Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Катионные пептиды как средство переноса ДНК в клетки млекопитающих

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Катионные пептиды как средство переноса ДНК в клетки млекопитающих"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИГНАТОВИЧ Ирина Анатольевна

КА'ГИОННЫЕ ПЕПТИДЫ КАК СРЕДСТВО ПЕРЕНОСА ДНК В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03.00.25 - Гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в отделе биохимии ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Перевозчиков Андрей

Петрович

Официальные оппоненты' доктор биологических наук Корнилова Елена Сергеевна

доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН, профессор Баранов Владислав Сергеевич

Ведущее учреждение: Центральный научно-исследовательский институт

рентгенологии и радиологии МЗ РФ

Защита диссертации состоится «.&» У^ес-1??-^ 2005 г. в <<.У^> часов на заседании Диссертационного совета Д.212.232.12 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 1990346 Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан «ЗсР » г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д.212.232.12, кандидат биологических наук

Л. А. Мамон

щхч очъ

лт

"v Акту;

'альность работы

Проникновение макромолекул в эукариотические клетки является фундаментальной основой ряда процессов, обеспечивающих поддержание интегральной целостности организма. Исследование механизмов интернализации макромолекул клетками имеет принципиальное значение для понимания функционирования многоклеточных организмов в норме и при различных патологиях.

Эвдоцитоз представляет собой классический путь интернализации макромолекул. Тем не менее, в последнее время накапливаются данные, свидетельствующие о способности ряда внутриклеточных ядерных белков (активатора транскрипции Tat вируса иммунодефицита человека I типа, гомеодомен-содержащего фактора транскрипции Antp и др.) переноситься из клетки в клетку без участия классического эндоцитоза. Механизм транслокации таких белков до сих пор остается мало понятным. По всей видимости, в проникновении этих белков через клеточную мембрану не участвуют какие-либо рецепторные молекулы (Prochiantz, 2000; Rubartelli et al., 1998). В ряде работ делеционным анализом установлено, что за интернализацию отвечают короткие фрагменты белковой молекулы, отличающиеся высоким содержанием положительно заряженных аминокислотных остатков - пенетратины (Wender et al., 2000). Более того, пенетратины, будучи ковалентио-сцепленными с белками-репортерами способны обеспечивать эффективную доставку последних в ткани экспериментальных животных (Fawell et al.,1994; Schwarze et al., 1999). Показана важность остатков аргинина для процесса переноса через клеточные мембраны (Suzuki Т. et al., 2002).

В последние годы значительное внимание уделяется разработке методов генетической коррекции ряда патологий человека. Применение с этой целью вирусных векторов имеет существенные ограничения. В связи с этим, актуальной является разработка невирусных методов переноса ДНК. Несмотря на более низкую эффективность, невирусные средства лишены ряда недостатков вирусных векторов. Высокая эффективность пенетратинов, в частности фрагмента (47-57) основного домена белка TAT вируса HTV-1 (ТАТ-пептида), в качестве средства доставки ковалентно сцепленных с ними биологически активных макромолекул, а также наличие в их составе большого числа основных аминокислотных остатков позволило рассматривать ТАТ-пептид как перспективное средство переноса ДНК в клетки млекопитающих in vitro и in vivo. В этой связи, принципиальное значение имеют детальные исследования механизма проникновения комплексов ДНК с пенетратинами в клетки млекопитающих.

Цель и задачи исследования. Целью работы является изучение условий формирования комплексов ДНК с катионными пептидами и исследование механизмов проникновения таких комплексов в клетки млекопитающих. Для достижения поставленной цели следовало решить

следующие задачи:

1 Изучить условия образования комплексов катионных олигопептидов, таких как ТЛТ и Ks, с плазмидной ДНК

2 Выяснить возможную роль эндоцитоза в поглощении клетками млекопитающих комплексов ДНК с катионными пептидами.

3. Разработать систему переноса ДНК в клетки млекопитающих на основе фрагмента (47-57)

основного домена транскрипционного фактора TAT вируса HTV-1. 4 Апробировать комплексы ДНК/TAT в качестве средства доставки ДНК в организм млекопитающих и выяснить факторы, препятствующие эффективной экспрессии перенесенных генов при системном введении комплексов. Научная новизна: В результате настоящего исследования впервые показана способность фрагмента (47-57) основного домена белка TAT вируса HTV-1 (ТАТ-пептада) электростатически взаимодействовать с плазмидной ДНК, образуя полиэлектролитные комплексы. Такие комплексы способны проникать в культивируемые клетки млекопитающих, обеспечивая эффективную экспрессию перенесенных генов. В ходе работы показан эндоцитоз-опосредованный механизм проникновения комплекса ДНК/TAT в клетки, аналогично процессу интернализации комплексов плазмидной ДНК с лизин-богатым пептидом Кв и другими поликатионными носителями. Впервые выяснено стимулирующие влияние избытка свободного положительно заряженного пептида в реакционной смеси на эффективность трансфекции клеток в культуре комплексом катионный пептид /ДНК.

В то же время показано, что повышение содержания свободного пептида в реакционной среде при системном введении комплексов ДНК/Т AT и ДНК/Ks in vivo приводит к снижению экспрессии доставляемого гена. Полученные данные свидетельствуют, что низкий уровень экспрессии чужеродного гена в случае внутривенной доставки комплексов ДНК/ТАТ объясняется их инактивацией в кровеносном русле животного в результате взаимодействия с сывороточным альбумином.

Практическая значимость работы заключается в разработке в ходе проведенного исследования системы переноса генов в культивируемые клетки млекопитающих на основе ТАТ-пептида Изучение механизмов проникновения комплексов ДНК/пептид, а так же влияния свободного пептида на эффективность доставки таких комплексов представляет определенную ценность для понимания механизмов переноса макромолекул через цитоплазматическую мембрану. Выяснение причин, препятствующих эффективной работе векторов экспрессии доставляемых с помощью катионных пептидов в организм животных позволяет вести работу по усовершенствованию средств доставки генетических конструкций Результаты настоящего исследования могут бьггь использованы при разработке и реализации проектов, направленных на создание невирусных методов переноса ДНК в организм млекопитающих ^Ч4л°век4.

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Фрагмент основного домена транскрипционного фактора ТАТ (47-57) вируса HIV-1 электростатически взаимодействует с плазмидной ДНК с образованием полиэлектролитных комплексов ДНК/TAT, которые способны проникать в клетки млекопитающих и обеспечивать эффективную экспрессию перенесенных генов

2 Комплексы плазмидной ДНК с катионными пептидами ТАТ и К« проникают в клетки млекопитающих путем эндоцитоза

3 Низкая активность комплексов ДНК/TAT при системном введении мышам обусловлена, в частности, взаимодействием комплексов с сывороточным альбумином, что приводит к изменению путей интернализации комплексов.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано две статьи и 9 тезисов докладов и сообщений на всероссийских и международных конференциях, симпозиумах и съездах Результаты работы докладывались на международных конференциях «СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург, 2000, 2002 гг.), международной конференции «Human Genome Meeting» (Шанхай, 2002), третьем Съезде биохимического общества России (Санкт-Петербург, 2002 г), 19-м Съезде Федерации европейских биохимических обществ «FEBS special meeting on signal transduction» (Брюссель, 2003 г), 5-й международной конференции rio биофизике «ÍCBP-2004» (Стокгольм, 2004 г ) и других конференциях Структура н объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы Диссертация изложена на »Страницах, содержит-^ рисунка и . таблиц. Список литературы содержитЯГ^ис гочника

Материалы и методы.

Клеточные линии. В работе использованы клетки гепатомы человека линии HepG2, клетки яичника золотистого хомячка линии CHOI, клетки почки зеленой мартышки линии BGM (банк клеточных культур Института цитологии РАН, СПб) Животные В экспериментах in vivo использовались мыши линии С57В1/6 (самцы) (питомник «Рапполово» РАМН СПб) Пла;миды pCMVL - вектор экспрессии бактериального гена lacZ, кодирующего (3-галактозидазу, pCMVIuc - вектор экспрессии бактериального гена люциферазы получены ранее в отд биохимии НИИЭМ РАМН. Конструкция pAIg, содержащая фрагмент 12 kb хромосомного гена аполипопротеина A-I человека (ароА-I), предоставлена Dr. L Chen. Пептиды. Лизин-бо!агый пептид Kg (YKAKgWK) (Gottschalk , ct al. 1996), аргинин-богатый фрагмент основного домена белка ТАТ вируса HIV-1 ("'YGRKKRRQRRR") (ТАТ-пептид) (Prochaiantz, et al. 2000), а также флюоресцентно меченый с помощью 4(5)-карбоксифлюоресцеипа ТАТ-пептид синтезированы с. н. с НИИ высокомолекулярных соединений РАН С В Буровым.

Комплексы ДНК с катионными пептидами TAT и K« готовили в насыщающих избытках пептида, с последующей очисткой от не связавшегося пептида ультрафильтрацией с использованием центрифугирования на конусах Centricon YM-10 ("Millipore"). Количество пептида, входящее в состав комплекса, определяли обратным титрованием гепарином. Прямое изучение стехиометрии комплексов ДНК/пептид проводили гель-ретардацией в агарозном геле с использованием флюоресцентно меченого ТАТ-пептида (TAT-F) Трансфекцию клеток препаратами комплексов ДНК/Kg, ДНК/ТАТ, ДНК/TAT-F выполняли на основании методики, предложенной Gottschalk с соавторами (Gottschalk et al., 1996). Комплексы ДНК/пептид с разными соотношениями зарядов ДНК и пептида готовили из расчета 12 мкг ДНК на чашку в 500 мкл PBS. После инкубации клеток с комплексами в течение 2 ч клетки отмывали от неинтернализовавшихся комплексов раствором гепарина (58 мкг/мл в PBS) и инкубировали в среде DMEM с 10% сывороткой 24 ч.

Конфокальная флюоресцентная микроскопия. Для исследования внутриклеточной локализации ТАТ-пептида и комплекса ТАТ-пептида с плазмидной ДНК к клеткам одновременно добавляли эквивалентные количества флюоресцентно меченого пептида TAT-F и комплекса ДНК/TAT-F Через 30 минут клетки трижды промывали раствором гепарина (58 мг/мл), анализировали с помощью микроскопа Leica TCS SP1.

Для измерения уровня интернализации флюоресцентно меченого пептида TAT-F и его комплексов с плазмидной ДНК клетки инкубировали с пептидом или с комплексами в течение двух часов, затем отмывали раствором гепарина (58 мг/мл) на PBS. Грубые цитоплазматические и ядерные фракции получали, как описано ранее (Andrews N. С., and Faller, D. V., 1991). Интенсивность флюоресценции измеряли с помощью флюоресцентного спектрофотометра (Hitachi 650-60) при облучении на 460 им, поглощении при 523 нм. Ширина щелей поглощения и испускания 10 и 20 нм соответственно.

Введение пептида и комплексов ДНК/пептид в кровеносное русло мышей: Введение комплексов, пептида и голой ДНК производили в хвостовую вену мыши гидродинамическим способом. (Liu F. et al., 1999). Для исследований использовали мышей линии C57BL/6 (самцы возраста 6-8 недель, вес 17-19 г). Точный объем (V) вводимого раствора вычисляли по формуле, полученной на основании данных F. Liu с соавторами V(mji) - 0 057143 х тср + 0.5143 (Акифьев Б.Н. и др., 2004). мРНК гена ароЛ-1 человека в печени мышей выявляли с помощью «гнездовой» RT-PCR (nested RT-PCR). Уровень человеческого АроА-1 в сыворотке инъецированных мышей определяли с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием поликлональных антител кролика против человеческого АроА-1 и вторичных козьих, антител к IgG кролика, коньюгированных с пероксидазой хрена. В качестве хромогенного субстрата использовали диаминобензидин.

Результаты и обсуждение 1. Изучение условий образования и ингернализации комплексов катионных олигопепидов TAT и K« с плазмидной ДНК.

Катионные пептиды TAT и Kg электростатически взаимодействуют с плазмидной ДНК, формируя комплексы, способные проникать сквозь плазматическую мембрану и обеспечивающие эффективную экспрессию доставляемых генетических конструкций. Эффективность трансфекции комплексами ДНК/TAT и ДНК/ICs возрастала в случае приготовления комплексов в условиях избытков по зарядам катионных пептидов Максимально эффективную доставку обеспечивали комплексы, приготовленные в условиях пятикратного избытка положительных зарядов в реакционной смеси (рис 1а) Дальнейшее увеличение положительно-заряженных избытков пептида приводило к снижению уровня грансфекции клеток (рис 16).

ш и

5 Й 0,4

S га

О Ч

5 3

с « о с £ Ё

0,2

I

Т]

m

.в4

[Tl

. N. -Ч ,4 .4

/ / / /

соотношение зарядов ДНК пептид

рСМЛЛ* (11)

pCNMJTet (15)

рСМЛЯа! (120) '

соотношение зарядов ДИКТАТ

Рис. 1. Трансфекция клеток Нерв2 комплексами ДНК/пептид: а- сравнение эффективности трансфекции комплексами ДНКАГАТ и ДНК/К! при различных соотношениях зарядов ДНК ■ пептид, б-изменение эффективности трансфекции клеток линии НерС(2 комплексам рСМУЬ/ТАТ при различных соотношениях в комплексе ДНК : ТАТ-пептид.

Такая зависимость эффективности переноса от избытка «+» заряда комплекса характерна и для других катионных переносчиков ДНК Вместе с тем, в литературе отсутствуют данные по изучению стехиометрии комплексов ДНК с поликатионами. Предполагается, что стимулирующее действие молярных избытков поликатионных носителей на уровень трансфекции клеток объясняется лучшей адсорбцией положительно заряженных комплексов ДНК/поликатион на отрицательно заряженной клеточной мембране (Coffin R S et af, 1996; Colin M et al, 2001; Cotten M. et al., 1990) Для проверки этой гипотезы в настоящей работе

проводили прямое исследование стехиометрии комплексов ДНК с катионными пептидами TAT и К) с использованием метода обратного титрования гепарином. С этой целью формирование комплексов ДНК/пептид проводили в условиях 10-кратного избытка положительно заряженных пептидов, с последующей очисткой от не связавшегося пептида ультрафильтрацией. Полученные комплексы содержали максимально возможный, положительный заряд. Количество пептида, входящего в состав комплекса, определяли обратным титрованием гепарином. Было показано, что максимальное соотношение в комплексе ДНК:К8 равно 1:1,8 и ДНК:ТАТ 1:1,7, соответственно. Полученные данные подтверждены анализом комплексов ДНК/TAT-F, приготовленных при различных соотношениях зарядов, методом гель-ретардации (рис. 2).

Рис. 2. Гель-ретардация комплексов ДНК/TAT-F, приготовленных при различных соотношениях;

->pCMVLft«»-F

1- pCMVL;

2- соотношение ДНК:ТАТ 1:0,3; «pCMVL 3" соотношение ДНК:ТАТ 1:0,6;

4- соотношение ДНК:ТАТ 1:1,

5- соотношение ДНК:ТАТ 1:1,7;

6- соотношение ДНЮТАТ 1:3;

1 2 3 4 в в

При формировании комплексов в условиях соотношения зарядов в реакционной смеси ниже чем 1:1,7 в среде регистрируется свободный TAT-F, мигрирующий при электрофорезе к катоду, в отличие от связанного с ДНК TAT-F, не выходящего из лунок геля. Доказательства того, что катод-мигрирующая фракция соответствует именно свободному ТАТ-пептиду, а не положительно заряженному комплексу ДНК/TAT-F, получены вымачиванием геля после электрофоретического разделения в растворе гепарина с бромистым этидием, что приводит к освобождению ДНК из комплексов с TAT и к восстановлению флюоресценции ДНК, опосредуемой этидием бромидом. В результате было показано, что вся ДНК остается в лунках геля.

Отличие оптимального для эффективности трансфекции соотношения ДНЮТАТ (пятикратный избыток «+» зарядов), от реального соотношения ДНК/ТАТ в составе комплексов (1,7-кратный избыток «+» зарядов) свидетельствует о возможном участии свободного ТАТ-пептида в прохождении комплексов ДНК/ТАТ через клеточные мембраны.

По-видимому, стимулирующее действие свободного, не входящего в состав комплекса TAT пептида объясняется защитой комплексов от разрушения отрицательно заряженными протеогликанами клеточной поверхности.

2. Механизм проникновения комплекса ДГПГ/кятчонный пептид в клетки млекопитающих. В литературе существуют противоречивые данные о механизмах

8

проникновения пенетратинов в клетки В этой связи особый интерес представляло изучение механизмов проникновения комплексов ДНК с ТАТ-пептидом в клетки млекопитающих.

Для сравнения механизмов проникновения ТАТ-пеотида и комплексов ДНК/ТАТ использовали флуоресцентную конфокальную микроскопию (рис. 3). Значительных отличий в скорости интернализации обнаружить не удалось. Появление окраски, как в случае ТАТ-Р, так и в случае рСМУЬЛ'АТ-Р, наблюдали не ранее чем через 20 минут после добавления пептида или комплекса к культуре клеток. Тем не менее, наблюдалась различная внутриклеточная локализация пептида и комплексов ДНК/пептид. При использовании свободного ТАТ-Р наблюдалось равномерное окрашивание цитоплазмы (рис За), тогда как при трансформации комплексами специфическая флюоресценция выявлялась в отдельных цитоплазматических везикулах (рис 36).

Рис. 3. Анализ внутриклеточной локализапии комплекса и пептида в клетках линии Нер62: а внутриклеточная локализация комплекса рСМУЬ/ТАТ-р; 6- внутриклеточная локализация свободного ТАТ-Р пептида. Клетки инкубировались в присутствии пептида или комплекса в среде при +37°С в течение 30 мин. Оценка флюоресценции с помощью конфокальной микроскопии

Более точное изучение динамики проникновения в клетки комплекса и пептида проводили количественным измерением флюоресценции интернализованного красителя в лизатах клеток через 5, 15, 30 и 120 минут после добавления к клеткам рСМЛТЛГАТ-Р и ТАТ-К (рис. 4а). Скорость интернализации комплексом ДНК/ТАТ-Р оказалась несколько ниже, чем скорость интернализации свободного ТАТ-Р, что, вместе с данными о везикулярной внутриклеточной локализации комплексов (рис. 3), свидетельствуют в пользу эндоцитоз-опосредованного механизма поглощения комплексов ДНК/ТАТ. Следует отметить, что уровень интернализации свободного ТАТ-пептида, зафиксированный в наших экспериментах, значительно ниже, чем предполагаемый в случае пенетратин-зависимого проникновения в клетки.

9

к « 3 5 0

S f 300 -

J 1Д+08 -

S ^ 1.E+07 -

is .,,-.„„

1.E+09 -

Z = illU *

i I »• -

E ® 200 -

u 9-

| I 150 -

Д 5 ioo -

100 -so -

1 g 1.E+04 -§ 1 1.E+03 -| 1.E+02 -

§ 1.E+06 -| 1.E+05 -

о

с

5' 15' 30' 60' 120' 240'

время (мин)

о i 15- зо вовремя, минуты

а

б

Рис. 4. а- Измерение уровня интернализацш комплекса ДНК/TAT-F и свободного пептида: кинетика проникновения TAT-F (квадраты) и комплексов pCMVL/TAT-F (треугольники) в клетки линии СНО-1.

б- Зависимость эффективности трансфекции от срока инкубации клеток линии HepG2 с комплексом pCMVluc/TAT.

Для исключения артефактов при измерении скорости проникновения комплексов ДНК/TAT-F за счет их возможного разрушения оценивали экспрессию гена-маркера люциферазы, доставленного в клетки в составе вектора экспрессии pCMVluc в комплексе с TAT-F (рис.4б). Выявлен сходный характер зависимости уровня трансфекции клеток от времени инкубации с комплексами, подтверждающий результаты измерения кинетики ингернализации комплексов (рис 4а).

Проникает ли комплекс ДНК/TAT в клетки энергонезависимо, подобно свободному ТАТ, или его проникновение происходит с затратой энергии, выясняли с использованием азида натрия (ингибитора окислительного фосфорилирования), присутствие которого в культуральной среде приводит к дефициту клеточного пула АТР и, как следствие, к ингибированию энергозависимого клеточного транспорта (Sandvig К. and Olsnes S. 1982). Проникновение комплекса в клетки было в значительной степени подавлено в присутствии 10 тМ азида натрия. На проникновение свободного ТАТ-пептида наличие NaN3 в той же концентрации не оказывало эффекта (рис 5а). Такие данные говорят в пользу энергозависимого механизма проникновения комплекса ДНК/TAT в клетки. Такую интерпретацию результатов подтверждают результаты по изучению влияния №N3 на эффективность трансфекции клеток комплексами pCMVL/TAT (рис. 56). Уровень активности Р-галактозидазы в клеточных лизатах после трансфекции комплексом pCMVL/TAT в присутствии в NaNi натрия значительно снижался. Отсутствие полного подавления экспрессии гена-репортера под действием азида натрия объясняется, тем фактом, что NaNi подавляет только митохондриальный сшггез АТР, не затрагивая гликолиз. Таким образом, частичное сохранение экспрессии гена-репортера соответствует уровню интернапизации комплексов, обеспеченному за счет гликолитического синтеза АТР.

1 б

Рис.5, а- Влияние №N3 на интернализацию свободного ТАТ-пептвда и комплекса рСМУЬ/ТАТ клетками Нерв2. через 2 часа после добавления пептида или комплекса; К - необработанные клетки; ТАТ-Р - клетки, обработанные ТАТ-Б; рСМУЬ/ТАТ-Р - клетки, инкубированные в присутствии комплекса рСМУЬ/ТАТ-Р; КаЭД - преинкубация клеток в присутствии азида натрия перед добавлением пептида или комплекса. Колонки белого цвета - флюоресцентная активность цитоплазматияеских фракций; заштрихованные колонки - ядерные фракции;

6- влияние №N3 на эффективность трансфекции клеток линий СНО-1, Нер02 и В ОМ комплексами рСМУЬ/ТАТ-Р. Колонки белого цвета - активность р-галактозидазы в клетках СНО-1; заштрихованные - в клетках линии НерС2; черные - в клетках линии ВвМ.

Еще одним доказательством энергозависимого механизма проникновения комплекса ДНК/ТАТ является влияние низкой температуры (4°С) и отсутствия ионов кальция в среде на эффективность трансфекции. Активность р-галактозидазы в экстрактах клеток линии НерСт2 практически полностью подавлялась в случае трансфекции клеток комплексом при температуре 4°С. Уровень активности р-галактозидазы значительно снижался при трансфекции комплексом в условиях отсутствия ионов экстраклеточного Са2+ в культуральной среде.

Из полученных результатов можно сделать вывод, что в интернализации свободного ТАТ-пептида и комплексов ДНК/ТАТ задействованы различные механизмы проникновения в клетки. Более того, полученные данные свидетельствуют в пользу эндоцитоз-опосредованного механизма поглощения комплексов ДНК/ТАТ клетками, подобно интернализации комплексов плазмидной ДНК с другими поликатионными носителями.

Дополнительные доказательства роли эндоцигоза в интернализации комплексов ДНК/ТАТ

были получены в опытах с метил-Р-циклодекстрином - веществом, удаляющим холестерин из

плазматической мембраны и ингибирующим клатрин-зависимый и кавеоле-зависимый

11

варианты эндоцитоза (Rodal S.K. et al., 1999; Subtil A. et al., 1999). Присутствие в культуральной среде метил-р-циклодекстрина приводило к существенному подавлению интернализации как свободного TAT-F, так и комплексов TAT-F с ДНК (рис. 6)

Рис. 6.

Влияние метил-Р-циклодекстрина на интернализацию свободного флуоресцентно меченного пептида TAT-F и комплексов pCMVL/TAT-F клетками линии HepG2.

По мнению некоторых исследователей, в определенных устовиях fEguchi А . et al 2001) ТАТ-пептид может обеспечивать доставку присоединенных к нему фаговых частиц в клетки млекопитающих через кавеоли, небольшие инвагинации (50-70 нм) в пла!чатической мембране Кавеоли относятся к подклассу устойчивых к детергентам мембранных доменов, обогащенных холестеролом и сфингочипидами (Kurzchalia TV, Parton RG, 1999) Возможную роль кавеолей в процессе интернализации комплексов ДНК/ТАТ исследовали с использованием специфического ингибиюра - нистатина, вызывающего рачрушение холестерин-богатых доменов цитоплазматической мембраны

Инкубация клеток линии СНО-1 и HepG2 с нистатином (25 мкг/мл) приводила к стимупяции проникновения свободною ТАТ-лептида, перепое комплексов pCMVL/TAT подавлялся в его присутствии (рис 7а) Аналогичные эксперименты, про веденные на линии BGM, показали 01сутствие влияния нжлажпа па перенос ТА I -пептида и комплексов pCMVI/ГАТ (рис 76) Данные подтверждены результатами по оценке уровня экспрессии гена-ренортера доставленного в комплексе pCMVL/TAT в клетки линий BGM и HepG2 в присутствии нистатина (25 мм/мл) (рис. 7в). Как и в предыдущих экспериментах, преинкубация клеток HepG2 в присутствии нистатина (25 мкг/мл) в значительно подавляла проникновение комплекса pCMVL/TAT, та же концентрация нистатина практически не оказывала влияния на активность Р-галактозидазы в клетках линии BGM. Полученные результаты служат обоснованием того, что кавеоли принимают участие в процессе интернализации комплексов ДПК/ТАТ, по крайней мере, в клетках линий СНО-1 и HepG2.

к 600 -1 § 500 -| а 400 || зоо So. 200-g § 100 Í£ о] rî-] rb ЧЕп -î-

* it , О C¿ ц. eJ . О 5 ¿O §2 2 ¿ О a ¡с s « р u. a4- ù. u.

¥ 900

If 800 Ф 700 -x 600 3 500 g. 400 -g 300 * 200 •е- loo S о

x л

i

<J

0

1

Рис. 7. Роль кавеолей в проникновении комплекса ДНК/TAT в клетки линий СНО-1, HepG2 и BGM. а-б - влияние нистатина на интернализашпо комплексов pCMVL/TAT клетками линий HepG2 (а) и BGM (б). Белый цвет - колонки представляющие флюоресцентную активность цитоплазматических фракций; штриховка - флюоресцентную активность ядерных фракций (в) - влияние нистатина на эффективность трансфекции комплексами pCMVL/TAT белый цвет - активность ß-галактоидазы в клетках линии HepG2; черный - активность ß-галактоидазы в клетках линии BGM.

Даже в случае нистатин-чувствительных клеток подавление переноса комплексов ДНК/ТАТ и экспрессии перенесенных генов-репортеров в присутствии нистатина было не полным, что указывает на участие других вариантов эндоцигоза в поглощении комплексов. Можно заключить, что проникновение комплексов ДНК/ТАТ в клетки млекопитающих происходит эндоцитоз-опосредованными путями. Более того, в зависимости от использованных линий клеток относительный вклад разных вариантов эндоцитоза в процесс поглощения комплексов ДНК/ТАТ оказывается различным.

3. Распределение комплексов ДНК/ТАТ в тканях мыши после их инъекций в хвостовую

вену мышей. Несмотря на высокую эффективность большинства из известных невирусных

систем доставки генов, основанных на образовании комплексов плазмидной ДНК с

поликатионными носителями, при трансфекции в системах in vitro, хорошо известно, что

комплексы ДНК с поликатионами подвергаются быстрой инактивации в кровеносном русле

после внутривенного введения (Dash P.R., et al. 1999), что создает существенные препятствия

для применения таких систем in vivo. С другой стороны, доставляемый с помощью

внутривенных инъекций млекопитающим свободный ТАГ-пептид, также как и ТАТ-пептид,

коньюгированный с биологически активными макромолекулами, обеспечивал эффективное

проникновение сцепленных с ним веществ в ткани (Schwarze S.R., et al. 1999). Для проверки

13

эффективности системы доставки ДНК, основанной на ТАТ-пептиде, in vivo комплекс

ДНК/TAT гидродинамически вводили в хвостовую вену мышам. Поскольку большая часть

комплексов, доставленных внутривенными инъекциями, локализовалась в печени, для

изучения экспрессии чужеродного гена, доставляемого в комплексе с ТАТ-пептидом,

использовали специфичный для печени вектор экспрессии pAlg, несущий ген человеческого

аполипопротеина A-I. мРНК ароА-1 человека выявляли с помощью гнездового PCR в печени

мышей через трое суток после инъекции им комплексов pAlg/Tat (рис 9).

Рис 9. Определение мРНК ароА-1 человека в печени инъецированных мышей 1 и 15 - ДНК фага X в составе конструкции Pstl (маркер) 2 и 3 позитивный контроль с внешними праймерами pAlg и pCMVapo, 4 - негативный контроль с внешними праймерами, 5 - негативный контроль с внутренними праймерами; 6-8 мышь №1 6 -nested PCR без RT, 7 - PCR с внешними праймерами 8 -nested PCR с внешними и внутренними праймерами; 9-11 мышь №2; 9 - nested PCR без RT; 10 - PCR с внешними праймерами,, 11 - nested PCR с внешними и внутренними праймерами; 12-14 мышь №3; 12 - nested PCR без RT; 13 -PCR с внешними праймерами; 14 - nested PCR с внешними и внутренними праймерами, Стрелки - специфические продукты амплификации с внешними и внутренними 1 i 1 4 9 I 7 > t 10 11 12 1» и II парами праймеров

£ 1800 -

1600

О 1400 m

1

<¿

о

CL (б к

S

=г

СО

е-

X §

1200 -1000 600 600 400 200 0

На рис. 10 представлены результаты оценки уровня человеческого аполипопротеина A-I в сыворотке крови мышей через 5 дней после гидродинамического внутривенного введения комплекса pAlg/Tat в сравнении с результатами инъекций плазмидной ДНК pAlg. Человеческий аполипопротеин A-I выявлялся в сыворотке мышей после инъекций как комплекса pAlg/Tat, так и «голой» pAlg. Однако уровень человеческого аполипопротеина А-1 в сыворотке после инъекции комплекса pAlg/Tat был ниже чем после введения голой ДНК. Более того, возрастание положительного заряда комплекса в значительной степени снижало экспрессию доставленного гена, в противоположность результатам, полученным на культуре клеток, где возрастание положительного заряда увеличивало эффективность трансфекции.

Рис.10. Оценка эффективности экспрессии человеческого ароА-1 после доставки комплекса pAlg/TAT в печень мыши в зависимости от соотношения ДНК ТАТ в доставляемом комплексе '

4. Влияние сывороточного альбумина на интернализацию комплексов ДНК/ТАТ и

экспрессию гена, доставленного в комплексе с носителем. Низкий уровень экспрессии

гена, доставленного в комплексе с ТАТ-пептидом мышам по сравнению с переносом «голой»

14

iSI ,

^ ^ ¿ъ4

^ т-»* *»•" т».'

4 Чу.

■г «г J

ДНК гидродинамическим методом может объясняться несколькими причинами. Во-первых, в случае доставки ароА-1 в комплексе с ТАТ-пептидом, низкий уровень экспрессии перенесенного гена может являться следствием деградацией большей части комплексов в лизосомах гепатоцитов; во-вторых, низким уровнем интернализации комплекса pAlg/TAT клетками по сравнению с «голой» плазмидной ДНК. В частности, низкий уровень человеческого аполипопротеинна A-I в сыворотке крови мышей может объясняться быстрой инактивацией полиэлектролитных комплексов за счет их взаимодействия с белками плазмы крови (Dash P.R., et al 1999).

Для изучения данного вопроса были проведены эксперименты по влиянию основного компонента плазмы крови - сывороточного альбумина (BSA) на проникновение комплексов ДНК/TAT и ТАТ-пептида в клетки (рис. 10).

у свободный TAT-F

V s\í> -vV г», ВЗА, мг/мл

Рис. 10. Взаимодействие BSA с пептидом TAT-F и комплексами pCMVL/TAT - влияние на процесс интернализации: а- электрофоретаческий анализ TAT-F и комплекса TAT-F-BSA; "+" и "-" указывают направление электрического поля; б- восстановление флюоресценции в комплексе pCMVL/ГАТ в результате добавления BSA; в- влияние BSA на эффективность трансфекции клеток HepG2 комплексами pCMVL/TAT; г- влияние BSA на процесс интернализации комплексов pCMVL/TAT-F в клетках линии HepG2 (столбики белого цвета) и BGM (заштрихованные столбики).

Установлено, что BSA способен связывать как свободный ТАТ-пептид, так и комплексы ДНК/TAT Для доказательства прямого взаимодействия между BSA и ТАТ-пептидом провели совместную инкубацию пептида TAT-F и BSA с последующим элсктрофорстическим анализом реакционной смеси (рис 10а) Инкубация TAT-F с BSA приводила к появлению в геле флюоресцентно меченой фракции, мигрирующей к аноду, в противоположность основной катод-мигрирующей флюоресцирующей фракции, соот ветствуюшей свободному TAT-F Наблюдаемая в этом эксперименте анод-мигрирующая фракция соответствует комплексу TAT-F/BSA и имеет отрицательный заряд, специфический для BSA На рис 106 представлены резучьтаты эксперимента по восстановлению этидий бромид-опосредованной флюоресценции ДНК в комплексе с ТАТ-пептидом при добавлении BSA Формирование комплекса ДНК/поликатиом обычно приводит к сильной компактизации ДНК и диссоциации последней с бромистым этидием, что, в свою очередь, вызывает гашение флюоресценции ДНК/этидиум бромид (Wolfert MA, et al 1996, Dash P R, et al 1999) Инкубирование комплекса pCMVL/TAT (соотношение по зарядам ДНК ТАТ 1'1) с BSA приводит к частичному восстановлению эгидиум бромид-опосредовапной флюоресценции ДНК Полученные результаты можно объяснить либо способностью BSA вытеснять ДИК из комплексов с ТАТ-пептидом, аналогично гепарину, либо взаимодействием BSA с комплексами ДНК/TAT, чго приводит к изменению конформации последних, сопровождающемуся частичной деконденсацией ДНК Такая декомпенсация, в свою очередь, позволяет ДНК взаимодействовать с этидиум бромидом и приводит к частичному восстановлению флюоресценции Электрофоретический анализ комплексов ДНК/TAT после их инкубации с BSA не выявил в реакционной смеси свободной ДНК (данные не представлены) Следовательно, приведенные на рис 106 данные свидетельствуют о том, что BSA в физиологических концентрациях способен связывать комплексы ДНК/TAT и изменять их структуру

Для проверки возможного эффекта BSA на уровень экспрессии гена-репортера lacZ, переносимого в комплексе с ТАТ-пептидом клетки HepG2 трансфецировали комплексами pCMVL/TAT (соотношение зарядов 1 5) в присутствии BSA в физиологической концентрации (3,5 мг/мл) в культуралыюй среде (рис 10в) Добавление BSA к кульгуре клеток одновременно с комплексами pCMVL/TAT приводило к значительному подавлению экспрессии гена-репортера Для изучения механизма влияния BSA анализировали интернализацию свободного пептида TAT-F, и комплекса pCMVI /ТАТ-F в присутствии BSA Обнаружено, что при добавлении к клеткам BSA возрастает уровень проникновения как свободного пептида, так и комплексов в клетки (рис Юг) Следовательно, негативное влияние BSA на экспрессию переносимой в комплексе с ТАТ-пептидом плазмидной ДНК не может объясняется опосредованным BSA ингибированием проникновения комплексов

Весьма вероятно, что взаимодействие BSA с комплексами ДНК/TAT приводит к его адсорбции на поверхности комплексов и изменению конформации BSA, что, в свою очередь, приводит к захвату таких комплексов «scavengere-рецепторами клеток. По всей видимости, BSA способен, связываясь с комплексом ДНК/TAT, менять путь интернализации последних, направляя такие комплексы в эндосомально/лизосмальные компартменты с последующей быстрой деградацией комплекса.

Тем не менее, способность ТАТ-пептида взаимодействовать с альбумином сыворотки крови не является препятствием для переноса ковалентно сшитых с ТАТ-пептидом макромолекул в ткани животного (Schwarze S.R et al., 1999), поскольку уровень переноса таких гибридных молекул значительно выше, чем при эндоцитоз-опосредованном механизме проникновения Возможно, пространственное расположение пептида при образовании комплекса с плазмидной ДНК изменятся таким образом, что позитивно-заряженные аргениновые остатки ТАТ-пептида, входящего в состав комплекса, не могут напрямую контактировать с фосфолипидами плазматической мембраны, что препятствует реализации пенетрааин-зависимого механизма проникновения пептида в клетки (Wender P.A. et al., 2000; Torchilin V.P. et al., 2001).

В настоящей работе показано, что катионные пептиды Kg и TAT способны эффективно формировать компактные комплексы с плазмидной ДНК. Такие комплексы способны успешно доставлять чужеродную ДНК в культивируемые клетки млекопитающих. Полученные данные доказывают эндоцитоз-опосредованный механизм проникновения комплекса ДНК/TAT в клетки млекопитающих, аналогично процессу интернализации комплексов плазмидной ДНК с Kg и другими поликатионными носителями. Избыток свободного положительно заряженного пептида увеличивает эффективность трансфекции клеток в культуре комплексом катионный пептид/ДНК. Вместе с тем, повышение содержания свободного пептида дает противоположный эффект при введении комплексов ДНК с ТАТ-пептидом in vivo и приводит к снижению уровня экспрессии трансфецированного гена. Достаточно низкий уровень экспрессии чужеродного гена в печени мыши в случае внутривенной доставки комплекса соответствует инактивации комплекса пептид/ДНК в кровеносном русле животного в результате взаимодействия вводимого комплекса с сывороточным альбумином.

ВЫВОДЫ

1. Фрагмент основного домена транскрипционного фактора TAT (47-57) вируса HIV-1 электростатически взаимодействует с плазмидной ДНК с образованием полиэлектролитных комплексов ДНК/TAT, которые способны проникать в культивируемые клетки млекопитающих и обеспечивать эффективную экспрессию перенесенных генов.

2. Увеличение положительного заряда комплексов катионных олигопептидов Kg и ТАТ с плазмидной ДНК оказывает положительный эффект на эффективность трансфекции клеток in vitro.

3. Избыток свободных, не связанных с ДНК катионных пептидов приводит к увеличению эффективности трансфекции клеток млекопитающих комплексами ДНКЛГАТ и ДНК/Kg, по всей вероятности, благодаря защите комплексов от разрушения отрицательно заряженными протеогликанами клеточной поверхности.

4. Комплексы плазмидной ДНК с катионными пептидами ТАТ и К8 проникают в клетки млекопитающих путем эвдоцитоза.

5. Низкая активность комплексов ДНК/TAT при системном введении мышам обусловлена взаимодействием комплексов с сывороточным альбумином, что приводит к изменению путей интернализации комплексов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Игнатович И.А., Диже Э.Б., Акифьев Б.Н., Буров С.В., Боярчук Е.А., Перевозчиков А. П. Доставка «суицидного» гена тимидинкиназы вируса герпеса в комплексе с катионным пептидом в клетки гепатомы человека in vitro, 2002 // Цитология, 44(5):455-462.

2. Ignatovich I.A., Dizhe Е.В., Pavlotskaya A.V., Akifiev B.N., Burov S.V., Orlov S.V., Perevozchikov A.P. Complexes of plasmid DNA with basic domain 47-57 of the HTV-1 Tat protein are transferred to mammalian cells by endocytosis-mediated pathways 2003 // J. Biol. Chem., 278.42625-42636.

3. Ignatovich I.A, Dizhe E.B., Burov S.V., Akifiev B.N, Perevozchikov A. P. Suicide effect of human herpes simplex virus thymidine kinase gene after its delivery within complexes with cationic peptides into human hepatoma cells.2000 // Rus. J. HIV/AIDS and Related problems, Vol. 4(1): 81.

4. Ignatovich I.A., Dizhe E.B., Burov S.V., Akifiev B.N, Perevozchikov A.P. Suicide effect of herpesvirus thymidine kinase gene delivered into human hepatoma cells in complex with oligopeptides, 2001 //Nature Genetics, Vol. 27, P. 61.

5. Ignatovich I. A., Dizhe E. В., Orlov S. V., Pavlotskaya А. В., Burov S. V., Percvozchikov A. P. A novel DNA-peptide complex for efficient gene delivery in mammalian cells Human CJenome Meeting 2002, Shanghai, China, 14th-17th April 2002, Abstract № 618.

6. Ignatovich I .A., Dizhe E.B., Pavlotskaya A.B., Burov S.V., Orlov S.V., Perevozchikov A.P. Mechanisms of plasmid DNA delivery into mammalian cells within complexes with the basic region ofTATprotein. 2002 //Rus. J. HIV/AIDS and Related problems, Vol. 6, (1):181.

7. Игнатович И.А., Павлоцкая А. В., Буров С.В., Перевозчиков А.П Высокоэффективный перенос плазмидной ДНК в клетки млекомитающих в комплексах с катионным пептидом ТАТ. 2002 // Материалы Ш съезда Российского Биохимического Общества, С-Пб., С. 543-544.

8. Burov S.V., Pavlovskaya A.V., Leko M.V., Dorosh M.Y., Ditkovskaya I.B., Dizhe E.B., Ignatovich I.A., Orlov S.V., Perevozchikov A.P. Direct complex formation between DNA and peptides derived from HTV-1 Tat protein in the preparation of simple non-viral gene delivery system 2002 // J. Peptide Sci., Suppl. to Vol. 8, S188.

9. Ignatovich I.A., Dizhe E.B., Pavlotskaya A.V, Akifiev B.N., Burov S.V, Orlov S.V., Perevozchikov A. P. Endocytosis-mediated entrance of DNA/TAT-peptide complex into mammalian cells. 2004 // HGM2004 -Human Genome Meeting Berlin, Germany, Abstract book, P. 173.

10. Ignatovich 1.А., Dizhe E.B., Pavlotskaya A.V., Akifiev B.N., Burov S.V., Orlov S.V., Perevozchikov A.P. 2004 // Polycationic complexes of DNA with cationic peptides enter cell by endocytosis-mediated pathways. The 5th International Conference on Biological Physics --ICBP2004 Gothenburg, Sweden ~ (August 23 - August 27,2004), Abstract book, P. B12-401.

Список цитированной литературы

1. Andrews N.C. and FallerD.V., 1991 Nucleic Acids Res. 11;19(9):2499 2 Coffin R.S., MacLean A.R., Latchman D.S., Brown S.M. 2000. Gene Therapy 7:139-152.

3. Colin M., Maurice M., Trugnan G., Kornprobst M., Harbottle R.P., Knight A., Cooper R.G., Miller A.D, Capeau J., Coutelle C., Brahimi-Hom M.C. 2000. Gene Therapy 7:139-152.

4. Cotten M., Laengle-Rouault F., Kirlappos H., Wagner E., Mechtler К, Zenke M., Beug H., Bimstiel M. L. 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:4033-4037.

5 Dash P. R., Read M. L., Barrett L. В., Wolfert M. A., Seymour L. W. 1999. Gene Ther. 6(4): 643-50.41

6. Eguchi A., Akuta Т., Okuyama H., Senda Т., Yokoi H., Inokuchi H., Fujita S., Hayakawa Т., Takeda K., Hasegawa M., and Nakanishi M.2001. J. Biol. Chem. 276,26204-26210

7. Fawell S, Seery J, Daikh Y, Moore C, Chen LL, Pepinsky B, Barsoum J. 1994. Proc Natl Acad Sci USA 18;91(2):664-668.

8 Gottschalk S., SpaiTow J Т., Hauer J., Mims M. P., Leland F. E., Woo S. L., and Smith L. C. 1996. Gene Ther 3:448-457.

9. Kurzchalia Т. V. and Parton R. G. 1999. Curr. Opin. Cell Biol. 11,424-^31

10.Liu F„ Song Y., and Liu D. 1999. Gene Ther 6:1258-1266. 1 l.Prochiantz A. 2000. Cuir Opin Cell Biol. 12(4):400-6.

12 Rodal S.K., Skrettmg G„ Garred O., Vilhardt F., van Deurs В., Sandvig K. 1999. Mol Biol Cell. 10(4):961-74.

13 Rubartelli A, Poggi A, Sitia R, Zocchi MR 1998. Immunol Today. 19(12):543-545 14.Sandvig K. and Olsnes S. 1982. J. Biol. Chem. 257,7504-7513

15.Schwarze S.R., Ho A., Vocero-Akbani A., Dowdy S.F. 1999. Science, 285;1569-1572.

16.Subtil A, Gaidarov I, Kobylarz K, Lampson MA., Keen J. H., McGraw Т.Е. 1999. Proc Natl Acad Sci USA.

96(12):6775-80.

17.Suzuki Т., Futaki S., Niwa M., Tanaka S , Ueda К, Sugiuia Y. 2002. J. Biol. Chem. 277(4); 2437- 2443.

18.Torchilin V., Rammohan R., Weissig V., Levchenko T.S. 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,8786-8791

19.Wender P., Mitchell D., Pattabiraman K., Pelkey E., Steinman L., Rothbard J. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97(24):13003-13008.

20.Wolfert M.A. and Seymour L.W. 1996. Gene Ther. 3,269-273

21.Акифиев Б.Н., Диже Э.Б., Ефремов A.M., Могиленко Д.А., Олейникова Г.Н., Лапиков И.А., Жданова О. Ю., Кидготко О.В., Орлов С.В., Перевозчиков А.П. 2004. Мол. Биол, 38(6); 1076-1084.

17

РНБ Русский фонд

2006-4 16413

Отпечатано в типографии Санкт-Петербургской торгово-промышленной палаты. Подписано в печать 13.09.2005. Тираж 75 экз. Заказ № 370.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Игнатович, Ирина Анатольевна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Транскрипционный фактор ТАТ.

2.2. Пенетратины.

2.2.1. Характеристика пенетратинов.

2.2.2. Пенетратины как векторы доставки.

2.3. Механизмы проникновения веществ в эукариотическую клетку.

4 2.3.1. Эндоцитоз-опосредованные пути проникновения веществ в эукариотическую клетку.

2.3.2. Фагоцитоз.

2.3.3. Макропиноцитоз.

2.3.4. Клатрин-опосредованный эндоцитоз.

2.3.5. Рафт-опосредованный эндоцитоз.

2.3.6. Клатрин- и кавеолин-независимый эндоцитоз.

2.3.7. Судьба эндоцитозных везикул.

2.4. Способы доставки чужеродных макромолекул в клетки млекопитающих.

2.4.1. Системы доставки на основе вирусных векторов.,.;.

2.4.2. Невирусные системы доставки генетических конструкций.

2.4.3. Катионные липиды.;.:.

3.4.4. Молекулярные конъюгаты.

2.4.5. катионные пептиды.;.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Материалы и объекты исследований.

3.2. Формирование комплексов плазмидной ДНК с катионными пептидами.

3.3. Определение стехиометрии комплексов ДНК с катионными пептидами.

3.4. Трансфекция культуры клеток катионными пептидами, их комплексами с плазмидной ДНК, кальций-фосфатная трансформация.

3.5. Определение активности генов-маркеров.

- 3.6. Конфокальная флюоресцентная микроскопия.

3.7. Измерение уровня интернализации флюоресцентно меченого пептида TAT-F и его комплексов с плазмидной ДНК.

3.8. Измерение флюоресценции ДНК с этидием бромидом.

3.9. Взаимодействие BSA с флюоресцентно меченым TAT-пептидом.

3.10. Внутривенное введение комплексов ДНК с катионными пептидами мышам.51 ■

3.11. Выделение РНК, реакция обратной транскрипции (RT), полимеразная цепная реакция (PCR)

3.12. Определение уровня АроА-1 человека в сыворотке крови мышей.

3.13. Статистическая обработка.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Изучение условий комплексообразования ДНК с лизин-богатым пептидом К8.

4.2. Оценка цитотоксичности комплексов ДНК/К8.

4.3 Факторы, влияющие на эффективность трансфекции клеток HepG2 комплексами ДНК/К8 .61 4.4. Изучение взаимодействия и условий образования комплекса ТАТ-пептида с плазмидной

4.5 Механизм проникновения комплекса ДНК/TAT в клетки.

4.6. Распределение комплексов ДНК/TAT в тканях мыши после их инъекций в хвостовую вену мышей.

4.7. Влияние сывороточного альбумина на интернализацию комплексов ДНЮТАТи экспрессию гена доставленного в комплексе с носителем.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Катионные пептиды как средство переноса ДНК в клетки млекопитающих"

Актуальность работы

Проникновение макромолекул в эукариотические клетки является фундаментальной основой ряда процессов, обеспечивающих поддержание интегральной целостности организма. Исследование механизмов интернализации макромолекул клетками имеет принципиальное значение для понимания функционирования многоклеточных организмов в норме и при различных патологиях.

Эндоцитоз представляет собой классический путь интернализации макромолекул. Тем не менее, в последнее время накапливаются данные, свидетельствующие о способности ряда внутриклеточных ядерных белков (активатора транскрипции Tat вируса иммунодефицита человека I типа, гомеодомен-содержащего фактора транскрипции Antp и др.) переноситься из клетки в клетку без участия классического эндоцитоза. Механизм транслокации таких белков до сих пор остается мало понятным. По всей видимости, в проникновении этих белков через клеточную мембрану не участвуют какие-либо рецепторные молекулы (Prochiantz А., 2000; Rubartelli A. et al., 1998). В ряде работ делеционным анализом установлено, что за интернализацию отвечают короткие фрагменты белковой молекулы, отличающиеся высоким содержанием положительно заряженных аминокислотных остатков - пенетратины (Wender P. et al., 2000). Более того, пенетратины, будучи ковалентно-сцепленными с белками-репортерами способны обеспечивать эффективную доставку последних в ткани экспериментальных животных (Fawell S. et al., 1994; Schwarze S. R. et al., 1999). Показана важность остатков аргинина для процесса переноса через клеточные мембраны (Suzuki Т. et al., 2002).

В последние годы значительное внимание уделяется разработке методов генетической коррекции ряда патологий человека. Применение с этой целью вирусных векторов имеет существенные ограничения. В связи с этим, актуальной является разработка невирусных методов переноса ДНК. Несмотря на более низкую эффективность, невирусные средства лишены ряда недостатков вирусных векторов. Высокая эффективность пенетратинов, в частности фрагмента (47-57) основного домена белка ТАТ вируса HIV-1 (ТАТ-пептида), в качестве средства доставки ковалентно сцепленных с ними биологически активных макромолекул, а также наличие в их составе большого числа основных аминокислотных остатков позволило рассматривать ТАТ-пептид как перспективное средство переноса ДНК в клетки млекопитающих in vitro и in vivo. В этой связи, принципиальное значение имеют детальные исследования механизма проникновения комплексов ДНК с пенетратинами в клетки млекопитающих.

Цель и задачи исследования

Целью работы является изучение условий формирования комплексов ДНК с катионными пептидами и исследование механизмов проникновения таких комплексов в клетки млекопитающих. Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:

1. Изучить условия образования комплексов катионных олигопептидов, таких как ТАТ и Kg, с плазмидной ДНК.

2. Выяснить возможную роль эндоцитоза в поглощении клетками млекопитающих комплексов ДНК с катионными пептидами.

3. Разработать систему переноса ДНК в клетки млекопитающих на основе фрагмента (47-57) основного домена транскрипционного фактора ТАТ вируса HIV-1.

4. Апробировать комплексы ДНК/TAT в качестве средства доставки ДНК в организм млекопитающих и выяснить факторы, препятствующие эффективной экспрессии перенесенных генов при системном введении комплексов. .

Научная новизна

В результате настоящего исследования впервые показана способность фрагмента (4757) основного домена белка ТАТ вируса HIV-1 (ТАТ-пептида) электростатически взаимодействовать с плазмидной ДНК, образуя полиэлектролитные комплексы. Такие комплексы способны проникать в культивируемые клетки млекопитающих, обеспечивая эффективную экспрессию перенесенных генов. В ходе работы показан эндоцитоз-опосредованный механизм проникновения комплекса ДНК/TAT в клетки, аналогично процессу интернализации комплексов плазмидной ДНК с лизин-богатым пептидом Kg и другими поликатионными носителями. Впервые выяснено стимулирующие влияние избытка свободного положительно заряженного пептида в реакционной смеси на эффективность трансфекции клеток в культуре комплексом катион ный пептид /ДНК.

В то же время показано, что повышение содержания свободного пептида в реакционной среде при системном введении комплексов ДНК/Т AT и ДНК/Kg in vivo приводит к снижению экспрессии доставляемого гена. Полученные данные свидетельствуют, что низкий уровень экспрессии чужеродного гена в случае внутривенной доставки комплексов ДНК/TAT объясняется их инактивацией в кровеносном русле животного в результате взаимодействия с сывороточным альбумином.

Практическая значимость

Практическая значимость работы заключается в разработке в ходе проведенного исследования системы переноса генов в культивируемые клетки млекопитающих на основе ТАТ-пептида. Изучение механизмов проникновения комплексов ДНК/пептид, а так же влияния свободного пептида на эффективность доставки таких комплексов представляет определенную ценность для понимания механизмов переноса макромолекул через цитоплазматическую мембрану. Выяснение причин, препятствующих эффективной работе векторов экспрессии доставляемых с помощью катионных пептидов в организм животных позволяет вести работу по усовершенствованию средств доставки генетических конструкций. Результаты настоящего исследования могут быть использованы при разработке и реализации проектов, направленных на создание невирусных методов переноса ДНК в организм млекопитающих и человека.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Фрагмент основного домена транскрипционного фактора ТАТ (47-57) вируса

H1V-1 электростатически взаимодействует с плазмидной ДНК с образованием полиэлектролитных комплексов ДНК/TAT, которые способны проникать в клетки млекопитающих и обеспечивать эффективную экспрессию перенесенных генов.

2. Комплексы плазмидной ДНК с катионными пептидами ТАТ и Kg проникают в клетки млекопитающих путем эндоцитоза.

3. Низкая активность комплексов ДНК/TAT при системном введении мышам обусловлена, в частности, взаимодействием комплексов с сывороточным альбумином, что приводит к изменению путей интернализации комплексов.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано две статьи и 9 тезисов докладов и сообщений на всероссийских и международных конференциях, симпозиумах и съездах. Результаты работы докладывались на международных конференциях «СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург, 2000, 2002 гг.), международной конференции «Human

Genome Meeting» (Шанхай, 2002), третьем Съезде биохимического общества России (Санкт-Петербург, 2002 г.), 39-м Съезде Федерации европейских биохимических обществ «FEBS special meeting on signal transduction» (Брюссель, 2003 г.), 5-й международной конференции по биофизике «1СВР-2004» (Стокгольм, 2004 г.) и других конференциях.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на . страницах, содержит . рисунка и . таблиц. Список литературы содержит . источника.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Игнатович, Ирина Анатольевна

6. выводы

Фрагмент основного домена транскрипционного фактора ТАТ (47-57) вируса HIV-1 электростатически взаимодействует с плазмидной ДНК с образованием полиэлектролитных комплексов ДНК/ТАТ, которые способны проникать в культивируемые клетки млекопитающих и обеспечивать эффективную экспрессию перенесенных генов.

Увеличение положительного заряда комплексов катионных олигопептидов Kg и ТАТ с плазмидной ДНК оказывает положительный эффект на эффективность трансфекции клеток in vitro.

Избыток свободных, не связанных с ДНК катионных пептидов приводит к увеличению эффективности трансфекции клеток млекопитающих комплексами ДНК/ТАТ и ДНК/Kg, по всей вероятности, благодаря защите комплексов от разрушения отрицательно заряженными протеогликанами клеточной поверхности.

Комплексы плазмидной ДНК с катионными пептидами ТАТ и К« проникают в клетки млекопитающих путем эндоцитоза.

Низкая активность комплексов ДНК/ТАТ при системном обусловлена взаимодействием комплексов с сывороточным приводит к изменению путей интернализации комплексов. введении мышам альбумином, что

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Игнатович, Ирина Анатольевна, Санкт-Петербург

1. Горман К. 1988. Высокоэффективный перенос генов в клетки млекопитающих: в книге "Клонирование ДНК. Методы." Под ред. Д. Гловера //М. "Мир", -1998,-с. 409463.

2. Aderem A., Underhill D. M. 1999. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu. Rev. Immunol. 1999(17):593-623.

3. Ahn С. H., Chae S. Y., Bae Y. H., Kim S. W. 2002. Biodegradable poly(ethylenimine) for plasmid DNA delivery, J. Controlled Release 80(l-3):273-82.

4. Albini A., Barillari G., Benelli R., Gallo R. C., Ensoli B. 1995. Angiogenic properties of human immunodeficiency virus type I Tat protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:48384842.

5. Albini, A., Benelli, R., Presta, M., Rusnati, M., Ziche, M., Rubartelli, A., Paglialunga, G., Bussolino, F., Noonan, D. 1996. HIV-tat protein is a heparin-binding angiogenic growth factor. Oncogene. 12(2):289-97,

6. Allinquant B, Hantraye P, Mailleux P, Moya K, Bouillot C, Prochiantz A. 1995. Downregulation of amyloid precursor protein inhibits neurite outgrowth in vitro. J. Cell. Biol. 128(5): 919-927.

7. Alio J. C., Midoux P., Merten M., Souil E., Lipecka J., Figarella C., Monsigny M., Briand P., Fajac I. 2000. Efficient gene transfer into human normal and cystic fibrosis

8. J- v tracheal gland serous cells with synthetic vectors. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 22:166175.

9. Anderson R. G. 1998. The caveolae membrane system. Annu. Rev. Biochem. 67:199-225.

10. Andrews N. C., Faller D. V. 1991. A rapid micropreparation technique for extraction of DNA-binding proteins from limiting numbers of mammalian cells. Nucleic Acids Res. 19(9):2499.

11. Apodaca G. 2001. Endocytic traffic in polarized epithelial cells: role of the actin and microtubule cytoskeleton. Traffic 2: 149-151.i

12. Applied Biosystems Inc. (1990) Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems-iV \1.c., Foster City, CA.

13. Bendas G., Rothe U., Scherphof G, L., Kamps J. A. 2003. The influence of repeated injections on pharmacokinetics and biodistribution of different types of sterically stabilizedч immunoliposomes, Biochim. Biophys. Acta 1609(l):63-70.

14. Benkirane M., Chun R.F., Xiao H., Ogryzko V. V., Howard B.H., Nakatanj Y., Jeang

15. К. T. 1998. Activation of integrated provirus requires histone acetyltransferase. p300 and P/CAF are coactivators for HIV-1 Tat. J. Biol. Chem. 273:24898-24905.

16. Berkhout В., Silverman R. H., Jeang К. T, 1989. Tat trans-activates the human immunodeficiency virus through a nascent RNA target. Cell 59:273-282.

17. Berlose J. P., Convert O., Derossi D., Brunissen A., Chassaing G. 1996. Conformational and associative behaviours of he third helix of Antennapedia homeodomain in membrane-mimetic environments Eur. J. Biochem. 24:372 386.1. Лл