Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Специфическая индикация антигенов вирусов лимфоцитарного хориоменингита, Ласса, Мопейя с помощью иммуноглобулинов G2a и G2b

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Специфическая индикация антигенов вирусов лимфоцитарного хориоменингита, Ласса, Мопейя с помощью иммуноглобулинов G2a и G2b"

министерство здравоохранения республики Беларусь

белорусский ордена трудового краспого знамени научно-исследовательский институт эпидемиологии н ,'5 о л микробиологии

-- 8 ДЬК 1998--

На правах рукописи

Уда 61:578.7- 07:615.375

ЗАЙЦЕВА Вера Пкколжеена

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ИНДИКАЦИЯ АНТИГЕНОВ ВИРУСОВ ЛИМФОЦИТАРНОГО ХОРИОМЕШШГИТА, ЛЛССА, МОИЕЙЯ С ПОМОЩЬЮ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ С2а И С2Ь

ОЗ.СО.Об - вирусология

Авторефграт лнссертяцнн на соискание ученой степени кандидата биологических паут:

мипаг тз

' Рябел а выполнена в Белорусском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте эпидемиологии н микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь

Научный руководитель: доктор медицинских наук

А.С.Владыко

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

И.П.Мншаева

кандидат медицинских наук Н.В.Малахова

Оппонирующая организация: Институт полиомиелита и вирусных

энцефалитов РАКШ, г.Москва

Защита состоится 998г. часов

на заседании совета в Белорусском ордег-а Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь по адресу: 220050 г.Минск, ул. К.Цепхин 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Белорусского . ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь.

Автореферат разослан "¿3* \ 998г.

Ученый секретарь совета кжцд. мед. наук

Л.С.Петкевнч

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Большинство из патогенных для человека >едставителей семейства Arenaviridae эндемнчны для стран Африканского континента Латинской Америки [Gonzalez J.P. et al., 1986, Lehmann-Giube F., 1986]. Однако, они мот быть потенциально опасными для любой страны. Подтверждением этому служат свежи о завозе лихорадки Ласса в США, Канаду, Австралию, Англию, Израиль и Японию (роздов С.Г., Сергиев В.П., 1984, Hirabayashi Y. et al. 1988, 1989, Shlaeffer F. et al., 1988]. ipyc лимфоцитарного хориоменингита (ЛХМ), являясь также патогенным для человека, .спрострзмен повсеместно, в том числе и в Беларуси [Воробьева З.Н. н др. 1975, 1979, шойлова Т.И. и др. 1994, СачекМ.М. и др. 1995].

Известно, что источником инфекции для человека и естественным резервуаром ipyca ЛХМ в природе являются мышевидные грызуны. Уровень их зараженности внру-м - один из наиболее демонстративных показателей эпидемического неблагополучия рритории [Зуев В. А., 1988]. Его оценка в различных регионах республики имеет важное идемиологическое и эпизоотологическое значение. В этой связи необходимость созда-[я высокочувствительных диагностических тест-систем, которые позволили бы выяв-ть вирус ЛХМ не только у природных хозяев, но и у больных людей, является актуальной аачен. Применяемые с этой целью в настоящее время общепринятые варианты прямого и прямого иммуноферментного метода основаны, как правило, на использовании в ка-стве иммуносорбента суммарных специфических иммуноглобулинов класса G (IgG).

Сведения по изучению роли отдельных подклассов IgG в диагностике аренави-

сных инфекций до настоящего времени в литературе отсутствуют. Определенный инте-

с в этом плане представляет работа Baldridje J.R. и Buchmeier M.J. (1992), в которой

казано, что при острой инфекцнн ЛХМ у мышей превалируют IgG2a, тогда как при

онической - IgGl. Исследований, связанных с изучением роли отдельных подклассов

1муноглобулннов в индикации антигенов аренавирусов не проводилось. В связи с этим

О

вкзна проблемы, а также ее практическая значимость, определяются, с одной cioponu, сутствнем в литературе данных о диагностическом значении отдельных подклассов им-ноглобулинов G. используемых для выявления возбудителен инфекционных эаболева-й и, с другой, связаны с необходимостью постоянного совершенствования методов, »меняемых в лабораторной диагностике.

СВЯЗЬ РАБОТЫ С КРУПНЫМИ НАУЧНЫМИ ПРОГРАММАМИ, ТЕМАМИ

Данная работа является составной частью тематики НИР в рамках социального заказа "Комплексный анализ возбудителей природиоочаговых вирусных инфекций, циркулирующих на территории Республики Беларусь, с целью своевременной разработки адекватных методов диагностики, профилактики и лечения" N госрегистрации .1993110, а также по Фонду фундаментальных исследований " Исследование механизма действия первого компонента комплемента С^ на специфический и неспецифический иммунные комплексы"

ЦЕЛЬРАБОТЫ

Дать характеристику и определить диагностическое значение отдельных подклассов иммуноглобулина в (в!, 02а, 02Ь), полученных из сыворотки крови инфицированных аренавкрусами ЛХМ, Ласса, Мопейя мышей линий СВА и ВАЬВ/с.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Моделирование инфекции у мышей линий ВА1_В/с и СВА вирусами ЛХМ, Лаоса, Мопейя.

2. Изучение динамики накопления антивирусных иммуноглобулинов класса б к изотопических ашител 01,02а, 02Ь у линейных мышей СВА и ВАЬВ/с.

3. Оптимизация условий получеши отдельных изотипов антивирусных анпгтш класса в (01, 02а, 02Ь) и изучение их иммунобиологических свойств (степени чистоты г специфичности к структурным вирусным белкам).

4. Определение диагностического значения .(специфической активности, относительной авшшости и перекрестной иммунореакгивности) изотипов ДО!, ^02а, I аренав(фусам ЛХМ, Ласса, Мопейя.

5. Определение перспективы разработки нового варианта нммунофермектно! тест-системы для ииднхации антигенов изучаемых вренавнрусов на основе использование подклассов иммуноглобулина в.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

При выполнении настоящей работы были получены данные, имеющие как теоретическое, так и практическое значение.

1. Выявлено, что при однократной интраназальной инокуляции аре пав иру сов ЛХМ, Мопейя, Лаоса в дозе 1000 БОЕ/мышь взрослые мыши линий СВА н ВА1ЛЗ/с являются одинаково чувствительными. Гибель животных варьирует от ] 5 до 36 процентов.

2. Показана зависимость динамики образования иммуноглобулинов класса в у линейных мышей СВА н ВАШ/с, инфицированных вирусами ЛХМ, Ласса, Мопейя, от вида возбудителя. При заражении мышей обеих линий вирусами ЛХМ н Ласса максимальное содержание антител в сыворотке крови отмечается на 15-23 сутки, а при заражении вирусом Мопейя - на 23-37 сутки.

3. А^гпгтела С2Ь, специфичные к аренавпрусам ЛХМ и Ласса, дают выраженные серологические перекресты с антигеном непатогенного доя человека аренавируса Мопейя, что может служить основанием для применена» данного антигена при создании диагностических тест-систем к аренавирусам ЛХМ и Ласса.

4. Впервые установлено, что при однократной юпраназалыюй инокуляции аре-навирусов ЛХМ, Ласса, Мопейя у мышей линии СВА и ВАЬВ/с образуется высокоавид-ный иммуноглобулин подкласса С2Ь.

5. Показано, что все исследуемые подклассы антител (01,02а, 62Ь) в реакции . радиоиммуиопреципитацин взаимодействуют с вирусным мажорным нуклеокапсидным белком ИР.

ПРАКТИЧЕСКАЯ Ц ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проведенные исследования позволили оптимизировать условия получения изотопических антител и 02а с поьошыо мвгэда аффинной хроматографии нР ппотенн-А сефарозе. '•' -

Выявлено, что использование »;ТфИФА антивирусных антител <32а н 02Ь подклассов на стадии нммуносорбента," в сочетании с комплементом, приводит к увеличению чувствительности и специфичности тест-системы в 4 - 16 раз.

На основе вирусспецифических изотопических шгител в2Ь разработан лабора торный регламент на производство "Тест-системы иммунофермекгной моноизотипичесми диагностической для выявления антигена вируса лимфоцитарного хориомешшгнт (ЛХМ)", утвержденный на Ученом Совете БелНИИЭМ, протокол N1 от 23 января 1998г.

ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

В качестве коммерческого продукта может быть налажен выпуск разработанно на основе использования из атипических антител С2Ь тест-системы иммуноферментно моноизоптической диагностической для вьивлети антигена вируса лиыфоцитарног хорноиешшпгга.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Уровень иммунного ответа и динамика образования антител у взрослых л* нейиых мышей СВА и ВАЬВ/с, инфицированных ннтраназапьно аренавирусамн ЛХМ, Ла< са, Мопейя, зависят от вида возбудителя. При заражении мышей обеих линий вирусам ЛХМ и Лаоса максимальное содержание антител в сыворотке крови животных отмечает ся на 15-23 сутки, а при заражении вирусом Мопейя - на 23-37 сутки.

2. Оптимальным методом получения мышиных противовирусных изотипич< ских антител Он и в2Ь является аффинная хроматография на протеин-А сефарозе с пр> менением в качестве элюента 0.05М с рН 4,5 и 0,1М с рН 3,5 нитратного буфера, соотвег ственно.

3. Икграназальное введение вирусов ЛХМ, Ласса, Мопейя линейным мыша СВА н ВАЬВ/с позволяет получить подкласс иммуноглобулина С2Ь с высокой относится! нон авидностью, который может быть использован в диагностике данного рода ннфекцн; Все исследуемые подклассы антител (01, С2а, С2Ь) в реакции радиоиммунопрециюгг цш1 взаимодействуют с мажорным структурным белком №. имеющим среди друп структурных белков аренавирусов большее диагностическое значение.

4. Специфические антитела С2а и в2Ь подклассов в сочетании с комплементе при выявлении антигенов аренавирусов ЛХМ, Ласса, Мопейя в 1 ФИФА приводят к увел! чению чувствительности тест-системы в 4-16 раз.

ЛПЧПЫЙ ВКЛАД СОИСКАТЕЛЯ

Работа выполнена лично автором на базе Белорусского НИИ эпидемиологии и икробнологни Министерства здравоохранения Республики Беларусь. Автору принадле-ат организация и проведение экспериментальных исследований, теоретическое обобще-ие полученных результатов и выводы. Отдельные разделы выполнены совместно с со-рудннками БелНИЮМ н.с. Быстро вой С.И., н.с. ШколиноП Т.В. "Я приношу им свою ис-реннюю благодарность. По всем результатам имеются совместные публикации.

Я глубоко признательна за научную консультативную помощь и поддержку зоему научному руководоггелю д.м.н. А.С.Владыко и руководителю отдела ДПВИ д.м.н., роф. И.С.Лукашевнчу. Особую благодарность за ценные советы н предложения при формлекии диссертационной работы выражаю к.б.и. Л.Я.Куницкой, к.м.н. !.М.Трофимову.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные экспериментальные данные и положения диссертации были доложены на зучной конференции "Актуальные проблемы современной медицины", посвященной 60-гтию Витебского государственного медицинского института; г.Витебск, 1994г.; на Меж-^нлродной научной конференции, посвященной 5-летию образования Гомельского госу-¡рственного медицинского инсппуга; г.Гомель, 1995; на IX съезде работников профи-•хтичесхой медицины Республики Беларусь (70 лет санитарно-эпидемиологической служ->|); г.Минск, 1996г. В завершенном виде диссертационная работа была доложена на жференции отдела ДПВИ, протокол N 5 от 12 ноября 1997 г., на заседании Ученого Со-гта БелНИИЭМ, протокол N14 от 23 декабря 1997г.

ОПУБЛПКОВАПНОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ

По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

•• Диссертационная работа изложена на 124 стр. машинописи и состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, обсуждения и выводов. Работа иллюстрирована 10 таблицами, 16 графиками и рисунками.

Список цитируемой литературы включает 217 источников отечественной и зарубежной литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ

Материалы и методы. В работе использовали вирус JIacca (штамм Josiah) и вирус Мопсйя (штамм М-150), полученные ш Института тропической медицины, Антверпен, Бельгия). Вирусы зарегистрированы в Национальной коллекции РБ, NN депонентов 11 и 2-3, соответственно, а также вирус ЛХМ (штамм СА-1371), • получешшый га Инспгту-та полиомиелита и вирусных энцефалитов (РАМН, г.Москва) н зарегистрированный в Национальной коллекции вирусов РБ, депонент N 2-7.

Вирусы накапливал» в перевиваемых культурах клеток L-929, Vero, ВНК-21 и титровали методом негативных колоний под агаровым покрытием в однослойных культурах клеток Vero. Внруссодержащая культуральная жидкость с пггром 106- 107 БОЕ/мл служила иммуногеном. . - .

i В качестве антигена для ТФИФА использовали концентрированные и очищенные в градиенгах урографнна 15-45% и сахарозы 20-60% вирус Мопейя н ннактивирован-ные гамма-облучением вирусы ЛХМ и Ласса (Лукашевич И.С. и др. 19S3, Elliott L. et al. 1982).

Для получения специфических сывороток к вирусам ЛХМ. Ласса, Мопейя использовали взрослых мышей массой 18-20г. линий СВА и BALB/c. Специфическую активность полученных сывороток определяли в реакции непрямой ИФ и ИФА.

При получении отдельных подклассов иммуноглобулинов применяли метод аффинной хроматографии на протеин-A сефарозе (Еу P.L. et al. 1978) в собственной модификации.

Изотип иммуноглобулинов, выделенных из нммунных сывороток мышей, определяли с помощью ТФИФА с использованием набора для нзотипировання мышиных антител фирмы Calbiochem (Швейцария).

Относительную авидность нзотнпов IgG определяли методом ТФИФА (Владыко A.C. 1987; Bruck С. et al., 1982). Оценивали ее по величине отношения разности показателя оптической плотности опытной и контрольной проб к концентрации белка опытной пробы.

Специфичность изотипов иммуноглобулинов Gl, G2a, G2b к структурным белкам аренавирусов определяли методом радиоиммунопреципитацни с последующим элекгро-форетическнм анализом (Lukashevich I.S., Lemeshko N.N., 1985).'

Статистическую обработку экспериме1гтальных результатов проводили по критерию Стьюдигга (Рокнцкий П.Ф., 1973) и методом рангов по Вилкоксону (Урбах В.Ю., 1975). Достоверными считали различия при р<0,05.

i

ОСОБЕННОСТИ ППДУКЦШ1 ВРСШПХЖИРУОТЫХ АШШЕЛ КЛАССА G

У МЫШЕЙ ЛПШШ СТА Н ВАШ: ПРИ ЗАРАЖЕНИИВИРУСАМИЛХМ, ЛАОСА, \ МОПЕЙЯ

HitreHCUBUocTb иммунной реакции организм», как известно, зависит от ряда факто-эов. К ним относятся качество и состав, количество и "сила" антигена, а также способ его введения [Svehag S.E et al.,1964]. Роль иммунной системы организма при аренавирусных инфекциях может быть двоякой [Lulcashevich I.S.,1985]. С одной стороны, лммунопатоло-wecioie реакции могут приводить к гибели организма, а с другой - иммунные механизмы гг веч агат за элиминацию вируса из организма, вшивают разшгтнв иммунного состояния, гто приводит к выздоровлению. В связи с вышеизложенным представляло интерес изу-нггь особенности индукции антивирусных иммуноглобулинов класса G в зависимости от фока (в сутках) после введения вируса. С этой целью было. применено интраназальное (ведение вируса как наиболее приближенный к естественным условиям путь заражения, >бсспечнвающий разв1гтие инфекции с минимальным процентом летальности. В работе 1Спользовали взрослых мышей массой 18-20г. линий СБА, как чувствительную н BALB/c, ак нечувствительную модели животных для аренавирусных инфекций при внутримозго-юм заражении [Баркар Н.Д. и др.,'989]. В результате проведенных исследований показа-!0, что при гапраназальном инфицировании мышей линий- СБА и BALB/c вирусами ИМ, Мопейя, Ласса в дозе 1000 БОЕ/мышь обе линия животных (СБА и BALB/c) являот-я одинаково чувствительными. При этом процент гибели жмвотньк варьирует от 15 до б для двух использованных линий мышей. При заражении мышей исследуемых линий зк-

русами ЛХМ и Ласса шггителг класса в в ТФИФА обнаруживались с 7 суток, причем уровень их был несколько выше в сыворотке крови мышей линии СВА, а максимальное содержание в сыворотке крови животных обеих линий отмечалось на 15-23 сутки. При введении мышам вируса Мопейя, антитела выявлялись на 20 сутки; их содержание было выше в сыворотке крови животных линии ВАЦВ/с, а максимальное количество у обеих линий определялось с 23 по 37 сутки.

Исследование динамики образования иммуноглобулина в подклассов 01, С2а, в2Ь при шпраназальном заражении линейных мышей СВА и ВАЬВ/с изучаемыми вирусами показало, что принципиальных различий в Индукции антител обнаружено не было. На рис. 1 представлена динамика образования подклассов антител 01, С2л, 02Ь, специфичных к вирусу ЛХМ.

P/N BALB/c СВА

1,2 3 - * « х

1,0

0,8 х к ' • X 3 К 1 1 1 1 1 1 1 1 1—1__1_1_L....I , 1_„| ,.,.!., 1 .

7 1$ 30 56

7 16 ¿3 37 sa

1,2 1,1 1,0 0.9

Рис.1. Динамика синтеза тти-ЛХМ изотипов IgG у мышей линий СВА и BALB/c:

по оси абсцисс - сутхи после введения вируса; по оси ординат - P/N - показатель отношения оптической плотности опига к показателю оптической плотности контроля, 1 - lgG2a, 2 - IgG2t>; 3-IgGl.

Как видно, у мышей линии СВА происходкт смена изотипов антител в процессе их синтеза. Индукция лзотина IgG 1 иосет волнообразный характер. Синтез вирусспсцнфиче-

их иммуноглобулинов G2a и G2b как в организме мышей линий СВА, так и BALB/c эж по своей динамике.

• Таким образом различный уровень и срок образования антител у мышей линий JA и BALB/c зависит, вероятно, от генотипических особенностей организма животных,

0 согласуется с данными литературы (Зудин Б.И. и др., 1990).

ОСОБЕННОСТИ ПОЛУЧЕНИЯ ПОДКЛАССОВ ИММУНОГЛОБУЛИНА G ИЗ СЫВОРОТОК КРОВИ МЫШЕЙ И ИХ ИММУНОБИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

Следующим разделом наших исследований явились опыты по оптимизации ус-вий выделения изотопических антител Gl, G2a, G2b из сыворотки крови линейных шотных.

По данным литературы (Еу P.L. et al., 1978), выделение подклассов IgG осущест-яется методом аффинной хроматографии на протеин-A сефарозе, применяя для эло-и 0,1М цитратаый буфер с рН в пределах от 3,5 до 7,0.

----При отработке условий выделения подклассов антивирусных иммуноглобулинов

5ыло выявлено, что фракции, обогащенные изотопами G1 и G2b с минимальным холи-ггвом примесей других белков, можно получать с помощью метода аффинной хромато-1фии на протеин-A сефарозе, используя в качестве элюента 0,1М цигратный буфер с рН

1 и 3,5, соответственно, а для выделения нзотипа антител G2a - 0.05М цшрзткый буфер с [4,5.

После выделения подклассов антител Gl, G2a, G2b с помощью метода аффинной эмато графин на протеии-А сефарозе были исследованы их иммунобиологические евой-•л: определена степень чистоты, относнгелькгя авидноспь, а такие изучена ия спецм-чностъ к структурным вирусным белкам. Определение степени чистоты подхлаесоз км-ноглобулииов проводили с помощью Жлектрофоретического анализа в псяиакршш-дном геле. Исследования показали, что полученные антитела содержали два белка с мо-(улярной массой 23 кД и 53 кД, что соответствует' легким н тяжелым цепям молекулы муноглобулинз. Примесей других белков обнаружено не было. °

При изучении относительной авидносгн изотопических антител Gl, G2a, G2b ло выявлено, что у мышей обеих линий (СВА н BALB/c) при икграназалыгоы заражении :навирусами ЛХМ, Ласса, Мопейя в сыворотке крови образуются низкоавидные антн-

тела изотопов и в2а и высокоавидные антитела изотипа в2Ь (рие.2). По степени авщ носги нзоггипы антител располагались в последовательности: в2Ь>01>С2а.

I

8

и

и

з

2 1.5 1

0.5 0

1дв2Ь

т : г

I- ± Гдв2а

2 3 4 5

Рис. 2. Удельная относительная авндность подклассов ^О,

специфичных к вирусам ЛХМ, Ласса, Мопейя: по оси абсцисс - номер фракции; по оси ординат - индекс ТФИФА (отношение разности абсолютных значений (ОП пыта и контроля к концентрации белка опытной пробы).

Панель А - штгтела к вирусу ЛХМ; Б - аппггела к вирусу Ласса, В - антитела к вирусу Мопейя.

В процессе изучения специфичности подклассов антител 01, б2а и в2Ь к струк-урным белкам исследуемых вирусов с помощью метода радиоиммунопрецншггации и юслсдующего злектрофоретического анализа было показано, что антитела, специфичные с возбудителям ЛХМ, Ласса и Мопейя, имели идентичные результаты. На рнс. 3 представ-юны результаты радиоиммунопрецитггация вирусспецкфических белков для ати-Ласса «оптических антител 01, 02а, 02Ь. Как видно из рис. 3, основным вирусным антигеном, : которым взаимодействовали изотипические антитела был белок, с молекулярной массой >4 кД, что соответствует структурному белку аренавирусов, имеющему преимуществен-юе диагностическое значение, по сравнению с белками вР-1 и СР-2 (Уегта А.Б. л а!.. 1978, Быстрова С.И. и др., 1992).

£И

-CPI

-i

-срг

30-

/ 2 3 4 5 6

Рис. 3. Радионммунопреципигация структурных белков вирус» Ласса, меченных [С 14]- бслжса хлореллы, изотмпи1"*скики иммуноглобулинами Ol, G2a, G2b:

о

1 - стандартные белки фирмы "АтегйипГ;

2 - полиизогилическиЯ (+К);

3 - нормальный иммуноглобулин (-К);

4 - изотип 1вС1, 5 - изотип 1^02», 6 - изотип 1в02Ь.

АНАЛИЗ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ ПОДКЛАССОВ ИММУНОГЛОБУЛИНА G, СПЕЦИФИЧНЫХ К АРЕНАВИРУСАМ ЛХМ, ЛАСО

МОПЕЙЯ

В связи с приведенными выше данными, практический интерес представлю вопрос об оценке возможности использования изотипнческих аипггел в диагностике ар навирусных инфекций. С этой целью была проанализирована перекрестная иммунореа тнвность изотопических антител Gl, G2a, G2b в момент их максимального накопления крови за период наблюдения (58 суток). Исследования проводили в гомологичной и г терологичной системе с помощью твердофазного иммуноферменгного анализа (табл Особенностью полученных результатов явилось то, что в гомологичной системе у o6ei линий мышей (СБА н BALB/c) были выявлены максимальные индексы ТФИФА (отнош нне показателя оптической плотности опытной пробы (специфический изотип) к показат лю оптической плотности контрольной пробы (неспецифический изотип) для изотш IgG2a. Величина его составила 23,3 относительных единиц в сыворотке крови mi шей линии СБА и 10,8 для мышей линии BALB/c. В аналогичных условиях исследов иия этот индекс для изотипа G2b был равен 2,8 в сыворотке крови мышей линии СВА и 2 • для мышей линии BALB/c. Сравнительное исследование изотопических антител гетерологичных условиях показало значительную разницу величины индекса ТФИФА д; изотипа IgG2b у обеих линий мышей при взаимодействии с антигеном непатогенного к человека вируса Мопейя. Величина его составила 8,6 в сыворотке крови мышей лнш CBÁ и 4,2 - в сыворотке крови мышей линии BALB/c. Аналогичные результаты по пер крестной реактивности изотопических антител были получены с использованием ueroj непрямой иммунофлюоресценции.

Таким образом, выявленные серологические перекресты в гетерологичной си теме дают основания полагать, что преимущественное диагностическое значение при ар навирусных инфекциях у линейных мышей СВА и BALB/c принадлежит изотопам airrim G2a и G2b.

На основании литературных данных о том, что величина В-кл сточного отвс зависит от активации in vivo Т-хелперных клеток, и что на инс! ционнын процесс в орг низме не все 1130ТНПЫ IgG реагируют в равной степени (McKendall R. et al., 1988), пре, ставляло интерес оценить иммунореактивность отдельных подклассов IgG при учасп неспецифических факторов иммунитета, в частности, комплемента.

Таблица

Перекрестная имнупореакгпвность подклассов анти-ЛХМ, антн-Лясса и антя-Мопейя п ТФИФА

Ливия Иммулиая Время после Шит

животных сыворотка 'к вирусу вьедешга виру" (сутки) аммупоглоО/-дкпа Аитигею!

Мопейя ЛХМ Лаоса

Мопейя 23 в2а 23,3 3.3 4,3

СВА ЛХЯГ 23 в2Ь 8,6 2,8 3,2

Лаоса 19 вгь 2,2 1.9 1.8

58 02а 3,0 2,4 • 1.7

Мопейя 58 02а 10,8 3.1 з.з

ВАЦВ/с ЛХМ 58 02а 1,7 1.7 1.4

Пасса 23 02а 3.6 1.9 1.8

58 в2Ь 4,2 2.7 2,2

Известно также, что среди мышиных активировать классический путь комплемента способны не все подклассы иммуноглобулина в (Вогеоз Т., Ддрр НЛ., 1965). Данные эксперименты были выполнены с помощью ТФИФА, где юотипы анпггел 01, 02а, С2Ь использовались в качестве иммуносорбента, а антиген в лунки панелей вносили в смеси с комплементом или без него. При этом принципиальных, зависящих от вида возбудителя различий в полученных данных обнаружено не было. Па рис. 4 представлены результаты иммунореактивности анти-ЛХМ изотипнческих антител при участии комплемента морской свинки в ТФИФА. Анализ данных показал, что применение антител изотнпов 02а и в2Ь в сочетании с комплементом приводит к значительному увеличеншо активности антигена. Эти результаты, во-первых, подтверждают данные литературы о наличии в системе комплемента эффекта связывания комплексов антиген-антитело (НалЫа А. « а!., 1990), а во-

вторых, показывают наличие неизвестных механизмов влияния комплемента на комплекс актиген-ипигедо.

- -

/ / / / Z_/fgQ

- ♦ - + ♦ — ♦

Р<(к02 РЮ.05 Р<0.001 Р<0.001

Рис. 4. Влияние кзотипа 1вО и комплемента на тигр антигена вируса ЛХМ в ТФИФА:

по оси X - наличие (+) или отсутствие (-) комплемента; по оси У - обратное значение разведений антигена; по оси Z - изотнпы антител.

Таюш образом, можно полагать, что влияние комплемента на реакцию акгиген-антитело в ТФИФА проявляется за счет его взаимодействия с изотопическими антителами G2a и G2b, что приводит к увеличению чувствительности тест-системы. Механизм участия комплемента в данном ^ффосте еще предстоит вьшсннть.

!

ВЫВОДЫ

• 1. Показано, что при шпраназальном инфицировании вирусами ЛХМ, Мопейя, Ласса взрослых мышей линий СВА и ВАЬВ/с в дозе ЮООБОЕ/мышь существенных различий в чувствительности не обнаружено (Р>0,05). Летальность животных варьировала от 15 до 36в/о.

2. Установлено, что при шпраназальном инфицировании взрослых линейных мышей СВА и ВАЬВ/с вирусами ЛХМ, Ласса, Мопейя в дозе 1000 БОЕ/животное сроки индукции вирусспецифических антител, зависят от вида возбудителя. Максимальный иммунный ответ (7,5-14,0 индекс ТФИФА) определялся от 15 до 23 суток после введения патогенных для человека вирусов Ласса и ЛХМ, и от 23 до 37 суток (6,5-8,0 индекс ТФИФА) - после введения непатогеиного для человека вируса Мопейя.

3. Впервые показано, что при однократном шпраназальном инфицировании мышей линий СВА и ВАХЛЗ/с вирусспецифический иммунный ответ сопровождается образованием подклассов иммуноглобулина 01 и 02а с низкой и иммуноглобулина 02Ь - с высокой относительной авидностью, что имеет определяющее значение при конструировании диагностических препаратов. По степени авидносги подклассы 1яО располагаются в возрастающей последовательности: 02а<01«02Ь.

4. Антивирусные иммуноглобулины подклассов в!, 02а, 02Ь прецитгтнруют диагностически значимый белок ОТ аренавирусов.

5. С помощью иммуноглобулина в2Ь подкласса к вирусу Мопейя установлено тесное антигенное родство вирусов ЛХМ, Ласса, Мопейя, что предполагает возможность использования анти-Мопейя ^02Ь подкласса при созданни иммуноферментных тест-систем для выявления антигенов вирусов ЛХМ и Ласса.

6. Иммуноглобулины подклассов 02а и 02Ь к вирусам ЛХМ Ласса и Мопейя в сочетании с комплементом приводят к увеличении чувствительности ТФИФА в 4-16 раз.

7. На основании использования вирусспецифнческого иммуноглобулина подкласса в2Ь разработан метод выявления антигена вируса ЛХМ в прямом ТФИФА.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

< 1. Продукция инфекционного вируса и накопление в клетках антигена вируса Пи-чннде, выявляемых в непрямом методе флюоресцирующих антител / Куницкая Л.Я., Зайцева В.Н., Владыко A.C., Новохатский A.C. // Вопр. вирусол.- 1986,- N4,- С.493-498.

2. Получение концентрированных препаратов вируса Мачупо / Твердохлебов A.B., Колиберов С.А., Зайцева В..Н., Кузьмин В.А., Красько А.Г., Игнатьев Г.М. // Вопр. вирусол,- 1992.-N1.-C.72-73.

3. Сравнительная характеристика антигенных свойств t фусов Ласса и лимфоци-тарного хориомекингкга / Быстрова С.И., Зайцева ВН., Школина Т.В.,, Марьянкова Р.Ф., -Лемешко H.H., Владыко A.C. // Матер, юбил. конф. БелНИИЭМ, Минск.- 1995,- С.135-143.

4. Комплеменгозависимая иммунореактивность отдельных подклассов иммуноглобулина G к антигенам аренавирусов / Зайцева В.Н., Бысггрова С.И., Владыко A.C. // Матер, юбнл. конф. БелНИИЭМ, Минск,- 1995,- С. 143-148.

5. Диагностическая значимость отдельных подклассов мышиных иммуноглобулинов G к вирусу лимфоцитарного хориоменингита / Зайцева В.Н., Быстрова С.И., Школина Т.В., Владыко A.C. // Сб.'Иммунодиагностика и иммунотерапия", Витебск.- 1995,- С.53-55.

6. Роль вируса ЛХМ в инфекционной патологии человека / Зайцева В.Н., Марьянкова Р.Ф., Владыко A.C. // Сб.'Современ. проблемы эпидемиол. и эпид. надзора за ин-фекц. болеэн." Минск. - 1996 - Т.З. - 4.2. - С.70-74.

7. Динамика образования подклассов IgG у мышей BALB/c и СВА при заражении вирусами ЛХМ, Ласса, Мопейя и их роль в диагностике /Зайцева В.Н. Быстропа С.И., Школина Т.В., Владыко A.C. //ЖМЭИ. - 1997. N1. - С.47-51.

8. Ложно-положительные реакции при лабораторной диагностике опасных вирусных геморрагических лихорадок Ласса, Марбург, Эбола и СПИДа / Владыко A.C., Зайцева В.Н., Трофимов Н.М., Школина Т.В.,Счесленок Е.П., Бощенко Ю.А., Петкеаич A.C. // Вопр. вирусол.- 1997. - N2. - С.66-70.

9. Перекрестная иммунореактивность среди особо опасных фило-(Марбург, Эбола) и грека-(Ласса, Мачупо) вирусов / Владыко A.C., Зайцева В.Н., Школина Т.В., Марьянкова Р Ф., Бощенко ЮЛ, Трофимов Н.М., Быстрова С.И., Куницкая Л.Я., Петкевич A.C. // I иннтарн. охрана территор. Украины и профнлакт.особо опасн. ннфекц. Матер, научн,-практ. конф., поев. 60-лет. Упр. Гос. противочумн. станиц. Одесса. - 1997,- С.35-50.

10. Сыворотки переболевших в Либерии тропической малярией специфически реагируют с антигенами возбудителей опасных вирусных инфекций Ласса, Марбург, Эбола ' Владыко A.C., Зайцева В.Н., Школнна Т.В., Марьянкова Р Ф., Бощенко Ю.А, Трофимов U.M., Быстрова С.И., Куницкая ЛЯ., Петкевич АС. // Саиитарн. охрана территор. Украины и профилакт. особо опасн. ннфекц. Матер, научн.-прагг. конф., посв.бО-лет. Укр. Гос. противочуми. станц. Одесса. - 1997. - С.50-58.

И. Выявление антигена вируса Ласса на основе применения прямого и непрямого методов нммуиофлюоресценции / Владыко A.C., Зайцева В.Н., Школина Т.В.//Тез. докл. юбилейи. конфер. Грузни, противочуми. станц. Тбилиси, 1988. - с. 17-19.

12. Серологический контроль за лихорадхой Ласса у иностранных граждан, при-эывших в СССР из зпидемнчных районов Африки I Владыко АС., Быстро ва С.И., Лемеш-ко H.H., Зайцева В.Н., Бощенко Ю.А., Рьггик П.Г. II Матер. 8 обьед. Съезда гаг., микроб., >пид, параз. Минск,- 1991,-Т. 2. - С.ЮЗ-104.

13. Malaria patient serum crow-reacts with Lassa, Marburg and Ebola viruses / Vladyko AS., Zaytseva V.N., Maryankova R.F., Petkevich AS. // 8th Intem.Congr, of Immunol. Budapest, Hungary.-1992,- P.520.

14. Лимфоцитерный хорноменингит: серологические перекресты с родственными jпрусами / Зайцева В.Н., Быстрова С.И., Марьянкова Р.Ф., Школнна Т.В., Петкевич АС., Владыко A.C. // Матер, научи, конф., посвящ. 60-лет. мед. инст., Витебск,- 1994,-:.67.

15. Предварительный анализ результатов серологического обследования на ЛХМ Зольных с нейроинфекшюнной патологией в Беларуси / Зайцева В.И., Быстрова С.И., Куницкая ЛЯ., Школина Т.В., Марьянкова Р.Ф., Владыко АС. // Матер, междунар. научи, сонф., поев. 6-пет. образов. Гомельского мед.инст., Гомель,- 1995. -С.248-249.

16. Иммунологическая и биохимическая характеристика из оптических иммуноглобулинов к вирусу ЛХМ / Зайцева B.IL, Школина Т.В., Сзчек М.М., Щерба В.В., Владыко VC. II Сб. статей и тез. междунар. иаучн.-прахт. конфер. Смолевичи. -1997,- С.88.

17. Перспективы использования изотнпических антител класса G в твердофазном шмуноферменпюм анализе (ТИФА) при индикации вируса лнмфоцнтарного хориоме-шнпгга (ЛХМ)/.Зайцева В.Н., Куницкая Л.Я., Быстрова С.П., Школина Т.В., Головачева J.H., Владыко АС. // Зооантропонозн. болезни, меры профилакт. и борьбы. Матер, меж-гун. научн.-практ. конф. Гродно. - 1997.-С.56-57.

18. Разработка иммуноферментной тест-системы для диагностики лнмфощгтарного хориоменнигита (JIXM) у больных нейроинфекционной патологией / Куницкая Л.Д., Бы-строва С И., Головачева В.Н., Зайцева В.Н., Владыко А.С. // Достижения мед. науки Беларуси. Вып. 2,- 1997,-С.72.

19. Clq Induces Conformational Changes into the NP of Lassa Vims Antigen / Vladyko A., Slikolina Т., Zaytseva V,N. // Clinical Microbiology and Infection. 8th Europ. Congr. of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Lausanne, Switzerland.- 1997.- P.3S8.

РЕЗЮМЕ Зайцева Вера Николаевна

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ИНДИКАЦИЯ АНТИГЕНОВ ВИРУСОВ ВИРУСОВ ЛИМФОЦИТ АРНОГО ХОРИОМЕНИНГИТА, ЛАССА, МОПЕЙЯ С ПОМОЩЬЮ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ 02а И 02Ь

Ключевые слова: АРЕНАВИРУСЫ, ЛИНЕЙНЫЕ МЫШИ СВА И ВАШС, ИММУННЫЕ СЫВОРОТКИ, ПОДКЛАССЫ. 1ва ВЫДЕЛЕНИЕ, ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ, АНТИГЕНЫ.

Объект исследования: линейные мыши СВА и ВАЬВ/с, иммунные сыворотки мышей, перевиваемые культуры клеток, вирусы ЛХМ, Ласса, Мопейя.

Цель работы: дать характеристику и определить диагностическое значение отдельных подклассов иммуноглобулина б (61, 02а, бЬ), полученных из сыворотки крови инфицированных аренавнрусами ЛХМ, Ласса, Мопейя мышей линий СВА и ВАЕВ/с.

Методы исследования: вирусолоппескне, серологические, биохимические, статистические.

Аппаратура: световой, люминесцентный микроскопы, низкоскоросгные и ультрацеитрнфуги, термостат, зацпгшые лишш-боксы, иммуиоферментный анализатор, хроматографические колонки.

Полученные результаты. Изучена динамика образования аипгтел у линейных мышей СВА и ВА1ЛЗ/с при шпраназальном инфицировании аренавнрусами ЛХМ, Ласса, Мопейя. Показано, что линейные животные одинаково чувствительны к исследуемым вирусам при данном способе заражения и установлено, что сроки индукции вирусспецн-фическнх иммуноглобулинов класса б зависят от вида возбудителя. Впервые показано, что антивирусный иммунный ответ при шпраназальном введении исследуемых вирусов линейным животным сопровождается образованием подкласса 1е02Ь с высокой относительной авндностью. Выявлена зависимость получения фракций максимально обогащенных изотипами 01 и 02а от молярносп! и значений рН элгаирующего буфера и показано, что изучаемые подклассы 1202а и 1£С2Ь специфичны к структурному белку нуклео-капсида ареиавнрусов - КР. . '

Проведено сравнительное изучение нммунореакгнвностн подклассов ^О в гомологичной и гетерологичной системах. Доказана возможность применения анти-Мопейя [gG2Ь для приготовления диагностических иммунофермеитных тест-систем при выявлении антигенов вирусов ЛХМ и Ласса. Установлено, что использование 1в02а и 1в02Ь подклассов в сочетании с комплементом морской свинки в конечной конце1працнн 2,5-10,0 мг/мл приводит к увеличению чувстггельности твердофазного иммуноферментного аиалюа в 416 раз. На основе использования вирусспецнфических 1н02Ь разработан лабораторный регламент на производство тест-системы нммуноферментнон диагностической моноизотн-пнческой для выявления антигена вируса лимфоцигзрного хориоменинпгга (ЛХМ).

Научная иовтна: получены данные по чувствотелыгосги линейных мышей СВА II ВА1ЛЗ/с к арснавнрусам ЛХМ, Ласса, Мопейя при шгграназалыюм инфицировании и установлена зависимость динамики образования от вида возбудютля. Впервые показано, что однократное интраназальное введение исследуемых вирусов приводит к образованию высокоавидных антивирусных подкласса. Выявлена возможность применения гнти-Мопейя 1з02Ь для приготовления диагностических иммуноферментних тест-систем.

Рекомендации по использованию. Использование монокзопшических антител хля приготовления диагностических тест-систем.

Область применения: НИИ вирусологического профиля, цнпры гигиены и эпидемиологии.

РЭЗЮМЭ Зайцава Вера МЬсалаеУна

СПЕЦЫС НАЛ ШДЫКАЦЫЯ АНТЫГЕНА^ В1РУСА? ЯГМФАЦЫТАРНАГА ХАРЫЕМЕН1НПТУ, ЛАСА, МАПЕЙЯ 3 ДАПАМОГАЙ 1МУНАГЛАБУЛ1НАУ

G2a I G2b

Ключавыя еловы: АРЭНАВ1РУСЫ, Л1НЕЙНШ МЫШЫ СБА I BALB/C, 1МУН-НЫЯ СЫВАРАТИ, ПАДКЛАСЫ IgG, ВЫДЗЯЛЕННЕ, 1МУНАФЕРМЕНТНЫ АНАЛ13, АНШГЕИЫ.

Аб'ект даеледвашиз: лшейныя ыышы СВА i BALB/c, ¡мунныя сыварати мышэй, пераа1ваемыя культуры клетак, aipycw ЛХМ, Ласа, Мапейя.

Мзта мраззы: даць характеристику i вызначыцъ дыягнастычнае значэнне асобных падкласаУ ¡¡¿унаглабушну G (Gl, G2a, G2b), атрыманых з сыварати крыы шфщыравакых арэнавфусам) ЛХМ, Ласа, Мапейя мышэй лшШ СВА i BALB/c.

Методы даследвання: в1русалапчныя, сералапчкьш, биоймнныя, сгатыстычкыя.

Апгрстура: светавы, люмийсцэнтны М1краскопы, шзкахуткасныя i Ультрацэнтрыфуп, тэрмастат, ахо^ваючыя лшй-боксы, «мунаферментны внашзатар, хргматаграф1чныя кзлоню.

Атрыманыа вынЬе!. Вывучаиа динамика утварэння антшэлау у линейных мышэй СВА i BALB/c при ¡ытраназальным йфцыраваши eipycawi ЛХМ, Ласа i Мапейя. Паказа-уа, што лшейныя хсывелы аднолькава адчувальны да даследуемых eipycaj/ пры дадаеным спосабе зараясэння t установлена, што тэрмш ¡кдуыш вдеусспецыфмных ¡мунаглабулшаУ кяасу G залгжыць ад вцу узбуджальтка. Упершыню паказана, што антъшрусиы ¡мунны аахаз пры нгграназалышм ¡нф'Цыраьакга даследуемым1 sipycanti лшейных жывел супра-ааджаецца утварэннем падкласу !gG2b з высока» адноснай авщнасцю. Выяулена залеж-насць атрымання фракций IgG, максимальна абапионых Ьатышиы Gl i G2a ад малярнасш i значэнняу pH элкмруючага буфера i наказана, што вынучаемыя падкласы IgGl, lgG2a i lgG2b спецыфмны да структурнага бялка NP арэнамрусау.

Праведаена супастаулядьнае вывунэние (мунарэакгыунасщ падхласау IgG у гамала-пчнай i гетзралапчнай склэмах. Паказана магчымасць прымянення акты-Мапейя IgG2b для пагфьмтоукг дыягнастычныя ¡мунаферментных тэст-остэм пры выяуленш антыгенау sipycay ЛХМ i Jiaca. Установлена, што выкарыстамне lgG2a i lgG2b падкласау у спалучэнн! i камплемснтгм марской csitiw у канчзткоаан канцэнтрацьа 2,5-10,0 мг/мл прыводзщь да ¡зазялга.чия адчум äciy цвердафаэнага ¡мунаферментнага аналЬу у4-1бразоу.

На падстгг.. выкарыстання в1русслецыф'|чньк IgG2b распрацавгны лабараторны рэгдамекг 1>г. вит >чг.гц!» тэст-с1стэмы 1муигфсрие1гтнай дыягиастычнай монмзатшнчнай дгя ¡¡ияулгммл аз. сна sipyca лЫфацьгтарнага харысметнпту (ЛХМ).

Навукоа&а пазика: атрыманы выши па адчувальнасш лшейных мышэй СВА i BALB/c да арзнаЫрусгу ЛХМ, Лассг, Мапейя пры Ьгграназальным шфщыраваиш i усганоулещ »лсжкасць дынамдо утварэння IgG ад В1ду узбуджальшка. Упершыню наказана, што Еднгргзовае ¡1гтра1изальнге ггражэинс даследуемым1 арэнав1русаш прызод-3iui дд >тмрэиня БЫсокадв;дкых cjfTbiBipyciiux IgG2b падкласу. Выяулена магчымасць прыманеккз алты-МапгГи ¡sG2b для падрыхтоу» дыягпастычных ¡муиаферментных •raci-ci—^м.

1Ъкамг-кдцць,м па Быкврмстан!!». Выкарыстанне мона^затышчных антыцела^ для г.адрыхто^та дияшастмчньк Tici-acnu.

Тлл\я& &ы»арыстаяая: 1Щ1 В1русалаггчнага профшю, цэнтры ririciiu i wlasMiajiorii.