Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль неспецифических факторов иммунитета при экспериментальных аренавирусных инфекциях, вызванных вирусами Ласса и Мачупо

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Роль неспецифических факторов иммунитета при экспериментальных аренавирусных инфекциях, вызванных вирусами Ласса и Мачупо"

на правах рукописи

РОЛЬ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ИММУНИТЕТА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ АРЕНАВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ, ВЫЗВАННЫХ ВИРУСАМИ ЛАССА И МАЧУПО

03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово- 1996

Работа выполнена в НИИ молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" Минздрава РФ

Научный руководитель: кандидат медицинских наук Г.М. Игнатьев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Б.И. Масычева

кандидат биологических наук A.B. Таранин

Ведущая организация:

Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. JI.A. Тарасевича, Минздрава РФ, г. Москва

Защита состоится "2& " декабря 1996 г. в _часов на заседании

диссертационного совета Д 074.20.01 Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" по адресу: 633159, Новосибирская область, пос. Кодьцово.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ "Вектор".

<м

Автореферат разослан "__ " ноября 1996 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Аренавирусы Ласса и Мачупо являются возбудителями острых инфекционных заболеваний человека, лихорадки Ласса и Боливийской геморрагической лихорадки (БГЛ), соответственно. Несмотря на то, что ареал распространения вируса Мачупо ограничен северовосточными районами Боливии, а вируса Ласса - странами Западной и Центральной Африки, эти возбудители, в связи с расширением экономических отношений и развитием туризма, могут представлять реальную опасность и для неэндемичных территорий.

В Западной Африке ежегодно выявляются более 250 ООО случаев

t

инфицирования людей вирусом Ласса. Заболевание характеризуется тяжелым течением и высокой смертностью (свыше 5 ООО случаев в год). При этом в эндемичных районах выявляется высокий уровень (25 - 55%) здоровых людей, имеющих антитела к вирусу Ласса, что свидетельствует о наличии стертых.

\

субклинических форм данного заболевания. В отличие от лихорадки Ласса. при БГЛ не наблюдается большого количества заболевших людей. Однако, спорадические случаи возникновения этой лихорадки характеризуются высокой легальностью (до 80%), что указывает на сохраняющуюся опасность этого заболевания в эндемичных районах.

Специфическая терапия геморрагических лихорадок основана, главным образом, на использовании рибавирина и иммунной плазмы, полученной от переболевших людей. Однако, результаты применения как иммунной плазмы, так и рибавирина для лечения аренавирусных лихорадок противоречивы и не могут однозначно свидетельствовать о достаточной эффективности такого лечения.

Поэтому сохраняется актуальной проблема поиска новых средств терапии и скрининг пригодных для этой цели препаратов должен быть основан на использовании адекватной модели заболевания.

В послеянее время появились убедительные данные о важной роли некоторых шггокинов в иммунолатогенезе различных геморрагических лихорадок и их участии в возникновении шокового состояния при бактериальных и вирусных инфекциях.

В згой связи вызывает интерес изучение роли факторов неспецифичеосого иммунитета в развитии экспериментального заболевания и возможности лечения инфекций, вьпванных вирусами Ласса и Мачупо, у мышей различных линий.

Целью настоящей диссертационной работы являлось изучение чувствительности инбреяных мышей к заражению вирусами Ласса и Мачупо, выбор линии мышей и оценка активности факторов неспецифического иммунитета и влияния некоторых препаратов на течение экспериментальных инфекций, вызванных этими вирусами.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить чувствительность инбреяных мышей различных линий к заражению вирусами Ласса и Мачупо и охарактеризовать иммунопатологические особенности течения у них экспериментальных инфекций.

2. Изучить изменения продукции ФНО, ИФН (в головном мозге и сыворотке крови) и ИЛ-1, изучить изменение активности НК при экспериментальных инфекциях, вызванных вирусами Ласса и Мачупо.

3. Изучить влияние иммунобиологических препаратов ка иммунный ответ после инфицирования инбредных мышей вирусами Ласса и Мачупо.

Научная новизна работы. Впервые изучена чувствительность к вирусу Мачупо (штамм Carvallo) различных линий мышей. Отобрана экспериментальная модель - высокочувствительные инбредные мыши линии BAJLB/c.

у

Впервые изучены иммунологические и клинико-патоморфологические особенности экспериментальной инфекции инбредных мышей, вызванной вирусом Мачупо.

Впервые изучена динамика неспецифических факторов иммунитета (ФНО, ИЛ-1, ИФН и НК) при экспериментальных инфекциях у инбредных мышей, вызванных вирусами Мачупо и Ласса.

Впервые изучено влияние препаратов десферал (ДФО), ридостина, специфического гамма-глобулина и анга-ФНО сыворотки на течение экспериментальной инфекции инбредных мышей, вызванной вирусами Мачупо.

Впервые изучено влияние препаратов десферал (ДФО), антагониста рецептора ИЛ-1 и анги-ФНО сыворотки на течение экспериментальной инфекции инбредных мышей, вызванной вирусом Ласса.

Практическая значимость работы. Результаты диссертационной работы позволяют рекомендовать мышей линии BALB/c и CBA/CaLac для оценки влияния имммунобиологических препаратов на активность некоторых медиаторов иммунного ответа при экспериментальных инфекциях у инбредных мышей, вызванных вирусами Мачупо и Ласса, соответственно.

Получен Патйгг РФ RU 2029561 С1 'Способ получения концентратов вирусов, вызывающих геморрагические лихорадки и обладающих иммуногенной и протективной активностью", приоритет от 14.10.91, МЬ 5004595/14, решение о выдаче 27.02.95. '

Штамм Carvallo вируса Мачупо депонирован в музее вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского (депонент ГКВ № 922 от 12 апреля 1991 г.).

Апробация работы. Полученные результаты были представлены на: International Symposium "100 Years of Virology" (Moscow, 1992), IX International Congress of Virology (Glasgow, Scotland, 1993), Российской Научной Конференции "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций" (Саратов. 1993), Seventh. International Conference on. Antiviral

Research (Chartstone, USA, 1994), Third Congress of the European Society for Veterinary Virology (Interlaken, Switzerland, 1994), Eighth International Conference on Antiviral Research (Santa Fe, USA, 1995), "New Approaches to Vaccine Development" (NAVD'95) (Vienna, Austria, 1995), Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene Residential Meeting (Cambridge. UK, 1996). В завершенном виде диссертационная работа доложена на заседании научного семинара НИИ молекулярной биологии ГНЦ ВБ "Вектор" 4 сентября 1996 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения и четырех глав: Обзор литературы (Глава 1), Материалы и методы (Глава 2), Результаты исследований (Глава 3), Обсуждение результатов (Глава 4), выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 151 странице машинописного текста. Иллюстрирована 13 таблицами и 22 рисунками. Библиография представлена 199 источниками отечественных и зарубежных, акторов.

Использованные сокращения: БГЛ - Боливийская геморрагическая лихорадка; БОЕ - бляшкообразующая единица; ИЛ-1 - ингерлейкин-1; и.с. -индекс стимуляции; ИФА - иммуноферменгный анализ; ИФН - интерферон; Кон А - конканавалин А; НК - натуральные киллеры; РБТЛ - реакция бласгаой трансформации лимфоцитов; СПЖ - средняя продолжительность жизни павших животных (сут.); ФНО - фактор некроза опухоли; IL-lra -антагонист рецептора ИЛ-1.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Вирусные препараты. В работе использовали вирусы Мачупо (штамм Carvallo) и Ласса (штамм Josiah). В качестве тест-вируса для титрования ИФН использовали вирус энцефаломиокардита мышей (EMQ.

Культуры клеток. Для культивирования вирусов Мачупо и Ласса использовали культуры клеток Л-68, Е6 (клон Vero) и 4647. Для определения продукции ИФН в цетопатическом тесте, использовали культуру клеток L-929. Для оценки активности НК в качестве клеток-мишеней использовали культуры клеток К-562 или YAC-1.

. ЙСивотные. В работе были использованы 30 - 40-суточные ауторедные морские свинки массой 200 - 250 г, инбредные мыши линий BALB/c. С57В1/6, CBA/CaLac, СЗН/Sneä (возраст 24 - 48 ч, 3 - 4 недели и 2 - 3 месяца), сосунки аутбредных мышей (возраст 24-48 ч).

Коммерческие препараты. В качестве гетерогенного неспецифического антигена при постановке РБТЛ использовали вакцину клещевого энцефалита (производство Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН (г. Москва, Россия)). В экспериментах была изучена противовирусная активность и влияние на показатели неспецифического иммунитета препаратов:

- Ридосгин (производства НИКТИ БАВ ГНЦ ВиБ "Вектор");

- специфический гамма-глобулин (полученный из сыворотки крови иммунизированных вирусом Мачупо коз, методом спиртового осаждения на холоду);

- Десферал (deferoxamin. methansulfonic. - ДФО производства CIBA - GEIGY ... Limited (Switzerland));

- анги-ФНО-<х сыворотка (полученная иммунизацией морских свинок препаратом рекомбинакгаого ФН0-а мыши (производства Boehringer Mannheim (Austria));

- рекомбинангный антагонист рецептора ИЛ-1 (IL- Ira), любезно предоставленный доктором A. Steinkasserer (Brunei University, The University of West London, U.K.). -

Для заражения животных, проведения ИФА и в качестве специфического антигена при постановке РБТЛ использовали культуратьные антигены

вирусов Мачупо и Ласса, сконцентрированные с использованием ультрафилътрадаонного плоскорамного модуля (НПК "Биотехнолог", г. Новосибирск) и очищенные в градиенте плотности сахарозы, с элекгрофорегической чистотой не менее 90% и содержанием специфического белка не менее 2,0 мкг/мл.

Определение биологической активности вируса проводили' методом негативных колоний под агаровым покрытием (Poiterfield and Allison, 1960).

Для исследования показателей клеточного иммунитета использовали РБТЛ, которую проводили по методике, описанной Хоробрых и др. (1983).

Активность ИЛ-1 в исследуемых сыворотках определяли по показателям пролиферации тимоцигов мышей линии C3H/Sn.

Активность НК оценивали в радиометрическом тесте с 3Н-уридином. используя в качестве клеток-мишеней клетки миелолейкоза человека Коб 2 или YAC-1 (Рыкова и др., 1981).

Продукцию ИФН определяли в. цигопатическом тесте, используя методику подавления цигопатического действия тест-вируса НМС на культуре клеток L-929 (Григорян и др., 1988).

Содержание ФНО-а в сыворотке крови мышей определяли с помощью диагностического набора "Quantikine Mouse TNF-«" (R&D Systems, USA) в соответствии с инструкцией по применению.

Статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятым методом (Ашмарин и Воробьев, 1962).

Результаты исследований.

Восприимчивость линейных мышей при экспериментальном заражении вирусами Ласса и Мачупо.

По нашим ' данным, оппозйтными по чувствительности к внугримозговому заражению вирусом Ласса (пггамм Josiah) являются мыши линии CBA/CaLac, показавшие 100%-ную летальность и мыши линии BALB/c,

оказавшиеся резистентными к данной инфекции. Животные линии С57В1/6 имели промежуточные значения в чувствительности.

При заражении вирусом Мачупо (штамм Carvallo) 100°/^ная летальность наблюдалась у мышей линии BALB/c, в противоположность мышам линии С57В1/6, оказавшимся резистентными к инфицированию. При этом животные линий СВ A/CaLac и СЗН/Snell имели промежуточные значения в чувствительности (Таблица 1).

Таблица 1

Чувствительность мышей различных линий к внутримозговому заражению вирусами Ласса и Мачупо (доза 1000 БОЕ)

Вирус Линия мьппей (Гагоютип)

BALB/c (H-2d) CBA/CaLac (H-2k) СЗН/Snell (H-2k) C57B1/6 (H-2b)

Ласса % павших животных (М±ш) 0 100+0.0 62+10.6

СПЖ (сут.) (М+т) н.о. 7,2+0,2 6.7+1.2

Мачупо » - % павших животных (М+т) 100,0+0,0 62.5+10,8 61.0+10.5 0

. СПЖ (сут.) (М+т) 9,5+0,2 i 9,8+1,3 9,1+0.2 H.O.

Известна важная роль путей инфицирования в патогенезе вирусных заболеваний, поэтому нами было проведено изучение чувствительности мышей различных линий к заражению вирусами Ласса и Мачупо, при внугримозговом, внутрибрюшинном и интраназальном способах инфицирования (Таблица 2). Полученные результаты показали, что наибольшей чувствительностью обладают животные, зараженные внутримозговым и интраназальным способами.

Таблица 2

Чувствительность инбредных мышей к вирусам Ласса и Мачупо при различных способах инфицирования (доза 1000 БОЕ)

Линия % павших животных (М+т)

мышей Вирус Способ инокуляции

(Гаплотип) Ингра- Интра- Иитра-

назальныи церебральный перитонеальный

ВАЬВ/с Ласса 0 0 0

(Н-2ф Мачупо 100.0+0.0 100,0+0,0 0

С57В1/6 Ласса 51,5+11,9 53,6+9,1 0

(Н-2Ь) Мачупо 0 0 0

СВАУСаЬас Ласса 100,0+0,0 100,0+0,0 0

(Н-2к) Мачупо 51,5+11,4 62,5+10,8 0

СЗНУБпеИ Мачупо 60,6+10,7 61,0+10,5 0

(Н-2к)

Полученные нами результаты показали, что при заражении животных в возрасте старше 2-х месяцев наблюдается снижение чувствительности к заражению, как вирусом Ласса, так и Мачупо. Поэтому нами использовались половозрелые мыши 3 - 4-х недельного возраста

Результаты изучения динамики накопления вируса Ласса в органах мышей линии СВА/СаЬас после внутримозгового заражения дозами 100и 1000 БОЕ показьшали (Таблица 3), что во время развития заболевания не наблюдается увеличения концентрации вируса в органах на 5 - 7 сутки. Также не наблюдается достоверного различия в концентрациях вируса в органах и СПЖ павших животных при заражении дозами как 100, так и 1000 БОЕ.

Сходные результаты были получены при изучении динамики накопления вируса Мачупо в головном мозге и селезенке мышей линий ВАЬ-В/с после внутримозгового заражения дозами 100 и 1000 БОЕ (Таблица 4).

При этом, проведенные совместно с доктором Перебоевой Л.А. патоморфологические исследования головного мозга, селезенки и печени у мышей, инфицированных вирусами Ласса и Мачупо, показали, что при достаточно широкой вовлеченности различных органов в инфекционный

Таблица 3

Динамика накопления вируса Ласса в органах мышей линии СВА/СаЬас при внутримозговом заражении

Доза Время после инфицирования Концентрация вируса в 1оею БОЕ/мл (М+т) СПЖ (сут.)

БОЕ (час) головной мозг селезенка (М+т)

1000 24 н.о. н.о. 7,81+0,05

72 ' 4,0+0,3 3,2+0,5

120 5,4+0,2 5,2+0,1

168 5.3+0.3 5,4+0,2

100 24 н.о. н.о. 8,00+0.12

72 3,7+0,4 3,0+0,2

120 4,9+0,3 4,7+0,4

168 5,2+0.4 5.0+0,1

Таблица 4

Динамика накопления вируса Мачупо в органах мышей линии ВАЬВ/с при внутримозговом заражении

Доза Время после инфицирования Концентрация вируса в 1о£ю БОЕ/мл (М+т) СПЖ (сут.)

БОЕ (час) головной мозг селезенка (М+т)

1000 24 н.о. н.о. 9,51+0,25

72 2,0+0,3 1,6+0,5

120 3,6+0,2 3,0+0,1

168 5,0+0,4 4,6+0,2

216 5.6+0,5 5,0+0,4

100 24 н.о. н.о. 9,80+0,12

72 1,7±0,4 1,4+0,2

120 3,5+0,3 2,7+0,4

168 5,2+0,4 4,5+0,1

216 5,4+0,5 5.1+0.2

процесс, трудно выделил, тот орган-" мишень", функциональная недостаточность которого могла бы стать причиной гибели животного. При этом гибель мышей, зараженных шпрацеребрально, как вирусом Ласса, так и вирусом Мачупо, по-видимому, наступает при отеке мягких мозговых

оболочек, что может быть следствием не только размножения вируса в головном мозге, но и иммунопатологической реакшей организма.

Изменения показателей неспецифического иммунитета при экспериментальных инфекциях у мышей различных линий, вызванных вирусами Ласса и Мачупо.

Поскольку чувствительность мышей связана с их генотипом, можно предположить, что и реакция иммунной системы, при заражении животных оппозитных линий, будет отличаться между собой.

Известно, что резистентность к вирусным инфекциям связана как с иммуноспецифическими, так и неспецифическими механизмами. Неспецифическая резистентность проявляется через активность таких факторов как система комплемента. ИФН, ИЛ-1, ФНО и других цитокинов, так и посредством макрофагов и натуральных киллеров и играет большую роль на ранних стадиях инфекции в случае отсутствия иммунной памяти.

Кроме того, имеющиеся данные клинических наблюдений,, полученные различными исследователями, как при геморрагических лихорадках у людей, так и в экспериментах на животных указывают на негативное прогностическое значение высоких показателей продукции интерферона и фактора некроза опухоли, которые приводят к возникновению так называемого "эндогенного шока".

На рис. 1 представлены результаты, полученные при изучении динамики продукции сывороточного ИФН, ИЛ-1, ФНО и активности НК у мышей оппозкгаых линий поете внутримозгового инфицирования вирусом Мачупо (доза 1000 БОЕ). Различная динамика изучаемых факторов у мышей оппозигньд линий позволяет сделать вывод о достаточно выраженной активации неспецифических факторов иммунитета у мышей линии ВАЬВ/с. С другой стороны, у мышей линии С57В1/6, резистентных к заражению вирусом Мачупо, максимальные значения активности медиаторов иммунного ответа наблюдались в первые супш поете заражения вирусом.

10000 s

1000 i

с

¡2100 -s ï

ИФН

10 ■

1 II!.. III [

l l i

2,0 •

1,5 -•

S

5 1,0 4-

0,5 --

1 4 24 72 120 168 216

ФНО

0,0 ! |

ifT, In

П

0 24 72 120 16» 216 Время после инфицирования (ч)

60

;; 50 --

¿Í0T

3" S 30-

HK -

■ • X 20 --

10 -г

Í

1 4 24 72 120 168 216

4,0 т

3,0 --

а

Í 2.ÛT

1,0 --

или

I т

X

0,0 'г I

х

i i i i

О 24 72 120 163 216 Время после инфицирования (ч)

IBALB/c I_IС57В1/6---контроль BALB/c ......контроль C57BI/6

i

X

Рис.1. Динамика продукции ИФН, ФНО, ИЛ-1 и активности НК у мышей линий BALB/c и С57В1/6 после внутримозгового заражения вирусом Мачупо.

При изучении динамики активности неспецифических факторов иммунитета у мышей оппозитных линий после внугримозгового заражения вирусом Ласса наблюдается повышение изучаемых параметров у мышей линии СВАУСаЬас, которое достигает своих максимальных значений на высоте клинических проявлений заболевания, на 5 - 6 сутки, накануне гибели животных. У мышей линии ВАЬВ/с, резистентных к заражению вирусом Ласса, отмечалась противоположная картина, когда максимальные показатели отмечались в первые часы после инфицирования (Рис. 2).

Таким образом, внутримозговое заражение мышей линии ВАЬВ/с вирусом Мачупо и мышей линии СВА/СаЬас вирусом Ласса заканчивается гибелью животных. Этому предшествует развитие воспаления, при котором наблюдается значительное повышение продукции ИЛ-1, ФНО и ИФН. Взаимосвязь высокой активности эпгих факторов неспецифического иммунитета с клиникой заболевания указывает на возможную причину гибели животных - "эндогенный шок".

Такое состояние наиболее изучено при инфекциях, вызванных грамм-отрицательными бактериями. При этом, развитие шока сопровождается резким увеличением продукции ФНО и ИЛ-1. Возможность лечения этого состояния была показана при использовании специфических антител к ФНО и антагониста рецептора ИЛ-1 (1Ь-1га).

Поэтому можно предположил., что влияя на активность этих цигокинов при экспериментальных инфекциях, вызванных вирусами Ласса и Мачупо, можно влиял, и на течение инфекционного процесса.

Экспериментальное изучение возможности лечения и экстренной профилактики инфекций у линейных мышей, вызванных вирусами Ласса и Мачупо.

В таблице 5 представлены результаты изучения влияния анти-ФНО-а сыворотки (препарат вводили внутривенно в объеме 100 мкл/мышь) и ГЫга (вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг) на течение экспериментальной

10000 =

1000 i

с

¡¡¡100 = 2

ИФН

X

,f

м-

Lf

1 4 24 72 120 163 ФНО

2,0 т

1,5 --

С

5 i.o |

0,5 --

00 | itt | in i ill | IfT 11гт | 1тт | 1п |

О 1 12 24 72 120 168

HK

50 --

с. 40 -• j

s

30 +

20 ■•

н 10

Т

в

I

&

i

1 4 24 72 120 163

4,0 т

3,0 --

Ч 2,0-

1,0

ИЛ-1

Йг.: ::

Время после инфицирования (ч)

0,0 I i I ' I

0 24 72 120 163 Время после инфицирования (ч)

i

1

I

ШМСВА/СаЦас СШ1ВА1.В/с---контроль СВА/Са1.ас......контроль ВА1.В/С

Рис.2. Динамика продукции ИФН, ФНО, ИЛ-1 и активности НК у мышей линий СВ А/СаЬас и ВАЬВ/с после внутримозгового заражения вирусом Ласса.

Влияние анти-ФНО сыворотки и антагониста рецептора ИЛ-1 (1Ь-1га) на течение экспериментальной инфекции у мышей линии СВА/Са1.ас, вызванной вирусом Ласса

выжившие/ % СПЖ сутки концентрация вируса в органах содержание активность

наблю- (1.01» ю/мл) ИЛ-1

препарат всего защиты (сут) дения мозг селезенка сыворотка ФИО (нг/мл) (и.с.)

контроль 0/20 0 7.7 0 и.о н.о Л.о <0.03 1.0

вирус Ласса 5 , 5.4+0.2 5.2+0.1 4.8+0.2 1.26 3.2

7 5.3+0.3 5.4+0.2 4.6+0.2 1.44 3.0

анти- 6/20 30 8.9 0 н.о н.о н.о <0.03 1.0

ФПО 5 5.3+0.2 5.2+0.1 4.8+0.2 1.26 3.2

сыворотка 7 5.2+0.1 5.0+0.2 4.2+0.2 1,00 3.0

21 но н.о н.о <0.03 1.0

нормальная 0/20 0 7.6 0 н.о н.о н.о <0.03 1.0

сыворотка 5 5.4+0.2 5.2+0./ 4.8+0.2 1.26- 3.2

• 7 5.3+0.3 5.4+0.2 4.6+0.2 1.44 3.0

11. -1га 7/10 70 7.6 0 н.о н.о н.о <0.03 1.2

5 5.0+0.1 5.0+0.1 4.5+0.5 1.18 3.0

7 4.6+0.2 4.6+0.1 4.0+0.2 0.59 2.0

21 н.о 11.0 11.0 0.06 1.6

Примечания: и.о.,- не определяется; препараты вводились ни 5, 6, 7 и 8 сутки мосле заражения

инфекции у мышей СВА/Са1_ас, вызваной вирусом Ласса. При этом наблюдалось снижение концентраций ФИО, уменьшение активности ИЛ-1, происходило увеличение процента выживших животных и удлинение СПЖ погибших животных.

Аналогичный эффект наблюдался при изучении влияния анги-ФНО-а сыворотки на течение экспериментальной инфекции у мышей ВАЬВ/с, вызванной вирусом Мачупо (Таблица 6).

Эти результаты указывают на заметную роль ФНО и ИЛ-1 в патогенезе экспериментальных инфекций, вьпванных вирусами Ласса и Мачупо.

В наших экспериментах для экстренной профилактики заболевания, вызываемого вирусом Мачупо, были использованы индуктор ИФН -. ридостин (который вводили инграназально или внутрибрюшинно в дозе 50 мхг/мьаш>) и специфический иммуноглобулин (который вводили внутримышечно в объеме 400 мкл/мышь).

На рис. 3 представлены результаты предварительных экспериментов на интактных животных по изучению динамики изменения продукции ИФН, ФНО, ИЛ-1 и активности НК у мышей линии ВАЬВ/с после инграназального заражения (100 БОЕ) вирусом Мачупо, после внутрибрюшинного и инграназального введения ридосгина и гамма-глобулина внутрибрюшинно. При интраназальном введении ридосгина максимальная продукция ИФН, ФНО, ИЛ-1 и активность НК наблюдались в первые часы после введения препарата. При внутрибрюшинном введении ридосгина наиболее высокие показатели определялись в первые сутки посте введения. При введении гамма-глобулина максимальные показатели изучаемых медиаторов наблюдались в более поздние сроки, на 2 - 3 сутки.

После инграназального заражения мышей линии ВАЬВ/с вирусом Мачупо наблюдалось развитие заболевания с характерными симптомами, максимум которых отмечался на 7 - 8 сутки после инфицирования (при этом гибель наступала через 9-10 суток после заражения).

Влияние анти-ФНО сыворотки на течение экспериментальной инфекции у мышей линии ВАЬВ/с, вызванной вирусом Мачупо

NN группы выжившие/ % СПЖ сутки концентрация вируса в органах содержание активность ИЛ-

наблю- (Ьоя ю/мл) 1

препарат всего защиты (сут) дения мозг селезенка сыворотка ФИО (иг/мл) (и.с.)

1 0/20 0 9.8 0 ».о н.о н.о <0.03 1.0

контроль 7 5.0+0.5 4.6+0.4 4.0+0.5 1.35 3.5

9 5.6+0.5 5.0+0.5 4.6+0.4 1.71 3.0

2 7/20 . 35 10.5 0 л.о н.о и.о <0.03 1.0

анти- 7 5.0+0.5 4.6+0.4 4.0+0.5 1.35 3.5

ФНО 9 5.0+0.5 4.6+0.4 4.0+0.5 1.00 3.0

сыворотка 21 н.о н.о н.о <0.03 1.0

3 0/20 0 9.8 0 11.о н.о н.о <0.03 1.0

нормальная 7 5.0+0.5 4.6+0.4 4.0+0.5 1.35 3.5

сыворотка 9 5.6+0.5 5.0+0.5 4.6+0.4 1.7 3.0

Примечания: и.о. - не определяется; препарат вводился на 7, 8, 9 и 10 сутки после заражения.

Время после введения (ч) Время после бвздсния (ч)

Е2ЕЭ ридостин (1р) СИ ридостин (ш) ■■ У-глобулин СП Мачупо -контроль

Рис.3. Динамика изменения неспецифических факторов иммунитета у мышей линии ВАЬВ/с посте введения ридостина внутрибрюшинно (ридостин (¡р)) и инграназально (ридостин (ш)), гамма-глобулина (Унглобулин) и вируса Мачупо (Мачупо).

При изучении влияния на течение экспериментальной инфекции, вызванной шпраназальным заражением вирусом Мачупо, введения через 2 часа посте инфицирования ридосгина (интраназально и внутрибрюшинно) и гамма-глобулина (внутрибрюшинно), зашита показана только при интраназальном применении ридосгина (т.е. агахликаторно на месте инфицирования) (Таблица 7). В наших экспериментах внутрибрюшинное введение как ридосгина, так и гамма-глобулина не приводило к защите животных. Клинические проявления заболевания, результаты патоморфологических исследований и концентрация вируса в органах на 7 - 9 сутки не отличались от аналогичных показателей у контрольных животных, зараженных вирусом Мачупо. Напротив, у животных, получивпшх ридосшн интраназально, не наблюдалось накопления вируса в органах и заметных патоморфологических изменений.

При изучении динамики изменения продукции ЙФН, ФНО, ИЛ-1 и активности НК у мышей линии BALB/c, инфицированных интраназально вирусом Мачупо, после введения ридосгина и гамма-глобулина, у животных, получивших ридосгин интраназально, высокая активность факторов иммунного ответа отмечалась а первые сутки после инфицирования и достигала исходных значений к 7-м суткам после заражения (рис. 4). Динамика изучаемых медиаторов иммунного ответа после внугрибрюшинного применения как ридосгина, так и гамма-глобулина не отличалась от контрольной.

Важное значение имеет возможность лечения аренавирусных лихорадок на стадии клинических проявлений заболевания. Поэтому целью нашего исследования было изучение возможности лечения экспериментальных аренавирусных инфекций, вызванных вирусами Ласса и Мачупо, с помощью препарата "Десферал" (десферриоксамин), для которого показана иммуномбдулируюшая и противовирусная активность, а также влияние на экспрессию молекул межклеточной адгезии in vitro.

Влияние на течение экспериментальной инфекции у мышеи В АI. В/с (вызванной пнтраназальиым заражением вирусом Мачуио (доза 100 ПОП)) введения ридосгина (иитраназаш.ио и ииутрибрюшшшо) и гамма-глобулпнп (ииутрибрюшшшо) через 2 часа после инфицирования

выжившие/ % с.п.ж. Концентрации вируса в Цоцю БОЕ/мл

препарат всего орган сутки после инфицирования

защиты (сут) 1 3 5 7 9

контроль Мачупо 0/30 0 9,8 мозг селезенка <1 <1 2,0+0,2 1,6+0,2 3,6+0,4 3,0+0,2 5,0+0,5 4,6+0,4 5,6+0,5* 5,0+0,5*

ридостип¡п 27/30 90 9,8 мозг селезенка <1 <1 <1 <1 и.о. и.о. и.о. и.о. И.О. и.о.

ридостин ¡р 5/30 16,6 9,2 мозг селезенка <1 <1 2,0+0,2 1,4+0,5 3,4+0,4 3,0+0,5 4,6+0,4 4,0+0,5 5,0+0,5* 4,5+0,5*

гамма-глобулин 4/30 13,3 9,0 мозг селезенка <1 <1 2,0+0,2 1,6+0,2 3,2+0,5 3,0+0,4 4,2+0,2 4,0+0,5 5,0+0,5* 4,2+0,5*

Примечании: * - псе жииотшле погибли; и.о. - не определяется.

Время после введения (ч) Время после введения (ч)

ЕНЗ ридосгин (¡р) НЛ ридосгин (ш) ЯН У-глобулин I I Мачупо -контроль

Рис.4. Динамика активности нестецифичеких факторов иммунитета у мышей линии ВАЬВ/с. инфицированных инграназально вирусом Мачупо (100 БОЕ) (Мачупо), после введения через 2 ч ридосгина внутрибрюшинно (ридосгин (!р)) и инграназально (ридосгин (т)), гамма-глобулина внутрибрюшинно (У-глобулин).

Таблица 8

Влияние препарата "Десферал" (ДФО) на течение экспериментальной инфекции у мышеи линии BALB/c, вызванной вирусом Мачупо, и мышей линии CBA/CaLac, вызванной вирусом Jlacca

NN группы выжившие/ % с.п.ж. сутки концентрация вируса в органах содержание активность

наблю- (Los т/мл) ФИО ИЛ-1

препарат нсего защиты' (сут) дении МОИ' селезенка еыноротка (пг/мл) (u.c.)

1 0/20 0 7.69 0 и.о п.о 11.о <0.03 1.0

контроль 5 5.36+0.24 5.24+0.12 4.8+0.2 1.26 3.2

Jlacca 7 5.30+0.30 5.36+0.12 4.6+0.2 1.44 3.0

2 8/20 40 8.62 0 п.о н.о 1I.O <0.03 1.0

ДФО 5 5,30+0.12 5.24+0.12 4.8+0.2 1.26 3.2

7 5.00+0.12 5.00+0.12 4.0+0.2 1.10 2.8

21 и.о II.O II.о <0.03 1.0

3 0/20 0 9.8 0 и.о 11.0 н.о <0.03 1.0

контроль 7 5.0+0.5 4.6+0.4 4.0+0.5 1.35 3.5

Мачупо 9 5.6+0.5 5.0+0.5 4.6+0.4 1.71 3.0

4 9/20 45 10.6 0 н.о 11.0 11.0 <0.03 1.0

ДФО 7 5.0+0.5 4.6+0.4 4.0+0.5 1.35 3.5

. 9 5.0+0.5 4.6+0.4 4.0+0.5 1.10 2.8

21 н.о 11.о н.о <0.03 1.0

Примечание: препарат ииодился виутрибрюшншю и дозе 5 мкг/жииотиое при заражении мышеи липни BALB/c на 7, 8, 9 и 10 сутки после инфицировании и при заражении мышеи линии CBA/Cal.ac па 5, 6, 7 и 8 сутки после иифицироилиш!.

При изучении влияния ДФО на течение экспериментальной инфекции у мышей, чувствительных к заражению вирусами Ласса и Мачупо, наблюдалось снижение концентраций ФНО и уменьшение активности ИЛ-1, при этом происходило удлинение СПЖ погибших животных и увеличение процента выживших животных, как при заражении вирусом Ласса, так и вирусом Мачупо (Таблица 8).

Таким образом, выбор средств лечения при аренавирусных геморрагических лихорадках должен основываться не только на оценке противовирусной активности препарата, но и на его влиянии на показатели иммунитета, которые играют важную роль при зггах инфекциях.

Выводы

1. Впервые показано, что среди мышей различных линий, отличающихся по гаплсггипам основного комплекса гистосовместимости, существуют линии оппозигные по чувствительности к внугримозговому заражению вирусом Мачупо (ппамм Carvallo) - наиболее восприимчивая линия BALB/c (пцшотап H2d, летальность 100%) и резистентная линия С57В1/6 (гаплотип Н2Ь, летальность 0%).

2. В экспериментах уа инбредных мышах показано, что в иммунопатогенезе инфекций, вызванных вирусами Ласса и Мачупо, важную роль играют неспецифичоские факторы иммунитета, такие как ФНО и ИЛ-1.

3. Показана возможность лечения экспериментальной аренавирусной инфекции у мышей линии CBA/CaLac, вызванной внутримозговым заражением вирусом Ласса, внутривенным введением анти-ФНОга сыворотки и внутрибрюшинным введением антагониста рецептора ИЛ-1.

4. Показана возможность лечения экспериментальной аренавирусной инфекции у мышей линии BALB/c, вызванной внутримозговым заражением вирусом Мачупо, внутривенным введением анти-ФНО-ct сыворотки.

5. Показана возможность экстренной профилактики экспериментальной аренавирусной инфекции у мышей линии BALB/c, вызванной

инграназатьным инфицированием вирусом Мачупо, при аппликаторном введении индуктора интерферона ''Ридостин" на место инфицирования.

6. В экспериментах на инбреяньи мьппах показана возможность лечения инфекций, вызванных внугримозговым заражением вирусами Ласса и Мачупо. при внугрибрюшинном введении препарата 'Десферал".

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Твердохлебов A.B., Калиберов С.А., Зайцева В.Н., Кузьмин В.А., Красько А.Г., Игнатьев Г.М. Получение концентрированных препаратов вируса Мачупо // Вопр. вирусол. - 1992. - т.37, № 1.- 72-73.

2. Игнатьев Г.М., Твердохлебов A.B., Калиберов С.А., Перебоеза Л.А.. Патрушева И.В., Кашенцеза Е.А. Показатели иммунитета при заражении мьпдей различных, линий мьшей вирусом Мачупо // Вопр. вирусол. - 1993. -38(4).- 167-170.

3. Игнатьев Г.М., Твердохлебов A.B., Калиберов С.А., Патрушева И.В.. Кашенцева Е.А., Воробьева М.С. Показатели иммунитета у мышей линии BALB/c, иммунизированных инактивированным антигеном вируса Мачупо // Вопр. вирусол. - 1993. - т.38, №5. - 227-230.

4. Игнатьев Г.М., Калиберов С.А., Перебоева Л.А., Твердохлебов A.B., Красько А.Г., Годнева А.Т. Изучение некоторых показателей иммунитета при заражении мышей линии CBA/CaLac вирусом Ласса // Вопр. вирусол. - 1994. -т.39. .N06. - 324-327.

5. Агафонов А.П., Стрельцова М.А., Игнатьев Г.М., Твердохлебов A.B.. Чепурнов A.A., Калиберов С.А., Кузьмин В.А., Черный Н.Б. Способ получения концентратов вирусов, вызывающих геморрагические лихорадки и обладающих иммуногенной и протекгивной активностью // патент РФ RU 2029561 С1. от 27.02.95.

6. Калиберов С.А., Игнатьев Г.М.. Перебоева Л.А., Кашенцева Е.А. Экспериментальное изучение возможности экстренной профилактики

Боливийской геморрагической лихорадки II Вопр. вирусол. - 1995. - т.40, №5. -211-215.

7. Ignatyev G.M., Kaiiberov S.A.. Godneva А.Т., Tverdokhlebov A.V., Pereboeva L.A., Patmsheva I.V., Kashentseva E.A. Immunity parameters in mice of different lines infected with Machupo or Lassa viruses // Proc. 3rd Congress Europ. Soc. Vet. Virol. - 1995. - 250-253.

8. Игнатьев F.M., Кашенцева E.A., Калиберов C.A., Прозоровский Н.С. Экспериментальное изучение влияния препарата десферал и сыворотки против фактора некроза опухоли на течение инфекционного процесса при аренавирусных геморрагических лихорадках И Ангибиот. химиотерап. - 1996. -

№2.-63-66.