Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Применение фосфатмобилизующих бактерий с учетом влияния бациллярной рибонуклеазы на их жизнедеятельность

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Применение фосфатмобилизующих бактерий с учетом влияния бациллярной рибонуклеазы на их жизнедеятельность"

На правах рукописи

УЛАХОВИЧ СВЕТЛАНА ВИКТОРОВНА

ПРИМЕНЕНИЕ ФОСФАТМОБШШЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ С УЧЕТОМ ВЛИЯНИЯ БАЦИЛЛЯРНОЙ РИБОНУКЛЕАЗЫ НА ИХ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТЬ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ -1998

Работа выполнена на кафедре микробиологии биолого-почвенного факультета Казанского государственного университета им. В. И. Ульянова-Ленина

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент С. Ю. Егоров

Консультант:

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Ф. Г. Куприянова-Ашина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, главный научный сотрудник Горшкова Т. А.

кандидат биологических наук, доцент Гимадутдинов О. А.

Ведущая организация:

институт микробиологии РАН, Москва

¿О

Защита диссертации состоится $ ^ _1998 г. в /часов

на заседании диссертационного Совета К 053.29.19. при Казанском государственном университете им. В. И. Ульянова - Ленина, 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного университета ,—

Автореферат разослан у 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук А. Н. Аскарова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Выращивание овощных культур в условиях защищенного грунта дает возможность обеспечить население сельскохозяйственной продукцией круглый год. К сожалению, не всегда тепличные хозяйства работают достаточно эффективно. Причины этого различны, одной из основных является дефицит фосфора, что объясняется быстрым связыванием фосфора в почвах в виде труднодоступных для растений соединений при внесении его с удобрениями. В связи с этим усвояемость сельскохозяйственными растениями фосфорных удобрений не превышает 25% (Муромцев и др., 1985).

Для улучшения фосфорного питания растений и повышения их урожайности в ряде стран разрабатываются и внедряются биологические препараты, приготовленные на основе активных штаммов фосфатмобшшзующих почвенных микроорганизмов, и уже достигнуты определенные успехи в практическом их применении (Kucey, 1987; Базилевская,1989; Токмакова, 1997). Положительное действие фосфатмобилизующей микрофлоры связано как с увеличением доступного для растений фосфора, так и с образованием ими физиологически активных веществ. Установлено, что микроорганизмы, солюбилизирующие почвенные фосфаты, продуцируют растительные гормоны (ауксины и гиббереллины) в количествах, необходимых для ускорения роста ряда сельскохозяйственных культур (Sattar, Gaur, 1987; Glick, 1995).

Вместе с тем уделяется недостаточное внимание вопросу о роли фосфатмо-билизующих микроорганизмов в снабжении растений фосфором в условиях защищенного грунта. В связи с этим существенный теоретический интерес и практическое значение представляет изучение развития фосфатмобилизующей почвенной микрофлоры в тепличных условиях и ее влияние на урожайность овощных культур.

Необходимость улучшения обеспеченности сельскохозяйственных растений фосфором делает актуальным поиск различных регуляторов роста и развития микроорганизмов, которые могут активно влиять на размножение фосфатмобили-

зующей микрофлоры. Большие перспективы при этом имеют регуляторы роста микробного происхождения ввиду их экологической безопасности. Особый интерес представляет внеклеточная рибонуклеаза В. ¡гНеппесУш;. Известно, что экзогенная РНКаза в микродозах стимулирует рост и деление микроорганизмов, увеличивает выход биомассы, усиливает способность бактерий продуцировать биологически активные вещества (Егоров и др., 1989; 1994; Ильинская и др., 1993; Ку-приянова-Ашина и др., 1995).

Цель и задачи исследований. Целью настоящего исследования явилась разработка бактериального препарата на основе эффективных штаммов фосфатмо-билизующих бактерий, с учетом влияния РНКазы В. киегтес1ш5 на их жизнедеятельность для использования в условиях защищенного грунта.

В соответствии с заданной целью были поставлены следующие задачи.

1. Выделение из прикорневой зоны огурца и идентификация штаммов микроорганизмов, обладающих высокой активностью трансформации труднодоступных для растений фосфатов.

2. Изучение влияния РНКазы В. ЫегтеёшБ на размножение и физиологическую активность бактерий.

3. Определение сорбционной способности и проницаемости бактериальных клеток в отношении рибонуклеазы.

4. Исследование влияния фермента на элекгрокинетические свойства и ионную проницаемость микроорганизмов.

5. Определение возможности использования РНКазы для повышения эффективности фосфатмобилизующего сообщества и увеличения урожайности огурца в производственных условиях.

Научная новизна работы. Впервые из прикорневой зоны огурца в условиях защищенного грунта выделены и идентифицированы бактерии, характеризующиеся высокой активностью трансформации труднодоступных фосфатов.

Обнаружена способность РНКазы В. пиегтеШиБ оказывать стимулирующее действие на размножение и физиологическую активность бактерий.

Установлено, что повышение фосфатмобилизующей активности бактерий под действием рибонуклеазы связано с увеличением количества клеток. На штаммах Е. coli и В. subtilis показано, что действие фермента сопровождается увеличением удельной скорости роста клеток, прироста биомассы, что связано с сокращением лаг-периода клеточного цикла. Ускорение размножения коррелирует с повышением интенсивности дыхания бактериальных клеток. При этом отмечено более продуктивное потребление глюкозы.

Установлено, что стимулирующий эффект РНКазы связан со способностью фермента адсорбироваться на клеточной поверхности и взаимодействовать с ци-топлазматичеекой мембраной. При этом наблюдается снижение плотности заряда клеток, меняется ионная проницаемость бактерий.

В модельном опыте показано, что инокуляция тепличного грунта сообществом фосфатмобилизующих бактерий способствует накоплению в нем водорастворимого фосфора, доступного для растений. Впервые в производственных условиях продемонстрирована возможность целенаправленного повышения урожая огурца путем предварительной обработки семян сообществом фосфатмобилизующих микроорганизмов. Применение РНКазы В. intermedius в качестве ростсгамули-рующей добавки повышает эффективность использования микробного сообщества.

Практическое значение работы. Разработан способ получения бактериального препарата на основе активных штаммов фосфатмобилизующих бактерий, выделенных из прикорневой зоны огурца, с применением РНКазы В. intermedius в качестве стимулирующей добавки. Эффективность применения этого удобрения выражается в улучшении обеспеченности растений доступным фосфором и за счет этого в увеличении урожая огурца.

Способ испытан в совхозе "Казанский Тепличный" Республики Татарстан. В диссертации имеется акт производственного испытания, подтверждающий эффективность использования фосфатмобилизующего сообщества.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на симпозиуме по биотехнологии в Голландии (Netherlands, 1995), Международной конференции "Экотехнология - 96" (Иркутск, 1996), на 8 Международной конференции молодых ученых "Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений" (Казань, 1996), на 2 съезде Биохимического общества при Российской академии наук (Москва, 1997), на конференции молодых ученых (Казань, 1997), на итоговых научных конференциях Казанского государственного университета (1996,1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах; состоит из обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 15 рисунков, 9 таблиц. Список литературы содержит 125 отечественных и 62 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследований служили: фосфатмобилизующие микроорганизмы, выделенные из прикорневой зоны огурца в условиях защищенного грунта совхоза "Казанский Тепличный"; Bacillus subtilis 168 - из Всесоюзной коллекции микроорганизмов; Escherichia coli К-12 - из Всесоюзной коллекции микроорганизмов.

Для выделения микроорганизмов, мобилизующих труднодоступные фосфаты использовали агаризованные питательные среды (Муромцев, Самойлова,1975; Методические указания...,1981).

Все исследуемые бактерии поддерживали в полужидком (0,5%) мясопеп-тонном агаре (МПА). Грамотрицательные бактерии выращивали на глюкозо-минеральной среде М-9 (Анросов, Левашев,1975), грамположительные - в жидкой среде Спицайзена (Spisizen, 1958).

Видовую и родовую принадлежность бактерий выявляли с помощью определителя Берги (1980).

Контроль за ростом культур осуществляли подсчетом клеток в 1 мл микробной взвеси с помощью фазово-контрастной микроскопии. Количественные параметры роста бактерий оценивали по величинам: удельной скорости роста (//), времени генерации (g) (Коротяев,1973). Выход биомассы (экономический коэффициент) определяли по Перту (1978).

Исследуемая в работе рибонуклеаза Bacillus intermedins получена в лаборатории ББФ КГУ. Молекулярная масса РНКазы составляет - 12300 кДа, удельная активность - 1000000 ед/мг белка.

Определение гомогенности препарата РНКазы В. intermedius проводили методом электрофореза (Loummli, 1970). О величине ферментативной активности РНКазы судили по количеству кислоторастворимых продуктов гидролиза РНК (Лещинская,1981). За единицу активности принимали количество фермента, способного увеличить поглощение кислоторастворимых продуктов гидролиза РНК при 260 нм на 1 единицу в минуту при 37°С и pH 8,5.

Влияние РНКазы на размножение бактерий определяли после 5 часовой инкубации клеток (2х107 /мл) культур в среде, содержащей добавленный в нее фермент в концентрациях 0,0001 - 0,1 мкг/мл. О скорости роста культур судили по количеству клеток в 1 мл среды. Контролем во всех вариантах опытов служили клетки, выращенные в среде без РНКазы.

Об интенсивности синтеза ДНК, РНК и белка в клетках бактерий судили по включению меченных предшественников 3Н-тимидина, 14С-урацила, 14С-лейцина, соответственно (Шаткин, 1972).

Количество цАМФ в лизатах клеток измеряли методом Джилмана (Gilman, 1972).

Потребление глюкозы клетками определяли ферментативным методом (Bergmeyer H.U. et. al., 1974).

Скорость потребления кислорода бактериями измеряли на полярографе LP-7Е (ЧСФР) с кислородной ячейкой (рабочий объем 1 мл) и платиновым электродом Кларка (Зеленский М.Н., 1986).

s

Фосфатмобшшзуюшая активность микроорганизмов изучалась в жидких глюкозо-аспарагиновых средах, содержащих различные соединения фосфора, которые вносили из расчета 500 мг на 1 л среды. Фосфор, перешедший в раствор, определяли по методу Лоури и Лопеса в модификации Скулачева (Лебедев П.Т., Усович А.Т., 1965).

При изучении влияния PI ПС азы на способность бактерий растворять фосфат кальция в питательной среде, фермент в стимулирующей дозе вносили в культуру экспоненциальной фазы роста исследуемых бактерий. После 12-ти часовой инкубации при оптимальной температуре определяли количество растворимого фосфора (Лебедев П.Т., Усович А.Т., 1965).

О фосфатмобилизующей активности бактерий, обработанных РНКазой, в тепличном грунте (модельный опыт) судили по содержанию подвижного фосфора в почве (Ягодин, 1987).

Сорбиионную способность клеток бактерий в отношении РНКазы определяли после инкубации микробной взвеси (2х107 клеток/мл) с ферментом (0,01 мкг/мл) и последующего определения РНКазной активности в супернатанте.

Проникновение РНКазы в клетки бактерий изучали с помощью иммунофер-ментного анализа твердофазным методом "сэндвич" (Дзантиев, Егоров, 1982).

Для выявления РНКазы в микробных клетках использовали электронно-микроскопические методы исследования. С этой целью клетки (2x107 в 1 мл) инкубировали с РНКазой (0,01 мкг/мл) в течение 20 мин после чего обрабатывали согласно методике (Carlemalm et.ai.,1982). Затем производили криоскалывание образцов и подвергали иммуномечению. В контроле исследовали клетки без РНКазы, а также меченные неспецифическими к РНКазе антителами.

Электрофоретическую подвижность (ЭФП) клеток измеряли на автоматическом микроскопе "Пармоквант 2" ("Carl Zeiss Jena", ГДР) в ручном режиме (Иванов, Фомченко, 1986).

Ионную проницаемость микроорганизмов определяли измерением сопротивления клеточных суспензий с помощью реохордного моста ВМ 401 Е фирмы "Tesla" (Чехословакия) (Маленков, 1976).

Концентрацию кальция в среде исследовали с помощью атомно-адсорбционного спектрофотометра АА8-3 (ГДР) при длине волны 422,7 нм.

Производственные испытания проводили в совхозе "Казанский Тепличный" в 1994-1995 гт в первом культурообороте. Для предпосевной обработки семян огурца сорта "Эстафета" применяли суспензию фосфатмобилизующих микроорганизмов, обработанных РНКазой. Учет урожая осуществляли в соответствии с графиком сбора урожая в данном тепличном хозяйстве.

Статистическая обработка результатов.

В работе все эксперименты были проведены не менее чем в пятикратной по-вторности. Анализ полученных данных осуществляли с использованием компьютеризованного теста Стьюдента, принимая критерий Р<0,05 достаточным для достоверной разницы в результатах.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение фосфатмобилизующей способности микроорганизмов, выделенных из прикорневой зоны огурца

Исследование тепличного грунта прикорневой зоны огурца показало, что в прикорневой зоне этого растения встречаются разные группы фосфатмобилизующих микроорганизмов: грамположительные и грамотрицательные бактерии, мик-ромицеты и актиномицеты. По мере развитая огурца наблюдалось быстрое увеличение численности фосфатрастворяющей микрофлоры. Нарастание количества микроорганизмов начиналось с момента появления у растений основных листьев, пик численности приходился на фазу цветения. Доминирующее положение занимала группа микроорганизмов, мобилизующая фосфат кальция.

Оценивая фосфатмобилизующую активность выделенных микроорганизмов, мы установили, что наиболее активными деструкторами фосфорных соединений являются бактерии, фосфаггрансформирующая активность микромицетов и актиномицетов незначительна (таблица 1).

Таблица 1

Распределение микроорганизмов, выделенных из прикорневой зоны огурца,

по активности растворения различных соединений фосфора_

Трудно доступные соединения фосфора Исследуемые микроорганизмы Радиусы зон растворения фосфатов (мм)

1-3 4-6 7-10 11-15 16-20

Саз(Р04)2 бактерии микромицеты актиномицегы 30 8 2 20 5 3 17 3 3 3 3 1

А1Р04 бактерии микромицеты 20 6 7 5 3 2 5 1

FeP04 бактерии микромицеты 15 2 7 2 4 3 -

ДНК бактерии микромицеты 30 1 14 1 3 2 1

Фитин бактерии микромицеты 14 1 4 1 4 ; _

На основании полученных данных нами было отобрано 7 штаммов бактерий, характеризующихся высокой фосфатрастворяющей активностью, которые были идентифицированы до вида: В. polymyxa, В. megaterium, В. subtilis, В. brevis, В. licheniformis, Pseudomonas stutzeri и Escherichia coli.

Из ряда отобранных микроорганизмов при культивировании в жидкой питательной среде наиболее активно переводили фосфор в раствор из фосфатов кальция, алюминия, железа бациллы: В. polymyxa, В. licheniformis, В. subtilis (табл. 2). При этом активность трансформации фосфата кальция была выше, чем фосфата алюминия и фосфата железа. Самыми активными микроорганизмами, переводившими органический фосфор (ДНК, фитин) в раствор,являются В. brevis и В. megaterium. Растворение органических и неорганических фосфатов сопровождалось снижением значений рН среды.

Итак, из прикорневой зоны огурца нами были выделены грамположитель-ные и грамотрицательные бактерии, обладающие высокой способностью трансформации органических и неорганических соединений фосфора.

и

Таблица 2

Активность трансформации органических и неорганических соединений фосфора фосфатмобилизующимн бактериями

Исследуемые микроорганизмы Растворенный фосфор, мг/л

Са3(Р04)2 AIPO4 FePOi ДНК Фитин

В. polymyxa 305,2 ±14,6 132,1 ±6,4 95,4 ±4,7 96,4 ±4,9 32,7± 1,6

В. megaterium 160,8 ±7,8 116,8 ±5,9 63,2 ±3,0 173,1 ±8,6 57,3 ±3,0

В. subtilis 204,3 ±10,0 117,9 ±5,8 80,9 + 3,8 69,7 ±3,2 21,2+1,0

В. brevis 196,7± 9,8 И 2,4 ±5,9 76,4 ±3,9 164,6±8,2 63,7 + 3,1

В. licheniformis 224,6 ±11,0 123,9 ±5,8 91,3 ±4,2 117,9 ±6,0 33,8 ±1,7

Р. stutzen 118,6 ±6,0 101,6+5,0 69,9 ±3,4 98,7+4,6 41,0 + 2,0

Е. coli 106,9 ±5,3 97,3 ±4,7 59,6 ±2,8 63,7 + 3,1 17,8 ±0,8

2. Влияние РНК азы В. intermedius на рост и физиологическую активность бактерий С целью повышения накопления растворимого фосфора в почве за счет увеличения численности популяции фосфатмобилизующих микроорганизмов мы использовали РНКазу В. intermedius, которая известна как стимулятор роста и жизнедеятельности ряда про- и эукариот. Предварительно были проведены исследования на классических штаммах Е. coli и В. subtilis. Установлено, что ростстиму-лирующий эффект РНКазы наиболее выражен при использовании в качестве ино-кулята клеток культуры экспоненциальной фазы роста. Действие РНКазы на бактерии, выделенные из прикорневой зоны огурца, исследовали с соблюдением условий, способствующих проявлению максимального стимулирующего эффекта. Как видно из рис. 1, оптимально стимулирующей концентрацией фермента для бактерий рода Bacillus явилась 0,001 мкг/мл/2*107 клеток, для Р. stutzen и Е. coli -0,01 мкг/мл/2* 107 клеток.

теда^шт [¡сЬетГогт^

□ 0,1мкг/мл 00,01 мкг/мл 130,001 мкг/мл П0,0001мкг/мл Рис. 1. Влияние РНКазы В. ¡тегтеШш, в различных дозах, на рост

фосфатмобилизующих бактерий. Исследование влияния РНКазы на фосфатмобилизующую активность микроорганизмов показало, что обработка бактерий ферментом способствует накоплению растворимого фосфора в среде, содержащей фосфат кальция, на 26-34% в зависимости от штамма бактерий (рис 2). Способность бактерий трансформировать фосфаты в присутствии рибонуклеазы положительно коррелирует с увеличением количества клеток. Следовательно, повышение фосфатмобшшзующей активности бактерий, под действием РНКазы, связано с увеличением численности микроорганизмов.

40 т

В. polymyxa В. В. brevis В. В. subtilis Ps. stutzen Е. coli

megaterium licheniformis

□Растворимый фосфор, мг/мл DКоличество клеток, мнл/мл

Рис. 2. Влияние РНКазы та рост фосфатмобилизующих микроорганизмов и накопление растворимого фосфора в среде, содержащей Саз(Р04)г

Более подробно влияние РНКазы на рост бактерий исследовалось на модели классических штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий В. subtilis и Е. coli, соответственно.

На синхроннорастущей культуре Е. coli показано, что в течение одной генерации включение меченого предшественника ДНК и деление клеток в присутствии РНКазы начинается раньше, чем в контроле на 10 минут (рис. 3). Сходный эффект наблюдается у В. subtilis при выращивании клеток в присутствии РНКазы.

| 80

с; 2

Ьй

о к

CD

о

m

ъ

о т

S

с; о 1£

80

Время, мин

Рис. 3. Влияние РНКазы В. intermedius на рост и синтез ДНК клеток Е. coli в течение одной генерации; 1, 2 - количество клеток в контрольных и опытных образцах, соответственно; 3, 4 - интенсивность включения меченных предшественников ДНК в клетках контрольных и опытных вариантов, соответственно.

Следовательно, ускорение роста и развития микроорганизмов при добавлении РНКазы в питательную среду вызвано сокращением лаг-периода клеточного цикла.

Анализ некоторых физиолого-биохимических функций культур Е. coli и В. subtilis, развивающихся на среде с РНКазой и без нее в течение 5 часов, показал, что стимуляция роста культур, вызванная ферментом, связана с увеличением удельной скорости размножения бактерий на 18,4 - 25,4%, прироста биомассы на 32,0 - 38,8%, что сопряжено с сокращением времени генерации на 16-20% (табл. 3). Ускорение размножения коррелирует с повышением интенсивности дыхания Е. coli и В. subtilis. Причем экономический коэффициент для культуры опытных

вариантов в 1,23-1,30 раза выше, чем в контрольных. Это свидетельствует об изменениях в метаболизме клетки под влиянием РНКазы, в результате чего энергетический материал (глюкоза) расходуется более продуктивно.

Таблица 3

Влияние РНКазы Bacillus intermedius на физиолого-биохимичесхую активность бактерий.

Штаммы бактерий

Параметры роста Escherichia coli Bacillus subtilis

контроль РНКаза (0,01 мкг/мл) контроль РНКаза (0,001 кг/мл)

Удельная скорость роста,час 0,51 ±0,02 0,64 ±0,03 0,76 ±0,03 0,9 ±0,04

Биомасса, г/л сухого веса 0,121 ±0,006 0,168 ±0,008 0,234 ±0,001 0,3 09±0,001

Время генерации,ч. 0,9 ±0,04 0,72 ±0,03 0,85 ±0,04 0,70 ±0,03

Потребление глюкозы, г/л 3,62 ±0,12 3,91 ±0,13 3,82±0,13 4,12±0,12

Экономический коэффициент 0,033 0,043 0,061 0,075

Скорость потребления кислорода, С!о нмоль/мг сухого веса в 1 ч 105,3 ±5,1 152,4 ±7,6 117,9 ±5,8 160,1 ±8,0

Итак, при культивировании грамположительных и грамотрицательных бак терий в присутствии экзогенной РНКазы, наблюдается ускорение размножение клеток, что коррелирует с усилением их метаболической активности.

З.Взаимодействие экзогенной рибонуклеазы с поверхностью бактериальной клетки Для понимания механизмов стимулирующего влияния РНКазы на рост i жизнедеятельность микроорганизмов необходимо рассмотреть вопрос о взаимо действии фермента с клеточной поверхностью бактерий, а также о проникновенш его в клетку.

Рассматривая адсорбцию фермента как один из первых этапов поступлени его в клетку, мы исследовали способность клеток бактерий сорбировать на CBoei поверхности РНКазу. В результате инкубации клеток В. subtilis и Е. coli с РНКазо: в течение 60 мин установлено, что достаточно 2-5-ти минутной экспозиции бакте рий с ферментом для того, чтобы около 33-50% РНКазы адсорбировалось на и клеточной поверхности (рис. 4).

Время, мин

Рис. 4. Адсорбция РНКазы на поверхности клеток: 1 - Е. coli; 2 - В. subtilis. Для обнаружения РНКазы в клетках после их инкубации с ферментом в течение 20 минут провели иммуноферментный анализ, с помощью которого РНКаза выявлена в лизатах сферопластов Е. coli и протопластов В. subtilis.

—?■»

Рис. 5. Электронная микрофотография сколов клеток Е. coli после проведения иммуноци-тохимической реакции на выявление РНКазы В. intermedius. Стрелками указан продукт реакции в виде электронно-плотных гранул диаметром 15 нм.

Использование в качестве объектов исследования лизатов, в состав которых входят мембранные структуры, не исключает возможности того, что экзогенный фермент находится в ассоциированном состоянии с цитоплазматической мембраной. Это было подтверждено результатами электронно-микроскопического анализа препаратов клеток Е. coli, полученных с помощью метода замораживания-скалывания. После проведения иммуноцитохимической реакции, выявляющей РНКазу на срезах, продукт реакции (РНКаза и комплекс "белок А - золото") обнаруживается в виде электронно-плотных гранул диаметром 15 нм, локализованный на наружной (EF) поверхности цитоплазматической мембраны Е. coli (рис.

5).

Как известно, поверхность микроорганизмов обладает зарядом, который обусловлен ионогенными группами, расположенными на цитоплазматической мембране и клеточной оболочке (Мирошников др., 1986).

5000

S 4000 \ § 3000 - \ О onnn .

'2000 1000 0

А

-5--S-

3000 ■

Б

-Ь

S 2000 J1 о

1000 •

т-

0

40

60

Время, мин

0

20

-контроль •

40 -опыт

60

Время, мин

20

—♦—контроль -

Рис.6. Влияние РНКазы на плотность поверхностного заряда клеток: А - Е. coli, Б - В. subtilis. Контроль - клетки, не обработанные ферментом; опыт - клетки, обработанные РНКазой.

Нами было установлено, что интакгные клетки, взятые из середины фазы экспоненциального роста, имеют плотность электростатического заряда -4000 СГСЭ/см2 для Е. coli и -2600 СГСЭ/см2 для В. subtilis (рис. 6). Действие фермента резко снижает заряд грамотрицательных клеток до -2250 СГСЭ/см2, а грамположительных до -1100 СГСЭ/см2, не меняя этого значения в течение 60 минут.

Таким образом, при сорбции молекул РНКазы происходит изменение зарядовых свойств поверхности вследствие нейтрализации отрицательно заряженных групп клеточной поверхности.

Учитывая, что уменьшение количества поверхностных анионных групп снижает барьерные свойства бактериальных мембран (Иванов, Фомченко, 1989), можно предположить, что под действием РНКазы происходит изменение ионной проницаемости клеток микроорганизмов. Для проверки этого измеряли изменение электропроводности суспензии бактерий, обработанных ферментом, в бидистил-ляте. После установления постоянного сопротивления клеточной суспензии в электрометрическую ячейку добавляли РНКазу. Показано, что добавление РНКазы к клеткам уменьшает сопротивление суспензии, что возможно при условии выхода из клеток дополнительных электролитов (рис. 7).

40 п

1

зо ! 20 -! 10 1

0 -L-

5 о 5 эо о

'i О „ -1 8.* 20 с

г г о & <° о

20

40

□ контроль Попыт

60

Время, мин

1С

О-!—1—

20 40

□ контроль Попыт

60

Время, мин

Рис. 7. Действие РНКазы на ионную проницаемость клеток: А - Е. coli, Б - В. subtilis. Контроль - клетки, не обработанные ферментом, опыт - клетки, обработанные РНКазой.

Помимо этого, при воздействии на клетки Е. coli РНКазой наблюдалось значительное увеличение скорости поступления экзогенного кальция в бактерии, что является дополнительным показателем изменения ионной проницаемости мембран бактериальных клеток, растущих в присутствии РНКазы.

На основании проведенных исследований можно заключить, что стимулирующий эффект РНКазы связан со способностью фермента адсорбироваться на клеточной поверхности и взаимодействовать с цитоплазматической мембраной. В

5

результате чего происходит снижение плотности заряда клеток, меняется ионная проницаемость цитоплазматической мембраны бактерий.

Вероятно, под действием экзогенной РНКазы происходит изменение мембранной системы клетки, в первую очередь проницаемости ее для ионов, приводящее, через каскад биохимических реакций, к усилению процессов пролиферации микроорганизмов (Маленков А. Г., 1976; Конев С. В. и др., 1991; Колпаков 1993; Ильинская, 1998).

4. Получение удобрения на основе фосфатмобилизмощих бактерий с применением в качестве стимулирующей добавки РНКазы В. intermedius Изложенные выше результаты исследований позволяют рассматривап РНК азу в качестве стимулятора роста фосфатмобилизующих бактерий, примене ние которого позволит повысить количество доступного фосфора в почве.

Для эффективного применения фосфатмобилизующих микроорганизмо] было сконструировано микробное сообщество, составленное го бактерий В. polymyxa, В. megaterium, В. subtilis, В. brevis, В. licheniformis, Pseudomona; stutzen. При изучении характера взаимоотношений между бактериями, состав ляющими фосфатмобилизующее сообщество, не наблюдалось антагонизма меж ду исследуемыми культурами.

Способность полученного нами сообщества осуществлять процесс транс формации труднодоступных органических и неорганических соединений фосфор в условиях защищенного грунта изучали в модельном опыте. Как видно из дан ных, представленных на рис. 8, в почве, инокулированной сообществом микроор ганизмов, содержание подвижного фосфора возросло на 85%, 44%, 28%, 47°А 62% в вариантах с Саз(Р04)г, AIPO4, FePO,), ДНК, фитином соответственно. Об работка фосфатмобилизующих микроорганизмов РНКазой в ростстимулирующи дозах (для рода Bacillus - 0,001 мкг/2х107 клеток/мл и рода Pseudomonas - 0,0 мкг/2х107 клеток/мл) повышала фосфатрастворяющую активность бактерий на Ii 20%.

250 200 -150 -100 -50

А1РО„

РеРО,,

ДНК

фитин

"Ч 1 сг

□тепличный грунт

□ тепличный грунт, инокулированный фосфатмобилизующими бактериями □тепличный фунт, инокулированный бактериями, обработанными РНКазой

Рис. 8. Мобилизация фосфора в тепличном грунте сообществом фосфатмобилизующих микроорганизмов. „

Таблица 5

Влияние микробного сообщества фосфатмобилизующих бактерий на урожайность огурца сорта "Эстафета" (в кг/м2 ) в 1994 году

Г

Даты сбора урожая Варианты опыта

контроль без инокуляции фосфат- моб. сообществом инокуляция фосфатмоб. сообществом (вариант 1) прибавка урожая, в % к контр. инокуляция фосфатмоб. собществом, обработанном РНКазой (вариант 2) прибавка урожая, в % к контр

февраль-март 3,8 ±0,1 6,1 ±0,2 61,0 6,7 ±0,2 76,3

апрель 7,9 + 0,2 9,4 ±0,3 18,9 10,2 + 0,3 29,1

май 6,7 ±0,2 7,1 ±0,2 5,9 8,0 ±0,2 29,1

июнь 8,9 ±0,2 9,7±0,3 8,9 9,6+0,3 7,8

всего за февраль-июнь 27,3 ±0,8 33,1 ±0,9 21,2 35,1 ±1,0 28,5

В дальнейшей работе в производственных условиях был поставлен опыт по изучению влияния на урожайность огурца предпосевной обработки семян сообществом фосфатмобилизующих микроорганизмов, необработанных (вариант1) и обработанных РНКазой (вариант2).

Как видно из данных таблицы 5; при инокуляции сообществом микроорганизмов (вариант 1) ранний урожай в феврале-марте составил 6,1 кг/м2, что на 61% выше, чем в контроле (3,8 кг/м2). Обработка фосфатмобилизующих бактерий РНКазой (вариант 2) приводила к увеличению урожая на 76,3% по сравнению с контролем и на 9,8% с опытным вариантом 1.

Общий урожай за 5 месяцев сбора без инокуляции семян сообществом фосфатмобилизующих микроорганизмов составил 27,3 кг/м2, в опытном варианте 133,1 кг/м2, в опытном варианте 2 - 35,1 кг/м2. Общая прибавка урожая за 5 месяцев плодоношения в опытном варианте 1 составила 5,8 кг/м2, т.е.21,2%, в опытном варианте 2 - 7,8 кг/м2, или 28,5%.

Аналогичная закономерность наблюдалась и в 1995 году.

Таким образом, сообщество, составленное из фосфатмобилизующих бактерий, выделенных из прикорневой зоны огурца, способно повышать усвояемость растений огурца труднорастворимого фосфора. Это дает возможность рекомендовать фосфатмобилизующее сообщество микроорганизмов в качестве бактериального препарата под овощные культуры, выращиваемые в условиях тепличных хозяйств. Применение РНКазы В. цйегтпесПиз в качестве стимулирующей добавки позволит повысить эффективность использования микробного сообщества.

ВЫВОДЫ

1. Из прикорневой зоны огурца выделены и идентифицированы бактериальные штаммы, обладающие высокой активностью трансформации труднорастворимых фосфатов.

2. РНКаза В. intermedius при внесении в среду культивирования ускоряет размножение фосфатмобилизующих микроорганизмов. Стимулирующий эффект РНКазы зависит от концентрации вносимого фермента.

3. Повышение фосфатмобилизующей активности бактерий, под влиянием РНКазы, связано со стимуляцией размножения клеток, что выражается в сокращении лаг-фазы клеточного цикла, увеличении удельной скорости роста и прироста биомассы.

4. Ускорение размножения бактерий коррелирует с увеличением интенсивности дыхания клеток, повышением экономического коэффициента.

5. Стимулирующий эффект РНКазы связан со способностью фермента адсорбироваться на клеточной поверхности и взаимодействовать с цитоплазматиче-ской мембраной, в результате чего происходит снижение плотности заряда клеток, меняется ионная проницаемость цитоплазматической мембраны бактерий.

6. Предпосевная обработка семян сообществом фосфатмобилизующих бактерий способствует накоплению водорастворимого фосфора в тепличном грунте, доступного для растений, что приводит к увеличению урожая огурца на 21,2%. Это дает возможность рекомендовать фосфатмобилизующее сообщество микроорганизмов в качестве бактериального препарата под овощные культуры, выращиваемые в условиях тепличных хозяйств.

7. Применение РНКазы В. intennediœ в качестве стимулирующей добавки повышает эффективность использования фосфатмобилизующего сообщества.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Egorov S. Yu., Kulagina E. M., Ulakhovich S. V. Aminoacid production using immobilized Escherichia coli cells treated with RNAase // Immobilized cells: basics and appications. The Netherlands. - 1995. - P. 63.

2. Егоров С. Ю., Козлова О. В., Улахович С. В., Ленинская И. Б. Роль РНКазы Bacillus intermedius в регуляции жизнедеятельности микроорганизмов // Тез. докл. Междунар. конф. "Экотехнология - 96". - Иркутск. - 1996. - С.29.

3. Улахович С. В., Торопцева Е. Н., Кулагина Е. М., Егоров С. Ю. Использование биополимера РНКазы и его комплекса в биотехнологии // Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений: Тез. докл. 8 Междуиар. конф. мол. ученых. Казань. 21-24 мал 1996. -Казань. - 1996. - С.149.

4. Егоров С. В., Улахович С. В., Захарова Н. Г., Алимова Ф. К., Лещинская И. Б. Воздействие фосфатмобилизующих мшфоорганизмов на растения защищенного грунта // Вестник Российской Академии сельскохозяйственных наук. -1997. - №4. - С.41-44.

5. Улахович С. В., Егоров С. Ю., Куприянова-Ашина Ф. Г. Влияние рибо-нуклеаз микробного и животного происхождения на клетки Escherichia coli // Сб. тр. мол. уч. "Проблемы общей биологии и прикладной экологии". Изд.: Са-ратовкого университета. - 1997. - Вып. 1. - С. 56-61.

6. Егоров С. Ю., Улахович С. В., Куприянова- Ашина Ф. Г. Влияние РНКазы Bacillus intermedius на рост Escherichia coli // Тез. докл. 2 съезда Биохимического общества при Рос. Ак. Наук. Москва. 19-23 мая 1997. - Москва. - 1997. -С. 96.

7. Улахович С. В., Егоров С. Ю. Действие РНКазы Bacillus intermedius на размножение Escherichia coli и иммуноцитохимическое исследование проникновения фермента в бактериальные клетки // Тез. докл. 3 Республ. научн. конф. мол. уч. и спец. 10-11 сентября. 1997. - Казань. - 1997. - С. 68.

8. Егоров С. Ю., Улахович С. В., Дмитриев В. В., Куприянова-Ашина Ф. Г. Иммуноцитохимическое исследование взаимодействия РНКазы Bacillus intermedius с клеточной поверхностью Escherichia coli и влияние фермента на размножение бактерий // Сб. докл. 11 Всерос. конф. "Ферменты микроорганизмов". - Казань. - 1998. - С.211-219.

9. Егоров С.Ю., Улахович С.В., Дмитриев В.В., Куприянова-Ашина Ф.Г. Лещинская И.Б. Исследование влияния РНКазы Bacillus intermedius на рост и фи зиологическую характеристику Escherichia coli // Микробиология. - 1999. - (в печа

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Улахович, Светлана Викторовна, Казань

КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

УЛАХОВИЧ СВЕТЛАНА ВИКТОРОВНА

ПРИМЕНЕНИЕ ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ С УЧЕТОМ ВЛИЯНИЯ БАЦИЛЛЯРНОЙ РИБОНУКЛЕАЗЫ НА ИХ

ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТЬ

03.00.07 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -кандидат биологических наук, доцент Егоров С.Ю.

Консультант -

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Куприянова-Ашина Ф. Г.

КАЗАНЬ - 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................... 5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. БИОФОСФОР И ЕГО ЗНАЧЕНИЕ

В СЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВЕ....................................................... 9

1.1. Микробиологическая трансформация минеральных

и органических соединений фосфора в почве.........................9

1. 2. Использование фосфатмобилизующих микроорганизмов

для усиления фосфорного питания сельскохозяйственных

растений..................................................................................... 17

ГЛАВА 2. РОЛЬ РИБОНУКЛЕАЗ В СТИМУЛЯЦИИ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ......................................21

2. 1. Рост и развитие бактерий..........................................................21

2. 2. Стимуляция роста и жизнедеятельности микроорганизмов... 32

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................................................... 42

1. Штаммы бактерий и условия выращивания................................42

2. Контроль за ростом культур......................................................... 44

3. Используемый в работе препарат рибонуклеазы........................45

4. Влияние РНКазы на размножение микроорганизмов.................45

5. Действие РНКазы на физиологическую

активность бактерий..................................................................... 47

6. Взаимодействие рибонуклеазы

с клеточной поверхностью бактерий........................................... 49

7. Действие фермента на электрокинетические

свойства бактерий......................................................................... 52

8. Влияние рибонуклеазы на ионную проницаемость

бактериальных мембран............................................................... 53

9. Определение эффективности фосфатмобилизующего сообщества в вегетационном и полевом опытах.........................55

10.Статистическая обработка результатов...................................... 57

РЕЗУЛЬТАТЫ

ГЛАВА 1. ИЗУЧЕНИЕ ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ

ПРИКОРНЕВОЙ ЗОНЫ ОГУРЦА............................................... 58

1.1. Выделение и идентификация фосфатмобилизующих микроорганизмов в прикорневой зоне огурца

в условиях защищенного грунта.............................................. 58

1. 2. Изучение способности выделенных бактерий мобилизовать труднодоступные фосфаты в жидкой среде......................................................................... 62

ГЛАВА 2. ВЛИЯНИЕ РНКазы BACILLUS INTERMEDIUS НА РОСТ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ......

64

2.1. Влияние различных доз РНКазы

на размножение бактерий........................................................ 64

2. 2. Влияние РНКазы на фосфатмобилизующую

активность бактерий................................................................. 65

2. 3. Влияние РНКазы В. ийегтесНш на биосинтетические процессы

и физиолого-биохимические функции бактерий.....................70

ГЛАВА 3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЭКЗОГЕННОЙ РИБОНУКЛЕАЗЫ С

КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТЬЮ БАКТЕРИЙ..........................75

3.1. Сорбционная способность клеток микроорганизмов

в отношении РНКазы В. кйегтесНш.........................................75

3. 2. Проницаемость бактерий для рибонуклеазы...........................77

3.3. Влияние РНКазы на плотность

поверхностного заряда бактерий.............................................. 80

3. 4. Влияние РНКазы на ионную проницаемость

бактерий..................................................................................... 80

ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО УДОБРЕНИЯ НА ОСНОВЕ ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ В КАЧЕСТВЕ СТИМУЛИРУЮЩЕЙ ДОБАВКИ

РНКазы BACILLUS INTERMEDIUS.......................................... 83

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................................... 90

ВЫВОДЫ........................................................................................................ 100

ЛИТЕРАТУРА................................................................................................. 102

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Выращивание овощных культур в условиях защищенного грунта дает возможность обеспечить население сельскохозяйственной продукцией круглый год. К сожалению, не всегда тепличные хозяйства дают полную отдачу. Причины этого различны, одной из основных является дефицит фосфора, что объясняется быстрым связыванием фосфора в почвах в виде труднодоступных для растений соединений при внесении с удобрениями. В связи с этим усвояемость сельскохозяйственными растениями фосфорных удобрений не превышает 25% (Муромцев Г. С. и др., 1985).

Для улучшения фосфорного питания растений и повышения их урожайности в ряде стран разрабатываются и внедряются биологические препараты, приготовленные на основе активных штаммов фосфатмобилизующих почвенных микроорганизмов, и уже достигнуты определенные успехи в практическом их применении (Kucey R. М., 1987; Базилевская М. В., 1989; Токмакова JI. М., 1997). Положительное действие фосфатмобилизующей микрофлоры связано как с увеличением доступного для растений фосфора, так и с образованием ими физиологически активных веществ. Установлено, что микроорганизмы, солюбилизирующие почвенные фосфаты, продуцируют растительные гормоны (ауксины и гиббереллины) в количествах, достаточных для ускорения роста ряда сельскохозяйственных культур (Sattar М.А., Gaur A.C., 1987; Glick В. R., 1995).

Вместе с тем уделяется недостаточное внимание вопросу о роли фосфатмобилизующих микроорганизмов в снабжении растений фосфором в условиях защищенного грунта. В связи с этим существенный теоретический интерес и практическое значение представляет изучение развития фосфатмобилизующей почвенной микрофлоры в тепличных условиях и ее влияние на урожайность овощных культур .

Необходимость улучшения обеспеченности сельскохозяйственных растений фосфором делает актуальным поиск различных регуляторов роста и развития микроорганизмов, которые могут активно влиять на размножение фосфатмобилизующей микрофлоры. Большие перспективы при этом имеют регуляторы роста микробного происхождения ввиду их экологической безопасности. Особый интерес представляет внеклеточная рибонуклеаза В. ЫегтесНиз. Известно, что экзогенная РНКаза в микродозах стимулирует рост и деление микроорганизмов, увеличивает выход биомассы, усиливает способность бактерий продуцировать биологически активные вещества (Егоров С. Ю. и др., 1989; 1994; Ильинская О. Н. и др., 1993; Куприянова-Ашина Ф. Г. и др., 1995).

Цель и задачи исследований. Целью настоящего исследования явилась разработка бактериального препарата на основе эффективных штаммов фосфатмобилизующих бактерий с учетом влияния РНКазы В. ^егтесИш на их жизнедеятельность для использования в условиях защищенного грунта.

В соответствии с заданной целью были поставлены следующие задачи.

1. Выделение из прикорневой зоны огурца и идентификация штаммов микроорганизмов, обладающих высокой активностью трансформации труднодоступных для растений фосфатов.

2. Изучение влияния РНКазы В. ¡ЩегтесПш на размножение и физиологическую активность бактерий.

4. Определение сорбционной способности и проницаемости бактериальных клеток в отношении рибонуклеазы.

4. Исследование влияния фермента на электрокинетические свойства и ионную проницаемость микроорганизмов.

5. Определение возможности использования РНКазы для повышения эффективности фосфатмобилизующего сообщества и увеличения урожайности огурца в производственных условиях.

Научная новизна работы. Впервые из прикорневой зоны огурца в условиях защищенного грунта выделены и идентифицированы бактерии, характеризующиеся высокой активностью трансформации труднодоступных фосфатов.

Обнаружена способность РНКазы В. intermedius оказывать стимулирующее действие на размножение и физиологическую активность фосфатмобилизующих бактерий. Установлено, что повышение

фосфатмобилизующей активности бактерий под влиянием рибонуклеазы связано с увеличением количества клеток. На штаммах Е. coli и В. subtilis показано, что действие фермента сопровождается увеличением удельной скорости роста клеток, прироста биомассы, что связано с сокращением лаг-периода клеточного цикла. Ускорение размножения коррелирует с повышением интенсивности дыхания бактериальных клеток. При этом отмечено более продуктивное потребление глюкозы.

Установлено, что стимулирующий эффект РНКазы связан со способностью фермента адсорбироваться на клеточной поверхности и взаимодействовать с цитоплазматической мембраной. При этом наблюдается снижение плотности заряда клеток, меняется ионная проницаемость цитоплазматической мембраны бактерий.

В модельном опыте показано, что инокуляция тепличного грунта сообществом фосфатмобилизующих бактерий способствует накоплению в нем водорастворимого фосфора, доступного для растений. Впервые в производственных условиях продемонстрирована возможность целенаправленного повышения урожая огурца путем предварительной обработки семян сообществом фосфатмобилизующих микроорганизмов. Применение РНКазы В. intermedius в качестве ростстимулирующей добавки повышает эффективность использования микробного сообщества.

Практическое значение работы. Разработан способ получения бактериального препарата на основе активных штаммов

фосфатмобилизующих бактерий, выделенных из прикорневой зоны огурца, с применением в качестве стимулирующей добавки РНКазы В. п^егтесИш. Эффективность применения этого удобрения выражается в улучшении обеспеченности растений доступным фосфором и за счет этого в увеличении урожая огурца.

Способ испытан в совхозе "Казанский Тепличный" Республики Татарстан. В диссертации имеется акт производственного испытания, подтверждающий эффективность использования фосфатмобилизующего сообщества.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. БИОФОСФОР И ЕГО ЗНАЧЕНИЕ В СЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВЕ 1.1. Микробиологическая трансформация минеральных и органических соединений фосфора в почве

Все возрастающий дефицит фосфора в земледелии делает актуальными исследования влияния микроорганизмов на фосфатный режим почв. Валовые запасы фосфора в почвах довольно значительны (Гинзбург К. Е., 1981). Культурные почвы могут содержать 10-20 и даже 30 т этого элемента на гектар пахотного слоя. В поверхностных слоях почвы фосфора всегда больше, чем в подпочве. Однако фосфор находится в почве, в основном, в водонерастворимой, недоступной для растений форме в виде разнообразных минеральных соединений, в основе которых лежат ортофосфаты кальция, железа и алюминия. Большая группа почвенных фосфатов, малодоступных растениям, представлена органическими соединениями.

В круговороте фосфора почвенная микрофлора играет важную роль. Ее влияние осуществляется по меньшей мере тремя путями:

1. Растворение минеральных и органических соединений фосфора.

2. Ферментативное разложение органических фосфорных соединений.

3. Потребление доступного фосфора и закрепление его в микробной биомассе.

Важными факторами мобилизации минеральных фосфатов почвы является pH среды и наличие хелатных соединений, способных прочно связывать металл (катион) фосфатов.

Согласно данным литературы, некоторые органические кислоты, аминокислоты и ряд других соединений, продуцируемые почвенными микроорганизмами могут образовывать с металлами минеральных фосфатов недиссоциирующие хелатные комплексы (Roychoudhury P., Kaushik В. D., 1989; Surange S., Kumar N., 1993; Himer P et. al., 1995).

Схематически этот процесс можно представить следующим образом:

Me - фосфат + В —>Ме - В + фосфат, где Me - Fe, Al или Ca; В - органическое соединение, дающее недиссоциирующий комплекс с металлом фосфата. В результате такой реакции фосфор освобождается и переходит в раствор, который может быть при этом нейтральным и даже щелочным (Павлова В. Ф., Муромцев Г. С., 1980).

По доступности для микроорганизмов минеральные фосфаты можно расположить следующим образом:

Са3(Р04)2 > А1Р04 > FeP04 Важное значение в питании сельскохозяйственных растений имеет процесс растворения в почве Са3(Р04)2 . соединения, представляющего основной резерв фосфора. Обширные микробиологические исследования выявили повсеместное распространение почвенных микроорганизмов, способных растворять трехкальцевый фосфат. Их число в разных типах почв (дерново-подзолистой, сероземе, красноземе, глинистой, песчаной, черноземе и т.д.) составляет от 5 до 95% от общей численности (Forster I., Freier К., 1988; Thomas L., Shantaram M. V., 1986).

Указанная группа микроорганизмов более обильно представлена в почве ризосферы по сравнению с неризосферной почвой (Lupta R. D. et. al., 1986). Так, по данным ряда авторов (Павлова В. Ф., Муромцев Г. С., 1980; Bopaiah В. М., 1985) в ризосфере кукурузы и арековых пальм их количество составляет 120 млн/г и 12 тыс/г соответственно, а в почве междурядий - 0,4 млн/г и 2,7 тыс/г.

Найдены фосфатрастворяющие микроорганизмы и в ризосфере таких растений как сахарная свекла, озимая пшеница, ячмень, вика, овес, горох. Общая численность микроорганизмов, усваивающих фосфор из Саз(Р04)2, в ризосфере указанных растений составляет 1,1 млн/г, 862 тыс/г, 305 тыс/г, 552 тыс/г и 441 тыс/г соответственно (Канивец В. И., Токмакова JI. Н., 1987). Обнаружены кислотообразующие микроорганизмы в ризосфере хлопчатника

и кокосовых пальм ( Lamal-el-Din Н., El-Din Badr S., 1983). Интересно отметить тот факт, что видовой состав микроорганизмов, способных растворять фосфаты кальция в почве, ризосфере и ризоплане одного и того же растения был различен. Так, в ризоплане кукурузы преобладали кокки (89%) и неспорообразующие палочки, в ризосфере - кокки (60%) и бациллы (30%>), в почве подавляющее большинство составляли актиномицеты.

Согласно данным литературы способностью растворять фосфаты обладают многие микроорганизмы из разных систематических групп: Arthrobacter, Achromobacter, Azotomonas, Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Corynebacterium, Alcaligenes, Aspergillus, Penicillium и др. ( Бабенко Ю. С. и др., 1984; Narsian W. et. al., 1993; Sattar М. A, Gaur A. C., 1987).

Активность растворения препарата трехкальцевого фосфора чистыми культурами фосфатрастворяющей микрофлоры довольно высока и находится в следующих пределах: грамотрицательные палочки способны переводить в раствор до 78,8 мг Р2О5 на 100 мл среды: Bacillus megatherium - 67,5; Вас. subtilis - 36,9; Streptomyces sp. - 66,6; Micrococcus sp. - 31,5. Высокой активностью в отношении Са3(Р04)2 обладают микромицеты родов: Aspergillus, Circinella, Fusarium, Penicillium, Phoma, Trichoderma. Накопление фосфора в растворе в результате биологической деятельности разных штаммов микромицетов составляло в пересчете на Р205 от 17,2 до 86 мг/100мл среды (Narsian V., Thakkar J., 1995; Reddy V. К., Reddy S. M., 1987).

Согласно данным литературы (Барбер С. А., 1988; Муромцев Г. С. и др., 1985), растворение фосфатов кальция связано с подкислением среды, но оно может происходить и в нейтральных и даже в слабощелочных условиях. В щелочных условиях Са3(Р04)2 способны растворять Вас. megatherium, Вас. circulaus, Asp. terreus, Asp.nidulaus.

В отличии от фосфатов кальция, фосфаты железа и алюминия гораздо устойчивее к растворению. До 1975 г исследования по мобилизации

микроорганизмами фосфатов алюминия и железа почти не проводились из-за отсутствия эффективных методов выделения активных культур. Метод, разработанный Муромцевым и Павловой (1975), открыл широкие возможности для выделения микроорганизмов, растворяющих фосфаты алюминия и железа.

Применение указанного метода позволило впервые выделить из разных типов почв (дерново-подзолистой, красноземной, сероземной и черноземной) микроорганизмы, способные растворять фосфаты алюминия и железа (Муромцев Г. С. и др., 1985). Их численность в перечисленных почвах составляла от 1 до 40% от общего количества микроорганизмов, учитываемых при высеве почвенной суспензии на агаризованную глюкозо-аспарагиновую среду.

Изучение распространения микроорганизмов, участвующих в мобилизации труднодоступных соединений фосфора в бурых, луговых-черноземных, луговых-глеевых, луговых-бурых почвах позволило установить, что их содержание составляет в почвах от 13 до 50% от общей численности. Показано, что различные способы окультуривания почв стимулируют развитие фосфатрастворяющих микроорганизмов. Однако внесение больших доз фосфорных удобрений (120-150 кг/га) угнетает их деятельность (Щапкова JI. Д., Дмитренко Т. И., 1985).

В красноземной почве с высоким содержанием окислов алюминия и железа фосфатрастворяющие микроорганизмы (бактерии, грибы, актиномицеты) были обнаружены под субтропическими культурами (чайный лист, лавр благородный, мандарин), при этом их численность и видовой состав был различен. Наибольшее количество фосфатрастворяющей микрофлоры было обнаружено на мандариновых плантациях. В почвах междурядий они были представлены следующими микроорганизмами: Actinomyces albus, Arthrobacter simplex, Enterobacter cloacae, Pseudomonas

fluorescens, Pénicillium rubrum (Павлова В. Ф., 1976). В ризосфере мандарина присутствовали только фосфатрастворяющие бактерии.

В ризоплане чая доминировали Вас. laterosporus, Вас. brevis, Zluconobacter ozydaus; мандарина - Xanthomonas amplina, Ps. mallei (Щапкова Л. Д., Дмитренко Т. И., 1985).

Микроорганизмы, способные к растворению фосфатов Fe и А1 распрост