Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Противоопухолевые эффекты модифицированных фрагментов GD2-специфичных антител

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Противоопухолевые эффекты модифицированных фрагментов GD2-специфичных антител"

На правах рукописи

Доронин Игорь Игоревич

Противоопухолевые эффекты модифицированных фрагментов СШ-специфичпых антител

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

00556973»

3 !'ЮЧ ?015

Москва — 2015

005569739

Работа выполнена в группе липидных модуляторов иммунитета отдела иммунологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ РАН).

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук, Холоденко Роман Васильевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор, Сащенко Лидия Павловна Заведующий лабораторией молекулярной иммуногенетики рака Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН).

Кандидат биологических наук, Лупатов Алексей Юрьевич

Ведущий научный сотрудник лаборатории клеточной биологии отдела персонализированной медицины Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» (ИБМХ).

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардга Российской академии наук (ИМБ РАН).

Защита состоится « 24 » июня 2015 года в 10:00 на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук по адресу: 117997, ГСП-7, г. Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ РАН) и на сайте ИБХ РАН: www.ibch.ru

Автореферат разослан «<? мая 2015 года

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор физико-математических наук

В.А. Олейников

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

В России ежегодно диагностируется около 500 тыс. новых случаев онкологических заболеваний, а число умерших от злокачественных новообразований составляет более 280 тыс. человек в год. Эти цифры во многом обусловлены как проблемами ранней диагностики, так и несовершенством существующих методов противоопухолевой терапии. В связи с этим, в настоящее время во всем мире остро стоят задачи по разработке новых адресных, высокоэффективных и низкотоксичных методов терапии онкологических заболеваний. Одним из таких наиболее перспективных направлений является иммунотерапия с использованием препаратов на основе моноклонапьных антител, направленных на таргетные опухолевые молекулы.

Мишенями для иммунотерапии рака могут служить не только белки, но и гликосфинголипиды, в частности ганглиозиды. Среди данных молекул наиболее ярко выделяется ганглиозид GD2, гиперэкспрессируемый опухолями различного происхождения, включая нейробластомы, ретинобластомы, меланомы, мелкоклеточный рак легких, остеосаркомы, рабдомиосаркомы, саркомы Юинга. По некоторым данным С02-позитивные опухоли составляют около 10% от общего числа онкологических заболеваний, и для многих из них характерна крайне ограниченная эффективность классических методов терапии.

Применение антител к GD2 дало существенный эффект, выраженный в супрессии опухолевых клеток в экспериментах как in vitro, так и in vivo. Несколько препаратов GD2-специфичных моноклональных антител (мАт) в настоящее время проходят клинические испытания, которые свидетельствуют в пользу перспективности иммунотерапии в лечении 002-позитивных опухолей. Однако выявлены побочные эффекты, вызванные иммуногенностью препаратов и гиперактивацией иммунной системы, что во многом опосредуется Fc-фрагментом моноклональных антител. Кроме того, большинство GD2-позитивных новообразований представляют собой солидные опухоли, для которых характерна невысокая противоопухолевая эффективность моноклональных антител, обусловленная большими размерами молекул.

В последнее время появились данные о прямой индукции гибели опухолевых клеток под действием 002-специфичных антител. При этом цитотоксическая активность моноклональных антител не опосредована классическими иммунными механизмами элиминирования опухолевых клеток, для проведения которых необходим Fc-фрагмент антител. В связи с этим открывается новый подход к исследованию 002-связывающих фрагментов антител в качестве индукторов гибели опухолевых клеток. В настоящее время в мировой литературе нет данных по изучению цитотоксических и противоопухолевых

эффектов фрагментов С02-специфичных антител. Таким образом, получение и модификация фрагментов 002-специфичных антител, изучение их способности к индукции гибели опухолевых клеток и исследование их противоопухолевых эффектов, является актуальной задачей и первым шагом к получению нового перспективного инструмента для адресной терапии ОЭ2-позитивных опухолей.

Цель работы — изучить цитотоксические и противоопухолевые эффекты фрагментов 002-специфичных антител.

Задачи исследования:

1) Доказать, что индукция клеточной гибели под действием С02-специфичпых антител является общим свойством 002-позитивных опухолевых линий.

2) Получить гибридомы, продуцирующие 002-специфичные антитела.

3) Выделить различные С02-связывающие фрагменты антител.

4) Изучить эффекты полученных С02-связывающих фрагментов антител на GD2-позитивные опухолевые клетки.

5) Сравнить цитотоксические эффекты и механизмы клеточной гибели, индуцированные фрагментами 002-специфичных антител и полноразмерными антителами.

6) Провести химические модификации фрагментов 002-специфичных антител.

7) Изучить противоопухолевые эффекты модифицированных фрагментов GD2-специфичных антител в мышиной модели рака.

Научная новизна

В настоящей работе проведен системный анализ цитотоксических эффектов GD2-специфичных антител, а также их производных на различных опухолевых клеточных линиях in vitro и в мышиной модели in vivo. Впервые показана прямая индукция клеточной гибели С02-позитивных опухолевых клеток под действием фрагментов моноклональных антител. Произведена оценка вклада различных механизмов клеточной гибели в процессы, запускаемые под действием производных 002-специфичных антител по сравнению с полноразмерными антителами. Была получена линия клеток гибридомы, секретирующих С02-специфичные антитела; для решения этой задачи был применен подход иммунизации лабораторных животных при помощи KLH-модифицированных ганглиозид-мимикрирующих пептидов. Сконструированы оригинальные рекомбинантные scFv-фрагменты, способные связывать опухолеассоциированный ганглиозид GD2. Впервые для фрагментов С02-специфичных антител показано, что увеличение времени циркуляции за счет монопегилирования Fab-фрагментов в мышиной модели ведет к существенному усилению противоопухолевых эффектов по сравнению с немодифицированными аналогами.

Научно-практическая значимость работы

Полученные данные открывают широкие практические перспективы использования фрагментов 002-специфичных антител в качестве нового, предположительно низкотоксичного инструмента противоопухолевой терапии. Кроме того, полученные 002-специфичные антитела могут стать основой для разработки высокочувствительных методов диагностики СГЙ-позитивных онкологических заболеваний, а также эффективных иммунотерапевтических препаратов химерных / гуманизированных 002-специфичных моноклонапьных антител.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Свойство С02-специфических антител и их фрагментов индуцировать клеточную гибель, является общей особенностью С02-позитивных опухолевых клеток.

2. С использованием оригинального подхода по применению КIЛ (-модифицированных СП)2-мнмикрирующих пептидов получена линия клеток гибридомы, секретирующих С02-специфичные моноклональные антитела, не проявляющие кросс-реактивности с другими ганглиозидами.

3. Созданные всРу-фрагменты антител ЗР8, обладающие способностью связывать ганглиозид С02, являются оптимальной модульной молекулой для изучения функциональных свойств данного опухолевого маркера.

4. Сайт-направленное пегилирование РаЬ-фрагментов С02-специфичных моноклонапьных антител не влияет на связывающую способность, а также цитотоксические свойства фрагментов антител, а противоопухолевая активность модифицированных фрагментов возрастает за счет увеличения времени их циркуляции в организме.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 159 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, заключения, списка сокращений, а также списка литературы, включающего 199 источников. Диссертация содержит 53 рисунка и 7 таблиц.

Степень достоверности и апробация работы

Достоверность полученных результатов обеспечена использованием в работе комплекса методических подходов: современных высокочувствительных молекулярно-биологических, биохимических и иммунологических методов исследования, тщательным

учетом и подробной оценкой результатов с использованием адекватных методов статистической обработки данных.

Основные результаты диссертации были доложены на конференции «15th International Congress of Immunology - ICI 2013», 2013, Милан, Италия; XXIII, XXIV, XXV, XXVI Зимних молодёжных научных школах «ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ», 2011-2014, Москва, Россия; научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова", 2011, Москва, Россия; научной конференции «Programmed Cell Death in Biology and Medicine», 2012, Moscow, Russia; XVIII, XX Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011, 2013»: Секция «Биология», Москва, Россия.

Публикации

По материалам работы опубликовано 6 статей в рецензируемых научных журналах, а также 13 публикаций в материалах научных конференций.

Основное содержание работы 1.1 Выбор клеточной модели для исследования действия С02-специфичных

антител и их фрагментов

Для выбора оптимальной клеточной модели была проанализирована экспрессия ганглиозида 002 на клетках более чем 20 опухолевых клеточных линий различного происхождения. Основываясь на полученных данных, было выбрано три клеточные линии, отличающиеся самым высоким уровнем экспрессии ганглиозида 002: клетки мышиной лимфомы ЕЬ-4, клетки нейробластомы человека 1МЯ-32 и клетки меланомы человека тБ; а также три линии, которые характеризуются либо полным отсутствием, либо крайне низким уровнем экспрессии ОЭ2: клетки лимфомы человека ,1игка1, мышиной нейробластомы №иго-2А, а также меланомы человека А375. Поверхностное окрашивание данных клеток А1ехаР1иог488-мечеными 002-специфичными моноклональными антителами 1402а и последующий их анализ методом проточной цитофлуориметрии показал, что линии опухолевых клеток ЕЬ-4, 1МЯ-32 и ш8 являются 002-позитивными и характеризуются высоким и равномерным уровнем экспрессии поверхностного ганглиозида 002 (Рис. 1 А), в то же время клетки линий ,1игка1, №иго-2А и А375 не экспрессируют на своей поверхности 0Э2 или экспрессируют его в минимальном количестве (Рис. 1 Б), и их можно считать 002-негативными линиями.

Клетки мышиной лимфомы ЕЬД

нейробластомы * человека 1М11-32 о

Клетки меланомы человека т5

V ю' 10: ю' 10'

Йт 3.28

вт 5.38

Бт 3.42

Рисунок 1. Цитометрические Клетки лимфомы измерения клеток,

4 """""Г" окрашенных мАт 1402а-А1ехаР1иог488 (5 мкг/мл). Пики, обозначенные цветом, отражают флуоресценцию клеток, окрашенных 002-мАт, контур - пик клеток,

окрашенных анти-

изотипическими антителами. Представлены результаты репрезентативного эксперимента.

Клетки меланомы человека А375

Клетки мышиной нейробластомы КОНТРОЛЬНЫХ Неиго-2А

Интенсивность флуоресценции

Клетки мышиной лимфомы EL-4

Клетки нейробластомы человека IMR-32

Клетки меланомы человека mS

Рисунок 2. Экспрессия ганглиозида GD2

КЛе^Геловека°МЫ КЛеТКЭМИ ЛИНИЙ EL-4, Jurkat IMR-32, mS, Jurkat. Neuro-

2a, и A3 75.

конфокальной

микроскопии.

Данные

Клетки ь

человека А375

Клетки мышиной Окрашивание клеток

нейробластомы

Neuro-2A мАт 14G2a-AlexaFluor488.

Зеленым обозначена флуоресценция AlexaFluor488-Me4eHbix мАт 14G2a. Ядра докрашены Hoechst 33342 (синий цвет). Отрезок шкалы - 50 мкм.

Результаты проточной цитофлуориметрии были подтверждены иммуноцитохимическим окрашиванием клеток анти-002-мАт с их последующей визуализацией с помощью конфокальной микроскопии (Рис. 2). Таким образом, двумя методами была проанализирована экспрессия ганглиозида GD2 на поверхности клеток нескольких клеточных линий. GD2-no3imiBHbie клеточные линии EL-4, mS и IMR-32 характеризуются высокой экспрессией ганглиозида GD2. при этом самый высокий уровень экспрессии наблюдается на клетках мышиной лимфомы EL-4. Результаты представленных экспериментов позволили выбрать адекватную клеточную модель для изучения эффектов GD2-cnem«|)ii4Hbix антител и их фрагментов в последующих экспериментах.

1.2 Цитотоксические эффекты GD2-cnem^ii4Hbix антител на опухолевые

клеточные линии

Перед оценкой цитотоксических эффектов aHTii-GD2-MAT на выбранные клеточные линии был проведен анализ их чистоты. Выделение анти-002-мАт МЕ361 из асцитной жидкости мышей, получивших инъекцию клеток гибридомы НВ9326, происходило в две стадии - сначала аффинная хроматография на Protein А-колонке, затем при помощи ионообменной HPLC на катионной колонке TSKgel SP-5PW. По результатам ПААГ-электрофореза (Рис. 3 А) чистота полученного белка после HPLC составляла более 95%.

Для того чтобы проанализировать влияние С02-специфичных антител на опухолевые клетки, был проведен ряд классических функциональных тестов. Было обнаружено, что

после 24-часовой инкубации опухолевых клеток с анти-002-мАт, 002-позитивные клетки линий ЕЬ-4, 1М11-32 и т8 претерпевали значительные морфологические изменения, включая сильное гранулирование и округление клеток с уменьшением их размера, наблюдалось открепление адгезионных клеток от подложки, а также формирование клеточных агрегатов. ДиЕкда Б Контроль мАт14С2а мАт МЕ361

Н-цепь Клетки

45 «Да 35 кДа

1дБ

мышином

25кДа «г *В менро-

I д О бластомы

18.4 к Да 14.4 к Да

человека 1МН.32

Клетки меланомы человека тЗ

Щ1Я __ : ПТШаШШ Р ^ • А ^ :

' ■ - / . ' : -- <

и, | ннинин - # ■ Р и имиииц ^ . .. ^ у 1= ">, ' .

Рисунок 3. А) Электрофорез в ПААГ (12,5%) мАт МЕ361. 1) мАт МЕ361 после очистки на Рг А-колонке. 2) мАт МЕ361 после очистки на Рг А-колонке + НРЬС. Б) Морфологические изменения 002-позитивных клеточных линий ЕЬ-4, 1МЯ-32 и т8 через 24 ч. инкубации с 002-специфичными антителами (500 тыс. клеток /образец, 1402а и МЕ361, 5 мкг/мл); Контроль - клетки в полной среде без антител. Отрезок шкалы - 50 мкм.

Указанные морфологические изменения были наиболее ярко выражены для клеточных линий ЕЬ-4 и шБ (Рис. 3 Б). При этом использованные анти-002-мАт 14С2а и МЕ361 не влияли на морфологию 002-негативных клеточных линий Дигка1, №иго-2А и А375.

Также был исследован уровень фрагментации ДНК в опухолевых клетках после инкубации с анти-002-мАт. Для этого клетки окрашивали ДНК-связывающим агентом -пропидум иодидом (Р1). На гистограммах распределения интенсивности флуоресценции Р1 можно выделить пик с высокой интенсивностью флуоресценции, соответствующий живым клеткам, и пик с низкой интенсивностью флуоресценции, соответствующий клеткам с фрагментированной ДНК. Процент клеток под гиподиплоидным пиком для трех протестированных 002-позитивных опухолевых клеточных линий ЕЬ-4, т5 и 1МЯ-32 увеличивался после инкубации с анти-002-мАт по сравнению с интактными клетками.

После 24-х часов инкубации с двумя различными типами анти-002-мАт 14С2а и МЕ361 в концентрации 5 мкг/мл процент клеток ЕЬ-4 с фрагментированной ДНК увеличивался в 5.0±0.7 и 3.1±0.9 раз по сравнению с базовым уровнем соответственно (Рис. 4). По сравнению с клетками линии ЕЬ-4, увеличение процента клеток с фрагментированной ДНК для клеток 1МЯ-32 и ш8 было несколько ниже, но также статистически значимо.

Количество клеток 1МЯ-32 с фрагментированной ДНК после инкубации с антителами увеличивалось в 2.5±0.5 и 1.7±0.7 раз для 14С2а и МЕ361 соответственно.

Рисунок 4. Р1-тест. Анализ уровня фрагментации ДНК клеток 002-позитивных клеточных линии после инкубации (24 ч) с 002-специфичными антителами (500 тыс. клеток /образец, 5 мкг/мл). Здесь и далее маркером обозначена доля клеток с фрагментированной ДНК.

Интенсивность флуоресценции (Р1)

Для клеток линии ш8, обработанных антителами 14С2а и МЕ361, эти значения составляли 3.2±0.4 и 2.3±0.5 соответственно (Рис. 4). Важно отметить, что антитела 14С2а и МЕ361 не увеличивали число клеток с фрагментированной ДНК после их инкубации с клетками линий ,1игка1, Кеиго-2А и А375.

При помощи МТТ-теста была исследована жизнеспособность опухолевых клеток в присутствии различных концентраций 002-специфичных моноклонапьных антител. 002-специфичные антитела значительно снижали жизнеспособность 002-позитивных клеточных линий ЕЬ-4, тв и 1МЯ-32, практически не оказывая влияния на С02-негативные клеточные линии №иго-2А, А375 и Дигка! (Рис. 5). Следует отметить, что антитела 14в2а проявили более сильные цитотоксические эффекты на 002-позитивных клеточных линиях по сравнению с антителами МЕ361.

После 72-часовой инкубации клеток с наибольшей из использованных концентраций антител 1402а (10 мкг/мл), самый сильный эффект наблюдался на клетках лимфомы ЕЬ-4, которые характеризуются гиперэкспрессией ганглиозида 002. Жизнеспособность клеток ЕЬ-4 снизилась более чем на 80%, а жизнеспособность клеток т8 и 1МЯ-32 - на 60-70% (Рис. 5).

Контроль

мАт 14С2а

мАт МЕ361

Клетки мышиной лимфомы Е1.-4

Клетки нейро- о бластомы £ человека » 1МИ-32 5

Клетки меланомы человека тЭ

5 во 5

| «

«О

8 20

к

|юо

X

0 80

i 0

0 0.31 0.63 1.25 2.5 5 10

mAt 14G2a, мкг/мл

Рисунок 5. МТТ-тест. Сравнение влияния различных концентраций мАт l4G2a на жизнеспособность опухолевых клеток. Инкубация в течение 72 ч. Каждая точка — среднее значение жизнеспособности клеток, полученное в трех независимых экспериментах, в каждом из экспериментов было проведено три повтора каждой точки. (***, Р < 0.001, Student-Newman-Keuls post-hoc анализ).

Уровни жизнеспособности ОВ2-позитивных и ОВ2-негативных клеток статистически достоверно различались для концентраций антител МЕ361 выше 2.5 мкг/мл. Для клеточных линий ЕЬ-4 и шБ самая высокая из использованных концентраций антител МЕ361 (10 мкг/мл) снижала выживаемость клеток на 60% и 40% соответственно.

Таким образом, было доказано, что 002-специфичные антитела 1402а и МЕ361, использованные в работе, представляют чистые белковые фракции. Были выявлены сильные цитотоксические эффекты антител на клетки, несущие ганглиозид С02, причем гибель клеток под действием анти-ОР2-мАт напрямую коррелировала с уровнем экспрессии данного маркера. Эффекта от воздействия высоких концентраций различных 002-специфичных антител на ОВ2-негативные опухолевые клеточные линии не обнаруживалось.

2.1 Создание и экспрессия рекомбинантного эсРу-фрагмента С02-специфичного

На следующем этапе работы стояла задача создать рекомбинантные scFv-фрагменты на основе 002-специфичных моноклональных антител 3F8, а также проверить их способность связывать опухолеассоциированный ганглиозид GD2. Использование 002-связывающих фрагментов антител в формате scFv представляется наиболее перспективным для изучения цитотоксических эффектов фрагментов 002-специфичных антител.

Для конструирования scFv-фрагмента были выбраны 002-специфические антитела 3F8. Выбор именно этого антитела был обусловлен его высокой аффинностью к GD2 (KD = 5 пМ), отсутствием кросс-реактивности с другими ганглиозидами, а также наличием в научной литературе нуклеотидной и аминокислотной последовательностей. Конструкция представляет собой фрагменты антител 3F8 (VL и VH), содержащие лидерный пептид, а также два тэга - FLAG и His6, которые позволяют эффективно очищать рекомбинантные белки с использованием Ni-NTA-агарозы (Рис. 6).

антитела 3F8

ипрагес! оув

смэюю союн аАЗЕч

РисуНОК 6. Структура рв1В сори со«.2 сори сорн! «5^8

разработанного всБу- ? 1 И

фрагмента. ~ ~ _

< >

Для наработки всру-фрагментов был выбран штамм НМ8174(ВЕЗ)рЬу58, поскольку он характеризовался максимальной экспрессией целевого белка. Выделенные тотальные фракции белка индуцированных и не индуцированных клеток НМ8174(БЕЗ)рЬу58, а также фракция периплазматических белков индуцированных клеток НМ8174(ВЕЗ)рЕуз8 были проанализированы при помощи ПААГ-электрофореза. Из анализа представленной электрофореграммы видно, что в лизате индуцированных клеток присутствует дополнительная полоса белка с молекулярной массой порядка 28 кДа (Рис. 7 Б2), который, скорее всего, является искомым всРу-фрагментом моноклонального антитела ЗР8, поскольку ожидаемая масса сконструированного фрагмента после отрезания лидерного пептида составляет ~ 28 кДа. К сожалению, его периплазматическая экспрессия оказалась слишком низкой (Рис. 7 БЗ). Вероятно, большая часть целевого белка оказалась в тельцах включения, что может быть связано с не оптимальными подобранными условиями культивирования клеток. В связи с этим стояла задача выделения всру-фрагментов из телец включения и подбор условий рефолдинга всру-фрагментов.

Рисунок 7. А) Афинная очистка всРу-фрагментов антител с использованием №-МТА агарозы, 12,5% ПААГ-электрофорез. 1) Тотальная фракция белка индуцированных клеток, выделенная в денатурирующих условиях. 2) Элюция 100 тМ ЫаН2Р04. 3) Элюция 10 тМ Тпв-НСЬ 4) Элюция 8 М мочевиной (рН 5.9). 5). Элюция 8 М мочевиной (рН 4.5). Б) Электрофорез в ПААГ (12,5%) лизатов НМ8174(ОЕЗ)рЬу88 в восстанавливающих условиях. 1) Тотальная фракция белка не индуцированных клеток, выделенная в денатурирующих условиях. 2) Тотальная фракция белка индуцированных клеток, выделенная в денатурирующих условиях. 3) Периплазматическая фракция белка индуцированных клеток. В) Вестерн-блот. 1) клеточный лизат индуцированной культуры, 2) клеточный лизат не индуцированной культуры, 3) бычий сывороточный альбумин, 4) очищенные с использованием №-ЫТА всру-фрагменты. Инкубация 2 ч. Вторичные антитела апй-Шэ

1:1000 (24 ч), anti-rabbit HRP 1:500 (1 ч), anti-FLAG 1:2000 (24 ч), anti-mouse HRP 1:12000 (1 ч). Визуализация с использованием Metal Enhanced DAB Substrate Kit.

Так как экспрессируемый scFv-фрагмент содержал гистидиновую метку, то его последующая очистка из лизата осуществлялась при помощи Ni-NTA агарозы. Оценку чистоты полученных scFv-фрагментов проводили методом ПААГ-электрофореза (Рис. 7 А). Как видно из Рисунка 7 A3, именно белок из денатурированного лизата индуцированных клеток с массой около 28 кДа связывается с Ni-NTA, что подтверждает предположение о том, что он является сконструированным scFv-фрагментом. Суммарный выход scFv-фрагмента в данных условиях составляет ~ 10% от общего белка. Для дополнительной характеристики выделенного белка был проведен вестерн-блот анализ с использованием His-и FLAG-специфичных антител (Рис. 7В). Как можно видеть из рисунка, His- и FLAG-специфичные антитела эффективно связываются с белком в районе 28 кДа во фракциях индуцированных клеток, а также фракциях, очищенных на Ni-NTA. Связывания антител с фракцией не индуцированных клеток не наблюдалось (Рис. 7 В2).

Для восстановления пространственной структуры был проведен рефолдинг с использованием цистамин хлорида / дигидрохлорида. Выход реакции составлял не более 1%, тем не менее, полученного количества белка хватило для оценки его связывания с ганглиозидом GD2.

2.2 Изучение связывающей способности полученных scFv-фрагментов

Связывающую способность scFv-фрагментов моноклональных антител проверяли методами иммуноферментного анализа (Рис. 8 А) и проточной цитофлуориметрии на различных GD2-no3HTHBHbix клетках (Рис. 8 Б).

Полученные рекомбинантные 002-связывающие scFv-фрагменты, сконструированные на основе моноклональных антител 3F8, способны взаимодействовать с опухолеассоциированным ганглиозидом GD2.

Концентрация, икг/мл

Рисунок 8. А) Прямой ИФА. Окрашивание антителами апй-Шв или апй-Р11,АО, с последующим окрашиванием антивидовыми Н11Р-мечеными антителами. На подложке

сорбированный ганглиозид ОЭ2 (250 нг/лунка). Здесь и далее каждая точка в трёх повторах. Б) Результаты поверхностного окрашивания клеток ЕЬ-4. Представлено отношение интенсивности флуоресценции клеток, окрашенных 002-специфичными всРу-фрагментами антител ЗР8 к интенсивности флуоресценции контрольных клеток.

3.1 Создание гибридомы, продуцирующей специфичные моноклональные антитела к опухолеассоциированному ганглиозиду GD2

Главной задачей следующего этапа работы являлось получение стабильных гибридом, производящих моноклональные антитела к ганглиозиду GD2. Необходимость этого заключается в отсутствии доступных гибридом, продуцирующих строго специфичные антитела к GD2. Для реализации поставленной задачи был использован адаптированный метод классической гибридомной технологии. В качестве иммуногена были выбраны ганглиозид-мимикрирующие пептиды, полученные с использованием 002-специфичных антител l4G2a, наиболее схожие по своей пространственной структуре с углеводными детерминантами ганглиозида GD2, а также их гемоцианин (КХН)-модифицированные аналоги. Оценка продукции 002-специфичных антител после иммунизации GD2-мимикрирующими пептидами, а также их KLH-модифицированными аналогами производилась при помощи ИФА (Рис. 9 А).

Модификация ганглиозид-мимикрирующих пептидов при помощи KLH позволила в несколько раз усилить иммунный ответ с образованием 002-специфичных антител по сравнению с не модифицированными пептидами (Рис. 9А). После процедуры получения гибридом отбор клонов производился методом последовательных лимитирующих разведений. Исходя из сравнения аффинности полученных антител, продуцированных различными клонами, при помощи ИФА, была выбрана наиболее оптимальная по ряду характеристик гибридома, продуцирующая антитела, обозначенные 9P-L1.

HAiitwawf 14G2a-91L —14G2a ю н —т - Капкгъная сьворока

11« кД» «Л» в 1.8 1.6

JSKI» 15кД* _ 1,2 3 о 1.0 о а8

° ав

< ш 0,4 0.2 0,0

Й1563 Q3125 Ц626 1,25 15

Разведение сыворютки 1 2

Рисунок 9. А) Прямой ИФА, на подложке ганглиозид 002 (250 нг/лунка). Сыворотки получены после четырехкратной иммунизации пептидами 1402а-94Ь и 1402а-94Ь-КЬН в полном адъюванте Фрейнда. Контроль - сыворотка, полученная от интактной мыши. Вторичные антитела апй-тоизе-НИР 1:6000. Б) ПААГ-электрофорез (10%) антител 9Р-Ы в

восстанавливающих условиях: 1). Фракция антител 9P-L1 после очистки на Protein А колонке. 2). Фракция антител 9P-L1 после последующей очистки на HPLC. В) Прямой ИФА. Различные концентрации антител 9P-L1 и МЕ361 вторичные антитела anti-mouse-HRP (fab-specific) 1:6000. На подложке ганглиозид GD2 (250 нг/лунка).

Изотипирование полученных антител показало, что они относятся к IgM классу иммуноглобулинов. Антитела 9P-L1 проявили способность связываться с Protein А, однако для получения чистой фракции антител потребовалась дополнительная хроматографическая очистка, позволившая получить фракции антител 9P-L1 с чистотой порядка 80%, что было показано при помощи ПААГ-электрофореза (Рис. 9 Б). Полученные антитела 9P-L1 обладают хорошей С02-связывающей способностью при сравнении с моноклональными антителами МЕ361, что было показано в ходе прямого ИФА с ганглиозидом GD2 (Рис. 9 В).

Также полученные антитела способны эффективно связываться с мембранным ганглиозидом GD2 клеток EL-4 (Рис. 10А). После 24-х часов инкубации клеток мышиной лимфомы EL-4 с антителами 9P-L1 в концентрации 20 мкг/мл процент клеток с фрагментированной ДНК увеличивался в 1.9±0.4 по сравнению с базовым уровнем (Рис. 10А2), что подтверждает общую закономерность, заключающуюся в индукции гибели GD2-позитивных опухолевых клеток под действием различных ОБ2-специфичных антител.

Проанализирована кросс-реактивность 9P-L1 с другими ганглиозидами (Рис. 10 Б). Антитела МЕ361 проявляют кросс-реактивность к ганглиозиду GD3, который является очень близким к ганглиозиду GD2 по структуре, но при этом его экспрессия отмечается на клетках нормальных тканей и органов, что существенно ограничивает возможности использования полноразмерных антител этого типа. Для антител 14G2a и 9P-L1 параметры кросс-реактивности для всех исследованных ганглиозидов не превышали 5%.

V.

2)

Gm 40.76

К 71

РЖ " 6,7%L " 13% L

l'0! IS' 10! 101 Го* V 10" 10" 10! 10' °101 10 • 10- 10»

9P-L1

13%

- GM2.CD2

- GD1WGD2

- GD3/GD2

Интенсивность флуоресценции

9P-L1, мкг/мл

Рисунок 10. А. 1). Цитометрические измерения клеток EL-4, окрашенных GD2-специфичными антителами 9P-L1, вторые антитела anti-mouse Fab-specific-FITC (титр 1:2000). 2). PI-тест. Анализ уровня фрагментации ДНК клеток GD2-no3HTHBHoft клеточной линий EL-4 после инкубации (24 ч) с ОБ2-специфичными антителами 9P-L1 (500 тыс. клеток / образец, 20 мкг/мл). Б. Оценка кросс-реактивности С02-специфичных антител 9P-L1 с ганглиозидами GM2, GDlb и GD3 по результатам ИФА. Антивидовые HRP-меченые анти-

Fab-специфичные антитела (1:6000). На подложке 250 нг/лунка различных ганглиозидов. % кросс-реактивности рассчитывался по отношению OD раствора пероксидазной реакции после связывания антител с ганглиозидами GM2, GDlb или GD3 к OD раствора после связывания антител с ганглиозидом GD2.

Для подтверждения результатов об отсутствии кросс-реактивности антител 9P-L1 с другими ганглиозидами было проведено цитометрическое окрашивание клеток различными ОЦ2-специфичными антителами. Результаты поверхностного окрашивания этих линий представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Результаты поверхностного окрашивания различных линий опухолевых клеток

С02-специфичными антителами (5 мкг/мл).

Клеточная линия Фенотип Эффективность окрашивания антителами

14G2a МЕ361 9P-L1 R24

EL-4 GD24JD3" высокая высокая высокая -

mS GD2+GD3+ средняя средняя средняя средняя

SKOV-3 GD2"GD3+ - низкая - средняя

Jurkat GD2GD3" - - - -

Данные, представленные в Таблице 1 демонстрируют связывание полученных антител 9P-L1 с двумя С02-позитивными линиями EL-4 и mS, а также полностью подтверждают результаты об отсутствии кросс-реактивности антител 9P-L1 с ганглиозидом GD3, поскольку они не показали связывания с СОЗ-позитивными клетками линии SKOV-3. GD2-специфичные антитела 14G2a, взятые, как контроль строго специфичных к ганглиозиду GD2 антител, также не связались с клетками этой линии. В случае антител МЕ361, для которых характерна кросс-реактивность к ганглиозиду GD3, было зарегистрировано изменение интенсивности флуоресценции вОЗ-позитивной линии SKOV-3. Ahth-GD3-mAt R24 окрасили клетки линий mS и SKOV-3. Все использованные в эксперименте антитела не связывались с поверхностью GD2- и СОЗ-негативных клеток линии Jurkat.

3.2 Энзиматическое получение фрагментов С02-специфичных моноклональных

антител класса IgM

Фрагменты антител 9P-L1 были получены протеолизом при помощи гидролазы пепсина, иммобилизованного на агарозе. Данный фермент специфически разрушает молекулу IgM между Cpl-, Сц2- и СцЗ-доменами. При обработке IgM пепсином можно получить несколько типов фрагментов антител — F(ab)'2 фрагменты (до 150 кДа), Fab-фрагменты (до 50 кДа) и Fv-фрагменты (порядка 25 кДа). Для очистки полученных фрагментов была использована Protein А колонка, что было обусловлено свойством антител 9P-L1 связываться с этим носителем, в результате чего были получены 002-связывающие фрагменты этих антител.

Поверхностное окрашивание клеток мышиной лимфомы линии ЕЬ-4 с использованием полученных 002-специфичных фрагментов антител демонстрирует увеличение уровня средней интенсивности флуоресценции клеток по сравнению с контрольными клетками (Рис. 11 А). Полученные фрагменты способны достоверно индуцировать гибель опухолевых клеток, количество клеток с фрагментированной ДНК увеличилось практически в два раза по сравнению с контрольными клетками (Рис. 11 Б), при этом следует отметить, что по сравнению с полноразмерными антителами 9Р-1Л эффекты снизились незначительно.

Энзиматическое получение 002-связывающих фрагментов антител 9Р-Ы и изучение их цитотоксической активности позволило решить одну из основных задач работы -доказать сохранение способности к индукции гибели клеток фрагментами й02-специфичных антител. В то же время ферментативное получение фрагментов из антител ^М не является оптимальным способом наработки их достаточных количеств и требует разработки весьма трудоёмких методов очистки смеси данных фрагментов. По этой причине в дальнейшей работе были использованы фрагменты антител МЕ361 (^в), для которых методики получения и очистки индивидуальных фрагментов являются однозначными и относительно простыми.

Рисунок 11. А) Цитометрические измерения клеток мышиной лимфомы EL-4, окрашенных 002-специфичными фрагментами антител 9P-L1 (10 мкг/мл), вторые антитела anti-mouse Fab-specific-FITC (Титр 1:2000). Б) Цитотоксические эффекты фрагментов GD2-специфичных антител 9P-L1, регистрируемые PI-тестом. Анализ уровня фрагментации ДНК клеток 002-позитивной клеточной линии EL-4 после инкубации (24 ч) с GD2-связывающими фрагментами антител (500 тыс. клеток / образец, 10 мкг/мл).

4.1 Энзиматическое получение Fab-фрагментов С02-специфичных антител

МЕ361

Чистые Fab-фрагменты антител МЕ361 были получены методом протеолиза с использованием иммобилизованного на агарозе фермента папаина (Рис. 12 А). Поверхностное окрашивание клеток GD2-no3HTHBHbix линий EL-4 и mS показало связывание

полученных Fab-фрагментов антител МЕ361 с мембранным GD2 (Рис. 12 Б). Для клеток линии мышиной лимфомы EL-4 отношение уровней средней интенсивности флуоресценции МЕ361 к Fab МЕ361 составляло 2.13±0.1, а для клеток линии меланомы человека mS - 2±0.1. Вероятно, сниженная интенсивность флуоресценции клеток, окрашенных Fab-фрагментами антител МЕ361, объясняется моновалентным взаимодействием Fab-фрагментов с антигеном.

д fSщШ МВБ

75 кДя щЯш

50 кДя НЦ ; - I |

37 кДя Чй : | S !

25 кДя щ 1

Fab МЕ361

Lkk.

GM 2,28 * ОМ 83,61 ОН 40,37

1 ¿1

Клаткм » пимфомы EL*4

меланомы цаломка mS

1 Интенсивность флуор«сц*нцми

Рисунок 12. А) ПААГ-электрофорез (10%) 002-специфичных антител и их фрагментов в восстанавливающих условиях. 1 - Антитела МЕ361; 2 — РаЬ-фрагменты антител МЕ361. Б) Гистограммы окрашивания клеток 002-позитивных опухолевых линий ЕЬ-4 и тЭ антителами МЕ361 и БаЬ МЕ361 в концентрации 50 нМ.

Связывание полученных РаЬ-фрагментов с ганглиозидом 002 также было проанализировано с использованием дот-блота и ИФА. Минимальное количество ганглиозида, детектируемое в случае использования РаЬ-фрагментов составило 80 нг, тогда как при использовании полноразмерных антител МЕЗ 61 удалось детектировать 20 нг антигена, нанесенного на нитроцеллюлозную мембрану.

4.2 Сравнение цитотоксических эффектов РаЬ-фрагментов антител МЕ361 с полноразмерными антителами

Сравнительная оценка цитотоксических эффектов, индуцируемых полученными РаЬ-фрагментами анти-002-мАт МЕЗ 61 и полноразмерными антителами, проводилась методами проточной цитофлуориметрии и с использованием МТТ-теста.

РаЬ-фрагменты и полноразмерные антитела МЕ361 значительно снижают жизнеспособность клеток ОВ2-позитнвной линии ЕЬ-4. Так, для антител МЕ361 характерно более выраженное снижение выживаемости клеток при низких концентрациях с последующим выходом на плато, в то время как РаЬ-фрагменты антител индуцировали более плавное ингибирование жизнеспособности клеток. Для РаЬ-фрагментов выхода на плато не наблюдается и происходит равномерное дозозависимое снижение жизнеспособности клеток ЕЬ-4 (Рис. 13 А).

Влияние фрагментов и полноразмерных антител МЕ361 на клетки мышиной лимфомы ЕЬ-4 оценивали по нескольким параметрам:

Нарушение целостности плазматической мембраны с использованием флуоресцентного зонда 7-ААЕ) — через 4 ч инкубации клеток линии ЕЬ-4 с мАт МЕ361 количество 7-ААО-позитивных клеток существенно повышалось по сравнению с контрольными клетками. После индукции клеток РаЬ-фрагментами изменений не наблюдалось. После суточной инкубации клеток ЕЬ-4 с индукторами происходило значимое увеличение количества 7-ААО-позитивных клеток как в образцах с антителами МЕ361, так и с РаЬ-фрагментами этих антител, что говорит об увеличении проницаемости мембран клеток при действии антител и их РаЬ-фрагментов. Полноразмерные антитела индуцируют нарушение целостности плазматической мембраны на ранних временах инкубации с клетками, в то время как для фрагментов этот процесс оказывается отсроченным (Рис. 13 Б).

0.5 1 1.35 1Э IX 156 31 И5 125 250

СОг-специфичньж лкганд. гМ

■■ К ЕЖI 4 часа имкубоцм 1 1 24 часа «ниубаци*

г 1П ¡1 I

Рисунок 13. А) МТТ-тест клеток ЕЬ-4. Клетки (10 тыс/лунка, инкубация с МЕ361 и РаЬ МЕ361 3 дня). Б) Результаты 7ААО-окрашивания клеток ЕЬ-4 после инкубации с анти-С02 мАт МЕ361 и их РаЬ-фрагментами (50 нМ). В) Результаты цитометрического измерения АУЭ клеток ЕЬ-4, обработанных анти-С02 мАт МЕ361 и их РаЬ-фрагментами (50 нМ). Г) Результаты Р1-теста клеток ЕЬ-4, проинкубированных с анти-ОВ2 мАт МЕ361 и их РаЬ-фрагментами (50 нМ).

При апоптоз-индуцированном уменьшении объема (АУЭ) происходит уменьшение размера клеток с увеличением их гранулированное™. При воздействии анти-С02-мАт МЕ361 на клетки мышиной лимфомы ЕЬ-4 происходит увеличение количества клеток с АУО уже через 4 ч после инкубации. Этот показатель возрастал через 24 ч инкубации клеток с антителами. Кратковременная (4 ч) инкубация клеток с РаЬ-фрагментами не приводила к

достоверно значимому изменению уровня А\Т>. Существенное увеличение числа клеток с АУБ происходило только после 24 ч инкубации с фрагментами антител (Рис. 13 В).

Результаты Р1-теста показали, что инкубация клеток ЕЬ-4 в течение 4 ч как с антителами МЕ361, так и с их РаЬ-фрагментами не приводила к увеличению доли клеток с фрагментированной ДНК, в то время как после 24 ч инкубации количество клеток с фрагментированной ДНК увеличивалось в 3.4 и 3.1 раза для РаЬ-фрагментов и антител МЕ361 соответственно (Рис. 13 Г).

Результаты вышеописанных экспериментов показывают, что РаЬ-фрагменты антител МЕ361 сохраняют цитотоксические эффекты, характерные для полноразмерных антител. В то же время некоторые этапы клеточной гибели, индуцированные антителами и их фрагментами, различаются. Инкубация клеток с полноразмерными антителами приводит к более быстрой индукции нарушения целостности плазматической мембраны и уменьшения клеточного объема, чем инкубация с РаЬ-фрагментами.

Одним из методических подходов, позволяющих дифференцировать гибель клеток на ранний апоптоз и некроз, является Р1ТС-Аппехт-У тест.

4 ч инку бации

"некротические"

24 ч инхубаци»

3 живые клетки 1 "аполтотнчвские" ■ "некротич*

МЕ361 РаЬ МЕЗ61

МЕ361 РаЬ МЕ361

Рисунок 14. Р1ТС-Аннексин V тест. Распределение живых, апоптотических и некротических клеток в популяциях контрольных и индуцированных в течение 4-х и 24-х часов анти-002-мАт МЕ361 и их фрагментами клеток линии ЕЬ-4 (50 нМ).

Короткая инкубация клеток с антителами и их РаЬ-фрагментами приводила лишь к незначительному увеличению доли апоптотических клеток (позитивных по Р1ТС-Аппехт V и негативных по Р1), в то время как количество "некротических" клеток (позитивных по Р1ТС-Аппехш V и Р1) возрастало почти в 5 раз в случае инкубации клеток с антителами МЕ361. Возрастания количества позитивных по Р1ТС-Аппехт V и Р1 клеток после короткой инкубации с РаЬ-фрагментами не наблюдалось. После 24-х часовой инкубации картина изменялась - после воздействия антител и их РаЬ-фрагментов значительно возрастала доля апоптотических клеток относительно контрольных клеток - в 4 и в 5 раз, соответственно. Так же увеличивалась доля позитивных по Р1ТС-Аппехт V и Р1 клеток, которые находятся либо в некрозе, либо на поздних стадиях апоптоза.

Ингибитор каспаз снизил долю клеток с фрагментированной ДНК. индуцированную антителами МЕ361, лишь на 20%. В случае клеточной гибели, запущенной Fab-фрагментами МЕ361. ингибирующая активность Z-VAD-FMK была значительно выше и составляла почти 50%. Исходя из представленных результатов можно предположить, что клеточная гибель, индуцированная aHTH-GD2-MAT МЕ361 проходит по сложному пути, имеющему признаки как апоптоза, так и некроза, а клеточная гибель, активированная их Fab-фрагментам, в большей степени проходит по апоптотическому пути.

4.3 Пегнлирование РаЬ-фрагментов IV1E361

Известно, что Fab-фрэгменты моноклональных антител значительно менее стабильны в организме за счёт отсутствия Fc-фрагмента, и время их циркуляции существенно ниже, чем для полноразмерных моноклональных антител. Поэтому перед исследованием противоопухолевых эффектов фрагментов антител in vivo, представлялось необходимым провести их химическую модификацию с целью улучшения фармакокинетических характеристик. В качестве наиболее оптимальной модификации фрагментов антител было выбрано монопегилирование РаЬ-фрагментов.

На электрофорезе отчетливо видны полосы, соответствующие полноразмерным Fab-фрагментам (Рис. 15 Al), монопегилированным Fab-фрагментам 5 кДа (~55 кДа) и 10 кДа

Рисунок 15. А) ПААГ-электрофорез (12.5%) фрагментов антител МЕ361 в

невосстанавливающих условиях. Б) Р1-тест. Анализ уровня фрагментации ДНК 002-позитивной клеточной линии ЕЬ-4 после суточной инкубации (500 тыс. клеток /образец, 5 мкг/мл).

Для оценки сохранения специфичности и цитотоксической активности полученных пегилированных РаЬ-фрагментов были использованы методы проточной цитометрии и иммуноферментного анализа. РаЬ-фрагменты 002-специфичных моноклональных антител сохранили способность связывать ганглиозид 002 после конъюгирования с полиэтилен гликолем как в случае 5 кДа, так и 10 кДа. При этом не наблюдалось сильной потери аффинности по сравнению с неконъюгированными РаЬ-фрагментами. Помимо этого, как контрольные 002-специфические антитела МЕ361. так и полученные фрагменты антител, а

также пегилированные РаЬ-фрагменты 5 и 10 кДа, показали связывание с клетками мышиной лимфомы ЕЬ-4.

Как видно из Рисунка 15 Б. после суточной инкубации с РаЬ-фрагментами и их пегилированными аналогами, количество клеток с фрагментированной ДНК возросло в 1,5-2 раза по сравнению с контролем. Таким образом, монопегилированные РаЬ-фрагменты антител МЕ361 сохраняют способность не модифицированных РаЬ-фрагментов связывать опухолеассоциированный ганглиозид 002 и индуцировать гибель 002-позитивных опухолевых клеток.

5.1 Изучение противоопухолевых эффектов ГаЬ-фрагментов СВ2-спепифичных антител, а также их модифицированных аналогов /и vivo

Для сравнения динамики используемых противоопухолевых агентов, с целью оценить, привело ли пегилирование фрагментов антител к увеличению времени их циркуляции в

крови, был исследован титр Fab-фрагментов и их пегилированных аналогов в сыворотке мышей линии С57В1/6 на протяжении трех недель. Животным внутривенно вводили Fab-фрагменты или их пегилированные аналоги (200 мкг/мышь), затем на разных временных

BprxH

■ Fib-ME361 »PEGFab ME3S1 5 LDa P£G-FabME361 lOkDa

Рисунок 16. Сравнение времени интервалах проводился забор крови (100 мкл)

циркуляции фрагментов антител в ... .

„„_.,„.,. и методом ИФА определялось присутствие

организме мышеи С57В1/6.

002-связывающих фрагментов.

Пегилирование Fab-фрагментов 002-специфических моноклональных антител МЕ361 позволило значительно увеличить время их циркуляции in vivo (Рис. 16).

Для того чтобы оценить противоопухолевую активность 002-специфичных антител и их Fab-фрагментов была создана сингенная мышиная модель рака. Для этого мышам линии С57В1/6 в хвостовую вену вводили клетки Т-лимфомы EL-4. Известно, что при таком способе введения клеток лимфомы EL-4 метастазы в основном образуются в печени. Таблица 2. Дизайн эксперимента.

Номер группы Количество животных в группе Описание группы

1 5 Здоровые животные

2 5 Животные с опухолью без терапии

3 5 Однократная доза МЕ361 (200 мкг/мышь)

4 5 Однократная доза Fab GD2-mAt (200 мкг/мышь)

5 5 Однократная доза монопегилированных Fab-фрагментов

(200 мкг/мышь)

6 5 Двукратная доза Fab GD2-mAt (200 мкг/мышь)

После вскрытия мышей группы 2 (животные с опухолью без терапии) через 30 дней после прививания опухолевых клеток было обнаружено обширное метастазирование, проявляющееся в поражении большинства органов. Наиболее выраженные метастазы были обнаружены в печени и почках исследуемых животных, при этом у 3 из 5 животных метастазами была поражена только одна почка, тогда как у 2 оставшихся животных метастазы содержали обе почки в равной степени. Метастазы в почках также обнаруживались в группах 4, 5 и 6. Однако степень развития и метастазирования опухоли у этих животных существенно отличалась от животных из группы 2. Так у животных из групп 5 и 6, которым внутривенно вводили пегилированные Fab-фрагменты антител и немодифицированные Fab-фрагменты двукратно через 7 и 14 дней, соответственно, после прививания опухолевых клеток развитие неоплазии было выражено слабее. При этом в обеих группах незначительные метастазы наблюдались только в почках, но не в печени.

При сравнении групп 4, 5 и 6 следует отметить тот факт, что Fab-фрагменты и их аналоги оказывают существенный противоопухолевый эффект. Причем наименьший эффект показала однократная доза не модифицированных Fab-фрагментов, с выраженными метастазами и в печени, и в почках, что обусловлено коротким временем полужизни молекул. Тогда как двукратная доза немодифицированных Fab-фрэгментов и однократная доза пегилированных Fab-фрагментов проявили схожие высокие уровни противоопухолевой активности, что подтверждается отсутствием метастаз в печени и наличием незначительного метастазирования в почках. Таким образом, пегилирование Fab-фрагментов моноклональных антител МЕ361 действительно способно усиливать положительный противоопухолевый эффект в системе in vivo. Вероятно, это связано в первую очередь с увеличенным временем циркуляции в организме.

Выводы

1) Индукция клеточной гибели С02-специфичными антителами является общим и специфичным свойством, характерным для С02-позитивных опухолевых линий.

2) Получена линия клеток гибридомы, продуцирующая С02-специфичныс антитела, характеризующиеся отсутствием кросс-реактивности с другими ганглиозидами.

3) Получены различные С02-связывающие фрагменты на основе нескольких типов С02-специфичных антител. Созданы scFv-фрагменты антител 3F8, фрагменты антител 9Р-L1, и Fab-фрэгменты антител МЕ361.

4) 002-связывающие фрагменты антител 9P-L1 и Fab-фрэгменты антител МЕ361 индуцируют гибель С02-позитивных опухолевых клеток, сохраняя цитотоксические эффекты полноразмерных антител.

5) Механизмы клеточной гибели, индуцированной анти-С02-мАт и их фрагментами, различаются. Полноразмерные антитела запускают гибель клеток, имеющую признаки некроза и апоптоза, в то время как для 002-связывающих фрагментов преобладающей является гибель клеток путем апоптоза.

6) В результате сайт-направленного пегилирования Fab-фрагментов 3hth-GD2-mAt получены модифицированные производные, сохранившие способность связывать ганглиозид GD2 и индуцировать гибель 002-позитивных опухолевых клеток.

7) Фрагменты 002-специфичных антител обладают значимыми противоопухолевыми эффектами в мышиной сингенной модели рака. Сайт-направленное пегилирование фрагментов антител приводит к усилению противоопухолевых эффектов за счет увеличения времени циркуляции в организме.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1. Холоденко И.В., Доронин И.И., Холоденко Р.В. Клинические испытания антител к ганглиозиду GD2 для терапии онкологических заболеваний: перспективы и ограничения. Современные проблемы венерологии, штунологии и врачебной косметологии. 2010. №6 (13). С. 79-83.

2. Доронин И.И., Холоденко И.В., Молотковская И.М., Холоденко Р.В. Получение Fab-фрагментов С02-специфичных антител и анализ их противоопухолевой активности in vitro. Бюллетень экспериментальной биологии и медшщны. 2012. Т. 154, №11. С. 616-622.

3. Холоденко И.В., Доронин И.И., Вишнякова П.А., Болховитина E.J1., Холоденко Р.В. Противоопухолевая активность С02-специфичных антител и их Fab-фрагментов в мышиной модели рака. Иммунология. 2013. Т.34, № 4. С. 199-203.

4. Холоденко И.В., Доронин И.И., Холоденко Р.В. Опухолевые модели в изучении онкологических заболеваний. Иммунология. 2013. Т.34, №5. С. 282-286.

5. Igor I. Doronin, Polina A. Vishnyakova, Irina V. Kholodenko, Eugene D. Ponomarev, Dmitry Y. Ryazantsev, Irina M. Molotkovskaya, Roman V. Kholodenko. Ganglioside GD2 in reception and transduction of cell death signal in tumor cells. BMC Cancer. 2014. 14(1): 295.

6. Вишнякова П.А., Доронин И.И., Холоденко И.В., Рязанцев Д.Ю., Молотковская И.М., Холоденко Р.В. Участие каспаз в клеточной гибели, индуцированной 002-специфичными антителами. Биоорганаческая химия. 2014. Т. 40, № 3. С. 305-314.

Тезисы докладов на конференциях

1. Доронин И.И., Холоденко И.В., Успенский Ю.А., Романова Н.А., Сухорукова Р.Х., Молотковская И.М., Холоденко Р.В. Выделение, очистка, модификация и проверка апоптоз-индуцирующей активности моноклональных антител к опухолевому ганглиозиду GD2. Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова", тезисы докладов и стендовых сообщений. 2011.С. 93.

2. Доронин И.И. Изучение апоптоз-индуцирующей активности моноклональных антител к опухолевому ганглиозиду GD2. Ломоносов 2011: XVIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых: Секция «Биология», тезисы докладов. 2011.С. 48-49.

3. Doronin I.I., Vishnyakova Р.А., Kholodenko I.V, Molotkovskaya I.M., Kholodenko R.V. GD2-specific peptides - new approach for cancer diagnostics and therapy. Programmed cell death in biology and medicine, abstract book. 2012. p. 16-17.

4. Vishnyakova P.A., Kholodenko I.V, Doronin I.I., Molotkovskaya I.M., Kholodenko R.V. Influence of GD2 specific antibody on cell-cycle and ciclins expression in murine T-cell lymphoma cell line. Programmed cell death in biology and medicine, abstract book. 2012. p. 64-65.

5. Вишнякова П.А., Холоденко И.В., Романова H.A., Доронин И.И,, Сухорукова Р.Х., Молотковская И.М., Холоденко Р.В. Сравнение цитостатического действия GD2-специфических антител и доксорубицина на клетках мышиной лимфмы EL-4. XXIV Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», тезисы докладов и стендовых сообщений. 2012. С. 61.

6. Вишнякова П.А., Доронин И.И., Холоденко И.В., И.М. Молотковская, Холоденко Р.В. Изучение кросс-реактивности С02-специфических антител. XXV Международная зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", тезисы докладов и стендовых сообщений. 2012. Т. 2. С. 35.

7. Вишнякова П.А., Дороннн И.И., Холоденко Р.В. Изучение вклада ганглиозида GD2 в рецепцию цитотоксического сигнала в опухолевых клетках. Ломоносов 2013: XX Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых. Секция «Биология», тезисы докладов. 2013. С. 147.

8. Холоденко Р.В., Вишнякова П.А., Доронин И.И., Холоденко И.В., И.М. Молотковская. Роль ганглиозида GD2 в акцепции цитостатического сигнала в клетках лимфомы EL-4. XXV Международная зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", тезисы докладов и стендовых сообщений. 2013. Т. 1. С. 88.

9. Доронин И.И., Вишнякова П.А., Холоденко Р.В. Перспективы использования пептидов в диагностике и терапии С02-позитивных опухолей. XXV Международная зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", тезисы докладов и стендовых сообщений. 2013. Т. 2. С. 75.

10. Доронин И.И., Вишнякова П.А., Холоденко Р.В. Сайт-направленное пегилирование Fab-фрагментов С02-специфичных антител. Ломоносов 2013: XX Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых. Секция «Биология», тезисы докладов. 2013. С. 47-48.

11. Doronin I.I., Kholodenko R.V. Antitumor activity of PEGylated Fab-fragments of GD2-specific antibody. Frontiers in Immunology, ICI-2013. 2013. doi: 10.33 89/conf.fimmu.2013.02.00193.

12. Вишнякова П.А., Доронин И.И., Смирнова E.B., Свирщевская Е.В., Молотковская И.М., Холоденко Р.В. Влияние ингибирования гена GM2/GD2 синтазы на жизнеспособность опухолевых клеток. XXVI Зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", тезисы докладов и стендовых сообщений. 2014. С. 116.

13. И.И. Доронин, Вишнякова П.А., Рязанцев Д.Ю., Ефремов М. А., Холоденко И.В., Молотковская И.М., Холоденко Р.В.Противоопухолевая активность пегилированных Fab-фрагментов 002-спсцифических антител. XXVI Зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", тезисы докладов и стендовых сообщений. 2014. С. 11.

Заказ № 14-Р/05/2015 Подписано в печать 13.05.15 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,2

ООО "Цифровичок", Москва, Большой Чудов пер., д.5 тел. (495)649-83-30 (О^*)) www.cfr.ru ; e-mail: zakpark@cfr.ru