью поликло-

тпс

нальноЗ антисыворотки в сочетании с белком А, меченным I. 2 -нереяушрующие условия, 2 - редуцирующие условия. Стрелками обозначены положения ставдартов молекулярного веса.

- 16 -

Изучение ГР и ..его ..молекулярных Форы , в циркуляции чела-Бека с. ¿штгользованием иммуносорбента на основе МКА Доказательство существования природных молекулярных вариайтс® гормона роста человека выдвигает на первый план принципиально нов$ю проблему поиска, идентификации и исследования роли изоформ -гормона в гормональной регуляции и в развитии патологических состояний. В связи с этим особый интерес представляло исследование возможности использования иммуносорбции на моноклонапьных антителах для концентрирования ГР и его форм из биологических жидкостей и тканей человека, где содержание гормона очень низкое.

Содержание гормона роста в сыворотке крови больных с акромегалией. взятой для исследования, как показали измерения при помощи ра-диоимуннологического метода, у двух из обследованных больных с акромегалией составляло около 100 нг/мл, а у третьего - около 43,4 нг/мл.

С помощью полученного иммуносорбента было проведено концентрирование ГР из сыворотки крови больных с акромегалией. В результате анализа материала, снятого с колонки 1 И роданидом аммония, электрофорезом в полиакриламиднйм теле е сочетании с радиоиммуноблоттингом во всех сыворотках, взятых для Исследования (рис. 5). выявлено присутствие иммунореактивкого компонента, соответствующего по подвижности основной секретируемой гипофизом форйё ГР 22 К, что согласуется с .литературными данными. В то же Время по крайней мере в одной из исследуемых сывороток, где на радиоавтографе зоны реакции были наиболее четкими . иммуноблоттингом в нередуцируОДи* условиях кроме компонента с молекулярной массой 22 кДа отчетливо выявлены иммунореак-тивные компоненты около 25 К и 15 К. В то же время в условиях восстановления иммунореактивный.компонент с молекулярной массой 25 К не выявляется, но при этом хорошо выраженные зоны реакции появляются в диапазоне молекулярной массы 12-15 К и 6-8 К. . -

Известно, что дополнительные электрофоретические компоненты ГР человека могут включать 20 К вариант, как результат альтернативного сплайсинга мРНК гормона, так и варианты, являющиеся результатом его посттрансляционных изменений - димеризации. олигомеризации, ограниченного специфического протеолиза с образованием двухцепочечной формы ГР. состоящей из двух фрагментов (1-134 и 141 или 147-199). связанных дисульфидным мостиком.

Таким образом, появление в сывбротке крови в Восстанавливающих услобиях иммунореактивных„ компонентов с более низкой молекулярной

кассой (12-15 К и 6-8 К), коррелирующие с исчезновением 25 К компонента,- может быть следствием разрыва дисульфидной связи в такой двухцепочечной форме ГР,

Экспериментально показано, что подобные двухцепочечные расщепленные формы ГР возникает при действии такого фермента как плаэмнн (или фибринолизин). Модифицированные формы ГР человека, полученные с помощью протеолиза плазмином. обладали повышенной ростовой активностью по сравнению со стандартными препаратами ГР. Таким образом, появление подобных расщепленных форм гормона в циркуляции человека также может быть обусловлено действием плазмина. циркулирующего в крови. Следовательно, такие формы ГР. которые могут обладать повышенной биологической активостьп. могут возникать в циркуляции в отдельных случаях гиперсекреции гормона и выполнять специфическую функцию в механизме развития нарушений при акромегалии. Выявление расщепленных форм ГР. циркулирующих в крови у таких больных, монет иметь определенное диагностическое значение.

Таким образом, использование таких методов как иимуноаффинная хроматография и электрофорез в полиакриламидном геле в сочетании с радиоиммуноблоттингом позволило получить новые данные относительно спектра иммунореактивного гормона роста в сыворотке крови при акромегалии. ' •

Иммунореактквный гормон роста в моче Дополнительная информация о секреции и превращениях гормона роста в организме может быть получена путем исследования гормона не только в крови, но и в моче. Согласно данным литературы, секреция ГР в кровь носит эпизодический характер, и ее уровень подвержен в течение суток значительным колебаниям, сам гормон обнаруживается в гипофизе и крови в нескольких молеку.лрных формах. Такт* образом, гормон, экскретирующийся с мочой, может быть интегральным показателем соматотропной функции, между тем вопрос о почечной экскреции и молекулярных формах ГР в моче изучен мало. Препятствием, существенна ос-ложнящим, исследования ГР в моче, является его очень низкое содержание. В.связи с этим в данной работе была исследована возможность применения разработанных иммуноаналитичвских систем для изучения ГР. экскретируемого с мочой. . '

Использование иммуносорбента. приготовленного на основе МКА против ГР тип. сделало возможным эффективно сконцентрировать содержащийся в моче отдельных больных материал, проявляющий имчунореак-

I—т

-1&-■—-

Р.

ШХР-

щ

а ч&

& |

«-2ДКГР

Рис. 5 » Радиом/муноблотякг шиунореактивного горкона роста из си* воротки крови человека. 1-4 - нереяуцаруюзде условия, 5=^8 - реду-. дарующие условия. 1,2,3 и 5,6,7 - сыворотка крош отдельных бохъ-ных> 4,8 - гипофизарный тр-. Визуализация зон реакции ^^нЗелкоы А, Стрелкой пока?ако -направление движения "эледтрофореграшы.

22КГР

1 1 г

Рис. 6. Радиолммуноблотяиг /электрофорез в 'редуцирующих условиях/ ш/лугореактиЕНого гормона роста из г.:очи человека. 1,2 - моча людей с акромегалией, 3 - гипофизарный гормон роста. Визуализация зон реакции ^51-белком А. Стрелкой показано направление движения электрофореграмш.

тивность гормона роста. Материал, специфически связавшийся на имну-носорбенте, после элюции 1 М роданидом аммония был Подвергнут, как и в случае с сывороткой крови, электрофорезу в полиакриламиднсм геле с последующей детекцией иммунореактавных электрофоретических фракций методом радиоиммуноблоттинга. Полученные результаты представлены на рис. б. Можно видеть, что у всех трех больных с акромегалией иммуно-реактавный гормон роста, экскретируемый почками, представлен в значительном количестве в виде молекулы с молекулярной массой 22 кДа. т.е. той же самой молекулярной форме, которая преимущественно секре-тируется .в кровь гипофизом. Иктактный гормон роста с молекулярной массой 22 кДа хорошо выявлялся как полиялональной антисывороткой в сочетании с меченым белком А (рис. 6), так и непосредственно меченными моноклональными антителами.

В то же время по крайней мере у одного из больных в моче (рис. 6.1) выявлена в небольшом количестве иммунореактивная форма, немного опережающая по подвижности при электрофорезе 22 К гормон роста, которая может представлять собой 20 К вариант гор,юна роста. Установлено также присутствие в моче в значительном количестве двух крупных фрагментов гормона с молекулярной массой 12-15 и 6-8 кДа, в большей или меньшей мере сохраняющих способность к взаимодействию с поликло-нальными и моноклональными антителами к интактному гормону роста.

Таким образом, спектр идентифицированных иммунореактавных форм ГР в моче ряда больных с акромегалией аналогичен спектру форм гормона, циркулирующих в крови . Наличие в мече тех же. что и в сыворотке крови, иммунореактавных фракций позволяет предположить, что циркулирующие в крови формы ГР могут в неизменном виде проникать через почечные клубочки, реабсорбироваться в почечных канальцах и экскре-тироваться с мочой. Это согласуется с литературньш данными. Обьару-жение в моче в качестве основной иммунореактивной формы интактного ГР с молекулярной массой 22 К подтверждает возможность характеристики солатотропной функции гипофиза пи экскреции гормона с моче"' с учетом, однако, присутствия в моче иммунореактавных продуктов его протеолиза.

Изучение иммунореактивного гр в культурах клеток соматотропиноц •

В настоящей работе изучение иммунореактивного ГР. циркулирующее го в крови и присутствующего в моче Сольных с акромегалией с ксполъ-

зованием методов щшуноаффинной хроматографии, электрофореза и имму-ноблоттинга проводилось In vivo. В то же время, большой интерес представляло изучение иммунореактивного гормона, синтезируемого и секретируемого клетками соматотропином человека, культивируемых in vitro вне организма.

Проведенные исследования иммунореактивного ГР. синтезируемого и секретируемого в культуральную среду клетками культуры соматотропи-номы человека, при использовании радиоиммунологической системы показали, что клетки соматотропином в первичных культурах сохраняют способность к регуляции соматотропной функции гипоталамическими гормонами соматостатином и тиролиберином. Под влиянием соматостатина секреция гормона роста существенно подавлялась, в то же время влияние тиролиберина на секрецию ГР культурами опухолевых клеток было слабым и неоднозначным.

На основании данных, полученных в настоящей работе, можно говорить, о том, что клетки соматотропином человека в первичных культурах представляют собой адекватную модель для изучения закономерностей секреции иммунореактивного ГР. В то же время, до недавнего времени не-было сведений о том, какова молекулярная природа ГР, секретируемого клетками соматотропиномы человека. Такие данные имеют ценность для раскрытия патогенеза опухолевого процесса в гипофизе, для изучения закономерностей функционирования клеток опухолей. В связи с этим в настоящей работе было проведено изучение молекулярных форм иммунореактивного ГГ. присутствующего в клетках культуры соматотропином и секретируемого ими в среду, при использовании метода иммуноблот-тинга. В результате исследования было показано, что присутствующий в среде 'ГР представлен в значительном количестве в виде молекулы с молекулярной массой 22 кДа - доминирующей формы гормона (рис. 7). Интактный гормон с молекулярной массой 22 кДа хорошо выявлялся как поликлональной антисывороткой в сочетании с меченым белком А , так и непосредственно меченными моноклоналыгами антителами. Кроме того, в среде.культуры выявлена иммунореактивная форма, немного опережающая по подвижности при электрофорезе 22 кДа ГР. которая по-видимому представляет собой 20 кДа вариант гормона, продукт альтернативного сплайсинга мРНК гормона. Третьей, выявляемой в среде культуры опухолевых клеток иммунореактивной формой гормона является форма, соответствующая по подвижности при электрофорезе расщепленной форме ГР. Появление в среде в восстанавливающих условиях1 крупного фрагмента ГР с молекулярной массой 12-15 кДа может быть следствием разрыва ди-сульфидной связи в расщепленной двухцепочечной форме ГР и свидетель-

.2А-

22ЯГР-

-22-КГР

Рис. 7. Радиоиммуноблоттинг иммунореактивного ГР среда культуры клеток соматотропиномы человека (больной А). Визуализация зон реакции с помощью белка А. меченного 125-1. 1-4 - нередуцирующие условия. 5-8.- редцирукщие условия. 1,2,3 и 5,6,7 среда культуры клеток соматотропиномы в разные дни культивирования, 4.8 - гипофизарный ГР.

ствовать о том, что этот вариант гормона может включать в состав расщепленную форму ГР. В то же время, в состав этой формы ГР входит компонент, устойчивый к воздействию меркаптоэтанола и додецилсульфа-та натрия. Проведенные исследования не позволили охарактеризовать природу и свойства этого компонента гормона. Полученные данные позволяют предположить, что секретируеыая в среду клетками соматотропиномы форма ГР, соответствующая по подвижности расщепленной форме гормона, состоит из нескольких компонентов, разлучающихся по сзоей химической природе. В среде культуры опухолевых клеток была идентифицирована также олигомерная форма гормона.

Добавление в культуру клеток соматотропиномы такого их.гибтую-щего синтез ГР гормона как сонатостатин (в концентрации 10 нг/мл) при его влиянии на содержание общего иммунореактивного ГР не вызывало изменения в соотношении молекулярных *юрм гормона.

Анализ молекулярных форм ГР, высвобождаемого в среду клетками культуры соматотропином разных больных, позволяет отметить. ч~э в :пектре форм иммунореактивного гормона . синтезирующегося в среду культурами клеток соматотропином от разных больных, могут быть индивидуальные отличия: содержание 20 кДа варианта и форм, соответству-

ющих по подвижностч^расщепленной форме гормона у разных больных может нзменятьс5^Спектр иммунсреактивных компонентов ГР. секретируе-мых в среду клетками культур соматотропином человека, в целом соответствует спектру форм гормона, которые синтезируются нормальными соматотрофами гипофизов: 22 кДа форма гормона является доминирующей, обнаруживается присутствие форм, соответствующих по подвижности расщепленной форме гормона, а также его 20 кДа вариант. На основании этого можно говорить о том, что процессинг ГР в клетках соматотро-пиномы человека протекает в основном так же. как и в нормальных клетках гипофизов. Вместе с тем сохранение после восстановления мер-каптоэтанолом некоторого количества иммунореактивного белка в зоне, соответствующей по злектрофоретической подвижности расщепленной форме гормона, свидетельствует о неоднородности этой зоны и не позволяет полностью исключить возможность секреции клетками соматотропиномы необычной для нормального гипофиза формы гормона.

В заключение можно отметить, что в результате проведенных исследований получены и охарактеризованы моноклональные антитела, обладающие уникальной специфичностью по отношению к гипофизарному ГР человека. Показано, что полученные МКА можно использовать в качестве высокоспецифического детектора при разработке иммуноферментной тест-системы для определения ГР человека, а также в системе радиоим-муноблоттинга. На основе ККА, высокоспецифичных по отношению к ГР человека, создан иммуносорбент с высокой связывающей способностью и исследована возможность его исползования для концентрирования ГР из биологических жидкостей и тканей человека. Показано, что использование созданного иммуносорбента делает возможным эффективно в одну стадию выделить из из гипофизарного экстракта биологически и иммуно-логически активный гормон роста с высокой степенью чистоты. Использование иммуноаффинной хроматографии и последующего электрофореза £ полиакриламидном геле-в сочетании с радиоиммуноблоттингом позволилс получить новые данные относительно спектра иммунореактивного ГР £ циркулирующей крови и моче больных с акромегалией, а также в культурах клеток соматотропином.

-2313 к в о о

1. Получены и охарактеризованы ионоклонадьные антитела с высокой специфичностью по отноиенив к гормону роста человека, пригодные для использования в иммунохимических системах исследования этого гормона.

2. Создан иммунесорбент на основе мококлональных антител с высокой связывающей способностью по отношению к гормону роста человека. применение которого делает возможным выделение биологически и икчунологически активного гормона из экстрактов гипофизов людей в одну стадий и с высокой степенью очистки и эффективное концентрирование гормона роста из биологических видкостей и тканей.

3. На основе моноклональннх и моноспецифических поллклональкых антител разработаны системы имкуноблотглнга, которые в сочетании с электрофорезом в полиакриламидном геле позволяют изучать з препаратах гормона роста, а такие в биологических гидкостях и тканях человека не только суммарный иимунореактивиый гормон, но и его отдельные молекулярные формы.

4. С помощью разработанных шшуноаналитичееких подходов {имму-носорбции и иммуноблоттинга) изучены имиунореактивные Форш гормона

роста при акромегалии: в сыворотках кровк и моче и в культурах клеток соматотропинок

5. Установлена молекулярная гетерогенность иммунореахтивного гормона роста, циркулирующего в кровн больных с акромегалией - присутствие наряду с основной сехретируемо« гипофизом формой гормона 22 кДа протеолитически расщепленной формы и крупных кммунореактивных Фрагментов.

6. Показано, что основные имкунореактшзные формы гормона роста, присутствуищие в крови - ингактньЛ 22 кДа гормон рестз, протео-мта-чески расщепленная форма и крупные фрагменты могут в определенном

количестве экскретироваться с мочой в неизменном виде. Обнаружение в моче в качестве основной иммунореактивной формы интактного 22 кДа гормона роста позволяет использовать да интегральной характеристики соматотропной функции гипофлза экскреции гормона с мочой.

7. Установлено, что клетки соиатотропкнокы. культивируемые In vitro, секретируют в среду гормон роста в виде доминирующей 22 кДа

формы, а такие двух дополнительных молекулярных форм, соответствующих по молекулярной массе 20 К и расв<впленной Форме горкона, то есть аналогичных вариантам гормона в нормальных гшофизах ладей. на

основании этих данных'можно утверждать, что процессинг гормона роста в клетках сомалютропином принципиально не отличается от такового в нормальных-^соматотрофах.

, СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Получение моноклональных антител к гормону роста человека и их характеристика //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1989, N11. стр. 593-596 // Соавт. Осипова Т.А.. Фидлер Р.,-Папазов И. П.. Вербицкий N. 111., Булатов A.A.

2. Иммунохимические исследования полиморфизма пролактина и гормона роста человека // Тезисы докладов III Всесоюзного съезда эндокринологов. Ташкент. 1989, стр. 26-27 // Соавт. Булатов A.A., Осипова Т. А.. Елизарова Г. П.

3. Изучение гормона роста в биологических жидкостях и тканях человека с помощью моноклональных антител // Тезисы докладов XVII Научной конференции молодых ученых и специалистов Харьковского НИИ эндокринологии и химии гормонов. Харьков. 1990. стр. 40.

4. Иммунореактивный гормон роста в моче больных с акромегалией// Проблемы эндокринологии.1991,т.37.N 6. стр.10-13// Соавт. Булатов А.А

5. Заявка на авторское свидетельство "Штамм гибридных культивируемых клеток - продуцент моноклональных антител к соматотропину человека" // Положительное решение по заявке N 4835631/13 (050607) // Соавт. Осипова Т. А.. Фидлер Р.. Вербицкий М.Ш.. Булатов A.A.

6. Использование моноклональных антител для иммуносорбции гормона роста из биологических тканей и жидкостей человека // Принята в печать в "Вопросы медицинской химии" // Соавт. Булатов A.A., Осипова Т. А.. Федотов В. П.

У ЧАС ТОК МНОЖИТШЬНОЙ ТЕХНИКИ они Р АМН

ПОЯП. К ПЕЧ 5 2 9Л. ЗАК А3 /С з.