Особенности экспрессии гена аполипопротеина A-l человека после его переноса в организм млекопитающего

Акифьев, Борис Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности экспрессии гена аполипопротеина A-l человека после его переноса в организм млекопитающего
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности экспрессии гена аполипопротеина A-l человека после его переноса в организм млекопитающего"

На правах рукописи

АКИФЬЕВ Борис Николаевич

ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА АНОЛИПОПРОТЕИНА А-I ЧЕЛОВЕКА ПОСЛЕ ЕГО ПЕРЕНОСА В ОРГАНИЗМ МЛЕКОПИТАЮЩЕГО

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Са»кт-Петсрбург 2004

Ршмня выполнена в омеле биохимии 1У Научно-исс.1сдова1с.н»скии

тки 1П>1 жеперимент&ныюи медицины РАМН. < анкт-Негербур! ( шректор академик РЛМ11 I) И Г качении

Научный руководитель:

доктор биологических наук профессор Перево$чиков Днлреи Петрович ([ У

ииюм рлмт

Официальные оппоненты:

Лектор биологических наук Ивашенко I ап.иня Эдуардовна Доктор биотогическич наук К'аюкава 1 а|ьниа Ьорисовид

Ведущее учреждение

Санкт-Петербургский государственный университет

Зашита лнссергатш состоится «27» «января» 2005 1 в Ц часов на мссдании ДнссерташюннО! о сонсм Д001022 03 при [ ^ НИИ жснеричешадыюи медицины РАМП по щресл 197376 Санкт-Пегептр! Камениоостровскии ир, 69 71

С диссертацией можно ошакомшься в шпчиои биб.шоюке I ^ ИМИ зчеиериченталыюи медицины РАМН по адрес\ 147376. Саикч-Петертр!, \.1 акал Павлова. 12

Ученым сенрсирв

лпесерганиошю! о совет Д001 022 0 \

юмор 0Н0/101 нческич иа\к профессор .1. В. Пучков»

OilЩАЯ XAPAKTFPHCTHKA РАБОТЫ

Актуа /ыккть пртпеиы

Сердечио-сосудисше *або 1евапия к частости ишеммчсская odiuiii» сердца (ИЬС ) широко распространены в развитых странах i нрош,| н Америки и являются наиоою. частой причинои смерти людей политого возраста Атеросклероз - о ша нз павпых причин ИБС - и ею развитие, а свою очеремь. обусловливается различными факторами риска Характерным показателем развития атеросклероза является снижение содержания в крови больных липопротеидов высокой плотности (ЛГШ11) - «ашнатерогенных» липопротеивдв и повышение содержания липопротеидов низком пюшости (ЛГШП) - «атерогенных» липопротеидов В работах A II Климова с сотрудниками (см монографию (Климов A II и др, 1995)) впервые было уделено внимание антиатерогенным свонствам ЛПВГ1 и рассмотрена возможность нспозьзования ЛПВГ! и их гивнои бс-жопок составляющей апозипопрогеина A-I (аро А-И в лечебных нетях

Лнтнагерогенные свойства четонечссюго аро\-1 бпш \бе штедьным образом продемонстрированы в экспериментах с гранстенными животными которые приобрега ш остойчивость к атерогенным нарушениям стенок сосудов после трансплантации в геном человеческого гена аро .1 I (Rubin 1 М et al. 1991а. Rubin L М сч al, 1991b, Shemer R et al. 1990. bwamon M h et al. 1992. Thompson L . 1992) Сопание экспериментально!! ñaua генотерашш ряда наследственных заоогсвашш чеювека и клиническая апробация этих подходов в ведмцмх мировых медико биолотческич ueinpax но ¡»о ш ш вп юшую по win и к ра ¡работ ке аналогичных методов н т ш лечения других тяже'лых заболеваний. включая приобретаемые с возрастом сердечно-сосудистые болезни

13 круг проблем, обпшх дзя решения вопросов 1сногсрапми. входит повышение эффективное ги и длительности работы в организме больною теистических конструкции, содержащих «лечащий» mi, а также устранение токсичности, имм)ио!снностм, и иных побочных действий средств переноса «точащих» генов пациенту (Culver К W, 1994) Но сути дела, решение этих проблем сводится к оптимизации испо1ьзуемых векторов экспрессии «лечащих» тенов и к разработке эффективных срезств доставки, лишенных указанных недостатков

Эффективность генотерлпсвтическою подхода к лечению атероск ic'pina путем доставки в opiniiiüM м iCKoiiHTaioiucio lena cipo I ! показана п нее ie даваниях по переносу iciia при 1-/ чеювека лабораюрным жнпогным с атеросклсритнческичн попреждечшямн сосу юн, индуцированными холестсршшкон диегоп (Liioma Р V, 1997, Fsiikamolo К etal. 1997, De (¡ec-,1 В et al. 2000. Benoil P el al. 1999 Tanyirila R k et al. 1999, Ikhlca/ir L M et il. 2001) lia основании попчепных pen и.I нов разрабатмпаются схемн |счсння больних пероск icpoioM, находящиеся in шиш upe ik пшнческих испытании (Uelalc.i7ar L М et

il.:(>(H)

РОС. НАЦИОНАЛЬНА БИБЛИОТЕКА

Вмшс с тем счелует отметить чю хотя широко исиолыуемыс* it настоящее нречя вирусные способы переноса «лечащих» i скоп (в рекомбинантных а «.шжирусам наиболее )ффекти»ны. они не шшены побочных эффектов г мнными щ которых яшякмел токсичность и иммуногенность рекомбинантных «прусов, ограничивающих и\ повторное испо штование для ueieií лечения Невирусные средства доставки, несмотря па их низкую *|к|>ект ивность. лишены указанных недостатков и могут исполыовлься неоднократно, что весьма важно для лечения длительно текущих заболеваний, к которым относится и атеросклероз

(акич образом, весьма актуальным яв>яется pi ¡работка таких шцходов к 1енотерапни атеросклероза, при которых однократное воздействие имею бы оптимальный и продолжительный эффект и одновременно не исключало бы возможность повторения генотерапевтическои процедуры Подобный нозхот должен сочетать исполыование оптимизированных генетических конструкций и невирусных способов и\ kkt.ibui к организм больного

Цель работы - сравнить различные невирусные способы переноса гена аполипопролеши Л-1 че ювека в клетки млекопитающих т чт> п ш ии> и изучить особенности экспрессии lena upo 4-1 че ювека в чужеродном окружении в зависимости от ею стр\кт\рно-фуикииональнои opi анизашш

Для достижения постав íeniioii цели с 1с*довало реши i ь с 1сду10шне за чачи

1) нее ie ювать возможности использования га-ыктош шрованною по ш L-ншша а ык-ле Kai ионных пеппиов дня переноса зкспрссснруюшегося гена щх> I / че ювека в печень млекопитающих (Kpi.it) и оценить эффективность работы этих носите ten в сравнении с использовавшимися ранее,

2) применить для доставки плазмилиых векторов экспрессии гена че ювеческою про 4 1 в opi лппм млекопитающих (мышеи) метоп гидродинамических инъекции «го юн» ДИК и сравнить эффективность этою способа с доставкой ДНК в пиле комтексов с мо окулярными коиъюгатами и кзтионными пептидами,

3) сравнить эффективность и длительность экспрессии гена че ювсчесшо u/да II в неченн мышеи в зависимости от струюурно-фупкиионалыюи opiaimjamm этого гена (наличия эклоино-интронной структуры и участков регуляции транскрипции)

Основные по южен ни, выносимые на лпцшну

I Перенос пшмнщон ДНК в по иплсктро чипом комплексе с и-иактознлнрованнич полн-Ь-лизиноч - poly(L-lyi)Gal в культивируемые клетки гепаюмы человека HepG2 происходит реценюр-опосредовапным эншцптоюм Эффективность доставки и 1л!мн шы\ векторов жспрессин п коми 1сксе с ро!у(1 lys)(ul в к\ п.тнвнруемые к ictkii (силтомы человека lkpG2 срапннм i с эффсмшшоеп.м досыпки niaiMiuinix ДНК'

методом кальцнй-фосфагнои копреципитации и швисит от молярного соотношения ДНК : poly(L-lysK¡al в комплексе.

2 I Ьлмидмый вектор экспрессии кДНК аро А-1 человека, инъецированный и комплексе с poly(L-lys)Gal в хвостовую вену крыс, доставляется в icieiKii печени и сохраняется в ядрах клеток в виде эписомм по меньшей мере в течение недели. Уровень аро А-! человека в крови крыс может быть повышен путем повторных внутривенных инъекции указанных комплексов.

3 Доставка векторов экспрессии гена аро А-1 человека в печень мышей C57DI/6 путем гидродинамических внутривенных инъекции соответствмощих плазмидныч ДИК обеспечивает высокое содержание человеческого аро А-1 в сыворотке крови животных. Уровень аро А-1 человека в крови мышеи может быть повышен повторными внутривенными инъекциями плазмидной ДИК.

4 Гидродинамическое введение комплексов ДИК с катионным пептидом Tat приводит к сметному снижению эффективности переноса по сравнению с введением «голой» ДНК.

? Человеческий белок аро А-1 спустя 2 недели после иш.екшш lena muiii.im не

стимулировал появления специфичных антител в крови животных (i. Динамика экспрессии гена аро А-1 человека в печени мышеи не зависит от пни промотора, а определяется организацией структурной части гена Сохранение экзонно-(iiirpoimoií структуры гена аро А-1 обеспечивает эффективную и более продолжительную (до 6 месяцев) экспрессию тепа в сравнении с экспрессией ею кДНК-копии. Научная новилш работы

Впервые была покашиа возможность доставки векторов жспрессии гена про .1-1 человека в opiaiimxi млекопитающего путем внутривенных инъекции комплексов n.taiMiiaiiort ДНК с ро1у(ЫуьКЫ. причем было установлен факт продолжи!с.п,ниш сохранения доставленной ДИК в клетках печени в виде эписомы. В результате гидродинамических внутривенных инъекций плазмидных векторов жспрессии г ска про А-1 человека мышам C57I31/6 оказалось возможным получить длительную и эффективн)к> лснрессию перенесенною гена в клетках печени, а за сч{т повторных инъекций добиться повышения уровня аро А-1 человека в крови животных.

11родолжителыюст1> и уровень экспрессии гена аро А-1 человека в клетках печени мышей (в чужеродном окружении) в шачитслыюй мере определяется не видом промотора (ннрусоснсннфическнй или клеточный), а экзонно-интроннои структурой кодирующей част lena, что является абсолютно новым фактом, имеющим приоритетное значение Нагчно-практнческая тачимостъ работы

Полхченные рсмлмагм хказывают на всимолность iiciio.imoiuiiiih р.плпчных катонных Houireien как основы для >ффск тпмоп .очинки ДНК.' н ккчьн

млекопитающих Вместе с юм, отрицательные данные, подученные по доставке нутом внутривенных инъекций в организм генов-маркеров и tena ano А-1 че ювека в комплексе с нсмолифициронанными катонными пептидами, указывают па существование определенных факторов, ограничивающих использование ною способа для практических заздч генотерапии атеросклероза Ьо.зее перспективным является способ гидродинамических инъекции «юлой» ДНК. который может быть адаптирован для целей тютерапии атеросклероза в дальнейшем Весьма важно в каждом конкретном случае учитывать также структурно-функциональную организацию доставаемого в организм lena В нашем случае важным для продолжительной и эффективной зкспрессии оказалось сохранение экзонно-интронной структуры гена аро /(-/человека

Результаты настоящего исследования могут быть использованы при разработке и реализации проекта, направленною на лечение атеросклероза путем генетической коррекции соотношения антиатерозенных и агсротшых дипонротезглов в крови нацмен гов

Материалы диссертации иизозьзукмея в курсах лскннн лля бакалавров и магистров кафедр эмбриологии и биохимии Санкт-Петербургского государственного университета Личный вкшд.

Основная часть экспериментов выполнена диссертантом К'у 1ьтивированнс и зрансфекния клеток млекопитающих выпо пзятись совместно с вед п с . к ó н Ь Диже С'|гнтез галактознлироваггного по rii-L-пз зина производился совместно со о пил l> I! Миссзолем.

Апройиция работы

По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 10 тезисов докладов и сообщении па всероссиискнх и международных конференциях, симпозиумах и съездах. Результазы работы докладывались на международном конференции «Human Genome» (Australia, 19941, ежегодных итоговых конференциях Г1П «Ichom Человека» Г1ПП РФ, съездах биохимического общества России (1997. 2002 ir.), международных конференциях «СПИД, рак и родственные проблемы» (1997, 1999 гг), международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пузиино. 1998 г), и других конференциях

Структура и объём диссертации Диссертация состоит из введения, обзора знтературы. материно» и мезодов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы Диссертация изложена на 105 страницах текста, ил носграгиинми материал содержит 20 рисунков и I таблицу Список литературы содержит 224 наименования, hi них 210 на иностранном я паке

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Штершиы и объекты исс wóimauuu

И paóoie ИС1ЮЛ1.юваны реактивы фирм «Siwna» (США) «Serva» Нсрчанил «Pharmacia» (Швеция!, «Boehringcr Mannheim» Перчания), а такле шчествешкич производства, квалификации х ч и ч д а, ферменты для генно-инженерных paóoi производства «bermenias» (Литва) и НПО «Сиб')тим» (Новосибирск)

Д'1я экспериментов ш vino испозьзованы к'патомные клегки четовека HepCi2 полученные из Американской коллекции клеточных культур (АТС С) Национальных институтов зюровья (NIH) США, мышиные фибробзасгы линии N111 >ТЗ hi óihk.i клеточных Kvii.rvp Института пигологии PAH

Д.ш экспериментов ш vno использовашсь крысы (самцы) линии VViMar Imjccdii I ID 125 г), мыши линии C57BI/6 и межлиненные пюрнзы C57DLCBA i самцы, самки i полученные in пигомннка «Рапполово» PAMII (Санкт-1 leTcpóvpi |

кДНК -копия гена upo А I человека {tapa If) и ею хромосомный вариант » encune протяженною геномною локуса. включающего з'-регутягорныи район цепочный юк\е более чем 5000 пи) - р 1/л; - были любезно прсдоставтены доктором L Chan (Baylor College, Texas. USA)

Пмзмилы pCMV/ис/, pCMVc«/ н pCMVt«/«j 1/. представляющие' собой векторы экспрессии соответственно бактериальных ienoe-маркеров tail, ни и к-.lllk к/к» I / четовека под контролем, промотора раннею гена шпочегаловируса. сконарифонлни методами генной инженерии и описаны ранее (Перевозчиков А. П и др. 1994, Клрышев I) 10 и др , 1994)

Протяженная 5'-концсвая регуляториая поелсдоваге п.ности (-2491 +173 nul ieiia аполипопрогеина А-1 чс млека - APOAI, и ее1 делеционные варианты, еоогветствмошнх промотору то п,ко с гепатоцитарныч энхапссром Símil Sphl (-256 +173) и S/mj \mt (-256 +71), были сцеплены с кДНК-геном-репоргером - чюпнфера 1Ы свепяка l'huimm pu alts - hu В качестве источника гена-репортера иснолыована нлалшда рСН} (' Protncga") Июговые нлазмидпые векторы экспрессии обозначены соотиетственпо рЛРОА1/нс, pAPOAISnw-Sph/i«, pAPOAlSma-Sui/in 'Зга работа бы ia выпо шепа совмести с В Ю Мрышскыч. Il Л Лапиковым Д А Момпенко в лабораюрнн реп шиш лини шого обмена 11И1ЮМ РАМП

Лп1Ш1-бо|а1Ы11 iieimii - YKAK«WK (K's ) (Gollschalk S et al. 1996) - К S и арпишн-боипын фратепт (47-57 а о ) грансактииаюрною бе 1ка Tat (Ш1Ч-1)- V (iRk.KRRQRKR (Tat-нептид) бы ill еннтешропаны в оме 1С пещи нюю ciiincia lliieiiiivii lu icokOMO le к\ DipiiMX сое uiiieiiHH l'Mlil побешо upe loe lait lelilí С I) 1>\р<ч<пм

Конъкиат iro.in-L-лишн - десиалироианныи opoioMVKmu - polyfL Ivs)ASOR синтезированный как описано Л П Перево!чикоиым с соавторами <|1ерево1чикои Л И н ip. 1997), получен or M M Шав ювского (огле i молекулярной iciicthkii НИИОМ РЛMl I)

С пита гашшонпщшштогч по iu-L-nt)Wio

I адактозипированныи noni-L-лизин -poly(L-lys)(jal. синтсзировати по ранее описаннон методике (Perales J С et al, 1994) К 2 мг гидробромида по m 1 -тишна (ере шяя степень по 1имеризации 100) («Sigma», США, кл № 7890). в I mi фосфатного буфера рИ 7.2. шбавтяли 85 мкг а-Ю-галактопиранозилфенилшотиоцианата («Sumía»), а затем 0,1 мл I M Nj;COj рН 9,0 Смесь инкубировали, периодически встряхивая, в темноте в течение 16 ч при комнатной температуре Процент галактози шрования i-аминогрупп в по ni-L- in тис составит 3 - 5 %

I [\liti формация оинтериа/иных меток накотешн: и очттки п ш тш! т'чешч itfji'tmpamott At IK

Iрансформацию бактериатьных клеток L toll KI2 (штаммы НВ101 \LI-bluei препаратами ДНК проводили метолом электропоранин накопзение и очистку тазмидныч ДНК. мечение изознрованныч препаратов ДНК осмиестшя ш в соответствии с методами описанными! Маниатисом с соавторами (Маииашс i и др. I9S4) (h'tpnмиопии kountíkio« ДНК • лпашотт/мванныи но iu-L-шиш

1итрование количества формирующеюся комптекса ДНК - polyiL-LyslGal проводили екчмошнм обраюм К атнквотам щлмнлнои ДНК (I mki очищенной у п.трацентрнфугированнем в градиенте CsCI). расглореннои в 10 мкл 0,7 M NaCI, добавляли по каплям с тщатетьным перемешиванием »отрастающие количеств.! poly(L-IniKjjI. растворенною в 0,7 M NaCI Равные порции каждом пробы наносит в стартовые iniikii дорожек 1%-ною агарозного геля и проводизи электрофоре) Задержку коми icKcoii ДИК - poly(L-lys)Gal в геле тестировали после электрофореза но стащартнои мею шке (Wu G Y et al. 1987) Для трансфекции культивируемых клеток и ,пя доставки ДИК m и m комтексы ДПК/конъюгат готовили следующим обраюм ДНК и коныогаг растворят в равных объемах 0,4 M NaCI (концентрация ДНК- 0.5 мкг'мкл. необчошмая концентрация конт.Ю1ата опредедясчея электрофорезом) из расчета 10 mki ДНК на растущие в чашке Пстрн (60 мм диаметр) клетки Раствор конъюгата добпвтя ш к раствору ДНК по ï-10 мкл каждые 5 минут с тщагешпам перемешиванием nocie калюю добав1епня Д1я пре un вращения выпадения оса 1ка Образовывался чмнын р ici вор. к которому добав 1я ш ашквоты 5М NaCI по 5-10 мкл ктждые 5 мин до концентрации 1,1 М. при лом происходи ю проевсмление p.icinopa Окутстпне афсчаюв в растере конгро шров.ин шмереннем ошнческою hoi ющення при 420 мм щ спеырофоюмемре ( Ф26 1Кч\чсшнп1

комплекс использовали лля траисфекшш культивируемых клеток (как описано ниже), либо инъецировали внутривенно животным.

¡'рансфекция KV ¡ыаивириватшх кмток и umi пи жсп/К'ссни бактерии iwiwv .vi/un-маркеров в трансформированных метках

Клетки НерС2 и NIH ЗТЗ выращивали до заполнения 70"0 поверхиосш чашки Петри (диаметр 60 мм) в среде DMEM. с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота («Gibco», США), при 37" С в СОз-инкубаторе. Трансфскцию клеток препаратами комплексов Д1 IK/poly(L-Iys)Gal выполняли но собственной схеме (Перевозчиков Л. П. и др., 1997) на основании методики, предложенной Эрбахером с соавторами (Erbacher P. et а!.. 1995).

Эффективность траисфекшш оценивали на основании определения активности бактериальных ферментов - продуктов экспрессии генов Un-/, и cal. Активность |J-галактозндазы в клетках, трансфецированны.х генетической конструкцией pCMV/ui'Z. определяли с использованием хрочо1енных субстратов X-Ci.il или л-шпрофенид-(}-1) t алаетопирано-итда («Sigma») (Herbomel P. et al., 1984). Cat-Tcci проводили в соответствии с методикой, предложенной Горчак!Гормаи К., 1988).

Конкурентное вытеснение абсорбированных на клеточной поверхности меченых кпutitcKCoti ДНК - poly(L'lys)Gal избытками немеченом коныо.чшш

Клетки HepG2 инкубировали в чашках Петри (диаметр 30 чм| в I мл среды DMEM в течение 2-х часов при 4"С с 32Р-меченым комплексом poly(L-lys)Gal-pCMVlacZ в присутствии возрастающих количеств немеченых комъюгатоп poly(L-lys)Gal или poly(L-lys)ASOR. Через 2 часа среду удаляли из чашек, монослой клеток отмывали I pai чистой охлажденной средой DMEM, 3 paja DMEM с добавлением 0.5"» BSA и 1 раз фосфатно-со.тсвым буфером. Во все чашки добавляли 1 мл 0.1 M NaOH и через 24 часа в аликвота.х белковых экстрактов измеряли радиоактивность.

Внутривенные инъекции контекст ДНК - pnlylL-lyslGa/ в хвостовую вену крысам

Комплексы ДНК (рСМУся/л>Л/) с poly(L-lys)Gal, приготовленные как указано выше, инъецировали в хвостовую вену крыс (25 мкт ДНК на одну крысу). Умерщвление животных по окончания эксперимента проводили в соответствии с общепринятыми правилами обращения с животными (с применением анестезирующих средств). Внутривенные инъекции плаышЫои ,'JHKe хноатшую вену мытчч

Выделенные и очищенные рлпновесиым у.тьтранентрнфмироиаииеч в |радиеиге плотности CsCl плазмидные ДНК дополнительно очищали xpowuoi рафией на колонках "Minicolumn-D" ("Sigma") и ит.ецнровалн с помощью гонкой шли в хвостовую иену мышей, массой от 12 до )Ч г (m расчета 10-20 чкг на мышь) медленно « 200 мк.т рлстпоре I'lHiivpa (или PUS), либо iидродннлчичсчкнч способом и 4-5 с н 1-3 м i p.icinopj Puincp.i

(и зависимости or iseca мыши) Для гидродинамических иньекпии непосредственно мере i женернментом отбира-т ipynny мышеи с массами ±1 грамм озноипс гыга сре шею шачення (пз,р) Точный ибьем (V) вводимого paciBopi вычисли ш по (|юрмуле. по зученнон на основании данных Г Liu с соавторами (Liu I et al 1994)

V (м i) = 0057143 x m1() -г 0 5143 ¡Ihiih' tenue ДНК m im, am'и життного и чиаии idh/jmiw тмеотионых им teooeame шннтеи в coutume ДНК крыс и мышеи Hill' апаш!

Я îpa клеюк печени вьпеляли пепфифугированием томогаьиа к ictok (2000xg 20 мин ■"!"( ) в ступенчатом i ралиенте сахарозы (0,5 M 22 M), осадок я tep сусненлнроззали в гипотоническом буфере (20 шМ KCl, 10 mM Tris-HCI, pli 741, нивкомолекулярную язерную (н м я ) ДНК изо гировали по методу Xepia. как описано bpavri I кот (Ьра\н ') M К и ip, 1989) Ллнквоп.1 и м я ДНК использован! дгя НПР-анашза на содержание после зова 1елыюсзен, специфичных для гена apo/t-l че ювека Ираимеры зля ПНР и peipo-ППК подбирали с помощью программы "Pumer', разработанной H Прутковским и О Сок\р (НИИ гриппа PWtll, CaiiKi-IIerepöypi) Нпешние праимеры прямой (<TÍ.<.G\ICG'\GK;AUiGAC-4 . образный -^-ССЛССТС \G V1GCTC GCiKiG-i (температура от.кнга 62"С) внмренине (nesteiií ираимеры прямой -CGCC ITGGGAAAACAGCTA V, обрашыи <'-(¡C К t'Ai Cl С CTCCTGCC Д( -> ( температура оикига 57"С )

ni liai сине» тотш)иых JHK ui utíep к ¡сток печени мышеи

АТНКВ01Ы и. м я ДНК использовали для элечпропорацни кочне генши\ бактериальных клеток (XLI-blue t. coli) Клоны, устойчивые к иеншшлдину, аналншроподи методом ПНР на присутствие плазмид, содержащих ich аро А-1 чсювека Данные ПНР подзвержда ти рестрнкзным анализом пла)мндных ДНК. выделенных и) клонов, давших подо/кикмьнын lui пал при ПЦР.

( 'mamut тичы k<ui обрш'ютш по ¡ученных peiy шттюь

Значения ферментативных активностей представлены как среднее арифметическое не менее ipiix парцелльных проб ± сгандаршая ошибка среднего Достоверность раз шчш! определят с помощью непарного Места . Различия рассматривались достоверными при р < 0.05 Стагистичсскии анализ выполнялся с помощью программы Siaiisticn 5 0, "StatSolt Ine"

РГЛУЛЫ АГЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБГУЖДПННГ

1Iciio.ii, лш.шнс |я,мк"п)111 iiiponjiiiioi о polv-L-.nniHn.i л im доставки ДНК п к.аткн 1сплю1|11г.1[1ш|1о ряда

Применение молекулярных кокьюгаюп. состоящих и i кона ichшо cmi.ihiii.ix поли катионов таких как лош-Ышзин иш поти 1 -jpi инин (5-120 кД| с боками лигандами каких-либо рецепторов клеточной поверхности, основано на рецептор-опосредованном зидоцшолюч пути проникновения ДНК в клетки (см об юр (Molas VI ei al, 2003)) Д1я разработки системы доставки ДНК в клетки гепатопитарною ря и в настоящей работе испотыован галактош шрованнын polv-L- ihjhii (polvd -IvmüjIi способный специфически интериапитоваться гепатошггами через асиа юпнкопротеинопьш рецептор (('erales J С см al. 1994) В работе испои, юна ш дпа koiram.n.i со cichchmo )амешснн» i-аминогрупп потп-Ь-лишна млактошыми остатками и '1Г„

соответственно Подбор хниярных соотношении ДНК и poly(L-lvx)Cal. необходимых ия ((юрмировання комтекса провозиш методом ie п.-ретардании I leirrpa нпапия отрицательных зарядов ДНК положительными зарядами polv(L-lvs)G.il достшазась при мо!ярном соотношении ДНК коныогат I 156 IIa рис I прек/ташены реп п.тагы переноса ДИК в клетки HcpG2 в комплексах с polvlL-lvblGal Повышение степени галактозишрования по ni-L-nuiiiia с 3 до 30"» не приводи ш к существенному Boipaciainuo зффектниносш трансфекции (рис 1а) Имеете с тем. комплексы, пршотопленные в условиях шбытка положительных зарядов, обеспечивали значите tuto бо ice высокий уровень переноса (рис 1а. б) На основании представlemibix pei\ h.mioh можно предположить, чю увеличение ыо1ярнои юти polv(L-Lvs)Gal 11 кочщсксе с ДНК приводящее к увеличению по южнтельною мряда комплекса, uiocooctuvct |\чншм контактам последнего с отрицательно заряженной клеточной мембраной bolee тою в работе по и (учению мехашимов проникновения комплексов Д1IK с катионными пет и ими в клетки млекопитающих памп бьпа предложена итоге и. объясняющая зенстие нюьпка положительных зарядов защитой комп ickcoÍi ДНК/ношкатион от р.ирмпспмн отрицате п.но заряженными прогсоглнкапами к юточной поверхности (Ignatovich I A et il. 2003) Однако нам не уда юсь добиться ощушмои эффективности трансфекции мынпшнх фибробласгов NIH 371. не имеющих асиало! шкопротсиноных рецепторов, поюжшепно мряжепнымп комплексами pC'MV/ac¿pol)(l.-Lyx)Gal. чю спндетси.ств\ег о важности лшапц-рсцспюрных нмимо ichctbiiii для )||)фекипшои шперн.1 пнацни коми ickcoii к1сткпми Ионому кажечея óoiee верояшым. что эффективность трансфекции мсюк HepG2 комШексахш ДНК pol\(l-Lys)Gal мнненг 01 нсско н.кнх причин - чширшш юш |.т 1.1МОШ юн н н ыпчия по in,мне плюю !.|ря 11 комп ickcoii

2 -г

■с Ац. Хф . Ац, Хф .АцХф

1 2 I

о а

о в

о 4

гЬ

if?

15ь i 1 st.o i «во 1 Соотношение лиганд ДНК

Ряс. 1. Зависимость эффективности доставки генетических конструкции в клетки HepG2 а комплексе с молекулярным коиъюгатом poly-L-iya-Gal от молярного соотношения конъюгат-ДНК. Результаты измерения активности хлорамфениколацетитрансферазы (а) и »-галактозидазы (б), а 1, 2- poly (L-lys)Gal с 3-5% замещения с-аминогрупл галакгозидом 1- соотношение ДНКконъюгат 1 1560 (положительно заряженный комплекс), 2- соотношение ДНК хонъюгат 1 15Ь (нейтральный комплекс), 3- poly(L-lys) с 30% замещения е-еминогрупп галоктозидом (нейтральный комплекс), Хф - хлорамфеникол Ац Хф - ацетилированные формы хлора мссеникола б poly (L-lyslGal с 3-5% замещения саминогрупп галвкгозидом Соотношения конъюгат ДНК указаны на диаграмме

Для доказательства специфичности связывания комплексов ДНК' polML-lvsKi.il с асиалогликопро1еиновыми рецепторами клеток HepG2 были проведены эксперимент по конкурентному вытеснению при 4"С ассоциированных с клеточной мембраной комплексов содержащих '~Р- меченую шшчндную ДНК. возрастающими избытками комплексов ДНК, poly(L-ly;>)ASOR либо /lHK/poly(L-lys)Oal (рис. 2). Асналоороюьп конл IASOR) -типичный асиалогликопротсин, избирательно взаимоденствующии ' с асиалогликопротеиновыми рецепторами (Wu С. Н. el al, 1989, Cristiano R J ct al. 1995) Предполагалось провершь способность комплексов на основе обоих контжнатов связываться с одним и тем же типом рецепторов. В этих экспериментах испозьзоволи электрически нейтральные комплексы для предотвращения их нсспецпфнческои сорбции на отрицательно заряженной клеточной мембране Представленные резузьтаты

Рис. 2. Специфичность связывания комплексов ДНК/конъюгат-асиалогликопротеиновыми рецепторами клеток HepG2 Треугольниками обозначена конкуренция с poly(L-lys)Gal Квадратами обозначена конкуренция с poly(l-lys)ASOR

"г-дяк

ИМ1/1ММ

4XMXJ

■I II 41) !Л НО 1U1 1 ti 14,1 ИЛ

Мояириыа шбмяш, пмыиш

свидетельствуют iii> )ффективнои конкуренции комплексов ДПК/ро1у(Ыуч)(к|1 и fllIK/poly(L-lys)ASOR с меченым комплексом ДИК/ро1у(L-iys>Oal за связывание с клежами HepG2 н, таким образом, подтверждают спеиифичносгь взаимодеиствия комплексов Д1 IK/poly(L-lys)G.il с асиалогликопро1еиновыми рецепторами клеток (Perales J. С. cu al.. 1994).

Возможность продолжительной экспрессии экзогенных генов после переноса в комплексах с poly(L-lys)Ga! в печени лабораторных животных проверяли с помощью инъекций комплексов вектора экспрессии кДНК гена аро А-1 человека под контролем промотора CMV (рСМ\capoAt) с poly(L-lys)Gal в хвостовую вену крыс линии Wistar. Трем группам крыс (по 5 штук! вводили обычной инъекцией в хвостовую вену комплексы pCMVcopal//'poly(L-lys)(ÍJl. Крысам первой группы проводили инъекцию однократно н начале эксперимента (на первый день), крысам второи группы инъекции делали через день, всего 4 инъекции. Крысам третьей группы комплексы ДПК/коиъюгат вводили на 6-и день эксперимента. В качестве контрольной группы использовались интактные крысы. Через h дней после начала эксперимента животных забивали. Адресованная доставка комплексов п печень крысы подтверждалась аналзгзоч ДНК разных тканей- крысы методом ПИР. Нуклсотидиая последовательность гена про А-1 человека была идентифицирована в составе крысиной ДНК, выделенной нэ клеток печени, но не из клеток тонкою кишечника, лез ки'х

íi'^ i . i

или сердца. Об экспрессии гена ара в клетках печени крыс судили по содержанию

человеческого аро А-1 в сыворотке крови 3-х групп животных (табл. I). В результате

однократной инъекции комплексов pCMVcap»/l//poiy(L-Lys)Gal человеческий белок

сохраняется в сыворотке крови крыс, по меньшей мере недс.нд.- а скорее всего более

продолжительное время, поскольку повторные инъекции приводили к повышению уровня - • V - :

аро А-1 человека в крови крыс. Вместе с тем следует отйётить. что уровень-itSeeaiíiiHoio и

крови аро А-1 человека был невысоким, кроме того, наблюдались значительные различия в

уровне аро А-1 человека в сыворотках отдельных животных.

Дзя доказательства эписомной локализации гена аро А-1 человека в печени инъецированных крыс мы провели эксперименты по «спасению» плазмид из инзкомолекулярной ДНК. изолированной по методу Херта из ядер клеток печени инъецированных животных, в клетках Е. coli. Ген аро А-1 человека в составе плазмид, изолированных из бактериальных к юной, выросших после трансформации компетентных

клеток Е. coli н. м. я. ДНК" определили методом ПЦР с использованием специфич.......

прпймероя (рис. 3). Как видно из чреде гавлениыч ре зуды а го». нуклсотидиая нослслоилслыюсть, специфичная для tсил аро I-/ человека, ирису iciпуст и пл.ззмилах. «спасенных» из ядер клеток печени иньецировлиных крыс, (.'.ic.ioiuicп.но, полученные

мнпмс свидетельствуют о длшелыюм (по меньшей мере, к 1ечение К дней! сохранении p(.'MVV</p«/l/« н ншеомах. ядер клеюк печени инъецированных крыс.

1апшца 41

Иммуноферментное определение белка аро А-1 человека в сыворотке крови крыс после введения им функционального гена apo А-1 человека в комплексе с конъюгатом poly(L-lys|Gal

Крыгм Л1'.Х?

1-5 I групп»

ft-ll) II i pvima

II- IS III rpvnilil

Число инъекций

Аро А-1 человек» н t'M»O()0Tlíe кропи крыс, III /м-i

(1-й лень эксперимента!

II» -50

(1-й, 2-й. 4-й, 6-й лни ■жепернментя |

(6-и лень жгмерименгя)

2« - 611

Контроль

■ |>Ив, Результаты PCR по определению содержания гена аро А-1 человека (фракции, отмеченные стрелкой слева от Элактрофореграммы) в плазмидах, выросших после трансформации бактериальных клеток с помощью н. м. я. ДНК, выделенной из печени опытных крыс: 1-10 - номера образцов плазмид, соответствующих номерам крыс л - ДНК фага X, гидролизованная рестриктаэой Pstl. К и К' - отрицательным и положительный 10 9 9 7 6 3 х 2 1 к" к* контроли ПЦР соответственно

Использование лишп-Ooiшы\ и аргинин-Гмнаппх пешню» дли доставки ДНК в клетки млсконншошнх

U литературе имеются укамнпя об исполыовапни катнонных пстилон (в частности, обогащенных L-лизшюм) для доставки геиешчеекп* конструкции в клеисн члекошпающих. В настоящей работе нсиолыовалнсь два катонных пептида - лншн-óoiaiuií - Кч и apiнпнн-богагый - Tat-нсшид (см. рлмед «Маюрнады и методы»). Результаты по трапсфекцин культииусчых клеток iciiaioMu человека HcpG2 комплексами п.шмнлны.х векюров экспрессии ичюв etil н 1м-/. с линш-бокным пептидом К, и лршннн-Гичл1ым пенимом Та! представлены па рис. 4

Ц8 Q7 i Q6 |Q5

Q3 02 Q1 0

№(11) №(15) ТДГ(11) TAT(15)

Рис 4 Сравнение эффективности трансфекции клеток Нерб2 комплексами рСМУ/асДкатионныи пептид в зависимости от вида пептида и соотношения электрических зарядов в комплексах. По оси ординат - активность продукта экспрессии гена 1асг - |1-галактозидазы в клетках

трансфецированных комплексами

ДНК/пептид По оси абсцисс - варианты использованных пептидов (в скобках указано соотношение зарядов ДНК и пептида)

П обоих случ!я\ эффективность трансфекции значительно \ исчнчива íaci, при использовании комп ickcob прнготолтенных и 1скшпях пятикратною икштка по южитсльных зарядов пептидов относитетыю отршше п.ныч зарядов ЛПК Вчеис с icm в npeii.uviiien работе мп понаши чю максиман.но возможный huhiiok la! пеший п составе компзекса не превышает I 7-кр.мишо (lunaiinidi 1 Л ctal.21)(H) IUvbiiihmomx сшчулирмошее деисише свобозною I и iiciitii ц на зффскшвносп. трансфскшш комп иксами JUllOljt обеспечивается защити комп ickcob от разрушения OTpimaic п.но заряженными прогеогликанами ктсточнои поверхности, опосредованно!! свободным Га! пептидом В наших да внешних нее ic юианиях бшо пока злю. чю комшсксы ДНК е катноннымн пситидами. инъецированные в хвостоимо иену мышеи обычным чбраюм (медленно, в количествах до 20 мкг и в мацах объемах, не превышающих 100 мкп не приводили к сколько-Hiióvib заметному появ leiniio аро Л I чеювека в сыворотке кропи жнвошых (период иаб.нодення 12-72 ч) IIa основании шлученных рсч\ платов можно принт к заключению, чю несмотря на высокую эффекнпшоаь применения катонных пешилов д 1я доставки ДНК в культивируемые клемки ли катонные пеиппы в обычных усювнях не могут быть использованы ;пя доставки ДНК ш шо. в кровяное р>сю Вероятно, эффективной доставке ДНК в комтсксс с катноннымн пепппами в ktcimi печени, при инъкцни комплексов в кровь препятствмо! взаимодействие пепинов с белками крови, например, с сывороточным а ibóyчином (Ignatovicli I Л ct al. 2001) )k'ciipeceiiu пил аро A-Iче.юиекл u печени нос ie доставки сю мышам меююм инмрнионных i идродниамнчесънх инъекции

Наиболее зффекшвным иевпр\сиым сре ictbom доставки i снов в opiainiiM м icKoinnaioiiiiix из пзвестпых на сеюдняшнин день являемся чети i н ipo шнамнчс'скнх инъекций (1 ш 1 с! al. 1ЧЧ9) Мы воеполыома шсь ним чет юм |акже енк н ноючх. чю б uno ыря niicoboii (ффектнвноеш экспрессии и печени перспсеснпою чпм меююм lena, можно тхч.мь

особенное Iii ею рему пиши и в часпюсш ировееш он I ими lamiio векн'ра женрееенп lena

и/ю А-1 человека. Для гидродинамического переноса были испрользованм плазмидные ДНК, представляющих собой векторы экспрессии кДИК аро А-1. под контролем промотора CMV (pCMVcapoAF), либо природный хросомомный локус (Хромосомный ген под собственным промотором АРОА1й/>оЛ-/| - рА1ц. На рис. 5 представлены результаты нммуноферментного определения в сыворотке крови мышей человеческого аро Л-l после гидродинамических инъекций в хвостовую вену животным (мыши С57В1/6) двух различных плазмидных векторов экспрессии аро А-1: рСМVcapoAl и рAls;. При инъекциях pCMVcopo/i/ человеческий аро А-1 выявлялся в сыворотке крови мышей спустя сутки после инъекции, тогда как, в, случая^,инъекции вектора экспрессии хромосомного гена lp.-1/g) человеческий белок появлялся не сразу, а лишь на третьи сутки.

• 45110

4 ?! 4000

3500

3000

1 1 2500

2000

? 1 ¡1 1500 1000

500

и ■>

Рис. 5. Динамика уровня аро А-1 в крови мышей после внутривенных гидродинамических инъекций плазмидных векторов экспрессии: кДНК-гена аро A-I (pCMVcapoAf) или хромосомного гена apoAl (pAlg) по 20 мкг на животное. Мыши- CS7BL/6 (самцы). По оси ординат - содержание в сыворотке аро А-1 человека; по оси абсцисс - дни измерений аро А-1 человека в сыворотке мышей; светлые столбцы - после инъекций рСМVcapoAl: темные столбцы • после инъекций рА1д.

Динамика содержания человеческого белка в крови также существенно зависела от вида инъецируемых плазмид. Гидродинамические инъекции рСМУг<//>н.1У вели к выявлению .максимальных значений человеческого аро А-1 в сыворотке крови мышей на первые сутки с иоследующим постепенным снижением его содержания практически до нулевых значений к концу второй недели. В то же время, содержание аро А-1 человека в кропи мышей, после инъекций /).1/ц', постепенно нарастало, достигая максимальных значении на 5-7 сутки и затем постепенно снижалось. Максимальный уровень человеческого аро А-1 в сывороже крови мышей, индуцированный при внутривенных инъекциях рА1ц. был достоверно сопоставим и даже превышал таковой, при инъекциях мышам конструкции рСМ\.'с<;/>о.1/ (рис. 5). Повторные инъекции рСМ\'<к/>».II с ишериалоч в диое-|рчс еуюк ненадолго ноддержииаич уровень Аро А-1 человека в крови мышеи, но не способе-|п>пч повышению

нот уровня (рис. 6а) Напротив, нов горние инъекции р Л/ц', вводимого в небольших количествах (по 10-20 мкг на мыть), ведут к постепенному повышению уровня человеческого белка аро А-1 в сыворотке крови мышеи (рис. 66) Способность рЛ/.ц'. в

<3 Й2

ю reo

seo

О.Ш

азм

3й

т.

mí

< = ч

as они

SÍ

1,5

а О

Рис. 6. Эффект повторных гидродинамических инъекции в хвостовую вену мышей CS7BL/6 pCMVcapoA/ (а) и рА1д (6) на содержание АроА-1 человека в сыворотке крови крыс: а-1- одна инъекция, анализ через 24 ч; 2- две инъекции с интервалом трое суток, анализ через 24 ч. J- одна инъекция, анализ через 12 суток: б- 1- одна инъекция. 2- две инъекции (с интервалом через три дня), анализ через трое суток после последней инъекции. 3- три инъекции (с интервалом двое суток), анализ через трое суток после последней инъекции

отличие отpCMVi'H/w/l/. длительное время обеспсчшшь высокий уровень жспрсссин mu про А-1 определяется либо сохранением экзон-игпроннон структуры lena в случае р 1/ц'. либо использованием в р.//ц' собственных регуляторпых районов, в отличие от вирусного промотора CMV.

С целью прояснения этого вопроса мы провели гидродинамические инъекции мышам генетических конструкции pSmaluc и pSraaSluluc, содержащих iен-репортер. колирующий люциферату, под контролем 5'-регуляторной области гена ори А-1 человека. Использованные генетические конструкции отличались лишь протяженностью З'-кониевых участков регуляторной области аро А-1. Результаты женернчепгоп приведены на рис. 7. Окагадось, что активность люцнферагы в гомогената.х печени всех инъецированных жпвощых максималга1а на первые сутки после инъекций и уже на ipeii.ii сутки после инъекций надает в сто раз. Следовательно, собственный промотор гена при А-1. включающий гепатцнгарный нкппсер, не в состоянии обеспечить длительную жспрессню в печени сцепленной с ним кДПК -копии lena Люцифераш - /не Полученные рс<\ тмагы ук'Л!Ынаю1 на роль жюшю-тиирошюп структуры в но.иержаннн

про юлжик'п.нои жспрессни (сна нослс переноса гидродинамическим методом н переживающих (не ic шцихся) kicikjx к каким шносжея клетки печени мдекопшаюших

Рис 7 Активность пюциферазы в печени мышеи поело переноса векторов экспрессии пюциферазы под контролем промотора гена аро А-1 человека гидродинамическим методом серые столбцы отображают активность пюциферазы через 24 ч после инъекции мыаам pAI'OAISnn Siu/ш (pSmaStu/uc) и pAPOAlSnu Slu/ш (pSnu/ш.) белые столицы отображают активность люциферазы через 72 ч после инъекции мышам тех же генетических конструкции

Не 1ыя исключить, что полученные резучьташ moivt объясняться не тол( ко víпетением экспрессии кДНК-ieiia люциферазы (пот коптрошм промотора А РОЛИ итн кДПК upo I I (noi конгротсм промотора ( MV/ но также и эшмннацнен I terpa.iamien) сооивснно тазмидных векторов экспрессии везететвне осооенностеи их конструкции (отсутствия эмонно-интронпои структуры) (De (icext Ц et al, 2000) Для прояснения вопроса бы ш пропс юны эксперименты по выящению пшмнд двух чкаынннх тиион в составе пи1кочо1скулярпои ядерной ДНК (не входящей в состав хромосом) гсиатоинтарпых ядер посте ипъекцнн мышам плазмид pC.MVíu/w.l/ и р f/t; На рис 8 нре итав ie-ны ретьташ выящения гена аро А-1 человека в шнкомолску (ярнон ДНК. выдсменнон щ я тер печени ншешфоплшых мышеи (рис Sai. а также рсстриктиою анашм пшмншон ДНК вылеченной из бактериальною к юна по именною в речутьгагс женерпментов по «спасению» инъецированных генетических конструкции (см «Материалы и мето щ») (рис 86) Видно, что с шкал, соответствующий присутствию копни 1ен,1 про А/ чеювека в шикомотскулярнои ДНК ядер мыши, которой бы и инъецирована pCMV<a/w I/. ни истечешно 50 шеп >же отемнпег. в ю время как он впяшяется в соилве низкомолекулярных ядерных ДНК мыши, инъецированном pl/i; (рис 8а) Рестриктшш aita.nii «спасенных» п.шчщ подтверждает сохранение р l/i; в жнеомиом сосюянии в ядрах печени мышеп (рис 86)

Таким обра юм па основании выпо шеппон работ можно ьзк ночи ti. с ic ty ionice • lleno íhioiiainie неннрииых epe leni досыпки lena ано nnioiipoiciiiia A I че юнека в метки м ickoiniыющнх, i ikiix kik KOMii.ikiinni Mo ieb\ 1яршni komioiai i.LItlklOill шронанныи pol\(l 1 \s) и Kai ионные nuil и ni (к, и l.it) по ню |яс1 нрниш к ныво |\ чю ее ш пп iíioohii hmcioi ер iiiiihmi ш 1ффсм в юсывкс (сноп ioi/ii/ui )<||фе'к1пиным ок чинимся шип i 11 ikioni шропшш ni poh(l l\s)(nl

loooococe

'Mora oo oooow

f¿ 1 ООО 00 10000 1000

обеспечивающий поглощение комплексов illIK/polylL-LysKial клетками печени рецептор-опосредованным зндоцитоюч

Ч 1156

<12007

< 2898

1 2 3 4 5

Рис. 8. Эписомиая локализация гена аро А-1 человека а ядрах гепатоцитов мышеи после гидродинамических инъекций рА1д в хвостовую вону мышей: а- ПЦР-анализ имя ДНК. выделенных из печени мышей через 50 дней после инъекции. 1- ДНК фага л. тидролизованная Pstl (маскер молукулярных масс|. 2- ПЦР с p/Wg (положительный контроль!. 3- ПЦР с н м я ДНК. выделенной из ядер клеток печени интактной мыши (отрицательный контроль); 4- ПЦР с н м я ДНК. выделенной из ядер клеток печени мыши, :инъецированнои рД/g, через 50 дней после инъекции; 5- ПЦР с н. м я. ДНК, выделенной из ядер клеток печени мыши, иньецированнои pCMVcapoA/. через 50 дней после инъекции Стрелюи отмечен специфическии фрагмент, соответствующий геномной последовательности гена яро А-1 человека, 6- рестриктныи анализ «спасенной» в бактериальных клетках плаэмидной ДМК. выделенной из ядер клеток печени мыши, инъецированной рА1д, через 50 дней после инъекции Стрелками отмечены фрагменты, соответствующие расщеплению pAlg ферментом EcoRI

• В сравнении с использованным в ранних работах молекулярным конъюгатом po!y(L-Lys)ASOR, галактозилированныП poly(l.-Lys)Gal обусловливает продолжительное сохранение в ядрах генаюцитов генетических конструкции, \ou в наших условиях уровень человеческого ¡шолшюпрогеши А-1 был выше в случае применения poly(L-Lys)ASOR, чем в случае применения poly(L-LysKial (Перевозчиков и др.. 1997) Дальнейшая онгимиыции згою способа доставки может привести к более шачимым резульшач. что даст вотчожность испо.и.юн.т. его для теистической коррекции .перосклероы

• Водее перспективным для этих целей может оказаться способ гидродинамических инъекций «голой» ДИК. представляющей собой пдазчидный вектор экспрессии гена аро А-1. поскольку существуют модификации этого метода, использующие инъекции генов при локальном повышении давления. Однократная инъекция плазмидного вектора экспрессии рA!g приводила к появлению аро А-1 человека н'; сыворотке крови мышеи в концентрации 5-20 мкг/чл. Мы установили, чю повторные инъекции - повышают уровень аро А-1 и крови вследствие продолжительной работы генетической конструкции в клетках печени. Полученные в нашей работе результаты указывают на важность экзонно-интрониой структуры гена аро А-1 для эффективной и продолжительной экспрессии этого гена. Пелыя исключить роли в этих процессах также и участков 5'-регуляторнои" последовательности гена аро А-1. хотя вариант этой 5'-регуляторнон последовательности включающий гепатоцитарный эн.хансср. сцепленный с кДНК гена-маркера; не в состоянии обеспечить продолжительную экспрессию этого гена я печени мышеи. Полученные результаты поднимают вопрос о роли пост-* транскрипционного созревания в экспрессии генов эукариот и в частности его роли в формировании полноценного продукта экспрессии iota a¡u> А-1. Кчульташ . доставки векторов экспрессии геиа человеческого аиолинопрозепна А-1 лабораторным животным методом гидродинамических внутривенных иньекшш лают в руки исследователя новый инструмент для исследования in vivo условий эффективной и продолжительной экспрессии геиа в чужеродном окружении, определяемой свойствами самой генетической конструкции. Свободные oí каких бы то ни было средств доставки, плазчилные векторы экспрессии paóoiaior в клетках без помех, создаваемых в резулыаге реакции клеток на постели эшх конструкции.

ВЫВОДЫ

1) Перенос плазмидной ДНК в полиэлсктролнтном комплексе с галактожлнрованпыч поли-Ь-лизином - poly(L-lys)Gal, в культивируемые клетки гепатомы человека Hep(¡2 происходит рецептор-опосредованным эндоцнтозом.

2) Оффективность доставки плазмндных векторов жспресснн генов в комплексе с pol)(L-lys)Gal в клетки HepG2 зависит от молярною соотношения кот.югага и ДНК в комплексе.

.?) П.тмидный вектор жспресснн кДНК upo А-1 человека в комплексе с poly(l.-lys)(ial. шисцированнын в хвостовую вену крыс, псрсиосшся в клетки печени и сохраняется в ялрах этих клеток в виде тпнеочы по меньшей мерс в течение недели '

4) Доставка «голых» плазмидных векторов экспрессии гена аро I / метовека в печети мышей С57В1/6 с помощью гидродинамических инъекции пьпмилных ДИК* в хвостовую вену мышеи приводит к наиболее высокому со 1срлаипю чс ювеческою аро \-1 в сыворотке крови животных Уровень аро Л-1 четовска в сыворотке мышеи попе первоначальной инъекции также может быть повышен повторными гндротинамическими инъекциями пзазмидных векторов экспрессии этою гена

5) Перенос птазмидных векторов экспрессии гена upo II в кочгиексс с капкншыч пептидом - копией катионного фра!мента белка Та! вируса иммунодефицита че ювека (Tat пептида) путем инъекции комплексов в хвостовую вену мышеи C57ÜI6 выпоэненных гидродинамическим методом, ведет к óoiee нижич значениям аро \ I чезовека в сыворотке в сравнении с тем. что достигается при ппрозинамических инъекциях аналогичных «голых» п газмил, в то время как шпекння Указанных коми ickcob. выполненная обычным способом дает отрицательный ra.iv п.гат

6) Продозжитезьная экспрессия icna upo 1-1 чс зовем в метках шчени мыши im и чес шеи) обусловливается сохранением лсюшю-пнтпошюп стр\кпры жно lena но не типом промотора (кзеточнын щи нирусоспеинфическин) контролирующего чо экспрессию

') Че ювеческий белок аро Л-1 стсгя две недеш лос ie инъекции плазчидного вектора жепрессип гена мышам C57BL6 не стпмузнрова i появ1сния специфичных к m.v% aiiTHie i в крови животных

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТГ ME Д11ССЕР Г ШИП

1 Перевозчиков А П.ДнжеЭ Б , Шав ювекни М М . К"\рышев 13 К). Парфенова II С. Баранов Д Н. Акифьев Б. Н. Сукоиина В Г , .1аззнков II А, Асеев М I! \дресованная доставка генов в культивируемые гепатомпые клетки и в печень крысы Материалы 5-й международной конференции "СПИД, рак и розствепные upoóicMii', 2*->0 мая 1997 г. г Санкт-Петербург, Россия / Рискнн журиаз ВИЧ СПИД н родственные проблемы, 1997,Т I.№ 1,С 256

2 Перевозчиков А П, Шавловский М М . Диже ') Б ПарфеноваИ С С\конина В I Сзшогеева Н И, Курышев В 10.. Акифьев Б. Н. Денисенко \ Д Экспрессия i сна апознпопротеина А-1 человека и бактериальных i снов-маркеров доставивших н к\ лыннпрусчыс гепатомпые клетки и в печень крысы в вше комщексов с мо 1ск\ зярнымзз копз.югатамн // Тезисы сообщении 11 то сл.сиа биохимическою общества РАН, 19-23 мая 1997, Москва, Пузцнно. 1997, часть I С 15?

1 ШавювекннМ М Сшюгеева II И Перевозчиков \ II Диже ) Ь \кифьси [>. II Ьаранов I) С Баранов A 11 Осипенко О В I линхокн I) С be ikii-пнащм

клеточных рецепторов и ткаиеспецифическая доставка экспрсссирусмых рекомбинантных генов // Международная конференция "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", 21-25 сентября 1998 г, Нущино. Сборник трудов, 1998, С. 169-171.

4. Перевозчиков А. П.. Дижс Э. Б., Шавловский M. М., Серов С. М„ Баранов Д. П.. Миссюль Б. В., Акифьсв Б. Н„ Сииогеева И. И., Кидготко О. В.. Суконина В. Е. Лапиков И. А. Направленная доставка антиатерогенного гена аполипопрозеииа A-I человека in vim в печень экспериментальных животных и in vitro в культивируемые клетки гепатомы человека. // Тезисы 9-ой итоговой конференции "Геном человека-99", 2-5 февраля 1999 г., г. Черноголовка, М, 1999, С. 126-127.

5. Perevozchikov A. P., Dizhe Е. В., Shavlovski M. M., MissuiT В. V., Akircv В. N.. Kidgotko О. V., Sinogeeva N. I., Sukonina V. E., Bogdanova M. A. Receptor-mediated human apolipopritein A-I gene delivery into a rat liver by intravenous injections of soluble DNA-molecular conjugate complexes // Human Genome Meeting, Brisbane, Australia. March 27-30, 1999. Abst.№. 192.

6. Perevozchikov A. P.. Dizhe E. В., Shavlovskij M. M. Missyuil' В. V. Akifev B. N.. Kidgotko О. V., Orlov S. V„ Sukonina V. E„ Bogdanova M. А. Продолжительная экспрессия гена аполипопротеина A-I, доставленного в печень крысы путем внутривенной инъекции комплексов: ДНК-молекулярный коньюгаг // Материалы 7-й международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы", 24-28 мая 1999 г.. г. Санкт-Петербург, Россия // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, 1999, Т. 3, № I.C. 174-175.

7. Sinogeeva N. I., Shavlovskij M. M., Baranov V. S., Baranov A. N.. Ostapcnko О. V. Perevozchikov А. P.. Dizhe E. В.. Akifiev В. N.. Gaitskhoki V, S. Tissue specific administration of reporter genes by injecting complexes of protein conjugates with DNA. // Bone Marrow Transplantation (supplement), 1999, p. 89-90.

8. Перевозчиков А. П., Днже Э. Б.. Миссюль Б. 13., Акифьсв Б. II.. Шавловский M. М, Орлов С. В., Кидготко О. В„ Суконина В. Е. Направленная доставка гена аполипопротеина A-I человека в клетки млекопитающих in vito и in vivo il Сборник отчетов программы «Геном человека» за 1999 г., М.. ВИНИТИ, 2000, С. 171-174.

9. Ignatovich I. A., Dizhe Е. В., Burov S. V., Akifiev В. N, Perevozchikov A. P. Suicide effect of herpesvirus thymidine kinase gene delivered into human hepatoma cells in complex with oligopeptides // Nature Genetics, 2001, V. 27, P. 61.

10. Днже '_). Б.. Акифьсв I>. II., Миссюль Б. В.. Орлов С. В., Кидго1ко О. В., Суконина В. Г.. Денисенко А. Д.. Перевозчиков А. И. Рецептор-опосредованный перенос комплексов Д11К-галактозилнроваиный [lo.'m-L-.iinini в клежи млекопитающих in vitro и in vivo '/ Биохимия, 2001, T. 66, №l.C. 71-79.

It Акифье» Б II Олейникова I Н, Буров С В Денисенко А Д Перевозчиков Л П XII Влияние способа доставки и свойств генетической конструкции на уровень и продолжительность экспрессии гена апотипопротеина А I че ювека в организме мышей // Тезисы докладов III съезда Всероссийского биохимического общества 26 Об 01 07 2002 г СПб, 532

12 Игнатович И А Диже Э G Акифьсв Ь Н Буров С В Ьоярчук Г Л Перевозчиков А Г] Доставка «суицидного» гена тичидинкиназы вируса герпеса в комплексе с катиоными олжопептидами в опухолевие клетки человека // Цитология 2002, Т 44, X1 5, С 455-462

13 Ignatovich 1 Л Dizhe Т В Pavlotskava A V, Akifiev В. N, Burov Ь V Ortov S V Pcrevo7chikov А Р, Complexes of plasmid DNA with basic domain 47 57 of the HIV-1 Tat protein arc transferred to mammalian cells bv cndocytobis-mediated pathways // J Biol Chem 2003 V 278, N 43 P 42625-42636

14 Акифьсв Ь. H„ Диже Э П Ьфремов А М Моги ichko Д А, Олейникова Г II Лапиков И А Жданова О 10 Килютко О В Орзов С В, Перевозчиков А Г1 Перенос гена аполипопрозеина А-1 че ювека мышам методом гизродинамическич инъекции факторы, влияющие на эффективность и продо 1Ж1лельность экспрессии гена в печени животного//Мол биоз 2004, Г 38,X¡6,C 1-10

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1 bpavil, Э М К. Ч Р Д Скогг 1989 Рстровируснме лекторы в книге Новое в клоииронпннн ДНК Методы под ред Д Гловср Мир Москва С 272 107

2 I ормян, К 19Н8 Высокоэффективный перекос генов в клетки млекопнпюшмх в хнше Клонирование ДНК Методы пол рея К Гловер Мир Москва С 409 463

3 К шмов V II, Ннкульченя И I 199$ Лшшн тнпопротенлы н атеросклероз Пнтер Пресс СПб

4 KvpMuieB 1) Ю, Дряпчннскяя II Л , Цяряпкшш L. В , Слвнновя О Вч Виробьсв í В, Диже Э Ь , ДеинсенкоА Д, Перевозчиков А II 1994 Бюлт экса биол мед 118 479 482

5 Мяннятне, Т, Э Фрич, Дж Сембрук 1984 Молекулярное клоннровшне Ме-готы гемеги icckoh инженерии Мир Москва

6 Перевозчиков А, II, Курышев В К), Арретувнн М., Пярфенопя II С, Ш;1л-юискш1 М М, Сукониня В L, Днже J В, О|)лов С. В, Денисенко А Д, ГяОтоки В е., Ктнмов А II 1997 Доклалы РАН 34 571-574

7 Перевозчиков А II, Серов С. М., Нвсоикнн II О , Курышев В К), Царяикиия I В.ЬяломнЛ II, Днже Э Б . VltiypoB В II 1994 Доюплы РАН ЛЧ (.46 649

К Вс|й1ся/11Г I М, Vlerched А, Сягг В.Окя К, Chin К II, РяМогс L, Binudil A, and Chan I 20113 С irculahon 107 2726 2732

9 Hi noil p, tntmnnuil F, Caillaud J M , lla^liul I . Caslro (.. Cullk Г 1 rucharl J ( . BrnnilLc 1) Dintfle P, und Dutcrger N 1999 l ireulmon 99 Hb 110

10 Cristiano К J und Roth J A UW J Mol Med 71 4'9 4S<i

11 (ulurk \\ 19)4 (icnc Iheripy 11 mdhook lor I'Iiimu ins Vt A l itlurl Pub!

12 De Geest B., Stengel D, Landekras M„ Lox M-, Lc C„ llolvoct P, and Nlnlo E. 20110 ArtcnOTclcr Thromb Vase Biol JO E68-E75

13 De Geest B„ Van Llnthout S., Lox M„ Collcn D., and Holvoet P. 2000 Hum Gene Ther II 101-112

14 Erbaeher P., Roche A. C, Momlgny M, and Mldonx P. 1995 Bioconjug Chem 6 401-410

15 Gottichalk S., Sparrow J. T„ Hauer J* Mlms M. P, Leland F. Woo S. L, and Smith L. C. 1996 Gene Ther 348-57

16 Herbomcl P„ Bourachot B, and Yanlv M. 1984 Cell 39 633-662

17 Ignatovich I. A, Dtzhc E. B„ Pavloukaya A. v., Aklflev B. N.. Burov S. V„ Orlov f, V., and Perevozchikov A. P. 200) J Biol Chem 27» 42625-42636

18 Uu F„ Song V, and Uu D. 1999 Gene Ther fi 1258-1266

19 Luoma P. V. 1997 Pharmacol Toxicol 81 57-64

20 Motas M„ Come7_Valadea A. C., Vldal_Alabro An MlgueMuru M„ Bermudcz J, Bartrom It, and Pernio J. C. 2003 Curt Gene Ther 3 468-485

21 Perales J. C, Ferkol T, Beegen H„ RatnofT O. D„ and Hamon R. W. 1994 Proc Natl Acad Sci U S A 914086-4090

22 Rubin fc. M* Isklda B. V, Clift S. M„ and krautt R. M. 1991a Proc Nail Acad Sci L S A 88 434-438

23 Rubin E. M„ Kraun R. M, Spangler E. A, Verstnyft J. G„ and Cllft S. M. 199lb Nature 3S3 265-267

24 Sfaemer R, Walsh A, Elaenberg S, Breafcw J. L, and Ruin A, 1990 1 Biol Chem. 265 1010-1015

25 Swanon M. f-, Hughe] T. E, Denny I. &, France D. S., FateraM J. R.. Tapparelli C„ Cfeller P. and Burkl K. 1992 TransgenRes I 142-147

26. Tanglrala R. K, Ttulumoto K. Chun S. H„ llsher D* Pure E„ and Rader D. i. 1999 Science 2S8 744-746

27 Tsukamoto K, Hlciter K. C„ Smith P, Usher D. C., Click J. M, and Rader D. J. 1997. J Lipid Res 38 1869-1876

28 Wu C. H. Wilson J. Mm and Wu G. Y. 1989 J Biol Chem 264 16985-16987

29 Wu G. Y. and Wu C. II. 1987 J Ural Chem 262 4429-4432

AwHoe MCCitenoaaKHC ncaaepwano rpaitTOM POOH №04-04-48683

Подписано в печать 18.11.04. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 70 экз. Заказ №60.

ЦОП типографии Издательства СПбГУ. 199061, С-Петербург, Средний пр., 41.

»--281

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Акифьев, Борис Николаевич

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Аполипопротеин A-I человека: структурно-функциональная ганизация и свойства.

2.2. Структурно-функциональная организация гена аро A-I человека

2.3. Методы доставки генов в клетки млекопитающих.

2.3.1. Перенос ДНК in vitro (перенос в культуру клеток).

2.3.1.1 Кальций-фосфатная преципитация.

2.3.1.2 Липофекция.

2.3.1.3 Электропорация.

2.3.1.4 Применение молекулярных конъюгатов.

2.3.1.5 Перенос генов с помощью рекомбинантных вирусов.

2.3.2. Перенос ex vivo.

2.3.3. Перенос генов in vivo.

2.3.3.1 Перенос с помощью рекомбинантных вирусов.

2.3.3.2 Использование для доставки генов in vivo липофекции.

3.5. Трансфекция культивированных клеток и анализ экспрессии бактериальных генов-маркеров в трансформированных клетках.

3.6. Измерения активности люциферазы.

3.7. Конкурентное вытеснение адсорбированных на клеточной поверхности меченых комплексов ДНК - роьу(Ь-Ьуз)Оаь избытками немеченого конъюгата.

3.8. Внутривенные инъекции комплексов ДНК - роьу(Ь-Ьуз)Оаь в хвостовую вену крысам.

3.9. Внутривенные инъекции плазмидной ДНК в хвостовую вену мышам

3.10. Выделение ДНК из тканей животного и анализ чужеродных нуклеотидных последовательностей в составе ДНК крыс и мышей, ПЦРанализ.

3.11. выделение РНК и ретро-ПЦР.

3. 12.«Спасение» плазмидных ДНК из ядер клеток печени мышей.

3.13. определение в сыворотке крови мышей и крыс человеческого аро A-I и антител, специфичных к аро A-I человека.

3.14. Статистическая обработка полученных результатов.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Использование роьу(Ь-Ьу8)Оаь для доставки ДНК в клетки гепатоцитарного ряда

4.1.1. Поиск оптимальной величины соотношения конъюгат/ДНК; формирование комплексов для трансфекции клеток и инъецирования.

4.1.2. Трансфекция культивируемых гепатомных клеток комплексами ДНК - галактозилированный поли-Ь-лизин.

4.1.3. Определение оптимальной величины ионной силы в реакционной среде при образовании комплексов ро1у(Ь-1уя)Оа1/ ДНК.

4.1.4. Анализ специфичности связывания комплексов ро1у(Ь-Ьу,ч)СаУДНК асиалогликопротеиновыми рецепторами клеток НерС2.

4.1.5. Доставка гена аролипопротеина А-1 человека в комплексе с галактозилированным поли Ь-лизином в печень крыс.

4.1.6. Вектор экспрессии гена аро А-1 человека сохраняется в ядрах клеток печени в виде эписомы.

4.2. Использование лизин-богатых и аргинин-богатых пептидов для доставки ДНК в клетки млекопитающих.

4.3. Экспрессия гена аро A-I человека в печени после доставки его мышам методом внутривенных гидродинамических инъекций.

4.3.1. Влияние комплексообразованш ДНК с катионными пептидами на эффективность гидродинамического переноса.

4.3.2. Сравнение характера экспрессии гена аро A-I в зависимости от интронно-экзонной структуры.

4.3.3. Оценка эффективности экспрессии гена люциферазы под контролем гепацитарного энхансера аро A-I в переживающих клетках печени мышей.

4.3.4. Анализ присутствия гена аро A-I в ядерной низкомолекулярной ДНК клеток печени мышей.

4.3.5. Оценка гуморального иммунного ответа у мышей на введение плазмиды pAlg.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности экспрессии гена аполипопротеина A-l человека после его переноса в организм млекопитающего"

Актуальность проблемы

Сердечно-сосудистые заболевания, в частности ишемическая болезнь сердца (ИБС), в настоящее время широко распространены в развитых странах Европы и Америки и являются наиболее частой причиной смерти людей пожилого возраста. Атеросклероз - одна из главных причин ИБС - и его развитие, в свою очередь, обусловливается различными факторами риска. Характерным показателем развития атеросклероза является снижение содержания в крови больных липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) - «антиатерогенных» липопротеидов, и повышение содержания липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) - «атерогенных» липопротеидов. В работах А. Н. Климова с сотрудниками (см. монографию (Климов А. Н. и др., 1995)) впервые было уделено внимание антиатерогенным свойствам ЛПВП и рассмотрена возможность использования ЛПВП и их главной белковой составляющей - аролипопротеина A-I (аро A-I) в лечебных целях.

Антиатерогенные свойства человеческого ароА-1 были убедительным образом продемонстрированы в экспериментах с трансгенными животными, которые приобретали устойчивость к атерогенным нарушениям стенок сосудов после трансплантации в геном человеческого гена аро A-I (Rubin Е. М. et al., 1991а; Rubin Е. М. et al., 1991b; Shemer R. et al., 1990; Swanson M. E. et al., 1992; Thompson L., 1992). Создание экспериментальной базы генотерапии ряда наследственных заболеваний человека и клиническая апробация этих подходов в ведущих мировых медико-биологических центрах позволили вплотную подойти к разработке аналогичных методов и для лечения других тяжёлых заболеваний, включая приобретаемые с возрастом сердечно-сосудистые болезни.

В круг проблем, общих для решения вопросов генотерапии, входит повышение эффективности и длительности работы в организме больного генетических конструкций, содержащих «лечащий» ген, а также устранение токсичности, иммуногенности, и иных побочных действий средств переноса «лечащих» генов пациенту (Culver К. W., 1994). По сути дела, решение этих проблем сводится к оптимизации используемых векторов экспрессии «лечащих» генов и к разработке эффективных средств доставки, лишенных указанных недостатков.

Эффективность генотерапевтического подхода к лечению атеросклероза путем доставки в организм млекопитающего гена аро A-I показана в исследованиях по переносу гена аро A-I человека лабораторным животным с атеросклеротическими повреждениями сосудов, индуцированными холестериновой диетой (Luoma P. V.,

1997; Tsukamoto К. et al., 1997; De Geest В. et al., 2000a; Benoit P. et al., 1999; Tangirala R. К. et al., 1999; Belalcazar L. M. et al., 2003). На основании полученных результатов разрабатываются схемы лечения больных атеросклерозом, находящиеся на стадии предклинических испытаний (Belalcazar L. M. et al., 2003).

Вместе с тем, следует отметить, что хотя широко используемые в настоящее время вирусные способы переноса «лечащих» генов (в рекомбинантных аденовирусах) наиболее эффективны, они не лишены побочных эффектов, главными из которых являются токсичность и иммуногенность рекомбинантных вирусов, ограничивающих их повторное использование для целей лечения. Невирусные средства доставки, несмотря на их низкую эффективность, лишены указанных недостатков и могут использоваться неоднократно, что весьма важно для лечения длительно текущих заболеваний, к которым относится и атеросклероз.

Таким образом, весьма актуальным является разработка таких подходов к генотерапии атеросклероза, при которых однократное воздействие имело бы оптимальный и продолжительный эффект и одновременно не исключало бы возможность повторения генотерапевтической процедуры. Подобный подход должен сочетать использование оптимизированных генетических конструкций и невирусных способов их доставки в организм больного.

Цель работы — сравнить различные невирусные способы переноса гена аролипопротеина A-I человека в клетки млекопитающих in vitro и in vivo и изучить особенности экспрессии гена аро A-I человека в чужеродном окружении в зависимости от его структурно-функциональной организации.

Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:

1) исследовать возможности использования галактозилированного поли-L-лизина, а также катионных пептидов для переноса экспрессирующегося гена аро A-I человека в печень млекопитающих (крыс) и оценить эффективность работы этих носителей в сравнении с использовавшимися ранее;

2) применить для доставки плазмидных векторов экспрессии гена человеческого аро A-I в организм млекопитающих (мышей) метод гидродинамических инъекций «голой» ДНК и сравнить эффективность этого способа с доставкой ДНК в виде комплексов с молекулярными конъюгатами и катионными пептидами;

3) сравнить эффективность и длительность экспрессии гена человеческого аро A-I в печени мышей в зависимости от структурно-функциональной организации этого гена (наличия экзонно-интронной структуры и участков регуляции транскрипции).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Перенос плазмидной ДНК в полиэлектролитном комплексе с галактозилированным поли-Ь-лизином — poly(L-lys)Gal в культивируемые клетки гепатомы человека HepG2 происходит рецептор-опосредованным эндоцитозом. Эффективность доставки плазмидных векторов экспрессии в комплексе с poly(L-lys)Gal в культивируемые клетки гепатомы человека HepG2 сравнима с эффективностью доставки плазмидных ДНК методом кальций-фосфатной копреципитации и зависит от молярного соотношения ДНК : poly(L-lys)Gal в комплексе.

2. Плазмидный вектор экспрессии кДНК аро A-I человека, инъецированный в комплексе с poly(L-lys)Gal в хвостовую вену крыс, доставляется в клетки печени и сохраняется в ядрах клеток в виде эписомы по меньшей мере в течение недели. Уровень аро A-I человека в крови крыс может быть повышен путём повторных внутривенных инъекций указанных комплексов.

3. Доставка векторов экспрессии гена аро A-I человека в печень мышей С57В1/6 путём гидродинамических внутривенных инъекций соответствующих плазмидных ДНК обеспечивает высокое содержание человеческого аро A-I в сыворотке крови животных. Уровень аро A-I человека в крови мышей может быть повышен повторными внутривенными инъекциями плазмидной ДНК.

4. Гидродинамическое введение комплексов ДНК с катионным пептидом Tat приводит к резкому падению эффективности переноса по сравнению с введением «голой» ДНК.

5. Человеческий белок аро A-I спустя 2 недели после инъекций гена мышам не стимулировал появления специфичных антител в крови животных.

6. Динамика экспрессии гена аро A-I человека в печени мышей не зависит от типа промотора, а определяется организацией структурной части гена. Сохранение экзонно-интронной структуры гена аро A-I обеспечивает эффективную и более продолжительную (до б месяцев) в сравнении с его кДНК-копией экспрессию гена.

Научно-практическая значимость работы Полученные результаты указывают на возможность использования различных катионных носителей как основы для эффективной доставки ДНК в клетки млекопитающих. Вместе с тем, отрицательные данные, полученные по доставке генов-маркеров и гена аро A-I человека в комплексе с ^модифицированными пептидами в организм путём внутривенных инъекций комплексов, указывают на существование определённых факторов, ограничивающих использование этого способа для практических задач генотерапии атеросклероза. Более перспективным является способ гидродинамических инъекций «голой» ДНК, который может быть адаптирован для целей генотерапии атеросклероза в дальнейшем. Весьма важно в каждом конкретном случае учитывать также структурно-функциональную организацию доставляемого в организм гена. В нашем случае важным для продолжительной и эффективной экспрессии оказалось сохранение экзонно-интронной структуры гена аро A-I человека.

Результаты настоящего исследования могут быть использованы при разработке и реализации проекта, направленного на лечение атеросклероза путем генетической коррекции соотношения антиатерогенных и атерогенных липопротеидов в крови больного за счёт доставки вектора экспрессии гена аро А-1в печень больного.

Материалы диссертации используются в курсах лекций для бакалавров и магистров кафедр эмбриологии и биохимии Санкт-Петербургского государственного университета.

Научная новизна работы

Впервые была показана возможность доставки векторов экспрессии гена аро A-I человека в организм млекопитающего путём внутривенных инъекций комплексов плазмидной ДНК с poly(L-lys)Gal, причем было установлен факт продолжительного сохранения доставленной ДНК в клетках печени в виде эписомы. В результате гидродинамических внутривенных инъекций плазмидных векторов экспрессии гена аро A-I человека мышам С57В1/6 оказалось возможным получить длительную и эффективную экспрессию перенесённого гена в клетках печени, а за счёт повторных инъекций добиться повышения уровня аро A-I человека в крови животных.

Продолжительность и уровень экспрессии гена аро A-I человека в клетках печени мышей (в чужеродном окружении) в значительной мере определяется не видом промотора (вирусоспецифический или собственный), а экзонно-интронной структурой кодирующей части гена, что является абсолютно новым фактом, имеющим приоритетное значение.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 17 тезисов докладов и сообщений на институтских, всероссийских и международных конференциях, симпозиумах и съездах. Результаты работы докладывались на международной конференции «Human Genome» (Australia, 1999), ежегодных итоговых конференциях ПП «Геном Человека» ГНТП РФ, съездах биохимического общества России (1997, 2002 гг.), международных конференциях «СПИД, рак и родственные проблемы», на 10-й международной студенческой конференции в Берлине, на конференциях молодых учёных России, Санкт-Петербурга и других конференциях. Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 105 страницах текста, иллюстративный материал содержит 20 рисунков и 1 таблицу. Список литературы содержит 222 наименования, из них 210 на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Акифьев, Борис Николаевич

6. выводы

1. Перенос плазмидной ДНК в полиэлектролитном комплексе с галактозилированным поли-Ь-лизином - poly(L-lys)Gal, в культивируемые клетки гепатомы человека HepG2 происходит рецептор-опосредованным эндоцитозом.

2. Эффективность доставки плазмидных векторов экспрессии генов в комплексе с poly(L-lys)Gal в клетки HepG2 зависит от молярного соотношения конъюгата и ДНК в комплексе.

3. Плазмидный вектор экспрессии кДНК ароА-1 человека в комплексе с poly(L-lys)Gal, инъецированный в хвостовую вену крыс, переносится в клетки печени и сохраняется в ядрах этих клеток в виде эписомы по меньшей мере в течение недели.

4. Доставка «голых» плазмидных векторов экспрессии гена аро A-I человека в печень мышей С57В1/6 с помощью гидродинамических инъекций плазмидных ДНК в хвостовую вену мышей приводит к наиболее высокому содержанию человеческого аро A-I в сыворотке крови животных. Уровень аро A-I человека в сыворотке мышей после первноначальпой инъекции также может быть повышен повторными гидродинамическими инъекциями плазмидных векторов экспрессии этого гена.

5. Перенос плазмидных векторов экспрессии гена аро A-I в комплексе с катионным пептидом - копией катионного фрагмента белка Tat вируса иммунодефицита человека (Tat-пептида) путем инъекций комплексов в хвостовую вену мышей С57В1/6, выполненных гидродинамическим методом, ведет к более низким значениям аро A-I человека в сыворотке в сравнении с тем, что достигается при гидродинамических инъекциях аналогичных «голых» плазмид, в то время как инъекция указанных комплексов, выполненная обычным способом, дает отрицательный результат.

6. Продолжительная экспрессия гена аро A-I человека в клетках печени мыши (до 6 месяцев) обусловливается сохранением экзонно-интронной структуры этого гена, но не типом промотора (клеточный или вирусоспецифический), контролирующего его экспрессию.

7. Человеческий белок аро A-I спустя 2 недели после инъекций плазмидного вектора экспрессии гена мышам С57В1/6 не стимулировал появления специфичных к нему антител в крови животных.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование невирусных средств доставки гена аролипопротеина A-I человека в клетки млекопитающих, таких как компактный молекулярный конъюгат галактозилированный poly(L-lys) и катионные пептиды (Ks и Tat) позволяет прийти к выводу, что если in vitro они имеют сравнимый эффект в доставке генов, то in vivo эффективным оказывается лишь галактозилированный poly(L-lys)Gal, обеспечивающий поглощение комплексов poly(L-lys)Gal-flHK клетками печени рецептор-опосредованным эндоцитозом.

В сравнении с использованным в ранних работах молекулярным конъюгатом poly(L-lys)ASOR, галактозилированный poly(L-lys)Gal обусловливает продолжительное сохранение в ядрах гепатоцитов генетических конструкций, хотя в наших условиях уровень человеческого аролипопротеина A-I был выше в случае применения poly(L-lys)ASOR, чем в случае применения poly(L-lys)Gal.

Дальнейшая оптимизация этого способа доставки может привести к более значимым результатам, что даст возможность использовать его для генетической коррекции атеросклероза.

Более перспективным для этих целей может оказаться способ гидродинамических инъекций «голой» ДНК, представляющей собой плазмидный вектор экспрессии аро A-I, поскольку существуют модификации этого метода, использующие инъекции генов при локальном повышении давления. Однократная инъекция плазмидБ рAlg приводила к появлению аро A-I человека в сыворотке крови мышей в концентрации 5-20 мкг/мл. Мы установили, что повторные инъекции повышают уровень аро A-I в крови вследствие продолжительной работы генетической конструкции в клетках печени. Полученные в нашей работе результаты указывают на важность экзонно-интронной структуры гена аро A-I для эффективной и продолжительной экспрессии этого гена. Нельзя исключить роли в этих процессах также и участков 5'-регуляторной последовательности гена аро A-I, хотя вариант этой 5'-регуляторной последовательности включающий гепатоцитарный энхансер, сцепленный с кДНК гена-маркера, не в состоянии обеспечить продолжительную экспрессию этого гена в печени мышей. Полученные результаты поднимают вопрос о роли пост-транскрипционного созревания в экспрессии генов эукариот и в частности его роли в формировании полноценного продукта экспрессии гена аро A-I.

Результаты доставки векторов экспрессии гена человеческого аролипопротеина A-I лабораторным животным методом гидродинамических внутривенных инъекций дают в руки исследователя новый инструмент для исследования in vivo условий эффективной и продолжительной экспрессии гена в чужеродном окружении, определяемой свойствами самой генетической конструкции. Свободные от каких бы то ни было средств доставки, плазмидные векторы экспрессии работают в клетках без помех, создаваемых в результате реакции клеток на носители этих конструкций.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Акифьев, Борис Николаевич, Санкт-Петербург

1. Браун, Э. М. К., М. Р. Д. Скотт. 1989. Ретровирусные векторы, в книге Новое в клонировании ДНК. Методы, под ред. Д. Гловер, Мир, Москва. С. 272-307.

2. Гормап, К. 1988. Высокоэффективный перенос генов в клетки млекопитающих, в книге Клонирование ДНК. Методы под ред. К. Гловер, Мир, Москва С. 409-463.

3. Игнатьева Е. В., Меркулова Е. И., Вишневский О. В., Кель А. Е. 1997. Регуляция транскрипции генов липидного метаболизма: описание в базе данных TRRD. Молекулярная биология 31:684-700.

4. Климов А. Н., Никульчева Н. Г. 1995. Липиды, липопротеиды и атеросклероз. Питер Пресс, СПб.

5. Климов А. Н., Никульчева Н. Г. 1999. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. Питер, СПб.

6. Маниатис, Т., Э. Фрич, Дж. Сембрук. 1984. Молекулярное клонирование. Методы генетической инженерии. Мир, Москва.

7. Щелкунов С. Н. 1988. Клониаование генов. Наука, Новосибирск.

8. Abdallah В., Hassan A., Benoist С., Goula D., Behr J. P., and Demeneix B. A. 1996. A powerful nonviral vector for in vivo gene transfer into the adult mammalian brain: polyethylenimine. Hum Gene Ther 7:1947-1954.

9. Andrianaivo F., Lecocq M., Wattiaux-De Coninck S., Wattiaux R., and Jadot M. 2004. Hydrodynamics-based transfection of the liver: entrance into hepatocytes of DNA that causes expression takes place very early after injection. J Gene Med 6:877-883.

10. Berg K., Selbo P. K., Prasmickaite L., and Hogset A. 2004. Photochemical drug and gene delivery. Curr Opin Mol Ther 6:279-287.

11. Blumberg B. and Evans R. M. 1998. Orphan nuclear receptors—new ligands and new possibilities. Genes Dev 12:3149-3155.

12. Boussif O., Lezoualc'h F., Zanta M. A., Mergny M. D., Scherman D., Demeneix B., and Behr J. P. 1995. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A 92:7297-7301.

13. Boussif O., Zanta M. A., and Behr J. P. 1996. Optimized galenics improve in vitro gene transfer with cationic molecules up to 1000-fold. Gene Ther 3:10741080.

14. Budker V., Budker T., Zhang G., Subbotin V., Loomis A., and Wolff J. A.2000. Hypothesis: naked plasmid DNA is taken up by cells in vivo by a receptor-mediated process. J Gene Med 2:76-88.

15. Byrnes L., Luo C. C., Li W. H., Yang C. Y., and Chan L. 1987. Chicken apolipoprotein A-I: cDNA sequence, tissue expression and evolution. Biochem Biophys Res Commun 148 :485-492.

16. Cao B. and Huard J. 2004. Gene transfer to skeletal muscle using herpes simplex virus- based vectors. Methods Mol Biol 246:301-308.

17. Chan L. 1989. The apolipoprotein multigene family: structure, expression, evolution, and molecular genetics. Klin Wochenschr 67:225-237.

18. Chen H. Y., Zhu H. Z., Lu B., Xu X., Yao J. H., Shen Q., and Xue J. L. 2004. Enhancement of naked FIX minigene expression by chloroquine in mice. Acta Pharmacol Sin 25:570-575.

19. Coffin R. S., MacLean A. R., Latchman D. S., and Brown S. M. 1996. Gene delivery to the central and peripheral nervous systems of mice using HSV1 ICP34.5 deletion mutant vectors. Gene Ther 3:886-891.

20. Coutelle C. and Williamson R. 1996. Liposomes and viruses for gene therapy of cystic fibrosis. J Aerosol Med 9:79-88.

21. Cristiano R. J. 2002. Protein/DNA polyplexes for gene therapy. Surg Oncol Clin NAm 11:697-716, viii.

22. Cristiano R. J. and Roth J. A. 1995. Molecular conjugates: a targeted gene delivery vector for molecular medicine. J Mol Med 73:479-486.

23. Culver K. W. 1994. Gene Therapy, Handbook for Phisicians. M.-A. Liebert Publ.

24. Culver K. W., Anderson W. F., and Blaese R. M. 1991a. Lymphocyte gene therapy. Hum Gene Ther 2:107-109.

25. Culver K. W., Osborne W. R., Miller A. D., Fleisher T. A., Berger M., Anderson W. F., and Blaese R. M. 1991b. Correction of ADA deficiency in human T lymphocytes using retroviral-mediated gene transfer. Transplant Proc 23:170-171.

26. Curiel D. T., Agarwal S., Wagner E., and Cotten M. 1991. Adenovirus enhancement of transferrin-polylysine-mediated gene delivery. Proc Natl Acad Sci USA 88:8850-8854.

27. Davies J. C. 2002. New therapeutic approaches for cystic fibrosis lung disease. J R Soc Med 95:58-67.

28. De Geest B., Van Linthout S., and Collen D. 2001. Sustained expression of human apo A-I following adenoviral gene transfer in mice. Gene Ther. 8:121-127.

29. Demeneix B., Behr J., Boussif O., Zanta M. A., Abdallah B., and Remy J. 1998. Gene transfer with lipospermines and polyethylenimines. Adv Drug Deliv Rev 30:1-3.

30. Denefle P. P., Hughes S., and Desurmont C. 1995. Towards gene therapy targeting HDL, p. 501-505. In F.P. Woodford, J. Davignon, and A. Sniderman (ed.), Atherosclerosis X. Elseiver Science,

31. Dini L., Falasca L., Ruzzittu M. T., Mossa G., FinazziAgro A., and DiGiulio A. 1998. Interaction between isolated and purified liver cells and small unilamellar liposomes. Liver 18:229-238.

32. Duzgunes N., De I. C., Simoes S., Zhdanov R. I., Konopka K., and Pedroso de Lima M. C. 2003. Cationic liposomes for gene delivery: novel cationic lipids and enhancement by proteins and peptides. Curr Med Chem 10:1213-1220.

33. Dworetzky S. I. and Feldherr C. M. 1988. Translocation of RNA-coated gold particles through the nuclear pores of oocytes. J Cell Biol 106:575-584.

34. Erbacher P., Bousser M. T., Raimond J., Monsigny M., Midoux P., and Roche A. C. 1996b. Gene transfer by DNA/glycosylated polylysine complexes into human blood monocyte-derived macrophages. Hum Gene Ther 7:721-729.

35. Erbacher P., Roche A. C., Monsigny M., and Midoux P. 1996a. Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes. Exp Cell Res 225:186-194.

36. Farhood H., Gao X., Son K., Yang Y. Y., Lazo J. S., Huang L., Barsoum J., Bottega R., and Epand R. M. 1994. Cationic liposomes for direct gene transfer in therapy of cancer and other diseases. Ann N Y Acad Sci 716:23-34.

37. Feldherr C. M. and Akin D. 1993. Regulation of nuclear transport in proliferating and quiescent cells. Exp Cell Res 205:179-186.

38. Feigner P. L., Gadek T. R., Holm M., Roman R., Chan H. W., Wenz M., Northrop J. P., Ringold G. M., and Danielsen M. 1987. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci U S A 84:7413-7417.

39. Fisher K. J., Choi H., Burda J., Chen S. J., and Wilson J. M. 1996. Recombinant adenovirus deleted of all viral genes for gene therapy of cystic fibrosis. Virology 217:11-22.

40. Flotte T. R. 2004. Gene therapy progress and prospects: recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Ther 11:805-810.

41. Friedmann T. 1989. Progress toward human gene therapy. Science 244:12751281.

42. Friend D. S., Papahadjopoulos D., and Debs R. J. 1996. Endocytosis and intracellular processing accompanying transfection mediated by cationic liposomes. Biochim Biophys Acta 1278:41-50.

43. Furth P. A., Shamay A., and Hennighausen L. 1995. Gene transfer into mammalian cells by jet injection. Hybridoma 14:149-152.

44. Gewirtz A. M., Stein C. A., and Glazer P. M. 1996. Facilitating oligonucleotide delivery: helping antisense deliver on its promise. Proc Natl Acad Sci U S A 93:3161-3163.

45. Glasspool-Malone J., Steenland P. R., McDonald R. J., Sanchez R. A., Watts T. L., Zabner J., and Malone R. W. 2002. DNA transfection of macaque and murine respiratory tissue is greatly enhanced by use of a nuclease inhibitor. J Gene Med 4:323-322.

46. Goins W. F., Wolfe D., Krisky D. M., Bai Q., Burton E. A., Fink D. J., and Glorioso J. C. 2004. Delivery using herpes simplex virus: an overview. Methods Mol Biol 246:257-299.

47. Goncalves C., Pichon C., Guerin B., and Midoux P. 2002. Intracellular processing and stability of DNA complexed with histidylated polylysine conjugates. J Gene Med 4:271-281.

48. Goncalves M. A., van der Velde I., Knaan-Shanzer S., Valerio D., and de Vries V. A. 2004. Stable transduction of large DNA by high-capacity adeno- associated virus/adenovirus hybrid vectors. Virology 321:287-296.

49. Goss J. R., Natsume A., Wolfe D., Mata M., Glorioso J. C., and Fink D. J. 2004. Delivery of herpes simplex virus-based vectors to the nervous system. Methods Mol Biol 246:309-322.

50. Gottschalk S., Sparrow J. T., Hauer J., Mims M. P., Leland F. E., Woo S. L., and Smith L. C. 1996. A novel DNA-peptide complex for efficient gene transfer and expression in mammalian cells. Gene Ther 3:48-57.

51. Graham F. L., Smiley J., Russell W. C., and Nairn R. 1977. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J Gen Virol 36:59-74.

52. Gregorevic P., Blankinship M. J., Allen J. M., Crawford R. W., Meuse L., Miller D. G., Russell D. W., and Chamberlain J. S. 2004. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno- associated viral vectors. Nat Med 10:828834.

53. Griesenbach U., Ferrari S., Geddes D. M., and Alton E. W. 2002. Gene therapy progress and prospects: cystic fibrosis. Gene Ther 9:1344-1350.

54. Guo Z. S. and Bartlett D. L. 2004. Vaccinia as a vector for gene delivery. Expert Opin Biol Ther 4:901-917.

55. Haddad I. A., Ordovas J. M., Fitzpatrick T., and Karathanasis S. K. 1986. Linkage, evolution, and expression of the rat apolipoprotein A-I, C-III, and A-IV genes. J Biol Chem 261:13268-13277.

56. Harnish D. C., Malik S., Kilbourne E., Costa R., and Karathanasis S. K. 1996. Control of apolipoprotein AI gene expression through synergistic interactions between hepatocyte nuclear factors 3 and 4. J Biol Chem 271:13621-13628.

57. Helium M., Hogset A., Engesaeter B. O., Prasmickaite L., Stokke T., Wheeler C., and Berg K. 2003. Photochemically enhanced gene delivery with cationic lipid formulations. Photochem Photobiol Sci 2:407-411.

58. Herbomel P., Bourachot B., and Yaniv M. 1984. Two distinct enhancers with different cell specificities coexist in the regulatory region of polyoma. Cell 39:653662.

59. Hertz R., Magenheim J., Berman I., and BarTana J. 1998. Fatty acyl-CoA thioesters are ligands of hepatic nuclear factor- 4alpha. Nature 392:512-516.

60. Herweijcr H., Zhang G., Subbotin V. M., Budker V., Williams P., and Wolff J.

61. A. 2001. Time course of gene expression after plasmid DNA gene transfer to the liver. J Gene Med 3:280-291.

62. Higuchi K., Law S. W., Hoeg J. M., Schumacher U. K., Meglin N., and Brewer H. B. 1988. Tissue-specific expression of apolipoprotein A-I (ApoA-I) is regulated by the 5'-flanking region of the human ApoA-I gene. J Biol Chem 263:1853018536.

63. Hirko A., Tang F., and Hughes J. A. 2003. Cationic lipid vectors for plasmid DNA delivery. Curr Med Chem 10:1185-1193.

64. Hogset A., Ovstebo E. B., Prasmickaite L., Berg K., Fodstad O., and Maelandsmo G. M. 2002. Light-induced adenovirus gene transfer, an efficient and specific gene delivery technology for cancer gene therapy. Cancer Gene Ther 9:365-371.

65. Hogset A., Prasmickaite L., Selbo P. K., Helium M., Engesaeter B. O., Bonsted A., and Berg K. 2004. Photochemical internalisation in drug and gene delivery. Adv Drug Deliv Rev 56:95-115.

66. Hogset A., Prasmickaite L., Tjelle T. E., and Berg K. 2000. Photochemical transfection: a new technology for light-induced, site-directed gene delivery. Hum Gene Ther 11:869-880.

67. Holmen S. L., Vanbrocklin M. W., Eversole R. R., Stapleton S. R., and Ginsberg L. C. 1995. Efficient lipid-mediated transfection of DNA into primary rat hepatocytes. In Vitro Cell Dev Biol Anim 31:347-351.

68. Hottiger M. O., Dam T. N., Nickoloff B. J., Johnson T. M., and Nabel G. J. 1999. Liposome-mediated gene transfer into human basal cell carcinoma. Gene Ther 6:1929-1935.

69. Huong T. M., Harashima H., and Kiwada H. 1998. Complement dependent and independent liposome uptake by peritoneal macrophages: cholesterol content dependency. Biol Pharm Bull 21:969-973.

70. Jeschke M. G. and Klein D. 2004. Liposomal gene transfer of multiple genes is more effective than gene transfer of a single gene. Gene Ther 11:847-855.

71. Karathanasis S. K. 1985. Apolipoprotein multigene family: tandem organization of human apolipoprotein AI, CIII, and AIV genes. Proc Natl Acad Sci U S A 82:63746378.

72. Kichler A., Leborgne C., Coeytaux E., and Danos O. 2001. Polyethylenimine-mediated gene delivery: a mechanistic study. J Gene Med 3:135-144.

73. Koch S., Pohl P., Cobet U., and Rainov N. G. 2000. Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects. Ultrasound Med Biol 26:897-903.

74. Kollen W., Erbacher P., Midoux P., Roche A. C., Monsigny M., Glick M. C., and Scanlin T. F. 1997. Glycosylated polylysines. Nonviral vectors for gene transfer into cystic fibrosis airway epithelial cells. Chest 111:95S-96S-95S-96S.

75. Kozarsky K., Grossman M., and Wilson J. M. 1993. Adenovirus-mediated correction of the genetic defect in hepatocytes from patients with familial hypercholesterolemia. Somat Cell Mol Genet 19:449-458.

76. Kozarsky K. F., Jooss K., Donahee M., Strauss J. F., and Wilson J. M. 1996. Effective treatment of familial hypercholesterolemia in the mouse model using adenovirus-mediated transfer of the VLDL receptor gene. Nat Genet 13:54-62.

77. Kwakye-Berko F. and Meshnick S. R. 1989. Binding of chloroquine to DNA. Mol Biochem Parasitol 35:51-55.

78. Kwong Y. L., Chen S. H., Kosai K., Finegold M., and Woo S. L. 1997. Combination therapy with suicide and cytokine genes for hepatic metastases of lung cancer. Chest 112:1332-1337.

79. Kwong Y. L., Chen S. H., Kosai K., Finegold M. J., and Woo S. L. 1996. Adenoviral-mediated suicide gene therapy for hepatic metastases of breast cancer. Cancer Gene Ther 3:339-344.

80. Ladias J. A. and Karathanasis S. K. 1991. Regulation of the apolipoprotein AI gene by ARP-1, a novel member of the steroid receptor superfamily. Science 251:561-565.

81. Lecocq M., Andrianaivo F., Warnier M. T., Wattiaux-De Coninck S., Wattiaux R., and Jadot M. 2003. Uptake by mouse liver and intracellular fate of plasmid DNA after a rapid tail vein injection of a small or a large volume. J Gene Med 5:142-156.

82. Lerondel S., Vecellio N. L., Faure L., Sizaret P. Y., Sene C., Pavirani A., Diot

83. P., and Le P. A. 2001. Gene therapy for cystic fibrosis with aerosolized adenovirus-CFTR: characterization of the aerosol and scintigraphic determination of lung deposition in baboons. J Aerosol Med 14:95-105.

84. Leventis R. and Silvius J. R. 1990. Interactions of mammalian cells with lipid dispersions containing novel metabolizable cationic amphiphiles. Biochim Biophys Acta 1023:124-132.

85. Liu F., Song Y., and Liu D. 1999. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther 6:1258-1266.

86. Lukacs G. L., Haggie P., Seksek O., Lechardeur D., Freedman N., and Verkman A. S. 2000. Size-dependent DNA mobility in cytoplasm and nucleus. J Biol Chem 275:1625-1629.

87. Luoma P. V. 1997. Gene activation, apolipoprotein A-I/high density lipoprotein, atherosclerosis prevention and longevity. Pharmacol.Toxicol. 81:57-64.

88. Matsui H., Johnson L. G., Randell S. H., and Boucher R. C. 1997. Loss of binding and entry of liposome-DNA complexes decreases transfection efficiency in differentiated airway epithelial cells. J Biol Chem 272:1117-1126.

89. McCreery T. P., Sweitzer R. H., Ungcr E. C., and Sullivan S. 2004. DNA delivery to cells in vivo by ultrasound. Methods Mol Biol 245:293-298.

90. Miao C. H., Thompson A. R., Loeb K., and Ye X. 2001. Long-term and therapeutic-level hepatic gene expression of human factor IX after naked plasmid transfer in vivo. Mol Ther 3:947-957.

91. Miller A. D. 1990. Retrovirus packaging cells. Hum Gene Ther 1:5-14.

92. Miller A. D. 2003. The problem with cationic liposome/micelle-based non-viral vector systems for gene therapy. Curr Med Chem 10:1195-1211.

93. Missol E., Sochanik A., and Szala S. 1995. Introduction of murine 11-4 gene into B16(F10) melanoma tumors by direct gene transfer with DNA-liposome complexes. Cancer Lett 97:189-193.

94. Molas M., GomezValades A. G., VidalAIabro A., MiguelTuru M., Bermudez J., Bartrons R., and Perales J. C. 2003. Receptor-mediated gene transfer vectors: progress towards genetic pharmaceuticals. Curr Gene Ther 3:468485.

95. Nakanishi M. 2003. New strategy in gene transfection by cationic transfection lipids with a cationic cholesterol. Curr Med Chem 10:1289-1296.

96. Nanda D., Vogels R., Havenga ML, Avezaat C. J., Bout A., and Smitt P. S. 2001. Treatment of malignant gliomas with a replicating adenoviral vector expressing herpes simplex virus-thymidine kinase. Cancer Res 61:8743-8750.

97. Niidome T. and Huang L. 2002. Gene therapy progress and prospects: nonviral vectors. Gene Ther 9:1647-1652.

98. Niranjan A., Wolfe D., Fellows W., Goins W. F., Glorioso J. C., Kondziolka D., and Lunsford L. D. 2004. Gene transfer to glial tumors using herpes simplex virus. Methods Mol Biol 246:323-337.

99. Nott A., Meislin S. H., and Moore M. J. 2003. A quantitative analysis of intron effects on mammalian gene expression. RNA 9:607-617.

100. Oberle V., de J. G., Drayer J. I., and Hoekstra D. 2004. Efficient transfer of chromosome-based DNA constructs into mammalian cells. Biochim Biophys Acta 1676:223-230.

101. Pedroso de Lima M. C., Neves S., Filipe A., Duzgunes N., and Simoes S. 2003. Cationic liposomes for gene delivery: from biophysics to biological applications. CurrMed Chem 10:1221-1231.

102. Perales J. C., Ferkol T., Beegen H., Ratnoff O. D., and Hanson R. W. 1994. Gene transfer in vivo: sustained expression and regulation of genes introduced into the liver by receptor-targeted uptake. Proc Natl Acad Sci U S A 91:4086-4090.

103. Pichon C., Guerin B., Refregiers M., Goncalves C., Vigny P., and Midoux P. 2002. Zinc improves gene transfer mediated by DNA/cationic polymer complexes. J Gene Med 4:548-559.

104. Pichon C., LeCam E., Guerin B., Coulaud D., Delain E., and Midoux P. 2002. PolyLys-(AEDTP).: a cationic polymer that allows dissociation of pDNA/cationic polymer complexes in a reductive medium and enhances polyfection. Bioconjug Chem 13:76-82.

105. Plump A. S., Scott C. J., and Breslow J. L. 1994. Human apolipoprotein A-I gene expression increases high density lipoprotein and suppresses atherosclerosis in the apolipoprotein E-deficient mouse. Proc Natl Acad Sci USA 91:9607-9611.

106. Poncet P., Panczak A., Goupy C., Gustafsson K., Blanpied C., Chavanel G., Hirsch R., and Hirsch F. 1996. Antifection: an antibody-mediated method to introduce genes into lymphoid cells in vitro and in vivo. Gene Ther 3:731-738.

107. Prasmickaite L., Hogset A., Selbo P. K., Engesaeter B. O., Helium M., and Berg K. 2002. Photochemical disruption of endocytic vesicles before delivery of drugs: a new strategy for cancer therapy. Br J Cancer 86:652-657.

108. Prasmickaite L., Hogset A., Tjelle T. E., Olsen V. M., and Berg K. 2000. Role of endosomes in gene transfection mediated by photochemical internalisation (PCI). J Gene Med 2:477-488.

109. Qiao J., Doubrovin M., Sauter B. V., Huang Y., Guo Z. S., Balatoni J., Akhurst T., Blasberg R. G., Tjuvajev J. G., Chen S. H., and Woo S. L. 2002. Tumor-specific transcriptional targeting of suicide gene therapy. Gene Ther 9:168-175.

110. Rittner K., Benavente A., Bompard Sorlet A., Heitz F., Divita G., Brasseur R., and Jacobs E. 2002. New basic membrane-destabilizing peptides for plasmid-based gene delivery in vitro and in vivo. Mol Ther 5:104-114.

111. Romero E. L., Morilla M. J., Regts J., Koning G. A., and Scherphof G. L. 1999. On the mechanism of hepatic transendothelial passage of large liposomes. FEBS Lett 448:193-196.

112. Rose J. K., Buonocore L., and Whitt M. A. 1991. A new cationic liposome reagent mediating nearly quantitative transfection of animal cells. Biotechniques 10:520-525.

113. Rossmanith W., Chabicovsky M., Herkner K., and Schulte-Hermann R. 2002. Cellular gene dose and kinetics of gene expression in mouse livers transfected by high-volume tail-vein injection of naked DNA. DNA Cell Biol 21:847-853.

114. Rottman J. N., Widom R. L., NadalGinard B., Mahdavi V., and Karathanasis S. K. 1991. A retinoic acid-responsive element in the apolipoprotein AI gene distinguishes between two different retinoic acid response pathways. Mol Cell Biol 11:3814-3820.

115. Rubin E. M., Krauss R. M., Spangler E. A., Verstuyft J. G., and Clift S. M. 1991b. Inhibition of early atherogenesis in transgenic mice by human apolipoprotein AI. Nature 353:265-267.

116. Schaffcr D. V. and Lauffenburger D. A. 1998. Optimization of cell surface binding enhances efficiency and specificity of molecular conjugate gene delivery. J Biol Chem 273:28004-28009.

117. Selbo P. K., Hogset A., Prasmickaite L., and Berg K. 2002. Photochemical internalisation: a novel drug delivery system. Tumour Biol 23:103-112.

118. Shemer R., Walsh A., Eisenberg S., Breslow J. L., and Razin A. 1990. Tissue-specific methylation patterns and expression of the human apolipoprotein AI gene. J.Biol.Chem. 265:1010-1015.

119. Shi W. K., Hopkins B., Thompson S., Heath J. K., Luke B. M., and Graham C. F. 1985. Synthesis of apolipoproteins, alphafoetoprotein, albumin, and transferrin by the human foetal yolk sack and other foetal organs. J Embryol Exp Morphol 85:191-206.

120. Shichiri M., Tanaka A., and Hirata Y. 2003. Intravenous gene therapy for familial hypercholesterolemia using ligand-facilitated transfer of a liposome:LDL receptor gene complex. Gene Ther 10:827-831.

121. Sobolev A. S., Rosenkranz A. A., Smirnova O. A., Nikitin V. A., Neugodova G. L., Naroditsky B. S., Shilov I. N., Shatski I. N., and Ernst L. K. 1998. Receptor-mediated transfection of murine and ovine mammary glands in vivo. J Biol Chem 273:7928-7933.

122. Somiari S., GIasspoolMalone J., Drabick J. J., Gilbert R. A., Heller R., Jaroszeski M. J., and Malone R. W. 2000. Theory and in vivo application of electroporative gene delivery. Mol Ther 2:178-187.

123. Stecenko A., King G., Torii K., Gao X., Persmark M., Shih K., Brigham K., and Raja-Walia R. 2000. Enhancement of liposome-mediated gene transfer to human airway epithelial cells by replication-deficient adenovirus. Exp Lung Res 26:179-201.

124. Sugaya S., Fujita K., Kikuchi A., Ueda H., Takakuwa K., Kodama S., and Tanaka K. 1996. Inhibition of tumor growth by direct intratumoral gene transfer of herpes simplex virus thymidine kinase gene with DNA-liposome complexes. Hum Gene Ther 7:223-230.

125. Szala S., Missol E., Sochanik A., and Strozyk M. 1996. The use of cationic liposomes DC-CHOL/DOPE and DDAB/DOPE for direct transfer of Escherichia coli cytosine deaminase gene into growing melanoma tumors. Gene Ther 3:10261031.

126. Tangirala R. K., Tsukamoto K., Chun S. H., Usher D., Pure E., and Rader D. J.1999. Regression of atherosclerosis induced by liver-directed gene transfer of apolipoprotein A-I in mice. Circulation 100:1816-1822.

127. Temin H. M. 1990. Safety considerations in somatic gene therapy of human disease with retrovirus vectors. Hum Gene Ther 1:111-123.

128. Thompson L. 1992. At age 2, gene therapy enters a growth phase. Science 258:744-746.

129. Tietge U. J., Cichon G., Buttner C., Genschel J., Heeren J., Gielow P., Grewe N., Dogar M., Beisiegel U., Manns M. P., Lochs H., Burchert W., and Schmidt

130. H. H. 2004. A sensitive noninvasive method for monitoring successful liver-directed gene transfer of the low-density lipoprotein receptor in Watanabe hyperlipidemic rabbits in vivo. Gene Ther 11:574-580.

131. Trivedi R. A. and Dickson G. 1995. Liposome-mediated gene transfer into normal and dystrophin- deficient mouse myoblasts. J Neurochem 64:2230-2238.

132. Tsukamoto K., Hiester K. G., Smith P., Usher D. C., Glick J. M., and Rader D. J. 1997. Comparison of human apoA-I expression in mouse models of atherosclerosis after gene transfer using a second generation adenovirus. J.Lipid Res. 38:1869-1876.

133. Tzameli I. and Zannis V. I. 1996. Binding specificity and modulation of the ApoA-I promoter activity by homo- and heterodimers of nuclear receptors. J Biol Chem 271:8402-8415.

134. Van Linthout S., CoIIen D., and De Geest B. 2002. Effect of promoters and enhancers on expression, transgene DNA persistence, and hepatotoxicity after adenoviral gene transfer of human apolipoprotein A-I. Hum.Gene.Ther. 13:829840.

135. Vandenbrouck Y., Janvier B., Loriette C., Bereziat G., and MangeneyAndreani M. 1995. Thyroid hormone modulates apolipoprotein-AI gene expression at the post-transcriptional level in Hep G2 cells. Eur J Biochem 231:126-132.

136. Vassaux G. and Martin-Duque P. 2004. Use of suicide genes for cancer gene therapy: study of the different approaches. Expert Opin Biol Ther 4:519-530.

137. Wagner E., Zenke M., Cotten M., Beug H., and Birnstiel M. L. 1990. Transferrin-polycation conjugates as carriers for DNA uptake into cells. Proc Natl Acad Sci U S A 87 :3410-3414.

138. Walters R. and Welsh M. 1999. Mechanism by which calcium phosphate coprecipitation enhances adenovirus-mediated gene transfer. Gene Ther 6:18451850.

139. Walther W. and Stein U. 2000. Viral vectors for gene transfer: a review of their use in the treatment of human diseases. Drugs 60:249-271.

140. Warden C. H., Hedrick C. C., Qiao J. H., Castellani L. W., and Lusis A. J. 1993. Atherosclerosis in transgenic mice overexpressing apolipoprotein A-II. Science 261:469-472.

141. Wasan E. K., Reimer D. L., and Bally M. B. 1996. Plasmid DNA is protected against ultrasonic cavitation-induced damage when complexed to cationic liposomes. J Pharm Sci 85:427-433.

142. Weir J. P., Dacquel E. J., and Aronovitz J. 1996. Herpesvirus vector-mediated gene delivery to human monocytes. Hum Gene Ther 7:1331-1338.

143. Widom R. L., Ladias J. A., Kouidou S., and Karathanasis S. K. 1991. Synergistic interactions between transcription factors control expression of the apolipoprotein AI gene in liver cells. Mol Cell Biol 11:677-687.

144. Wildner O. 2003. Comparison of replication-selective, oncolytic viruses for the treatment of human cancers. Curr Opin Mol Ther 5:351-361.

145. Williamson R., Lee D., Hagaman J., and Maeda N. 1992. Marked reduction of high density lipoprotein cholesterol in mice genetically modified to lack apolipoprotein A-I. Proc Natl Acad Sci U S A 89:7134-7138.

146. Wiseman J. W., Goddard C. A., McLelland D., and Colledge W. H. 2003. A comparison of linear and branched polyethylenimine (PEI) with DCChol/DOPE liposomes for gene delivery to epithelial cells in vitro and in vivo. Gene Ther 10:1654-1662.

147. Wolfe D., Wechuck J. B., Krisky D. M., Goff J. P., Goins W. F., Ozuer A., Epperly M. E., Greenberger J. S., Fink D. J., and Glorioso J. C. 2004. Delivery of herpes simplex virus-based vectors to stem cells. Methods Mol Biol 246:339352.

148. Wrobcl I. and Collins D. 1995. Fusion of cationic liposomes with mammalian cells occurs after endocytosis. Biochim Biophys Acta 1235:296-304.

149. Wu C. H., Wilson J. M., and Wu G. Y. 1989. Targeting genes: delivery and persistent expression of a foreign gene driven by mammalian regulatory elements in vivo. J Biol Chem 264:16985-16987.

150. Wu G. Y. and Wu C. H. 1987. Receptor-mediated in vitro gene transformation by a soluble DNA carrier system. J Biol Chem 262:4429-4432.

151. Yamamoto S., Suzuki S., Hoshino A., Akimoto M., and Shimada T. 1997. Herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir-mediated killing of tumor cell induces tumor-specific cytotoxic T cells in mice. Cancer Gene Ther 4:91-96.

152. Zabner J., Couture L. A., Gregory R. J., Graham S. M., Smith A. E., and Welsh M. J. 1993. Adenovirus-mediated gene transfer transiently corrects the chloride transport defect in nasal epithelia of patients with cystic fibrosis. Cell 75:207-216.

153. Zabner J., Fasbender A. J., Moninger T., Poellinger K. A., and Welsh M. J.1995. Cellular and molecular barriers to gene transfer by a cationic lipid. J Biol Chem 270:18997-19007.

154. Zanta M. A., Boussif O., Adib A., and Behr J. P. 1997. In vitro gene delivery to hepatocytes with galactosylated polyethylenimine. Bioconjug Chem 8:839-844.

155. Zenke M., Steinlein P., Wagner E., Cotten M., Beug H., and Birnstiel M. L.1990. Receptor-mediated endocytosis of transferrin-polycation conjugates: an efficient way to introduce DNA into hematopoietic cells. Proc Natl Acad Sci USA 87:3655-3659.

156. Zhang G., Budker V., Williams P., Subbotin V., and Wolff J. A. 2001. Efficient expression of naked dna delivered intraarterially to limb muscles of nonhuman primates. Hum Gene Ther 12:427-438.

157. Zhang G., Budker V., and Wolff J. A. 1999. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther 10:1735-1737.

158. Zhang G., Gao X., Song Y. K., Yollmer R., Stolz D. B., Gasiorowski J. Z., Dean D. A., and Liu D. 2004. Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery. Gene Ther 11:675-682.

159. Zhang S. H., Reddick R. L., Piedrahita J. A., and Maeda N. 1992. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science 258:468-471.

160. Zuhorn I. S., Kalicharan R., and Hoekstra D. 2002. Lipoplex-mediated transfection of mammalian cells occurs through the cholesterol-dependent clathrin-mediated pathway of endocytosis. J Biol Chem 277:18021-18028.

Информация о работе

Акифьев, Борис Николаевич
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Особенности экспрессии гена аполипопротеина A-l человека после его переноса в организм млекопитающего - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы