Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование морфогенетических особенностей опухолей, оппозитных по чувствительности к циклофосфану, на модели перевиваемых лимфосарком мышей

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование морфогенетических особенностей опухолей, оппозитных по чувствительности к циклофосфану, на модели перевиваемых лимфосарком мышей"

На правах рукописи

ООЗОВ7В8Б

Андреева Екатерина Михайловна

ИССЛЕДОВАНИЕ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ ОПУХОЛЕЙ, ОППОЗИТНЫХ ПО ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ЦИКЛОФОСФАНУ, НА МОДЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ ЛИМФОСАРКОМ МЫШЕЙ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2006

003067686

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск) и в ГОУ ВПО Новосибирском государственном университете Рособразования

Научные руководители: кандидат биологических наук, доцент

Попова Нелли Александровна

доктор биологических наук, доцент Шестопалова Лидия Владимировна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Бгатова Наталия Петровна

доктор биологических наук, профессор Гуляева Людмила Федоровна

Ведущая организация: ГОУ ВПО Сибирский государственный

медицинский университет Росздрава,

г. Томск

Защита диссертации состоится « ¥ » 2007 г. в « У^7 » часов

на заседании Диссертационного совета Д 208.062.05 при ГОУ ВПО Новосибирском государственном медицинском университете Росздрава по адресу: 630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Новосибирского государственного медицинского университета Росздрава по адресу: 630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52

Автореферат диссертации разослан «

у/

.» р^ШМ^АЛ- 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совет доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на успехи в изучении причин и особенностей онкологических заболеваний, их частота и смертность от них продолжают увеличиваться (American Cancer Society, 2005). В последние 50 лет лечение злокачественных заболеваний, наряду с хирургическими методами, преимущественно основано на использовании различных форм цитотоксической химио- и радиационной терапии. С помощью данных видов терапии достигнуты определенные успехи в лечении ряда злокачественных заболеваний крови и некоторых солидных опухолей, а также метастазов. Однако эффективность химиотерапии часто ограничивается устойчивостью опухолевых клеток к используемым препаратам (Tsuruo Т. et al., 2003). Исследования последних лет показали, что клеточные механизмы лекарственной устойчивости разнообразны: от ограничения накопления вещества внутри клетки до отмены программы гибели клетки, индуцируемой веществом (Ставровская A.A., 2000).

Снижение накопления цитотоксического препарата в клетке может быть результатом увеличения скорости его выведения. Главную роль в этом процессе отводят трансмембранному белку - Р-гликопротеину, который функционирует как энергозависимый насос, способный выводить из клетки широкий спектр цитотоксических веществ (Ford J.M. et al., 1990). Р-гликопротеин является продуктом гена mdrl, увеличение уровня экспрессии которого коррелирует с приобретением опухолевыми клетками фенотипа множественной лекарственной устойчивости (Garraway L.A. et al., 2002). Показано, что при лечении острой лейкемии (Pirker R. et al., 1992; Zhou D.C. et al., 1992), различных миелом (Salmon S.E. et al., 1989; Musto P. et al., 1991), сарком (Chan H.S. et al., 1990) и нейробластом (Goldstein L. et al., 1990) химиотерапия является неэффективной из-за повышения экспрессии гена mdrl.

Эффективность терапевтического действия ряда противораковых препаратов зависит от способности этих веществ запускать в чувствительных опухолевых клетках апоптоз (Fisher D., 1994). Данный тип клеточной гибели имеет ряд преимуществ по сравнению с некрозом, не только в отношении эффективности действия химиопрепаратов, но и в отношении побочных явлений: некротическая гибель клеток, в отличие от апоптотической, всегда сопровождается развитием воспалительного процесса и гибелью окружающих клеток и тканей (Kroemer G. et al., 1998; Henson P.M. et al., 2001) В настоящее время в клинике используется целый ряд химиопрепаратов, которые запускают апоптоз в опухолевых клетках (Kaufmann S.H. et al., 2000). Неспособность химиопрепаратов включить апоптоз в малигнизированных клетках может являться причиной устойчивости к их действию. Это, в свою очередь, является следствием того, что в опухолевых клетках нарушены механизмы апоптоза. К наиболее часто встречающимся нарушениям относят изменение уровня экспрессии протоонкогена bcl-2 и гена онкосупрессора р53 (O'Connor P.M. et al., 1997; Dive С., 1997). Повышенная экспрессия гена bcl-2 является маркером устойчивости опухолевых клеток к химиотерапии при некоторых видах лимфом, лейкозах, а также при нейробластоме, раках предстательной железы и

яичника (DiPaola R.S. et al., 1999; Beale P.J. et al., 2000). Это объясняется тем, что белковый продукт данного гена препятствует запуску апоптоза по внутреннему (митохондриальному) пути.

Очевидно, что все изменения на молекулярно-генетическом уровне, имеют свое отражение в морфологических характеристиках опухолей. Изучение этих характеристик может дать представление о целостной картине перестроек, которые происходят в структурах тканей опухолей, приобретающих резистентность к химиопрепаратам. Однако в настоящее время работ, посвященных исследованию морфологии клеток, обладающих устойчивостью к противоопухолевым препаратам, очень мало.

Уникальной моделью для комплексного изучения особенностей опухолей, оппозитных по чувствительности к химиопрепаратам (в частности, к циклофосфану), являются высокочувствительная (LS) и резистентная (RLS) лимфосаркомы мышей. Терапевтический эффект циклофосфана на клетки опухоли LS опосредуется путем запуска в них апоптоза (Каледин В.И. и др., 2000). Субштамм RLS был получен нами из LS путем многократных внутримышечных перевивок рецидивов этой опухоли, возникающих после воздействия циклофосфаном при постепенном повышении дозы. Подобное приобретение устойчивости к химиопрепаратам во время проведения курса терапии широко распространено в клинической практике и является одной из важнейших проблем в лечении злокачественных заболеваний (Seki М. et al., 1999).

Сравнительное изучение двух лимфосарком — чувствительной (LS) и резистентной (RLS) - может дать понимание механизмов лекарственной устойчивости к циклофосфану, широко применяемому в клинике при лечении неходжкинских лимфом, разнообразных сарком костных и мягких тканей, а также острого лейкоза лимфобластического типа (Moore M.J., 1991).

Цель работы: выявить морфогенетические особенности оппозитных по чувствительности к циклофосфану лимфосарком мышей, являющиеся основой лекарственной устойчивости опухолей.

Задачи исследования:

1. Сравнить чувствительность опухолевых клеток LS и RLS к ряду химиопрепаратов, оказывающих свой эффект на клетки посредством различных механизмов.

2. Сравнить в клетках двух субштаммов LS и RLS лимфосаркомы мышей уровни экспрессии генов mdrla и mdrlb, белковые продукты которых участвуют в процессах выведения цитотоксических веществ из клеток опухолей.

3. Сравнить в клетках двух субштаммов LS и RLS лимфосаркомы мышей уровни экспрессии генов р53 и bcl-2, белковые продукты которых участвуют в процессе апоптоза, запускаемого, химиопрепаратами.

4. На светооптическом уровне сравнить морфологию опухолей LS и RLS до и после введения животным циклофосфана через различные1 временные интервалы.

5. Изучить особенности ультраструктуры клеточных элементов опухолей LS и RLS до и после введения животным циклофосфана через различные временные интервалы.

Научная новизна результатов исследования. Впервые проведено сравнительное исследование двух субштаммов лимфосаркомы LS и RLS по их чувствительности к противоопухолевому действию ряда химиопрепаратов (циклофосфана, адриамицина и цисплатина), а также к их комбинации in vivo. Показано, что лимфосаркома RLS является высокорезистентной к действию не только циклофосфана, но и к действию других исследованных химиопрепаратов.

Впервые в клетках лимфосарком LS и RLS исследована экспрессия генов р53, bcl-2, mdrla и mdrlb, изменение уровня которой может приводить к возникновению лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Показано, что для клеток лимфосаркомы RLS, по сравнению с LS, характерны повышенные уровни экспрессии генов mdrlb и bcl-2 и пониженные - р53 и mdrla.

Впервые проведено сравнение морфологии интактных лимфосарком LS и RLS, а также их структурных реакций на введение циклофосфана животным на светооптическом и электронномикроскопическом уровнях. Показано, что лимфосаркома RLS обладает признаками способности к агрессивному росту и метастазированию. Для интактной лимфосаркомы LS характерно более высокое значение апоптотического индекса, что свидетельствует о большей способности данной опухоли к спонтанному апоптозу. При этом митотические индексы интактных опухолей не различаются. Показано, что в ответ на введение циклофосфана клетки лимфосаркомы RLS отвечают накоплением липидных включений, что может являться одним из механизмов защиты опухолевых клеток от повреждающего действия циклофосфана. В отличие от лимфосаркомы LS, клетки которой подвергаются апоптозу в ответ на введение животным циклофосфана, клетки лимфосаркомы RLS, преимущественно, погибают путем некроза, сопровождаемого мощным воспалительным процессом.

Теоретическое и практическое значение работы. Комплексное изучение уникальной модели оппозитных по чувствительности к циклофосфану субштаммов LS и RLS лимфосаркомы мышей позволит выявить механизмы лекарственной устойчивости опухолевых клеток к действию химиопрепаратов и найти пути ее преодоления.

Проведенное исследование имеет общебиологическое значение в плане расширения представлений о морфогенетических механизмах защиты клеток, вообще, и опухолевых, в частности, от токсических воздействий.

Ряд полученных результатов имеет большое значение для клиники: необходимость индивидуального подбора схемы терапии злокачественных новообразований; использование в качестве одной из важных характеристик не только митотической активности, но и интенсивности спонтанной апоптотической гибели опухолевых клеток; выбор комплексного подхода при разработке инновационных методик генной терапии злокачественных заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Пассирование чувствительной к циклофосфану лимфосаркомы LS в условиях постепенного повышения дозы препарата привело к появлению высокорезистентого субштамма - лимфосаркомы RLS.

2. Клетки резистентной к действию ряда химиопрепаратов лимфосаркомы RLS характеризуются повышенными (по сравнению с LS) уровнями экспрессии генов bcl-2 и mdrlb и пониженными - р53 и mdrla.

3. Одним из механизмов появления устойчивости клеток RLS к циклофосфану является снижение их чувствительности • к факторам, вызывающим апоптоз (как спонтанный, так и индуцированный).

4. Молекулярно-генетические изменения имеют морфологические корреляты в организации клеток, составляющих резистентную к циклофосфану опухоль.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на XL, XLI и XLIV международных студенческих конференциях «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2002, 2003, 2006 гг.), отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, 2002 и 2005 гг.), V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005 г.), Всероссийской конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2005 г.), IX Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2005 г.), международной конференции «Cell Signaling World 2006. Signal Transduction Pathways as therapeutic targets» (Люксембург, 2006 г.), Международной конференции «Basic Science for Biotechnology and Medicine» (Новосибирск, 2006 г.), Международном междисциплинарном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, 2006 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, из них 5 в ведущих рецензируемых научных журналах согласно Перечню ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 192 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, описание использованных в работе материалов и методов, результаты проведенных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, список литературы, включающий 362 работы (24 отечественных и 338 зарубежных авторов). Работа иллюстрирована 42 рисунками и 13 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Эксперименты проводили на 2-4-х месячных самцах и самках мышей линии CBA/Lac (СВА), полученных из лаборатории разведения экспериментальных животных Института цитологии и генетики СО РАН. Они содержались группами по 8-10 особей одного пола в пластиковых ванночках при естественном режиме освещения и имели свободный доступ к воде и корму.

Перевиваемые опухоли мышей. В работе использованы перевиваемая лимфосаркома LS мышей, индуцированная В.И.Калединым у самца линии

СВА нитрозометилмочевиной (Каледин В.И. и др., 2000), и резистентный перевиваемый субштамм лимфосаркомы - RLS, полученный нами из LS путем многократных внутримышечных перевивок рецидивов этой опухоли, возникающих после воздействия циклофосфаном при постепенном повышении дозы препарата с 10 до 200 мг/кг. Обе опухоли поддерживались на мышах линии СВА в асцитной форме. Оценку активности противоопухолевых препаратов и гистологическое исследование проводили на внутримышечных трансплантатах опухолей LS и RLS. Для прививки использовали клетки асцитного варианта опухоли. Асцит разводили физиологическим раствором (асцит LS - 1:10, RLS - 1:50) и инъецировали мышам в мышцы бедра по 0.1 мл.

Противоопухолевые препараты. Для проведения экспериментов in vivó были выбраны следующие противоопухолевые препараты: циклофосфан («Биохимик», Россия), адриамицин ("Pharmacia&Upjohn", Италия) и цисплатин ("Ebewe Pharma", Австрия). Противоопухолевые препараты вводили внутривенно (в объеме 2 мл на 100 г массы тела животных) однократно, когда опухоли достигали объема в среднем около 1 см3 (на 10 день после прививки).

Оценка противоопухолевого эффекта препаратов in vivo. Критериями оценки противоопухолевого эффекта препаратов были динамика и торможение роста опухолей, увеличение средней продолжительности жизни животных, перенесших токсическое действие препаратов. Динамику опухолевого роста отслеживали, периодически измеряя опухоли с помощью штангенциркуля-и определяя объем опухоли перемножением трех ее взаимноперпендикулярных размеров. Торможение роста опухолей (ТРО) оценивали по формуле: ТРО = (V контроль - V опыт) / V контроль х 100%, где V контроль - среднее значение объема опухолей в группе контрольных животных, V опыт - среднее значение объема опухолей в группе опытных животных.

Суммарную клеточную РНК выделяли из первичных культур клеток LS и RLS (Chattopadhyay N. et al., 1993). Концентрацию РНК и степень очистки от белка определяли спектрофотометрически на приборе BioMate3 при длинах волн 260 и 280 нм (Маниатис Т. и др., 1984).

Определение уровня экспрессии генов mdrla, mdrlb, р53 и bcl-2 проводили с помощью метода полуколичественной обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с использованием в качестве внутреннего стандарта гена белка домашнего хозяйства Д-актина (Bouaboula М. et al., 1992; Wong Н. et al., 1994).

Методы светооптического и электронномикроскопического исследований. На 10-й день после прививки опухоли животным однократно внутривенно вводили циклофосфан в дозе 100 мг/кг. Для светооптического исследования материал опухолевой ткани брали из интактных опухолей на 10-й и 13-й дни после трансплантации, а также из опухолей через 2.5, 24, 48 и 72 часа после введения мышам циклофосфана; для электронномикроскопического исследования - из интактных опухолей на 10-й день после трансплантации и через 2.5 и 24 часа после введения мышам циклофосфана. Быстроизвлеченный материал для светооптического исследования фиксировали в 12% растворе формалина, далее проводили стандартную обработку и заливали в парафин.

Срезы окрашивали по стандартным методикам гематоксилином и эозином, азур-П-эозином и по Ван-Гизону. Препараты исследовали под микроскопом Axioskop 40, фотографировали с использованием фотокамеры AxioCam MRc, полученные изображения обрабатывали при помощи программного обеспечения AxioVision (reí. 4.5).

Материал для электронномикроскопического исследования фиксировали в 3% растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере рН 7.4 при температуре 4°С, дофиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, смеси ацетона и абсолютного спирта, ацетоне. Заливку проводили в смеси аралдита-эпона (1:6) с добавлением катализатора DMP-30, полимеризовали при комнатной температуре, далее в - термостате при 60°С. Тонкие срезы получали на ультрамикротоме Tesla BS490Á, контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Полученные срезы исследовали и фотографировали под трансмиссионным электронным микроскопом JEM-100CX при ускоряющем напряжении 60-80 kV.

Методы морфометрического исследования. В работе определяли: апоптотический и митотический индексы (результаты выражали в промилле (%>)), плотность ткани (число опухолевых клеток на поле зрения микроскопа), а также объемную плотность зон с некротическими изменениями клеток (%). Исследования выполнены на зашифрованных препаратах, окрашенных азур-П-эозином (объемную плотность некрозов определяли на препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином), под световым микроскопом Amplival при увеличении окуляра х 12.5, иммерсионного объектива х 100.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета программ STATISTICA (ver. 6.0): различия между экспериментальными группами при исследовании-динамики роста опухолей оценивали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа. Для выявления статистически значимых отличий между данными всех остальных экспериментов использовали t-критерий Стьюдента. Различия считали достоверным при р < 0.05. Все приведенные в работе данные представлены в виде: среднее ± стандартная ошибка среднего (М ± SEM).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Чувствительность лимфосарком LS и RLS мышей к химиопрепаратам in vivo. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что циклофосфан (ЦФ) - один из широко используемых цитотоксических препаратов - обладает высокой противоопухолевой активностью в отношении чувствительной опухоли LS мышей. Введенный однократно в дозах 10 или 50 мг/кг мышам с внутримышечными трансплантатами опухоли LS он вызывал значительную регрессию этой опухоли с последующими рецидивами, а в дозе 100 мг/кг - вызывал полную регрессию лимфосаркомы (рис. 1 А). Введение ЦФ в дозах 50 и 100 мг/кг привело к значительному торможению роста этой опухоли и увеличению продолжительности жизни животных-опухоленосителей более чем в 3 раза по сравнению с контролем (табл. 1).

В результате трансплантации рецидивов опухоли LS, возникающих после низкодозовой' терапии (10 мг/кг) с постепенным повышением дозы ЦФ до 200мг/кг, нами был получен резистентный субштамм лимфосаркомы - RLS. Для этой опухоли характерна низкая чувствительность к терапевтическому эффекту высоких доз (300 мг/кг) ЦФ (рис. 1Б). Введение ЦФ в дозах 100, 200 и 300 мг/кг не отразилось на средней продолжительности жизни мышей с внутримышечными трансплантатами опухоли RLS (табл. 1). Таким образом, субштаммы лимфосаркомы - LS и RLS, - полученные из одного исходного штамма, обладают оппозитными характеристиками: опухоль LS высокочувствительна к ЦФ, а RLS обладает выраженной резистентностью к нему.

0123456789 Время после введения

препарата, сутки

■ Контроль -л- Цф, Ю мг/кг

■ ЦФ, 50 мг/кг ЦФ, 100 мг/кг

0 1 2 3 4 5 6 Время после введения

препарата, сутки

■ Контроль -о— ЦФ, 100 мг/кг

■ ЦФ, 200 мг/кг -о- ЦФ, 300 мг/кг

Рисунок 1. Противоопухолевый эффект различных доз ЦФ по отношению к внутримышечным трансплантатам лимфосарком LS (А) и RLS (Б). *** - р < 0.001 по сравнению с контролем.

Таблица 1. Противоопухолевая активность различных доз циклофосфана по

Лимфосаркома LS Лимфосаркома RLS

Группа животных ТРО, % ПЖ, сутки ' УСПЖ, % Группа животных ТРО, % ПЖ, сутки УСПЖ, %

Контроль - 15.0±0.4 - Контроль - 14.6±0.4 -

Цф, 10 мг/кг 90 43.5±2.5 *** 190 ЦФ, 100 мг/кг 34 15.1±0.3 3.4

ЦФ, 50 мг/кг 95 >двух месяцев >300 ЦФ, 200 мг/кг 51 15.6±0.3 6.8

ЦФ, 100 мг/кг 100 >двух месяцев >300 ЦФ, 300 мг/кг 64 16.0±0.6 9.6

Примечание: ТРО - торможение роста опухоли; ПЖ - продолжительность жизни; УСПЖ - увеличение средней продолжительности жизни. *** - р < 0.001 по сравнению с контролем.

Использованный метод получения резистентного субштамма RLS лимфосаркомы под селективным давлением возрастающих доз ЦФ позволяет утверждать, что неэффективное лечение даже тем препаратом, к которому опухоль изначально проявляет выраженную чувствительность, может привести к образованию высокоустойчивых рецидивов.

Для решения вопроса о том, сопровождается ли приобретение клетками лимфосаркомы RLS устойчивости к (ЦФ возникновением перекрестной резистентности к другим противоопухолевым препаратам, мы исследовали in vivo терапевтический эффект цисплатина, адриамицина и комбинации трех противоопухолевых препаратов (ЦФ, цисплатина и адриамицина) на оба субштамма лимфосаркомы. Нами получены данные, которые показали, что лимфосаркома LS является гораздо более чувствительной к действию цисплатина, чем лимфосаркома RLS (рис. 2). Реакции лимфосарком LS и RLS на введение адриамицина в дозе 12 мг/кг мышам сходны: происходит незначительная регрессия опухолей обоих субштаммов (рис. 2). При использовании в качестве терапии комбинации трех химиопрепаратов динамика развития лимфосаркомы LS сходна с динамикой развития этой опухоли при использовании только ЦФ (рис. 2А). Применение полихимиотерапии несколько затормаживало рост лимфосаркомы RLS, но не вызывало ее регрессии (рис. 2 Б).

0 1 2 3 4 5 6 Время после введения препарата, сутки -¿г- Контроль -л- Цисплатин, 8 мг/кг

Адриамицин, 12 мг/кг -о-ПХТ

ю 0 Н-1-1-1-1-1-1

0 1 2 3 4 5 6 Время после введения

препарата, сутки -л- Контроль -а- Цисплатин, 8 мг/кг

Адриамицин, 12 мг/кг —ПХТ

Рисунок 2. Противоопухолевый эффект цисплатина, адриамицина и полихимиотерапии (ПХТ: ЦФ, 50 мг/кг, цисплатин, 3.6 мг/кг, адриамицин, 3.6 мг/кг) по отношению к внутримышечным трансплантатам лимфосарком LS (А) и RLS (Б). *** - р < 0.001 по сравнению с контролем.

Введение мышам 8 мг/кг цисплатина или 12 мг/кг адриамицина приводило к существенному торможению роста опухоли LS и увеличению средней продолжительности жизни опухоленосителей. Использование полихимиотерапии приводило к полной регрессии опухоли и, по крайней мере, трехкратному увеличению продолжительности жизни (табл. 2). Наиболее

10

значительное торможение роста внутримышечных трансплантатов лимфосаркомы RLS вызывал адриамицин, тем не менее его эффект на эту опухоль был почти в 2 раза менее выражен, чем на опухоль LS, как по торможению роста опухоли, так и по увеличению средней продолжительности жизни животных (табл. 2). Использование цисплатина или комбинации трех химиопрепаратов лишь на 10% увеличивало продолжительность жизни животных с опухолью RLS (табл. 2).

Таблица 2. Противоопухолевая активность цисплатина, адриамицина и полихимиотерапии по отношению к лимфосаркомам LS и RLS_

Группа животных Лимфосаркома LS Лимфосаркома RLS

ТРО, % ПЖ, сутки УСПЖ, % ТРО, % ПЖ, I УСПЖ, сутки 1 %

Контроль - 15.0±0.4 - - 14.6±0.4 -

Цисплатин, 8 мг/кг 74 25.9±0.9 72 20 15.9±0.6 9

Адриамицин, 12 мг/кг 71 21.3±0.6 41 40 17.3±1.1 * 18

ПХТ 100 61.3±1.9 *** >300 28 16.0±0.2 ** 10

Примечание: ПХТ - полихимиотерапия: ЦФ, 50 мг/кг, цисплатин, 3.6 мг/кг, адриамицин, 3.6 мг/кг. * - р < 0.05, ** - р < 0.01, *** - р < 0.001 по сравнению с контролем. Остальные обозначения как в таблице 1.

На основании полученных данных можно заключить, что использование в терапии лимфосаркомы RLS комбинации малоэффективных (при раздельном введении животным) химиопрепаратов (ЦФ, цисплатина, адриамицина) не приводит к существенному увеличению противоопухолевого эффекта. Отчасти это можно объяснить необходимостью снижения дозы отдельных препаратов, входящих в состав используемой комбинации, с целью уменьшения ее токсичности. В то же время это можно отнести к существенному недостатку полихимиотерапии, так как, исходя из полученных нами результатов, а также основываясь на литературных данных (Marie J.P. et. al., 1996), можно утверждать, что использование низких доз даже эффективного противоопухолевого препарата (например, ЦФ при терапии лимфосаркомы LS) приводит к возникновению множественной лекарственной устойчивости.

Экспрессия генов mdrla, mdrlb, р53 и bcl-2 в клетках первичных культур LS и RLS. Для изучения особенностей опухолевых клеток вообще, а также клеток лимфосарком LS и RLS, в частности, необходимо отделить опухолевые клетки от нормальных клеток организма и от сывороточных факторов крови, что возможно при культивировании опухолевых клеток m vitro. Для этого из асцитных форм лимфосарком LS и RLS мышей были получены первичные культуры клеток. Для выявления механизмов, обеспечивающих развитие устойчивости опухоли к действию

химиопрепаратов, было проведено сравнение уровней экспрессии генов: 1) mdrla и mdrlb, кодирующих Р-гликопротеин; 2) р53, кодирующего белок -фактор транскрипции, который обеспечивает восприятие повреждений в структуре ДНК и запуск апоптоза клеток; 3) bcl-2, белковый продукт которого способен приводить к отмене запуска апоптоза.

Анализ методом ОТ-ПЦР выявил, что все исследуемые гены - mdrla, mdrlb, р53 и bcl-2 - экспрессируются как в клетках исходного субштамма лимфосаркомы LS, так и в клетках резистентной опухоли RLS. Однако уровни экспрессии этих генов отличаются: экспрессия гена mdrlb в 2.5, а bcl-2 - в 6.7 раз выше в клетках линии RLS по сравнению с клетками линии LS, в то время как экспрессия генов mdrla и р53 ниже в 4.0 и 2.0 раза, соответственно (рис. 3).

я

U

Э о

X

и о

о с

э

1.2 Л

£0,8 s

СО.

0,4-

0

гЬ

□ LS Ш RLS

гЪ

лЭ

4 i

3 -

2 -

1 -

mdrla mdrlb р53 Различия, полученные по

0

ñ

Рисунок 3. Уровни экспрессии генов т<3г1а, тс1г1Ь, р53 и Ьс1-2 в клетках первичных культур LS и RLS. Денситометрическая обработка результатов электрофореза продуктов ОТ-ПЦР. ** - р < 0.01, *** - р < 0.001 по сравнению с клетками LS.

bcl-2

экспрессии генов bcl-2 и р53, хорошо согласуются с данными литературы по механизмам формирования лекарственной устойчивости опухолей. Повышенный уровень экспрессии гена mdrla объясняет относительную устойчивость клеток лимфосаркомы LS к действию адриамицина in vivo (Sakaeda Т. et al., 2002). В клетках RLS экспрессия этого гена снижена в 4 раза, тем не менее данная опухоль обладает меньшей чувствительностью к цитостатикам - субстратам Р-гликопротеина. Возможно, Р-гликопротеин, кодируемый геном mdrlb, вносит гораздо больший вклад в возникновение множественной лекарственной устойчивости лимфосаркомы RLS, чем кодируемый геном mdrla.

Механизмы появления резистентной лимфосаркомы RLS могут быть различны: 1) под давлением ЦФ может происходить отбор различных клонов опухолевых клеток (Loeb L.A., 2001; van den Heuvel-Eibrink M.M. et aL, 2001), для каждого из которых характерен повышенный/пониженный уровень одного из исследуемых генов; 2) опухоль могут составлять клетки, несущие множественные мутации, результатом которых является изменение уровней экспрессии всех исследуемых генов (в одной и той же клетке); 3) изменение экспрессии генов происходит вследствие влияния различных эпигенетических факторов (Farrell W.E. et al., 2003; Glasspool R.M., 2006).

Уместно предположить, что молекулярно-генетические изменения в клетках лимфосаркомы RLS, влияют на их морфологию. Поэтому нам представлялось важным сравнить структурную реакцию клеток лимфосарком LS и RLS на введение ЦФ на светооптическом и электронномикроскопическом уровнях.

Светооптическое изучение влияния циклофосфана на опухоли LS и

RLS. На основании светооптического исследования интактных лимфосарком (взятых на 10-й день после трансплантации) можно заключить, что лимфосаркома RLS является менее дифференцированной. Уровень спонтанного апоптоза клеток лимфосаркомы LS достоверно выше, чем в RLS (рис. 4В). Однако митотический индекс двух субштаммов интактных опухолей не различается (рис. 4Б). Это дает основание полагать, что более медленный рост лимфосаркомы LS, по сравнению с RLS, обусловлен большей склонностью клеток LS к спонтанному апоптозу, а не увеличением митотической активности лимфосаркомы RLS. По-видимому, именно нарушения в механизмах апоптоза, привели к формированию резистентного штамма опухоли. Об изменениях генетической регуляции апоптоза свидетельствуют и полученные нами данные по экспрессии генов - регуляторов апоптоза: bcl-2 и р53. Для изучаемых опухолей установлена обратная зависимость между апоптотическим индексом и уровнем экспрессии гена bcl-2. Такая же зависимость выявлена рядом исследователей, в том числе для лимфом (Du М. et al., 1996). Эти данные согласуются с представлениями о блокирующей роли белка Bcl-2 в развитии апоптоза. Известно, что белок р53 отвечает за запуск апоптоза в клетках, имеющих эндогенные или экзогенные повреждения ДНК, в том числе в клетках, подвергшихся злокачественному перерождению. По-видимому, в лимфосаркоме LS еще частично сохранены механизмы элиминации опасных для организма клеток, что и находит свое отражение в более высоком уровне спонтанного апоптоза.

Интересной особенностью интактной лимфосаркомы LS, взятой на 13-й день после трансплантации, является достоверное снижение апоптотического индекса по сравнению с интактной опухолью, взятой на 10-й день после трансплантации (рис. 4В). Однако между лимфосаркомами LS и RLS достоверных отличий не выявлено (рис. 4В). Подобное снижение апоптотической гибели клеток во время роста было обнаружено и для других опухолей (Лушников Е.Ф. и др., 2001). Одной из причин этого, вероятно, является гибель наиболее чувствительных клеток, сохраняющих механизмы апоптоза, еще в начале развития.

Через 2.5 часа после введения ЦФ мышам значительных отличий между реакциями чувствительной и резистентной опухолей не выявлено. По сравнению с интактными опухолями отмечается увеличение числа очагов кровоизлияний, что может быть обусловлено влиянием ЦФ на эндотелиальные клетки сосудов (Kachel D.L. et al., 1994; Albertsson Р. et al„ 2003; Hamano Y. et al., 2004; Ohtani T. et al., 2006).

Через 24 часа после введения ЦФ для обоих штаммов лимфосаркомы отмечено достоверное уменьшение плотности ткани, по сравнению с интактным состоянием (рис. 4А). Однако приводящие к этому механизмы различны: мы наблюдаем достоверное увеличение апоптотической гибели клеток лимфосаркомы LS, тогда как в RLS, этот показатель не изменяется (рис. 4В). Уменьшение плотности ткани во втором, случае обеспечивается некротической гибелью клеток (рис. 4Г). В обоих субштаммах отмечено

о Б

в

о 300 " 2 о О

§100 £ П

200

&&&

К 1

К 2

■к к

х

о

о" *

Ч =

к

>к

1 Л

К Р"

ь ^

К к

§ I

о к

к <

ё

о „ г

Ь

г- ш

В о — сч

^ СХ я К

(и к

(О

<5 О

5 4 3 2 1 0

90 75 60 45 30 15 0

50 40 30 20 10 0

2.5 часа Б

24 часа 48 часов 72 часа

а

&&&

К I

К 2

2.5 часа

24 часа

+++

48 часов 72 часа

++ *** —1

400 300 200 100 -0

и

К 1

К 2

2,5 часа Г

24 часа

48 часов

ш **

О

и

гЬ

Г'

к

К 2

2.5 часа 24 часа □ 1.8 а КЬЗ

48 часов 72 часа

Рисунок 4. Изменение плотности ткани (А), митотического (Б), апоптотическога (В) индексов и объемной плотности некрозов (Г) лимфосарком 1,5 и К после введения циклофосфана. К 1 - интактная опухоль, взятая на 10-й день после трансплантации, К 2 - интактная опухоль, взятая на 13-й день после Транс плантации; далее по оси абсцисс - время после введения циклофосфана животным. * - р < 0.05, ** - р < 0.01, *** - р < 0.001 по сравнению с ЬЙ того же срока; + - р < 0,05, ++ - р < 0.01, +++ - р < 0.00! по сравнению с интактной взятой на 10-й день после трансплантации; # -р < 0.05, ## - р < 0.01, #Ш - р < 0.001 по сравнению с интактной ЛЬЭ, взятой на 10-й день после трансплантации; &.& - р < 0.05, &&& - р < 0.001 по сравнению с интактной взятой на 13-й день после трансплантации; лл- р < 0.01, ллл-р < 0.001 по сравнению с интактной Ю-З, взятой на 13-й день после трансплантации. Данные по апоптозу через 72 часа после введения циклофосфана не приводятся, так как его число невозможно объективно оценить из-за значительного уменьшения плотности тканн лимфосаркомы

14

развитие воспалительных процессов. Однако в отдельных участках лимфосаркомы LS воспаление находится в стадии завершения, о чем свидетельствуют появившиеся признаки репарации. В лимфосаркоме RLS к этому сроку, напротив, выявлены центры опухолевого роста.

Через 48 часов после введения ЦФ плотность ткани лимфосаркомы LS еще больше снижается, что обусловлено апоптозом большого числа составляющих ее клеток и активным фагоцитозом образующихся апоптотических телец, в то время как плотность лимфосаркомы RLS остается на прежнем уровне (рис. 4А). Достоверных различий между митотическими индексами двух типов опухолей не выявляется (рис. 4Б), тогда как апоптотические индексы лимфосарком LS и RLS существенно отличаются (рис. 4В). Некротизация тканей в опухоли LS происходит в значительно меньшей степени, чем в RLS (рис. 4Г), что ведет к большей сохранности окружающих тканей. В лимфосаркоме RLS продолжается активное течение воспалительного процесса, в LS - преобладают репаративные изменения.

Через 72 часа после введения ЦФ мышам, в отличие от лимфосаркомы RLS, в лимфосаркоме LS отмечается значительное снижение митотического индекса, что, наряду с апоптотической гибелью клеток, приводит к разрыхлению опухолевой ткани (рис. 4А, Б, В). В опухоли RLS отмечается высокая митотическая активность (рис. 4Б), которая является причиной ее дальнейшего роста, несмотря на увеличение гибели клеток, в том числе и апоптотической.

Ультраструктурное исследование влияния циклофосфана на опухоли

LS и RLS. Электронномикроскопический анализ показал, что по сравнению с исходной опухолью LS, устойчивая RLS представлена, преимущественно, менее дифференцированными лимфоцитами с полиморфными ядрами, обладающими высокой пролиферативной способностью. Рядом исследователей было продемонстрировано, что для менее дифференцированных клеток характерна большая устойчивость к действию химиопрепаратов, в том числе за счет большей устойчивости к запуску апоптоза (Suarez L. et al., 2001; Suarez L. et al., 2005). Это согласуется с данными по уровням экспрессии генов р53 и bel-2 в клетках двух лимфосарком. Кроме того, Klimecki W.T. et al. (1994) обнаружили, что со степенью дифференцировки лимфоцитов человека связан и уровень экспрессии Р-гликопротеина. Согласно нашим результатам, для клеток RLS характерен высокий (по сравнению с LS) уровень экспрессии гена mdrlb.

Продукция большого количества межклеточного вещества (Toole В.Р. et al., 2002), а также наличие морфологических признаков подвижности (множества цитоплазматических отростков) малигнизированных клеток, свидетельствуют о способности RLS к метастазированию.

Большинство клеток RLS не выявили существенных изменений внутриклеточной организации в ответ на введение ЦФ животным. Прежде всего, отмечена хорошая степень сохранности митохондрий, которые в клетках LS, напротив, характеризуются обводнением и нарушением структуры, что является одним из морфологических признаков вовлечения клетки в апоптоз (Vander Heiden M.G. et al., 1997; Самуилов В.Д. и др., 2000). Сохранение

структуры митохондрий в клетках лимфосаркомы RLS, как мы полагаем, может быть связано с выявленным нами повышенным уровнем экспрессии гена bcl-2 в клетках данной опухоли. Белок Вс1-2 препятствует встройке белков-каналов в мембрану митохондрий, через которые опосредуется обводнение матрикса и запуск всего процесса апоптоза (Eamshow W.C. et al., 1999; Desagher S. et al., 2000; Von Ahsen O. et al., 2000). Еще одно структурное отражение устойчивости RLS - появление большого количества липвдных внутриклеточных включений. Полагают, что липиды способны связывать цитотоксические вещества и таким образом блокировать осуществление их эффектов на клетку (Le Моуес L. et al., 1996; Belhoussine R. et al., 1998). Возможно, в накоплении большого количества липидных включений в клетках RLS участвует Р-гликопротеин, транспортирующий холестерин (van Helvoort A. et al., 1996; Eckford P.D.W, et al., 2005) и кодируемый геном mdrlb, повышенная экспрессия которого была отмечена нами в клетках этой опухоли.

Таким образом, реакции исследованных опухолей на воздействие ЦФ резко различаются по характеру. В чувствительной LS развивается апоптоз, приводящий к полному исчезновению новообразования. В RLS после введения препарата отмечены некробиотические изменения, сопровождаемые выделением большого количества медиаторов воспаления, что приводит к гибели опухоленосителей.

ВЫВОДЫ

1. Клетки лимфосаркомы RLS, полученной из чувствительной LS в результате пассирования при возрастающих концентрациях циклофосфана, приобрели резистентность к апоптогенному действию циклофосфана, а также перекрестную устойчивость к адриамицину, цисплатину и комбинации трех химиопрепаратов (циклофосфана, адриами цина и цисплатина) in vivo.

2. Клетки двух исследованных лимфосарком (LS и RLS) различаются по уровню экспрессии всех четырех исследованных генов: р53, bcl-2, mdrla и mdrlb, белковые продукты которых участвуют в приобретении опухолевыми клетками лекарственной устойчивости.

3. Особенностью лимфосаркомы RLS является наличие морфологических признаков способности к агрессивному росту и метастазированию. Это: большое количество малодифференцированных клеток с полиморфными ядрами, наличие у клеток цитоплазматических отростков, расширенное межклеточное пространство.

4. Сравнение структуры интактных лимфосарком показало, что для LS характерно более высокое значение уровня спонтанного апоптоза. Цитотоксический эффект циклофосфана в чувствительной и резистентной лимфосаркомах реализуется посредством различных механизмов: клетки LS погибают апоптозом, в то время как в RLS развиваются, главным образом, клеточные некрозы, сопровождаемые обширным воспалительным процессом.

Это свидетельствует о роли апоптоза в механизмах , развития лекарственной чувствительности клеток.

5. После введения животным циклофосфана наиболее значимыми изменениями в ультраструктуре опухолевых клеток исследованных лимфосарком являются: обводнение матрикса митохондрий в клетках LS и накопление липидных включений, способных блокировать действие химиопрепаратов, в клетках RLS.

6. На примере двух субштаммов лимфосарком можно утверждать о наличии взаимосвязи морфологических и молекулярно-генетических особенностей опухолевых клеток. В частности, возникновение устойчивости к действию циклофосфана лимфосаркомы RLS обеспечивается повышенной экспрессией генов bcl-2 и mdrlb, а также сохранностью структуры большинства митохондрий и накоплением липидных капель в цитоплазме ее клеток.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Новые данные о морфогенетических особенностях резистентных клеток целесообразно внедрить в учебную программу для студентов ВУЗов по курсу «Цитология, клеточная биология» (в раздел о защите клеток от токсических воздействий). Полученные данные по изменению уровней экспрессии нескольких генов в резистентных опухолях необходимо учитывать при разработке инновационных методик генной терапии. При составлении гистологического описания опухолевых тканей требуется оценка не только митотического, но и апоптотического индексов. С осторожностью следует использовать низкие дозы химиопрепаратов в клинике.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Галямова М.Р., Андреева Е.М. LS лимфосаркома мышей как модель для изучения механизмов апоптоза, вызываемого противоопухолевыми химиопрепаратами // Материалы XL Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». - Новосибирск, 2002. -С. 73-74.

2. Андреева Е.М. Влияние биологической и химической активации циклофосфана на его апоптогенную и противоопухолевую активности // Материалы XLI Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». - Новосибирск, 2003. - С. 163-164.

3. Каледин В.И., Николин В.П., Баймак Т.Ю., Галямова М.Р., Попова H.A., Андреева Е.М. Влияние фенобарбитала на противоопухолевый эффект циклофосфана в зависимости от типа вызываемой им гибели опухолевых клеток // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2003.-Т. 135. -№3. -С. 334-338. '

4. Андреева Е.М, Миронова Н.Л., Зенкова М.А., Попова H.A., Николин В.П., Каледин В.И. Сравнение экспрессии генов, ответственных за формирование лекарственной устойчивости опухолей, оппозитных по чувствительности к апоптогенному действию циклофосфана // Бюллетень Сибирской медицины. - 2005. - Т. 4. - Приложение 1. Тезисы докладов V Сибирского физиологического съезда. - С. 110.

17

5. Mironova N., Shklyaeva O., Aridreeva E., Popova N., Zenkova M., Vlassov V. Validation of gene targets: genes overexpressed in drug resistant tumors (mice model) // Всероссийская конференция «Фундаментальные науки -медицине». - 4-8 сентября 2005, Новосибирск. - С. 97.

6. Миронова Н., Шкляева О., Андреева Е., Зенкова М., Власов В. Валидация генов-мишеней: профиль экспрессии генов в опухолях, обладающих фенотипом лекарственной устойчивости // IX Российский онкологический конгресс. - 22-24 ноября 2005, Москва. - С. 217.

7. Zenkova М., Mironova N., Shklyaeva О., Andreeva Е., Vlassov V. Animal model of tumor progression: a study of combined therapy to overcome the multiple drug resistance syndromes of malignant cells // Proceedings of the meeting: Cell Signaling World 2006. Signal Transduclion Pathways as therapeutic targets. -January 25th to 28th, 2006, Luxembourg. - P. 667.

8. Каледин В.И., Попова H.A., Андреева E.M. Изучение эффективности моно- и полихимиотерапии на модели перевиваемой мышиной лимфосаркомы, нечувствительной к индукции апоптоза // Вопросы онкологии. - 2006. - Т. 52. -№ 1. - С. 70-73.

9. Андреева Е.М. Изменения ультраструктуры лимфосаркомы мышей, сопровождающие возникновение резистентности к циклофосфану // Материалы XLIV Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». - Новосибирск, 2006. - С. 83-84.

10. Андреева Е.М., Шестопалова Л В., Попова Н.А. Характеристика ультраструктуры лимфосарком LS и RLS мышей, оппозитных по чувствительности к апоптогенному действию циклофосфана // Вестник Новосибирского государственного университета. - 2006. - Т. 4. - Вып. 1. - С. 1420.

11. Андреева Е.М., Миронова Н.Л., Шкляева О.А., Попова Н.А., Зенкова М.А. Участие генов mdrla, mdrlb, р53 и bcl-2 в формировании устойчивости клеток лимфосаркомы RLS мышей к терапевтическому действию циклофосфана // Вестник Новосибирского государственного университета. -2006. - Т. 4. - Вып. 1.-С. 21-26.

12. Сорокина И.В., Жукова Н.А., Толстикова Т.Г., Позднякова С.В., Грек О.Р., Попова Н.А., Андреева Е.М., Каледин В.И., Николин В.П. Изучение влияния бетулоновой кислоты и ее амидных производных на рост и метастазирование перевиваемых опухолей у мышей // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2006. - № 1. - С. 29-31.

13. Миронова Н.Л., Шкляева О.А., Андреева Е.М., Попова Н.А., Зенкова М.А., Власов В.В. Модель опухолевой прогрессии in vivo для исследования комбинированной терапии, направленной на преодоление синдрома множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток // International conference "Basic Science for Biotechnology and Medicine". -September 3-7,2006, Novosibirsk, Russia. - P. 23.

Подписано в печать 07.12.2006 г. Формат 60x84 1/16. Офсетная печать. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 574

Лицензия ЛР № 021285 от 6 мая 1998 г Редакционно-издательский центр НГУ 630090, Новосибирск-90, ул. Пирогова, 2