Перенос генов в клетки млекопитающих с помощью молекулярных конъюгатов: разработка носителей и оптимизация генетических конструкций

Ефремов, Александр Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Перенос генов в клетки млекопитающих с помощью молекулярных конъюгатов: разработка носителей и оптимизация генетических конструкций
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Перенос генов в клетки млекопитающих с помощью молекулярных конъюгатов: разработка носителей и оптимизация генетических конструкций"

На правах рукописи

Ефремов Александр Михайлович

ПЕРЕНОС ГЕНОВ В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ С ПОМОЩЬЮ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОНЪЮГАТОВ: РАЗРАБОТКА НОСИТЕЛЕЙ И ОПТИМИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ КОНСТРУКЦИЙ

03.03.04- клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 НОЯ 2012

Санкт-Петербург 2012

005056085

Работа выполнена на кафедре цитологии и гистологии биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета и в отделе биохимии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного Отделения Российской Академии Медицинских Наук.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Андрей Петрович Перевозчиков

Официальные оппоненты: д.б.н., профессор Падкина М.В.

Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра генетики и селекции к.б.н., Киселёв А. Б.

НИИ акушерства и гинекологии имени Д.О. Отта РАМН Ведущая организация:

Институт цитологии Российской Академии Наук Защита состоится:

«13» декабря 2012 в_час на заседании совета Д.212.232.12 по защите докторских

и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9,

Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра генетики и селекции, ауд. 1

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского Государственного Университета

Автореферат разослан_2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета:

д.б.н. Л. А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Генотерапия - перенос генов в соматические клетки организма в целях лечения заболеваний. Ключевым моментом, определяющим эффективность лечения, является выбор способа переноса ДНК в клетки-мишени. Максимальная эффективность переноса обеспечивается вирусными векторами, однако данный подход имеет существенные ограничения (Gerard R.D., Chan L., 1996; Temin Н.М. et al., 1990). Невирусные методы переноса ДНК лишены ряда принципиальных недостатков, присущих вирусным средствам (побочные эффекты, высокая иммуногенность и токсичность), и могут быть использованы многократно (Schmidt-Wolf G.D. et al., 2003). Наиболее перспективными среди невирусных носителей ДНК являются молекулярные конъюгаты - катионные носители для конденсации ДНК за счет электростатических взаимодействий с последующим введением полиэлектролитных комплексов ДНК/носитель в клетки млекопитающих (Molas М. et al., 2003). Однако, для невирусных способов доставки чужеродной ДНК также существует ряд ограничений. Комплексы ДНК/катионный пептид, как правило проникают в клетки за счет адсорбционного эндоцитоза, что снижает адресность доставки (Ignatovich I.A. et al., 2003). Кроме того, эффективность трансфекции будет зависеть от размера образующихся комплексов и способности этих комплексов попадать в цитоплазму из эндосом (Molas М. et al., 2003). В этой связи представляется актуальным разработка пептидных катионных носителей, взаимодействующих с ДНК за счет электростатических сил и способных переносить эту ДНК в клетки путем специфического, рецептор-опосредованного эндоцитоза. Кроме этого, необходимо адаптировать подобранные in vitro молекулярные конъюгаты (комплексы ДНК/катионный пептид) к условиям in vivo. Взаимодействие таких комплексов с белками плазмы крови (прежде всего с сывороточным альбумином) может привести к частичной, или даже полной инактивации комплексов и существенно ограничивает возможности системного применения комплексов ДНК с молекулярными конъюгатами в целях генотерапии, или экспериментального исследования экзогенных генетических конструкций (Ignatovich I.A. et al., 2003).

роль в обеспечении продолжительной и интенсивной экспрессии перенесенного гена играет его экзон-интронная структура. Механизмы влияния интронов на продолжительность экспрессии экзогенных генов изучены недостаточно (Miao С.Н. et al., 2001).

Целью данной работы являлась разработка молекулярных конъюгатов, способных обеспечить рецептор-опосредованный перенос генов in vitro и in vivo, а также выявление факторов, влияющих на продолжительность работы перенесенного гена in vivo.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи исследования:

1. Разработать на основе катионных пептидов молекулярные конъюгаты, проникающие в клетки рецептор-опосредованым эндоцитозом. Выявить факторы, влияющие на трансфекционную активность комплексов чужеродной ДНК с катионными пептидными конъюгатами.

2. Исследовать трансфекционную активность комплексов ДНК с молекулярными конъюгатами in vivo в случае системного или локального переносов.

3. Определить генетические факторы, влияющие на продолжительность экспрессии гена аполипопротеина А1 человека после доставки его в составе невирусного вектора экспрессии в печень или в другие клетки млекопитающих.

Научная новизна работы. Впервые созданы молекулярные конъюгаты на основе синтетических пептидных катионов и лигандов люлибериновых и трансферринового рецепторов, способные попадать в клетки рецептор-опосредованым эндоцитозом. Впервые получена работающая модель для направленного переноса генетических конструкций через рецептор к трансферрину в поверхностные ткани млекопитающих in vivo. Показана возможность переноса генетических конструкций в ткани зародыша мыши при гидродинамических инъекциях в организм матери. Продемонстрировано значение экзон-интронной структуры гена аполипопротеина Al человека в поддержании долговременной экспрессии этого гена после его переноса мышам методом гидродинамических инъекций.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный поликатион NLS способен связывать плазмидную ДНК, однако комплексы ДНК/NLS не способны к трансфекции in vitro.

2. Созданы молекулярные конъюгаты NLS-LHRH, NLS-TSF7 HNLS-TSF12, способные доставлять плазмидную ДНК посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза в клетки, экспрессирующие значительные количества рецепторов

люлиберина (конъюгат NLS-LHRII) и трансферрина (конъюгаты NLS-TSF7, NLS-TSF12).

3. Комплексы ДНК с пептидом NLS-TSF7 способны к эффективному переносу в поверхностные ткани мышей. В модели заживления ран NLS-TSF7 обеспечивает перенос гена инсулин-подобного ростового фактора IGFls и ускоряет процесс восстановления.

4. На продолжительность экспрессии экзогенного гена аполипопротеина Al человека в печени мышей влияют участки второго интрона гена, а не его

5'- и З'-регуляторные области.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены в виде 6 статей, опубликованных в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК, а также в виде устных и стендовых докладов на следующих конференциях: IX Всероссийский форум с международным участием «Дни Иммунологии в Санкт-Петербурге», Всероссийская медико-биологическая научная конференция молодых учёных «Фундаментальная наука и клиническая медицина», конференция «Живые системы» в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы».

Объем и структура диссертации. Диссертация содержит разделы «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Диссертация представлена на 139 страницах, содержит 34 рисунка и 2 таблицы. В «Списке цитируемой литературы» 234 источников, из них 14 на русском языке и 218 на английском.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы работы. В работе использованы реактивы и другие материалы следующих фирм: «Sigma» (США), «Serva» (Германия), «Pharmacia» (Швеция), «Boehringer Mannheim» (Германия), а также отечественного производства, квалификации х.ч. и ч.д.а; ферменты для генно-инженерных работ производства «Promega» (США), «Fermentas» (Литва) и НПО «СибЭнзим» (Россия). Для экспериментов in vivo использовались мыши линий С57В1/6 и DBA (самцы), полученные из питомника «Рапполово» РАМН (Санкт-Петербург). Все процедуры с животными были проведены в соответствии с общепринятыми правилами обращения и ухода за ними. Для экспериментов in vitro использованы клеточную линию гепатоцеллюлярной карциномы (гепатомы) человека HepG2, фибробласты кожи человека линии VH-10 и клетки карциномы человека А431. Все клеточные культуры получены из банка клеточных культур Института цитологии РАН. кДНК - копня гена ano Al человека него хромосомный вариант в составе протяженного геномного локуса, включающего 5'-регуляторный район (геномный локус протяженностью более чем 5000 н.п., плазмида pAlg) были любезно предоставлены доктором L. Chan (Baylor College, Texas, USA). Плазмпды pCMVapo и pCMVLuc, представляют собой вектора экспрессии

кДНК ano Al человека или люциферазы светляка под контролем промотора ранних генов цитомегаловируса человека, сконструированы методами генной инженерии и описаны ранее. Протяженная 5'-концевая регуляторная последовательности (-2491.. .+173 н.п.) гена аполипопротеина Al человека и её делеционные варианты, соответствующие промотору только с гепатоцитарным энхансером (-256...+ 173 н.п. относительно точки инициации транскрипции), сцепленные с геном-репортером luc, кодирующим люциферазу светляка, описаны ранее (Перевозчиков А.П. и др., 1997; Лапиков И.А. и др., 2008).

Методы исследования. Используемые в работе пептиды синтезированы методом твердофазного синтеза и предоставлены С. В. Буровым (ИВС РАН).

Формирование комплексов ДНК с катионными пептидами. Формирование комплексов ДНК с К8, NLS, и молекулярными коньюгатами проводили в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) при различном соотношении зарядов ДНК и пептида в реакционной среде. Образование комплексов ДНК/пептид контролировали методом гель-ретардации в агарозном геле. Количество пептида, входившее в состав комплекса, определяли обратным титрованием гепарином.

Трансформация с использованием катионных пептидов. Трансфекцию клеток препаратами комплексов ДНК с катионными пептидами и молекулярными коньюгатами выполняли на основании методики, предложенной Gottschalk с соавторами (Gottschalk S. et al., 1996). Комплексы ДНК/пептид с разными соотношениями зарядов ДНК и пептида готовили, как описано выше, из расчета 12 мкг ДНК на чашку диаметром 35 мм в 500 мкл ФСБ. После инкубации клеток с комплексами в течение 2-4 ч клетки отмывали от неинтернали-зовавшихся комплексов три раза раствором гепарина (58 мкг/мл в ФСБ), после чего к клеткам добавляли среду DMEM с 10% сывороткой и инкубировали в атмосфере 5% СО, при 37"С в течение 24 ч. В экспериментах по оценке эффективности трансфекции клеток с использованием флюоресцентно-меченных пептидов клетки после инкубации в течение 2 часов при 37'С отмывались от неинтернализованного пептида раствором гепарина (58 мкг/мл в ФСБ) три раза по 10 минут.

Системное введение плазмидной ДНК в хвостовую вену мышей. Плазмидные ДНК (10 мкг на мышь) инъецировали с помощью иглы в хвостовую вену мышей С57Ы/6 (самцы в возрасте 6-8 недель, массой от 12 до 19 г) гидродинамическим способом: за 4-5 с в 13 мл раствора Рингера (в зависимости от веса мыши). Для гидродинамических инъекций непосредственно перед экспериментом отбирали группу мышей с массами +1 грамм относительно среднего значения (тср). Точный объем (V) вводимого раствора вычисляли по формуле (Акифьев Б.Н. и др., 2004), полученной на основании данных F. Liu с соавторами (Liu F. et al., 1999): У(мл)=0,057143xmcp +0,5143

Перенос комплексов плазмидной ДНК с молекулярными конъюгатами NLS-TSF7 в поверхностные ткани мышей. Перед нанесением ран кожа экспериментальных животных подготавливалась — удалялся волосяной покров. Резаные раны наносились с помощью хирургического скальпеля па глубину примерно 2 мм, захватывая подлежащую мышечную ткань, в области нижней части спины. Колотые раны наносились путем десяти уколов инсулиновым шприцом в нижнюю часть спины. Инъекции экспериментальных препаратов наносились инсулиновым шприцом в виде 10 уколов в каждую рану. Плазмидная ДНК и комплексы плазмидной ДНК с молекулярным конъюгатом вводились в количестве 50 мкг ДНК на мышь в 100 мкл ФСБ, содержащем 4 мМ СаСЬ. Для измерения люцифераз-ной активности па 3-й день после переноса мышам pCMVluc животных умерщвляли и вырезали участок тканей, включающий рану. Для постановки эксперимента использовалось 100 мг ткани каждого животного. Образцы гомогенизировали в буфере Reporter Lysis Buffer производства «Promega», замораживали и после разморозки центрифугировали 3 мин при 10000 g. Супернатант использовали для измерения люциферазной активности и концентрации белка.

Анализ экспрессии генов методом RealTime ОТ-ПЦР. Оценку экспрессии синтетического гена инсулиноподобпого фактора роста I типа (IGF-1) проводили на первые, третьи и седьмые сутки после переноса мышам pCMVlGF-1 методом RealTime ОТ-ПЦР. Для отрицательного контроля испольювали мышей, не обработанных pCMVIGF-1. Выделение РНК из тканей осуществляли с использованием набора «TRI Reagent» производства фирмы «Sigma», по инструкции изготовителя. Синтез кДНК проводили с помощью набора Revert Aid© First Strand cDNA Synthesis Kit производства фирмы «Fermentas». Для измерения относительного содержания мРНК применяли метод RealTime PCR с использованием SYBR GREEN (SYBR Green Sitpermix («Bio-Rad»). Все образцы нормировались по уровню экспрессии гена ß-актииа. Реакцию проводили с использованием термоцнклера 1Q5 («BioRad»), предварительный анализ данных осуществляли с использованием прилагающегося программного обеспечения. В качестве отрицательного контроля использовалась реакция без добавления ДНК. Нормализацию данных проводили по количеству ткани, концентрации РНКикДНК.

Делеция участков плазмидиой ДНК с помощью ПЦР. Для делецни второго (плазмида pS234) и третьего (плазмида pS34) интронов из плазмиды pSgapo (содержит геномный ген ano AI под контролем собственной 5'-регуляторной области -256. ..+1 н.п. относительно точки инициации транскрипции) мы использовали методику, основанную на ПЦР. С плазмидиой ДНК раздельно ставились две ПЦР, включающие области, граничащие с делетиру-емым участком в 5'-(Jl) и З'-(П) положении. Использовались праймеры для делецни третьего ннтрона

Л: прямой 5'-AGAGACTGCGAGAAGGAG-3'

обратный 5'-CAGTTGTCAAGGAGCTTTAGGTTTAGCTGTTTTCCCAAG-3' П: прямой 5'-GCCTTGGGAAAACAGCTAAACCTAAAGCTCCTTGACAACTGGG-3' о братный 5'-CCGCTCTAGAACTAGTGGAT-3' и для делецни второго интрона

Л: прямой 5'-AGAGACTGCGAGAAGGAG-3'

обратный 5'-GAAATGCCGAGCCTGGCTCCCCGTCAGGAAGAGCAC-3' П: прямой 5'-GGCCGTGCTCTTCCTGACGGGGAGCCAGGCTCGGCATTTC-3' обратный 5'- CCGCTCTAGAACTAGTGGA-3' Праймеры, фланкирующие область делении, помимо участков, комплиментарных своей половине фрагмента, содержали участок, комплиментарный последовательности ДНК, фланкирующей область делецни с противоположной стороны. В результате этого раунда ПЦР, образовывались два фрагмента (Л и П) с перекрывающимися концами. Полученные фрагменты очищались от остатков ираймеров и плазмидиой ДНК с помощью препаративного гель-электрофореза. Эквимолярную смесь правого и левого фрагментов денатурировали и проводили кросс-отжиг с последующей амплификацией продукта с использованием краевых праймеров: прямой 5'-AGAGACTGCGAGAAGGAG-3', обратный 5'-CCGCTCTAGAACTAGTGGAT-3'. Полученными фрагментами с помощью генно-инженерных манипуляций замещали соответствующие геномные части в плазмиде pSapo. Определение в сыворотке крови мышей человеческого белка Ano Al. Для определения концентрации Ario Al использовали метод твердофазного иммуноферментного анализа с использованием поликлональных антител кролика против человеческого Ano Al и вторых антител козы против кроличьих IgG, сконъюгированных с пероксидазой хрена. Поли-клональные кроличьи антитела против человеческого Ano Al были описаны ранее (McVicar J.P. et al., 1984).

Статистическая обработка полученных результатов. Значения ферментативных активностей представлены как среднее арифметическое не менее трёх параллельных проб ¿стандартная ошибка среднего. Достоверность различий определяли с помощью непарного t-теста. Различия рассматривались достоверными при р<0,05. Статистический анализ выполнялся с помощью программы Statistica 5.0, «StatSoft Inc».

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ Молекулярные коныогаты. Выбор катнонного носителя.

Направленность переноса ДНК в комплексах с молекулярными конъюгатами определяется структурой лигандной составляющей комплекса ДНК/катионный пептид, специфически взаимодействующей с рецепторами клеточной поверхности и обеспечивающей интернализацию комплексов ДНК/молекулярный конъюгат в клетки путем рецептор-опосредованного эндоцитоза. Катионной составляющей обычно отводится роль носителя ДНК. Тем не менее, в ряде предыдущих исследований показана способность комплексов ДНК с катионными пептидами проникать в клетки за счет неспецифического адсорбционного эндоцитоза. Использование подобных пептидов в качестве катион-ных составляющих молекулярных конъюгатов приводит к снижению специфичности переноса генов в клетки-мишени.

В задачи работы входил анализ способности различных катионных пептидов доставлять чужеродную ДНК внутрь клеток путем неспецифического адсорбционного эндоцитоза. В работе использовали два катионных пептида - лизин-богатый модифицированный сигнал ядерной локализации Т-антигена вируса SV40 (NLS - PKKKRKV) и аргинин-богатый сигнал ядерной локализации белка Rev ВИЧ1 (NLS-Arg - RRNRRRR). Оба пептида оказались способны формировать полиэлектролитные комплексы с плаз-мидной ДНК за счет электростатических взаимодействий, аналогично описанным ранее катионным пептидам Tat и К8 (ignatovich I.et al., 2003; Диже Э.Б. и др., 2006). Оценку трансфекционной активности пептидов NLS и NLS-Arg проводили в экспериментах по трансфекции клеток человека HepG2 комплексами плазмидой ДНК (pCMVluc) с катионными пептидами с последующим анализом эффективности переноса с помощью люциферазного теста (рис. 1). В качестве положительного контроля использовали ранее изученный катионный пептид К8 (Gottschalk S. et al., 1996).

Трансфекция клеток HepG2 комплексами ДНК с пептидом NLS-Arg приводит к высокому уровню люциферазной активности в лизатах клеток. В тех же условиях эксперимента, в лизатах клеток, трансфецированных комплексами pCMVluc с пептидом NLS, люциферазная активность не выявлялась. Таким образом, несмотря на электростатическое связывание плазмидной ДНК, пептид NLS не способен доставлять ДНК в культивируемые клетки человека путем адсорбционного эндоцитоза (рис. 1). На основе полученных данных пептид NLS был выбран в качестве катионной составляющей для создания молекулярных конъюгатов.

Рис. I. Активность люцифсразы в экстрактах клеток НерС2 после переноса комплексов рСМУ1ис с катонными пептидами NLS, NLS-arg и К8.

По оси абцис указаны избытки зарядов катионных пептидов по отношению к ДНК. По оси ординат (ЯЬи) указана относительная активность люциферазы на микрограмм тотального белка: число зарегистрированных вспышек в минуту на 1 мг тотального клеточного белка (р<0,01)

Комплексы ДНК с молекулярными конъюгатами проникают в клетки за счет рецептор-опосредованного эндоцитоза

Для синтеза молекулярных конъюгатов в качестве лигандной части использовали агонист (EHWSYKLRPG) и антагонист (KPGFPSYKLRPG) рецепторов гонадолибери-на, (Буров С. В. и др., 2010), а также пептидные лиганды трансферринового рецептора, описанные ранее Lee J.H. и соавторами (TSF-7 - AHAIYPRH hTSF-12 -ATHRPPMWSPVWP) (Lee J.H. et al., 2001). Рецепторы к люлиберину в норме присутствуют на ограниченном числе клеток организма млекопитающих (гонады, гипофиз, мозг и плацента) (Schally A.V., 1999). Однако эти рецепторы обнаружены во многих типах опухолей, что делает агонисты и антагонисты люлиберина перспективными средствами доставки терапевтических агентов (Nagy A. et al., 2006). В отличие от рецепторов люлиберина, рецепторы к трансферрину присутствуют во многих типах клеток, и их количество зависит от пролиферативной активности клеток.

В качестве катионной составляющей во всех случаях использовали пептид NLS (см. выше). В результате были получены следующие молекулярные конъюгаты (рис. 2). Анализ интернализации молекулярных конюгатов клетками проводили с использованием флуоресцентно меченых конъюгатов NLS-LHRH, Nukl и комплексов ДНК с конъю-

ДНК : пептид

гатом 1\1Ь8-ЬН11Н. Клетки гепатомы человека Нер02 (содержат значительные количества люлибериновых рецепторов) и фибробластов человека УН-10 (не содержат люли-бериновых рецепторов) инкубировали с конъгатами в течение 10 мин. Присутствие флуоресцентной метки в культурах исследовали методом конфокальной микроскопии. Как свободный МЬ5-ЬН1Ш иЫик1, так и комплексы ДНК сИЬЗ-ЬНЯН обнаруживались в везикулярных компартментах клеток гепатомы, но не фибробластов (рис. 2).

М^-ЬНЯН:

Енхузуките I

РКККЛКУ Ыик1:

РЮСКЛКУ-крсррзукьярс

ЫЬ5-Т5Р7:

РКККЮСУ-АТНИРРМШЗРУШР

ЫЬ5-Т5Р12: РКККЯК У-АНА1 УРИН

Рис. 2. Структура молекулярных конъюгатов (справа) и интернализация молекулярных конъюгатов ЬНЯН-1УЬ8 (в, е), Nukl (б, д) и комплексов ЬНГШ-1\Ь8/ДНК (а, г) клетками Нер02 (а, б, в) и фибробластами человека (г, д, е)

Полученные данные свидетельствуют о тканеспецифической доставке ДНК с помощью молекулярных конъюгатов на основе лигандов люлибериновых рецепторов. Ещё одно доказательство роли рецепторов люлиберина в проникновении комплексов конъюгатов с ДНК на основе аналогов люлиберина получено в экспериментах по доставке коньюгатов на основе синтетических аналогов люлеберина КЬ8-ЬНЯН и Мик1 клеткам Нер02 с избытками аларелина (известный агонист люлибериновых рецептров). Установлено, что аларелин дозозависимо подавляет эффективность трансфекции клеток комплексами ДНК с молекулярным конъюгатом МЬв-ЬНЯН и не влияет на уровень трансфекции клеток комплексами ДНК с конъюгатом Ыик! (рис. 3).

500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0

PpCMVluc/NLS-LHRH □ pCMVluc/Nukl

Рис. 3 Влияние аларелина на эффективность переноса комплексов ДНК/NLS-LHRH и ДНК/Nukl в клетки HepG2. По оси ординат (RLU) указана относительная активность люциферазы па микрограмм тотального белка: число зарегистрированных вспышек в минуту на 1 мг тотального х1 х5 х10 к25 клеточного белка (р<0,01 )

Полученные результаты указывают на рецептор-опосредованный характер проникновения комплексов ДНК с NLS-LIIRII в клетки HepG2. В отношении путей проникновения в клетки комплексов ДНК с Nukl однозначных выводов сделать нельзя.

Специфичность взаимодействия пептидных лигандов TSF7 и TSF 12 с рецептором трансферрина была установлена в предыдущих исследованиях (Lee J.H. et al., 2001). Доказательства рецептор-опосредованного характера проникновения комплексов ДНК с молекулярными конъюгатами NLS-TSF7 и NLS-TSF12 получены в экспериментах по трансфекции клеток HepG2 комплексами pCMVluc/NLS-TSF7 и pCMVlnc/NLS-TSF12 в присутствии 50-кратных молярных избытков соответствующих свободных молекулярных конъюгатов. В обоих случаях добавление к клеткам молярных избытков свободных конъюгатов приводило к существенному снижению уровня трансфекции клеток, что доказывает рецептор-опосредованный механизм интернализации клетками комплексов ДНК с молекулярными конъюгатами на основе пептидных лигандов транс-ферриновых рецепторов.

На рисунке 4 приведены результаты люциферазного теста, демонстрирующие влияние различных факторов на эффективность трансфекции клеток llepG2 молекулярными конъюгатами NLS-LHRII, Nukl, NLS-TSF7 и NSL-TSF12. Установлено, что удаление СаСЬ из культуральной среды приводит к практически полному подавлению уровня экспрессии переносимого гена при использовании всех вышеперечисленных конъюгатов. Полученные данные хорошо согласуются с тем фактом, что как рецептор-опосредованный, так и адсорбционный эндонитоз угнетаются в отсутствие ионов Са: . Еще одним важным фактором, существенно влияющим на эффективность трансфекции клеток полиэлектролитными комплексами, является присутствие в культуральной среде белков сыворотки крови. В предыдущих исследованиях установлено, что трансфекции клеток комплексами ДНК с катионными пептидами Tat и К8 в присутствии белков

сыворотки крови приводит к существенному снижению уровня экспрессии перенесенного гена (Ignatovich I.A. et al., 2003). Это подавление может иметь решающее значение при разработке систем переноса генов in vivo. Установлено, что введение при транс-фекции клеток в культуральную среду 10% эмбриональной сыворотки коров (FCS) приводило к падению уровня экспрессии перенесенного гена для молекулярных конъюга-тов NLS-LHRH, NLS-TSF7 и NLS-TSF12 (рис. 4).

D ОС

pCMVIuc : пептид (1:1)

□ NLS-TSF7

□ NLS-TSF12 ЕЗ Nuk1

■ NLS-LHRH

pCMVIuc : пептид (1:5)

среда с FCS

среда без CaCI2

Рис. 4. Уровень активности люциферазы в экстрактах клеток HepG2 после трансформации комплексами pCMVluc с молекулярными копыо-гатами NLS-LHRH, Nukl, NLS-TSF7 и NLS-TSF12: влияние белков сыворотки и ионов кальция. По оси ординат (RLU) указана относительная активность люциферазы на микрограмм тотального белка: число зарегистрированных вспышек в минуту на I мг тотального клеточного белка (р<0,01)

Молекулярные конъюгаты на основе аналогов люлиберина в модели суицидальной генотерапии in vitro способны эффективно уничтожать опухолевые клетки

Полученные данные о тканеспецифическом проникновении комплексов ДНК/ЬНРН-МЬБ и ДНК/Ыик1 (см. выше) в клетки НерС2 позволили перейти к моделированию «суицидальной» генотерапии опухолей путем переноса в клетки вектора экспрессии гена тимидинкиназы вируса НвУ! (рРТК 1) с последующей обработкой транс-фецированных клеток ацикловиром. Клетки Нер02 трансфепировали комплексами рРТК1/ЫЬ5-Ь1ШН и рРТК1/Ыик1, приготовленными при соотношении зарядов один

к одному. Распределение клеток по фазам клеточного цикла оценивали методом проточной цитофлуорометрии. Результаты представлены на рисунке 5. Обработка клеток, трансфецированных комплексами рРТКЛ/МЬБ-ЬНИН, ацикловиром приводит к полному исчезновению клеток в фазах клеточного цикла С2 и Б и практически полному исчезновению клеток в фазе 01. Более 90% клеточной популяции находятся в апоптоти-ческом состоянии (рис. 5в). В случае использования конъюгата Ыик1 также наблюдалась массовая гибель клеток, однако, эффект был менее выражен, так как около 15% клеток оставались в фазе в 1. Клетки в фазах Б и в2 также отсутствовали. Апоптоз клеток обусловлен именно экспрессией «суицидального» гена, так как обработка ин-тактных клеток Нерв2 ацикловиром (рис. 56) не приводила к существенным отклонением клеточного цикла по сравнению с контролем (рис. 5а).

Рис. 5. Анализ распределения клеток НерС2 по фазам клеточного цикла методом проточной цитофл юорометрии: а- интактные клетки (контроль); б- клетки после обработки ацикловиром (50 мкг/мл) в течение 24 ч

в- клетки, трансфецированные комплексами рРТК1/ЫЬ5-ЬНЯН после обработки ацикловиром (50 мкг/мл) в течение 24 ч

г- клетки, трансфецированные комплексами рРТК1/Ыик1 после обработки ацикловиром (50 мкг/мл) в течение 24 ч

Системное введение комплексов pCMVIuc/Nukl в хвостовую вену мышей приводит к трансфекции клеток печени

Известно, что люлибериновый рецептор присутствует в клетках гипофиза, мозга, гонад и плаценты. В качестве мишени для переноса генетических конструкций с люци-феразой наибольший интерес представляет плацента, благодаря удобному расположению и большому количеству кровеносных сосудов. Для модели переноса комплексов ДНК с пептидами NLS-LHRH и Nukl in vivo мы выбрали беременных самок мышей линии С57В1/6. При введении комплексов ДНК/Nukl и ДЫК/NLS-LHRH путем обычных

(«медленных») инъекций в хвостовую вену беременной мыши, люциферазная активность регистрировалась только при использовании комплексов ДНК/Nukl в печени взрослых самок, причем уровень люминесценции составлял порядка 5,8х10^Еи/мг белка. В других тканях и при использовании комплексов ДЫК/NLS-LHRH экспрессия люциферазного гена не наблюдалась. Как известно, в нормальных (не опухолевых) ге-патоцитах рецепторы к люлиберину не найдены (Schally A.V. et al, 1996), что позволяет предположить не связанное с люлибериновым рецептором проникновение комплексов ДНК/Nukl. Данное предположение подтверждается также результатами опытов in vitro на клетках гепатомы HepG2, где уровень трансфекции клеток комплексами ДНК с пептидом Nuk 1 не снижался в присутствии избытков аларилина (рис. 2). Возможно, что пептид Nuk 1 взаимодействует не только с рецепторами гонадолиберина, но и с какими-то иными рецепторами на поверхности гепатоцитов. Отсутствие активности молекулярного конъюгата NLS-LHRH при системном введении мышам объясняется, по-видимому, угнетающем действием белков плазмы крови (рис. 4).

Перенос гена ннсулиноподбного фактора роста 1 с помощью конъюгата NLS-TSF7

в поврежденные поверхностные ткани мышей ускоряет заживление ран

В экспериментах по локальному переносу in vivo молекулярный конъюгат NLS-TSF7 оказался способен эффективно переносить гены в поверхностные ткани млекопитающих (Ефремов A.M. и др., 2010).

□ pCMVIGF-1s/NLS-TSF7

С 40,00 -i SpCMVIGF-1s

* SÉ

72 часа 120 168

часов часов

Рис. 6. Динамика накопления РНК-продукта перенесенного гена 1СП5, нормализованного на единицу веса тканей образцов, на разных сроках методом НеаНЧте ОТ-ПЦР. На графике приведены данные значения циклов выхода кривой реакции на плато (р<0,01)

Эти данные позволили использовать NLS-TSF7 в системе регенерационной терапии поверхностных повреждений млекопитающих. Перенос вектора экспрессии гена инсули-ноподобного фактор роста I типа человека pCMVIGF-ls (Иванов И.А. и др., 2007) в поверхностные раны мышей (DBA, самцы, 6 недель) осуществляли с помощью молекулярного конъюгата NLS-TSF7. В эксперименте было сформировано 4 группы животных, по 10 мышей в каждой. Мышей из опытной группы инъецировали 50 мкг либо свободной pCMVIGF-ls, либо комплексами pCMVIGF-ls/NLS-TSF7. Контрольных мышей инъецировали плазмидной ДНК с делетированным промотором (pdelIGF-ls) или свободным NLS-TSF7. На 3, 5 и 7 сутки по две мыши из каждой группы умерщвляли и из областей, прилегающих к ране, выделяли РНК, которую использовали для количественной оценки экспрессии IGF-1 методом RealTime ОТ-ПЦР. Уровень экспрессии гена IGF-1 на 3 и 5 сутки после начала эксперимента был выше от 64 до 128 раз при инъекциях комплексов pCMVIGF-ls/NLS-TSF7 по сравнению с инъекциями свободной pCMVIGF-ls (рис. 6). У мышей контрольной группы, инъецированных плазмидой с делетированным промотором, или свободным молекулярным конъюгатом NLS-TSF7, экспрессии IGF-1 человека зарегистрировано не было. Эти данные подтверждают ранее полученные результаты о высокой эффективности молекулярного конъюгата NLS-TSF7 при доставке генов в поверхностные ткани млекопитающих.

^^ Bp емя животных 1 день 7 день 10 день 14 день 21 день

pCMVIGF-ls 60±13.5 28.5±6 12±3 0 0

pCMVIGF-ls /NLS-TSF7 57±11.2 24 ±7.5 6±2 0 0

pdelIGF-ls бб±20 42±9 24±5.5 10.5± 6 0

NLS-TSF7 62±13.5 4б.5±8 28.5±б 10. 5±4.5 0

Таблица 1. В таблице приведены средние значения площади раны (в мм2) в экспериментальных и контрольных группах мышей: рСМУЮР-1з -мыши, инъецированные свободным вектором экспрессии инсулин-подобного фактора роста I типа человека; рСМУЮР-15/ЫЬ8-Т8Р7 - мыши, инъецированные комплексами рСМУЮР-Ь/ЫЬБ-ТвР?; pdelIGF-ls - мыши, инъецированные свободным вектором экспрессии инсулин-подобного фактора роста I типа человека с делетированным промотором; ЫЬ8-Т8Р7 - мыши, инъецированные свободным молекулярным конъюгатом ЫЬ8-Т8Р7.

Оценку скорости регенерации проводили, измеряя площадь ран на 7, 10, 14 и 21 сутки после начала эксперимента. Результаты суммированы в таблице 1. Инъекции как свободной pCMVIGF-ls, так и комплексов pCMVIGF-ls/NLS-TSF7 приводили к существенному ускорению процесса заживления раны по сравнению с контрольными животными. Через 14 суток после начала эксперимента у мышей, инъецированных комплексами pCMVIGF-ls/NLS-TSF7, происходило полное заживление раны, тогда как в контроле площадь раны составляла около 10 мм2 (-17% от исходного размера, таблица 1). Более того, у мышей, инъецированных комплексами pCMVIGF-ls/NLS-TSF7, на 10 сутки после начала эксперимента, размер раны был в два раза ниже, чем у мышей, инъецированных свободной плазмидой, и в 4 раза ниже, чем у контрольных групп. Полученные результаты свидетельствуют об эффективности разработанной системы невирусной регенерационной генотерапии поверхностных повреждений млекопитающих.

Влияние структуры гена ano Al человека на продолжительность его экспрессии после переноса в печень мышей

В предыдущих работах (De Geest В. et al., 2000; Акифьев Б.Н. и др., 2004) было показано, что в отличие от конструкции рСМVapo (кДНК копия гена ano Al под контролем промотора CMV), геномный вариант гена ano А! человека с полноразмерной (-6194...+ 1 н.п.) 5'- и 3'- регуляторной областью (плазмида pAlg) способен поддерживать долговременную экспрессию более двух недель) после переноса в печень мышей методом гидродинамических инъекций. На продолжительность экспрессии перенесенного гена могут влиять 5'- и 3'- регуляторные области, регуляторные элементы, которые могут находиться в кодирующей части и сама экзон-интронная структура гена (De Geest В. et al., 2000). Для установления роли собственно экзон-интронной структуры геномного гена был получен делеционный вариант плазмиды pAlg - плазмида pSApo, представляющая собой ген ano AI человека с сохранённой экзон-интронной структурой и усеченной 5'-регуляторной областью (-256...+1 н.п. относительно точки инициации транскрипции), содержащей собственно промотор гена и гепатоцитарный энхансер. Данный район 5'-регуляторной области гена ano Al необходим и достаточен для его тканеспецифической экспрессии в гепатоцитах (Widom R.L. et al., 1991). Перенос генетических конструкций с геном ano Al человека в печень мышей проводили методом гидродинамических инъекций (Акифьев Б.Н. и др., 2004). Установлено, что уда-

ление протяженных 5'- и З'-регуляторных областей гена ano Al человека не приводило к сокращению продолжительности экспрессии в печени мышей.

Продолжительная экспрессия гена ano Al человека в печени мышей может быть обусловлена либо присутствием неких регуляторных элементов в составе интронов, либо важностью сплайсинга для стабилизации и эффективной трансляции мРНК ano Al. Для проверки этих вариантов были созданы генетические конструкции pSA34 и pSA234, представляющие собой производные плазмиды pSApo, лишенные, соответственно, третьего (плазмида pSA34) и второго и третьего (плазмида pSA234) интронов.

3501) .1(111(1 с 25(И1

i 20110

< 15(1(1

с.

10 1000 500 0

3 5 7 9

Дни noc.it ШГЫкППП

5'-регуляторная □ „534 область + 1 кадирующай часть anofil

" +1 256 i с экзшами и имтронаш

-зР - ~

^ ел 5'-регуляторная

^ pSApo область + А кодирующая часть эпоА1

+ 1 256 i..............с зкзонами и нитронами

- -ir- — -=L

□ PS234 5''РегУлят°Рная

" Область + Л кодирующая масть апо А1

+1 256 ■ с зкзонами и ингрсмами

■■" —

Рис. 7. Уровень ano А1 в крови мышей после внутривенных гидродинамических инъекций нлазмидных векторов экспрессии: хромосомного гена ano Al (pAlg) и гена сто Al с сохраненной экзон-интроной структурой под контролем «печеночного энхансера» (pSapo), делеционого геномного варианта с удалённым третьим интроном (pS34) и вторым и третьим интроиом (pS234) по 20 мкг на животное. Мыши - C57BI/6 (самцы). По оси ординат -содержание в сыворотке Ano Al человека; по оси абсцисс - дни после начала эксперимента; па рисунке представлена сводная гистограмма всех трех конструкций (р<0,05)

Результаты переноса данных генетических конструкций в печень мышей в сравнении с плазмидой pSApo приведены на рисунке 7. Обнаружено, что делеция третьего нитрона не сказывается на продолжительности работы перенесенного гена ano Al (рис. 7). Однако дополнительная делеция второго интрона приводит к прекращению экспрессии человеческого ano А1 уже на 5 день после начала эксперимента. Полученные результаты свидетельствуют о существовании в пределах второго интрона регуляторных последовательностей, обеспечивающих продолжительную работу перенесенного гена ano Al в печени мышей.

Таким образом, в результате данной работы созданы молекулярные конъюгаты, способные эффективно доставлять ДНК в клетки млекопитающих рецептор-опосредованным эндоцитозом через рецепторы люлиберинов (конъюгат NLS-LHRH), или транс-ферриновый рецептор (конъюгаты NLS-TSF7 nNLS-TSF12). Созданные молекулярные конъюгаты успешно апробированы на модели суицидальной генотерапии опухолей in vitro и модели регенеративной генотерапии поверхностных повреждений мышей in vivo. Изучены генетические факторы, влияющие на работу перенесенного гидродинамическими инъекциями гена ano Al человека в организме мышей. В частности, установлена принципиальная важность второго интрона гена ano А1 человека в поддержании продолжительной (более недели) его экспрессии в печени мышей после гидродинамического переноса.

выводы

1.Катионный пептид NLS, несмотря на формирование комплексов с ДНК, не способен доставлять ДНК в клетки человека in vitro но является перспективным носителем ДНК при разработке на его основе активных молекулярных коныогатов.

2. Молекулярные коныогаты на основе аналогов люлиберина (NLS-LHRH и Nukl) и трансферрииа (NLS-TSF7) способны к переносу нлазмидной ДНК в культивируемые клетки человека рецептор-опосредованным эндоцитозом.

3. В модели «суицидной» генотерании опухолей in vitro коныогаты NLS-LHRH и Nukl оказались эффективным средством направленного переноса гена тимидинкиназы герпесвируса.

4. Локальный перенос комплексов пептида NLS-TSF7 с плазмидным вектором экспрессии инсулипоподобпого фактора роста 1 в повреждённые поверхностные ткани мышей ускоряет заживление ран.

5. Продолжительная, не менее двух недель, экспрессия гена аполииопротеина А1 человека после гидродинамического переноса в печень мышей обеспечивается вторым интроном гена.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

публикации в изданиях, рекомендованных ВАК России

1) Акифьев Б.Н., Дюке Э.Б., Ефремов A.M., Могиленко Д.А., Олейникова Г.Н., Лапиков И.А., Жданова O.A., Кидготко О.В., Орлов C.B., Перевозчиков А.П. Перенос гена человеческого аполипопротеина A-I мышам методом гидродинамических инъекций: факторы, влияющие на эффективность и продолжительность экспрессии гена в печени животного. Молекулярная биология, Т. 38, С. 1076-1084, 2004.

2) Диже Э.Б., Игнатович И.А., Буров C.B., Похвощева A.B., Акифьев Б.Н., Ефремов A.M., Перевозчиков А.П., Орлов C.B. Комплексы ДНК с катионными пептидами: условия формирования и факторы, влияющие на их проникновение в клетки млекопитающих. Биохимия, Т. 71, №. 12, С. 1659-1667, 2006.

3) Ефремов A.M., Буглаева А.О., Орлов C.B., Буров C.B., Игнатович И.А., Диже Э.Б., Шавва B.C., Перевозчиков А.П. Перенос генетических конструкций через трансплацентарный барьер в зародыши мыши. Онтогенез, Т. 41, № 2, С. 94-100, 2010.

4) Ефремов A.M., Духовлинов И.В., Диже Э.Б., Буров C.B., Леко М.В., Акифьев Б.Н., Могиленко Д.А., Иванов И.А., Перевозчиков А.П., Орлов C.B. Невирусная регенеративная генотерапия повреждений кожных покровов млекопитающих. Цитология, Т. 52, № 5, С. 371-379, 2010.

5) Буров C.B., Яблокова Т.В., Дорош М.Ю., Кривизюк Е.В., Ефремов A.M., Орлов C.B. Аналоги люлиберина, содержащие последовательность ядерной локализации Т-антигена вируса SV-40. Биоорганическая химия, Т. 36, № 5, С. 630-637, 2010.

6) Яблокова Т.В., Челушкин П.С., Дорош М.Ю., Ефремов A.M., Орлов C.B., Буров C.B. Синтез аналогов люлиберина и их использование в системах адресной доставки генов. Биоорганическая химия, 38(1), 31-39, 2012.

другие публикации

7) Ефремов A.M., Акифьев Б.Н., Диже Э.Б., Могиленко Д.А., Олейникова Г.Н., Лапиков И.А., Жданова О.Ю., Орлов C.B., Перевозчиков А.П. Влияние структуры гена Аполипопротеина A-I человека на его экспрессию после переноса мышам методом гидродинамических инъекций. Медицинская Иммунология, тезисы IX Конференции «Дни Иммунологии в Санкт-Петербурге», Т. 7, №2-3, 2005

8) Ефремов A.M., Акифьев Б.Н., Диже Э.Б., Могиленко Д.А., Олейникова Г.Н., Лапиков И.А., Жданова О.Ю., Орлов C.B., Перевозчиков А.П. Экспрессия гена Аполипопротеина A-I человека после его переноса мышам методом гидродинамических инъекций. Онтогенез, тезисы докладов XIV школы «Биология развития», Т. 36 №5, 2005.

9) Орлов C.B., Диже Э.Б., Игнатович И.А., Буров C.B., Яблоква Т.В., Ефремов A.M., Акифьев Б.Н., Перевозчиков А.П. Суицидная генотерапия гормон- чувствительных опухолей человека: разработка невирусной системы направленного переноса гена тимидинкиназы вируса простого герпеса первого типа на основе аналогов люлиберинов. Сборник трудов конференции ««Живые системы» в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», 2008

10) Иванов И.А., Духовлинов И.В., Буров C.B., Ефремов A.M., Акифьев Б.Н., Диже Э.Б., Могиленко Д.А., Перевозчиков А.П..Орлов C.B. Система невирусной регенеративной генотерапии поверхностных повреждений тканей человека. Сборник трудов конференции ««Живые системы» в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», 2009

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1) Иванов И.А. Фармацевтическая композиция для генной терапии заболеваний, требующих стимуляции регенераторных процессов, включая повреждения тканей человека различной этиологии, на основе синтетического модифицированного гена инсулиноподобного фактора роста человека первого типа (ИФР-1, IGF-1). Заявка на изобретение 2007124538/15 от 02.07.2007.

2) Лапиков И.А., Могиленко Д.А., Диже Э.Б., Игнатович И.А., Орлов С.В., Перевозчиков А.П. API-подобные цис-элементы в 5'-регуляторной области гена аполипопротеина A-I человека. Молекулярная биология, Т. 42, №2, с. 295-305,2008.

3) Перевозчиков А.П., Курышев В.Ю., Арредоуани М., Парфенова Н.С., Шавловский М.М., Суконина В.Е„ Диже Э.Б., Орлов С.В., Денисенко А.Д., Гайцхоки B.C., Климов А.Н. Направленный перенос гена аполипопротеина А-1 человека и бактериальных генов-маркеров в печень крысы. Доклады РАН, 352, 571-574, 1997.

4) De Geest В., Van Linthout S., Lox M., Collen D., and Holvoet P. Sustained expression of human apolipoprotein A1 after adenoviral gene transfer in C57BL/6 mice: role of apolipoprotein A1 promoter, apolipoprotein A1 introns, and human apolipoprotein E enhancer.

Hum.Gene .Ther. 11:101-112,2000.

5) Gerard R.D., Chan L. Adenovirus-mediated gene transfer: strategies and applications in lipoprotein research. CurrOpin Lipidol. Apr;7(2): 105-11, 1996.

6) Gottschalk S., Sparrow J.T., Hauer J., Mims M.P., Leland F.E., Woo S.L., and Smith L.C. A novel DNA-peptide complex for efficient gene transfer and expression in mammalian cells. Gene Ther 3:448-457, 1996.

7) Ignatovich 1.А., Dizhe E.B., Pavlotskaya A.V., Akifiev B.N., Burov S.V., Orlov S.V., Perevozchikov A.P. Complexes of plasmid DNA with basic domain 47-57 of the HIV-1 Tat protein are transferred to mammalian cells by endocytosis-mediated pathways. J Biol Chem 278:42625-42636, 2003.

8) Lee J.H., Engler J.A., Collawn J.F., Moore B.A. Receptor mediated uptake of peptides that bind the human transferring receptor. Eur. J. Biochem., 268:2004-2012, 2001.

9) Liu F., Song Y., and Liu D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther 6:1258-1266, 1999.

10) McVicarJ.P., Kunitake S.T., Hamilton R.L., KanJ.P. Characteristics of human lipoproteins isolated by selected-affinity immunosorption of apolipoprotein A-I. Proc Natl Acad Sci USA. Mar;8l(5):1356-60, 1984.

U) Miao C.H., Thompson A.R., Loeb K., and Ye X. Long-tenn and therapeutic-level hepatic gene expression of human factor IX after naked plasmid transfer in vivo. Mol Ther 3:947-957, 2001.

12) Molas M., Gomez-Valades A.G., Vidal-Alabro A., Miguel-Turu M., Bermudez J., Bartrons R., PeraIes,J.C. Receptor-mediated gene transfer vectors:progress toward genetic pharmaceuticals. Curr. Gene Ther., 3, 468^185, 2003.

13) Nagy A., Schally A.V. Targeting of cytotoxic luteinizing hormone-releasing hormone analogs to breast, ovarian, endometrial, and prostate cancers. 2006. Biol. Reprod. 73:851-859

14) Schally A.V. Luteinizing hormone-releasing hormone analogs: their impact on the control of tumorigenesis Peptide (Elmsford) 20:1247-1262, 1999.

15) Schally AV, Srkalovic G, Szende B, Redding TW, Janaky T, Juhasz A, Korkut E, Cai RZ, Szepeshazi K, Radulovic S. Antitumor effects of analogs of LH-RH and somatostatin: experimental and clinical studies. J Steroid Biochem Mol Biol. 1990 Dec 20;37(6):1061-7, 1990.

16) Schmidt-Wolf G.D. and Schmidt-Wolf I.G. Non-viral and hybrid vectors in human gene therapy: an update Trends Mol. Med., 9, 67-72, 2003.

17) Temin H.M. Safety considerations in somatic gene therapy of human disease with retrovirus vectors. Hum Gene Ther 1:111 -123, 1990.

18) Widom R.L., Ladias J.A., Kouidou S., and Karathanasis S.K. Synergistic interactions between transcription factors control expression of the apolipoprotein AI gene in liver cells. Mol Cell Biol 11:677-687, 1991.

Подписано в печать 17.10.2012. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 9833b.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812)550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ефремов, Александр Михайлович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Генспсрапия

Доставка генов в клетки млекопитающих

Сононорацин

Электропорация

Кальций-фосфашан 1 рансформация

Липофскция: катионные лиииды и липосомы

Рекомбиианшые вирусы

Катионные пептиды: средства доставки НК и основа для молекулярных конъюгатов

Использование молекулярных коньюгатов как невирусных средств доставки ДНК

Люлиберин и его синтетические аналоги: лиганды для ¡молекулярных конъюгатов

Лиганды трансферринового рецептора: лиганды для молекулярных конъюгатов

Перенос ДНК методом гидродинамических внутривенных инъекций

Пренатальная генотерапия

Стратегия «суицидальной» генотерапии опухолей

Аполипопротеин А1 человека

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Трансформация бактериальных клеток, накопление и очистка плазмид.

Делеция участков плазмидной ДНК с помощью ПЦР

Формирование комплексов ДНК с катионными пептидами

Трансфекция клеточных культур

Активность перенесенного гена бактериальной р-галактозидазы в лизатах

Измерении активное! и люциферазы it лнза гах

Конфокальная флюоресцентная микроскопия

Внутривенные шп.екщш плазмндной ДНК в хвостовую вену мышей

Измерении а кч и it и пеги люциферазы п лнзагах органон ммшей

Перенос комплексов плазмндной ДНК с молекулярными коныогатами NLS-TSF7 в поверхностные ткани мышей

Определение п сыворотке крови мышей человеческого белка ano Al

Анализ экспрессии перенесенного гена IGF

Гистологическое исследование бпошаюв

Выделение нпзкомолскулярной ядерной ДНК из тканей животного

ПЦР-анализ

Статистическая обработка полученных результатов

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ.

Лизин-богатый пептид К8. Формирование комплексов с ДНК in vitro

Использование пей гида К8 как средства доставки ДНК в клстки млекопшающих.

Комплексы ДНК\К8 зндоцнтоз-опосредованпо проникают в клетки млекопитающих

Стрешанндпн стимулирует проникновение комплексов ДНК\К8 in vitro

Комплексы ДНК\К8 понижают эффективность трансформации при гидродинамических инъекциях и не способны переносить ген in vitro

Молекулярные конъюганл. Выбор Kanioinioi о постели.

Полученные молекулярные коныогаты проникают в клетки млекопитающих путем рецептор-опосредованного эидоцш оза

Комплексы ДНК с молекулярными коныогатами способны трансформировать клетки HepG2, но не фпбробласты.

Молекулярные коныогаты на основе аналогов люлпберина в .модели суицидной ienoiepannii in vitro способны эффективно уничтожать опухолевые клетки.

В отличие от комплексов ДНКМЧЬБ-ЬНКН, комплексы ДНКУЧик1 способны к переносу in vivo

Гидродинамические инъекции плазмндной ДНК в хвостовую вену беременных самок приводят к переносу рспортерного гена в i капп зародыша.

При гидродинамических инъекциях комплексы ДНЮЛтик1 пе влияют па эффективность переноса, но повышают вероятность попадания нлазмндион ДНК в ткани зародыша

Молекулярный конъюгат NLS-TSF-7 повышает эффективность переноса рспортерного гена in vivo

Перенос гена инсулиноподобного фактора роста 1 с помощью конъюгата ГЧЬБ-Т5Р-7 в поврежденные поверхностные ткани мышей ускоряет заживление ран

Дслсционный вариант геномного Ano Al способен поддерживать продолжительную экспрессию перенесенного гена

5'-ре1уляторная область гена Ano Al не способна поддерживать до.п овременную экспрессию сцепленного с ними гена люциферазы.

Деления третьего интрона не влияет на продолжительность экспрессии однако деления вюрого интрона приводит к подавлению долговременной экспрессии перенесенного гена ano Al

ОБСУЖДЕНИЕ

Пептид К8 не подходит в качестве катионной части для молекулярных конъюгатов

Катионный носитель и лигандная часть для молекулярных конъюгатов

Применение молекулярных конъюгатов для доставки in vivo 99 Продолжительность экспрессии перенесенного мышам человеческого гена ano Al зависит от второго интрона

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Перенос генов в клетки млекопитающих с помощью молекулярных конъюгатов: разработка носителей и оптимизация генетических конструкций"

Актуальность проблемы. Генотерапня - перенос генов в соматические клетки организма в целях лечения заболевании. Ключевым моментом, определяющим эффективность лечения, является выбор способа переноса ДНК в клетки-мишени. Максимальная эффективность переноса обеспечивается вирусными векторами, однако данный подход имеет существенные ограничения (Gerard R.D., Chan L., 1996). Невирусные методы переноса ДНК лишены ряда принципиальных недостатков, присущих вирусным средствам (побочные эффекты, высокая нммуногенность и токсичность), и могут быть использованы многократно (SchmidtWolf G.D. et al., 2003). Наиболее перспективными среди невирусных носителей ДНК являются молекулярные конъюгаты - катионные носители для конденсации ДНК за счет электростатических взаимодействий с последующим введением полиэлектролитных комплексов ДНК/носнтель в клетки млекопитающих (Molas М. et al., 2003). Однако для невпрусных способов доставки чужеродной ДНК также существует ряд ограничений. Комплексы ДНК/катионный пептид, как правило, проникают в клетки за счет адсорбционного эндоцитоза, что снижает адресность доставки (Ignatovich I.A. et al., 2003). Кроме того, эффективность трансфекции будет зависеть от размера образующихся комплексов и способности этих комплексов попадать в цитоплазму из эндосом (Molas М. et al., 2003). В этой связи представляется актуальным разработка пептидных катионных носителей, взаимодействующих с ДНК за счет электростатических сил и способных переносить эту ДНК в клетки путем специфического, рецептор-опосредованного эндоцитоза. Кроме этого, необходимо адаптировать подобранные in vitro молекулярные конъюгаты (комплексы ДНК/катионный пептид) к условиям in vivo. Взаимодействие таких комплексов с белками плазмы крови (прежде всего с сывороточным альбумином) может привести к частичной, или даже полной инактивации комплексов н существенно ограничивает возможности системного применения комплексов ДНК с молекулярными конъюгатами в целях генотерапии, или экспериментального исследования экзогенных генетических конструкций (Ignatovich I.A. et al., 2003).

Вторым по значимости фактором (после средств доставки), влияющим на специфичность и эффективность генотерапии, является создание специфичных генетических конструкций, обеспечивающих экспрессию перенесенных в клетки чужеродных генов. Помимо использования тканеспецнфических и индуцибельных промоторов, важную роль в обеспечении продолжительной и интенсивной экспрессии перенесенного гена играет его экзон-интронная структура. Механизмы влияния интронов на продолжительность экспрессии экзогенных генов изучены недостаточно (Miao С.Н. et al., 2001).

Для достижения цели были поставлены следующие задачи исследования:

3. Определить генетические факторы, влияющие на продолжительность экспрессии гена аполипопротеина Al человека после доставки его в составе невирусного вектора экспрессии в печень или в другие клетки млекопитающих.

Научная новизна работы. Впервые созданы молекулярные конъюгаты на основе синтетических пептидных катионов и лигандов люлибериновых и трансферрннового рецепторов, способные попадать в клетки рецептор-опосредованым эндоцитозом. Впервые получена работающая модель для направленного переноса генетических конструкций через рецептор к трансферрину в поверхностные ткани млекопитающих in vivo. Показана возможность переноса генетических конструкций в ткани зародыша мыши при гидродинамических инъекциях в организм матери. Продемонстрировано значение экзон-интронной структуры гена аполипопротеина Al человека в поддержании долговременной экспрессии этого гена после его переноса мышам методом гидродинамических инъекций.

Основные положения, выноснмыс на защиту:

1. Разработанный поликатион NLS способен связывать плазмидную ДНК, однако комплексы ДНК/NLS не способны ктрансфекцин in vitro.

2. Созданы молекулярные конъюгаты NLS-LHRH, NLS-TSF7 п NLS-TSF12, способные доставлять плазмидную ДНК посредством рецептор-опосредованного эндоцптоза в клетки, экспрессирующие значительные количества рецепторов люлиберина (конъюгат NLS-LHRH) и трансферрина (конъюгаты NLS-TSF7, NLS-TSF12).

3. Комплексы ДНК с пептидом NLS-TSF7 способны к эффективному переносу в поверхностные ткани мышей. В модели заживления ран NLS-TSF7 обеспечивает перенос гена ннсулиноподобного ростового фактора IGFls и ускоряет процесс восстановления.

4. На продолжительность экспрессии экзогенного гена аполипопротеина А1 человека в печени мышей влияют участки второго нитрона гена, а не его 5'- и З'-регуляторные области.

Личный вклад автора в исследования. Соискателем были проведены: анализ литературы по теме исследования, планирование экспериментов, получение основной части результатов, работа над статьями и подготовка докладов на конференциях. Подбор отношений зарядов ДНК\пептид, исследование полученных комплексов к устойчивости к действию ДНКаз, титрование гепарином, подготовка комплексов ДНК\пептид для трансфекции, работа с животными, гидродинамические инъекции, отбор биоматериала, определение активности люциферазы в лизатах культур клеток и тканей животных, ПЦР в н.м.я. ДНК, генетическое конструирование, ИФА и гистологические исследования были выполнены соискателем. Все катионные пептиды синтезированы C.B. Буровым. Опыты с пептидом К8 и конфокальная микроскопия были проведены совместно с Игнатович И.А в Институте Цитологии РАН. Культивирование и трансформация культур эукарнотических клеток проводились совместно с Э.Б. Диже и И.А. Игнатович. Эксперименты по проточной цитофлюометрии выполнены совместно с C.B. Орловым и И.В. Кудрявцевым. Опыты по переносу комплексов гена IGF1YNLS-TSF7 в поверхностные ткани млекопитающих проводились совместно с Духовлиновым И.В.

Внедрение результатов работы. Полученные данные могут послужить основой для разработки систем генотерапии ран. Научные результаты и практические рекомендации могут быть внедрены в научный и учебный процесс кафедры Цитологии и гистологии и кафедры Эмбриологии биолого-почвенного факультета СПбГУ.

Объем и структура диссертации. Диссертация содержит разделы «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Диссертация представлена на 133 страницах, содержит 33 рисунка и 2 таблицы. В «Списке цитируемой литературы» 230 источников, из них 14 на русском языке и 216 на английском.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Ефремов, Александр Михайлович

выводы

1. Катионный пептид NLS, несмотря на формирование комплексов с ДНК, не способен доставлять ДНК в клетки человека in vitro но является перспективным носителем ДНК при разработке на его основе активных молекулярных коиъюгатов.

2. Молекулярные конъюгаты на основе аналогов люлиберина (NLS-LHRH и Nukl) и трансферрина (NLS-TSF7) способны к переносу плазмидной ДНК в культивируемые клетки человека рецептор-опосредованным эндоцитозом.

3. в модели «суицидной» геиотерапии опухолей in vitro конъюгаты NLS-LHRH и Nukl оказались эффективным средством направленного переноса гена тимидинкиназы герпесвируса.

4. Локальный перенос комплексов пептида NLS-TSF7 с плазмидным вектором экспрессии инсулиноподобного фактора роста 1 в повреждённые поверхностные ткани мышей ускоряет заживление ран.

5. Продолжительная, не менее двух недель, экспрессия гена аполипопротеина А1 человека после гидродинамического переноса в печень мышей обеспечивается вторым интроном гена.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Яблокова Т. В., Челушкин П. С., Дорош М. Ю., Ефремов А. М., Орлов С. В., Буров С. В. Синтез аналогов люлибернна и их использование в системах адресной доставки генов, Биоорганическая химия, 2012, 38(1), 31-39.

2) Ефремов А. М., Духовлинов И. В., Диже Э. Б., Буров С. В., М. В. Леко М. В., Акифьев Б. Н., Могиленко Д. А., Иванов И. А., Перевозчиков А. П., Орлов С. В. 2010 Невирусная регенеративная генотерапия повреждении кожных покровов млекопитающих // Цитология, Т. 52, № 5, С. 371-379.

3) Ефремов А. М., Буглаева А. О., Орлов С. В., Буров С. В., Игнатович И. А., Диже Э. Б., Шавва В. С., Перевозчиков А. П. 2010 Перенос генетических конструкций через трансплацентарный барьер в зародыши мыши // Онтогенез, Т. 41, №2, С. 94-100.

4) Буров С. В., Яблокова Т. В., Дорош М. Ю., Кривизюк Е. В., Ефремов А. М., Орлов С. В. 2010 Аналоги люлпберина, содержащие последовательность ядерной локализации Т-антигена вируса SV-40 // Биоорганическая химия, Т. 36, № 5, С. 630-637.

5) Диже Э. Б., Игнатович И. А., Буров С. В., Похвощева А. В., Акифьев Б.Н., Ефремов А. М., Перевозчиков А. П., Орлов С. В. 2006 Комплексы ДНК с катионнымн пептидами: условия формирования и факторы, влияющие на их проникновение в клетки млекопитающих // Биохимия, Т. 71, №. 12, С. 16591667.

6) Акифьев Б. Н., Диже Э. Б., Ефремов A. ¡VI., Могиленко Д. А., Олейникова Г.Н., Лапиков И. А., Жданова О. А., Кпдготко О. В., Орлов С. В., Перевозчиков А. П. 2004 Перенос гена человеческого аполипопротеина A-I мышам методом гидродинамических инъекции: факторы, влияющие на эффективность и продолжительность экспрессии гена в печени животного //Молекулярная биология, Т. 38, С. 1076-1084.

7) Ефремов A.M., Акифьев Б.Н., Диже Э.Б., Могиленко Д.А., Олейникова Г.Н., Лапиков И.А., Жданова О.Ю., Орлов C.B., Перевозчиков А.П. 2005 Влияние структуры гена Аполипопротеина A-I человека на его экспрессию после переноса мышам методом гидродинамических инъекций // Медицинская Иммунология, тезисы IX Конференции «Дни Иммунологии в Санкт-Петербурге», Т. 7, №2-3

8) Ефремов A.M., Акифьев Б.Н., Днже Э.Б., Могиленко Д.А., Олейникова Г.Н., Лапиков И.А., Жданова О.Ю., Орлов C.B., Перевозчиков А.П. 2005 Экспрессия гена Аполипопротенна A-I человека после его переноса мышам методом гидродинамических инъекций // Онтогенез, тезисы докладов XIV школы «Биология развития», Т. 36 №5

9) Орлов C.B., Диже Э.Б., Игнатович И.А., Буров C.B., Яблоква Т.В. Ефремов A.M., Акифьеф Б.Н., Перевозчиков А.П., 2008 «Суицидная генотерапия гормон-чувствительных опухолей человека: разработка невирусной системы направленного переноса гена тимидинкиназы вируса простого герпеса первого типа на основе аналогов люлиберинов»// Сборник трудов конференции ««Живые системы» в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы»

10) Иванов И.А., Духовлинов И.В., Буров C.B., Ефремов A.M., Акифьеф Б.Н., Диже Э.Б., Могиленко Д.А., Перевозчиков А.П.,Орлов C.B. 2010 «Система невирусной регенеративной генотерапии поверхностных повреждений тканей человека»// Сборник трудов конференции ««Живые системы» в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы»

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ефремов, Александр Михайлович, Санкт-Петербург

1. Браун, Э. М. К., М. Р. Д. Скотт. 1989. Ретровирусные векторы, в книге Новое в клонировании ДНК. Методы, под ред. Д. Гловер, Мир, Москва. С. 272-307.

2. Горбунова В. Н., Баранов В. С., 1997. «Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний». Спб., «Специальная Литература», 287 с

3. Горман К. 1988. Высокоэффективный перенос генов в клетки млекопитающих, в книге Клонирование ДНК. Методы под ред. К. Гловер, Мир, Москва С. 409-463.

4. Ефремов A. M., Буглаева А. О., Орлов C.B., Буров С. В., Игнатович И. А., Диже Э. Б., Шавва В. С., Перевозчиков А. П. 2009. Перенос генетических конструкций через трансплацентарный барьер в зародыши мыши. Онтогенез 40.

5. Игнатович И. А., Диже Э. Б, Акифьев Б. Н., Буров С. В., Боярчук Е. А., Перевозчиков А. П. 2002. Доставка «суицидного» гена тимидинкиназы вируса герпеса в комплексе с катнонным пептидом в клетки гепатомы человека in vitro. Цитология 44:455-462.

6. Игнатьева Е. В., Меркулова Е. И., Вишневский О. В., Кель А. Е. 1997. Регуляция транскрипции генов лнпидного метаболизма: описание в базе данных TRRD. Молекулярная биология 31:684-700.

7. Климов А. Н., Никульчева Н. Г. 1995. Липиды, липопротеиды и атеросклероз. Питер Пресс, СПб.

8. Климов А. Н., Никульчева Н. Г. 1999. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. Питер, СПб.

9. Лапиков И.А., Могнленко Д.А., Диже Э.Б., Игнатович И.А., Орлов С.В., Перевозчиков А.П. API-подобные цис-элементы в 5'-регуляторноп области гена аполипопротеина A-I человека. Молекулярная биология, Т. 42, №2, с. 295-305, 2008.

10. Маннатис Т., Фрнч Э., Сембрук Дж., 1984. Молекулярное клонирование. Методы генетической инженерии. Мир, Москва.

11. A.F Andrade-Rozentala, R Rozentala, M.G Hopperstada, J.K Wue, F.D Vrionise, D.C Spray. Gap junctions: the "kiss of death" and the "kiss of life". Brain Research Reviews Volume 32, Issue I, 24 March 2000, Pages 308-315

12. Abela R. A., Qian J., Xu L., Lawrence T. S., Zhang M. 2008. Radiation improves gene delivery by a novel transferrin-lipoplex nanoparticle selectively in cancer cells. Cancer Gene Ther., May 16.

13. Ahn С. H., Chae S. Y., Bae Y. H., Kim S. W. 2002. Biodegradable poly(ethylenimine) for plasmid DNA delivery. J. Controlled Release 80:273-82.

14. Akinc A, Thomas M, Klibanov AM, Langer R. Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis. J Gene Med. 2005 May;7(5):657-63.

15. AI-Dosari Mohammed S., Gao Xiang. Nonviral Gene Delivery: Principle, Limitations, and Recent Progress. The AAPS Journal. December 2009, Volume 11, Issue 4, pp 671-681

16. Ali S. A., Joao H. C., Hammerschmid F., Eder J., Steinkasserer A. 1999. Transferrin trojan horses as a rational approach for the biological delivery of therapeutic peptide domains. J. Biol. Chem., 274:24066-24073.

17. Andrianaivo F., Lecocq M., Wattiaux-De Coninck S., Wattiaux R., and Jadot M. 2004. Hydrodynamics-based transfection of the liver: entrance into hepatocytes of DNA that causes expression takes place very early after injection. J Gene Med 6:877-883.

18. Ansell BJ., Fonarovv GC., Navab M., Fogelman AM. 2007. Modifying the antiinflammatory effects of high-density lipoprotein. Curr. Atheroscler. Rep. 9(1):57-63.

19. Bacchetti S. and Graham F. L. Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA. 1977 Proc Natl Acad SciU S A. 1977 April; 74(4): 1590-1594.

20. Barabas K., Sizensky J. A., Faulk W. P. 1992. Transferrin conjugates ofadriamycin are cytotoxic without intercalating nuclear-DNA. J. Biol. Chem., 267:9437-9442.

21. Bartel i\IA, Weinstein JR, SchafTer DV. Directed evolution of novel adeno-associated viruses for therapeutic gene delivery. Gene Ther. 2012 Jun;19(6):694-700.

22. Berczi A., Barabas K., Sizensky J. A., Faulk W. P. 1993. Adriamycin conjugates of human transferrin bind transferrin receptors and kill K562 and HL-60-cells. Arch. Biochem. Biophys., 300:356-363.

23. Berczi A., Ruthner M., Sziits V., Fritzer M., Schweinzer E., Goldenberg H. 1993. Influence of conjugation of doxorubicin to transferrin on the iron uptake by K562-cells via receptor-mediated endocytosis, Eur. J. Biochem., 213:427-436.

24. Bielicki JK, Oda MN 2002 Apolipoprotein A-I(Milano) and apolipoprotein A-I(Paris) exhibit an antioxidant activity distinct from that of wild-type apolipoprotein A-I. Biochemistry. 41(6):2089-96.

25. Budker V, Zhang G, Danko I, Williams P, Wolff J. (1998). The efficient expression of intravascularly delivered DNA in rat muscle. Gene Ther 5: 272-276.

26. Budker V., Budker T., Zhang G., Subbotin V., Loomis A., and Wolff J. A.2000. Hypothesis: naked plasmid DNA is taken up by cells in vivo by a receptor-mediated process. J Gene Med 2:76-88.

27. Chan L. 1989. The apolipoprotein multigene family: stnicture, expression,evolution, and molecular genetics. Klin Wochenschr 67:225-237.

28. Chen H. Y., Zhu H. Z., Lu B., Xu X., Yao J. H., Shen Q., and Xue J. L. 2004. Enhancement of naked FIX minigene expression by chloroquine in mice. Acta Pharmacol Sin 25:570-575.

29. Chen Z Y., He C Y Meuse L., Kay M A. Silencing of episomal transgene expression by plasmid bacterial DNA elements in vivo. 2004. Gene Therapy (2004) 11, 856-864.

30. Chiesa G, Sirtori CR. 2003 Recombinant apolipoprotein A-I(Milano): a novel agent for the induction of regression of atherosclerotic plaques. Ann Med. 35(4):267-73.

31. Cho YW, Kim JD, Park K. Polycation gene delivery systems: escape from endosomes to cytosol. J Pharm Pharmacol. 2003 Jun;55(6):721-34.

32. Christopher L. Grigsby, Kam W. Leong Balancing protection and release of DNA: tools to address a bottleneck of non-viral gene delivery. J R Soc Interface. 2010 February 6; 7(Suppll): S67-S82.

33. CoutelIe C. Wnddington SN. The concept of prenatal gene therapy. (2012) Methods MolBiol. 891:1-7.

34. Crespo A., Peydro A., Dasi F., et al. 2005. Hydrodynamic liver gene transfer mechanism involves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocytic vesicles. Gene Ther.

35. Cristano R.J., Roth J.A. 1995. Molecular conjugates: a targeted gene delivery vector for molecular medicine. J.Mol.Med.73:479-486

36. Crook K., McLachlan G., Stevenson B. J., Porteous D. J. 1996. Plasmid DNA molecules complexed with cationic liposomes are protected from degradation by nucleases and shearing by aerosolisation, Gene Ther. 3:834- 839.

37. Culver K. W. 1994. Gene Therapy, Handbook for Phisicians. M.-A. Liebert Publ.

38. Dass CR. Lipoplex-mediated delivery of nucleic acids: factors affecting in vivo transfection. 2004. J Mol Med (Berl). 2004 Sep;82(9):579-91.

39. Davidson MH, Rosenson RS. 2009. Novel targets that affect high-density lipoprotein metabolism: the next frontier. Am J Cardiol. Nov 16;104(10 Suppl):52E-7E

40. Davies J. C. 2002. New therapeutic approaches for cystic fibrosis lung disease. J R Soc Med 95:58-67.

41. Davies M, Parry J. E., Sutclifle R.G. 1981. Examination of different preparations of human placental plasma membrane for the binding of insulin, transferrin and immunoglobulins. J. Reprod. Fertil. 63:315-324.

42. Dennis J. Yoon, Christina T. Liu, Devin S. Quinlan, Parsa M. Nafisi, and Daniel T. Kamei Intracellular Trafficking Considerations in the Development of Natural Ligand-Drug Molecular Conjugates for Cancer. Ann Biomed Eng. 2011 April; 39(4): 1235-1251.

43. Derek W. Bartlett and Mark E. Davis. 2007. Physicochemical and biological characterization of targeted, nucleic acid-containing nanoparticles. Bioconjug Chem. 18(2): 456^168.

44. Di N. M., Carlo-Stella C., Anichini A., Mortarini R., Guidetti A., Tragni G., Gallino F., Del V. M., Ravagnani F., Morelli D., Chaplin P., Arndtz N.,

45. Dinner S., Turk M., and Piscedilkin E. 2005. Intelligent polymers as nonviral vectors. Gene Therapy 12, S139-S145

46. Dornburg R. Reticuloendotheliosis viruses and derived vectors for human gene therapy. Front Biosci. 2003 May l;8:d801-17.

47. Douar AM, Adebakin S, Themis M, Pavirani A, Cook T, Coutelle C. Foetal gene delivery in mice by intra-amniotic administration of retroviral producer cells and adenovirus. Gene Therapy 1997, 4(9):883-890.

48. Endoh M., Koibuchi N., Sato M. Fetal Gene Transfer by Intrauterine Injection with Microbubble-Enhanced Ultrasound, Mol. Ther., 2002, vol. 5, pp. 501-508

49. Enns C. A., Suomalainen H. A., Gebhardt J. E., Schroder J., Sussman H. H. 1982. Human transferrin receptor: expression of the receptor is assigned to chromosome 3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 79:3241-3245.

50. Feigner P. L., Gadek T. R., Holm M., Roman R., Chan H. W., Wenz M., Northrop J. P., Ringold G. M., and Danielsen M. 1987. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci U S A 84:7413-7417.

51. Findeis Mark A., Nonviral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols (Methods in Molecular Medicine) 2001. Humana Press, 416 pages, 1 edition.

52. Fisher KJ, Wilson JM. The transmembrane domain of diphtheria toxin improves molecular conjugate genetransfer. Biochem J. 1997 Jan 1 ;321 ( Pt l):49-58.

53. Friedniann T. 1989. Progress toward human gene therapy. Science 244:1275

54. Friedmann T.; Roblin R., 1972. "Gene Therapy for Human Genetic Disease?". Science 175 (4025): 949-955.

55. Friedmann Theodore, Rossi John Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA, A Laboratory Manual, 2006, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1 st edition, 793 p.

56. Friend D. S., Papahadjopoulos D., and Debs R. J. 1996. Endocytosis and intracellular processing accompanying transfection mediated by cationic liposomes. Biochim Biophys Acta 1278:41-50

57. Gerard R.D., Chan L. Adenovirus-mediated gene transfer: strategies and applications in lipoprotein research. Curr Opin Lipidol. Apr;7(2):105-11, 1996.

58. Gewirtz A. M., Stein C. A., and Glazer P. M. 1996. Facilitating oligonucleotide delivery: helping antisense deliver on its promise. Proc Natl Acad Sci U S A 93:3161-3163.

59. Ghanvan H, Wightnian L, Kircheis R, Wagner E., Zatloukal K. Nonviral gene transfer into fetal mouse livers (a comparison between the cationic polymer PEI and naked DNA). Gene Therapy (2003) 10, 810-817.

60. Glasspool-Malone J., Steenland P. R., McDonald R. J., Sanchez R. A., Watts T. L., Zabner J., and Malone R. W. 2002. DNA transfection of macaque and murine respiratory tissue is greatly enhanced by use of a nuclease inhibitor. J Gene Med 4:323-322.

61. Goncalves M. A., van der Velde I., Knaan-Shanzer S., Valerio D., and de Vries V. A. 2004. Stable transduction of large DNA by high-capacity adeno-associated virus/adenovirus hybrid vectors. Virology 321:287-296.

62. Gottschalk S., Sparrow J. T., Hauer J., Mims M. P., Leland F. E., Woo S. L., and Smith L. C. 1996. A novel DNA-peptide complex for efficient gene transfer and expression in mammalian cells. Gene Ther 3:448-457.

63. Griesenbach U., Ferrari S., Geddes D. JVL, and Alton E. W. 2002. Gene therapy progress and prospects: cystic fibrosis. Gene Ther 9:1344-1350.

64. Guo Z. S. and Bartlett D. L. 2004. Vaccinia as a vector for gene delivery. Expert1. Opin Biol Ther 4:901-917.

65. Gust Tatjana C. and Zenke Martin, Receptor-Mediated Gene Delivery 2002. TheScientificWorldJOURNAL Volume 2 (2002), Pages 224-229.

66. Hackett CS, Geurts AM, Hackett PB. Predicting preferential DNA vector insertion sites: implications for functional genomics and gene therapy. Genome Biol. 2007;8 SuppI 1 : S12.

67. Haddad I. A., Ordovas J. M., Fitzpatrick T., and Karathanasis S. K. 1986. Linkage, evolution, and expression of the rat apolipoprotein Àl, C-III, and À1V genes. J Biol Chem 261:13268-13277.

68. Hatzoglou M, Lamers W, Bosch F, Wynshaw-Boris A, Clapp DW, Hanson RW.

69. Hepatic gene transfer in animals using retroviruses containing the promoter from the gene for phosphoenolpyruvate carboxykinase. J Biol Chem. 1990 Oct 5;265(28): 17285-93.

70. Henveijer H., Zhang G., Subbotin V. M., Budker V., Williams P., and Wolff

71. J. A. 2001. Time course of gene expression after plasmid DNA gene transfer to the liver. J Gene Med 3:280-291.

72. Higuchi K., Law S. \\., Hoeg J. M., Schumacher U. K., Meglin N., and Brewer H. B. 1988. Tissue-specific expression of apolipoprotein Al (ApîAl) is regulated by the 5'-flanking region of the human AïîAl gene. J Biol Chem 263:18530-18536.

73. Hirko A., Tang F., and Hughes J. A. 2003. Cationic lipid vectors for plasmid DNA delivery. Curr Med Chem 10:1185-1193.

74. Huang S., Kamihira M. Development of hybrid viral vectors for gene therapy. Biotechnol Adv. 2012 Oct 13.

75. Hui S. W., Langner M., Zhao Y. L., Ross P., Hurley E., Chan K. 1996. The role of helper lipids in cationic liposome-mediated gene transfer. Biophys. J. 71:590-599.

76. Hye Yeong Nam, Jaesung Kim, Soojin Kim, James W. Yockman, Sung Wan Kim, David A. Bullc. Cell Penetrating Peptide Conjugated Bioreducible Polymer for siRNA Delivery. Biomaterials. 2011 August; 32(22): 5213-5222.

77. Ishida T, Li W, Liu Z, Kiwada H 2006 Stimulatory effect of polyethylene glycol (PEG) on gene expression in mouse liver following hydrodynamics-based transfection. J Gene Med. 8(3):324-34.

78. Jennifer E Ziello, Yan Huang, Ion S Jovin. Cellular Endocytosis and Gene

79. Delivery. Mo I Med. 2010 May-Jun; 16(5-6): 222-229.

80. Jonathan D Smith. Apolipoprotein A-I and its mimetics for the treatment of atherosclerosis. Curr Opin Investig Dnigs. 2010 September; 11(9): 989-996.

81. Jones A. R. and Shusta E. V. 2007. Blood-Brain Barrier Transport of Therapeutics via Receptor-Mediation. Pharmaceutical Research, 24(9): 1759-1771.

82. Jun Gao, Yusheng Wei, Yue Huang, et al. 2005. The expression of intact and mutant Human auAI/AIV/CIII/AV gene cluster in transgenic mice. J Biol Chem 280:12559-12566

83. Jun Li, Yun-Ching Chen, Yu-Cheng Tseng, Leaf Huang. Biodegradable Calcium

84. Phosphate Nanoparticle with Lipid Coating for Systemic siRNA Delivery. J Control Release. 2010 March 19; 142(3): 416^121.

85. Kadlecova Z, Baldi L, Hacker D, Wurm FM, Klok HA. Comparative study on the in vitro cytotoxicity of linear, dendritic, and hyperbranched polylysine analogues. Biomacromolecules. 2012 Oct 8;13(10):3127-37.

86. Kaushik Singha, Ran Namgung, and Won Jong. 2011. Polymers in Small-Interfering RNA Delivery. Nucleic Acid Ther. 21(3): 133-147.

87. Kawano H, Nishikawa M, Mitsui M, Takahashi Y, Kako K, Yamaoka K, Watanabe Y, Takakura Y. 2007 Improved anti-cancer effect of interferon genetransfer by sustained expression using CpG-reduced plasmid DNA. Int J Cancer. 121(2):401-6.

88. Kichler A., Leborgne C., Coeytaux E., Danos O. 2001. Polyethylenimine mediated gene delivery: a mechanistic study, J. Gene Med. 3(2): 135-44

89. Kost T. A. 1999. Expression vectors and delivery systems: Tools for determining gene function and gene therapy. Cur. Opin. Biotech. 10:409-410.

90. Kwakye-Berko F. and Meshnick S. R. 1989. Binding of chloroquine to DNA. Mol Biochem Parasitol 35:51-55.

91. Ladage D, Ishikawa K, Tilemann L, Miiller-Ehmsen J, Kawase Y. Percutaneous methods of vector delivery in preclinical models. Gene Ther. 2012 Jun;19(6):637-41.

92. Laing Susan T., Kim Hyunggun, Kopechek Jonathan A., Parikh Devang, Huang Shaoling, Klegerman Melvin E., Holland Christy K., McPherson David

93. D. Ultrasound-mediated delivery of echogenic immunoliposomes to porcine vascular smooth muscle cells in vivo 2011. J Liposome Res. 2010 June; 20(2): 160167.

94. Lala Shangara, Lauerb Ulrich M., Niethanimera Dietrich, James F. Beckc, Paul G. Schlege. Suicide genes: past, present and future perspectives. Immunology Today Volume 21, Issue 1, 1 January 2000, Pages 48-54

95. Lebherz C, Sanmiguel J, Wilson JM, Rader DJ. 2007 Gene transfer of wild-type apoA-I and apoA-I Milano reduce atherosclerosis to a similar extent. Cardiovasc Diabetol. 6:15.

96. Lecocq M., Andrianaivo F., Warnier M. T., Wattiaux-De Coninck S., Wattiaux R., and Jadot M. 2003. Uptake by mouse liver and intracellular fate of plasmid DNA after a rapid tail vein injection of a small or a large volume. J Gene1. Med 5:142-156.

97. Lee J. H., Engler J. A., Collawn J. F., Moore B. A. 2001. Receptor mediated uptake of peptides that bind the human transferring receptor. Eur. J. Biochem., 268:2004-2012.

98. Li Shulin. Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro. 2004. Current Gene Therapy, Volume 4, Number 3, September 2004 , pp. 309-316(8)

99. Liu F., Song Y., and Liu D. 1999. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther 6:1258-1266.

100. Liu G., Molas M., Grossmann G. A., Pasuniarthy M., Perales J. C., Cooper M. J., Hanson R. W. Biological properties of poly-L-lysine-DNA complexes generated by cooperative binding of the polycation. 2001. J. Biol. Chem. 276:34379-34387.

101. Lukacs G. L., Haggie P., Seksek O., Lechardeur D., Freedman N., and Verkman A. S. 2000. Size-dependent DNA mobility in cytoplasm and nucleus. J Biol Chem 275:1625-1629

102. Luoma PV. 2009. Gene-activators prevent and regress atherosclerosis and reduce mortality. Cardiovasc Hematol Agents Med Chem. 7(4):295-304.

103. Luong L. N., McFalls K. M., Kohn D. H. Gene Delivery via DNA Incorporation Within a Biomimetic Apatite Coating. Biomaterials. 2009 December; 30(36): 69967004.

104. Lynch J, Behan N, Birkinshaw C. Factors controlling particle size during nebulization of DNA-polycation complexes. J Aerosol Med. 2007 Fall;20(3):257-68.

105. Ma B, Zhang S, Jiang H, Zhao B, Lv H. Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery. J Control Release. 2007 Nov 20; 123(3): 184-94.

106. IVIaja T. Tomicic, Claudia Friedrichs, Markus Christmann, Peter Wutzler, Rudolf Thust and Bernd Kaina. Apoptosis Induced by (E)-5-(2-Bromovinyl)-2-deoxyuridine in Varicella Zoster Vims Thymidine Kinase-Expressing Cells Is

107. Driven by Activation of c-Jun/Activator Protein-1 and Fas Ligand/Caspase-8. Molecular Pharmacology Febmary 1, 2003 vol. 63 no. 2 439-449

108. Matthew H Porteus, Jon P Connelly, Shondra M Pruett. A Look to Future Directions in Gene Therapy Research for Monogenic Diseases. PLoS Genet. 2006 September; 2(9): el33.

109. McArdle HJ, Andersen HS, Jones H, Gambling L. 2008. Copper and iron transport across the placenta: regulation and interactions. J Neuroendocrinol. Apr;20(4):427-31.

110. McVicar JP, Kunitake ST, Hamilton RL, Kane JP. Characteristics of human lipoproteins isolated by selected-affinity immunosorption of apolipoprotein A-I. Proc Natl Acad Sci USA. 1984 Mar;81(5): 1356-60.

111. Meyer M, Zintchenko A, Ogris M, Wagner E., A dimethylmaleic acid-melittin-polylysine conjugate with reduced toxicity, pH-triggered endosomolytic activity and enhanced gene transfer potential. J Gene Med. 2007 Sep;9(9):797-805.

112. Miao C. H., Thompson A. R., Loeb K., and Ye X. 2001. Long-term and therapeutic-level hepatic gene expression of human factor IX after naked plasmid transfer in vivo. Mol Ther 3:947-957.

113. Millar R. P. 2005 GnRHs and GnRH receptors. Animal Reproduction Science 88:5-28.

114. Miller A. D. 2003. The problem with cationic liposome/micelle-based non-viral vector systems for gene therapy. Curr Med Chem 10:1195-1211.

115. Minal Garg., MicroRNAs, stem cells and cancer stem cells. World J Stem Cells., 2012 July 26; 4(7): 62-70.

116. Mirzayans R, Andrais B, Scott A, Murray D., 2012, New insights into p53 signaling and cancer cell response to DNA damage: implications for cancer therapy.

117. J Biomed Biot echnol. 2012:170325.

118. Molas iM., Gomez-Valades A.G., Vidal-AIabro A.,MigueI-Turu M., Bermudez J., Bartrons R., and Perales J.C. Receptor-mediated gene transfer vectors: progress towards genetic pharmaceuticals. (2003) Curr. Gene Ther., 3, 468-485.

119. NagyA., SchallyA. V. 2006 Targeting of cytotoxic luteinizing hormone-releasing hormone analogs to breast, ovarian, endometrial, and prostate cancers. Biol. Reprod. 73:851-859

120. Nakanishi M. 2003. New strategy in gene transfection by cationic transfection lipids with a cationic cholesterol. Curr Med Chem 10:1289-1296

121. Navab M., Anantharamaiah GM., Reddy ST., Fogelman AM. 2006. Apolipoprotein A-I mimetic peptides and their role in atherosclerosis prevention. Nat. Clin. Pract. Cardiovasc Med. 3(10):540-7.

122. Negishi Y., Tsunoda Y., Endo-Takahashi Y., Oda Y., Suzuki R., Maruyama K., Yamamoto M., Aramaki Y., Local Gene Delivery System by Bubble Liposomes and Ultrasound Exposure into Joint Synovium. 2011. J Drug Deliv. 2011; 2011: 203986.

123. Newman C. M. H. and Bettinger T. Gene therapy progress and prospects: Ultrasound for gene transfer. 2007. Gene Therapy (2007) 14, 465-475.

124. Nott A., Meislin S. H., and Moore M. J. 2003. A quantitative analysis of introneffects on mammalian gene expression. RNA 9:607-617.

125. Ogris M., Brunner S., SchuIIer S., Kircheis R. and Wagner E. 1999. PEGylated DNA/transferrin-PEI complexes: reduced interaction with blood components, extended circulation in blood and potential for systemic gene delivery. Gene Ther. 6:595-605.

126. Ogura T. 2002 In vivo electroporation: a new frontier for gene delivery and embryology. Differentiation. 70(4-5): 163-71.

127. Oh S, Kim BJ, Singh NP, Lai H, Sasaki T. 2009. Synthesis and anti-cancer activity of covalent conjugates of artemisinin and a transferrin-receptor targeting peptide. Cancer Lett. 274(l):33-9.

128. Oupicky D., Ogris M., Howard K. A., Dash P. R., Ulbrich K., Seymour L. W. 2002. Importance of lateral and steric stabilization of polyelectrolyte gene delivery vectors for extended systemic circulation. Mol. Ther. 5:463-472.

129. Pati D, Habibi H. R. 1995. Inhibition of human hepatocarcinoma cell proliferation by mammalian and fish gonadotropin-releasing hormones. Endocrinology. 136(l):75-84.

130. Pearson Sue, Jia Hepeng, Kandachi Keiko., China approves first gene therapy. 2004. Nature Biotechnology 22, 3 —4

131. Penacho N., Filipe A., Simoes S., Pedroso de Lima M. C. 2008. Transferrin-associated lipoplexes as gene delivery systems: relevance of mode of preparation and biophysical properties. J. Membr. Biol., 221(3): 141-152.

132. Ponka P. and Lok C. N. 1999. The transferrin receptor: role in health and disease. Int. J. Biochem. Cell Biol., 31:1111-1137.

133. Qasim W, Vink CA, Thrasher AJ. Hybrid lentiviral vectors. Mol Ther. 2010 Jul; 18(7): 1263-7.

134. Ramsay E., Gumbleton M. 2002. Polylysine and polyornithine gene transfercomplexes: a study of complex stability and cellular uptake as a basis for their differential in-vitro transfection efficiency. J. Drug Target. 10:1-9.

135. Richard N. Cohen, Marieke A.E.M., van der Aa, Nichole Macaraeg, Ai Ping Lee, Francis C. Szoka, Jr. Quantification of Plasmid DNA Copies in the Nucleus after Lipoplex and Polyplex Transfection. J Control Release. 2009 April 17; 135(2): 166-174.

136. Richters J., Grulich A. E., Rissel C. E. 2003. Sex in Australia: autoerotic, esoteric and other sexual practices engaged in by a representative sample of adults. Australian and New Zeland journal of public health 27:180-190

137. Rohrer L., Hersberger M., von Eckardstein A. 2004. High density lipoproteins in the intersection of diabetes mellitus, inflammation and cardiovascular disease. Curr. Opin. Lipidol. 15(3):269-78.

138. Ropert C. 1999. Liposomes as a gene delivery system. Braz. J. Med. Biol. Res. 32:163-169.

139. Rossmanith W., Chabicovsky M., Herkner K., and Schulte-Hermann R.2002. Cellular gene dose and kinetics of gene expression in mouse livers transfected by high-volume tail-vein injection of naked DNA. DNA Cell Biol 21:847-853.

140. Roy I., Stachowiak Michal K., Bergey Earl J., Non-viral gene transfection nanoparticles: Function and applications in brain. Nanomedicine. 2008 June; 4(2): 89-97.

141. Rudolph C., LausierJ., Naundorf S., Miiller R. H., Rosenecker J. 2000. In vivo gene delivery to the lung using polyethylenimine and fractured polyamidoamine dendrimers. Journal of Gene Medicine 2:269-278.

142. Sabine A. Eming, Thomas Krieg, Jeffrey M Davidson. Gene Therapy and Wound Healing. Clin Dermatol. 2007; 25(1): 79-92.

143. Schakowski F, Gorschliiter M, Buttgereit P, Marten A, Lilienfeld-Toal MV,

144. Junghans C, Schroff M, König-Merediz SA, Ziske C, Strelil J, Sauerbruch T, Wittig B, Schmidt-Wolf IG. 2007 Minimal size MIDGE vectors improve transgene expression in vivo. In Vivo 21(1): 17-23.

145. Schally A. V. 1999 Luteinizing hormone-releasing hormone analogs: their impact on the control of tumorigenesis Peptide (Elmsford) 20:1247-1262.

146. Scherman D., Bessodes M., Cameron B., Herscovici J., Hofland H., Pitard B., Soubrier F., Wils P., Crouzet J. 1998. Application of lipids and plasmid design for gene delivery to mammalian cells. Cur. Opin. Biotechnol. 9:480-485.

147. Schmidt-Wolf G.D. and Schmidt-Wolf I.G. Non-viral and hybrid vectors in human gene therapy: an update Trends Mol. Med., 9, 67-72, 2003.

148. SchwarzenbergerP., Huang W., Oliver P., Osidipe T., Theodossiou C., Kolls J. K. 2001. Poly-L-lysine-based molecular conjugate vectors: a high efficiency gene transfer system for human progenitor and leukemia cells. Am. J. Med. Sei., 321(2): 129-136.

149. Shegokar R, Al Shaal L, Mishra PR. 2011. SiRNA delivery: challenges and role of carrier systems. Pharmazie. 66(5):313-8.

150. Shepard JA, Wesson PJ, Wang CE, Stevans AC, Holland SJ, Shikanov A, Grzybowski BA, Shea LD. 2011. Gene therapy vectors with enhanced transfection based on hydrogels modified with affinity peptides. Biomaterials.32(22):5092-9.

151. Singh M. 1999. Transferrin as a targeting ligand for liposomes and anticancer drugs. Curr. Pharm. Des. 5: 443-451.

152. Sizensky J. A., Barabas K., Faulk W. P. 1992. Characterization of the anticancer activity of transferrin-adriamycin conjugates. Am. J. Reprod. Immunol., 27:163-166.

153. Sloots Arjen, Winfried S. Wels. Recombinant derivatives of the human high-mobility group protein HMGB2 mediate efficient nonviral gene delivery. 2005. FEBS Journal Volume 272, Issue 16, pages 4221-4236.

154. Sobolev A.S., Rosenkranz A.A., Smirnova O.A., NikitinV.A., Neugodova G.L., Naroditsky B.S., Shilov I.N.,Shatski I.N., and Ernst L.K. 133. Receptor-mediated transfection of murine and ovine mammary glands in vivo. (1998) J. Biol. Chem., 273,7928-7933.

155. Somiari S., GIasspooIMalone J., Drabick J. J., Gilbert R. A., Heller R., Jaroszeski M. J., and Malone R. W. 2000. Theory and in vivo application of electroporative gene delivery. Mol Ther 2:178-187.

156. Srinivasachari S, Liu Y, Zhang G, Prevette L, Reineke TM. 2006. Trehalose click polymers inhibit nanoparticle aggregation and promote pDNA delivery in serum. J Am Chem Soc. 2006 Jun 28; 128(25):8176-84

157. Strydom S., Van Jaarsveld P., Van Helden E., Ariatti M., Hawtrey A. 1993. Studies on the transfer of DNA into cells through use of avidin-polylysine conjugates complexed to biotinylated transferrin and DNA. J. Dnig Target., 1(2): 165-174.

158. Subramanian A., Ranganathan P., Diamond S. L. 1999. Nuclear targeting peptide scaffolds for lipofection of nondividing mammalian cells. Nat. Biotechnol. 17:873-877.

159. Sutla T., Suda K., Liu D. Computer-assisted Hydrodynamic Gene Delivery. Molecular Therapy (2008) 16 6, 1098-1104.

160. Suda Takeshi, Liu Dexi. Hydrodynamic Gene Delivery: Its Principles and Applications. Molecular Therapy (2007) 15 12, 2063-2069.

161. Sullivan Sean M., Connor Jerome, Huang Leaf. Immunoliposomes: Preparation, properties, and applications. Medicinal Research Reviews Volume 6, Issue 2, pages 171-195, April/June 1986

162. Suzuki R, Takizawa T, Negishi Y, Utoguchi N, Maruyama K. 2008. Effective gene delivery with novel liposomal bubbles and ultrasonic destmction technology. IntJPharm. 16;354(l-2):49-55.

163. Takei Y, Maruyama A, Ferdous A, Nishimura Y, Kawano S, Ikejima K, Okumura S, Asayama S, Nogawa M, Hashimoto M, Makino Y, Kinoshita M,

164. Watanabe S, Akaike T, Lemastcrs JJ, Sato N. 2004. Targeted gene delivery to sinusoidal endothelial cells: DNA nanoassociate bearing hyaluronan-glycocalyx. FASEB J. (6):699-701.

165. Taxman D. J., Lee E. S., Wojchowski D. M. 1993. Receptor-targeted transfection using stable maleimido-transferrin/thio-poly-L-lysine conjugates. Anal. Biochem., 213(1):97-103.

166. Thaci Bart, Ulasov Ilya V., Wainwright Derek A., Lesniak Maciej S. The Challenge for Gene Therapy: Innate Immune Response to Adenoviruses. Oncotarget. 2011 March; 2(3): 113-121.

167. Thorstensen K. and Romslo I. 1993. The transferrin receptor: its diagnostic value and its potential as therapeutic target., Scand. J. Clin. Lab Invest. 53:113-120.

168. Tiera MJ, Shi Q, Winnik FM, Fernandes JC., Polycation-based gene therapy: current knowledge and new perspectives. Curr Gene Ther. 2011 Aug;l 1(4):288-306.

169. Tristan R McKay, Ahad A Rahim, Suzanne M.K Buckley, Natalie J Ward, Jerry K.Y Chan, Steven J Howe, Simon N Waddington. Perinatal Gene Transfer to the Liver. Curr Pharm Des. 2011 August; 17(24): 2528-2541.

170. Tseng W-C, Su L-Y, Fang T-Y. 2012. pH responsive PEGylation through metal affinity for gene delivery mediated by histidine-grafted polyethylenimine. J Biomed Mater Res Part B 2012:00B:000-000

171. Vandenbrouck Y., Janvier B., Loriette C., Bereziat G., and MangeneyAndreani M. 1995. Thyroid hormone modulates apolipoprotein-AIgene expression at the post-transcriptional level in Hep G2 cells. Eur J Biochem 231:126-132.

172. Varga G, Bori E, Kallo K, Nagy K, Tarjan I, Racz GZ. Novel Possible Pharmaceutical Research Tools: Stem Cells, Gene Delivery and their Combination. 2012. Curr Pharm Des. 2012 Aug 23

173. Wagner E., Zenke M., Cotten M., Beug H., and Birnstiel M. L. 1990. Transferrin-polycation conjugates as carriers for DNA uptake into cells. Proc Natl Acad Sci U S A 87 :3410-3414.

174. Walther W. and Stein U. 2000. Viral vectors for gene transfer: a review of their use in the treatment of human diseases. Drugs 60:249-271.

175. Wells DJ. 2010. Electroporation and ultrasound enhanced non-viral gene delivery in vitro and in vivo. Cell Biol Toxicol. 26( 1 ):21-8.

176. Wiethoff C. M., Middaugh C. R. 2003. Barriers to nonviral gene delivery. J. Pharm. Sci. 92:203-217.

177. Wolfe D., Wechuck J. B., Krisky D. M., GoffJ. P., Goins W. F., Ozuer A., Epperly M. E., Greenberger J. S., Fink D. J., and Glorioso J. C. 2004. Delivery of herpes simplex vims-based vectors to stem cells. Methods Mol Biol 246:339-352.

178. Wolff J, Lewis DL, Herweijer H, Hegge J, Hagstrom J. 2005 Non-viral approaches for gene transfer. Acta Myol. 24(3):202-8.

179. Wolff J.A., Malone R.W., Williams P., Chong W., Acsadi G., Jani A., Feigner

180. P.L. (1990). Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science 247, 14651468

181. Woo Y. J., Raju G. Praveen, Swain Judith L., Richmond Marc E., Gardner Timothy J., Balice-Gordon Rita J. In Utero Cardiac Gene Transfer via1.traplacental Delivery of Recombinant Adenovirus. Circulation. 1997; 96: 35613569

182. Wu, C.H., Wilson, J.M., and Wu, G.Y. Targeting genes: delivery and persistent expression of a foreign gene driven by mammalian regulatory elements in vivo (1989) J. BioLChem., 264, 16985-16987.

183. Xing Yifei, Pua Eric C., Lu Xiaochun, Zhong Pei. Low-Amplitude Ultrasound Enhances Hydrodynamic-Based Gene Delivery to Rat Kidney. Biochem Biophys Res Commun. 2009 August 14; 386(1): 217-222.

184. Xu Y., Szoka F. C. Jr. 1996. Mechanism of DNA release from cationic liposome/DNA complexes used in cell transfection. Biochemistry 35:5616-5623.

185. Yanagihara K., Cheng H., Cheng P-W. 2000. Effects of epidermal growth factor, transferrin, insulin on lipofection efficiency in human lung carcinoma cells. Cancer Gene Ther. 7:59-65.

186. Yeh C. J. G.and Faulk W. P. 1984. Killing of human-tumor cells in culture with adriamycin conjugates of human transferrin. Clin. Immunol. Immunopathol.32:l-11.

187. Yessine M. -A., Leroux J. -C. 2004. Membrane-destabilizing polyanions: interaction with lipid bilayers and endosomal escape of biomacromolecules. Advanced Drug Delivery Rev. 56:999-1021.

188. Yoshizawa, J., Li, X.K., Fujino, M., Kiniura, H., Mizuno, R., Hara, A., Ashizuka, S., Kanai, M., Kuwashima, N., Kurobe, M. (2004). Successful in utero gene transfer using a gene gun in midgestational mouse fetuses. J Pediatr Surg 39, 81-84.

189. Young-Wook Wona, Kwang Suk Lima, Yong-Hee Kim. Intracellular organelle-targeted non-viral gene delivery systems. 2011. Journal of Controlled Release Volume 152, Issue 1, Pages 99-109

190. Yu X, Zhang Y, Chen C, Yao Q, Li M. 2010. Targeted drug delivery in pancreatic cancer. Biochim Biophys Acta. Jan;1805(l):97-104. Epub2009 Oct 22.

191. Yusuke Sato, Hiroto Hatakeyania, and Hideyoshi Harashima. 2010 Ornithine and Tryptophan Analogs as Efficient Polycations for Short Interference RNA

192. Delivery to Tumor Cells. Biol. Pharm. Bull. 33(7) 1246—1249

193. Zanta M. A., Boussif O., Adib A., Behr J. P. 1997. In vitro gene delivery to hepatocytes with galactosylated polyethylenimine, Bioconjug. Chem. 8:839-844.

194. Zelphati O., Uyechi L., Barron L. G., Szoka F. C. 1998. Effect of serum components on the physico-chemical properties of cationic lipid r oligonucleotide complexes and on their interactions with cells. Biochimica et Biophysica Acta 1390:119-133.

195. Zenke M, Steinlein P, Wagner E, Cotten M, Beug H, and M L Birnstiel. 1990. Receptor-mediated endocytosis of transferrin-polycation conjugates: an efficient way to introduce DNA into hematopoietic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 87(10): 3655-3659.

196. Zhang G., Budker V., and Wolff J. A. 1999. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther 10:1735-1737.

197. Zhang G., Gao X., Song Y. K., Vollmer R., Stolz D. B., Gasiorowski J. Z., Dean D. A., and Liu D. 2004. Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery. Gene Ther 11:675-682.

198. Zhang Xiaohong, Dong Xuebin, Sawyer Greta J., Collins Louise, Fabre John W. Regional hydrodynamic gene delivery to the rat liver with physiological volumes of DNA solution. The Journal of Gene Medicine Volume 6, Issue 6, pages 693-703, June 2004

199. Zhu X., Wu G., Zeng W., Xue H., Chen B. 2005. Cysteine mutants of human apolipoprotein A-I: a study of secondary staictural and functional properties. J Lipid Res. 46(6).1303-11.

200. Zuhorn I. S., Kalicharan R., Hoekstra D. 2002. Lipoplex-mediated transfection of mammalian cells occurs through the cholesterol-dependent clathrin-mediated pathway of endocytosis. J. Biol. Chem. 277:18021-18028.

Информация о работе

Ефремов, Александр Михайлович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2012
ВАК 03.03.04

Диссертация

Перенос генов в клетки млекопитающих с помощью молекулярных конъюгатов: разработка носителей и оптимизация генетических конструкций - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы