Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние РНКазы Bacillus intermedius на жизнедеятельность и симбиотические свойства Rhizobium meliloti

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние РНКазы Bacillus intermedius на жизнедеятельность и симбиотические свойства Rhizobium meliloti"

, i сд

2 7 OKI 1998

На правах рукописи

НАУМОВА ЭЛЬЗА СТАНИСЛАВОВНА

ВЛИЯНИЕ РНКазы BACILLUS INTERMEDIUS НА ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТЬ И СИМБИОТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА RHIZOBroM MELILOTI

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ -1998

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина

Научный руководитель:

Консультант:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, доцент С.Ю. Егоров

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Ф.Г. Куприянова - Ашина

доктор биологических наук, профессор Л.П. Хохлова

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник М.Н. Давыдова

Ведущая организация: институт микробиологии РАН,

Москва

Защита диссертации состоится ЛР 1998 г в часов

на заседании диссертационного Совета К 053.29.19. при Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова - Ленина, 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного университета

Автореферат разослан ЫиТМ^Ц 1998

г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук у , А.Н. Аскарова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Биологическая фиксация азота атмосферы второе десятилетие остается проблемой, значение которой все возрастает и выходит далеко ¡а рамки биологии и сельского хозяйства. Причин тому много: производство минеральных удобрений потребляет до трети энергии, выделяемой на сельское <озяйство в развитых странах, в том числе и у нас в стране, а применение - ведет к :ерьезному загрязнению окружающей среды, ухудшению качества ¡елъскохозяйственной продукции, росту заболеваемости и смертности людей и кивотных, снижению почвенного плодородия (Черемисов, 1988; Шумный и др., 1991).

Именно по этим причинам во многих странах мира возросло внимание к «пользованию биологического азота в земледелии. Это связано с полной 5езвредностью процесса азотфиксации для человека и окружающей среды и тюсительно небольшими затратами энергии на активизацию микроорганизмов, )существляющих этот процесс.

В настоящее время наметилось 2 основных пути усиления азотфиксации в 1гроэкосистемах: первый - активизация деятельности естественной популяции □отфиксирующих микроорганизмов в ризосфере и на корнях; второй - инокуляция истений активными штаммами диазотрофов.

Общепризнанным является тот факт, что за счет нитрагинизации бобовые )астения могут существенно улучшить свое минеральное питание, повысить 'стойчивость к фитопатогенным микроорганизмам и даже регулировать свое »азвитие за счет использования гормональных факторов или витаминов, :интезируемых микросимбионтами.

Сегодня во многих странах мира на основе активных штаммов клубеньковых ¡актерий широко налажено производство высококачественных экологически чистых ¡иоудобрений (Smith, 1992).

Как показала практика, относительно высокая продуктивность агроэкосистем фи возделывании многих сельскохозяйственных культур достигается внесением шнерального азота в концентрации 60-90 кг/га и более в зависимости от исходного «держания в почве его легкогидролизуемых форм. Использование препаратов лубеньковых бактерий снижает эту норму на 60-100% (Патыка и др.,1993).

Вместе с тем интенсификация сельскохозяйственного производства гредусматривает разработку и внедрение все новых и прогрессивных экологически

безопасных приемов повышения урожайности растений. Одним из таких способов, повышающих эффективность бобово-ризобиального симбиоза, может быть применение регуляторов роста и развития микроорганизмов, которые могут активно влиять на жизнедеятельность клубеньковых бактерий и тем самым позволят максимально реализовать их потенциальные возможности.

Однако, внедрение синтетических регуляторов роста микроорганизмов в практику тормозится либо из-за высокой их стоимости, либо из-за отсутствия водорастворимых препаративных форм, а также возможности побочных явлений. В этом плане значительный интерес представляют биологические вещества и, в частности, РНКаза бактериального происхождения - экологически безопасный и доступный ферментный препарат.

К началу наших исследований было известно, что экзогенные РНКазы оказывают стимулирующее влияние на размножение бактерий и усиление способности продуцировать биологически активные вещества (Егоров и др., 1994; 1997; Куприянова-Ашина и др., 1995)

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование действия РНКазы Bacillus intermedius на жизнедеятельность и симбиотические свойства клубеньковых бактерий Rhizobium meliloti.

В связи с поставленной целью в работе решались следующие задачи:

1. Исследовать действие РНКазы В. intermedius на рост R. meliloti и способность их продуцировать биологически активные соединения.

2. Изучить влияние фермента на азотфиксирующую активность ризобий в чистой культуре и в модельной сим биотической системе.

3. Исследовать влияние РНКазы на размножение R. meliloti в почвенных условиях.

4. Определить возможность использования РНКазы для повышения эффективности бобово-ризобиального симбиоза и увеличения урожая люцерны.

Научная новизна работы. Впервые обнаружена способность РНКазы В. intermedius оказывать стимулирующее действие на рост и размножение симбиотических азотфиксирующих микроорганизмов R. meliloti. Установлено, что РНКаза в низких дозах стимулирует размножение ризобий независимо от фазы роста популяции. Максимальный эффект РНКазы проявляется в концентрации 0,01мкг/мл/107 клеток при засеве среды культурой экспоненциальной фазы роста. Показано, что клубеньковые бактерии синтезируют биологически активные вещества только в фазу замедления роста и стационарную фазу. Добавление РНКазы

j фазу замедления роста культуры усиливает биологическую активность ризобий, гго выражается в повышении энергии прорастания семян, всхожести и накоплении лассы проростками люцерны. Установлено, что микробная РНК аза обладает ;пособностью стимулировать выход витаминов пиридоксина и тиамина, а также юществ фитогормоналыюй природы, в частности индолштуксусной кислоты. Токазана возможность усиления антагонистической активности клубеньковых 5актерий, обработанных РНКазой, в отношении фитопатогенных микромицетов.

Установлено, что в стерильной почве РНКаза стимулирует рост R. meliloti. В юстерильной почве под воздействием фермента увеличивается выживаемость отубеньковых бактерий, что приводит к сокращению периода адаптации и к более ¡ыстрой стабилизации численности популяции.

Впервые выявлено усиление нитрогеназной активности ризобий в присутствии микробной РНКазы в чистой культуре. В вегетационных опытах под действием фермента показано усиление симбиотических свойств R. meliloti, что проявляется в 'величении количества корневых клубеньков, в повышении азотфиксирующей наивности и в увеличении урожая надземной массы растений. Впервые для иубеньковых бактерий в условиях полевого опыта продемонстрирована юзможность целенаправленного повышения урожая люцерны путем федварительной обработки ризобий РНКазой.

Практическая значимость работы. Нами разработан способ изготовления шзоторфина в совхозе «Казанский Тепличный» Республики Татарстан на основе цтаммов клубеньковых бактерий, активируемых РНКазой Bacillus intermedius, юзволяющий увеличить титр клеток и сохранить его достаточно высоким в течение 15 дней. Полевые испытания на дернobo-i годзолистой почве совхоза «Новая жизнь» 'еспублики Татарстан показали, что инокуляция семян люцерны клубеньковыми ¡акгериями, обработанными рибонуклеазой, увеличивала урожай и содержание :ырого протеина в растениях. В диссертации имеются акты производственных [спытаний, подтверждающие положительный эффект действия РНКазы.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на 16-ом Леждународном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Индия, Дели, 994), на Международном симпозиуме «Органическое вещество торфа» Белоруссия, Минск, 1995), на Ш Международной конференции «Регуляторы роста [ развития растений» (Россия, Москва, 1995), на 7 Европейском конгрессе по ¡иотехнологии (Франция, Ницца, 1995), на конференции по биотехнологии для ельского хозяйства (Италия, Феррара, 1995), на 7 международном симпозиуме по

экологии микроорганизмов (Бразилия, Сантос, 1995), на итоговых научны конференциях Казанского государственного университета (1994, 1995,1997,1998). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 115 страница? состоит из обзора литературы, описания материалов и методов исследованш раздела собственных иследований, обсуждения результатов, выводов и списк литературы. Работа содержит 15 таблиц, 10 рисунков. Список литературы содержи 129 отечественных и 79 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Штаммы микроорганизмов и условия выращивания. В работе использование микроорганизмы, описанные в таблице 1.

Таблица

Штамм Характеристика Источник

Rhizobium raeliloti (Medicago) 441 Быстрорастущий штамм клубеньковых бактерий ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии, г. Пушкин

Rhizobium meliloti (Melilotus) 1117 Быстрорастущий штамм клубеньковых бактерий ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии, г. Пушкин

Rhizobium meliloti (Medicago) 1723 Быстрорастущий штамм клубеньковых бактерий ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии, г. Пушкин

Rhizobium trifolii (Trifolium) 1326 Быстрорастущий штамм клубеньковых бактерий ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии, г. Пушкин

Индикаторные тест - организмы

Fusarium oxysporum F-137 Фитопатогенный микромицет ВКМ, г. Москва

Alternaria alternata F-l 120 Фитопатогенный микромицет ВКМ, г. Москва

Saccharomyces cereviisiae 523 Определяемый витамин биотип ВКМ, г. Москва

Saccharomyces ludwigii 1167 Определяемый витамин пиридоксин, пантотеновая кислота ВКМ, г. Москва

Pichia dispora 1034 Определяемый витамин тиамин ВКМ, г. Москва

Клубеньковые бактерии выращивали на бобовой среде (Новикова, 1981).

Фазы роста клубеньковых бактерий и способность их продуцировать ростстимулирующие и антагонистические вещества определяли при выращивании культуры на минеральной среде (Шемаханова, Бунько, 1968).

Для изучения азотфиксирующей активности клубеньковых бактерий в чистой культуре использовали среду CS-7 (Бонарцева и др., 1989).

Клетки дрожжей выращивали на среде Ридера (Мейсель, 1950).

Микромицеты, выделенные с поверхности семян люцерны, культивировали на агаризованной среде Чапека (Семенов, 1990).

Для количественной характеристики ростовых процессов вычисляли среднюю общую скорость (Vcp.), удельную скорость роста (ц) (Коротяев, 1973).

Используемая в работе рибонуклеаза была изолирована из культуральной жидкости Bacillus intermedius 7Р, очищена до гомогенного состояния с молекулярной массой 12300 Да. Физико-химические и каталитические свойства описаны (Голубенко и др.,1979). Удельная активность РНКазы 1000000 ед/мг белка.

О величине ферментативной активности РНКазы судили по количеству кислоторастворимых продуктов гидролиза РНК (Лещинская и др., 1981).

Влияние РНКазы на размножение R. meliloti. Клетки в определенные фазы роста культуры отделяли, суспендировали в свежей питательной среде до конечной плотности 1*107, вносили РНКазу в разных концентрациях (0,0001-0,1мкг/мл) и культивировали в течение 5 часов при оптимальной температуре в вибротерме. Контролем во всех опытах служили клетки, выращенные в среде без фермента. О скорости размножения культуры судили по количеству клеток в 1 мл среды.

Изучение влияния продуктов жизнедеятельности ризобий на прорастание семян и формирование проростков различных растений проводили в лабораторных условиях. Для этого семена стерилизовали и замачивали в культуралыюй жидкости 'КЖ), взятой в различные фазы роста клубеньковых бактерий, в разведении 1:5 'Сабелышкова,1979). В опытах учитывали энергию прорастания (на 3-й сутки), всхожесть (на 7-е сутки), накопление массы проростками (Вавилов и др.,1986).

Для определения влияния РНКазы В. intermedius на способность R. meliloti тродуцировать вторичные метаболиты фермент в разных концентрациях (0,01-10мкг/мл) вносили в фазу замедления роста культуры. Через 12,18,24 часа после

внесения фермента проводили подсчет клеток, а КЖ проверяли на ростстимулирующую и антагонистическую активность.

Способность Я. теШой синтезировать индолил-З-уксусную кислоту (ИУК) определяли фотоколориметрическим методом с использованием реактива Сальковского в модификации Гордона и Вебера (Колешко, 1981).

Способность изучаемого штамма клубеньковых бактерий синтезировать витамины группы В определяли в культуральной жидкости с использованием витаминзависимых тест-культур (Возняковская, 1987).

Определение антагонистической активности ризобий проводили двумя методами. В первом случае использовали блочный метод для чего микромицсты выращивали на агаризованной среде Чапека (Сэги, 1983). Во втором случае антагонистическую активность оценивали по способности ризобий подавлять рост и развитие фитопатогенных микромицетов в жидкой питательной среде Чапека, что определяли по сухому весу.

Исследование нитрогеназной активности клубеньковых бактерий проводили с помощью ацетиленового метода. При наличии в среде активной нитрогеназы ацетилен восстанавливается до этилена. Количество этилена, образуемого б течение этого периода, определяли на газовом хроматографе «ХРОМ-4» (ЧСФР). В пробах после определения этилена устанавливали титр клубеньковых бактерий путем подсчета в камере Горяева (Бонарцева и др., 1989).

Изучение симбиотических свойств И. теШой в модельной системе. В качестве объекта использовали люцерну сорта Зайкевича. Растения выращивали на безазотной агаризованной среде Торнтона с добавлением микроэлементов и заражали: необработанными ферментом клубеньковыми бактериями (контроль), клубеньковыми бактериями, обработанными РНКазой в различных дозах (Калюжная и др., 1993).

Растения выращивали в климатической камере при 25° С, влажности 65%, длине светового дня 16 ч. в течение 1 мсс.

Определение жизнеспособности клубеньковых бактерий проводили на дерново-подзолистой хорошо окультуренной стерильной и нестерильной почве путем ежедневного учета количества колоний на бобовом агаре без стрептомицина (стерильная почва) и со стрептомицином для нестерильной почвы (Симаров, 1984).

Приготовление ризоторфина. При изготовлении ризоторфина нестерильный торф влажностью 35-40%, содержащий СаСОз (5%) расфасовывали в пакеты из полиэтиленовой пленки по 50 г. Торф инокулировали раствором углеводов

глюкоза, меласса) и суспензией клубеньковых бактерий, предварительно )бработанных рибонуклеазой в соотношении 1*109 клеток/1 мкг фермента/г торфа.

Инокулированные пакеты хранили в течение 35 дней при температуре 18-20° С. Саждые 7 дней вели подсчет числа клеток ризобий методом серийных разведений с ¡ысевом на бобовую среду (Хотянович, 1991).

Определение эффективности бобово-ризобиального симбиоза проводили в >егетационных (Симаров, 1984) и полевых опытах.

Статистическую обработку результатов проводили минимум в пяти ювторностях. Анализ полученных данных осуществляли с использованием ;омпьютеризованного теста Стьюдента, принимая критерий Р<0,05 достаточным щя достоверной разницы в результатах; а также методом дисперсионного анализа Доспехов, 1987).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние РНКазы В. ¡тиегтеёш.ч на рост клубеньковых бактерий Я. теШоИ и способность их продуцировать биологически активные соединения 1.1. Изменение роста популяции клубеньковых бактерий и синтеза биологически активных веществ в динамике роста культуры под действием экзогенной РНКазы

Влияние РНКазы на рост клубеньковых бактерий изучали в зависимости от онцентрации фермента и физиологического состояния посевной культуры, (обавляя в среду одновременно с инокулятом РНКазу в концентрациях 0,0001-,1мкг/мл, установили увеличение количества клеток в популяции независимо от >азы роста культуры, используемой в качестве инокулята. Оптимальная тимулирующая доза микробной рибонуклеазы составляла 0,01 мкг/мл среды/107 леток. Изменение концентрации фермента в сторону увеличения или уменьшения риводило к снижению или утрате эффекта. Причем наибольший стимулирующий ффект РНКазы наблюдался при засеве среды культурой экспоненциальной фазы оста, где величина стимуляции составляла 32%. Эффект стимуляции достигал ишь 8-10% при инокуляции среды клетками культуры в фазе замедления роста и тационарной фазе, что могло быть обусловлено изменением жизнедеятельности леток, сопряженным с замедлением их роста и усилешши синтезом продуктов горичного метаболизма.

Т.о., установлено, что РНКаза В. ниегтесИш при внесении в среду ультивирования ускоряет размножение клубеньковых бактерий. Стимулирующий

эффект РНКазы зависит от физиологического состояния инокулята и до: экзогенного фермента.

Исследование образования продуктов жизнедеятельности R. meliloti культуральной жидкости в динамике роста показало, что бактерии продуциру» биологически активные вещества, в основном, в фазу замедления роста стационарную фазу роста популяции. Существенно, что положительное влияы метаболитов клубеньковых бактерий проявляется в одинаковой степени n¡ обработке культуральной жидкостью семян люцерны, пшеницы и огурца, ч' свидетельствует о неспецифичности их действия.

Обработка РНКазой клубеньковых бактерий усиливает их метаболическу активность, что выражается в повышении энергии прорастания семян, их всхожес: и накоплении массы проростками люцерны (табл.2). Максимально эффект РНК а' проявляется при концентрации 1мкг/мл, т.к. в этом опыте использовалась клеточн; взвесь плотностью на 2 порядка выше (1*109 клеток/мл среды), чем в случ; изучения влияния РНКазы на рост культуры клубеньковых бактерий.

Таблица

Влияние метаболитов ШигоЪшт теЫоЬ, обработанных РНКазой, на энергию прорастани всхожесть семян и накопление массы проростками люцерны (пересчет на 100 проростко!

Вариант Энергия прорастания, % Всхожесть, % Сухое вещество, г

Контроль 1 (вода) 42,7 56,3 0,231+0,010

Контроль 2 (среда) 43,9 61,7 0,247+0,013

Контроль 3 (ЮК) 67,2 78,3 0,292+0,011

КЖ, взятая при выращивании ризобий в течение 12 часов с различными дозами РНКазы

мкг/мл:

0,01 70,1 79,6 0,294+0,014

0,1 87,9 93,1 0,331+0,017

1 92,3 97,3 0,342+0,015

10 73,4 82,6 0,306+0,011

Т.о. установлено, что клубеньковые бактерии при вступлении в фа замедления роста начинают усиленно синтезировать ростовые веществ Добавление РНКазы в концентрации 1,0 мкг/мл в расчете на 1*109 клеток в i среды (или 0,01 мкг/мл в расчете на 1*107 клеток в мл среды) способству увеличению содержания ростовых веществ в культуральной жидкости, ч

выражается в повышении энергии прорастания семян, всхожести и накоплении массы проростками люцерны.

1.2. Влияние РНКазы на синтез ростовых веществ и антагонистическую

активность R. meliloti Известно, что положительное влияние клубеньковых бактерий на растения может быть связано как со способностью их синтезировать вещества фитогормоналыюй природы и витамины группы В, так и вещества, обладающие антагонистическими свойствами в отношении фитопатогенных микроорганизмов (Chao, 1990; Шумный и др., 1991; Nikanova, Kubat, 1994). В связи с этим прежде всего исследовали влияние РНКазы на способность R. meliloti продуцировать известный ростовой фактор - индолилуксусную кислоту и ряд витаминов (пиридоксин, тиамин, биотин и пантотеновую кислоту). Для этого фермент в стимулирующей концентрации 1 мкг/мл/1 *109 клеток вносили в фазу замедления роста культуры. В качестве предшественника индольных соединений использовали a-триптофан в концентрации 1 мг на 100 мл среды. Было установлено, что максимальный синтез ИУК достигается при совместном действии на клубеньковые бактерии триптофана и РНКазы (табл.3).

Таблица 3

Накопление индольных соединений Rhizobium meliloti в динамике роста культуры

Время Содержание ИУК мкг/100 мл культуральной жидкости

культивиро Без Без триптофана С С триптофаном

-вания, ч триптофана +РНКаза триптофаном +РНКаза

(1 мкг/мл) (1 мкг/мл)

0 0 0 0 0

12 0 0 6,4 11,2

24 0 0 12,8 20,7

36 0 0 31,1 58,6

48 11,2 11,6 56,9 103,4

Исследование способности Л. теШой синтезировать такие витамины как пиридоксин, тиамин, биотин и пантотеновая кислота показало, что добавление РНКазы в среду культивирования способствует увеличению выхода тиамина и пиридоксина. Так, количество пиридоксина, продуцируемого клубеньковыми бактериями на 3 сутки, составляло 0,69 мкг, что было в 1,3 раза больше, чем в контрольном варианте, а тиамина 0,44 мкг, что в 1,2 больше, чем в среде без

фермента. Таким образом, R. meliloti, обработанные РНКазой, более активн продуцируют биологически активные вещества, в том числе ИУК, пиридоксин i тиамин, чем бактерии, растущие в среде без фермента.

При изучении антагонистической активности культуральной жидкосп клубеньковых бактерий было установлено угнетающее действие ее на рос широкого ряда фитопатогенных микромицетов, выделенных с семян люцерш (табл.4). При этом РНК аза В. intermedius, добавленная в фазу замедления рост культуры R. meliloti в концентрации 1 мкг/мл/1 *109 клеток, значительно усиливал антагонистическую активность бактерий, что выражалось в более сильно! подавлении роста микромицетов в сравнении с контролем. Так, наиболыпе антагонистическое действие ризобий, выращенных в среде с РНКазой, проявлялос по отношению к микромицетам родов Botrytis, Fusarium, Trichothecium, Alternaria Несколько меньшим ингибирующим действием R. meliloti обладает по отношению i грибам родов Aspergillus и Penicillum.

Таблица -

Влияние РНКазы В. intermedius на антагонистическую активность R. meliloti в отношении фитопатогенных микромицетов

Tecx-o6seKT Зона подавления роста грибов (диаметр в см)

Контроль Опыт

Alternaria alteniata 2,6 ±0,15 3,6 ±0,18

Alternaría tenius 2,4+0,14 3,2 ±0,17

Aspergillus flavus 2,0 ±0,09 2,6 ±0,12

Aspergillus niger 2,2 ±0,1 2,7 ±0,15

Aspergillus fumigatus 2,1 ±0,1 2,6 ±0,12

Botrytis cinerea 2,9 ±0,18 3,8 ±0,21

Fusarium oxysporum 2,8 ±0,17 4,0 ±0,18

Mucor fragilis 2,1 ±0,09 2,7 ±0,12

Penicillum cuclopium 1,3 ±0,04 1,6 ±0,05

Penicillum lanosum 1,6 ±0,06 2,0 ±0,07

Trichothecium roseum 2,7 ±0,16 3,4 ±0,17

Контроль - без РНКазы; опыт - с РНКазой.

Т.о., на основании проведенных исследований можно заключить, что усиленш ростстимулирующей активности ризобий под действием РНКазы обусловлен! стимуляцией синтеза веществ фитогормоналыюй природы, в том числе ИУК ] витаминов (пиридоксин, тиамин), а также веществ, обладающих антагонистически активностью в отношении фитопатогенных микромицетов.

2. Азотфиксирующая активность R. meliloti, растущих в среде с добавленной РНКазой 2.1. Влияние РНКазы на нитрогеназную активность клубеньковых бактерий в чистой культуре Нитрогеназная активность клубеньковых баюгерий определялась при культивировании их на среде CS-7, способствующей индукции нитрогеназы в чистой культуре. Следует отметить, что процесс фиксации азота начинался у трех-четырехсуточных культур и достигал максимального значения на 5-ые сутки (табл.5). Добавление РНКазы в дозах 0,001 и 0,01 мкг/мл/10 млн. клеток способствовало увеличению азотфиксирующей способности клубеньковых бактерий на 5-ые сутки в 1,9 и 1,4 раза, соответственно, по сравнению с контролем. Таким эбразом, РНКаза в определенных концентрациях усиливала нитрогеназную наивность R. meliloti. Эффект РНКазы является дозозависимым.

Таблица 5

Нитрогеназная активность в чистой культуре Rhizobium meliloti, обработанной РНКазой

Вариант Активность нитрогеназы, нМ СгН^флакон/ч

4 суток 5 суток 6 суток 7 суток

Контроль 1 0,5 ±0,03 0,4 ±0,02 0,4 ±0,03 0,5 ±0,04

Контроль 2 20,6+0,81 28,3 ±1,1 24,1+1,0 19,7 ±0,9

Опыт (с РНКазой)

0,0001 мкг/мл 22,2+0,7 27,1 +1,2 25,4+1,2 18,5+1,0

0,001 мкг/мл 39,1+1,1 53,9 ±1,6 42,2 +1,5 37,4+1,3

0,01 мкг/мл 30,4+0,9 41,7 ±1,4 33,6+1,2 27,2 ±1,2

0,1 мкг/мл 19,8+0,7 27,6 +1,0 21,3+0,9 17,6 ±0,8

Сонтроль 1 - среда без РНКазы и бактерий. Сонтроль 2 - среда с бактериями и без фермента. )пыт - среда с бактериями и РНКазой в разных дозах.

Усиление азотфиксирующей активности у клубеньковых бактерий не связано с 'величением количества клеток, т.к. в присутствии тех же доз РНКазы количество ¡акгерий в культуре оставалось на уровне контроля.

2.2. Влияние РНКазы на нитрогеназную активность R. meliloti в модельной симбиотической системе Следующим этапом работы было изучение влияния РНКазы на нитрогеназную ктивость R. meliloti в модельной симбиотической системе. Растения выращивали на ¡езазотной агаризованной среде Торнтона с добавлением; микроэлементов по

Федорову в колбах Эрленмейера на 250 мл, закрытых ватными пробками. Был< установлено, что в контрольном варианте наблюдается формирование симбиоз; люцерны с Я. теШоН. Обработка РНКазой (0,001 и 0,01 мкг/мл) клубеньковы; бактерий перед заражением проростков люцерны повышала количество клубенько] на корнях растений, что коррелировало с усилением азотфиксирующей активности 1 накоплением массы проростками люцерны.

Таким образом показано, что в чистой культуре под действием экзогенно! РНК азы в определенных концентрациях усиливается азсггфиксирующая активност Я. теШоН. В модельной сим биотической системе при обработке клеток РНКазой ] тех же дозах повышается количество клубеньков на корнях люцерны, чп коррелирует с усилением азотфиксирующей активности Я. теШой и накопление! массы проростков люцерны.

3. Изменение жизнеспособности клубеньковых бактерий, обработанных РНКазой, в условиях приближенных к естественным

3.1.Действие фермента на развитие популяции Я. теШой в почвенных условия;

На первом этапе работы исследовалось влияние РНКазы В. Ыегте&ш н развитие популяции ризобий в стерильной почве при использовании фермента концентрации 0,001-0,1 мкг/мл. Из данных, представленных в табл.6, видно, чт РНКаза в дозе 0,01 мкг/мл/107 клеток оказывает стимулирующее действие на рос культуры, о чем свидетельствует увеличение численности клубеньковых бактерии Наибольшее количество клеток выявляется на 8 сутки, когда величина стимуляци составляет около 60%. Однако при более длительном выращивании ризобий степен стимулирующего эффекта снижается, хотя численность клеток в культуре опытног варианта несколько выше, чем в контрольном.

Для изучения закономерностей развития клубеньковых бактерий нестерильной почве нами использовался стрептомицинустойчивый мутан Я. теШой, не отличающийся по своим биологическим свойствам от исходног штамма Я. теЫой (441).

В нестерильной почве в первые дни после внесения в нее бактери происходило значительное уменьшение числа клеток, которое можно объяснить ка результат адаптации микроорганизмов к почвенным условиям. Если процес адаптации в контроле длился до 3 сут, и численность популяции сократилась в раза, то в опытном варианте он сократился до 2 сут при снижении численност популяции в 2 раза. В дальнейшем наблюдается нарастание количества клеток, как

Таблица 6

Влияние различных концентраций РНКазы на динамику роста клубеньковых бактерий в стерильной почве

Время выращивания, сутки

4 8 12 16

Количество %к Количество %к Количество %к Количество %к

Варианты клеток в 1 г контро- клеток в 1 г контро- клеток в 1 г контро- клеток в 1 г контро-

почвы (х107) лю почвы (х107) лю почвы (х107) лю почвы (хЮ7) лю

Контроль 4,3+0,1 100 9,6+0,46 100 49,1+1,9 100 81,1+3,2 100

Опыт

0,1 мкг 4,7+0,18 109,3 11,6+0,5 120 52,2+2,0 106,3 83,3+3,5 102,7

0,01 мкг 5,0+0,2 116,2 15,0+0,5 156,2 63,4+2,4 129,1 93,1+4,7 114,7

0,001 мкг 4,4+0,15 102,3 11,2+0,4 116 51,9+1,9 104,4 84,5+3,9 104,1

Контроль - клетки, не обработанные ферментом;

опыт - клетки, обработанные РНКазой в разных концентрациях.

опыте, так и в контроле, хотя в опыте максимальная численность популяци достигается на 2 сут раньше, чем в контроле (рис. 1).

Полученные данные позволяют заключить, что в почвенных условиях по, воздействием РНКазы увеличивается выживаемость Л. теШоЬ, что приводит сокращению периода экологической адаптации и в конечном итоге к более быстро: стабилизации численности популяции.

сутки

Рис.1 Влияние РНКазы на жизнеспособность стрептомицинустойчивого штамма Я. теШой в нестерильной почве Ось ординат - число клеток в 1 г почвы.

О- клетки, обработанные РНКазой; К- клетки, не обработанные РНКазой.

3.2. Влияние РНКазы на размножение ризобий в торфе Учитывая, что одним из наиболее важных приемов повышения продуктивност и качества бобовых растений является применение высокоэффективных препарате клубеньковых бактерий, в частности ризоторфина, исследовали влияние РНКазы н размножение ризобий в торфе. Результаты показали, что добавление рибонуклеазы стимулирующей дозе приводит к увеличению титра исследуемых штаммо клубеньковых бактерий (рис.2). На 14 сутки исследований концентрация ризоби: достигла (6,86-8)* 109 клеток/г торфа, а стимулирующий эффект составил 45-51%.

Полученные данные свидетельствуют о возможности использовани бациллярной РНКазы в качестве стимулятора роста клубеньковых бактерий в торф с целью интенсификации процесса получения ризоторфина и улучшения ег качества.

А

Рис 10 Влияние РНКазы Bacillus intermedius на жизнеспособность различных штаммов клубеньковых бактерий в нестерильном торфе A- R. meliloti 1117 (донник); В- R. meliloti 1723 (люцерна); C-R. trifolii 1326 (клевер).

О-клетки, обработанные ферментом; К- клетки, необработанные ферментом. Ось X -сутки; Ось Y- количество жизнеспособных клеток * 10'.

4. Практическое применение РНКазы в ловышении эффективности создания бобово-ризобиального симбиоза с целью увеличения урожая люцерны 4.1. Влияние РНКазы на симбиотические свойства Л. теШой в вегетационных опытах В вегетационных опытах было показано, что обработка клубеньковых бактери микродозами РНКазы В. цИеппеШиз оказывает положительное действие н эффективность бобово-ризобиального симбиоза, что выражается в увеличени; количества клубеньков на корнях люцерны, усилении азотфиксирующе; активности, повышении урожая надземной массы растений и содержания в ни сырого белка. При этом эффект РНКазы был дозозависимым и достига максимального значения при концентрации РНКазы 0,01 мкг/107 клеток (табл.7).

Таблица

Влияние клубеньковых бактерий, обработанных РНКазой на эффективность бобово ризобиального симбиоза (вегетационные опыты)

РНКаза, Кол-во Масса сухой Содержание Активность

мкг клубеньков на 1 надземной части сырого белка, нитрогеназы мкг

раст. раст., г/сосуд г/сосуд М/раст./ч

0 21,2 1,07 0,19 29,4

0,001 26,5 1,22 0,23 31

0,01 34,6 1,53 0,29 42,1

0,1 28,3 1,37 0,25 35,3

1 25 1,26 0,20 33,9

НСР 0,95 4,95 0,245 0,035 5,05

4.2. Влияние клубеньковых бактерий, обработанных РНКазой, на урожай люцерны в полевых испытаниях В полевых опытах, проведенных в 1995-1996 гг., семена люцернь инокулировали клубеньковыми бактериями, обработанными РНКазой, с цельк определения эффективности использования этого приема для повышения урожа) люцерны. В результате исследований в среднем за 2 года было дополнительш получено 5,1 ц/га сухой массы люцерны, что составляет 15% от контроля. Сбо] сырого белка также увеличился на 0,72 ц/га, что соответствует 12% в сравнении < контрольным вариантом (табл.8).

Таблица 8

Влияние R. meliloti, обработанных РНКазой на урожай люцерны (полевые опыты)

Вариант Урожай сухой массы Содержание сырого белка в урожае

ц/та % от контроля ц/га % от контроля

Контроль 33,2 100 5,76 100

Опыт (с РНКазой) 38,3 115 6,48 112

НСР095 1,6 0,29

Контроль - клетки, не обработанные ферментом.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования [репаратов рибонуклеаз в качестве регуляторов жизнедеятельности клубеньковых ¡актерий, с целью повышения урожайности люцерны.

Склоняясь к возможному непрямому действию экзогенной РНКазы на лубеньковые бактерии, считаем вероятным, что наблюдаемые эффекты являются торичными и опосредуются действием фермента на мембрану.

На основании данных литературы можно видеть, что одним из условий [еобходимых для проявления эффекта РНКазы является адсорбция фермента на неточной поверхности и взаимодействие с цитоплазматической мембраной (Егоров [ др., 1996). При этом происходит снижение плотности заряда клеток и меняется юнная проницаемость клеточной поверхности микроорганизмов (Гузев, Звягинцев, 977; Улахович и др., 1997). Учитывая, что РНКаза представляет собой идрофобный, положительно заряженный белок (Балабан и др., 1988), можно [редположить, что адсорбция белка на клетке зависит как от электрокинетических войств, так и от гидрофильно-гидрофобной природы поверхности клетки.

Известно, что защитные свойства внешней мембраны грамотрицательных ¡актерий определяются, главным образом, отрицательно заряженными [ипосахаридами (Иванов, Фомченко, 1989). Это позволяет высказать [редположение, что обработка клеток РНКазой приводит к частичной потере прицательного заряда, в результате чего снижаются барьерные свойства внешней гембраны. По-видимому, под действием экзогенной РНКазы происходит изменение сей мембранной системы клетки, в первую очередь проницаемости ее для ионов и (ругих соединений, приводящее к усилению общего или специфического 1етаболизма (Конев, 1977, 1991; Маленков, 1976), что способствует стимуляции юста бактерий или облегчает выход метаболитов в окружающую среду.

выводы

1. РНКаза В. ЫегтеёшБ при внесении в среду культивирования ускорж размножение И. теН1о^. Стимулирующий эффект РНКазы зависит с физиологического состояния инокуляга и концентрации вносимого фермента.

2. Клубеньковые бактерии люцерны синтезируют ростовые вещества только фазу замедления роста и в стационарную фазу развития популяции. Добавлен! РНКазы В. киеппе&из в фазу замедления роста культуры усиливас ростстимулирующую активность ризобий, что выражается в повышении энерги прорастания семян, обработанных культурапьной жидкостью, их всхожести накоплении массы проростками люцерны.

3. Усиление ростстимулирующей активности ризобий под действием РНКаз обусловлено стимуляцией синтеза веществ фитогормональной природы, в частност ИУК и витаминов (пиридоксин, тиамин), а также веществ - антагонистс фитопатогенных микромицетов.

4. Экзогенная РНКаза в дозах 0,001-0,01 мкг/мл (1-10 ед. акт.) усиливас нитрогеназную активность ризобий в чистой культуре в 1,4 -1,9 раза по сравнени с контролем. В условиях модельной симбиотической системы под действие фермента в тех же дозах повышается количество клубеньков на корнях люцерш что коррелирует с усилением азотфиксирующей активности К. теШой накоплением массы проростков люцерны.

5. В условиях приближенных к естественным было установлено, что РНКаза микродозах стимулирует размножение клубеньковых бактерий в стерильной почв! В нестерильной почве под воздействием фермента возрастает выживаемое! ризобий, что приводит к сокращению периода адаптации и к более быстро стабилизации численности популяции.

6. Предварительная обработка РНКазой клубеньковых бактерий стимулировал размножение ризобий в торфе, что приводило к интенсификации процесс получения ризоторфина более высокого качества.

7. В вегетационных опытах усиление симбиотических свойств ризобий по действием РНКазы выражается в повышении азотфиксирующей активност растений, что связано с увеличением количества корневых клубеньков.

8. Обработка РНКазой клубеньковых бактерий в полевых испытаниях привода к повышению урожая люцерны и содержания сырого белка в нем, что позволяс

мендовать экзогенный фермент в качестве регулятора жизнедеятельности бий.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Егоров С.Ю., Захарова Н.Г., Наумова Э.С., Куприянова-Ашина Ф.Г. Влияние .азы на жизнеспособность и симбиотические свойства Rhizobium meliloti в ¡енных условиях //Микробиология.-1994.-Т.63, N.3. -С.484-488.

2.Egorov S.Yu., Naumova E.S., Kupriyanova F.G. The influence of RNase on survival and symbiotic properties of Rhizobium meliloti in soil // 16th International Congress of hemistry and Molecular Biology. India. New Delhi, 1994,- V.1.-P.37.

3.Егоров С.Ю., Захарова Н.Г., Алимова Ф.К., Наумова Э.С. Азотфиксирующие ерии защищенного грунта //Вестник Российской академии сельскохозяйственных с,- 1994, N6. -С.18-21.

4.Егоров С.Ю., Наумова Э.С., Захарова Н.Г., Алимова Ф.К., Куприянова-Ашина . Влияние РНКазы Bacillus intermedins на способность Rhizobium meliloti iy пировать вторичные метаболиты //Микробиология. -1995. -Т.64, N5. -С.637-641.

5.Егоров С.Ю., Наумова Э.С., Куприянова-Ашина Ф.Г. Использование микробной энуклеазы в процессе получения ризоторфина, применяемого в сельском хозяйстве ежд. симпозиум «Органическое вещество торфа». - Минск, 15-19 мая, 1995. -С.40.

6.Наумова Э.С., Егоров С.Ю., Захарова Н.Г., Алимова Ф.К., Лещинская И.Б. >аботка методов применения биологического препарата - РНКазы Bacillus medius в качестве регулятора жизнедеятельности клубеньковых бактерий // Ш-я кд. конференция «Регуляторы роста и развития растений». -Москва, 27-29 июня, 5.-С.215.

7.Егоров С.Ю., Наумова Э.С., Алимова Ф.К., Захарова Н.Г., Лещинская И.Б. гериальная рибонуклеаза - стимулятор роста овощных и декоративных культур // гник Российской Академии сельскохозяйственных наук. - 1995, N2. -С.42-44.

8.Егоров С.Ю., Наумова Э.С., Алимова Ф.К., Захарова Н.Г. Влияние РНКазы illus intermedins на способность Rhizobium meliloti продуцировать биологически иные соединения //Агрохимия. -1995,N3. -С.60-64.

9.Egorov S.Yu., Naumova E.S. A new regulator of bacterial growth // 7th European gress on Biotechnology. France.Nice, 1995.- V.3. -P.34.

10.Egorov S.Y., Naumova E.S., Kozlova O.V., Alimova F.K., Zakharova N.G. A new jvth regulator for nitrogen fixation microorganisms // Advanced Biotechnologies for ¡culture. Italy. Ferrara,1995.V6. -P.47.

11.Egorov S.Yu., Alimova F.K., Zakharova N.G., Naumova E.S. Nitrogen fi: bacteria of protected ground // 7th International symposium on microbial ecology. I Santos, 1995. -V.2.-P.112.

12.НаумоваЭ.С., Козлова O.B., Егоров С.Ю. Влияние РНКазы Bacillus interm на азотфиксирующую активность Rhizobium meliloti // Агрохимия. -1996,N4. -C.2S

13.Егоров С.Ю., Наумова Э.С., Козлова О.В., Алимова Ф.К., Захарова Влияние клубеньковых бактерий, подвергнутых воздействию рибонуклеа: эффективность бобово-ризобиального симбиоза и урожай люцерны // Агрохиы 1997,N2. -С.37-40.

14.НаумоваЭ.С., Козлова О.В., Егоров С.Ю. Влияние РНКазы Bacillus interm на жизнедеятельность Rhizobium meliloti. Проблемы общей биологии и прикла экологии: Сб. тр. молодых ученых. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1997,N1. -С.51-