Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль неспецифических факторов иммунитета экспериментальных аренавирусных инфекциях, вызванных вирусами Ласса и Мачупо

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Роль неспецифических факторов иммунитета экспериментальных аренавирусных инфекциях, вызванных вирусами Ласса и Мачупо"

м ¡'.¡.и

' ' на правах рукописи

КАЛИБЕРОВ Сергей Анатольевич

РОЛЬ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ИММУНИТЕТА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ АРЕНАВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ, ВЫЗВАННЫХ ВИРУСАМИ ЛАССА И МАЧУПО

03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 1996

Работа выполнена в НИИ молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" Минздрава РФ

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук Г.М. Игнатьев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В.И. Масычева

кандидат биологических наук A.B. Таранин

Ведущая организация:

Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. J1.A. Тарасевича, Минздрава РФ, г. Москва

Защита состоится ." декабря 1996 г. в > часов на заседании диссертационного совета Д 074.20.01 Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" по адресу: 633159, Новосибирская область, пос. Кольцово.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ "Вектор". Автореферат разослан " ноября 1996 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Аренавирусы Ласса и Мачупо являются возбудителями острых инфекционных заболеваний человека, лихорадки Ласса и Боливийской геморрагической лихорадки (БГЛ), соответственно. Несмотря на то, что ареал распространения вируса Мачупо ограничен северовосточными районами Боливии, а вируса Ласса - странами Западной и Центральной Африки, эти возбудители, в связи с расширением экономических отношений и развитием туризма, могут представлять реальную опасность и для неэндемичных территорий.

В Западной Африке ежегодно выявляются более 250 ООО случаев инфицирования людей вирусом Ласса. Заболевание характеризуется тяжелым течением и высокой смертностью (свыше 5 ООО случаев в год). При этом в эндемичных районах выявляется высокий уровень (25 - 55%) здоровых людей, имеющих антитела к вирусу Ласса, что. свидетельствует о наличии стертых, субклинических форм данного заболевания. В отличие от лихорадки Ласса. при БГЛ не наблюдается большого количества заболевших людей. Однако, спорадические случаи возникновения эггой лихорадки характеризуются высокой летальностью (до 80%), что указывает на сохраняющуюся опасность этого заболевания в андемичных районах.

Специфическая терапия геморрагических лихорадок основана, главным образом, на использовании рибавирина и иммунной плазмы, полученной от переболевших людей. Однако, результаты применения как иммунной плазмы, так и рибавирина для лечения аренавирусных лихорадок противоречивы и не могут однозначно свидетельствовать .о достаточной эффективности такого лечения.

Поэтому сохраняется актуальной проблема поиска новых средств терапии и скрининг пригодных для этой цели препаратов должен быть основан на использовании адекватной модели заболевания.

В последнее время появились убедительные данные о важной роли некоторых цигокинов в иммунопатогенезе различных геморрагических лихорадок и их участии в возникновении шокового состояния при бактериальных и вирусных инфекциях.

В этой связи вызывает интерес изучение роли факторов неспецифического иммунитета в развитии экспериментального заболевания и возможности лечения инфекций, вызванных вирусами Пасса и Мачупо, у мышей различных линий.

Целью настоящей диссертационной работы являлось изучение чувствительности инбредных мышей к заражению вирусами Ласса и Мачупо, выбор линии мышей и оценка активности факторов неспецифического иммунитета и влияния некоторых препаратов на течение экспериментальных инфекций, вызванных этими вирусами.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить чувствительность инбредных мышей различных линий к заражению вирусами Ласса и Мачупо и охарактеризовать иммунопатологические особенности течения у них экспериментальных инфекций.

2. Изучил, изменения продукции ФНО, ИФН (в головном мозге и сыворотке крови) и ИЛ-1, изучить изменение активности НК при экспериментальных инфекциях, вызванных вирусами Ласса и Мачупо.

3. Изучить влияние иммунобиологических препаратов на иммунный ответ после инфицирования инбредных мышей вирусами Ласса и Мачупо.

Научная новизна работы. Впервые изучена чувствительность к вирусу Мачупо (штамм Carvallo) различных линий мышей. Отобрана экспериментальная модель - высокочувствительные инбредные мыши линии BALB/c.

Впервые изучены иммунологические и клинико-патоморфологические особенности экспериментальной инфекции инбредных мышей, вызванной вирусом Мачупо.

Впервые изучена динамика неспецифических факторов иммунитета (ФНО, ИЛ-1, ИФН и НК) при экспериментальных инфекциях у инбредных мышей, вызванных вирусами Мачупо и Ласса.

Впервые изучено влияние препаратов десферал (ДФО), ридосгана. специфического гамма-глобулина и анти-ФНО сьшоротки на течение экспериментальной инфекции инбредных мышей, вызванной вирусами Мачупо.

Впервые изучено влияние препаратов десферал (ДФО), антагониста рецептора ИЛ-1 и анги-ФНО сыворотки на течение экспериментальной инфекции инбредных мышей, вызванной вирусом Ласса.

Практическая значимость работы. Результаты диссертационной работы позволяют рекомендовать мышей линии BALB/c и CBA/CaLac для оценки влияния имммунобиологических препаратов на активность некоторых медиаторов иммунного ответа при экспериментальных инфекциях у инбредных мышей, вызванных вирусами Мачупо и Ласса, соответственно.

Получен Патеяг РФ R.U 2029561 С1 'Способ получения концентратов вирусов, вызывающих геморрагические лихорадки и обладающих иммуногенной и протекшвной активностью", приоритет.от 14.10.91, № 5004595/14, решение о выдаче 27.02.95.

_ Штамм Carvallo вируса Мачупо депонирован в музее вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского (депонент ГКВ № 922 от 12 апреля 1991 г.).

Апробация работы. Полученные результаты были представлены на: International Symposium "100 Years ofVirology" (Moscow, 1992), IX International Congress of Virology (Glasgow, Scotland, 1993), Российской Научной Конференции "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций" (Саратов, 1993), Seventh International Conference on Antiviral

Research (Charlstone, USA, 1994), Third Congress of the European Society for Veterinary Virology (Interlaken, Switzerland, 1994), Eighth International Conference on Antiviral Research (Santa Fe, USA. 1995), "New Approaches to Vaccine Development" (NAVD'95) (Vienna, Austria, 1995), Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene Residential Meeting (Cambridge, UK, 1996). В завершенном виде диссертационная работа доложена на заседании научного семинара НИИ молекулярной биологии ГНЦ ВБ "Вектор" 4 сентября 1996 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения и четырех глав: Обзор литературы (Глава 1), Материалы и методы (Глава 2), Результаты исследований (Глава 3), Обсуждение результатов (Глава 4), выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 151 странице машинописного текста. Иллюстрирована 13 таблицами и 22 рисунками. Библиография представлена 199 источниками отечественных и зарубежных авторов.

Использованные сокращения: БГЛ - Боливийская геморрагическая лихорадка; БОЕ - бляшкообразующая единица; ИЛ-1 - интерлейкин-1; и.с. -индекс стимуляции; ИФА - иммуноферменхный анализ; ИФН - интерферон; Кон А - конканавалин А; НК - натуральные киллеры; РБТЛ - реакция бласгаой трансформации лимфоцитов; СПЖ - средняя продолжительность жизни павших животных (сут.); ФНО - фактор некроза опухоли; IL- Ira -антагонист рецептора ИЛ-1.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Вирусные препараты. В работе использовали вирусы Мачупо (нггамм Carvallo) и Ласса (штамм Josiah). В качестве тест-вируса для титрования ИФН использовали вирус энцефаломиокардита мышей (EMQ.

Культуры клеток. Для культивирования вирусов Мачупо и Ласса использовали культуры клеток Л-68, Е6 (клон Vero) и 4647. Для определения продукции ИФН в шггопатическом тесте, использовали культуру клеток L-929. Для оценки активности НК в качестве клеток-мишеней использовали культуры клеток К-562 или YAC-1.

Животные. В работе были использованы 30 - 40-суточные аутбредные морские свинки массой 200 - 250 г, инбредные мыши линий BALB/c, С57В1/6, CBA/CaLac, СЗН/Snell (возраст 24 - 48 ч, 3 - 4 недели и 2 - 3 месяца), сосунки аутбредных мышей (возраст 24 - 48 ч).

Коммерческие препараты. В качестве гетерогенного неспецифического антигена при постановке РБТЛ использовали вакцину клещевого энцефалита (производство Инсттуга полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН (г. Москва. Россия)). В экспериментах была изучена противовирусная активность и влияние на показатели неспецифического иммунитета препаратов:

- Ридосгин (производства НИКТИ БАВ ГНЦ ВиБ "Вектор");

- специфический гамма-глобулин (полученный из сыворотки крови иммунизированных вирусом Мачупо коз, методом спиртового осаждения на холоду);

- Десферал (deferoxamin. methansulfonic. - ДФО производства CIBA - GEIGY Limited (Switzerland));

- анти-ФНО-а сыворотка (полученная иммунизацией морских свинок препаратом рекомбинангного ФНО-á мыши (производства Boehrmger Mannheim (Austria));

- рекомбинангный антагонист рецептора ИЛ-1 (IL-lra), любезно предоставленный доктором A. Steinkasserer (Brunei University, -The University of West London, U.K.).

Для заражения животных, проведения ИФА и в качестве специфического антигена при постановке РБТЛ использовали культуральные антигены

вирусов Мачупо и Ласса, сконцентрированные с использованием ультрафильтрашонного плоскорамного модуля (НПК "Биотехнолог", г. Новосибирск) и очищенные в градиенте плотности сахарозы, с элекгрофоретической чистотой не менее 90% и . содержанием специфического белка не менее 2,0 мкг/мл.

Определение биологической активности вируса проводили методом негативных колоний под агаровым покрьггием (Porterfield and Allison, 1960).

Для исследования показателей клеточного иммунитета использовали РБТЛ, которую проводили по методике, описанной Хоробрых и др. (1983).

.Активность ИЛ-1 в исследуемых сыворотках определяли по показателям пролиферации тимошттов мышей линии C3H/Sn.

Активность НК оценивали в радиометрическом тесте с 3Н-уридином. используя в качестве клеток-мишеней клетки миелолейкоза человека К-562 или YAC-1 (Рыкова идр., 1981).

Продукцию ИФН определяли в цигопатическом тесте,' используя методику подавления цитопатического действия тест-вируса ЕМС на культуре клеток L-929 (Григорян и др., 1988).

Содержание ФНО-а в сьторотке крови мьппей определяли с помощью диагностического набора "Quantikine Mouse TNF-a" (R&D Systems, USA) в соответствии с инструкцией по применению.

Статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятым методом (Ашмарин и Воробьев, 1962).

Результаты исследований.

Восприимчивость линейных мышей при экспериментальном заражении вирусами Ласса и Мачупо.

По нашим данным, оппозитными по чувствительности к внутримозговому заражению вирусом Ласса (ппамм Josiah) являются мыши линии CBA/CaLac, показавшие 100%-ную летальность и мыши линии BALB/c,

оказавшиеся резистентными к данной инфекции. Животные линии С57В1/6 имели промежуточные значения в чувствительности.

При заражении вирусом Мачупо (штамм Сал/аЛо) 100%-ная летальность наблюдалась у мышей линии ВА1_В/с, в противоположность мышам линии С57В1/6, оказавшимся резистентными к инфицированию. При этом животные линий СВА/СаЬас и СЗШЗпеЦ имели промежуточные значения в чувствительности (Таблица 1).

Таблица I

Чувствительность мышей различных линий к внутримозговому заражению вирусами Ласса и Мачупо (доза 1000 БОЕ)

Вирус Линия мышей (Гаплотип)

ВАЬВ/с (Н-М) СВАУСаЬас (Н-2к) СЗН/Бпей (Н-2к) С57ВУ6 (Н-2Ь)

% Ласса павших животных (М+т) 0 100+0.0 62+10.6

СПЖ (сут.) (М+т) и.о. 7,2+0,2 6.7+1,2

% Мачупо павших ЖИВОТНЫХ (М+т) 100,0±0,0 62.5+10.8 61.0+10.5 0

СПЖ (сут.) (М+т) 9,5+0,2 9,8+1,3 9.1+0.2 н.о.

Известна важная роль путей инфицирования в патогенезе вирусных заболеваний, поэтому нами было проведено изучение чувствительности мышей различных линий к заражению вирусами Ласса и Мачупо, при внугримозговом, внутрибрюшинном ■ и интраназальном способах инфицирования (Таблица 2). Полученные результаты показали, что наибольшей чувствительностью обладают животные, зараженные внутримозговым и интраназапьным способами.

Таблица 2

Чувствительность инбредных мышей к вирусам Ласса и Мачупо при различных способах инфицирования (доза 1000 БОЕ)

Линия % павших животных (М±т)

мышей Вирус Способ инокуляции

(Гаплотип) Интра-назальный Интра- Интра-церебральный перитонеальный

ВАЬВ/с Ласса 0 0 0

(Н-2с1) Мачупо 100,0+0.0 100.0+0.0 0

С57В1/6 Ласса 51.5+11,9 53,6+9,1 0

(Н-2Ь) Мачупо 0 0 0

СВА/СаЬас Ласса 100,0+0,0 100,0+0,0 0

(Н-2к) Мачупо 51,5+11,4 62,5+10,8 0

СЗН/ЗпеП (Н-2к) Мачупо 60,6+10,7 61,0+10,5 0

Полученные нами результаты показали, что при заражении животных в возрасте старше 2-х месяцев наблюдается снижение чувствительности к заражению, как вирусом Ласса, так и Мачупо. Поэтому нами использовались половозрелые мыши 3 - 4-х недельного возраста.

Результаты изучения динамики накопления вируса Ласса в органах мышей линии СВ А/СаЬас после внутримозгового заражения дозами 100 и 1 ООО БОЕ показывали (Таблица 3), что во время развитая заболевания не наблюдается увеличения концентрации вируса в органах на 5 - 7 сутки. Также не наблюдается достоверного различия в концентрациях вируса в органах и СПЖ павших животных при заражении дозами как 100, так и 1000 БОЕ.

Сходные результаты были получены при изучении- динамики накопления вируса Мачупо в головном мозге и селезенке мышей линий ВАЛВ/с посте внутримозгового заражения дозами 100 и 1000 БОЕ (Таблица 4).

При этом, проведенные совместно с доктором Перебоевой Л.А. патоморфологичесхие исследования головного мозга, селезенки и печени у мышей, инфицированных вирусами Ласса и Мачупо, показали, что при достаточно широкой вовлеченности различных органов в инфекционный

Таблица 3

Динамика накопления вируса Ласса з органах мышей линии СВА/СаЬас при внутримозговом заражении

Доза Время после Концентрация вируса в СПЖ

инфицирования 1одш БОЕ/мл (М+т) (сут.)

БОЕ (час) головной мозг селезенка (М+т)

1000 24 н.о. н.о. 7,81+0,05

72 4,0+0,3 3,2+0,5

120 " 5,4+0,2 5,2+0,1

168 5,3+0.3 5,4+0.2

100 24 н.о. н.о. 8,00+0,12

72 3,7+0,4 3,0+0.2

120 4.9+0.3 4,7+0,4

168 5,2+0.4 5.0+0.1

Таблица 4

Динамика накопления вируса Мачупо в органах мышей линии ВАЬВ/с при внутримозговом заражении

Доза Время после инфицирования Концентрация вируса в 1о§ю БОЕ/мл (М+т) СПЖ (сут.)

БОЕ (час) головной мозг селезенка (М+т)

1000 24 н.о. н.о. 9,51+0,25

72 2,0+0,3 1,6+0.5

120 3,6+0,2 3,0+0,1

168 5,0+0,4 4,6+0,2.

216 5.6+0,5 5,0+0.4

100 24 н.о. н.о. 9,80+0,12

72 1.7+0,4 1.4+0,2

120 3.5+0.3 2,7 г0,4

168 5.2+0,4 4,5+0.1

216 5,4+0.5 5.1+0.2

процесс, трудно выделить тот орган-" мишень", функциональная недостаточность которого могла бы стать причиной гибели животного. При этом гибель мышей, зараженных интрацеребрально, как вирусом Ласса, так и вирусом Мачупо, по-видимому, наступает при отеке мягких мозговых

оболочек, что может быть следствием не только разложения вируса в головном мозге, но и иммунопатологической реакцией организма.

Изменения показателей неспецифического иммунитета при экспериментальных инфекциях у мышей различных линий, вызванных вирусами Ласса и Мачупо.

Поскольку чувствительность мышей связана с их генотипом, можно предположить, что и реакция иммунной системы, при заражении животных оппозитных линий, будет отличаться между собой.

Известно, что резистентность к вирусным инфекциям связана как с иммуноспецифическими, так и неспецифическими механизмами. Неспецифическая резистентность проявляется через активность таких факторов как система комплемента, ИФН, ИЛ-1, ФНО и других цигокинов. так и посредством макрофагов и натуральных киллеров и играет большую роль на ранних стадиях инфекции в случае отсутствия иммунной памяти.

Кроме того, имеющиеся данные клинических наблюдений, полученные различными исследователями, как при геморрагических лихорадках у людей,' так и в экспериментах на животных указывают на негативное прогностическое значение высоких показателей продукции интерферона и фактора некроза опухоли, которые приводят к возникновению так называемого "эндогенного шока".

На рис. 1 представлены результаты, полученные при изучении динамики продукции сывороточного ИФН, ИЛ-1, ФНО и активности НК у мышей оппозитных линий после внутримозгового инфицирования вирусом МачуПо (доза 1000 БОЕ). Различная динамика изучаемых факторов у мышей оппозитных линий позволяет сделать вывод о достаточно выраженной активации неспецифических факторов иммунитета у мышей линии ВАЬВ/с. С другой стороны, у мышей линии С57В1/6, резистентных к заражению вирусом Мачупо, максимальные значения активности медиаторов иммунного ответа наблюдались в первые сутки после заражения вирусом.

10000 :

1000 ■

ИФН

с

i100í X

10 ±

1 I 111 I 1 1111

2,0 т

1,5 --

Л 1,0 --

0,5

1 4 24 72 120 16$ 216 ФНО Т

0,0

■ Н ; I

ilJÜL

I I

л.

0 24 72 120 168 216 Время после инфицирования (ч)

60 т

50 --

Е40 +

ц

S 30 --

нк

• ■ X

20::| ю 4-*-

I

I

4,0

1 4 24 72 120 163 216

I ип'1 Т I

3,0 --

2,0-

1,0 --

0,0

1

X

т

i 111 I 111 1 111 I

О 24 72 120 16« 216 Время после инфицирования (ч)

I ВА1.В/С |,„ 1С57В1/6---контроль ВАЬВ/с .....- контроль С57В1/6

Г

Рис.1. Динамика продукции ИФН, ФНО, ИЛ-1 и активности НК у мышей

линий ВАЬВ/с и С57В1/6 после внутримозгового заражения вирусом Мачупо.

При изучении динамики активности неспецифических факторов иммунитета у мышей оппозитных линий после внутримозгового заражения вирусом Jlacca наблюдается повышение изучаемых параметров у мышей линии СВ A/CaLac. которое достигает своих максимальных значений на высоте клинических проявлений заболевания, на 5 - 6 сутки, накануне гибели животных. У мышей линии BALB/c, резистентных к заражению вирусом Ласса, отмечалась противоположная картина, когда максимальные показатели отмечались в первые часы посте инфицирования (Рис. 2).

Таким образом, внугримозговое заражение мышей линии BALB/c вирусом Мачупо и мышей линии CBA/CaLac вирусом Ласса заканчивается гибелью животных. Этому предшествует развитие воспаления, при котором наблюдается значительное повышение продукции ИЛ-1, ФНО и ИФН. Взаимосвязь высокой активности этих факторов неспецифического иммунитета с клиникой заболевания указывает на возможную причину гибели животных - "эндогенный шок".

Такое состояние наиболее изучено при инфекциях, вызванных грамм-отрицательными бактериями. При этом, развитие шока сопровождается резким увеличением продукции ФНО и ИЛ-1. Возможность лечения этого состояния была показана при использовании специфических антител к ФНО и антагониста рецептора ИЛ-1 (IL- Ira).

Поэтому можно предположить, что влияя на активность этих цитокинов при экспериментальных инфекциях, вызванных вирусами Ласса и Мачупо, можно влиять и на течение инфекционного процесса.

Экспериментальное изучение возможности лечения и экстренной профилактики инфекций у линейных мышей, вызванных вирусами Ласса и Мачупо.

В таблице 5 представлены результаты изучения влияния анга-ФНО-а сыворотки (препарат вводили внутривенно в объеме 100 мкл/мышь) и IL-1га (вводили внутрибрюишнно в дозе 100 мг/кг) на течение экспериментальной

2,0 r

1,5 --

С

-I 1,0 --

1 4 24 72 120 168 ОНО

0,5--

TÍI | fn , Ítt i Irr , ln

0[0 ITT | П | III I ITT | 1П | ITT I 1П | O 1 12 24 72 120 168 Время после инфицирования (ч)

1 4 24 72 120 168

4,0 -

3,0 --

2,0 +

S

ИЛ-1

1,0 --

0,0

¿Er.

I ■" I

5-: 'I

i ■" i

О 24 72 120 168 Время после инфнцироэчнкя (ч)

■■ СВ А/СаЦас I I ВДЦВ/с---контроль СВА/Саиас......контроль ВА1_В/с

Рис.2. Динамика продукции ИФН, ФНО, ИЛ-1 и активности НК у мышей линий СВАУСаЬас и В АЛ В/с посте внутримозгового заражения вирусом Ласса.

Влияние анти-ФНО сыворотки и антагоииста рецептора ИЛ-1 (IL-Ira) па течение экспериментальной инфекции у мышей линии CBA/CaLac, вызванной вирусом Ласса

иыжшшше/ % СПЖ сутки концентрация вируса и органах содержание активность

наблю- (Los ш/мл) IIJI-I

препарат всего защиты (сут) дения мозг селезенка сыворотка ФИО (ш /мл) (u.c.)

контроль 0/20 0 7.7 0 11.0 н.о л.о <0.03 1.0

вирус Ласса 5 5.4+0.2 5.2+0.1 4.8+0.2 1.26 3.2

7 5.3+0.3 5.4+0.2 4.6+0.2 1.44 3.0

анти- 6/20 30 8.9 0 II.о 11.о н.о <0.03 1.0

ФПО 5 5.3+0.2 5.2+0.1 4.8+0.2 1.26 3.?

сыворотка 7 5.2+0.1 5.0+0.2 4.2+0.2 1.00 3.0

21 н.о н.о н.о <0.03 1.0

нормальная 0/20 0 7.6 0 н.о н.о 11.о <0.03 1.0

сыворотка 5 5.4+0.2 5.2+0.1 4.8+0.2 1.26 3.2

1 5.3+0.3 5.4+0.2 4.6+0.2 1.44 3.0

IL-1га 7/10 70 7.6 0 н.о п.о н.о <0.03 1.2

5 5.0+0.1 5.0+0.1 4.5+0.5 1.18 3.0

7 4.6+0.2 4.6+0.1 4.0+0.2 0.59 2.0

21 н.о н.о н.о 0.06 1.6

Примечания: и.о.,- не определяется; препараты вводились на 5, 6, 7 и 8 сутки после заражения

инфекции у мышей СВА/СаЬас, вызваной вирусом Ласса. При этом наблюдалось снижение концентраций ФНО, уменьшение активности ИЛ-1, происходило увеличение процента выживших животных и удлинение СПЖ погибших животных.

Аналогичный эффект наблюдался при изучении влияния анти-ФНО-а сыворотки на течение экспериментальной инфекции у мышей ВАЬВ/с, вызванной вирусом Мачупо (Таблица 6).

Эти результаты указывают на заметную роль ФНО и ИЛ-1 в патогенезе экспериментальных инфекций, вызванных вирусами Ласса и Мачупо.

В наших экспериментах для экстренной профилактики заболевания, вызываемого вирусом Мачупо, были использованы индуктор ИФН -ридостин (который вводили интраназально или внугрибрюшинно в дозе 50 мкг/мышь) и специфический иммуноглобулин (который вводили внутримышечно в объеме 400 мкл/мышь).

На рис. 3 представлены результаты предварительных экспериментов на интакгных животных по изучению динамики изменения продукции ИФН, ФНО, ИЛ-1 и активности НК у мышей линии ВАЬВ/с посте интраназапьного заражения (100 БОЕ) вирусом Мачупо, после внутрибрюшинного и шпраназального введения ридостина и гамма-пгобулина внугрибрюшинно. При инграназальном введении ридостина максимальная продукция ИФН, ФНО, ИЛ-1 и активность НК наблюдались в первые часы поете введения препарата. При внутрибрюшинном введении ридостина наиболее высокие показатели определялись в первые сутки посте введения. При введении гамма-глобулина максимальные показатели изучаемых медиаторов наблюдались в более поздние сроки, на 2 - 3 сутки.

Поете шпраназального заражения мышей линии ВА1.В/С вирусом Мачупо наблюдалось развитие заболевания с характерными симптомами, максимум которых отмечался на 7 - 8 сутки после инфицирования (при этом табель наступала через 9-10 суток после заражения).

Влияние анти-ФНО сыворотки на течение экспериментальной инфекции у мышей линии ВАЬВ/с, вызванной вирусом Мачупо

NN группы выжившие/ % СПЖ сутки концентрация вируса в органах содержание активность ИЛ-

наблю- (Ьов ю/мл) 1

препарат всего защиты (сут) дения мозг селезенка сыворотка ФНО (нг/мл) (н.с.)

1 0/20 0 9.8 0 н.о н.о н.о <0.03 1.0

контроль 7 5.0+0.5 4.6+0.4 4.0+0.5 1.35 3.5

5.6+0.5 5.0+0.5 4.6+0.4 1.71 3.0

2 7/20 35 10.5 0 н.о н.о н.о <0.03 1.0

анти- 7 5.0+0.5 4.6+0.4 4.0+0.5 1.35 3.5

ФНО 9 5.0+0.5 4.6+0.4 4.0+0.5 1.00 3.0

сыворотка 21 н.о н.о н.о <0.03 1.0

3 0/20 0 9.8 0 н.о н.о н.о <0.03 1.0

нормальная 7 5.0+0.5 4.6+0.4 4.0+0.5 1.35 3.5

сыворотка 9 5.6+0.5 5.0+0.5 4.6+0.4 1.7 3.0

Примечания: н.о. - не определяется; препарат вводился на 7, 8, 9 и 10 сутки после заражения.

3.5

3 -124

_ 2 и

3

- 1,5 1

04

О

ИФН

Дт

2,0 Т

14"

ФНО

ч

-5 1,о--

04-

1 0,0

ТТПттт. ТГпт

I тГпТ

I тпТ

34

3-

24

у

14-

4 24 48 72 16«

Ш1-1

Тт

I

1

Дх

бе-

зо --

.40--

30 - -

20-

10

4 24 48 72 96 168 НК Т

4 24 4« 72 % 168 Время после введения (ч)

4 24 48 72 96 16« Время послг 2 ведения (ч)

Е2Э ридостин (1р) СП ридостин (111) ■■ У-глобулин [ИЗ Мачупо -контроль

Рис.3. Динамика изменения неспецифических факторов иммунитета у мышей линии ВАЬВ/с после введения ридоспша внутрибрюшинно (ридостин (¡р)) и интраназально (ридостин (ш)), гамма-глобулина (У-глобулин) и вируса Мачупо (Мачупо).

При изучении влияния на течение экспериментальной инфекции, вызванной интраназальным заражением вирусом Мачупо, введения через 2 часа после инфицирования ридостина (шпраназально и внутрибрюшинно) и гамма-глобулина (внутрибрюшинно), защита показана только при интраназальном применении ридостина (т.е. аппликаторно на месте инфицирования) (Таблица 7). В наших экспериментах внутрибрюшинное введение как ридостина, так и гамма-глобулина не приводило к защите животных. Клинические проявления заболевания, результаты патоморфологических исследований и концентрация вируса в органах на 7 - 9 сутки не отличались от аналогичных показателей у контрольных животных, зараженных вирусом Мачупо. Напротив, у животных, получивших ридосшн интраназально, не наблюдалось накопления вируса в органах и заметных патоморфологических изменений.

При изучении динамики изменения продукции ИФН, ФНО, ИЛ-1 и ' активности НК у мышей линии BALB/c, инфицированных интраназально вирусом Мачупо, посте введения ридостина и гамма-глобулина, у животных, получивших ридостин интраназально, высокая активность факторов иммунного ответа отмечалась в первые сугки после инфицирования и достигала исходных значений к 7-м суткам после заражения (рис. 4). Динамика изучаемых медиаторов иммунного ответа после внутрибрюшинного применения как ридостина, так и гамма-глобулина не отличалась от контрольной.

Важное значение имеет возможность лечения аренавирусных лихорадок на стадии клинических проявлений заболевания. Поэтому целью нашего исследования было изучение возможности лечения экспериментальных аренавирусных инфекций, вызванных вирусами Ласса и Мачупо, с помощью препарата "Десферал" (десферриоксамин), для которого показана иммуномодулирующая и противрвирусная активность, а также влияние на экспрессию молекул межклеточной адгезии in vitro.

Влияние на течение экспериментальной инфекции у мышеи ВАЬВ/с (вызванной инграназальным заражением вирусом Мачупо (д03'' ЮО БОЕ)) введения рндостииа (интраназально и вцутрибрюшшшо) и гамма-глобулина (инутрибрюшннно) через 2 часа после инфицировании

выжившие/ % с.п.ж. Концентрация вируса в Ьойю БОЕ/мл

препарат всего орган сутки после инфицирования

защиты (сут) 1 3 5 7 9

контроль Мачупо 0/30 0 9,8 мозг селезенка <1 <1 2,0+0,2 1,6+0,2 3,6+0,4 3,0+0,2 5,0+0,5 4,6+0,4 5,6+0,5* 5,0+0,5*

рцдостлн т 27/30 90 9,8 мозг селезенка <1 <1 <1 <1 и.о. и.о. и.о. и.о. н.о. и.о.

ридостии ¡р 5/30 16,6 9,2 мозг селезенка <1 <1 2,0+0,2 1,4+0,5 3,4±0,4 3,0+0,5 4,6+0,4 4,0+0,5 5,0+0,5* 4,5+0,5*

гамма-глобулин 4/30 13,3 9,0 мозг селезенка <1 <1 2,0+0,2 1,6+0,2 3,2+0,5 3,0+0,4 4,2+0,2 4,0+0,5 •5,0+0,5* 4,2+0,5*

Примечании: * - все жинотнмс погибли; и.о. - не определяется.

Время после введения (ч) Время после введения (ч)

ЕЭЗ ридостин (¡р) СЕЛ ридостин (ш) ВЯ У-глобулин I I Мачупо -контроль

Рис.4. Динамика активности неспецифичеких факторов иммунитета у мышей линии ВАЬВ/с, инфицированных ингранаЗально вирусом Мачупо (100 БОЕ) (Мачупо), после введения через 2 ч ридосгина внутрибрюшинно (ридостин (¡р)) и интраназально (ридостин (¡п)), гамма-гаобулина внутрибрюшинно (У-глобулин).

Влияние препарата "Десферал" (ДФО) па течение экспериментальной инфекции у мышей линии ВАЬВ/с, вызванной вирусом Мачупо, и мышей линии СВА/Са^ас, вызванной вирусом Ласса

NN группы выжившие/ % с.н.ж. сутки концентрация вируса в органах содержание активность

наблю- (Ьой ш/мл) ФИО ИЛ-1

препарат всего защиты (сут) дения мозг селезенка сыворотка (нг/мл) (и.с.)

1 0/20 0 7.69 0 11.о н.о н.о <0.03 1.0

контроль 5 5.36+0.24 5.24+0.12 4.8+0.2 1.26 3.2

Ласса 7 5.30+0.30 5.36+0.12 4.6+0.2 1.44 3.0

2 8/20 40 8.62 0 и.о н.о II.о <0.03 1.0

ДФО 5 5,30+0.12 5.24+0.12 4.8+0.2 1.26 3.2

7 5.00+0.12 5.00+0.12 4.0+0.2 1.10 2.8

21 II.о н.о н.о <0.0.3 1.0

3 0/20 0 9.8 0 И.о . н.о 11.о <0.03 1.0

контроль - 7 5.0+0.5 4.6+0.4 4.0+0.5 1.35 3.5

Мачупо 9 5.6+0.5 5.0+0.5 4.6+0.4 1.71 3.0

4 9/20 45 10.6 0 н.о но н.о <0.03 1.0

ДФО 7 5.0+0.5 4.6+0.4 4.0+0.5 1.35 3.5

. 0 5.0+0.5 4.6+0.4 4.0+0.5 1.10 2.8

21 н.о н.о II. о <0.03 1.0

Примечание: препарат вводился ипугрибрюшинмо и дозе 5 мкг/жииотное при заражении мышей лшшн ВАЬВ/с на 7, 8, 9 и 10 сутки после инфицирования и при заражении мышей линии СВА/СаЬас на 5, 6, 7 и 8 сутки после инфицирования.

При изучении влияния ДФО на течение экспериментальной инфекции у мышей, чувствительных, к заражению вирусами Ласса и Мачупо, наблюдалось снижение концентраций ФИО и уменьшение активности ИЛ-1, при этом происходило удлинение СПЖ погасших животных и увеличение процента выживших животных, как при заражении вирусом Ласса, так и вирусом Мачупо (Таблица 8).

Таким образом, выбор средств лечения при аренавирусных геморрагических лихорадках должен основываться не только на оценке противовирусной активности препарата, но и на его влиянии на показатели иммунитета, которые играют важную роль при этих инфекциях.

Выводы

1. Впервые показано, что среди мышей различных линий, отличающихся по гаплотилам основного комплекса гистосовместимосги, существуют линии оппозшные по чувствительности к внугримозговому заражению вирусом Мачупо (штамм Carvallo) - наиболее восприимчивая линия BALB/c (гаплотип H2d, легальность 100%) и резистентная линия С57В1У6 (гаплотип Н2Ь, легальность 0%).

2. В экспериментах ца инбредных мышах показано, что в иммунопатогенезе инфекций, вызванных вирусами Ласса и Мачупо, важную роль играют неспецифические факторы иммунитета, такие как ФНО и ИЛ-1.

3. Показана возможность лечения экспериментальной аренавирусной инфекции у мышей линии CBA/CaLac, вызванной внутримозговым заражением вирусом Ласса, внутривенным введением'анга-ФНОга сыворотки и внутрибрюшинным введением антагониста рецептора ИЛ-1.

4. Показана возможность лечения экспериментальной аренавирусной инфекции у мышей линии BALB/c, вызванной внутримозговым заражением вирусом Мачупо, внутривенным введением анти-ФНО-а сыворотки.

5. Показана возможность экстренной профилактики экспериментальной аренавирусной инфекции у мьппей линии BALB/c, вызванной

шпраназальным инфицированием вирусом Мачупо, при аппликаторном введении индуктора интерферона ''Ридосгин" на место инфицирования.

6. В экспериментах на инбредных мьппах показана возможность лечения инфекций, вьпванных внугримозговым заражением вирусами Ласса и Мачупо, при внутрибрюшинном введении препарата 'Десферал".

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Твердохлебов A.B., Калиберов С.А., Зайцева В.Н., Кузьмин В.А., Красько А.Г., Игнатьев Г.М. Получение концентрированных препаратов вируса Мачупо // Вопр. вирусол. - 1992. - т.37, №1.- 72-73.

2. Игнатьев Г.М., Твердохлебов A.B., Калиберов С.А., Перебоеаа Л.А., Патрушева И.В., Кашешева Е.А. Показатели иммунитета при заражении мышей различных линий мышей вирусом Мачупо II Вопр. вирусол. - 1993. -38(4). -167-170.

3. Игнатьев Г.М., Твердохлебов A.B., Калиберов CA., Патрушева И.В.. Кашенцева Е.А., Воробьева М.С. Показатели иммунитета у мышей линии BALB/c, иммунизированных инактивированным антигеном вируса Мачупо // Вопр. вирусол. -1993. -Т.38, №5. - 227-230.

4. Игнатьев Г.М., Калиберов С.А., Перебоева Л.А., Твердохлебов A.B., Красько А.Г., Годнева А.Т. Изучение некоторых показателей иммунитета при заражении мышей линии CBA/CaLac вирусом Ласса // Вопр. вирусол. - 1994. -т.39, №6. - 324-327.

5. Агафонов А.П., Стрельцова М.А.. Игнатьев Г.М., Твердохлебов A.B.. Чепурнов A.A., Калиберов С.А., Кузьмин В.А., Черный Н.Б. Способ получения концентратов вирусов, вызывающих геморрагические лихорадки и обладающих иммуногенной и протективной активностью // патент РФ RU 2029561 С1, от 27.02.95.

6. Калиберов С.А.. Игнатьев Г.М.. Перебоева Л.А., Кашенцева Е.А. Экспериментальное изучение возможности экстренной профилактики

Боливийской геморрагической лихорадки II Вопр. вирусол. - 1995. - т.40, №5. -211-215.

7. Ignatyev G.M., Kaliberov S.A., Godneva А.Т., Tverdokhlebov A.V., Pereboeva LA.. Patrusheva I.Y., Kashentseva H.A. Immunity parameters in mice of different lines infected with Machupo or Lassa viruses /I Proc. 3rd Congress Europ. Soc. Vet. Virol. -1995. - 250-253.

8. Игнатьев Г.М., Кашенцева E.A., Калиберов C.A., Прозоровский Н.С. Экспериментальное изучение влияния препарата десферал и сыворотки против фактора некроза опухоли на течение инфекционного процесса при аренавирусных геморрагических лихорадках // Ангабиот. химиотерап. - 1996. -